JP2012090574A - METHOD FOR PRODUCING γδT-CELL, AND PHARMACEUTICAL - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、γδＴ細胞の製造方法およびγδＴ細胞を含有する医薬に関する。 The present invention relates to a method for producing γδT cells and a medicament containing γδT cells.
がん（悪性腫瘍）は、１９８１年から日本における死亡原因のトップとなっている。がんの治療法としては、外科療法、化学療法、放射線療法の三大療法がよく知られているが、近年、第４の治療法として免疫細胞療法が注目されている。免疫細胞療法とは、患者の体外で増殖および活性化させた免疫細胞を患者に投与し、その免疫細胞にがん細胞を攻撃させる治療法である。免疫細胞療法は、三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有している。 Cancer (malignant tumor) has been the top cause of death in Japan since 1981. As cancer treatment methods, three major therapies of surgery, chemotherapy, and radiation therapy are well known, but in recent years, immune cell therapy has attracted attention as the fourth treatment method. Immune cell therapy is a treatment method in which immune cells grown and activated outside a patient's body are administered to the patient, and the immune cells attack cancer cells. Immunocell therapy has the advantage of having few side effects compared to the three major therapies.
免疫細胞療法には様々な種類の治療法があるが、その一つとしてγδＴ細胞療法がある。γδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞であり、がん細胞に対して細胞障害活性を有することが知られている。γδＴ細胞療法は、患者由来のγδＴ細胞を体外で増殖および活性化させた後、調製されたγδＴ細胞を患者の体内に戻す治療法である。 There are various types of immune cell therapy, one of which is γδ T cell therapy. γδ T cells are cells responsible for innate immunity and are known to have cytotoxic activity against cancer cells. γδ T cell therapy is a treatment method in which γδ T cells derived from a patient are expanded and activated outside the body, and then the prepared γδ T cells are returned to the body of the patient.
γδＴ細胞療法では、患者の末梢血から得られた末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cells；以下「ＰＢＭＣｓ」と略記する）を細胞源として、γδＴ細胞を増殖および活性化させる。しかしながら、γδＴ細胞は、末梢血中に１〜５％程度しか存在しないため、患者から少量の末梢血を採取しても、治療に十分な数のγδＴ細胞を調製できないおそれがある。したがって、γδＴ細胞療法では、ＰＢＭＣｓを細胞源として、γδＴ細胞を効率的に増殖および活性化させることができる培養方法を確立することが重要である。そのような培養方法としては、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（Interleukin-2；以下「ＩＬ−２」と略記する）を培養液に添加する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。 In γδ T cell therapy, γδ T cells are proliferated and activated using peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as “PBMCs”) obtained from the peripheral blood of a patient as a cell source. However, since γδ T cells are present only in about 1 to 5% in peripheral blood, even if a small amount of peripheral blood is collected from a patient, there is a possibility that a sufficient number of γδ T cells cannot be prepared for treatment. Therefore, in γδT cell therapy, it is important to establish a culture method that can efficiently proliferate and activate γδT cells using PBMCs as a cell source. As such a culture method, a method of adding a bisphosphonate bone metabolism improving agent and interleukin-2 (hereinafter abbreviated as “IL-2”) to a culture solution has been proposed (for example, patents). Reference 1).
一方、現在、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（human T-cell leukemia virus type-1；以下「ＨＴＬＶ−１」と略記する）の感染者は、日本に約１００万人以上存在し、世界に２０００万人以上存在する。感染者の一部は、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（HTLV-I associated myelopathy；以下「ＨＡＭ」と略記する）を発病する（発病率：約０.３％）。また、感染者の別の一部は、成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell leukemia；以下「ＡＴＬ」と略記する）を発病する（発病率：約５％）。 On the other hand, there are currently over 1 million people infected with human T-cell leukemia virus type-1 (hereinafter abbreviated as “HTLV-1”) in Japan, and 2000 worldwide. There are more than 10,000 people. Some infected people develop HTLV-I associated myelopathy (hereinafter abbreviated as “HAM”) (onset rate: about 0.3%). Another part of the infected person develops adult T-cell leukemia (hereinafter abbreviated as “ATL”) (onset rate: about 5%).
ＨＡＭおよびＡＴＬは、体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数が増加すると発病しやすくなることが知られている。したがって、ＨＴＬＶ−１感染者（キャリア）の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬの発病を予防できると期待される。同様に、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療できると期待される。しかしながら、現在のところ、ＨＡＭおよびＡＴＬに対する有効な予防法および治療法は確立されておらず、一刻も早い予防法および治療法の開発が切望されている。 HAM and ATL are known to become more susceptible to disease when the number of HTLV-1-infected cells in the body increases. Therefore, if the number of HTLV-1-infected cells in the body of an HTLV-1-infected person (carrier) can be reduced, it is expected that the onset of HAM and ATL can be prevented. Similarly, it is expected that HAM and ATL can be treated if the number of HTLV-1 infected cells in HAM and ATL patients can be reduced. However, at present, effective prevention methods and treatment methods for HAM and ATL have not been established, and development of prevention methods and treatment methods as soon as possible is eagerly desired.
ＨＴＬＶ−１感染者が、ＡＴＬ以外のがんまたは感染症に罹患した場合、がんまたは感染症を治療するために免疫細胞療法を実施することが考えられる。しかしながら、従来の免疫細胞の培養方法では、試験管内においてＨＴＬＶ−１の感染が拡大してしまうおそれがある。このようにして調製されたＨＴＬＶ−１感染細胞を含む細胞集団を患者（ＨＴＬＶ−１感染者）に戻すと、患者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数が増加してしまうおそれがある。以上のことから、ＨＴＬＶ−１感染者に対しては、γδＴ細胞療法などの免疫細胞療法を実施することができなかった。 When an HTLV-1 infected person suffers from a cancer or infection other than ATL, it is conceivable to perform immune cell therapy to treat the cancer or infection. However, in the conventional immune cell culture method, HTLV-1 infection may spread in a test tube. When the cell population containing HTLV-1 infected cells prepared in this way is returned to the patient (HTLV-1 infected person), the number of HTLV-1 infected cells in the patient's body may increase. From the above, immune cell therapy such as γδ T cell therapy could not be performed on HTLV-1 infected persons.
