JP2012122750A - Method for separating and refining chlorophyll c and/or xanthophyll - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料からクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法に関する。 The present invention relates to a method for separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll from a sample containing chlorophyll c and / or xanthophyll.
これまでフコキサンチン等のキサントフィルの分離精製は、従来は、担体として合成吸着樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー（特許文献１）、再結晶（特許文献２）等の多段階の精製方法により単離されていた。 Until now, separation and purification of xanthophyll such as fucoxanthin has been conventionally isolated by a multi-stage purification method such as column chromatography using a synthetic adsorption resin as a carrier (Patent Document 1) and recrystallization (Patent Document 2). It was.
しかしながら、特許文献１に記載の精製方法では、キサントフィルの合成吸着樹脂への不可逆的吸着により収率が低下するという問題があった。また、特許文献２に記載の精製方法では、再結晶という方法の原理上、収率の向上には限界があり、更に冷却や濃縮等の操作に時間がかかるという問題があった。 However, the purification method described in Patent Document 1 has a problem that the yield decreases due to irreversible adsorption of xanthophyll onto the synthetic adsorption resin. Further, the purification method described in Patent Document 2 has a problem in that the yield is limited due to the principle of recrystallization, and further operations such as cooling and concentration take time.
一方、天然に多く存在するクロロフィルｃは、クロロフィルｃ１、クロロフィルｃ２、クロロフィルｃ３の三種類が知られている。これらについては藻類を原料とする以下の精製方法が知られている（非特許文献１）。 On the other hand, three types of chlorophyll c existing in nature are known: chlorophyll c1, chlorophyll c2, and chlorophyll c3. For these, the following purification method using algae as a raw material is known (Non-Patent Document 1).
これらのクロロフィルｃの精製方法はいずれも薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、ＨＰＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を必要とするものであり、これらは分析用の手法であるため、ミリグラムスケールの分離しかできず、スケールアップが困難な方法であった。また、クロロフィルｃは、有機酸であるため、一般的なカラムによる分離は困難であるだけでなく、カラム担体に不可逆的吸着が起こるため、収率が低下するという問題もあった。更に、クロロフィルｃは一般的な抽出・精製の有機溶媒に対する溶解度が極めて低く、精製各段階における回収効率が極めて低いという問題点があった。 All of these chlorophyll c purification methods require thin layer chromatography (TLC, HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Since these are analytical methods, they can only be separated on a milligram scale. It was impossible to scale up and it was a difficult method. Further, since chlorophyll c is an organic acid, it is difficult to separate by a general column, and irreversible adsorption occurs on the column carrier, resulting in a problem that the yield decreases. Furthermore, chlorophyll c has a problem that its solubility in a general extraction / purification organic solvent is extremely low, and the recovery efficiency in each purification stage is extremely low.
また、特にクロロフィルｃとキサントフィルを共に含有する試料からキサントフィルを精製する場合、キサントフィルがクロロフィル類と混在しているとクロロフィル類が異性化を促進するため抽出混合物におけるクロロフィル類との一刻も早い分離が望ましい。また、クロロフィルａの分解物もクロロフィルｃと同様の物理化学的性質を示すため、キサントフィルをクロロフィルｃと分離できればクロロフィルａの分解物からも分離できる。 In particular, when xanthophyll is purified from a sample containing both chlorophyll c and xanthophylls, if the xanthophylls are mixed with chlorophylls, the chlorophylls promote isomerization, so that the chlorophylls in the extraction mixture can be separated as soon as possible. desirable. Moreover, since the decomposition product of chlorophyll a also exhibits the same physicochemical properties as chlorophyll c, if xanthophyll can be separated from chlorophyll c, it can also be separated from the decomposition product of chlorophyll a.
更に、クロロフィルｃとキサントフィルは極性が高い等の物理的性質が類似しているため、通常は脂溶性のほかの光合成色素、クロロフィルａやβカロテンとの分離をまず行なってから更にクロロフィルｃとキサントフィルを分離するという二段階の精製法になる。この精製法においてキサントフィルとクロロフィルｃ（およびクロロフィルａの分解物）は精製段階に行くまでは混在することとなり、キサントフィルの耐久性および収量が低下するという問題があった。 Furthermore, since chlorophyll c and xanthophylls have similar physical properties such as high polarity, they are usually separated from other photosoluble dyes such as chlorophyll a and β-carotene, and then chlorophyll c and xanthophylls are further separated. Is a two-stage purification method. In this purification method, xanthophyll and chlorophyll c (and a decomposition product of chlorophyll a) are mixed until the purification stage, and there is a problem that durability and yield of xanthophyll are lowered.
