JP2012060997A - Gene transfer composition and utilization thereof - Google Patents
Gene transfer composition and utilization thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012060997A JP2012060997A JP2011179598A JP2011179598A JP2012060997A JP 2012060997 A JP2012060997 A JP 2012060997A JP 2011179598 A JP2011179598 A JP 2011179598A JP 2011179598 A JP2011179598 A JP 2011179598A JP 2012060997 A JP2012060997 A JP 2012060997A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- conhch
- nhcor
- gene
- cationic
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 56
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 49
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 43
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 150000001767 cationic compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 claims description 82
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 19
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 19
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 14
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 13
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 11
- 229920000962 poly(amidoamine) Polymers 0.000 claims description 10
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 claims description 7
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 229920000333 poly(propyleneimine) Polymers 0.000 claims description 7
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 claims description 5
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 5
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 claims description 4
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 claims description 4
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical group NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Chemical group NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Chemical group OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001165 Poly(4-hydroxy-l-proline ester Polymers 0.000 claims description 4
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 claims description 4
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 claims description 4
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 4
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical group 0.000 claims description 4
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 claims description 4
- 229920002006 poly(N-vinylimidazole) polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 claims description 4
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 claims description 4
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 claims description 3
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 claims description 3
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 claims description 2
- BZRLYGTWEDFWCR-UHFFFAOYSA-N amino 2-methylpent-2-enoate Chemical compound CCC=C(C)C(=O)ON BZRLYGTWEDFWCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 69
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 19
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 18
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 9
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 9
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 9
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 8
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 125000004427 diamine group Chemical group 0.000 description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- SENLDUJVTGGYIH-UHFFFAOYSA-N n-(2-aminoethyl)-3-[[3-(2-aminoethylamino)-3-oxopropyl]-[2-[bis[3-(2-aminoethylamino)-3-oxopropyl]amino]ethyl]amino]propanamide Chemical compound NCCNC(=O)CCN(CCC(=O)NCCN)CCN(CCC(=O)NCCN)CCC(=O)NCCN SENLDUJVTGGYIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N chembl1408157 Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(C(=O)O)=CC=1C1=CC=C(O)C=C1 KXZJHVJKXJLBKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- JVEUTCWLEJSEDI-PXYINDEMSA-N (2s)-2,6-diamino-7-oxo-7-phenylmethoxyheptanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(N)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 JVEUTCWLEJSEDI-PXYINDEMSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- MNZMECMQTYGSOI-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydron;bromide Chemical compound Br.CC(O)=O MNZMECMQTYGSOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILFHWTIJICTGOT-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethyl(tert-butyl)carbamic acid Chemical compound CC(C)(C)N(C(O)=O)CCN ILFHWTIJICTGOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical group CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N bis(4-nitrophenyl) carbonate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- SUPCQIBBMFXVTL-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)C(C)=C SUPCQIBBMFXVTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003916 ethylene diamine group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229920001002 functional polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005645 linoleyl group Chemical group 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 125000002811 oleoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 229920001513 poly[2-(diethylamino)ethyl methacrylate] polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002246 poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 125000005314 unsaturated fatty acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Description
本発明は、遺伝子導入用組成物およびその利用に関する。 The present invention relates to a composition for gene transfer and use thereof.
遺伝子療法等に用いられる効率の高い遺伝子ベクターとしてウイルスベクターが知られている。しかしながら、ウイルスベクターは、臨床応用において死に至る重篤な副作用が報告されている。 Viral vectors are known as highly efficient gene vectors used for gene therapy and the like. However, viral vectors have been reported to have serious side effects leading to death in clinical applications.
一方、非ウイルスベクターは安全性により優れるとされる。このため、非ウイルスベクターに関する研究が盛んに行われてきた。例えば、様々なカチオン性高分子とDNAとの複合体（ポリプレックス）を用いるポリフェクション法や、カチオン性脂質とDNAとの複合体（リポプレックス）を用いるリポフェクション法、さらにこれらを組み合わせたリポポリフェクション法などがこれまでに提案されている。 On the other hand, non-viral vectors are considered to be superior in safety. For this reason, research on non-viral vectors has been actively conducted. For example, a polyfection method using a complex of various cationic polymers and DNA (polyplex), a lipofection method using a complex of cationic lipid and DNA (lipoplex), and a lipopolyphe combining these The action method has been proposed so far.
本発明者らはこれまでに、独自のポリフェクション法として、ポリアミドデンドロンからなるヘッド部と、カチオン性高分子からなるテイル部で構成されるヘッド−テイル型ポリカチオンブロック共重合体とDNAとの複合体を用いる方法を検討してきた（非特許文献１及び２）。
The present inventors have so far made a head-tail type polycation block copolymer composed of a head portion composed of polyamide dendron and a tail portion composed of a cationic polymer, and DNA as a unique transfection method. A method using a complex has been studied (
本発明は、遺伝子導入効率に優れる、非ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a gene transfer method using a non-viral vector that is excellent in gene transfer efficiency.
