JP2012092095A - Protein solution preservable in liquid state, and method of preserving the protein solution in liquid state - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状での保存方法に関する。 The present invention relates to a protein solution that can be stored in a liquid state and a method for storing the protein solution in a liquid state.
臨床検査や食品分析において、操作の簡便さなどから、保存対象タンパク質を、流動性のある溶液の状態（以下本明細書において「液状」ということがある）のまま長期間保存できる方法が要望されている。すなわち、保存対象タンパク質を含む溶液を凍結して固体状にしたり、該溶液を凍結乾燥して粉末固体とすることなく、液状で長期間保存できる方法が要望されている。 In clinical examination and food analysis, a method that can store a protein to be stored for a long period of time in the state of a fluid solution (hereinafter sometimes referred to as “liquid” in the present specification) is desired for ease of operation. ing. That is, there is a demand for a method that can be stored in a liquid state for a long period of time without freezing the solution containing the protein to be stored into a solid state or lyophilizing the solution into a powdered solid.
しかし、多くのタンパク質は液状で不安定であり、溶液中で保存されている間に構造的分解およびその結果生じる活性の喪失を受けやすい。分解の速度は温度に比例する、すなわち、タンパク質は通常高温で変性しやすく低温で安定であることが知られている。
一方、タンパク質溶液が凍結するほど低温になった場合、凍結−解凍サイクルはタンパク質の分解や変性の原因となり得ることも知られており、タンパク質溶液を繰り返し凍結融解して使用することは通常避けられる。
However, many proteins are liquid and unstable and are susceptible to structural degradation and the resulting loss of activity while stored in solution. It is known that the rate of degradation is proportional to temperature, ie proteins are usually easily denatured at high temperatures and stable at low temperatures.
On the other hand, it is known that freeze-thaw cycles can cause protein degradation and denaturation when the temperature of the protein solution becomes low enough to freeze, and it is usually avoided to freeze and thaw the protein solution repeatedly. .
保存対象タンパク質を液状で長期間保存する場合に望まれる事項としては、生物学的活性（例えば、特異抗体に対する抗原性、抗体やレクチンなどが有する特異的結合相手に対する結合活性、ペプチドホルモンなどが有する生理活性、酵素活性、前記各活性を支持するためのタンパク質としての立体構造など）の維持、容器への吸着防止、防腐能力の維持などがあげられる。 When the protein to be preserved is stored in a liquid state for a long period of time, biological activities (for example, antigenicity to specific antibodies, binding activity to specific binding partners of antibodies and lectins, peptide hormones, etc.) Physiological activity, enzyme activity, three-dimensional structure as a protein to support each of the above-mentioned activities, etc.), adsorption to a container, maintenance of antiseptic ability, and the like.
例えば溶液中の保存対象タンパク質がインスリンの場合、３７℃以上で急速に熱変性すること、および前記溶液を凍結することによっても構造変化が起きることが知られている。構造の変化は血糖降下といった生理活性や抗体に対する抗原性の喪失をもたらすため、高温あるいは凍結・融解条件での構造変化を防ぐための保存手段が必要である。 For example, when the protein to be stored in the solution is insulin, it is known that the structural change also occurs by rapid thermal denaturation at 37 ° C. or higher and by freezing the solution. Since the structural change causes physiological activity such as hypoglycemia and loss of antigenicity to the antibody, a storage means for preventing the structural change at high temperature or under freezing / thawing conditions is necessary.
免疫学的測定方法での使用を意図した保存対象タンパク質の液状での保存方法（抗体の結合活性の維持、特異抗体に対する抗原性の維持などを目的としている）としては、アルブミンを添加する方法が広く使用されている。
特許文献１（ＷＯ９２／０１８０８）には、抗体を液状で保存する方法として、抗体含有溶液にアルブミンを添加する方法が開示されている。
特許文献２（特開昭６１−０７６４２３）には、抗体を液状で保存する方法として、抗体含有溶液に加水分解された卵アルブミンを添加する方法が開示されている。
特許文献３（特開平０６−１８６２３０）には、抗体を液状で保存する方法として、抗体含有溶液にアルブミン及び構造中にナフタレンスルホン酸を含むアゾ系色素を添加する方法が開示されている。
特許文献４（特開２００７−５１４９５４）には、トロポニンＩやＢ型ナトリウム利尿ペプチドといった心臓マーカーポリペプチドを液状で保存する方法として、当該ポリペプチド含有溶液に塩基性側鎖を有する複数のアミノ酸及びアルブミンを添加する方法が開示されている。
As a method for preserving a protein to be preserved in a liquid state intended for use in an immunological measurement method (for the purpose of maintaining the binding activity of an antibody, maintaining the antigenicity of a specific antibody, etc.), a method of adding albumin is used. Widely used.
Patent Document 1 (WO92 / 01808) discloses a method of adding albumin to an antibody-containing solution as a method for storing an antibody in a liquid state.
Patent Document 2 (Japanese Patent Laid-Open No. 61-076423) discloses a method of adding hydrolyzed ovalbumin to an antibody-containing solution as a method for storing the antibody in a liquid state.
Patent Document 3 (Japanese Patent Laid-Open No. 06-186230) discloses a method of adding an azo dye containing albumin and naphthalenesulfonic acid in the structure to the antibody-containing solution as a method for storing the antibody in a liquid state.
In Patent Document 4 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-514554), as a method for storing a cardiac marker polypeptide such as troponin I or B-type natriuretic peptide in a liquid state, a plurality of amino acids having a basic side chain in the polypeptide-containing solution and A method of adding albumin is disclosed.
一方、大腸菌由来の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔとも呼称される。以下「ＢＰＦ」ということがある。）は、免疫学的測定方法における新規なブロッキング用物質として特許文献５（ＷＯ２００５／００３１５５）および非特許文献１に開示され、市販もされている。
特許文献６では、ＢＰＦの配列を含むＤｎａＫのアミノ酸配列３８６番目から６３８番目のポリペプチドを用いて、液状でタンパク質を保存する臨床診断用酵素や抗体、研究用酵素などの保存安定性を向上させる用途への応用について指摘している。しかし、液状でヘキソキナーゼを４５℃、２４時間保存処理した試験では、ＤｎａＫのアミノ酸配列３８６番目から６３８番目のポリペプチドを添加した場合でも、未処理の（変性していない）ヘキソキナーゼに対する相対活性は５０％であり、ＢＳＡ添加または何も添加していないコントロールの４５％と大きな差はなかった。
しかし、保存対象タンパク質を液状で長期間保存する際のＢＰＦの効果（生物活性の維持ほか）について、実際に試験をした報告はない。また、高温や凍結、さらに凍結融解の繰り返しといった、厳しい温度条件でのタンパク質の保存に対するＢＰＦの効果についても報告はない。
On the other hand, the 419th to 607th amino acid sequence of DnaK, which is a heat shock protein (HSP) derived from Escherichia coli (also referred to as “Blocking Peptide Fragment”, hereinafter also referred to as “BPF”) is immunologically measured. As a novel blocking substance in the method, it is disclosed in Patent Document 5 (WO2005 / 003155) and Non-Patent Document 1, and is also commercially available.