従って、本発明の課題は、従来の方法では困難であった、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料からクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルの分離精製を高収率で、迅速に行う方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for rapidly separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll from a sample containing chlorophyll c and / or xanthophyll, which has been difficult with conventional methods, in a high yield. There is.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料に、特殊な固定相および移動相を用いた高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣＣ）を行うことにより、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを高収率で、迅速に分離精製できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors perform high-speed counter-current chromatography (HSCCC) using a special stationary phase and a mobile phase on a sample containing chlorophyll c and / or xanthophyll. As a result, it was found that chlorophyll c and / or xanthophyll can be quickly separated and purified in high yield, and the present invention was completed.
すなわち、本発明はクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料に、メタノールまたはエタノール、アセトンまたは酢酸エチル、ヘキサンおよび水を混和して得られる２相系溶媒の上層を固定相および下層を移動相に用いた高速向流クロマトグラフィーを行うことを特徴とするクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法である。 That is, in the present invention, a sample containing chlorophyll c and / or xanthophyll is mixed with methanol or ethanol, acetone or ethyl acetate, hexane and water so that the upper layer is a stationary phase and the lower layer is a mobile phase. It is a method for separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll, characterized by performing high-speed countercurrent chromatography.
本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法によれば、褐藻類等に含まれるクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを高収率で、迅速に分離精製することができる。特にこの方法に用いられる高速向流クロマトグラフィーは、固定相が溶媒であるため、原理上担体（固定相）への不可逆的吸着が起こりえず、原則１００％の回収率である。また、後述するが、分離に際して濃縮や乾燥の操作をほとんど経ずに抽出溶媒のまま分離を行うことができるため、操作も簡便である。 According to the method for separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll of the present invention, chlorophyll c and / or xanthophyll contained in brown algae and the like can be quickly separated and purified at a high yield. In particular, in the high-speed counter-current chromatography used in this method, since the stationary phase is a solvent, irreversible adsorption to the carrier (stationary phase) cannot occur in principle, and the recovery rate is 100% in principle. As will be described later, since the separation can be carried out with the extraction solvent almost without any concentration or drying operation, the operation is also simple.
また、特に上記高速向流クロマトグラフィーを行うときの移動相に、イオン対試薬を添加することにより、分離能が高まるので、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを高純度で分離精製することができる。 In particular, by adding an ion-pairing reagent to the mobile phase when performing the above-mentioned high-speed countercurrent chromatography, the separation ability is enhanced, so that chlorophyll c and / or xanthophyll can be separated and purified with high purity.
更に、本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法では、これまでの方法では試料とすることが困難であった大型藻類を試料とすることもできる。また、クロロフィルｃを濃縮や乾燥の操作をほとんど経ずに抽出溶媒のまま精製することが可能であるため、低溶解度による回収率の低下も回避できる。 Furthermore, in the method for separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll of the present invention, it is also possible to use large algae that were difficult to prepare as a sample by the conventional methods. Moreover, since it is possible to refine | purify chlorophyll c with an extraction solvent, hardly through operation of concentration and drying, the fall of the recovery rate by low solubility can also be avoided.