本発明者らは、鋭意検討の末、ポリプレックス形成能を有する他のカチオン性高分子（以下、「ポリプレックス形成カチオン性高分子」ということがある。）、又はリポプレックス形成能を有する他のカチオン性脂質（以下、「リポプレックス形成カチオン性脂質」ということがある。）の遺伝子導入作用を向上させることに成功した。すなわち、ポリアミドデンドロンからなるヘッド部と、カチオン性高分子からなるテイル部で構成されるヘッド−テイル型ポリカチオンブロック共重合体において、さらにヘッド部の樹状に拡がる末端側に親水性高分子を結合させた化合物を、ポリプレックス形成カチオン性高分子等と組み合わせることによって、その遺伝子導入作用を向上できることを見出した。 As a result of intensive studies, the present inventors have made other cationic polymers having the ability to form polyplexes (hereinafter sometimes referred to as “polyplex-forming cationic polymers”) or others having the ability to form lipoplexes. Has succeeded in improving the gene transfer effect of the cationic lipid (hereinafter referred to as “lipoplex-forming cationic lipid”). That is, in a head-tail type polycation block copolymer composed of a head part made of polyamide dendron and a tail part made of a cationic polymer, a hydrophilic polymer is further added to the terminal side of the head part that spreads in a dendritic shape. It has been found that the gene transfer effect can be improved by combining the bound compound with a polyplex-forming cationic polymer or the like.
本発明はかかる知見に基づき、さらに検討を重ねた結果完成されたものであり、下記に掲げるものである。 Based on this knowledge, the present invention has been completed as a result of further studies, and is described below.
項１．
Ａ−１．ポリプレックス形成能を有するカチオン性高分子、及び
Ａ−２．リポプレックス形成能を有するカチオン性脂質
からなる群より選択される少なくとも一種のカチオン性化合物；並びに
Ｂ．下記式（１）〜（５）のいずれかで表される化合物
を含む、遺伝子導入用組成物
（１）R1−L−N（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2
（２）R1−L−N（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2
（３）R1−L−N（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2
（４）R1−L−N（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（５）R1−L−N（X（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（上記式中、
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を、
R1は、カチオン性高分子を、
R2は、親水性高分子を、かつ
Lは、リンカーを示す。）。
項２．
前記R1が、カチオン性直鎖状高分子である、請求項１に記載の遺伝子導入用組成物。
項３．
前記R1が、（A）n−（Aはリジン、アルギニン、ヒスチジン、若しくはオルニチン、又は側鎖にアミノ基、グアニジノ基、若しくはイミダゾール基を有するアミノ酸誘導体を示す。）、又はポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、若しくはポリビニルイミダゾールである、請求項１又は２に記載の遺伝子導入用組成物。
項４．
前記R2が、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリオキサゾリン、又はそれらの誘導体である、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子導入用組成物。
項５．
前記R2が、−（OCH2CH2）n−Y（n＝１０〜５００；Yは、親水性基を示す。）である、請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子導入用組成物。
項６．
前記リンカーの分子量が１４〜５００である、請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子導入用組成物。
項７．
前記リンカーが、−NH（CH2）n−である、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子導入用組成物。
項８．
前記ポリプレックス形成能を有するカチオン性高分子が、プロタミン、ポリ-L-リジン、ポリ-L-オルニチン、ポリ（4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル）、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリ（2-ジエチルアミノエチルメタクリレート）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリプロピレンイミンデンドリマー、又はポリリシンデンドリマーである、請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子導入用組成物。
項９．
前記リポプレックス形成能を有するカチオン性脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸、又は２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）である、請求項１〜７のいずれかに記載の遺伝子導入用組成物。
項１０．
Ａ−１．ポリプレックス形成能を有するカチオン性高分子、及び
Ａ−２．リポプレックス形成能を有するカチオン性脂質
からなる群より選択される少なくとも一種のカチオン性化合物；並びに
Ｂ．下記式（１）〜（５）のいずれかで表される化合物
を含む、遺伝子導入用キット
（１）R1−L−N（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2
（２）R1−L−N（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2
（３）R1−L−N（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2
（４）R1−L−N（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（５）R1−L−N（X（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（上記式中、
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を、
R1は、カチオン性高分子を、
R2は、親水性高分子を、かつ
Lは、リンカーを示す。）。
項１１．
請求項１〜９のいずれかに記載の遺伝子導入用組成物を遺伝子とともにイン・ビトロ又はイン・ビボ（ただし、ヒトを除く）で細胞に導入する工程を含む、細胞に遺伝子を導入する方法。
A-1. A cationic polymer having polyplex-forming ability, and A-2. B. at least one cationic compound selected from the group consisting of cationic lipids having lipoplex-forming ability; A composition for gene introduction comprising a compound represented by any one of the following formulas (1) to (5) (1) R 1 -LN (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2
(2) R 1 -L-N (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2 ) 2
(3) R 1 -L-N (X (X (
(4) R 1 -L-N (X (X (X (
(5) R 1 -L-N (X (X (X (X (
(In the above formula,
X represents -CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N-
R 1 is a cationic polymer,
R 2 is a hydrophilic polymer, and
L represents a linker. ).
The composition for gene transfer according to
Item 3.
R 1 is (A) n — (A represents lysine, arginine, histidine, ornithine, or an amino acid derivative having an amino group, guanidino group, or imidazole group in the side chain), polyethyleneimine, polyvinylamine The composition for gene transfer according to
Item 4.
The gene transfer composition according to any one of
Item 5.