According to Patent Document 6, the storage stability of clinical diagnostic enzymes, antibodies, research enzymes, etc. for storing proteins in liquid form is improved by using a polypeptide of amino acids 386 to 638 of DnaK containing the BPF sequence. It points out its application. However, in a test in which hexokinase was stored in a liquid state at 45 ° C. for 24 hours in a liquid state, even when a polypeptide of amino acid sequence 386 to 638 of DnaK was added, the relative activity with respect to untreated (unmodified) hexokinase was 50 %, Which was not significantly different from 45% of the control with BSA added or nothing added.
However, there is no report that actually tested the effect of BPF (maintaining biological activity, etc.) when the protein to be stored is stored in a liquid state for a long period of time. There is no report on the effect of BPF on protein storage under severe temperature conditions such as high temperature, freezing, and repeated freeze-thawing.
本発明の課題は、液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状での保存方法を提供することにある。より詳細な課題のひとつとしては、溶液中の保存対象タンパク質を、保存対象タンパク質を含む溶液を凍結または凍結乾燥をすることなく、流動性のある溶液状態（液状）のまま長期間保存することができるタンパク質液状保存用水溶液と、該水溶液として保存対象タンパク質を長期間保存する方法を提供することが挙げられる。
また、もうひとつのより詳細な課題としては、保存対象タンパク質を含む溶液が高温や凍結といった一般的にタンパク質が変性するとされる条件に晒された場合でも、保存対象タンパク質を安定的に保存するための該タンパク質液状保存用水溶液の使用と該使用によるタンパク質の保存方法を提供することが挙げられる。
An object of the present invention is to provide a protein solution that can be stored in a liquid state and a method for storing the protein solution in a liquid state. One of the more detailed issues is to store a protein to be stored in a solution for a long period of time in a fluid state (liquid state) without freezing or lyophilizing the solution containing the protein to be stored. And a method for preserving a protein to be stored for a long period of time as an aqueous solution.
Another more detailed issue is to stably store the protein to be stored even when the solution containing the protein to be stored is exposed to conditions that generally denature the protein, such as high temperature or freezing. Use of the aqueous solution for preserving protein in a liquid and providing a method for preserving protein by the use.
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies, the present inventors have found that the above problems can be solved by the following means, and have completed the present invention.
すなわち本発明は、以下の構成からなる。
〔１〕容器に充填され、インスリンおよび大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（ＢＰＦ）を含むことを特徴とする、インスリン保存用水溶液。
〔２〕インスリン保存用水溶液中のＢＰＦ濃度が０．０１〜５重量％である前記〔１〕に記載のインスリン保存用水溶液。
〔３〕容器の材質が、ポリプロピレン、ポリスチレン又はガラスのいずれかである前記〔１〕または〔２〕に記載のインスリン保存用水溶液。
〔４〕３７℃で２週間保存した後のインスリンの残存率が９０％以上である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔５〕６０℃で１８時間保存した後のインスリンの残存率が５０％以上である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔６〕１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存した後のインスリンの残存率が９０％以上である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔７〕１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存する保存サイクルを３回繰り返した後のインスリンの残存率が８５％以上である前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のインスリン保存用水溶液。
〔８〕容器に充填され、インスリンおよび大腸菌由来熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるＤｎａＫのアミノ酸配列４１９番目から６０７番目のポリペプチド（ＢＰＦ）を含むことを特徴とする、インスリン凍結保存用水溶液。
〔９〕インスリン含む水溶液の保存方法であって、インスリンを含む水溶液にＢＰＦを添加することを特徴とする前記保存方法。
〔１０〕インスリンを含む水溶液中のインスリンの容器への吸着防止方法であって、ＢＰＦを添加することを特徴とする前記吸着防止方法。
〔１１〕インスリンを含む水溶液中のインスリンの容器への吸着防止剤であって、ＢＰＦを有効成分として含有する前記吸着防止剤。
That is, this invention consists of the following structures.
[1] An aqueous solution for preserving insulin, filled in a container and containing a polypeptide (BPF) of amino acids 419 to 607 of DnaK that is insulin and E. coli-derived heat shock protein (HSP).
[2] The aqueous solution for insulin storage according to [1] above, wherein the BPF concentration in the aqueous solution for insulin storage is 0.01 to 5% by weight.
[3] The aqueous solution for preserving insulin according to [1] or [2], wherein the material of the container is any of polypropylene, polystyrene, or glass.
[4] The aqueous solution for preserving insulin according to any one of [1] to [3], wherein the residual ratio of insulin after storage at 37 ° C. for 2 weeks is 90% or more.
[5] The aqueous solution for preserving insulin according to any one of [1] to [4], wherein the residual ratio of insulin after storage at 60 ° C. for 18 hours is 50% or more.
[6] The aqueous solution for preserving insulin according to any one of [1] to [5] above, wherein the residual ratio of insulin after being frozen and stored for 1 day and then thawed and stored at 37 ° C. for 1 day is 90% or more.
[7] Any one of the above [1] to [6], wherein the residual rate of insulin is 85% or more after three cycles of a storage cycle of thawing and storing at 37 ° C. for 1 day after freezing for 1 day The aqueous solution for insulin storage as described.
[8] An insulin aqueous solution for cryopreservation, which is filled in a container and contains a polypeptide (BPF) of amino acid sequence 419 to 607 of DnaK which is insulin and E. coli-derived heat shock protein (HSP).
[9] A method for storing an aqueous solution containing insulin, wherein BPF is added to the aqueous solution containing insulin.
[10] A method for preventing adsorption of insulin in an aqueous solution containing insulin to a container, wherein BPF is added.
[11] An adsorption inhibitor for insulin in an aqueous solution containing insulin, which contains BPF as an active ingredient.
本発明により、従来技術では達成できなかった保存対象タンパク質の液状での長期間の保存が可能となった。
また、本発明のタンパク質液状保存用水溶液は、保存対象タンパク質を含む液体が高温や凍結といった一般的にタンパク質が変性するとされる条件に晒された場合でも、保存対象タンパク質の安定的な保存に使用することができる。
According to the present invention, it was possible to store a protein to be stored for a long time in a liquid state, which could not be achieved by the prior art.
The aqueous solution for protein storage according to the present invention is used for stable storage of a protein to be stored even when the liquid containing the protein to be stored is exposed to a condition in which the protein is generally denatured such as high temperature or freezing. can do.
以下、本発明のタンパク質液状保存用水溶液（以下「液状保存液」ということがある）及び本発明の保存対象タンパク質を含む水溶液の保存方法（以下「液状保存方法」ということがある）の形態について、保存対象タンパク質が免疫学的測定方法に使用されるものである場合を例に説明する。なお、本発明の液状保存液及び本発明の液状保存方法を総称して「本発明方法等」ということがある。 Hereinafter, the form of the aqueous solution for protein storage of the present invention (hereinafter also referred to as “liquid storage solution”) and the storage method of the aqueous solution containing the protein to be stored of the present invention (hereinafter also referred to as “liquid storage method”) The case where the protein to be preserved is used in an immunological measurement method will be described as an example. The liquid preservation solution of the present invention and the liquid preservation method of the present invention are sometimes collectively referred to as “the method of the present invention”.
