JP2012140284A - カーボンナノチューブ膜の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】CNTと、水溶性キシランのようなCNTを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を混合して、CNTが溶解した溶液を作製する工程と、ガラス板などの細胞を培養するための基材の表面にCNTが溶解した溶液を滴下等に供給して、基材表面に液層を形成する工程と、液層を残した状態で前記水系溶媒を蒸散し、溶液中のCNTを析出させて、当該基材表面にCNTを沈着させる工程と、前記基材表面を水で洗浄する工程とによって基材表面に含むCNT膜を有する細胞培養用の器具を得る。
【選択図】図1
Description
本発明においては、まず、CNTと当該CNTを可溶化する水溶性の可溶化剤を含む水系溶液が調製される。本発明において、CNTは単層CNT(SWNT)又は多層CNT(MWNT)であり得る。
CNTは、炭素の同素体であり、複数の炭素原子が結合して筒状に並んだものである。CNTとしては、任意のCNTを用いることができる。CNTの例としては、単層CNT及び多層CNT、及びこれらがコイル状になったものが挙げられる。単層CNTは、グラファイトシートが一重で筒状になったものであり、多層CNTは、グラファイトシートが2層以上同心円状に重なったものである。本発明で用いられるCNTは、多層CNTでも単層CNTでもよいが、より好ましくは単層CNTである。CNTの片側が閉じた形をしたカーボンナノホーン、その頭部に穴があいたコップ型のナノカーボン物質、両側に穴があいたCNTなども用いることができる。
本発明の可溶化剤はCNTを水系溶媒に可溶化する任意の物質である。本発明において可溶化とは、難溶性又は不溶性であった物質が可溶性になるか若しくは可溶性物質と同様の挙動をするようになることを言う。CNTが溶液中に均質に溶解していることは、CNT溶液を約7,000gで5〜30分間の遠心分離して沈殿が生じなければ溶解していると言える。また、CNT溶液中のCNTを遠心分離などにより回収し、溶媒で洗浄して回収物中に存在する可溶化剤を除いた後、原子間力顕微鏡を用いて確認することもできる。
本発明で用いられる溶媒は、可溶化剤が溶解しうる溶媒であり、より好ましくは可溶化剤が室温(約20℃)で1リットルあたり約10g以上溶解できる溶媒である。このような溶媒は水系溶媒であり、水及び水と混和性のある任意の有機溶媒である。本発明で用いられる水系溶媒は、より好ましくは水又は水と当該有機溶媒との混液であり、最も好ましくは水である。有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、アセトニトリル、プロピオニトリル、テトラヒドロフラン、1,4−ジオキサン、メチルイソブチルケトン、メチルエチルケトン、γ−ブチルラクトン、プロピレンカーボネート、スルホラン、ニトロメタン、N,N−ジメチルホルムアミド、N−メチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、N−メチルピロリドン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタンが挙げられる。
次いで、可溶化剤を含む混合液に、CNTを添加してCNTの溶液を得る。添加するCNTは、粉末の形態であることが好ましい。また、水溶性キシランとCNTとを予め混合した後、これに溶媒を添加することによってCNT溶液を得てもよい。また、他の機械的手段によって充分に混合してもよい。
上記で得られた溶液は、基材表面に供給され、基材表面に液の層を形成する。溶液の供給は、塗布や滴下などの方法により行われる。溶液の塗布量は適宜定められ得る。CNTの溶液の塗布量は、基材の表面積1cm2に対して、0.001ml以上、好ましくは0.01ml以上、好ましくは0.05ml以上である。CNTの溶液の塗布量は、基材の表面積1cm2に対して、0.5ml以下、0.1ml以下、好ましくは0.05ml以下である。