本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法（以下、単に「本発明精製方法」という）に用いるクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを含有する試料としては、前記成分を含有していれば特に限定されず、例えば、クロロフィルｃ２のみを含むアンフィジニウム・カーテラエ（Amphidinium carterae）、クロオモナス・サリーナ（Chroomonas salina）等の微細藻類、クロロフィルｃ１、ｃ２等のクロロフィルｃ、フコキサンチン、ビオラキサンチン、アンテラキサンチン、ゼアキサンチン等のキサントフィルを含むオキナワモズク等のモズク、コンブ、ワカメ等の褐藻類等が挙げられる。これらの中でもクロロフィルｃおよびキサントフィルを含むオキナワモズクが好ましく、特にその盤状体が好ましい。なお、オキナワモズクの盤状体は、例えば、特開２００４−３５５２８号公報に記載の方法により容易に得ることができる。 As a sample containing chlorophyll c and / or xanthophyll used in the method for separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll of the present invention (hereinafter simply referred to as “the purification method of the present invention”) Without limitation, for example, microalgae such as Amphidinium carterae and Chroomonas salina containing only chlorophyll c2, chlorophyll c such as chlorophyll c1 and c2, fucoxanthin, violaxanthin, anthaxanthin , Mozuku such as Okinawa mozuku containing xanthophyll such as zeaxanthin, brown algae such as kombu and wakame, and the like. Among these, Okinawa mozuku containing chlorophyll c and xanthophyll is preferable, and its plate-like body is particularly preferable. In addition, the plate-like body of Okinawa mozuku can be easily obtained by the method described in JP-A-2004-35528, for example.
なお、試料は、後記する高速向流クロマトグラフィーを行う前に、抽出等し、粗精製物としてもよい。粗精製物の調製は、常法に従って行えばよく、例えば、試料をメタノール、アセトン、クロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出を行い、得られた抽出物を、更に、乾燥物を高速向流クロマトグラフィーに用いる２相系溶媒の上層、下層または上層：下層＝１：１（ｖ／ｖ）等の２相系溶媒を維持できる溶液、特に移動相に用いる下層に溶解しておくことが収率の点から好ましい。 In addition, the sample may be extracted or the like before being subjected to high-speed countercurrent chromatography, which will be described later, to obtain a crude product. The crude product may be prepared according to a conventional method. For example, a sample is extracted with an organic solvent such as methanol, acetone, chloroform, etc., and the obtained extract is further subjected to high-speed countercurrent chromatography. Yield of a solution that can maintain a two-phase solvent such as an upper layer, a lower layer, or an upper layer: a lower layer = 1: 1 (v / v) of the two-phase solvent used for lithography, particularly a lower layer used for the mobile phase From the point of view, it is preferable.
本発明精製方法は、上記試料について、メタノールまたはエタノール、アセトンまたは酢酸エチル、ヘキサンおよび水を混和して得られる２相系溶媒、好ましくはエタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）、メタノール：酢酸エチル：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）の２相溶媒系、より好ましくはエタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）の２相溶媒系の上層を固定相および下層を移動相に用いた高速向流クロマトグラフィーを行う。 The purification method of the present invention is a two-phase solvent obtained by mixing methanol or ethanol, acetone or ethyl acetate, hexane and water, preferably ethanol: acetone: hexane: water = 5: 5: 5: 2 (Volume ratio), methanol: ethyl acetate: hexane: water = 5: 5: 5: 2 (volume ratio) two-phase solvent system, more preferably ethanol: acetone: hexane: water = 5: 5: 5: 2 ( High-speed countercurrent chromatography is performed using the upper layer of the two-phase solvent system (volume ratio) as the stationary phase and the lower layer as the mobile phase.
本発明精製方法において、高速向流クロマトグラフィーは、上記固定相と移動相とを用いる以外には特に限定されず、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィルが分離精製できる条件を適宜採用して行えばよい。 In the purification method of the present invention, the high-speed countercurrent chromatography is not particularly limited except that the stationary phase and the mobile phase are used, and the conditions under which chlorophyll c and / or xanthophyll can be separated and purified may be appropriately employed.
具体的に、高速向流クロマトグラフィーをＥＡＳＹ ＰＲＥＰ ３２０（カラム：コイルプラネット型、カラム容量：３２０ｍｌ：クツワ産業製）を用いて行う場合には、次のような条件で行うことができる。
カラム回転数：８００〜１０００ｒｐｍ、好ましくは９５０ｒｐｍ
固定相：上記２相溶媒系の上層
移動相：上記２相溶媒系の下層
流速：３〜６ｍｌ／分、好ましくは３ｍＬ／分
Specifically, when high-speed countercurrent chromatography is performed using EASY PREP 320 (column: coil planet type, column capacity: 320 ml: manufactured by KUTSUWA SANGYO), it can be performed under the following conditions.