The composition for gene transfer according to any one of
Item 6.
The composition for gene introduction according to any one of
Item 7.
Wherein the linker, -NH (CH 2) n - is a gene transfer composition according to any one of
Item 8.
The cationic polymer having the ability to form polyplex is protamine, poly-L-lysine, poly-L-ornithine, poly (4-hydroxy-L-proline ester), polyethyleneimine, polypropyleneimine, poly (2-diethylamino) The composition for gene transfer according to any one of
Item 9.
The cationic lipid having the ability to form lipoplex is phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyelin, plasmalogen, phosphatidic acid, or 2,3-dioleyloxy-N The composition for gene transfer according to any one of
A-1. A cationic polymer having polyplex-forming ability, and A-2. B. at least one cationic compound selected from the group consisting of cationic lipids having lipoplex-forming ability; Gene introduction kit (1) R 1 -LN (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2 containing a compound represented by any of the following formulas (1) to (5)
(2) R 1 -L-N (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2 ) 2
(3) R 1 -L-N (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2
(4) R 1 -L-N (X (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2) 2
(5) R 1 -L-N (X (X (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2) 2
(In the above formula,
X represents -CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N-
R 1 is a cationic polymer,
R 2 is a hydrophilic polymer, and
L represents a linker. ).
Item 11.
A method for introducing a gene into a cell, comprising a step of introducing the composition for gene introduction according to any one of
本発明によって、同じポリプレックス形成カチオン性高分子とDNAのみからなるポリプレックス、又は同じリポプレックス形成カチオン性脂質とDNAのみからなるリポプレックスを利用したリポプレックス法よりも高い遺伝子導入効率を達成できる。 The present invention can achieve higher gene transfer efficiency than the lipoplex method using the same polyplex-forming cationic polymer and DNA-only polyplex, or the same lipoplex-forming cationic lipid and DNA-only lipoplex. .
１．ポリプレックス形成カチオン性高分子
ポリプレックス形成カチオン性高分子としては、ポリフェクション法において用いられる、あるいは用いることができると考えられる様々なカチオン性高分子を用いることができる。
1. Polyplex-Forming Cationic Polymer As the polyplex-forming cationic polymer, various cationic polymers that can be used or considered to be used in the polyfection method can be used.
ポリプレックス形成カチオン性高分子の分子量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、１０００〜１０００００であれば好ましく、２５００〜５００００であればより好ましい。 The molecular weight of the polyplex-forming cationic polymer is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but it is preferably 1000 to 100,000, more preferably 2500 to 50000.
ポリプレックス形成カチオン性高分子の具体例としては、荷電性側鎖を有するアミノ酸又はアミノ酸誘導体のポリマーを挙げることができる。この場合、アミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等が挙げられる。 Specific examples of the polyplex-forming cationic polymer include an amino acid or amino acid derivative polymer having a charged side chain. In this case, examples of amino acids include lysine, arginine, histidine, ornithine and the like.
アミノ酸誘導体としては、特に限定されないが、例えば、側鎖にアミノ基、グアニジノ基又はイミダゾール基をもつアミノ酸誘導体、並びに側鎖にジアミン構造をもつアミノ酸誘導体等が挙げられる。ジアミン構造としては、特に限定されないが、例えば次の式に示すような構造が挙げられる。 The amino acid derivative is not particularly limited, and examples thereof include an amino acid derivative having an amino group, a guanidino group or an imidazole group in the side chain, and an amino acid derivative having a diamine structure in the side chain. Although it does not specifically limit as a diamine structure, For example, a structure as shown to the following formula is mentioned.
アスパラギン酸の側鎖にジアミン構造を導入した誘導体のポリマーの例を次の式に示す。 An example of a derivative polymer in which a diamine structure is introduced into the side chain of aspartic acid is shown in the following formula.
グルタミン酸の側鎖にジアミン構造を導入した誘導体のポリマーの例を次の式に示す。 An example of a derivative polymer in which a diamine structure is introduced into the side chain of glutamic acid is shown in the following formula.
アミノ酸としては、Ｌ型アミノ酸が好ましい。 As the amino acid, an L-type amino acid is preferred.
ポリプレックス形成カチオン性高分子としては、１種または２種以上のアミノ酸又はアミノ酸誘導体からなるポリマーを用いることができる。 As the polyplex-forming cationic polymer, a polymer composed of one or more amino acids or amino acid derivatives can be used.
ポリプレックス形成カチオン性高分子の具体例としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルイミダゾール、プロタミン、ポリ（4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル）、ポリ（２−ジエチルアミノエチルメタクリレート）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリプロピレンイミンデンドリマー、ポリリシンデンドリマー等も挙げることができる。これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。 Specific examples of the polyplex-forming cationic polymer include, for example, polyethyleneimine, polypropyleneimine, polyvinylamine, polyallylamine, polyvinylimidazole, protamine, poly (4-hydroxy-L-proline ester), poly (2-diethylaminoethyl) Methacrylate), polyamidoamine dendrimer, polypropyleneimine dendrimer, polylysine dendrimer, and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
ポリプレックス形成カチオン性高分子の好適例としては、上に好適例として例示したような高分子においてさらに少なくとも１つ以上の置換基を有するものが挙げられる。置換基としては、カチオン性を示すものが好ましい。置換基としては、例えば、アミノ基、グアニジノ基、又はイミダゾール基が好ましい。 Preferable examples of the polyplex-forming cationic polymer include those having at least one substituent in the polymer as exemplified above as a preferred example. As a substituent, what shows cationic property is preferable. As the substituent, for example, an amino group, a guanidino group, or an imidazole group is preferable.
