JP2012087126A - ヒトサイトメガロウイルスの免疫ー反応性ペプチドctlエピトープ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】潜伏HCMVを保有する患者のCD8+クラスI MHC拘束性細胞傷害性T-リンパ球により認識される免疫原性エピトープである複数のペプチド(およびその免疫学的に機能的な変異体)からなる、HCMVに対するワクチン。また、脂質化したペプチド、DNAアジュバント、または抗原提示細胞を含む細胞性ワクチン。さらに該ペプチドをコードする、ウイルスベクターワクチン。これらワクチンは、HCMVに対するCTLおよびCTLpを活性化することができ、HCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すために有用である。
【選択図】図1
Description
本発明は、米国保健社会福祉省からの助成番号CA30206、CA77544およびCA33572の形式における政府の支援を用いて行われた。政府は本発明において特定の権利を有しうる。
1.技術分野
本発明は、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、および特にヒトにおいてHCMVのT-細胞エピトープとして機能する1つあるいはそれ以上のサブユニットタンパク質由来のペプチド断片に関する。本発明のペプチドは、ヒト細胞傷害性Tリンパ球(CTL)がHCMVの感染と同等にヒト細胞を認識して融解することを指示することが可能である。これらのペプチドを使用して製剤化されるワクチンも、本発明により提供される。
HCMVゲノムは比較的大きく(約235k塩基対)、200以上のタンパク質をコードする能力を有する。HCMVは、構造的あるいは酵素的な機能を有するカプシドタンパク質により囲まれる二本鎖DNAの核複合体、および外側の糖ペプチド-および糖脂質-含有膜エンベロープから成る。HCMVはヘルペスウイルス科の一員であり、多くの臨床的症候群に関連している。
結果的に、本発明の一つの観点は、ヒトにおいてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すことができる免疫学的に活性なペプチド、およびその機能的変異体、例えば、SEQ ID NO: 10-25および30-41に関する。ペプチドは、ヒトCTLを指示してHCMVに感染したヒト細胞を認識して融解させることができる。そのような免疫学的に活性なペプチドは、MHCクラスI分子に関連しており、潜在的な(不活性な)HCMV感染を有する個体のCTLにより認識される。
配列NLVPMVATV(pp65495-503)(SEQ ID NO: 1)を有するノナペプチドは、現在まで調べられているCMV実験室株AD169およびTowneおよびその他の野生型分離株由来のpp65の免疫原性エピトープである。エピトープは、潜在的なCMV感染を保有する患者のCD8+クラスI MHC拘束性細胞傷害性T-リンパ球により認識される。ペプチドは活性ウイルス複製がない状態でCTLを活性化することができ、従って、正常および免疫不全患者の両方の免疫系を増大させるために、ならびにHCMVタンパク質のクラスI抗原プロセス経路の研究において有用である。位置2および9にあるアミノ酸残基は、HLA A*0201およびあるサブタイプのHLA A*02XX、ここではXX = サブタイプ02-22、との相互作用のためそれらの位置での好ましい残基である(J.W. Drijfhout et al., Human Immunology 43:1-12 (1995))。それにもかかわらず、その他のより好ましくないアミノ酸残基は好ましいアンカーを置換する可能性があり、ペプチドはHLA A*0201およびあるサブタイプのHLA A*02XXを結合する能力を示し、およびHCMV-特異的CD8+CTLを刺激し続けることができる。
NLVPMVATV(SEQ ID NO: 1)である免疫学的に活性なペプチドを提供する。
YSEHPTFTSQY(SEQ ID NO: 3)