また、前述の通り、ＨＴＬＶ−１感染者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防することができると期待される。ＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させる手法としては、上述の免疫細胞療法を実施することが考えられる。しかしながら、ＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させる免疫細胞療法は、まだ確立されていない。 Further, as described above, if the number of HTLV-1-infected cells in the body of an HTLV-1-infected person can be reduced, it is expected that HAM and ATL can be treated or prevented. As a technique for reducing the number of HTLV-1-infected cells, it is conceivable to perform the above-described immune cell therapy. However, immune cell therapy that reduces the number of HTLV-1 infected cells has not yet been established.
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる、γδＴ細胞の製造方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above point, and even when PBMCs derived from an HTLV-1 infected person are used as a cell source, the HTLV-1 infected cell is hardly contained and a large amount of γδT cells are contained. It is an object of the present invention to provide a method for producing γδT cells, which can obtain a cell population contained in
また、本発明は、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a medicament for treating or preventing cancer or an infectious disease, which contains a cell population containing almost no HTLV-1 infected cells and containing a large amount of γδT cells. .
また、本発明は、ＨＴＬＶ−１の感染に起因するＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防するための医薬を提供することを目的とする。 It is another object of the present invention to provide a medicament for treating or preventing HAM and ATL caused by HTLV-1 infection.
本発明者は、γδＴ細胞を増殖させる前に、細胞源となるＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去することで、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得られることを見出した。また、本発明者は、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞（白血病細胞を含む）に対して細胞傷害活性を有することも見出した。本発明者は、これらの知見を基にしてさらに検討を加えて本発明を完成させた。 The present inventor can obtain a cell population containing almost no HTLV-1-infected cells and a large amount of γδT cells by removing CD4 + cells from PBMCs as a cell source before expanding γδT cells. I found out. The present inventors have also found that γδT cells have cytotoxic activity against HTLV-1-infected cells (including leukemia cells). The present inventor has further studied based on these findings and completed the present invention.
すなわち、本発明の第１は、以下のγδＴ細胞の製造方法に関する。
［１］末梢血単核球を準備するステップと；前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと；前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと；を含む、γδＴ細胞の製造方法。
［２］前記表面マーカーは、ＣＤ４である、［１］に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［３］前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、［１］または［２］に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［４］前記細胞懸濁液中における前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内であり；前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の製造方法。
［５］前記ビスホスホネート系骨代謝改善薬は、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の製造方法。
Specifically, the first of the present invention relates to the following method for producing γδT cells.
[1] preparing peripheral blood mononuclear cells; cells expressing one or more surface markers selected from the group consisting of CD4, CCR4, TSLC1, and CD25 from the peripheral blood mononuclear cells Removing, and adding a bisphosphonate bone metabolism improving agent and interleukin-2 to a cell suspension containing peripheral blood mononuclear cells from which cells expressing the surface marker have been removed, and culturing γδT cells And a method for producing γδ T cells.
[2] The method for producing γδ T cells according to [1], wherein the surface marker is CD4.
[3] The method for producing γδ T cells according to [1] or [2], wherein the peripheral blood mononuclear cells are obtained from peripheral blood of an HTLV-1 infected person.
[4] The concentration of the bisphosphonate bone metabolism improving drug in the cell suspension is in the range of 0.05 to 100 μM; the concentration of the interleukin-2 in the cell suspension is 50 to The method for producing γδT cells according to any one of [1] to [3], which is within a range of 2000 U / mL.
[5] The bisphosphonate bone metabolism improving agent is pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid, or a salt thereof, or a hydrate thereof. [1] ] The manufacturing method of (gamma) delta T cell as described in any one of [4].
また、本発明の第２は、以下の医薬に関する。
［６］末梢血単核球を準備するステップと；前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと；前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと；を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬。
［７］前記表面マーカーは、ＣＤ４である、［６］に記載の医薬。
［８］前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ−１の感染者の末梢血から得られたものである、［６］または［７］に記載の医薬。
［９］ＨＴＬＶ−１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病を治療または予防するための医薬である、［８］に記載の医薬。
Moreover, 2nd of this invention is related with the following pharmaceuticals.
[6] A step of preparing peripheral blood mononuclear cells; cells expressing one or more surface markers selected from the group consisting of CD4, CCR4, TSLC1, and CD25 from the peripheral blood mononuclear cells Removing, and adding a bisphosphonate bone metabolism improving agent and interleukin-2 to a cell suspension containing peripheral blood mononuclear cells from which cells expressing the surface marker have been removed, and culturing γδT cells A medicament for treating or preventing cancer or an infectious disease, comprising γδT cells produced by a method for producing γδT cells.
[7] The medicament according to [6], wherein the surface marker is CD4.
[8] The medicament according to [6] or [7], wherein the peripheral blood mononuclear cells are obtained from peripheral blood of an HTLV-1 infected person.
[9] The medicament according to [8], which is a medicament for treating or preventing HTLV-1-related myelopathy or adult T-cell leukemia.