２．リポプレックス形成カチオン性脂質
リポプレックス形成カチオン性脂質としては、リポフェクション法において用いられる、あるいは用いることができると考えられる様々なカチオン性脂質を用いることができる。
2. Lipoplex-forming cationic lipid As the lipoplex-forming cationic lipid, various cationic lipids that can be used or considered to be usable in the lipofection method can be used.
リポプレックス形成カチオン性脂質としては、リン脂質等が挙げられる。 Examples of lipoplex-forming cationic lipids include phospholipids.
リポプレックス形成カチオン性脂質の具体例としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸、２,３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ,Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）等を挙げることができる。これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファリジルコリンをそれぞれ単独で、または組み合わせて用いるのが好ましい。 Specific examples of the lipoplex-forming cationic lipid include, for example, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardiolipin, sphingomyelin, plasmalogen, phosphatidic acid, 2,3-dioleyloxy- N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneaminium trifluoroacetate (DOSPA) and the like can be mentioned. These can be used alone or in combination of two or more. Of these, phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine are preferably used alone or in combination.
これらのリポプレックス形成カチオン性脂質の脂肪酸残基は、特に限定されるべきものではないが、炭素数１２から１８の飽和または不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等を挙げることができ、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）が特に好ましい。 Fatty acid residues of these lipoplex-forming cationic lipids are not particularly limited, and can include saturated or unsaturated fatty acid residues having 12 to 18 carbon atoms, specifically, lauroyl Group, myristoyl group, palmitoyl group, stearoyl group, oleoyl group, linoleyl group and the like, and DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine) is particularly preferable.
ポリプレックス形成カチオン性高分子の好適例としては、上に好適例として例示したような高分子においてさらに少なくとも１つ以上の置換基を有するものが挙げられる。置換基としては、カチオン性を示すものが好ましい。置換基としては、例えば、アミノ基、グアニジノ基、又はイミダゾール基が好ましい。 Preferable examples of the polyplex-forming cationic polymer include those having at least one substituent in the polymer as exemplified above as a preferred example. As a substituent, what shows cationic property is preferable. As the substituent, for example, an amino group, a guanidino group, or an imidazole group is preferable.
３．化合物（１）〜（５）
３−１．構造
化合物（１）〜（５）は、Tail−Linker−Headで表される化合物（図１）である。
3. Compounds (1) to (5)
3-1. Structural compounds (1) to (5) are compounds represented by Tail-Linker-Head (FIG. 1).
Tail部は、生理的pH条件下（pH 7.4）でイオン化しており、DNAと強固な複合体を形成する性質を有する。なお、本発明においてDNAとは好ましくはプラスミドDNA（pDNA）を意味する。 The tail part is ionized under physiological pH conditions (pH 7.4) and has a property of forming a strong complex with DNA. In the present invention, DNA preferably means plasmid DNA (pDNA).
Head部は、生理的pH条件下（pH 7.4）でイオン化しておらず、pHが低い部位に取り込まれた際にpH低下を抑制する性質（プロトンスポンジ効果）を有する。 The Head part is not ionized under physiological pH conditions (pH 7.4), and has a property (proton sponge effect) that suppresses a decrease in pH when taken into a site having a low pH.
TailをR1、そしてLinkerをLと示すことがある。 Sometimes Tail is indicated as R 1 and Linker is indicated as L.
化合物（１）〜（５）は、下記式（１）〜（５）のいずれかで表される化合物である。化合物（１）〜（５）は、互いにHeadの種類が異なっている。
（１）R1−L−N（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2
（２）R1−L−N（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2
（３）R1−L−N（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2
（４）R1−L−N（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（５）R1−L−N（X（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（上記式中、
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を、
R1は、カチオン性高分子を、
R2は、親水性高分子を、かつ
Lは、リンカーを示す。）
Compounds (1) to (5) are compounds represented by any of the following formulas (1) to (5). Compounds (1) to (5) have different types of heads.
(1) R 1 -L-N (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2
(2) R 1 -L-N (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2 ) 2
(3) R 1 -L-N (X (X (
(4) R 1 -L-N (X (X (X (
(5) R 1 -L-N (X (X (X (X (
(In the above formula,
X represents -CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N-
R 1 is a cationic polymer,
R 2 is a hydrophilic polymer, and
L represents a linker. )
３−１−１. Tailの構造
Tail部は、生理的pH条件下（pH 7.4）でイオン化しており、Tail部を介してTail−Linker−Head はDNAとポリプレックスを形成する。
3-1-1. Tail structure
The tail part is ionized under physiological pH conditions (pH 7.4), and the tail-linker-head forms a DNA and polyplex through the tail part.
R1は、カチオン性高分子である。 R 1 is a cationic polymer.
R1としては、ポリフェクション法において用いられる、あるいは用いることができると考えられる様々なカチオン性高分子を用いることができる。 As R 1 , various cationic polymers that can be used or considered to be used in the polyfection method can be used.