は、A*0101およびそのサブタイプを含むHLA A*01XXに結合する。このペプチドの配列変異体は、XがS、TあるいはLである配列YXEHPTFTSQY(SEQ ID NO: 4)のペプチドを含む。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、A*6801およびそのサブタイプを含むHLA A*68XXに結合する。このペプチドの配列変異体は、X1がVあるいはTおよびX2がL、RあるいはKである配列FX1FPTKDVALX2(SEQ ID NO: 6)のペプチドを含む。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、B*0702およびそのサブタイプを含むHLA B*07XXに結合する。このペプチドの配列変異体は、XがL、F、あるいはMである配列TPRVTGGGAX(SEQ ID NO: 8)のペプチドを含む。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、互換性ペプチド結合部位を有するB*3502、B*3504、B*3506およびその他のそのサブタイプを含むHLA B*35XXに結合する。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、互換性ペプチド結合部位を有するB*0702およびその他のそのサブタイプを含むHLA B*07XXに結合する。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、互換性ペプチド結合部位を有するA*1101およびその他のそのサブタイプを含むHLA A*11XXに結合する。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、互換性ペプチド結合部位を有するHLA B*3801/2およびその他のそのサブタイプに結合する。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、互換性ペプチド結合部位を有するB*4402およびその他のそのサブタイプを含むHLA B*44XXに結合する。本発明はその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
は、互換性結合部位を有するA*2402およびその他のそのサブタイプを含むHLA A*24XXに結合する。本発明は、TFTSQYRIQGKL(SEQ ID NO: 44)などのその他の機能的な配列変異体の構造および選択を含み、本開示に基づいて当業者により実行されることができる。本明細書で開示されるペプチドあるいは構造変異体もまた、本明細書で開示される免疫学的な効果を産生するより長いペプチドの機能的部分でありうる。
AKXVAAWTLKAAANLVPMVATV(SEQ ID NO: 17)
dAKXVAAWTLKAAANLVPMVATV(SEQ ID NO: 18)
VSTIVPYIGPALNIAAANLVPMVATV(SEQ ID NO: 19)
AKXVAAWTLKAAAYLVPMVATV-NH2(SEQ ID NO: 20)
dAKXVAAWTLKAAAYLVPMVATV- NH2(SEQ ID NO: 21)
AKXVAAWTLKAAANLVPMVATV- NH2(SEQ ID NO: 22)
AKXVAAWTLKAAAYLVPMVASV- NH2(SEQ ID NO: 23)
AKXVAAWTLKAAANLLPMVASV- NH2(SEQ ID NO: 24)
AKXVAAWTLKAAASVLGPISGHVLK(SEQ ID NO: 25)
ここでX = シクロヘキシルアラニンおよびd =右旋性である。
CMV血清陽性個体からT細胞クローンを誘導する方法は、文献に記載されている(上記参考文献参照)。40から50ミリリットルの全末梢血の試料は、(標準的抗体法により検出された)CMV血清陽性のボランティアから得た。白血球(WBC)は、Ficoll-HyPaque(DuPont)密度勾配遠心分離を使用して分離した。全血は最初に卓上遠心機にて1400 rpmで10分間遠心分離して、赤血球細胞の数を減少させた。軟膜(buffy coat)をリン酸緩衝食塩水(PBS)を用いて12 mlに希釈して、6 mlを1/2量のFicoll-HyPaqueの上に重層した。最上層は、卓上遠心機において2000 rpmで15-30分間の遠心分離後に除去した。WBCを含有する界面(interface)を除去し、PBSで希釈して8-12分間1000 rpmで再び遠心分離することで、WBCをペレットにした。細胞をPBSに再懸濁してさらにもう1回上記のように洗浄した。4から5百万 WBC/mlを、プールしたAB+(血液型)CMV血清陰性ドナー(HAB)から得たヒト血清を用いたT細胞培地(TCM)に再懸濁した。