Column rotation speed: 800-1000 rpm, preferably 950 rpm
Stationary phase: Upper layer of the above two-phase solvent system Mobile phase: Lower layer of the above two-phase solvent system Flow rate: 3 to 6 ml / min, preferably 3 mL / min
上記した本発明精製方法により、クロロフィルｃおよび／またはキサントフィル、好ましくはフコキサンチン、ビオラキサンチン、アンテラキサンチン、ゼアキサンチン等を分離精製することができる。なお、ここで分離精製されたクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルの純度はＨＰＬＣおよび吸収スペクトルで測定することができる。 By the above-described purification method of the present invention, chlorophyll c and / or xanthophyll, preferably fucoxanthin, violaxanthin, anthaxanthin, zeaxanthin and the like can be separated and purified. The purity of chlorophyll c and / or xanthophyll separated and purified here can be measured by HPLC and absorption spectrum.
また、本発明精製方法において、特に、移動相となる２相系溶媒の下層にイオン対試薬を添加することにより高速向流クロマトグラフィーにおけるクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルのピークのテーリングを軽減し、ピーク分解能が高まるため好ましい。 Further, in the purification method of the present invention, the tailing of chlorophyll c and / or xanthophyll peaks in high-speed countercurrent chromatography is reduced by adding an ion-pairing reagent to the lower layer of the two-phase solvent serving as the mobile phase. This is preferable because the resolution is increased.
上記で用いるイオン対試薬としては、酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸、蟻酸、酢酸等が挙げられ、これらの中でも酢酸アンモニウムが好ましい。２相系溶媒の下層へのイオン対試薬の添加量は、例えば、０.５Ｍ〜２０ｍＭ、好ましくは０.３Ｍ〜５０ｍＭである。 Examples of the ion pair reagent used above include ammonium acetate, trifluoroacetic acid, formic acid, acetic acid, and the like. Among these, ammonium acetate is preferable. The amount of the ion pair reagent added to the lower layer of the two-phase solvent is, for example, 0.5 M to 20 mM, preferably 0.3 M to 50 mM.
本発明精製方法で得られたクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルは、更に、カラム精製や再結晶を行い、純度を高めることができる。例えば、クロロフィルｃにクロロフィルｃ１とｃ２の両方が含まれていて、それを分離する場合はＨＰＬＣあるいはカラムクロマトグラフィーを行えばよく、クロロフィルｃにクロロフィルｃ２しか含まれない場合には再結晶だけでもよい。 Chlorophyll c and / or xanthophyll obtained by the purification method of the present invention can be further purified by column purification and recrystallization to increase the purity. For example, when both chlorophyll c1 and c2 are contained in chlorophyll c and separated, HPLC or column chromatography may be performed. When chlorophyll c contains only chlorophyll c2, only recrystallization may be performed. .
上記した本発明精製方法により得られたクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルは、従来、クロロフィルｃやキサントフィルが配合されていた各種医薬品、化粧品、飲食品等に利用することができる。 Chlorophyll c and / or xanthophyll obtained by the above-described purification method of the present invention can be used for various pharmaceuticals, cosmetics, foods and drinks and the like in which chlorophyll c and xanthophyll are conventionally blended.
また、クロロフィルｃについては、特に、色素増感太陽電池への応用、研究試薬等にも利用することができる In addition, chlorophyll c can be used particularly for application to dye-sensitized solar cells, research reagents, and the like.
更に、キサントフィルについては、特に、脂肪組織における脂肪の燃焼を助けるので、脂肪燃焼用の飲食品、医薬品に利用することができる。 Furthermore, xanthophyll can be used in foods and drinks and pharmaceuticals for burning fat, particularly because it helps burn fat in adipose tissue.
以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明は何らこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples at all.
参 考 例 １
試料の調製：
１００ｍｌの蓋付き瓶に、オキナワモズク盤状体９.８７ｇと、メタノールとアセトンの混液（アセトン：メタノール＝７：２（容量比））１００ｍｌを加え、氷で冷却しながら、１.５時間、９００ｒｐｍで撹拌した。次にこれを１０,０００ｒｐｍで５分間遠心するのを１セットとして、これを４セット行った。遠心後に得られた上清を採取し、エバポレーターで乾燥させたところ、乾燥物と、乾燥しなかった粘性の高い黄色い溶液５ｍｌが得られた。
Reference example 1
Sample preparation:
To a 100 ml bottle with a lid, add 9.87 g of Okinawa Mozuku discoid and 100 ml of a mixture of methanol and acetone (acetone: methanol = 7: 2 (volume ratio)) and cool with ice for 1.5 hours. Stir at 900 rpm. Next, this was centrifuged for 5 minutes at 10,000 rpm as one set, and four sets were performed. The supernatant obtained after centrifugation was collected and dried with an evaporator to obtain a dried product and 5 ml of a highly viscous yellow solution that was not dried.