本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。したがって、本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬を製造することができる。本発明の医薬は、特に、ＨＴＬＶ−１感染者に対してγδＴ細胞療法を行う際に有用である。 According to the production method of the present invention, even when PBMCs derived from an HTLV-1 infected person are used, a cell population containing almost no HTLV-1 infected cells and containing a large amount of γδT cells can be obtained. . Therefore, according to the production method of the present invention, a medicament for treating or preventing cancer or an infectious disease, which contains a cell population containing almost no HTLV-1 infected cells and containing a large amount of γδT cells, is produced. be able to. The medicament of the present invention is particularly useful when γδ T cell therapy is performed on an HTLV-1 infected person.
１．γδＴ細胞の製造方法
本発明のγδＴ細胞の製造方法は、１）末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する第１のステップと、２）前記ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去する第２のステップと、３）残余のＰＢＭＣｓを懸濁した細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して、γδＴ細胞を培養する第３のステップとを含む。
1. Method for Producing γδT Cell The method for producing γδT cell of the present invention comprises 1) a first step of preparing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and 2) a cell expressing a predetermined surface marker from the PBMCs. A second step of removing, and 3) adding a bisphosphonate bone metabolism improving agent and interleukin-2 (IL-2) to the cell suspension in which the remaining PBMCs are suspended, and cultivating γδT cells. Steps.
本発明のγδＴ細胞の製造方法は、第２のステップにおいて、ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去することを一つの特徴とする。以下、各ステップについて説明する。 One feature of the method for producing γδT cells of the present invention is that, in the second step, cells expressing a predetermined surface marker are removed from PBMCs. Hereinafter, each step will be described.
第１のステップでは、γδＴ細胞の細胞源となる末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する。ここで「末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）」とは、末梢血から分離された、リンパ球（ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、γδＴ細胞など）、単球および樹状細胞を含む細胞集団を意味する。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。たとえば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心することで、ＰＢＭＣｓを得ることができる。採血量は、γδＴ細胞療法を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば４５〜７５ｍＬ程度である。 In the first step, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) serving as a cell source of γδT cells are prepared. Here, “peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)” refers to a cell population containing lymphocytes (natural killer cells, natural killer T cells, γδ T cells, etc.), monocytes and dendritic cells isolated from peripheral blood. means. The method for preparing PBMCs is not particularly limited. For example, PBMCs can be obtained by subjecting peripheral blood obtained by blood collection to density gradient centrifugation. The amount of blood collected may be set as appropriate according to the patient undergoing γδT cell therapy, and is, for example, about 45 to 75 mL.
第２のステップでは、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓから、ＣＤ４、ＣＣＲ４（C-C chemokine receptor 4）、ＴＳＬＣ１（Tumor suppressor in lung cancer 1）およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去する。 In the second step, one or more surfaces selected from the group consisting of CD4, CCR4 (CC chemokine receptor 4), TSLC1 (Tumor suppressor in lung cancer 1) and CD25 from the PBMCs prepared in the first step. Remove cells expressing the marker.
ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５は、ＨＴＬＶ−１感染細胞において発現することが知られている表面マーカーである。したがって、これらの表面マーカーを発現している細胞を除去することで、仮にＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ−１感染細胞が含まれていたとしても、ＰＢＭＣｓ中のＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんどすべて除去することができる（実施例参照）。これらの表面マーカーは、単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。たとえば、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞、ＣＣＲ４＋細胞またはＴＳＬＣ１＋細胞を除去してもよいし、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を除去してもよい。 CD4, CCR4, TSLC1 and CD25 are surface markers known to be expressed in HTLV-1 infected cells. Therefore, by removing cells expressing these surface markers, it is possible to remove almost all HTLV-1-infected cells in PBMCs even if HTLV-1-infected cells are contained in PBMCs. Yes (see examples). These surface markers may be used alone or in combination of two or more. For example, CD4 + cells, CCR4 + cells or TSLC1 + cells may be removed from PBMCs, or CD4 + CD25 + cells may be removed from PBMCs.
ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択すればよい。ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法の例には、磁気細胞分離法、フローサイトメトリーなどが含まれる。 The method for removing cells expressing the surface marker from PBMCs is not particularly limited, and may be appropriately selected from known methods. Examples of the method for removing cells expressing the surface marker from PBMCs include magnetic cell separation, flow cytometry, and the like.
第３のステップでは、第２のステップにおいて所定の表面マーカーを発現している細胞を除去した後のＰＢＭＣｓを培養液（培地）に懸濁し、得られた細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加して、γδＴ細胞を培養する。ＰＢＭＣｓをビスホスホネート系骨代謝改善薬およびＩＬ−２の存在下で培養することにより、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化γδＴ細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる（特許文献１参照）。 In the third step, PBMCs after removing cells expressing a predetermined surface marker in the second step are suspended in a culture solution (medium), and the resulting cell suspension is improved in bisphosphonate bone metabolism. Drugs and interleukin-2 (IL-2) are added and γδ T cells are cultured. By culturing PBMCs in the presence of a bisphosphonate bone metabolism improving agent and IL-2, γδT cells can be selectively proliferated and activated to prepare a cell population containing activated γδT cells with high purity. Yes (see Patent Document 1).
ＰＢＭＣｓを懸濁させる培養液（培地）の種類は、γδＴ細胞を増殖させることができれば特に限定されない。そのような培養液の例には、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地が含まれる。これらの培養液には、必要に応じて血清を添加してもよい。添加される血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ＡＢ血清、自己血漿が含まれる。 The type of the culture solution (medium) in which PBMCs are suspended is not particularly limited as long as γδT cells can be grown. Examples of such a culture solution include AIM-V medium, RPMI-1640 medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), and Iskov medium. Serum may be added to these culture solutions as necessary. Examples of added serum include fetal calf serum (FCS), AB serum, and autologous plasma.