同時に、自己抗原提示細胞株をPBLのエプスタインバーウイルス不死化により調製した(Current Protocols in Immunology, Unit 7.22, Wiley-Liss Press (1993)参照)。同じ個体からのCTLおよび抗原提示細胞の誘導は、細胞株の間のHLAマッチングを確実にした。
WBCのin vitro刺激を開始するため、WBCとして同じボランティアから得た自己由来皮膚線維芽細胞の単層を、DMSO-10%HAB中にて105細胞/ml/ウェルで12-ウェルプレートにおいて細胞を24時間平板培養(plate)することにより確立した。培養の24時間後、線維芽細胞をCMVビリオン(AD169あるいはTowne株)に1および5の間の感染多重度で2時間感染させた。培地およびウイルスを単層から吸引して、1 mlの新鮮なDMEM-HABを加えた。単層はさらに4時間培地中でインキベートして、その時間の後、培地を吸引した。8-10百万WBCを含有する培地の2ミリリットルを、CMV感染線維芽細胞を含有するウェル毎に加えた。WBCおよび線維芽細胞は、50 U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、4 mM L-グルタミン、25μM 2-メルカプトエタノール、10 mM HEPESおよび10%HAB(TCM-HAB)を含有するRPMI-1640(Irvine Scientific)中で培養した。これは最初の刺激と名付けられ、細胞は7日間共インキベート(co-incubate)した。TCM-HABはもし消耗された場合は交換し、培養はもし活発な細胞増殖があった場合は拡張した。
100×((Re)-(Rs) / ((Rmax)-(Rs))。
アッセイは非許容可能であるとみなされ、自然放出(Rs)が30%以下でない場合は繰り返した。
皮膚線維芽細胞上にてHCMVにより2回刺激されたWBCは、以下のように96ウェルU底プレート中での限界希釈法によりクローン化した。2つのHCMV刺激の後、抗CD4抗体に結合する常磁性ビーズを用いたインキベーションを使用して、陰性選択(negative selection)によりWBCからCD4+T細胞を取り除いた。結果として生じた集団は、一般に90-95%がCD8+(信頼できるT細胞サブセットマーカー)であり、および一般に90%がCD3+(大半の末梢血T細胞のマーカー)であり、フローサイトメトリーあるいは蛍光顕微鏡のいずれかによりアッセイされる。この最終集団は、終量150μlにおいてウェル毎0.3-3細胞の間の濃度で平板培養した。各々のウェルはまた、50-100 IU/ml組換えIL-2(Chiron-Cetus)および0.5 pg/ml PHA(Murex)を追加したTCM-HAB中に、γ-放射線照射の1.0-3.0×105アロジェニック末梢血単核細胞(PBMC)も含有した。
495ペプチドの階段希釈は、CRAにおいて自己由来LCLがT細胞クローン3-3F4により殺されるようにプライム化することにおける、10μMおよび0.01μMの間の活性では変化を示さなかった。1/2-最大(half-maximal)溶解は、0.5 nMペプチドの近くで起きた。ペプチド-トランスポーター欠損細胞株T2(D.B. Crumpacker et al., J. Immunol. 148:3004-3011 (1992))は、HLA A*0201陽性であり、またCRAにおけるペプチドの認識について3-3F4 T細胞クローンの感受性のより下方限界を試験するために使用した。0.1 nMほどの少ないペプチドが、10 nMペプチドの条件と等しく、T2細胞の最大溶解を引き起こすことが見出された。これらの実験は、この最小細胞傷害性エピトープがHLA A*0201アリルに対する強力な結合物質(binder)であることを説明する。
TNF-αは、多くの細胞型にとって細胞傷害性であるT細胞リンホカインであり、HCMV感染に対して増加するin vivoでの免疫応答に寄与しうる。3-3F4 T細胞クローンの細胞は、全HCMVビリオンあるいは表1の495ペプチドでプライム化されるかのどちらかでプレインキベート(pre-incubate)した自己由来線維芽細胞と共にインキベートした。24時間後、共インキベートした細胞からの上清を上記したようにバイオアッセイにおいて指示(indicator)細胞株に適用した。指示細胞株はWEHI誘導体であり、ピコモルレベルでTNF-αの細胞傷害作用に対して感受性がある。