次に基材表面に供給された溶液は乾燥に付され、溶媒が蒸散される。乾燥は、自然乾燥又は強制乾燥であり得る。自然乾燥は自然の状態で放置することである。強制乾燥は、強制的に高温にした環境下で放置することである。乾燥時の温度は、10℃以上、好ましくは20℃以上、好ましくは30℃以上、より好ましくは40℃以上である。乾燥時の温度は100℃以下、好ましくは80℃以下、好ましくは70℃以下、より好ましくは60℃以下である。
溶媒の蒸散により、基材表面には析出したCNTが付着すると共に水溶性キシランとCNTを含む溶液が残る。この場合には、残った溶液を除去する。除去は任意的工程である。除去は吸引によることもできるが、除去のための特別な装置は不要である。基材表面を傾けると基材表面の溶液が流れ落ちる。形成されたCNT膜は、基材表面における分子間力によって基材表面に付着し、基材の傾斜では表面から剥離しない。
溶媒を蒸散させた後の基材表面は水洗される。水洗により、基材の表面に残留していたGX及び余剰のCNTが洗い流され、基材表面上にCNT膜が残る。その後、必要に応じて乾燥に付される。乾燥は、自然乾燥又は強制乾燥であり得る。自然乾燥は自然の状態で放置することである。強制乾燥は、強制的に高温にした環境下で放置することである。乾燥時の温度は、10℃以上、好ましくは20℃以上、好ましくは50℃以上、より好ましくは80℃以上、より好ましくは100℃以上である。乾燥時の温度は200℃以下、好ましくは150℃以下、好ましくは120℃以下、より好ましくは100℃以下である。この乾燥により基材表面にCNT膜が固定される。
CNT膜を備えた細胞培養用の器具は細胞培養のために使用される。本発明の細胞培養用の器具は公知の器具と何ら変わるところなく使用できる。また、本発明の製造方法により形成されたCNT膜は幹細胞の分化を刺激し、又は促進しうる。分化を刺激するとは、CNT膜を有しない細胞培養用の器具において分化が生じなかった細胞が、CNT膜を有する細胞培養用の器具において分化が生じることであり、分化を促進するとは、CNT膜を有しない細胞培養用の器具で培養した場合に比べて、分化を生じる細胞数が多いことあるいは分化を生じるまでの期間が短くなることを言う。
水溶性キシランとしてグルクロノキシラン(スロヴァキア科学アカデミー製、数平均分子量18,000、キシロース残基:4−O−メチル−D−グルクロン酸残基=10:1;アセチル化なし;ブナ由来:及び江崎グリコ製Lot.080126)を用いた。
上清中のCNTの溶解度を測定した。その結果は図1〜8に示された。溶解度は500nmにおける吸光度で示した。吸光度の測定は室温(15〜25℃)にて行われた。また、吸光度の測定には分光光度計(島津製作所製UV-1600PC)を用いた。
CNTの溶解性が最もよかった1mg/ml又は2mg/ml濃度のGX水溶液3mlに、12mgのCNTを添加した後、上記の条件に従って2種類の超音波装置を用いてCNTを分散し、遠心分離(20℃、10分間、1,600G)による上清をCNT溶液とした。
得られたCNT膜をAFM(原子間力顕微鏡)で観察した。シャーレ表面に傷をつけないようにCNT膜を5mm四方に切り取り観察に供した。Veeco製MMAFM型マルチモードを使用し、Tappingモードで測定した。プローブはModel:RTESP、Part:MPP-11100-10を使用し、大気中、室温(15〜25℃)にて行った。また、その断面画像から接着しているCNTの直径を測定し、全20カ所の測定からその平均値を求めた。その代表的な画像を図9及び図10に示した。図9はそれぞれSWNTが使用されたCNT膜(スロヴァキア科学アカデミー製のGX水溶液に、名城ナノカーボン製のCNTを溶解した溶液を使用)の例であり、図10はMWNTが使用されたCNT膜(スロヴァキア科学アカデミー製のグルクロノキシラン水溶液に、バイエル製のCNTを溶解した溶液を使用)の例である。参考のために、市販品である未使用の名城ナノカーボン製の単層CNTコートディッシュについても同様に観察した。その画像を図11に示した。
細胞培養のためにCNT膜を備えた細胞培養用の器具(カバーガラス)を新たに作製した。0.2mg/mlのGX水溶液(スロヴァキア科学アカデミー製、数平均分子量18,000、キシロース残基:4−O−メチル−D−グルクロン酸残基=10:1;アセチル化なし)の3mlに、12mgのSWNT(名城ナノカーボン製)及びMWNT(バイエル製DP-LP150P)を添加した後、実施例1に記載の条件に従って超音波ホモジナイザーを用いてCNTを溶解した。このCNT溶液の1mlを、直径12mmのカバーガラス上に滴下し、60℃で乾燥して溶媒をほぼ蒸散させた。次いで、十分に水洗した後、60℃で十分に乾燥して、CNT膜を備えたカバーガラスを作製した。