R1は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、好ましくは、カチオン性直鎖状高分子である。 R 1 is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but is preferably a cationic linear polymer.
R1の分子量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、１０００〜１０００００であれば好ましく、２５００〜５００００であればより好ましい。 The molecular weight of R 1 is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but is preferably 1000 to 100,000, more preferably 2500 to 50,000.
R1の具体例としては、例えば、（A）n−（Aは荷電性側鎖を有するアミノ酸又はアミノ酸誘導体を示す。）を挙げることができる。この場合、アミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等が挙げられる。アミノ酸誘導体としては、側鎖にアミノ基、グアニジノ基又はイミダゾール基をもつアミノ酸誘導体、並びに側鎖にジアミン構造をもつアミノ酸誘導体等が挙げられる。ジアミン構造としては、特に限定されないが、例えば前記式（化１）に示すような構造が挙げられる。 Specific examples of R 1 include (A) n- (A represents an amino acid or amino acid derivative having a charged side chain). In this case, examples of amino acids include lysine, arginine, histidine, ornithine and the like. Examples of amino acid derivatives include amino acid derivatives having an amino group, guanidino group or imidazole group in the side chain, and amino acid derivatives having a diamine structure in the side chain. Although it does not specifically limit as a diamine structure, For example, a structure as shown to the said Formula (Formula 1) is mentioned.
アミノ酸としては、Ｌ型アミノ酸が好ましい。 As the amino acid, an L-type amino acid is preferred.
R1としては、１種または２種以上のアミノ酸又はアミノ酸誘導体からなるポリマーを用いることができる。 As R 1 , a polymer composed of one or more amino acids or amino acid derivatives can be used.
R1の具体例としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルイミダゾール、プロタミン、ポリ（4-ヒドロキシ-L-プロリンエステル）、及びポリ（２−ジメチルアミノエチルメタクリレート）等も挙げることができる。 Specific examples of R 1 include, for example, polyethyleneimine, polypropyleneimine, polyvinylamine, polyallylamine, polyvinylimidazole, protamine, poly (4-hydroxy-L-proline ester), and poly (2-dimethylaminoethyl methacrylate). Can also be mentioned.
R1の好適例としては、上に好適例として例示したような構造の基においてさらに少なくとも１つ以上の置換基を有するものが挙げられる。置換基としては、カチオン性を示すものが好ましい。置換基としては、例えば、アミノ基、グアニジノ基、及びイミダゾール基が好ましい。 Preferable examples of R 1 include those having at least one substituent in the group having the structure exemplified above as a preferable example. As a substituent, what shows cationic property is preferable. As the substituent, for example, an amino group, a guanidino group, and an imidazole group are preferable.
３−１−２. Linkerの構造
Lは、リンカーを示す。Lは単にTail部とHead部とを連結するものであり、特に機能を有さないものである。したがって、Tail部とHead部の機能を阻害しないものである必要がある。機能性高分子を連結する際に用いられる、あるいは用いることができると考えられる様々なリンカーを用いることができる。
3-1-2. Linker structure
L represents a linker. L simply connects the tail part and the head part, and has no particular function. Therefore, it is necessary to prevent the functions of the tail part and the head part from being impaired. Various linkers that are used or considered to be usable when linking functional polymers can be used.
Lの分子量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、１４〜５００であれば好ましく、１４〜２００であればより好ましい。 The molecular weight of L is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but it is preferably 14 to 500, and more preferably 14 to 200.
Lの具体例としては、−NH（CH2）n−が挙げられる。 Specific examples of L include —NH (CH 2 ) n —.
Lは、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、−NH（CH2）n−（n＝１〜４０）であれば好ましく、−NH（CH2）n−（n＝１〜１５）であればより好ましい。 L is not particularly limited as long as the effect of the present invention, -NH (CH 2) n - preferably if (n = 1 to 40) a, -NH (CH 2) n - (n = 1~15) Is more preferable.
３−１−３. Headの構造
Head部は、第２級アミノ基、及び第３級アミノ基を多く有するカチオン性高分子を構成する。これらのアミノ基は生理的pH条件下でイオン化しない。このため、いわゆるプロトンスポンジ効果を発現する。これにより、Tail−Linker−Head とDNAからなるポリプレックスが細胞内に導入された後に、エンドソーム内でDNAが分解される割合を低減できる。
3-1-3. Head structure
The Head portion constitutes a cationic polymer having many secondary amino groups and tertiary amino groups. These amino groups do not ionize under physiological pH conditions. For this reason, a so-called proton sponge effect is exhibited. Thereby, after the polyplex which consists of Tail-Linker-Head and DNA is introduce | transduced in a cell, the ratio by which DNA is decomposed | disassembled within endosome can be reduced.
さらに、Head部は、多岐状に分布したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有している。ＰＥＧ鎖がない場合はTail部とDNAとの間のイオン性相互作用によりDNAが凝縮し、直径約０．２〜２μmの球状凝集体が形成されるが、ＰＥＧ鎖がある場合はDNAの凝縮が抑えられ、長さ約１００〜２００nmのより小さな棒状凝集体が形成される。 Furthermore, the Head part has polyethylene glycol (PEG) chains distributed in a variety of ways. When there is no PEG chain, the DNA is condensed by the ionic interaction between the tail part and the DNA, and a spherical aggregate having a diameter of about 0.2 to 2 μm is formed. When there is a PEG chain, the DNA is condensed. And a smaller rod-like aggregate having a length of about 100 to 200 nm is formed.