HCMV血清陽性個体からのPBLは7日間、SEQ ID NO: 1のペプチドプライム化した自己由来線維芽細胞上での平板培養、あるいはSEQ ID NO: 1ペプチドで感作した放射線照射自己由来PBLと共にインキベートした。一度刺激したPBLは、CD4 T細胞の消耗を用いてあるいは用いずに、同様な様式で再刺激した。2週間後、ペプチドプライム化、CMV感染、あるいは未処理自己由来線維芽細胞のいずれかを標的として使用してクロム放出アッセイを行った。CD8+T細胞は、ペプチドプライム化およびHCMV感染線維芽細胞あるいはSEQ ID NO: 1でプライム化したEBVLCLの著しいパーセンテージを溶解したが、未処理細胞は溶解しなかった。自己由来線維芽細胞標的は、同じ条件下で新鮮に取られた血液からのCD4-消耗PBLによっては溶解されなかった。実験は、15人の健康な成人ボランティア由来のT細胞を用いて繰り返した。1つ以外の全ての場合において、マッチングHLAアリルを保持するドナーはSEQ ID NO: 1に応答するT細胞を有した。同様な実験は、T細胞のin vitro刺激を用いずに、HIV患者で行った。マッチングHLAアリルを有するHIV陽性ドナーの大半はまた、SEQ ID NO: 1でプライム化された自己由来EBVLCLを認識できるT細胞クローンも保持していた。
12種の細胞株は、それらを495ペプチド(pp65495-503)ノナマーでパルスして、クロム-51を用いてロードして、495ペプチドおよびHCMVを認識する2つの異なるHLA A*0201拘束性CTLと共にインキベートするクロム放出アッセイに供した。特異的細胞傷害性を計算して、1μMおよび1 nM濃度の495ペプチドについて以下の表形式で示した。プラス記号(+)は30%以上の細胞傷害性を表し、プラス/マイナス記号(+/-)は5%および30%の間の細胞傷害性を表し、マイナス記号(-)は15%以下の細胞傷害性を表す。
事前にHCMV暴露がないトランスジェニックマウスモデル、HLA A2.1マウス(E.J. Bernhard et al., J. Exp. Med. 168:1157-1162 (1988))、を利用して、495ペプチドが事前にウイルス暴露がないCTLを刺激してワクチンとして機能できるかどうかを試験した。これらの実験は、ウイルスにより感染されたかあるいはSEQ ID NO: 1のペプチドあるいは非特異的対照ペプチドでのプライム化されたもののいずれかの、マウスおよびヒト細胞標的を使用するin vitro解析を含む。
免疫原性を亢進させるためにアジュバントを使用することは動物研究では一般的なストラテジーであるが、ヒトにおけるそれらの使用に関しては重要な制限がある。それゆえ、本発明の1つの態様は、脂質分子を取り込むペプチドを含む。このストラテジーは、動物(K. Deres et al., Nature 342:561-564 (1989))およびヒト臨床的研究(A. Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341-349 (1995))の両方において効果的であり、アジュバントの使用の必要性を回避した。
495ペブチドおよびその機能的配列変異体は、共有結合HTLエピトープを有する脂質化ペプチドとしてのワクチンとして製剤化できる。HTLエピトープは、古典的ヘルパー応答を刺激するためのヒトMHCクラスIIに対する広い反応性を有するいずれかのペプチドでありうる。そのような分子は、破傷風毒素由来のアミノ酸830-843(P. Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immun. 19:2237-2242 (1989))、HIVエンベロープタンパク質由来のHTLエピトープ(J.A. Berzofsky et al., J. Clin. Invest. 88:876-884 (1991))、あるいは既知のアンカー残基から推測される合成版(PADRE)(J. Alexander et al., Immunity 1:751-761 (1994))を含むが、それらには限定されない。