ビスホスホネート系骨代謝改善薬の種類は、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されているものであれば特に限定されない。ビスホスホネート系骨代謝改善薬の例には、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が含まれる。これらの中では、窒素原子を有するアミノビスホスホネートである、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が特に好ましい。市販されているビスホスホネート系骨代謝改善薬としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム五水和物（アレディア；ノバルティスファーマ株式会社）、ゾレドロン酸水和物（ゾメタ；ノバルティスファーマ株式会社）などが挙げられる。 The type of bisphosphonate bone metabolism-improving drug is not particularly limited as long as it has a bone resorption suppressing action and is generally used as a therapeutic drug for osteoporosis. Examples of bisphosphonate bone metabolism improving agents include pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, etidronic acid and salts thereof, and hydrates thereof. Among these, pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid and their salts, and their hydrates, which are aminobisphosphonates having a nitrogen atom, are particularly preferred. Examples of commercially available bisphosphonate bone metabolism improving drugs include pamidronate disodium pentahydrate (Aledia; Novartis Pharma Co., Ltd.), zoledronic acid hydrate (Zometa; Novartis Pharma Co., Ltd.), and the like.
細胞懸濁液中におけるビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.０５〜１００μＭの範囲内が好ましく、０.１〜３０μＭの範囲内がより好ましい。より具体的には、ビスホスホネート系骨代謝改善薬としてアレンドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、１〜３０μＭの範囲内が好ましい。また、ビスホスホネート系骨代謝改善薬としてゾレドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネート系骨代謝改善薬の濃度は、０.１〜１０μＭの範囲内が好ましい。 The concentration of the bisphosphonate bone metabolism improving agent in the cell suspension is preferably in the range of 0.05 to 100 μM, and more preferably in the range of 0.1 to 30 μM. More specifically, when alendronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof is added as a bisphosphonate bone metabolism improving agent, the concentration of the bisphosphonate bone metabolism improving agent is preferably in the range of 1 to 30 μM. In addition, when zoledronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof is added as a bisphosphonate bone metabolism improving agent, the concentration of the bisphosphonate bone metabolism improving agent is preferably within a range of 0.1 to 10 μM.
細胞懸濁液中におけるＩＬ−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内が好ましく、４００〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲内がより好ましい。 The concentration of IL-2 in the cell suspension is preferably in the range of 50 to 2000 U / mL, and more preferably in the range of 400 to 1000 U / mL.
ＰＢＭＣｓの培養条件は、γδＴ細胞を増殖および活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４〜３８℃（好ましくは３７℃）かつ２〜１０％（好ましくは５％）ＣＯ２存在下で、７〜１４日程度培養すればよい。 The culture conditions for PBMCs are not particularly limited as long as γδT cells can be grown and activated. Usually, it may be cultured for about 7 to 14 days in the presence of 34 to 38 ° C. (preferably 37 ° C.) and 2 to 10% (preferably 5%) CO 2 .
以上の手順により、γδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細胞集団は、後述するようにγδＴ細胞療法において患者に移植する細胞として利用することができる。 By the above procedure, a cell population containing a large amount of γδT cells can be obtained. The obtained cell population can be used as cells to be transplanted into a patient in γδ T cell therapy as described later.
本発明のγδＴ細胞の製造方法では、第２のステップにおいてＨＴＬＶ−１感染細胞を除去することから、第１のステップにおいて準備するＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ−１感染細胞が含まれていても特に問題とならない。したがって、本発明のγδＴ細胞の製造方法は、第１のステップにおいて準備するＰＢＭＣｓがＨＴＬＶ−１感染者の末梢血由来のものであってもよい。本発明のγδＴ細胞の製造方法を用いれば、ＨＴＬＶ−１感染者の末梢血由来のＰＢＭＣｓを用いてもＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を製造することができる。 In the method for producing γδT cells of the present invention, since HTLV-1-infected cells are removed in the second step, even if HTLV-1-infected cells are contained in the PBMCs prepared in the first step, Don't be. Therefore, in the method for producing γδT cells of the present invention, the PBMCs prepared in the first step may be derived from peripheral blood of an HTLV-1-infected person. By using the method for producing γδT cells of the present invention, a cell population containing almost no HTLV-1 infected cells and containing a large amount of γδT cells even if PBMCs derived from peripheral blood of HTLV-1 infected patients are used. Can do.
２．γδＴ細胞を含む医薬
本発明の医薬は、上述の本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬である。
2. Medicament containing γδT cells The medicament of the present invention is a medicament for treating or preventing cancer or an infectious disease containing the cell population produced by the above-described method for producing γδT cells of the present invention.
本発明の医薬は、例えば、本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。 The medicament of the present invention is, for example, an injection (cell suspension) in which a cell population produced by the method for producing γδT cells of the present invention is suspended in a liquid (eg, physiological saline) that can be used as a pharmaceutical product. is there. This injection may be injected intravenously, intradermally, subcutaneously, etc., may be directly injected into a lesion, or may be administered systemically as an infusion.
本発明の医薬は、必須成分として本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。たとえば、本発明の医薬をがんの治療または予防剤として使用する場合は、ＩＬ−２やＩＬ−１２などのサイトカインを添加してもよい。また、本発明の医薬をウイルス感染症の治療または予防剤として使用する場合は、インターフェロンなどを添加してもよい。 The medicament of the present invention contains the cell population produced by the method for producing γδT cells of the present invention as an essential component, but may contain other components as optional components. For example, when the medicament of the present invention is used as an agent for treating or preventing cancer, cytokines such as IL-2 and IL-12 may be added. In addition, when using the medicament of the present invention as a therapeutic or prophylactic agent for viral infection, interferon or the like may be added.