３−１−３−１．Xの構造
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を示す。
3-1-3-1. X structure
X represents -CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N-.
３−１−３−２．R 2 の構造
R2は、親水性高分子を示す。
3-1-3-2. Structure of R 2
R 2 represents a hydrophilic polymer.
R2は、直鎖状高分子であってもよいし、分岐状高分子であってもよい。 R 2 may be a linear polymer or a branched polymer.
R2の分子量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、４００〜２００００であれば好ましく、１０００〜１００００であればより好ましい。 The molecular weight of R 2 is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but is preferably 400 to 20000, more preferably 1000 to 10,000.
R2の具体例としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリオキサゾリン、及びそれらの誘導体等が挙げられる。誘導体としては、例えばポリプロピレンオキシド等が挙げられる。 Specific examples of R 2 include polyethylene glycol, dextran, polyoxazoline, and derivatives thereof. Examples of the derivatives include polypropylene oxide.
R2の具体例としては、−（OCH2CH2）n−Y （n＝１０〜５００；Yは、親水性基を示す。）が挙げられる。−（OCH2CH2）n−Y （n＝２０〜２５０）であればより好ましい。 Specific examples of R 2 include — (OCH 2 CH 2 ) n —Y (n = 10 to 500; Y represents a hydrophilic group). - (OCH 2 CH 2) More preferably, if n -Y (n = 20~250).
Yの具体例としては、例えば、メトキシ基、水酸基、カルボキシル基等が挙げられる。 Specific examples of Y include a methoxy group, a hydroxyl group, and a carboxyl group.
３−２．製法
化合物（１）〜（５）は、例えば以下のようにして製造することができる。なお、以下には合成経路を示すが、各合成反応の具体的な反応条件については、実施例に記載の方法に準じたものとすることができる。
3-2. Manufacturing method compound (1)-(5) can be manufactured as follows, for example. In addition, although a synthetic | combination route is shown below, about the specific reaction conditions of each synthesis reaction, it can be based on the method as described in an Example.
Headのうちポリアミドデンドロン構造の部分の製法を以下の式に示す。「DG1〜DG5」の末尾はデンドロンの世代数を表しており、DG1〜DG4はそれぞれ化合物（１）〜（５）のHead部のポリアミドデンドロン構造に相当する。 A method for producing a polyamide dendron structure portion of Head is shown in the following formula. The end of “DG1 to DG5” represents the number of dendron generations, and DG1 to DG4 correspond to the polyamide dendron structure of the head part of each of the compounds (1) to (5).
DG1〜DG5の構造を以下の式に示す。 The structure of DG1 to DG5 is shown in the following formula.
親水性高分子の導入は以下のようにして行うことができる。親水性高分子としてポリエチレングリコール、又はポリオキサゾリンを導入する際の例を示す。 Introduction of the hydrophilic polymer can be performed as follows. An example of introducing polyethylene glycol or polyoxazoline as a hydrophilic polymer will be shown.
カチオン性高分子の導入は以下のようにして行うことができる。カチオン性高分子としてポリ-L-リシンを導入する際の例を示す。 The cationic polymer can be introduced as follows. An example of introducing poly-L-lysine as a cationic polymer is shown.
４．遺伝子導入用組成物
化合物（１）〜（５）とポリプレックス形成カチオン性高分子、又はリポプレックス形成カチオン性脂質の配合割合は、本発明の効果が奏される限り特に限定されない。ポリプレックス形成カチオン性高分子、又はリポプレックス形成カチオン性脂質の種類によっても異なるが、例えば、ポリプレックス形成カチオン性高分子、又はリポプレックス形成カチオン性脂質のカチオン性官能基数と、化合物（１）〜（５）のカチオン性高分子（R1）部分のカチオン性官能基数の総数のうち、化合物（１）〜（５）のカチオン性高分子（R1）部分のカチオン性官能基数が１０％以上となるように配合する割合を挙げることができる。このとき、３０％以上となるような割合であればより好ましい。
4). The blending ratio of the gene introduction composition compounds (1) to (5) and the polyplex-forming cationic polymer or the lipoplex-forming cationic lipid is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited. Depending on the type of the polyplex-forming cationic polymer or lipoplex-forming cationic lipid, for example, the number of cationic functional groups of the polyplex-forming cationic polymer or lipoplex-forming cationic lipid and the compound (1) - (5) cationic polymer (R 1) of the total number of cationic functional groups of the moiety, compounds (1) to (5) cationic polymer (R 1) cationic functional groups of the portion of 10% The ratio mix | blended so that it may become the above can be mentioned. At this time, the ratio is more preferably 30% or more.