上記で得られた乾燥物に、ヘキサン：エタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）を１０ｍｌ添加し、完全に溶解させたところ、２層に分離した。この溶液を抽出液１とした。 When 10 ml of hexane: ethanol: acetone: hexane: water = 5: 5: 5: 2 (volume ratio) was added to the dried product obtained above and dissolved completely, it was separated into two layers. This solution was designated as Extract 1.
また、上記で得られた黄色い溶液に、ヘキサン：エタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）を１０ｍｌ添加し、完全に溶解させたところ、２層に分離した。この溶液を抽出液２とした。 Moreover, 10 ml of hexane: ethanol: acetone: hexane: water = 5: 5: 5: 2 (volume ratio) was added to the yellow solution obtained above, and when it was completely dissolved, it separated into two layers. This solution was designated as Extract 2.
実 施 例 １
ＨＳＣＣＣによるクロロフィルｃおよびキサントフィルの分離精製（１）：
参考例１で得られた抽出液１の下層の８ｍｌを試料とした。この試料について以下の条件でＨＳＣＣＣを行った。なお、ＨＳＣＣＣの固定相および移動相としては、ヘキサン：エタノール：アセトン：水＝５：５：５：２（容量比）を混合後、２相に分かれた、上層を固定相および下層を移動相とした。また、各フラクションは手動で捕集した。このＨＳＣＣＣの溶出曲線を図１に示した。
＜ＨＳＣＣＣ条件＞
ＨＳＣＣＣ装置：ＥＡＳＹ ＰＲＥＰ３２０（クツワ産業製）
カラム：セミプレップ３２０ｍｌ
カラム容量：３２０ｍｌ
流速：３.０ｍｌ／ｍｉｎ
回転速度：９６０ｒｐｍ
回転様式：縦型(コイルプラネット型)
送液ポンプ：Ｊａｓｃｏ ＰＵ−１５８０（日本分光製）
検出器：ＰＤＡ（２５０−８００ｎｍ）ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所製）
Example 1
Separation and purification of chlorophyll c and xanthophyll by HSCCC (1):
8 ml of the lower layer of the extract 1 obtained in Reference Example 1 was used as a sample. This sample was subjected to HSCCC under the following conditions. In addition, as a stationary phase and a mobile phase of HSCCC, hexane: ethanol: acetone: water = 5: 5: 5: 2 (volume ratio) was mixed, and then divided into two phases. The upper layer was the stationary phase and the lower layer was the mobile phase. It was. Each fraction was collected manually. The elution curve of this HSCCC is shown in FIG.
<HSCCC conditions>
HSCCC device: EASY PREP320 (manufactured by Kutuwa Sangyo)
Column: Semiprep 320ml
Column capacity: 320ml
Flow rate: 3.0 ml / min
Rotation speed: 960rpm
Rotation style: Vertical type (coil planet type)
Liquid feed pump: Jasco PU-1580 (manufactured by JASCO)
Detector: PDA (250-800 nm) SPD-M10AVP (manufactured by Shimadzu Corporation)
ＨＳＣＣＣの溶出曲線（図１）には、ピークが３つ認められた。次に、各ピークに該当するフラクションについて以下の条件でＨＰＬＣを行い、各ピークが何に由来するかを確認した（フラクション１〜６）。各フラクションのＨＰＬＣチャートを図２に示した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
展開溶媒Ａ：メタノール（０.１Ｍ酢酸アンモニウム）：アセトニトリル：水＝９／７／ ４（ｖ／ｖ）
展開溶媒Ｂ：酢酸エチル：アセトニトリル＝７：３（ｖ／ｖ）
流速０.８ｍｌ／分
０−５分：展開溶媒Ａ１００％
５−２５分：展開溶媒Ａを１００％から展開溶媒Ｂを１００％へのリニアグラジエント
２５分以降：展開溶媒Ｂ１００％
Three peaks were observed in the elution curve of HSCCC (FIG. 1). Next, HPLC was performed on the fractions corresponding to each peak under the following conditions to confirm what each peak was derived from (fractions 1 to 6). The HPLC chart of each fraction is shown in FIG.