各々脂質を含有する2つのさらなる分子、HTLおよびCTLエピトープ、を構築してマウスにて試験した:
100以上のAおよびB遺伝子のHLAクラスIアリルがある(J.G. Bodmer et al., Tissue Antigens 49:297-321 (1997))。推定するアルゴリズムおよびトランケーション解析を組み合わせて使用することで、MHC-拘束性ヒトCTLにより溶解される自己由来およびアロジェニック細胞の両方を感作するpp65由来のさらなるペプチドを同定した。実施例1で考察したように、CTLはHCMV血清陽性なヒトから生じる;それゆえ、pp65由来の明確なエピトープは、内因的HCMV再活性化あるいはウイルス血症を抑制するためにヒトにより使用されるものであった。特異的HLAアリルと組み合わせてHCMV pp65に対するCTL反応を明確にするため、個々のクローン化CTL株は、CTLを誘導するために使用される血液を有する個体に見出されるHLA AあるいはBアリルの1つを含有するpp65vacを用いて感染させたEBVLCLの認識について試験した。少なくとも1つのHLAアリルがEBVLCL標的およびCTLの間で共用される場合は、認識および溶解のための感作が観察された。この実験は、拘束性アリルを含有する少なくとも3つの独立細胞株を用いて繰り返された。表6は、pp65エピトープ、それらのHLA拘束性、感作される同じ拘束性の独立細胞株の数、およびエピトープの描写の方法を示す。
本明細書中に記載される手順に従って、同じあるいは異なるHLAクラスI拘束成分に特異的である、pp150および/あるいはpp65エピトープの組み合わせを含むワクチンを調製した。ヒトのワクチン接種のため、各々のエピトープは同じMHC拘束を有する必要性はない。2つあるいはそれ以上のMHC拘束成分を標的とするワクチン分子は好ましいことがあり、なぜならそれはより少ないワクチン分子の産生を可能にして、さらに多型集団において大半のHLAアリルが標的とされることを確実にするからである。頻繁に発現するHLAアリル(表1および6参照)により拘束されるCTLエピトープを有するペプチドは好ましく、およびpp65およびpp150タンパク質の両方からのエピトープならびにHTLエピトープを含有するポリペプチドワクチンは、HCMVに対するヒトワクチン接種にとって特に好ましい。表1および6に示されるHLAアリルは、複数CTLエピトープワクチン分子において含まれる可能性のあるHLA A、B、およびC CTLエピトープのサブセットである。複数CTLエピトープおよびHTLエピトープを含ませることにより、ペプチドを長くするであろう(40-50アミノ酸の範囲内)。あるいは、HCMVポリペプチドワクチンは、共有結合的に接着されるHTLエピトープを用いずに、表3に示されるように、3つのアラニン残基あるいは各々のエピトープの間のアミノ酸の他の組み合わせのスペーサー、および、N末端での2つのパルミチン酸-リシルアミドを有する複数CTLエピトープを使用することにより調製されうる。
本発明に従う抗原ペプチドの治療的な活性形態は、骨髄移植の前の所定の日数あるいは週数により分割される単一あるいは複数用量にて、十分な時間(例えば、6から8週)でHCMV血清陽性骨髄移植ドナーに投与されて、抗HCMV細胞性免疫応答の発生を可能にする。抗原ペプチドは、それ自体既知の様式にて(例えば、場合によりヘルパーペプチドおよび/あるいはアジュバントと組み合わせて、脂質化ペプチドとして)製剤化することができ、好ましくは、複数用量において投与されるであろう。例えば、ヘルパーペプチドおよび抗原ペプチドが1つの配列において一緒に結合されるペプチドは、この目的に適している。
本発明のペプチドをin vitroアッセイに使用して、HCMV状態(感染あるいは非感染)が未知の患者から得たHCMV感染細胞の有無を検出する。患者から得たTリンパ球は、本発明のペプチドを用いてプライム化された抗原提示細胞と共にインキベートする。CTLあるいはCTLpの活性化により、患者がHCMVに感染したことが明らかになる。