本発明の医薬に含まれるγδＴ細胞の数は、投与方法や疾患の種類、患者の症状などに応じて適宜設定されうる。通常は、１０８〜１０１２個／人（好ましくは１０９個／人）となるように設定すればよい。 The number of γδT cells contained in the medicament of the present invention can be appropriately set according to the administration method, the type of disease, the patient's symptoms, and the like. Usually, it may be set to be 10 8 to 10 12 pieces / person (preferably 10 9 pieces / person).
本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。たとえば、本発明の医薬は、１）本発明のγδＴ細胞の製造方法により得られた細胞集団を遠心分離などにより回収し；２）回収した細胞集団を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄した細胞集団を遠心分離などにより回収し；４）回収した細胞集団を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることで製造されうる。 The method for producing the medicament of the present invention is not particularly limited. For example, the medicament of the present invention is obtained by 1) recovering the cell population obtained by the method for producing γδT cells of the present invention by centrifugation or the like; 2) washing the recovered cell population with a washing solution (eg, physiological saline or PBS). 3) The washed cell population is recovered by centrifugation or the like; 4) The recovered cell population is suspended in a liquid that can be used as a pharmaceutical (for example, physiological saline).
前述の通り、本発明のγδＴ細胞の製造方法により製造された細胞集団は、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む。よって、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ−１感染者に投与しても、体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を増加させることはない。したがって、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ−１感染者に対してγδＴ細胞療法を実施するための医薬として利用されうる。 As described above, the cell population produced by the method for producing γδT cells of the present invention contains almost no HTLV-1-infected cells even when PBMCs derived from HTLV-1 infected individuals are used as a cell source, And it contains a large amount of γδT cells. Therefore, the medicament of the present invention does not increase the number of HTLV-1-infected cells in the body even when administered to an HTLV-1-infected person. Therefore, the medicament of the present invention can be used as a medicament for performing γδT cell therapy for HTLV-1-infected persons.
また、後述する実施例に示されるように、γδＴ細胞は、ＨＴＬＶ−１感染細胞（ＡＴＬ患者の白血病細胞を含む）に対する細胞傷害活性を有する。このことは、本発明者らによって初めて見出されたことである。前述の通り、ＨＴＬＶ−１感染者の体内のＨＴＬＶ−１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防することができると期待される。したがって、本発明の医薬は、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防するための医薬として利用されうる。 In addition, as shown in Examples described later, γδ T cells have cytotoxic activity against HTLV-1-infected cells (including leukemia cells of ATL patients). This was first discovered by the present inventors. As described above, it is expected that HAM and ATL can be treated or prevented if the number of HTLV-1-infected cells in the body of an HTLV-1 infected person can be reduced. Therefore, the medicament of the present invention can be used as a medicament for treating or preventing HAM and ATL.
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail with reference to an Example, this invention is not limited by these Examples.
１．従来の方法によるγδＴ細胞の培養
はじめに、比較例として、従来の方法（ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去しない）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
1. Cultivation of γδT cells by a conventional method First, as a comparative example, an example in which γδT cells are cultured by a conventional method (without removing CD4 + cells from PBMCs) is shown.
（１）γδＴ細胞の培養
抗凝固剤としてヘパリンを使用して、ＨＴＬＶ−１感染者から新鮮血を採取した。得られた血液を遠心分離して、血球成分と血漿成分に分離した。血漿成分は、５６℃で６０分間非働化した後、−８０℃で一旦凍結させた。凍結した血漿を再度溶解させた後、遠心分離して上清を得た。得られた上清は、細胞培養時に自己血漿として用いた。一方、血球成分は、ＰＢＳ（−）で希釈した後、リンパ球分離溶液（ＬＳＭ；コスモ・バイオ株式会社）を用いてＰＢＭＣｓを分離した。分離したＰＢＭＣｓは、ＰＢＳ（−）で洗浄した。
(1) Cultivation of γδ T cells Fresh blood was collected from a person infected with HTLV-1 using heparin as an anticoagulant. The obtained blood was centrifuged to separate a blood cell component and a plasma component. The plasma components were inactivated at 56 ° C for 60 minutes and then frozen at -80 ° C. The frozen plasma was dissolved again and centrifuged to obtain a supernatant. The obtained supernatant was used as autologous plasma during cell culture. On the other hand, the blood cell component was diluted with PBS (−), and then PBMCs were separated using a lymphocyte separation solution (LSM; Cosmo Bio Inc.). The separated PBMCs were washed with PBS (−).
洗浄したＰＢＭＣｓをリンパ球培養用培地（ＡＬｙＳ２０３；株式会社細胞科学研究所）に懸濁して細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を２×１０６ＰＢＭＣｓ／ウェルとなるように２４ウェルマイクロプレートに分注した。次いで、各ウェルに、ＩＬ−２（イムノテック社）、ゾレドロン酸水和物（ゾメタ；ノバルティスファーマ株式会社）および自己血漿を添加した。各成分の終濃度は、ＩＬ−２：１０００Ｕ／ｍＬ、ゾレドロン酸水和物：５μＭ、自己血漿：１０％である。 The washed PBMCs were suspended in a lymphocyte culture medium (ALyS203; Cell Science Laboratory Co., Ltd.) to prepare a cell suspension. The obtained cell suspension was dispensed into 24-well microplates at 2 × 10 6 PBMCs / well. Next, IL-2 (Immunotech), zoledronic acid hydrate (Zometa; Novartis Pharma Co., Ltd.) and autologous plasma were added to each well. The final concentration of each component is IL-2: 1000 U / mL, zoledronic acid hydrate: 5 μM, autologous plasma: 10%.