CNT膜に残留するGXの検出を試みた。GXの存在量は、標準品となるGXがなく、GXの分子量によっても異なる。そこで、CNT膜の調整に用いたGXを用いて作製した標準サンプルと対比することで、GXの存否を確認することにした。色素(RBB:レナゾール・ブリリアント・ブルー;スロヴァキア科学アカデミー製)で標識されたGXの水溶液(0.2mg/ml)の3mlに、12mgのSWNT(名城ナノカーボン製)を添加し、上記と同様にしてCNT膜を有するカバーガラスを作製した。また、色素で標識されたGXの水溶液の1mlをカバーガラスに滴下し、60℃で乾燥して標準サンプルを作製した。なお、標準サンプルは水洗されていない。それぞれ標準サンプル及びCNT膜を備えたカバーガラスについて、それぞれ400nm〜800nmにおける透過率を、分光光度計を用いて測定した。その結果を図12に示す。色素による吸収が見られる約500〜約700nmにおいて、CNT膜を有するカバーグラスの透過率は低下せず、非処理のカバーグラスとほぼ同じ透過率であった。この結果から、基材(カバーグラス)上に形成されたCNT膜はGXを含まないと言える。
上記カバーグラス上において、骨芽細胞のモデル株であるヒト骨肉腫由来細胞(HOS細胞)を培養し、細胞の接着量及び細胞の形態を観察した。対照としてポリ−L−オルニチン(PLO)の膜を表面に備えたカバーグラスを用いて同様に培養を行った。PLO水溶液(0.1mg/ml)にカバーグラスを37℃で12時間浸した後、室温で風乾させてPLOの膜を有するカバーガラスを作製した。培養には1%FBS(Cat No.12603C、Lot No.6M0672、65℃、30min非働化済)を含むMEM培地(Earle's minimum essential medium)と10%FBSを含むMEM培地を用いた。MEM培地は10mg/mlのNEAA(non-essential amino acid solution)、抗生物質−抗真菌剤 Mix(Antibiotic-Antimycotic:Invitrogen 15240-062)を含む。各培地にて0.5×105cells/mlの細胞濃度でHOS細胞を蒔き、37℃、5%CO2に調整されたインキュベーターで3日間培養した。培養開始1日目、3日目に、4%のパラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を添加して、細胞固定を行った。固定後、それぞれ光学顕微鏡による形態観察、細胞数の計測、AFM観察及び蛍光顕微鏡観察を実施した。
HOS細胞の初期接着量が、培養開始1日目に固定した細胞の顕微鏡画像(図14参照)をもとにした単位面積当たりの細胞数を数えることによって求められた。その結果を図13に示す。10%FBS含有条件下におけるHOS細胞の初期接着量は、SWNTとMWNTのいずれのCNTを用いた場合でも、対照の初期接着量と同等の値を示したが、1%FBS添加条件下の初期接着量は対照の初期接着量よりも小さかった。また、10%FBS添加条件下の細胞増殖率は対照のそれとほぼ同じであったのに対し、1%FBS添加条件下の細胞増殖率は対照のそれよりも小さくなった。10%FBS添加条件下では培養された細胞は均一に進展したのに対し、1%FBS添加条件下では細胞同士が接着する傾向にあり、凝集した細胞群が多く見られた(図14参照)。CNT膜を有する細胞培養用の器具を利用した場合でも、FBSの添加量を多くした培地を用いれば、CNT膜表面に細胞の付着が良好に観察され、増殖性に影響を及ぼすことなく培養できた。
細胞が付着したカバーガラスをAFM観察に供した。Veeco製MMAFM型マルチモードを使用し、Tappingモードで測定した。プローブはModel:RTESP、Part:MPP-11100-10を使用し、大気中、室温(15〜25℃)にて行った。その結果を図15〜図17に示す。1%FBS添加条件下では細胞同士の接着がみられ、10%FBS添加条件下では細胞同士の接着はみられなかった。しかしながら、AFM観察によると、1%FBS添加条件及び10%FBS添加条件いずれの培養条件でも、突起状の仮足が観察された(図16及び図17参照)。また、細胞が存在する場所における表面高さを測定したところ、1%FBS添加条件下では、その表面高さは対照の表面高さよりも大きな値を示したが、10%FBS添加条件下ではその表面高さは対照の表面高さとほぼ同じであった。1%FBS条件下では、接着性は良好であるとは言えないがCNT膜が接着性を阻害するものではなかった。一方、10%FBS条件下では良好な接着性を示した。以上の結果から、CNT膜を備えたカバーガラスは接着性細胞の培養に使用し得るものと判断される。