（ＢＰＦ）
本発明方法等に使用するＢＰＦは、特許文献５の記載に従い調製することができる。また、市販品（東洋紡社製、カタログ番号ＢＰＦ−３０１）を使用してもよい。本発明方法等における使用濃度としては、保存対象タンパク質を液状で保存しようとする溶液中の濃度として、０．０１〜５％が好適であり、より好適には０．０５〜３％、さらに好適には０．０８〜２％を例示することができる。なお、本明細書中では特に断らない限り％はｗ／ｖ％をしめすものとする。当業者であれば、保存対象タンパク質の性状や濃度（量）などを考慮し、実験的に最適なＢＰＦの濃度を決定することができる。
(BPF)
BPF used in the method of the present invention can be prepared according to the description in Patent Document 5. Commercial products (manufactured by Toyobo, catalog number BPF-301) may also be used. The concentration used in the method of the present invention is preferably 0.01 to 5%, more preferably 0.05 to 3%, and even more preferably as the concentration in the solution in which the protein to be stored is to be stored in liquid form. For example, 0.08 to 2% can be exemplified. In the present specification, unless otherwise specified,% indicates w / v%. A person skilled in the art can determine the optimum BPF concentration experimentally in consideration of the properties and concentration (amount) of the protein to be stored.
（液状保存液の組成）
本発明方法等における液状保存液の組成は、ＢＰＦを有効成分として当該溶液中に含有させる以外、本発明方法等の効果を損なわないこと、保存対象タンパク質の用途に対して妨害的に作用しないことを限度として特に制限はない。保存対象タンパク質を免疫学的測定方法に使用するのであれば、本発明方法等の効果を損なわず、かつ、抗原抗体反応、ビオチン・アビジンによる検出のための標識反応、酵素免疫測定法である場合の酵素反応など、測定系を構成する反応の全部又は一部を妨害しなければよい。免疫学的測定方法において通常使用される各種成分、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸やグッドなどの各種緩衝液、イオン強度や浸透圧を調整するための成分（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ2などの金属塩）、非特異的な反応を抑制するための成分（Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの非イオン性界面活性剤など）、抗原抗体反応を促進する成分（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子など）、ＢＰＦ以外のタンパク質やペプチド（アルブミンやカゼインなど）、アミノ酸、糖類（ショ糖、シクロデキストリンなど）、防腐剤（アジ化ナトリウム、ＰｒｏＣｌｉｎ３００など）などを目的に応じ、適宜選択して使用することができる。
(Composition of liquid preservation solution)
The composition of the liquid preservation solution in the method of the present invention does not impair the effects of the method of the present invention, and does not interfere with the use of the protein to be preserved, except that BPF is contained in the solution as an active ingredient. There is no particular limitation on the limit. If the protein to be preserved is used in an immunological measurement method, the effect of the method of the present invention is not impaired, and it is an antigen-antibody reaction, a labeling reaction for detection with biotin / avidin, an enzyme immunoassay method All or part of the reactions constituting the measurement system, such as the enzyme reaction, may be prevented. Various components commonly used in immunological measurement methods, for example, various buffers such as acetic acid, citric acid, phosphoric acid, tris, glycine, boric acid, carbonic acid, and good, and components for adjusting ionic strength and osmotic pressure (For example, metal salts such as NaCl, KCl, and CaCl 2 ), components for suppressing non-specific reactions (non-ionic surfactants such as Tween 20 and Triton X-100), components that promote antigen-antibody reaction (Polymers such as polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone and phospholipid polymer), proteins and peptides other than BPF (such as albumin and casein), amino acids, sugars (such as sucrose and cyclodextrin), preservatives (sodium azide, ProClin 300) Etc.) can be appropriately selected and used according to the purpose.
（保存対象タンパク質）
本発明方法等が使用可能な保存対象タンパク質は、特に制限はない。インスリンなどのペプチド、シスタチンＣなどの低分子タンパク質、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、アディポネクチンなどの多量体タンパク質、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、抗梅毒抗体などの特異抗体類、酸化ＬＤＬ、ＩＶ型コラーゲン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、マイクロアルブミン、リウマチ因子（ＲＦ）、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、可溶性フィブリン（ＳＦ）、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、プラスミン−インヒビター複合体（ＰＩＣ）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩ、インフルエンザ抗原などを例示できるが、これらに限定されない。
本発明方法等は、インスリンおよびインスリン類似体に対し特に有効である。インスリンとしては、ヒトインスリン以外に、ブタインスリン、ウサギインスリン、などのヒト以外の動物のインスリンも含まれる。インスリン類似体としては、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジンなどが挙げられる。
(Protein to save)
The protein to be stored for which the method of the present invention can be used is not particularly limited. Specific antibodies such as peptides such as insulin, low molecular weight proteins such as cystatin C, multimeric proteins such as CRP (C-reactive protein) and adiponectin, anti-CCP (cyclic citrullinated peptide) antibodies, antiphospholipid antibodies, and anti-syphilis antibodies , Oxidized LDL, type IV collagen, prostate specific antigen (PSA), microalbumin, rheumatoid factor (RF), IgG, IgA, IgM, FDP, D dimer, soluble fibrin (SF), thrombin-antithrombin III complex ( Examples include, but are not limited to, TAT), plasmin-inhibitor complex (PIC), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), blood coagulation factor XIII, pepsinogen I · II, influenza antigen and the like.
The method of the present invention is particularly effective for insulin and insulin analogs. Insulin includes, in addition to human insulin, insulin from non-human animals such as porcine insulin and rabbit insulin. Insulin analogues include insulin lispro, insulin aspart, insulin glargine, insulin detemir, insulin gluridine and the like.
（本発明方法等の具体的な用途）
本発明方法等は、免疫学的測定方法における標準品溶液（濃度較正用基準：キャリブレーター）、精度管理などに用いる管理試料溶液、標識抗体溶液などに好適に使用することができる。また、保存対象タンパク質を含有しない状態の溶液（以下、「ＢＰＦ溶液」ということがある）として調製し、測定試料の希釈液として使用（希釈された後の測定試料は、本発明の液状保存液に含まれる）したり、凍結乾燥されている標準品、管理試料、標識抗体を溶液状態に復元する際に使用（復元された後の標準品溶液、管理試料溶液、標識抗体溶液は、本発明の液状保存液に含まれる）することもできる。
(Specific use of the method of the present invention)
The method of the present invention can be suitably used for a standard solution (concentration calibration standard: calibrator) in an immunological measurement method, a control sample solution used for accuracy control, a labeled antibody solution, and the like. Further, it is prepared as a solution containing no protein to be stored (hereinafter sometimes referred to as “BPF solution”), and used as a diluent for the measurement sample (the diluted measurement sample is the liquid storage solution of the present invention) Or the lyophilized standard product, control sample, or labeled antibody used to restore the solution state (the standard product solution, control sample solution, or labeled antibody solution after restoration is used in the present invention). In a liquid preservation solution).