マイクロプレートをＣＯ２インキュベータ（温度：３７℃、ＣＯ２濃度：５％、湿度：過飽和）内に移し、ＰＢＭＣｓを１４日間培養した。培養期間中、細胞がコンフルエントになるたびに、ＩＬ−２を添加した培地を加えた。また、培地中の血漿濃度が１％を下回らないように、適宜自己血漿を加えた。 The microplate was transferred into a CO 2 incubator (temperature: 37 ° C., CO 2 concentration: 5%, humidity: supersaturated), and PBMCs were cultured for 14 days. During the culture period, whenever cells became confluent, a medium supplemented with IL-2 was added. In addition, autologous plasma was appropriately added so that the plasma concentration in the medium did not fall below 1%.
（２）フローサイトメトリー
培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）の細胞に含まれるγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて測定した。今回の実験では、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＴＣＲ Ｖγ９＋の細胞をγδＴ細胞と判定した。
(2) Flow cytometry The proportion of γδ T cells contained in the cells before culture (day 0) and after culture (day 14) was measured using flow cytometry. In this experiment, CD45 + CD3 + TCR Vγ9 + cells were determined as γδT cells.
フローサイトメーターはＦＣ５００（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、解析ソフトはＣＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。また、抗ＣＤ４５抗体はＥＣＤ標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＣＤ３抗体はＰＣ５標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＴＣＲ Ｖγ９抗体はＦＩＴＣ標識抗ヒトＴＣＲ Ｖγ９抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。 FC500 (Beckman Coulter, Inc.) was used as the flow cytometer, and CXP (Beckman Coulter, Inc.) was used as the analysis software. The anti-CD45 antibody uses an ECD-labeled anti-human CD45 antibody (Beckman Coulter, Inc.), the anti-CD3 antibody uses a PC5-labeled anti-human CD3 antibody (Beckman Coulter, Inc.), and the anti-TCR Vγ9 antibody uses FITC. A labeled anti-human TCR Vγ9 antibody (Beckman Coulter, Inc.) was used.
図１Ａは、ｄａｙ０の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。図１Ｂは、ｄａｙ１４の細胞中のＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ３およびＴＣＲ Ｖγ９の発現パターンを示す２パラメータドットプロットである。これらの図に示されるように、ｄａｙ０の細胞中のγδＴ細胞の割合は３.５％であったのに対し（図１Ａ参照）、ｄａｙ１４の細胞中のγδＴ細胞の割合は６８.５％であった（図１Ｂ参照）。 FIG. 1A is a two parameter dot plot showing the expression pattern of CD3 and TCR Vγ9 in CD45 + cells in day 0 cells. FIG. 1B is a two parameter dot plot showing the expression pattern of CD3 and TCR Vγ9 in CD45 + cells in day14 cells. As shown in these figures, the proportion of γδT cells in day 0 cells was 3.5% (see FIG. 1A), whereas the proportion of γδ T cells in day 14 cells was 68.5%. (See FIG. 1B).
これらの結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としても、ビスホスホネート系骨代謝改善薬およびＩＬ−２を添加した培地中で培養することで、γδＴ細胞を増殖および活性化させうることが示唆される。 From these results, it is possible to proliferate and activate γδ T cells by culturing them in a medium supplemented with bisphosphonate bone metabolism-improving drugs and IL-2 using PBMCs derived from HTLV-1 infected individuals as a cell source. Is suggested.
（３）ＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の測定
培養前の細胞（ｄａｙ０）および培養後の細胞（ｄａｙ１４）について、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量をリアルタイムＰＣＲ法により測定した。
(3) Measurement of provirus amount of HTLV-1 With respect to cells before culture (day 0) and cells after culture (day 14), the amount of provirus of HTLV-1 per 100 cells was measured by a real-time PCR method.
測定対象の細胞集団（ｄａｙ０またはｄａｙ１４の細胞）を溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０），２０ｍＭ ＥＤＴＡ，０.１Ｍ ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ）に懸濁した。得られた細胞懸濁液にプロテイナーゼＫ（和光純薬工業株式会社）を終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、５５℃で一晩振盪した後、フェノールクロロホルムを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＴＬＶ−１のｐＸ領域およびヒトβ−アクチンに対するＴａｑＭａｎプローブ−プライマーセットを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。標準検体を用いて検量線を作成してＨＴＬＶ−１のｐＸ領域およびヒトβ−アクチンの量を算出し、これらの値から１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を算出した。 A cell population to be measured (cells of day 0 or day 14) was suspended in a lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 1% SDS). Proteinase K (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to the obtained cell suspension so that the final concentration is 150 μg / mL, shaken overnight at 55 ° C., and then extracted with genomic DNA using phenol chloroform. did. Real-time PCR was performed using the TaqMan probe-primer set for the pX region of HTLV-1 and human β-actin. A standard curve was prepared using a standard sample to calculate the amount of HTLV-1 pX region and human β-actin, and from these values, the amount of HTLV-1 provirus per 100 cells was calculated.
図２は、ｄａｙ０およびｄａｙ１４の細胞についての、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝４）。このグラフに示されるように、ｄａｙ０の細胞中の平均ウイルス量は３３.２４（コピー／１００細胞）であったのに対し、ｄａｙ１４の細胞中の平均ウイルス量は３.３７（コピー／１００細胞）であった。 FIG. 2 is a graph showing the amount of HTLV-1 provirus per 100 cells for day 0 and day 14 cells (n = 4). As shown in this graph, the average amount of virus in cells at day 0 was 33.24 (copy / 100 cells), whereas the average amount of virus in cells at day 14 was 3.37 (copy / 100 cells). )Met.
この結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を培養すると、γδＴ細胞の増殖に伴いＨＴＬＶ−１感染細胞の割合がある程度減少することがわかる。しかしながら、ＨＴＬＶ−１感染細胞を３％も含む細胞集団は、生体内のウイルス感染細胞数を増加させるおそれがあるため、γδＴ細胞療法に使用することはできない。 From this result, it is understood that when γδT cells are cultured using PBMCs derived from HTLV-1-infected persons as a cell source, the proportion of HTLV-1-infected cells decreases to some extent along with the proliferation of γδT cells. However, a cell population containing as much as 3% of HTLV-1-infected cells cannot increase the number of virus-infected cells in the living body and cannot be used for γδT cell therapy.