2尾のHLA-A2.1kbトランスジェニックマウスに、15-30秒間の音波処理により不完全フロインドアジュバントと1:1比で乳化した、10%DMSO中の100 nmoleのA2 HCMV pp65ペプチドNLVPMVATV(SEQ ID NO: 1)、20μgのT-ヘルパーペプチドを含む0.1%酢酸、PADRE(AKXVAAWTLKAAA、Xはシクロヘキシルアラニンを表す;SEQ ID NO: 29)を接種した。移送中の損失を計上するため、注射に必要とされる以上の300μLあるいはそれ以上の過剰な乳化ワクチンを調製した。ペプチドワクチン(上の100μLの全量乳化調製)は、外側尾静脈(lateral tail vain)を避けて、各々の側に50μLずつ、尾の基部に皮下的に注射した。陽性対照動物は、無関係なHLA-A2.1拘束hu p531147-157ペプチドおよびPADREを用いて同じ様式で注射された。ブースターは7日後に投与した。ブースター免疫の1週間後、脾臓細胞を回収、培養、およびin vitroで刺激した。培養のため、細胞を脾臓から単離して、40 mL培地に懸濁させて計数した。赤血球は計数から除外した。そして、細胞を20%Rat-Stim(Collaborative Biomedical Cat #40115, Waltham, MA)を含有する培地中でミリリットルあたり3百万細胞の濃度にして、24ウェルプレート中にて1 mL/ウェルで平板培養した。細胞を刺激するため、1 mLの懸濁抗原提示細胞(3免疫化脾臓細胞に対して1抗原提示細胞の割合)を培養に加えた。細胞は37℃で7日間インキベートした。新鮮培地は必要に応じて加えた。刺激は、上のように1 mLの懸濁抗原提示細胞を加えることにより、平板培養後7日毎に行った。
%特異的放出 = 100×(実験的放出 - 自発的放出)/(全放出 - 自発的放出)
自発的放出が最大全放出の30%あるいはそれ以上である実験は放棄した。図4Aは1回のin vitro刺激後の結果を示し、図4Bは2回のin vitro刺激後の結果を示し、および図4Cは4回のin vitro刺激後の結果を示す。この図および続く図では、“T2 A2パルス”はSEQ ID NO: 1のペプチドを提示する細胞を示し、“T2 p53パルス”はヒト対照ペプチドp53149-157を提示する細胞を示す。データは、本発明のペプチドワクチンを用いたワクチン接種が適した標的細胞を認識して殺すことができる特異的CTLを確実に生じさせたことを示した。結果は、2回目のin vitro刺激で向上した。
マウスは実施例17に記載されるように、Xがシクロヘキシルアラニンを表す(Pam)2- KSSAKXVAAWTLKAAANLVPMVATV(SEQ ID NO: 37)を含有するワクチンの4つの異なる製剤を用いてワクチン接種した。脾臓細胞をアッセイした。クロム放出アッセイにおけるエフェクター対標的比は、結果を示す図5に示したとおりである。図5Aは、99.9%DMSOおよび0.1%蟻酸を含有する溶液中での100 nmoleのペプチドを用いて接種したマウスについての結果を提供する。図5Bは、50%DMSO、49.9%PBSおよび0.1%蟻酸を含有するビヒクル中に懸濁した100 nmoleのペプチドを用いてワクチン接種したマウスについての結果を提供する。図5Cは、41.7%DMSO、57.7%PBSおよび0.6%蟻酸に溶解した83.3nmoleのペプチドを用い注射したマウスについて言及する。図5Dは、66.7%DMSO、26.7%酢酸および6.7%Tween 20に懸濁した83.3 nmoleのペプチドを用いて注射したマウスについての結果を提供する。99.9%DMSO溶液ワクチンは、対照に対して最大の細胞傷害を有するマウス脾臓細胞を提供した。
マウスは上記されるように、(Pam)2- KSSAKXVAAWTLKAAANLVPMVATV(ここではXがシクロヘキシルアラニンを表す)(SEQ ID NO: 37)の増加量をワクチン接種およびアッセイをした。ペプチドは、図6に示す量にて80%DMSO、20%PBSおよび0.08%蟻酸における溶液中に提供された。100あるいは150 nmoleのペプチドを用いたワクチン接種は、強力な特異的細胞傷害を引き起こし、150 nmoleではより強力な結果であった。
マウスは上記されるように、実施例19におけるように製剤化されたSEQ ID NO: 37のペプチドの150あるいは25 nmoleを用いてワクチン接種をした。脾臓細胞は、様々な異なるペプチドによりパルスし、そして提示するT2細胞の細胞傷害性についてアッセイした。図7参照。“T2 177パルス”はSEQ ID NO: 39(NLVPMVATV-NH2)のアミド化(amidated)ペプチドを提示する細胞を示す;“T2 118パルス”はSEQ ID NO: 40(YLVPMVASV-NH2)のアミド化ペプチドを提示する細胞を示す。“T2 193パルス”はSEQ ID NO: 41(YLVPMVATV-NH2)のアミド化ペプチドを提示する細胞を示す。結果は、高度の特異性を示した。