ポリプレックス形成カチオン性高分子、又はリポプレックス形成カチオン性脂質の種類によっては、化合物（１）〜（５）の配合割合を一定割合以上としても遺伝子導入効率のさらなる向上がみられなくなる領域が存在する。このような事情を勘案すると、例えば、カチオン性官能基総数のうち、化合物（１）〜（５）の割合を８０％以下、または好ましくは７０％以下となるように配合する割合を上限として設定できる。 Depending on the type of polyplex-forming cationic polymer or lipoplex-forming cationic lipid, there is a region where further improvement in gene transfer efficiency is not observed even when the compounding ratio of compounds (1) to (5) is a certain ratio or more. To do. Considering such circumstances, for example, the ratio of the compounds (1) to (5) in the total number of cationic functional groups is set to 80% or less, or preferably 70% or less, as the upper limit. it can.
本発明の遺伝子導入用組成物は、ポリプレックス形成カチオン性高分子、及びリポプレックス形成カチオン性脂質を組み合わせて含んでいてもよい。これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。 The composition for gene introduction of the present invention may contain a combination of a polyplex-forming cationic polymer and a lipoplex-forming cationic lipid. These can be used alone or in combination of two or more.
遺伝子と遺伝子導入用組成物の配合割合は、遺伝子のリン酸基数に対し、遺伝子導入用組成物のカチオン性官能基数を１〜３０倍、好ましくは３〜２０倍、より好ましくは５〜１０倍使用する。 The mixing ratio of the gene and the gene introduction composition is 1 to 30 times, preferably 3 to 20 times, more preferably 5 to 10 times the number of cationic functional groups of the gene introduction composition relative to the number of phosphate groups of the gene. use.
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよいが、より好ましくはプラスミドＤＮＡ（pDNA）である。特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができる。 The gene may be any of oligonucleotide, DNA and RNA, but is more preferably plasmid DNA (pDNA). In particular, genes introduced for in vitro such as transformation, genes that act by expression in vivo, such as genes for gene therapy, genes used for breeding of industrial animals such as laboratory animals and livestock preferable. Examples of genes for gene therapy include genes encoding physiologically active substances such as antisense oligonucleotides, antisense DNAs, antisense RNAs, enzymes, and cytokines.
遺伝子が導入される細胞としては、ヒトなどの動物細胞、植物細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞が例示できる。 Examples of cells into which genes are introduced include animal cells such as humans, eukaryotic cells such as plant cells, and prokaryotic cells such as bacteria.
本発明の組成物の形態としては、例えば、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。 Examples of the form of the composition of the present invention include a dried lipid mixture form, a form dispersed in an aqueous solvent, a dried form, and a frozen form.
水系溶媒（分散媒）の組成も特に限定されるべきものではないが、水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが重要である。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、糖水溶液を、凍結保存する場合には、糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。 The composition of the aqueous solvent (dispersion medium) is not particularly limited, but in addition to water, sugar aqueous solutions such as glucose, lactose and sucrose, polyhydric alcohol aqueous solutions such as glycerin and propylene glycol, and phosphate buffer And buffer solutions such as citrate buffer solution and phosphate buffered physiological saline solution, physiological saline, medium for cell culture, and the like. In order to stably store the lipid membrane structure dispersed in the aqueous solvent for a long period of time, it is important to eliminate the electrolyte in the aqueous solvent as much as possible from the viewpoint of physical stability such as aggregation. From the viewpoint of chemical stability of the lipid, it is important to set the pH of the aqueous solvent from weakly acidic to neutral (pH 3.0 to 8.0) or to remove dissolved oxygen by nitrogen bubbling. . Further, when lyophilized storage or spray-dried storage is used, effective storage is possible by using a sugar aqueous solution, and when storing frozen, a sugar aqueous solution or a polyhydric alcohol aqueous solution is used.
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、２から２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５から１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、１から５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２から２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が５から５０ｍＭが好ましく、１０から２０ｍＭがさらに好ましい。 The concentration of these aqueous solvent additives is not particularly limited. For example, in an aqueous sugar solution, 2 to 20% (W / V) is preferable, and 5 to 10% (W / V) is more preferable. preferable. Moreover, in a polyhydric alcohol aqueous solution, 1 to 5% (W / V) is preferable, and 2 to 2.5% (W / V) is more preferable. In the buffer solution, the concentration of the buffer is preferably 5 to 50 mM, more preferably 10 to 20 mM.
本発明の遺伝子導入用組成物は、遺伝子だけでなく、親水性の大きい薬物、高分子量の生理活性ペプチド類、蛋白質などの細胞内に導入されにくい薬物などにも適用できる。本発明の組成物を用いれば、イン・ビトロ及びイン・ビボのいずれにおいても細胞内に遺伝子を効率良く導入することができる。 The gene introduction composition of the present invention can be applied not only to genes but also to drugs that are difficult to be introduced into cells such as highly hydrophilic drugs, high molecular weight physiologically active peptides and proteins. By using the composition of the present invention, a gene can be efficiently introduced into cells both in vitro and in vivo.
イン・ビトロでの遺伝子導入は、標的とする細胞を含む懸濁液に本発明の遺伝子導入用組成物と遺伝子の混合物を添加したり、本発明の遺伝子導入用組成物と遺伝子を含有する培地で標的とする細胞を培養する等の手段により、行うことができる。 In vitro gene transfer can be achieved by adding the gene transfer composition of the present invention and a gene mixture to a suspension containing target cells, or a medium containing the gene transfer composition of the present invention and a gene. Can be performed by means such as culturing target cells.