２．本発明の方法によるγδＴ細胞の培養
次に、実施例として、本発明の方法（ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去する）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
2. Cultivation of γδT cells by the method of the present invention Next, as an example, examples of culturing γδT cells by the method of the present invention (removing CD4 + cells from PBMCs) are shown.
（１）γδＴ細胞の培養
上記比較例と同様の手順で、ＨＴＬＶ−１感染者の新鮮血から自己血漿およびＰＢＭＣｓを得た。次いで、磁気細胞分離法により、得られたＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去して、ＣＤ４−の細胞集団を得た。具体的には、ＰＢＭＣｓを抗ＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）と反応させた後、反応物をＭＡＣシステムの分離カラム（ミルテニーバイオテク社）に通して、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去した。
(1) Cultivation of γδ T cells Autologous plasma and PBMCs were obtained from fresh blood of HTLV-1 infected patients by the same procedure as in the comparative example. Subsequently, CD4 + cells were removed from the obtained PBMCs by magnetic cell separation to obtain a CD4 − cell population. Specifically, PBMCs were reacted with anti-CD4 microbeads (Miltenyi Biotech), and then the reaction product was passed through a MAC system separation column (Miltenyi Biotech) to remove CD4 + cells from PBMCs.
得られたＣＤ４−の細胞集団を上記比較例と同様の手順で１４日間培養した。その結果、比較例と同様に、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させることができた（図１参照）。 The obtained CD4 − cell population was cultured for 14 days in the same manner as in the comparative example. As a result, similar to the comparative example, γδT cells could be selectively proliferated and activated (see FIG. 1).
（２）ＨＴＬＶ−１のプロウイルス量の測定
培養前の細胞（ｄａｙ０）および培養後の細胞（ｄａｙ１４）について、上記比較例と同様の手順で、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を測定した。
(2) Measurement of provirus amount of HTLV-1 For the cells before culture (day 0) and the cells after culture (day 14), the amount of HTLV-1 provirus per 100 cells was determined by the same procedure as in the comparative example. It was measured.
図３は、ｄａｙ０およびｄａｙ１４の細胞についての、１００細胞あたりのＨＴＬＶ−１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝２）。このグラフに示されるように、ｄａｙ０の細胞中の平均ウイルス量は３０.９６５（コピー／１００細胞）であったのに対し、ｄａｙ１４の細胞中の平均ウイルス量は０.０９５（コピー／１００細胞）であった。 FIG. 3 is a graph showing the amount of HTLV-1 provirus per 100 cells for day 0 and day 14 cells (n = 2). As shown in this graph, the average amount of virus in cells at day 0 was 30.965 (copy / 100 cells), whereas the average amount of virus in cells at day 14 was 0.095 (copy / 100 cells). )Met.
この結果から、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源とする場合であっても、ＣＤ４＋細胞を除去した後に培養すると、ＨＴＬＶ−１感染細胞をほぼ完全に除去した状態でγδＴ細胞を増殖させうることがわかる。このようにＨＴＬＶ−１感染細胞をほとんど含まない細胞集団は、生体内のウイルス感染細胞数を増加させるおそれが低いため、γδＴ細胞療法に使用することができる。 From this result, even when PBMCs derived from an HTLV-1 infected person are used as a cell source, if CD4 + cells are removed and cultured, γδT cells are proliferated in a state where HTLV-1 infected cells are almost completely removed. You can see that As described above, since a cell population containing almost no HTLV-1 infected cells is less likely to increase the number of virus-infected cells in the living body, it can be used for γδT cell therapy.
３．ＨＴＬＶ−１感染細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害活性の測定
上記比較例で示したように、ＨＴＬＶ−１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源としてγδＴ細胞を増殖させたところ、ＨＴＬＶ−１感染細胞の割合がある程度減少した（図２参照）。このことは、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞に対して傷害活性を有することを示唆している。そこで、γδＴ細胞がＨＴＬＶ−１感染細胞に対して傷害活性を有するかどうかを調べた。
3. Measurement of Cytotoxic Activity of γδT Cells against HTLV-1 Infected Cells As shown in the above comparative example, when γδT cells were proliferated using PBMCs derived from HTLV-1 infected cells as a cell source, the ratio of HTLV-1 infected cells Decreased to some extent (see FIG. 2). This suggests that γδT cells have toxic activity against HTLV-1-infected cells. Therefore, it was examined whether γδT cells have a toxic activity against HTLV-1-infected cells.
ターゲット細胞としては、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株「ＨＣＴ−４」およびＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株「ＫＫ−１」を使用した。これらの培養細胞を回収し、細胞膜標識用蛍光色素（ＰＫＨ２６；シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いて染色した。細胞密度は、いずれも２×１０５細胞／ｍＬに調整した。 As target cells, HAM patient-derived HTLV-1 infected cell line “HCT-4” and ATL patient-derived HTLV-1 infected cell line “KK-1” were used. These cultured cells were collected and stained using a fluorescent dye for cell membrane labeling (PKH26; Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.). The cell density was adjusted to 2 × 10 5 cells / mL in all cases.