<HPLC conditions>
Developing solvent A: methanol (0.1 M ammonium acetate): acetonitrile: water = 9/7/4 (v / v)
Developing solvent B: ethyl acetate: acetonitrile = 7: 3 (v / v)
Flow rate 0.8 ml / min 0-5 min: Developing solvent A 100%
5-25 minutes: Linear gradient from 100% of developing solvent A to 100% of developing solvent B After 25 minutes: 100% of developing solvent B
フラクション１および２にはクロロフィルｃ１（Ｃｈｌ ｃ１）およびｃ２（Ｃｈｌ ｃ２）が認められ、フラクション３にはクロロフィルｃ１、ｃ２およびフコキサンチン（Ｆｘ）が認められ、フラクション４および５にはフコキサンチンが認められ、フラクション６にはフコキサンチンおよびビオラキサンチン（Ｖｘ）が認められた。以上の結果から、ピーク１がクロロフィルｃに基づくもの、ピーク２がフコキサンチンに基づくもの、ピーク３がビオラキサンチンに基づくものであることがわかった。そしてフラクション１および２を採取することによりクロロフィルｃが分離でき、フラクション４および５を採取すればフコキサンチンが分離できることがわかった。 Fraction 1 and 2 have chlorophyll c1 (Chl c1) and c2 (Chl c2), fraction 3 has chlorophyll c1, c2 and fucoxanthin (Fx), and fractions 4 and 5 have fucoxanthin In fraction 6, fucoxanthin and violaxanthin (Vx) were observed. From the above results, it was found that peak 1 was based on chlorophyll c, peak 2 was based on fucoxanthin, and peak 3 was based on violaxanthin. It was found that chlorophyll c can be separated by collecting fractions 1 and 2, and fucoxanthin can be separated by collecting fractions 4 and 5.
実 施 例 ２
ＨＳＣＣＣによるクロロフィルｃおよびキサントフィルの分離精製（２）：
参考例１で得られた抽出液１の下層の１ｍｌと、抽出液２の下層の９ｍｌを混合したものを試料とした。この試料について、移動相としてヘキサン：エタノール：アセトン：ヘキサン：水＝５：５：５：２（容量比）を混合後、２層に分かれた下層に、更に、酢酸アンモニウムを１００ｍＭとなるように添加したものを用いる以外は実施例１と同様の条件でＨＳＣＣＣを行った。このＨＳＣＣＣの溶出曲線を図３に示した。
Example 2
Separation and purification of chlorophyll c and xanthophyll by HSCCC (2):
A mixture of 1 ml of the lower layer of the extract 1 obtained in Reference Example 1 and 9 ml of the lower layer of the extract 2 was used as a sample. With respect to this sample, hexane: ethanol: acetone: hexane: water = 5: 5: 5: 2 (volume ratio) was mixed as a mobile phase, and then ammonium acetate was added to 100 mM in the lower layer divided into two layers. HSCCC was performed under the same conditions as in Example 1 except that the added one was used. The elution curve of this HSCCC is shown in FIG.
ＨＳＣＣＣの溶出曲線にはクロロフィルｃに基づくピーク１、フコキサンチンに基づくピーク２およびビオラキサンチンに基づくピーク３が認められた。特に実施例１と比べて、下層にイオン対試薬である酢酸アンモニウムを用いることにより、各ピークの分離が進んだ。また、回収したフコキサンチンに基づくピーク２を含むフラクション９を回収し、その吸収スペクトルを測定した（図４）。このスペクトルにはフコキサンチンの吸収スペクトルに基づく６６５ｎｍにシャープな吸収帯が認められた。 In the elution curve of HSCCC, peak 1 based on chlorophyll c, peak 2 based on fucoxanthin and peak 3 based on violaxanthin were observed. In particular, as compared with Example 1, the separation of each peak progressed by using ammonium acetate as an ion-pairing reagent in the lower layer. Moreover, the fraction 9 containing the peak 2 based on the collect | recovered fucoxanthin was collect | recovered, and the absorption spectrum was measured (FIG. 4). In this spectrum, a sharp absorption band was observed at 665 nm based on the absorption spectrum of fucoxanthin.