（本発明方法等に使用する容器）
本発明方法等は、生物学的活性の維持に加え、容器への吸着を防止・抑制する効果も有している。本発明方法等に好適な保存容器の材質としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ガラスを挙げることができる。保存容器の形態としては、ハードタイプまたはソフトタイプのいずれでもよく、アンプル、バイアル、ソフトバッグ、注射型容器などが例示される。
(Container used for the method of the present invention)
The method of the present invention has an effect of preventing / suppressing adsorption to a container in addition to maintaining biological activity. Examples of the material of the storage container suitable for the method of the present invention include polypropylene, polystyrene, and glass. The form of the storage container may be either a hard type or a soft type, and examples include ampoules, vials, soft bags, and injection-type containers.
（吸着防止方法／吸着防止剤）
本発明方法等は、上記のとおり、容器への吸着を防止・抑制する効果も有していることから、本発明の別の態様はタンパク質を含む水溶液中にＢＰＦを添加することによる、当該タンパク質の容器への吸着防止方法である。
また、本吸着防止方法において、ＢＰＦは、タンパク質を含む水溶液中の当該タンパク質の容器への吸着防止剤としての役割を担っている。
(Adsorption prevention method / adsorption inhibitor)
As described above, since the method of the present invention also has the effect of preventing / suppressing adsorption to the container, another aspect of the present invention is to add the protein by adding BPF to the aqueous solution containing the protein. This is a method for preventing the adsorption to the container.
Moreover, in this adsorption | suction prevention method, BPF plays the role as an adsorption | suction prevention agent to the container of the said protein in the aqueous solution containing protein.
（保存安定性／残存率）
本発明の液状保存液は、保存対象タンパク質を長期間安定して保存できることが望ましく、具体的には、インスリンを３７℃で２週間保存した場合、インスリンの残存率が９０％であることがより望ましい。
また、本発明の液状保存液は、高温における保存でも高い安定化効果を有することが望ましく、例えばインスリンを６０℃で１８時間保存した場合、インスリンの残存率が５０％以上であることがより望ましい。
また、本発明の液状保存液は、凍結状態の保存でも高い安定化効果を有することが望ましく、インスリンを凍結後さらに３７℃で保存した場合、インスリンの残存率は９０％以上であることがより望ましい。
さらにまた、本発明の液状保存液は凍結と融解のサイクルを繰り返した後の保存であっても高い安定化効果を有していることが望ましく、インスリンを１日凍結保存した後、融解し３７℃で１日保存する保存サイクルを３回繰り返した場合、インスリンの残存率８５％以上であることがより望ましい。
(Storage stability / Remaining rate)
The liquid storage solution of the present invention desirably stores the protein to be stored stably for a long period of time. Specifically, when insulin is stored at 37 ° C. for 2 weeks, the residual ratio of insulin is preferably 90%. desirable.
The liquid preservation solution of the present invention desirably has a high stabilizing effect even when stored at high temperatures. For example, when insulin is stored at 60 ° C. for 18 hours, the residual ratio of insulin is more preferably 50% or more. .
In addition, it is desirable that the liquid preservation solution of the present invention has a high stabilizing effect even in a frozen state, and when insulin is stored at 37 ° C. after freezing, the residual rate of insulin is more than 90%. desirable.
Furthermore, it is desirable that the liquid preservation solution of the present invention has a high stabilizing effect even when it is preserved after repeating the cycle of freezing and thawing. When the storage cycle of storing at 1 ° C. for 1 day is repeated three times, it is more desirable that the residual rate of insulin is 85% or more.
（凍結保存用水溶液）
本発明のタンパク質液状保存用水溶液は、凍結保存溶液として使用することもできる。インスリンは凍結によって構造変化が起こることが知られているが、本発明の液状保存液で保存した場合、凍結・融解してもインスリンの残存率は非常に高く、本発明の液状保存液は、タンパク質の凍結保存用の水溶液としても有用であることがわかる。特にインスリンの凍結保存用水溶液としての用途が望ましい。また、本発明のタンパク質液状保存用水溶液は、保存対象タンパク質を凍結保存し、その後使用時に解凍して全部あるいは必要量を使用し、その後残余があればこれを凍結し、あるいは液状のまま保存することができる。
(Aqueous solution for cryopreservation)
The protein liquid storage aqueous solution of the present invention can also be used as a cryopreservation solution. Insulin is known to undergo structural changes upon freezing, but when stored in the liquid preservation solution of the present invention, the residual rate of insulin is very high even when frozen and thawed. It turns out that it is useful also as the aqueous solution for the cryopreservation of protein. The use as an aqueous solution for cryopreservation of insulin is particularly desirable. In the protein liquid storage aqueous solution of the present invention, the protein to be stored is stored frozen, and then thawed at the time of use to use all or the necessary amount, and if there is a residue, it is frozen or stored in a liquid state. be able to.
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明を限定するものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited.
〔実施例１〕BPFの保存効果確認試験（１）−インスリン溶液の場合（37℃保存試験）−
インスリンを保存対象タンパク質とし、BPFの液状保存効果をBSAと比較した。
[Example 1] BPF preservation effect confirmation test (1)-Insulin solution (37 ° C storage test)-
Insulin was a protein to be stored, and the liquid storage effect of BPF was compared with BSA.
１．試験材料
（１）BPF溶液A
1％ BPF（東洋紡社製、カタログ番号BPF-301）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例１）
インスリン（シグマ社製）濃度が、0pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1,000pg/mL、5,000pg/mL、10,000pg/mLになるようBPF溶液Aで希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。
1. Test material (1) BPF solution A
A 1% BPF (Toyobo Co., Ltd., catalog number BPF-301) solution (25 mM HEPES buffer (pH 8.2), 0.05 (v / v)% ProClin300 (SUPERCO)) was used.
(2) Insulin liquid preservation solution (Example 1)
Dilute with BPF solution A so that the concentration of insulin (manufactured by Sigma) is 0 pg / mL, 100 pg / mL, 500 pg / mL, 1,000 pg / mL, 5,000 pg / mL, 10,000 pg / mL. A liquid preservation solution of the present invention was prepared.
２．試験方法
（１）保存条件
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL分注した。ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃、2週間保存した。
（２）インスリンの測定
2種類の抗体（国際寄託番号：FERM BP-11233及びFERM BP-11234）を使用するラテックス免疫比濁法（PCT/JP2010/062261、WO2011/010673）により測定した。
PCT/JP2010/062261の実施例１に記載の第一試薬と第二試薬を用い、日立7170形自動分析装置により測定した。具体的には、各濃度のインスリン液状保存液10μLに、第一試薬150μLを加えて37℃で5分間加温後、第二試薬50μLを加えて攪拌し、その後5分間の吸光度変化を、主波長570nm、副波長800nmにて測定した。測定された吸光度の変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線を用いてインスリン濃度に換算した。
（３）インスリン残存率（%）の算出
37℃、2週間保存後の各インスリン液状保存液のインスリン濃度について、次式を用いて、インスリン残存率（%）を算出した。
インスリン残存率(%)＝37℃2週間保存後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）/調製直後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）×100
2. Test Method (1) Storage Conditions 0.5 mL of each concentration of the insulin liquid storage solution was dispensed into a 2.0 mL cryopreservation tube (manufactured by Assist, material: polypropylene). It was stored at 37 ° C for 2 weeks in a heater type incubator (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.).