アクチンフィラメント、ビンキュリン及び核を対象とする多重蛍光染色法により染色された細胞を顕微鏡観察に供した。PLOを用いた対照では、アクチンフィラメントは密な繊維状の網目構造を有し、ストレスファイバーが形成された。1%FBS培養条件下ではアクチンフィラメントの構造を形成しなかったのに対し、10%FBS培養条件下では、対照と同様に、アクチンフィラメントは密な繊維状の網目構造を有し、ストレスファイバーが形成された。また、PLOを用いた対照では、ビンキュリンが染色されたフォーカルアドヒージョンが多く観察された。一方、1%FBS培養条件下ではフォーカルアドヒージョンが観察されなかったのに対し、10%FBS培養条件下では、対照と同様に、フォーカルアドヒージョンを有する糸状仮足が多く観察された。
次に、上記CNT膜を有するカバーガラス上で、ラット骨髄由来の間葉系幹細胞(rMSC)を分化誘導した。分化誘導には、分化誘導因子としてデキサメタゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸をそれぞれ10mg/mlを含む15%FBS添加MEM培地を用いた。MEM培地は10mg/mlのNEAA(non-essential amino acid solution)、抗生物質−抗真菌剤 Mix(Antibiotic-Antimycotic:Invitrogen 15240-062)を含む。各培地にて0.5×105cells/mlの細胞濃度でrMSCを蒔き、37℃ 5%CO2に調整されたインキュベーターで3週間培養した。培養開始から1週間経過後及び3週間後に、4%のパラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を添加して、細胞固定を行った。固定後、初期骨分化の指標であるアルカリフォスファターゼ(ALP)染色及び細胞抽出液のALP活性の測定を行った。対照としてCNT膜を有しない培養皿を用いて同様に培養を行った。
Claims (9)
- 基材表面にカーボンナノチューブ膜を製造する方法であって、
カーボンナノチューブとカーボンナノチューブを可溶化する水溶性の可溶化剤と水系溶媒を含み、カーボンナノチューブが溶解された溶液を作製する工程と、
前記溶液を前記基材表面に供給する工程と、
前記供給された溶液の溶媒の蒸散により溶液中のカーボンナノチューブを析出させて、当該基材表面にカーボンナノチューブを付着させる工程と、
前記カーボンナノチューブが付着した基材表面を水で洗浄する工程を含むカーボンナノチューブ膜の製造方法。 - 前記可溶化剤が、水系溶媒に溶解した溶液において、当該可溶化剤の濃度を高めた場合に、ある濃度を境にしてカーボンナノチューブの溶解度が低下する特性を有する物質である請求項1に記載の製造方法。
- 前記水溶性の可溶化剤は、水溶性キシランである請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記水溶性キシランは、グルクロノキシランである請求項3に記載の製造方法。
- 前記基材は、プラスチック、高分子化合物、金属、セラミック又はこれらから選ばれる1種又は2種以上を含む複合材からなる請求項1〜4の何れか1項に記載の製造方法。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載の製造方法により得られたカーボンナノチューブ膜を表面に有する物品。
- 前記物品は、細胞培養用の器具又は体内埋め込み型医療器具である請求項6に記載の物品。
- 請求項7に記載の細胞培養用の器具を用いる幹細胞の分化誘導方法。
- 前記幹細胞は組織幹細胞である請求項8に記載の分化誘導方法。
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