エフェクター細胞としては、前述のγδＴ細胞の選択的培養（比較例）により得られた、培養１４日目の活性化γδＴ細胞（γδＴ−ＬＡＫ）を含む細胞集団を使用した。また、対照実験として、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−２を用いる培養方法（Takayama T. et al., Lancet, Vol.356, No.9232, pp.802-807.）により得られた、培養１４日目の活性化αβＴ細胞（αβＴ−ＬＡＫ）を含む細胞集団も使用した。細胞密度は、いずれも２×１０５細胞／ｍＬ、１×１０６細胞／ｍＬおよび５×１０６細胞／ｍＬに調整した。 As the effector cells, a cell population containing activated γδT cells (γδT-LAK) on the 14th day of culture obtained by selective culturing of γδT cells (comparative example) described above was used. Further, as a control experiment, 14 days of culture obtained by a culture method using anti-CD3 antibody and IL-2 (Takayama T. et al., Lancet, Vol. 356, No. 9232, pp. 802-807.) A cell population containing eye activated αβ T cells (αβT-LAK) was also used. The cell density was adjusted to 2 × 10 5 cells / mL, 1 × 10 6 cells / mL and 5 × 10 6 cells / mL.
エフェクター細胞の細胞懸濁液とターゲット細胞の細胞懸濁液を混合して共培養を行い、４時間後に細胞を回収した。エフェクター細胞とターゲット細胞との比率は、１：１、５：１または２５：１である。アポトーシス検出キット（ベックマン・コールター株式会社）に含まれるＦＩＴＣ−アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて回収した細胞を染色した。そして、前述のフローサイトメーターを用いてアポトーシスを起こした細胞の割合を測定して、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対するγδＴ細胞の細胞傷害活性を決定した。 The cell suspension of effector cells and the cell suspension of target cells were mixed and co-cultured, and the cells were collected after 4 hours. The ratio of effector cells to target cells is 1: 1, 5: 1 or 25: 1. The recovered cells were stained using FITC-annexin V and propidium iodide contained in an apoptosis detection kit (Beckman Coulter, Inc.). And the ratio of the cell which caused the apoptosis was measured using the above-mentioned flow cytometer, and the cytotoxic activity of γδT cells against HTLV-1 infected cells was determined.
図４Ａは、ＨＣＴ−４（ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株）に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。図４Ｂは、ＫＫ−１（ＡＴＬ患者由来ＨＴＬＶ−１感染細胞株）に対するγδＴ細胞およびαβＴ細胞の細胞傷害活性を示すグラフである。「γδＴ−ＬＡＫ」はγδＴ細胞を示し、「αβＴ−ＬＡＫ」はαβＴ細胞を示す。また、「Ｅ／Ｔ」は、ターゲット細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の割合を意味する FIG. 4A is a graph showing the cytotoxic activity of γδT cells and αβT cells against HCT-4 (HAM patient-derived HTLV-1-infected cell line). FIG. 4B is a graph showing the cytotoxic activity of γδT cells and αβT cells against KK-1 (ATL patient-derived HTLV-1-infected cell line). “ΓδT-LAK” indicates γδT cells, and “αβT-LAK” indicates αβT cells. “E / T” means the ratio of effector cells (E) to target cells (T).
図４Ａおよび図４Ｂのグラフから、γδＴ細胞は、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対する細胞傷害活性がαβＴ細胞に比べて高いことがわかる。このことから、γδＴ細胞療法がＨＡＭおよびＡＬＴの治療および予防に有効であることが示唆される。 From the graphs of FIG. 4A and FIG. 4B, it can be seen that γδT cells have higher cytotoxic activity against HTLV-1-infected cells than αβT cells. This suggests that γδT cell therapy is effective for the treatment and prevention of HAM and ALT.
本発明の製造方法は、例えば、ＨＴＬＶ−１の感染者に対してγδＴ細胞療法を実施する際のγδＴ細胞の培養方法として有用である。また、本発明の医薬は、例えばＨＴＬＶ−１感染者、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者に対してγδＴ細胞療法を実施する際に用いられる医薬として有用である。 The production method of the present invention is useful, for example, as a method for culturing γδT cells when γδT cell therapy is performed on a person infected with HTLV-1. In addition, the medicament of the present invention is useful as a medicament used when, for example, γδT cell therapy is performed on HTLV-1-infected persons, HAM patients, and ATL patients.
Claims (9)
前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと、
前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと、
を含む、γδＴ細胞の製造方法。 Preparing peripheral blood mononuclear cells;
Removing from the peripheral blood mononuclear cells cells expressing one or more surface markers selected from the group consisting of CD4, CCR4, TSLC1 and CD25;
Adding a bisphosphonate-based bone metabolism improving agent and interleukin-2 to a cell suspension containing peripheral blood mononuclear cells from which cells expressing the surface marker have been removed, and culturing γδT cells;
A method for producing γδ T cells, comprising:
前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、
請求項１に記載のγδＴ細胞の製造方法。 The concentration of the bisphosphonate bone metabolism improving agent in the cell suspension is in the range of 0.05 to 100 μM;
The concentration of interleukin-2 in the cell suspension is in the range of 50 to 2000 U / mL.
The method for producing γδT cells according to claim 1.
前記末梢血単核球から、ＣＤ４、ＣＣＲ４、ＴＳＬＣ１およびＣＤ２５からなる群から選択される１または２以上の表面マーカーを発現している細胞を除去するステップと、
前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球を含む細胞懸濁液にビスホスホネート系骨代謝改善薬およびインターロイキン−２を添加して、γδＴ細胞を培養するステップと、
を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含有する、
がんまたは感染症を治療または予防するための医薬。 Preparing peripheral blood mononuclear cells;
Removing from the peripheral blood mononuclear cells cells expressing one or more surface markers selected from the group consisting of CD4, CCR4, TSLC1 and CD25;
Adding a bisphosphonate-based bone metabolism improving agent and interleukin-2 to a cell suspension containing peripheral blood mononuclear cells from which cells expressing the surface marker have been removed, and culturing γδT cells;
Containing γδ T cells produced by a method for producing γδ T cells comprising
A medicine for treating or preventing cancer or infectious diseases.
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