(2) Measurement of insulin
It was measured by a latex immunoturbidimetric method (PCT / JP2010 / 062261, WO2011 / 010673) using two types of antibodies (international deposit numbers: FERM BP-11233 and FERM BP-11234).
Using the first reagent and the second reagent described in Example 1 of PCT / JP2010 / 062261, measurement was performed with a Hitachi 7170 automatic analyzer. Specifically, 150 μL of the first reagent was added to 10 μL of the insulin liquid stock solution of each concentration and heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then 50 μL of the second reagent was added and stirred. The measurement was performed at a wavelength of 570 nm and a sub wavelength of 800 nm. The measured change in absorbance was converted into insulin concentration using a calibration curve obtained by measuring a standard substance with known concentration.
(3) Calculation of insulin remaining rate (%)
With respect to the insulin concentration of each insulin liquid preservation solution after storage at 37 ° C. for 2 weeks, the residual insulin ratio (%) was calculated using the following formula.
Insulin residual rate (%) = insulin concentration (pg / mL) of insulin liquid preservation solution after storage at 37 ° C for 2 weeks / insulin concentration (pg / mL) of insulin liquid preservation solution immediately after preparation x 100
３．比較例１
BPF溶液Aに代えて、1％ BSA（シグマ社製）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液Aとした以外は、実施例１と同様の操作を行った。
3. Comparative Example 1
Instead of BPF solution A, 1% BSA (Sigma) solution (25 mM HEPES buffer (pH 8.2), 0.05 (v / v)% ProClin300 (SUPERCO)) Except that, the same operation as in Example 1 was performed.
４．試験結果
実施例１、比較例１の試験結果を表１に示した。
BSAを使用する従来の保存液Aで調製した比較例１の2週間経過後のインスリン残存率は、いずれのインスリン濃度においても20%以下の残存率しか示さなかった。一方、BPFを使用する本発明の液状保存液の場合、2週間経過後の残存率はいずれのインスリン濃度においても92%以上を維持しており、従来の保存液Aを使用した場合と比較してはるかに高い残存率を示した。
以上より、本発明の液状保存液は、37℃、2週間という保存対象タンパク質にとっての劣悪条件下での保存においてもインスリンの抗原性の喪失を防止していると考えられ、すぐれた液状保存効果を有していることが確認された。
4). Test Results The test results of Example 1 and Comparative Example 1 are shown in Table 1.
The residual insulin rate after 2 weeks of Comparative Example 1 prepared with the conventional preservation solution A using BSA showed only a residual rate of 20% or less at any insulin concentration. On the other hand, in the case of the liquid preservation solution of the present invention using BPF, the residual rate after 2 weeks is maintained at 92% or more at any insulin concentration, compared with the case where the conventional preservation solution A is used. The survival rate was much higher.
From the above, the liquid storage solution of the present invention is considered to prevent the loss of antigenicity of insulin even in storage under inferior conditions for the protein to be stored at 37 ° C. for 2 weeks, and has an excellent liquid storage effect It was confirmed that
〔実施例２〕BPFの保存効果確認試験（２）−シスタチンC溶液の場合−
シスタチンCを保存対象タンパク質とし、BPFの液状保存効果をBSAと比較した。
[Example 2] BPF preservation effect confirmation test (2) -Cystatin C solution-
Cystatin C was a protein to be stored, and the liquid storage effect of BPF was compared with BSA.
１．試験材料
（１）BPF溶液B
0.1％ BPF（東洋紡社製、カタログ番号BPF-301）溶液（リン酸緩衝液（137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4 （pH7.4））、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用した。
（２）シスタチンC液状保存液（実施例２）
組換えシスタチンC（オリエンタル酵母社製）粉末1mgに生理食塩液1mLを加えシスタチンC原液とした。シスタチンC原液を3mg/LになるようBPF溶液Bで希釈し、保存対象タンパク質をシスタチンCとする本発明の液状保存液を調製した。
1. Test material (1) BPF solution B
0.1% BPF (manufactured by Toyobo, catalog number BPF-301) solution (phosphate buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 , 2 mM KH 2 PO 4 (pH 7.4)), 0.05 (v / v)% ProClin300 (supplied by SUPERCO) was used.
(2) Cystatin C liquid preservation solution (Example 2)
1 mL of physiological saline was added to 1 mg of recombinant cystatin C (manufactured by Oriental Yeast Co.) to give a cystatin C stock solution. The liquid cystatin C stock solution of the present invention was prepared by diluting the cystatin C stock solution with BPF solution B to 3 mg / L and using cystatin C as the protein to be stored.
２．試験方法
（１）保存条件
シスタチンC液状保存液2.0mLをガラス瓶V2（不二硝子社製）（以下、ガラス瓶という）に充填した。これを充填時シスタチンC溶液とした。充填時シスタチンC溶液0.2mLをサンプルカップ（EVER GREEN SCIENTIFIC社製、BMC/Hitachi/Olympus Sample Cups、材質：ポリスチレン）に移し、シスタチンC濃度を測定した。残りの1.8mLが入ったガラス瓶を封栓し、ウェイブローター WR-40（サーモニクス社製）にて、室温、60rpmの条件で15分間回転混和した後、新しいガラス瓶に移した。この操作を2回行い、操作後のシスタチンC液状保存液をガラス瓶保存後シスタチンC溶液とした。ガラス瓶保存後シスタチンC溶液0.2mLを、前記サンプルカップに移し、シスタチンC濃度を測定した。
2. Test Method (1) Storage Conditions 2.0 mL of cystatin C liquid storage solution was filled in a glass bottle V2 (Fuji Glass Co., Ltd.) (hereinafter referred to as a glass bottle). This was designated as cystatin C solution at the time of filling. At the time of filling, 0.2 mL of cystatin C solution was transferred to a sample cup (manufactured by EVER GREEN SCIENTIFIC, BMC / Hitachi / Olympus Sample Cups, material: polystyrene), and cystatin C concentration was measured. The remaining 1.8 mL of the glass bottle was sealed, and the mixture was rotated and mixed for 15 minutes at 60 rpm with room temperature at WR-40 (manufactured by Thermonics) and transferred to a new glass bottle. This operation was performed twice, and the cystatin C liquid storage solution after the operation was stored in a glass bottle and used as a cystatin C solution. After storage in a glass bottle, 0.2 mL of cystatin C solution was transferred to the sample cup, and the cystatin C concentration was measured.
（２）シスタチンCの測定
2種類の抗体を使用するラテックス免疫比濁法（WO2010/064435）により測定した。
WO2010/064435の実施例に記載の第一試薬と第二試薬を用い、日立7170形自動分析装置により測定した。具体的には、充填時シスタチンC溶液あるいはガラス瓶保存後シスタチンC溶液2.4μLに、第一試薬120μLを加えて37℃で5分間加温後、第二試薬120μLを加えて攪拌し、その後5分間の吸光度変化を、主波長570nm、副波長800nmにて測定した。測定された吸光度の変化量を濃度既知の標準物質を測定して得られる検量線を用いてシスタチンC濃度に換算した。
(2) Measurement of cystatin C
It was measured by latex immunoturbidimetry (WO2010 / 064435) using two types of antibodies.