マウスを免疫して、それらの脾臓細胞を様々なDSMO濃度を含有するビヒクルにおける100あるいは150 nmoleのSEQ ID NO: 37を用いて実施例17に記載するようにアッセイした。クロム放出アッセイの結果について図8参照。図8A:80%DMSO、20%PBSおよび0.08%蟻酸中100 nmole。図8B:80%DMSO、60%PBSおよび0.04%蟻酸中100 nmole。図8C:80%DMSO、20%PBSおよび0.08%蟻酸中150 nmole。図8D:40%DMSO、60%PBSおよび0.04%蟻酸中150 nmole。モノ脂質化ワクチンの製剤は、完全にワクチンペプチドを可溶性にするのに十分なDMSO濃度で提供されるときにより効き目があった。理論により縛られることを望まないが、脂質化ペプチドワクチンの完全な可溶性を生じさせるDMSOの濃度は、よりすぐれた結果を提供すると信じられる。
マウスを免疫して、それらの脾臓細胞をDSMOの減少量を含有する以下のビヒクルにおける100 nmoleのSEQ ID NO: 37を用いて実施例17に記載するようにアッセイした。図9A:80%DMSO、20%PBSおよび0.02%蟻酸;図9B:70%DMSO、30%PBSおよび0.07%蟻酸;図9C:60%DMSO、40%PBSおよび0.06%蟻酸;図9D:50%DMSO、50%PBSおよび0.02%蟻酸。図9Aについての製剤は溶液であり、より少ないDMSOを含有する残りの製剤は懸濁液であった。図9Dにおける結果はブースターを受けたマウスを反映しており、一方、図9の残りのパネルは1回のワクチン接種のみを受けたマウスからのデータを示す。これらのデータは、ワクチンが最高の結果のために完全に可溶化されるべきであるという仮説を確認にする。
実施例22の方法を、以下の製剤を使用して繰り返した。図10A:80%DMSO、20%PBSおよび0.02%蟻酸;図10B:70%DMSO、30%PBSおよび0.02%蟻酸;図10C:60%DMSO、40%PBSおよび0.02%蟻酸;図10D:50%DMSO、50%PBSおよび0.02%蟻酸。前のように、図10Aにおいてデータを産生するために使用したワクチン調製は溶液であり、一方、残りの製剤は懸濁液であった。図10Dにおいてアッセイされる脾臓細胞を提供するマウスは、ブースター免疫を受けた。
マウスを免疫して、それらの脾臓細胞を25あるいは50 nmoleのSEQ ID NO: 37の1あるいは2回の免疫を使用して実施例17に記載するようにアッセイした。図11における結果を参照。図11A:50 nmole;図11B:25 nmole;図11C:50 nmole+1回のブースター;図11D:50 nmole+1回のブースター。ブースター注射は、50 nmole投与量についての免疫により達成される細胞傷害効果を増加させたが、25 nmole投与量について向上の提供は明らかにほとんどないあるいはなかった
実施例25. 変化可能な蟻酸濃度の効果
マウスを免疫して、それらの脾臓細胞を0.08%蟻酸(図12Aおよび12B)あるいは0.02%蟻酸(図12Cおよび12D)を含有する、80%DMSO、20%PBS中のSEQ ID NO: 37の1回の免疫を使用して実施例17に記載するようにアッセイした。注射したペプチドの量は、150 nmole(図12A)、100 nmole(図12B)、50 nmole(図12C)あるいは25 nmole(図12D)であった。より多量の投与量では明らかに、ワクチン接種後のより高い特異的細胞傷害性を生じた。