実 施 例 ３
ＨＳＣＣＣによるクロロフィルｃおよびキサントフィルの分離精製（３）：
参考例１の抽出液２と同様にして調製した抽出液の下層の１０ｍｌを試料とした。この試料について以下の条件でＨＳＣＣＣを行った。なお、ＨＳＣＣＣの固定相および移動相としては、酢酸エチル：ヘキサン：メタノール：水＝５：５：５：２（容量比）を混合後、２相に分かれた、上層を固定相および下層を移動相とした。また、移動相には酢酸アンモニウムを１００ｍＭとなるように添加した。更に、各フラクションは手動で捕集した。このＨＳＣＣＣの溶出曲線を図５に示した。
＜ＨＳＣＣＣ条件＞
ＨＳＣＣＣ装置：ＥＡＳＹ ＰＲＥＰ３２０（クツワ産業製）
カラム：セミプレップ３２０ｍｌ
カラム容量：３２０ｍｌ
流速：３.０ｍｌ／ｍｉｎ
回転速度：１０００ｒｐｍ
回転様式：縦型(コイルプラネット型)
送液ポンプ：Ｊａｓｃｏ ＰＵ−１５８０（日本分光製）
検出器：ＰＤＡ（２５０−８００ｎｍ）ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ（島津製作所製）
Example 3
Separation and purification of chlorophyll c and xanthophyll by HSCCC (3):
10 ml of the lower layer of the extract prepared in the same manner as Extract 2 of Reference Example 1 was used as a sample. This sample was subjected to HSCCC under the following conditions. As the stationary phase and mobile phase of HSCCC, ethyl acetate: hexane: methanol: water = 5: 5: 5: 2 (volume ratio) was mixed and then divided into two phases. The upper layer was moved to the stationary phase and the lower layer. Phased. In addition, ammonium acetate was added to the mobile phase so as to be 100 mM. In addition, each fraction was collected manually. The HSCCC elution curve is shown in FIG.
<HSCCC conditions>
HSCCC device: EASY PREP320 (manufactured by Kutuwa Sangyo)
Column: Semiprep 320ml
Column capacity: 320ml
Flow rate: 3.0 ml / min
Rotation speed: 1000rpm
Rotation style: Vertical type (coil planet type)
Liquid feed pump: Jasco PU-1580 (manufactured by JASCO)
Detector: PDA (250-800 nm) SPD-M10AVP (manufactured by Shimadzu Corporation)
ＨＳＣＣＣの溶出曲線（図５）には、ピークが３つ認められた。各ピークに該当するフラクションの吸収スペクトルを測定したところ、ピーク１はクロロフィルｃ１、ピーク２はクロロフィルｃ２、ピーク３はフコキサンチンであった。この結果から、ＨＳＣＣＣの溶媒として酢酸エチル：ヘキサン：メタノール：水＝５：５：５：２（容量比）を用いてもクロロフィルｃおよびキサントフィルを分離精製できることがわかった。 Three peaks were observed in the HSCCC elution curve (FIG. 5). When the absorption spectrum of the fraction corresponding to each peak was measured, peak 1 was chlorophyll c1, peak 2 was chlorophyll c2, and peak 3 was fucoxanthin. From these results, it was found that chlorophyll c and xanthophyll could be separated and purified even when ethyl acetate: hexane: methanol: water = 5: 5: 5: 2 (volume ratio) was used as the solvent for HSCCC.
本発明のクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを分離精製する方法は、各種医薬品、化粧品、飲食品等に利用することができる純度の高いクロロフィルｃおよび／またはキサントフィルを容易に得ることができる。
The method for separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll of the present invention can easily obtain high-purity chlorophyll c and / or xanthophyll that can be used for various pharmaceuticals, cosmetics, foods and drinks, and the like.
Claims (6)
The method for separating and purifying chlorophyll c and / or xanthophyll according to any one of claims 1 to 5, wherein the sample containing chlorophyll c and / or xanthophyll is Okinawa moscow disc.
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