Using the first reagent and the second reagent described in the examples of WO2010 / 064435, measurement was performed with a Hitachi 7170 automatic analyzer. Specifically, after filling the cystatin C solution or glass bottle after filling into 2.4 μL of cystatin C solution, add 120 μL of the first reagent, warm at 37 ° C. for 5 minutes, add 120 μL of the second reagent, and then stir for 5 minutes. Was measured at a main wavelength of 570 nm and a sub wavelength of 800 nm. The measured change in absorbance was converted to cystatin C concentration using a calibration curve obtained by measuring a standard substance with known concentration.
（３）シスタチンC残存率（%）の算出
ガラス瓶充填時及びガラス瓶保存後シスタチンC溶液の濃度から次式を用いて、シスタチンC残存率（％）を算出した。
シスタチンC残存率(%)＝ガラス瓶保存後シスタチンC溶液のシスタチンC濃度（mg/L）/充填時シスタチンC溶液のシスタチンC濃度（mg/L）×100
(3) Calculation of cystatin C residual ratio (%) The cystatin C residual ratio (%) was calculated from the concentration of the cystatin C solution when the glass bottle was filled and after storage in the glass bottle using the following formula.
Cystatin C remaining rate (%) = cystatin C concentration of cystatin C solution (mg / L) after storage in glass bottle / cystatin C concentration of cystatin C solution (mg / L) at filling × 100
３．比較例２
BPF溶液Bに代えて、0.1%BSA（デザートバイオロジカル社製）溶液（リン酸緩衝液（137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4 （pH7.4））、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液Bとした以外は、実施例２と同様の操作を行った。
3. Comparative Example 2
Instead of BPF solution B, 0.1% BSA (manufactured by Desert Biological Corporation) solution (phosphate buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO4, 2 mM KH 2 PO 4 (pH 7.4)), 0.05 ( v / v)% ProClin300 (manufactured by SUPERCO)) was used, and the same operation as in Example 2 was performed except that the conventional stock solution B was used.
４．試験結果
実施例２、比較例２の試験結果を表２に示した。
BSAを使用する従来の保存液B（比較例２）の場合、ガラス瓶保存後のシスタチンCの残存率は87.6%であった。一方、BPFを使用する本発明の液状保存液（実施例２）のガラス瓶保存後の残存率は99.0%であり、従来の保存液Bを使用した場合に対して、きわめて高い残存率を確認することができた。
以上より、BPFは、液状保存時の抗原性の喪失防止効果に加え、容器への非特異吸着防止効果も有していることが確認された。
4). Test results The test results of Example 2 and Comparative Example 2 are shown in Table 2.
In the case of the conventional preservation solution B using BSA (Comparative Example 2), the residual ratio of cystatin C after storage in a glass bottle was 87.6%. On the other hand, the residual ratio of the liquid preservation solution of the present invention using BPF (Example 2) after storage in a glass bottle is 99.0%, confirming a very high residual ratio compared with the case where the conventional preservation liquid B is used. I was able to.
From the above, it was confirmed that BPF also has the effect of preventing nonspecific adsorption to the container in addition to the effect of preventing the loss of antigenicity during liquid storage.
〔実施例３〕BPFの保存効果確認試験（３） −カゼインとの比較−
インスリンを保存対象タンパク質とし、BPFの液状保存効果を、ブロッキング剤として汎用されているカゼインと比較した。
[Example 3] BPF preservation effect confirmation test (3)-Comparison with casein-
Using insulin as a protein to be stored, the liquid storage effect of BPF was compared with casein, which is widely used as a blocking agent.
１．試験材料
（１）BPF溶液A
実施例１に記載のBPF溶液Aを使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例３）
インスリン（シグマ社製）を、濃度が5,000pg/mLになるようBPF溶液Aで希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。
1. Test material (1) BPF solution A
The BPF solution A described in Example 1 was used.
(2) Insulin liquid preservation solution (Example 3)
Insulin (manufactured by Sigma) was diluted with BPF solution A so as to have a concentration of 5,000 pg / mL to prepare a liquid stock solution of the present invention in which the protein to be stored is insulin.
２．試験方法
（１）保存条件
インスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃、9日間保存した。
（２）インスリンの測定およびインスリン残存率（％）の算出
実施例１と同様の測定を行った。また、次式を用いて残存率の算出を行った。
インスリン残存率(%)＝保存後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）/調製直後のインスリン液状保存液のインスリン濃度（pg/mL）×100
なお、本試験では残存率９０％以上を保存安定性ありと判断した。
2. Test method (1) Storage conditions After dispensing 0.5 mL of insulin liquid storage solution into 2.0 mL cryopreservation tube (assist, material: polypropylene) in a heater-type incubator (manufactured by Sanyo Electric) at 37 ° C, Stored for 9 days.
(2) Measurement of insulin and calculation of insulin residual rate (%) The same measurement as in Example 1 was performed. Further, the residual ratio was calculated using the following formula.
Insulin residual rate (%) = Insulin concentration (pg / mL) of stored insulin liquid preservation solution / Insulin concentration (pg / mL) of insulin liquid preservation solution immediately after preparation × 100
In this test, a residual rate of 90% or more was judged as having storage stability.
３．比較例３
BPF溶液Aに代えて、1.0%カゼイン（VWR International Ltd.社製）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液（比較例３）とした以外は、実施例３と同様の測定および残存率の算出を行った。
3. Comparative Example 3
Instead of BPF solution A, 1.0% casein (VWR International Ltd.) solution (25 mM HEPES buffer (pH 8.2), 0.05 (v / v)% ProClin300 (SUPERCO)) is used for conventional storage. Except for the liquid (Comparative Example 3), the same measurement as in Example 3 and calculation of the residual ratio were performed.
４．試験結果
結果を表３に示す。カゼインを使用する従来の保存液（比較例３）の場合、インスリンの抗原性はほぼ失われており、測定不能であった。これよりカゼインを使用する従来の保存液は37℃、9日間という長期間の過酷条件でのタンパク質液状保存に適さないことがわかった。これに対してBPFを使用する本発明の液状保存液（実施例３）では、残存率が90％以上であり、インスリンを安定的に保存できた。
4). Test results The results are shown in Table 3. In the case of a conventional preservation solution (Comparative Example 3) using casein, the antigenicity of insulin was almost lost and could not be measured. From this, it was found that conventional storage solutions using casein are not suitable for protein liquid storage under harsh conditions such as 37 ° C. and 9 days. In contrast, in the liquid preservation solution of the present invention using BPF (Example 3), the residual rate was 90% or more, and insulin could be stably preserved.
〔実施例４〕BPFの保存効果確認試験（４）−ガラス容器でのインスリンの保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし、ガラス容器におけるBPFの液状保存効果をBSA（比較例４−１）、カゼイン（比較例４−２）と比較した。
[Example 4] BPF storage effect confirmation test (4)-Storage stability of insulin in a glass container-
With insulin as a protein to be stored, the liquid storage effect of BPF in a glass container was compared with BSA (Comparative Example 4-1) and Casein (Comparative Example 4-2).