マウスを免疫して、それらの脾臓細胞を、不完全フロインドアジュバントを用いて乳化した1つの配列(100 nmole;KS SAKXVAAWTLKAAANLVPMVATV、ここではXはシクロヘキシルアラニンである;SEQ ID NO: 37)を形成するために直接PADREに結合する、SEQ ID NO: 1のHCMVペプチドの1回の注射を使用して実施例17に記載するようにアッセイした。投与したワクチンは、5%DMSO、45%通常食塩水および50%不完全フロインドアジュバントを含有する100μLの乳濁液であった。10%Rat-Stimの存在下で2回刺激したSEQ ID NO: 1のペプチドを提示するT2細胞を使用して試験すると、免疫化脾臓細胞は100のE/T比では11.22%および20のE/T比では3.18%の特異的細胞障害性を示した。免疫化脾臓細胞は、対照p53ペプチドを提示するT2細胞については-4.44%および-0.10%、SEQ ID NO: 39のペプチドを提示するT2細胞については3.31%および3.44%、および未処理T2細胞については-6.39%および-1.81%、の平均%細胞傷害性を示した。
2尾のマウスは、CpG配列を含有する50μg DNAアジュバント(陽性DNAアジュバント)と共に100 nmoleのSEQ ID NO: 37のペプチドを用いて1回免疫した。使用したDNA配列は、Z. Moldoveanu, Vaccine 16(11/12):1216-1224 (1998)に記載されるように、(1826)5' TCCATGACGTTCCTGACGTT 3'(SEQ ID NO: 42)であった。これらの免疫化脾臓細胞からのクロム放出アッセイデータは、以下に表7において提供する。
実施例27は、CpG配列を欠くDNAアジュバント(陰性DNAアジュバント)を使用して繰り返した。使用したDNA配列は、Z. Moldoveanu, Vaccine 16(11/12):1216-1224 (1998)に記載されるように、(1982)5' TCCAGGACTTCTCTCAGGTT 3'(SEQ ID NO: 43)であった。これらクロム放出アッセイデータは、以下に表7において提供する。
Claims (19)
- SEQ ID NO: 10-25および30-41から選択したペプチド。
- SEQ ID NO: 1、10-25および30-41から選択した配列を有するペプチドおよび医薬的に許容可能なキャリアを含むヒトサイトメガロウイルスに対するワクチン。
- さらにアジュバントを含む、請求項2に従うワクチン。
- 前記アジュバントがDNAアジュバントである、請求項3に従うワクチン。
- 前記ペプチドが脂質化されない、請求項2に従うワクチン。
- 前記ペプチドが脂質化される、請求項2に従うワクチン。
- 前記ペプチドがモノ脂質化される、請求項6に従うワクチン。
- 前記ペプチドがジ脂質化される、請求項6に従うワクチン。
- SEQ ID NO: 1、10-25および30-41のいずれか1つに従うペプチドを提示するためにin vitroで処理された抗原提示細胞を含む、ヒトサイトメガロウイルスに対する細胞性ワクチン。
- 前記抗原提示細胞が自己由来のものである、請求項9に従う細胞性ワクチン。
- 前記抗原提示細胞がアロジェニックである、請求項9に従う細胞性ワクチン。
- SEQ ID NO: 1-14、19、26-28および30のいずれか1つに従うペプチドをコードする遺伝子を発現する、組換えウイルスベクターワクチン。
- 請求項2、3、4、9あるいは12のいずれか1項に従うワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウイスル感染に対する免疫応答をモジュレートする方法。
- 請求項2に従うワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウイスル感染に対する免疫応答をモジュレートする方法。
- 請求項9に従うワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウイスル感染に対する免疫応答をモジュレートする方法。
- 請求項12に従うワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウイスル感染に対する免疫応答をモジュレートする方法。
- ヒトサイトメガロウイルスの天然にプロセスされたエピトープおよびDNAアジュバントを含む、ヒトサイトメガロウイルスに対するワクチン。
- SEQ ID NO: 1の配列を有するペプチドおよびDNAアジュバントを含む、ヒトサイトメガロウイルスに対するワクチン。
- 請求項4に従うワクチンを投与することを含む、ヒトサイトメガロウイスル感染に対する免疫応答をモジュレートする方法。
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