１．試験材料
（１）BPF溶液
0.01、1.0、5.0％ BPF（東洋紡社製、カタログ番号BPF-301）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05(v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例４）
インスリン（シグマ社製）を、濃度が5,000pg/mLになるよう（１）のBPF溶液でそれぞれ希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。
1. Test material (1) BPF solution
0.01, 1.0, 5.0% BPF (Toyobo, catalog number BPF-301) solution (25 mM HEPES buffer (pH 8.2), 0.05 (v / v)% ProClin300 (SUPERCO)) was used.
(2) Insulin liquid preservation solution (Example 4)
Insulin (manufactured by Sigma) was diluted with the BPF solution of (1) so as to have a concentration of 5,000 pg / mL to prepare a liquid preservation solution of the present invention in which the protein to be preserved was insulin.
２．試験方法
インスリン液状保存液をガラス瓶V2（不二硝子社製）に保存した以外は実施例３と同様の試験および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率75％以上を保存安定性ありと判断した。
2. Test Method The same test as in Example 3 and the calculation of the residual ratio were performed except that the liquid insulin storage solution was stored in a glass bottle V2 (Fuji Glass Co., Ltd.).
In this test, a residual rate of 75% or more was judged to have storage stability.
３．比較例
（１）比較例４−１
BPF溶液に代えて、0.01,1.0,5.0％ BSA（シグマ社製）溶液（25mM HEPES緩衝液（pH8.2）、0.05（v/v)% ProClin300（SUPERCO社製））を使用し従来の保存液（比較例４−１）とした以外は実施例４と同様の試験および残存率の算出を行った。
（２）比較例４−２
BPF溶液に代えて、比較例３に記載の1.0%カゼイン（VWR International Ltd.）溶液を使用し従来の保存液（比較例４−２）とした以外は、実施例４と同様の試験および残存率の算出を行った。
3. Comparative Example (1) Comparative Example 4-1
Conventional storage using 0.01,1.0,5.0% BSA (Sigma) solution (25 mM HEPES buffer (pH 8.2), 0.05 (v / v)% ProClin300 (SUPERCO)) instead of BPF solution A test and a residual ratio were calculated in the same manner as in Example 4 except that the liquid (Comparative Example 4-1) was used.
(2) Comparative Example 4-2
The same test and remaining as in Example 4 except that the 1.0% casein (VWR International Ltd.) solution described in Comparative Example 3 was used instead of the BPF solution to obtain a conventional stock solution (Comparative Example 4-2). The rate was calculated.
４．試験結果
結果を表４に示す。BSAを使用する従来の保存液（比較例４−１）の場合、ガラス瓶保存後のインスリンの残存率はいずれも75%以下であった。また、カゼインを使用する従来の保存液（比較例４−２）の場合、測定不能となり、ガラス容器での保存に適さないことが示された。一方、BPFを使用する本発明の液状保存液（実施例４）のガラス瓶保存後の残存率はいずれの濃度で用いた場合も75%以上であり、比較例４−１、比較例４−２に対して、きわめて高い残存率を示した。
4). Test results The results are shown in Table 4. In the case of a conventional preservation solution using BSA (Comparative Example 4-1), the residual rate of insulin after storage in a glass bottle was 75% or less. Moreover, in the case of the conventional preservation | save liquid (Comparative Example 4-2) which uses casein, it became impossible to measure and it was shown that it is not suitable for preservation | save with a glass container. On the other hand, the residual ratio of the liquid preservation solution of the present invention using BPF (Example 4) after storage in a glass bottle is 75% or more when used at any concentration, and Comparative Examples 4-1 and 4-2. In contrast, the survival rate was extremely high.
〔実施例５〕BPFの保存効果確認試験（５）−高温条件での保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし、高温条件におけるBPFの液状保存効果をBSA（比較例５）と比較した。
[Example 5] BPF storage effect confirmation test (5)-Storage stability under high temperature conditions-
Using insulin as a protein to be stored, the liquid storage effect of BPF under high temperature conditions was compared with that of BSA (Comparative Example 5).
１．試験材料
（１）BPF溶液
実施例４に記載のBPF溶液を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例５）
インスリン（シグマ社製）濃度が、1,000pg/mL、5,000pg/mLになるよう（１）のBPF溶液でそれぞれ希釈し、保存対象タンパク質をインスリンとする本発明の液状保存液を調製した。
1. Test Material (1) BPF Solution The BPF solution described in Example 4 was used.
(2) Insulin liquid preservation solution (Example 5)
The liquid preservation solution of the present invention was prepared by diluting the insulin (manufactured by Sigma) with the BPF solution of (1) so that the concentrations of insulin (Sigma) were 1,000 pg / mL and 5,000 pg / mL, respectively.
２．試験方法
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、ヒーター式インキュベーター（エスペック社製）中で60℃18時間保存した以外は実施例３と同様に測定および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率50％以上を保存安定性ありと判断した。
2. Test method Liquid insulin storage solution of each concentration was dispensed in 2.0mL cryopreservation tubes (assist, material: polypropylene) in 0.5mL portions, and then stored in a heater-type incubator (ESPEC) for 18 hours at 60 ° C. Except for the above, the measurement and the residual ratio were calculated in the same manner as in Example 3.
In this test, a residual rate of 50% or more was judged to have storage stability.
３．比較例５
BPF溶液に代えて、比較例４−１に記載のBSAを使用する従来の保存液（比較例５）とした以外は、実施例５と同様の試験および残存率の算出を行った。
3. Comparative Example 5
The test and the residual ratio were calculated in the same manner as in Example 5 except that the conventional preservation solution (Comparative Example 5) using BSA described in Comparative Example 4-1 was used instead of the BPF solution.
４．試験結果
結果を表５に示す。インスリンは37℃以上では速やかに変性が進むことが知られているが、BPFを使用する本発明の液状保存液を用いた場合（実施例５）、いずれの濃度においてもインスリンの残存率は60％以上であり、BSAを使用する従来の保存液（比較例５）と比較して熱に対する高い安定化効果を有していることが示された。
4). Test results The results are shown in Table 5. Insulin is known to rapidly denature at 37 ° C. or higher, but when the liquid preservation solution of the present invention using BPF is used (Example 5), the residual rate of insulin is 60 at any concentration. It was shown that it has a high stabilization effect against heat compared with the conventional preservation solution using BSA (Comparative Example 5).
〔実施例６〕BPFの保存効果確認試験（６）−凍結融解条件に対する保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし温度変化に対するBPFの液状保存効果をBSA（比較例６）と比較した。
[Example 6] BPF storage effect confirmation test (6)-Storage stability against freeze-thaw conditions-
Using insulin as a protein to be stored, the liquid storage effect of BPF against temperature change was compared with BSA (Comparative Example 6).
１．試験材料
（１）BPF溶液
実施例４に記載のBPF溶液を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例６）
実施例５に記載のインスリン液状保存液を使用した。
1. Test Material (1) BPF Solution The BPF solution described in Example 4 was used.
(2) Insulin liquid preservation solution (Example 6)
The insulin liquid preservation solution described in Example 5 was used.
２．試験方法
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、バイオメディカルフリーザ（三洋電機社製）中で-30℃1日凍結保存したあと、ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃1日保存した以外は実施例３と同様に測定および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率90％以上を保存安定性ありと判断した。
2. Test method Insulin liquid stock solutions of various concentrations are dispensed in 0.5 mL aliquots into 2.0 mL cryopreservation tubes (made by Assist, material: polypropylene), and then -30 ° C for 1 day in a biomedical freezer (Sanyo Electric). After cryopreserving, the measurement and the residual ratio were calculated in the same manner as in Example 3 except that the sample was stored at 37 ° C. for 1 day in a heater type incubator (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.).
In this test, a residual rate of 90% or more was judged to have storage stability.
３．比較例６
BPF溶液に代えて、比較例４−１に記載のBSAを使用する従来の保存液（比較例６）とした以外は、実施例６と同様に試験および残存率の算出を行った。
3. Comparative Example 6
The test and the residual ratio were calculated in the same manner as in Example 6 except that the conventional storage solution (Comparative Example 6) using BSA described in Comparative Example 4-1 was used instead of the BPF solution.
４．試験結果
結果を表６に示す。インスリンは凍結によって構造変化が起こることが知られているが、BPFを使用する本発明の液状保存液（実施例６）では、凍結後さらに37℃で保存してもインスリンの残存率は90％以上であった。
BSAを使用する従来の保存液（比較例５）は、BSAの添加濃度によっては高い残存率を示したが、高濃度で用いた場合には残存率が著しく低下し、安定的な保存に適さないことがわかった。
4). Test results The results are shown in Table 6. Insulin is known to undergo structural changes upon freezing. However, in the liquid preservation solution of the present invention using BPF (Example 6), the residual rate of insulin is 90% even when stored at 37 ° C. after freezing. That was all.
The conventional storage solution using BSA (Comparative Example 5) showed a high residual rate depending on the concentration of BSA added, but the residual rate was significantly reduced when used at a high concentration, and is suitable for stable storage. I knew it was n’t there.
〔実施例７〕BPFの保存効果確認試験（７）−凍結融解に対する保存安定性−
インスリンを保存対象タンパク質とし、凍結融解に対するBPFの液状保存効果をBSA（比較例７）と比較した。
[Example 7] Preservation effect confirmation test of BPF (7)-Storage stability against freezing and thawing-
Using insulin as a protein to be preserved, the liquid preservation effect of BPF on freezing and thawing was compared with BSA (Comparative Example 7).
１．試験材料
（１）BPF溶液
実施例４に記載のBPF溶液を使用した。
（２）インスリン液状保存液（実施例７）
実施例５に記載のインスリン液状保存液を使用した。
1. Test Material (1) BPF Solution The BPF solution described in Example 4 was used.
(2) Insulin liquid preservation solution (Example 7)
The insulin liquid preservation solution described in Example 5 was used.
２．試験方法
各濃度のインスリン液状保存液を2.0mL凍結保存チューブ（アシスト社製、材質：ポリプロピレン）に、0.5mL小分け分注したあと、バイオメディカルフリーザ（三洋電機社製）中で-30℃1日凍結保存したあと、ヒーター式インキュベーター（三洋電機社製）中で37℃1日保存した。このサイクルを3回おこなった以外は実施例３と同様に測定および残存率の算出を行った。
なお、本試験では、残存率85％以上を保存安定性ありと判断した。
2. Test method Insulin liquid stock solutions of various concentrations are dispensed in 0.5 mL aliquots into 2.0 mL cryopreservation tubes (made by Assist, material: polypropylene), and then -30 ° C for 1 day in a biomedical freezer (Sanyo Electric). After freezing, it was stored at 37 ° C. for 1 day in a heater type incubator (manufactured by Sanyo Electric Co., Ltd.). The measurement and the residual ratio were calculated in the same manner as in Example 3 except that this cycle was performed three times.
In this test, a residual rate of 85% or more was judged to be storage stable.
３．比較例７
BPF溶液に代えて、比較例４−１に記載のBSAを使用する従来の保存液（比較例７）とした以外は、実施例７と同様に試験および残存率の算出を行った。
3. Comparative Example 7
The test and the residual ratio were calculated in the same manner as in Example 7 except that the conventional preservation solution (Comparative Example 7) using BSA described in Comparative Example 4-1 was used instead of the BPF solution.
４．試験結果
結果を表7に示す。BPFを使用する本発明の液状保存液を用いた場合（実施例７）、凍結融解を３回繰り返す過酷試験後でも、残存率85％以上の高いインスリンの残存率を示した。一方、0.01％または1.0％BSAを使用する従来の保存液を用いた場合（比較例７）、凍結融解１回の条件（比較例６）ではインスリン残存率75.0％以上であったが、凍結融解を３回繰り返すより過酷な条件では残存率が低下した。BSAを使用する従来の保存液は分注したインスリンを凍結保存し、融解して使いきるような場合には適用可能であるが、１本の試薬を繰り返し凍結融解して使用するような場合には不適であると考えられる。本発明の液状保存液は、凍結と融解が長期に繰り返される条件下で用いた場合でも、タンパク質を安定的に保存可能である。
4). Test results The results are shown in Table 7. When the liquid preservation solution of the present invention using BPF was used (Example 7), even after a severe test in which freeze-thawing was repeated three times, a high insulin residual rate of 85% or more was shown. On the other hand, when a conventional preservation solution using 0.01% or 1.0% BSA was used (Comparative Example 7), the residual insulin rate was 75.0% or more under the condition of one freeze-thaw (Comparative Example 6). The residual rate decreased under severer conditions than repeating 3 times. The conventional preservation solution using BSA can be applied to the case where the dispensed insulin is stored frozen and thawed and used, but in the case where one reagent is repeatedly frozen and thawed. Is considered inappropriate. The liquid preservation solution of the present invention can stably preserve proteins even when used under conditions where freezing and thawing are repeated for a long time.
本発明により、液状保存可能なタンパク質溶液及びタンパク質溶液の液状保存方法が提供される。
本発明により、保存対象タンパク質を含む溶液を凍結したり、凍結乾燥をすることなく、流動性のある溶液状態（液状）のまま長期間保存することが可能になる。
また、本発明により、保存対象タンパク質を高温や凍結状態に晒した後、または凍結・融解を繰り返した後であっても安定した保存対象タンパク質溶液を提供することが可能となる。
さらにまた、本発明の液状保存溶液は、凍結保存溶液としての使用も可能である。
The present invention provides a protein solution that can be stored in a liquid state and a method for storing the protein solution in a liquid state.
According to the present invention, a solution containing a protein to be stored can be stored for a long period of time in a fluid state (liquid state) without freezing or lyophilization.
Further, according to the present invention, it is possible to provide a stable protein solution to be stored even after the protein to be stored is exposed to a high temperature or a frozen state, or even after repeated freezing and thawing.
Furthermore, the liquid preservation solution of the present invention can be used as a cryopreservation solution.
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