イン・ビボでの遺伝子導入は、本発明の遺伝子導入用組成物と遺伝子の混合物を宿主に投与すればよい。宿主への投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。剤形としては、通常知られたものでよく、経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等を挙げることができる。また、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。 In vivo gene transfer may be performed by administering the gene transfer composition of the present invention and a mixture of genes to a host. The means for administration to the host may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration is preferred. The dosage form may be a conventionally known dosage form, and examples of the dosage form for oral administration include tablets, powders, granules, syrups and the like. Examples of the dosage form for parenteral administration include injections, eye drops, ointments, suppositories and the like. Among these, an injection is preferable, and an administration method is preferably intravenous injection or local injection into a target cell or organ.
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
製造例．本発明のTail−Linker−Head化合物（４）及び（５）の製造
以下のようにして、本発明の化合物（４）及び（５）（Tail−Linker−Head化合物）を製造した。
Manufacturing example. Production of Tail-Linker-Head Compounds (4) and (5) of the Present Invention Compounds (4) and (5) (Tail-Linker-Head compounds) of the present invention were produced as follows.
１．種々世代数のポリアミドアミンデンドロンの合成
tert-ブチル N-(2-アミノエチル)カルバミン酸 3.012 g(1.880×10-2 mol)を451 ml (11.1mol)のメタノールに溶解させた。これにアクリル酸メチル1000 ml(11.1 mol)を Ar 雰囲気下において加え、35 ℃ で 7 日間撹拌した。その後、アクリル酸メチルを減圧留去して得られた粗生成物を、シリカゲルを用いたカラム(溶離液：クロロホルム:メタノール＝10:1、v/v)によって精製し、薄黄色で粘性のある液体を得た。得られた液体 5.954 g(1.791×10-2mol)を12 ml のメタノールに溶解させ、Ar 雰囲気下において、蒸留したエチレンジアミン 1200 ml(17.911 mol)とシアン化ナトリウム0.351 g(7.16×10-3mol)を加えた後、40 ℃で 8 日間撹拌した。その後、エチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20 カラム(溶離液：メタノール)によって精製することで、DG1を薄黄色で粘性のある液体として得た。DG1 2.290 g (5.895×10-3 mol)を476 ml のメタノールに溶解させ、アクリル酸メチル1062 ml(11.79 mol)を加え 35 ℃ で 4 日間撹拌した。その後、アクリル酸メチルを減圧留去して得られた粗生成物を Sephadex LH-20 カラム(溶離液：メタノール)によって精製することで、薄黄色で粘性のある液体を得た。得られた液体 2.540 g(3.466×10-3 mol)を 10 ml のメタノールに溶解させ、Ar 雰囲気下において、蒸留したエチレンジアミン 465 ml(6.93 mol)とシアン化ナトリウム0.1359 g(2.773×10-3 mol)を加えた後、35 ℃ で 6 日間撹拌した。その後、エチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20 カラム(溶離液：メタノール)によって精製することで、DG2を薄黄色で粘性のある液体として得た。DG2 1.543 g (1.826×10-3 mol)を295 ml のメタノールに溶解し、アクリル酸メチル658 ml (7.303 mol)を加え 35 ℃で 7 日間撹拌した。その後、アクリル酸メチルを減圧留去して得られた粗生成物を、Sephadex LH-20 カラム(溶離液：メタノール)によって精製することで、薄黄色で粘性のある液体を得た。得られた液体 2.610 g(1.702×10-3 mol)を 10 ml のメタノールに溶解させ、Ar 雰囲気下において蒸留したエチレンジアミン 915 ml(13.66 mol)とシアン化ナトリウム0.2678 g(5.464×10-3mol)を加えた後、35 ℃ で 7 日間撹拌した。その後、エチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20 カラム(溶離液：メタノール)によって精製することで、DG3を薄黄色で粘性のある液体として得た。DG3 1.605 g (9.13×10-4 mol)を300 ml のメタノールに溶解し、アクリル酸メチル658 ml (7.303 mol)を加え 35 ℃で 7 日間撹拌した。その後、アクリル酸メチルを減圧留去して得られた粗生成物を、Sephadex LH-20 カラム(溶離液：メタノール)によって精製することで、薄黄色で粘性のある液体を得た。得られた液体 1.057 g（3.371×10-4 mol）を5 mlのメタノールに溶解させ、Ar雰囲気下において、蒸留したエチレンジアミン361 ml（5.388 mol）とシアン化ナトリウム0.106 g（2.158×10-3 mol）の混合溶液へ加えた後、40℃で6日間撹拌した。その後、エチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム（溶離液：メタノール）によって精製することで、DG4を薄黄色で粘性のある液体として得た。DG4 0.299 g（8.341×10-5mol）を20 ml（0.493 mol）のメタノールに溶解させ、アクリル酸メチル46 ml（0.511 mol）を加え35℃で6日間撹拌した。その後、アクリル酸メチルを減圧留去して得られた粗生成物を、Sephadex LH-20カラム（溶離液：メタノール）によって精製することで、薄黄色で粘性のある液体を得た。得られた液体 0.122 g（1.924×10-5 mol）を6 mlのメタノールに溶解させ、Ar雰囲気下において、蒸留したエチレンジアミン41 ml（0.616 mol）とシアン化ナトリウム0.012 g（2.464×10-4 mol）の混合溶液へ加えた後、40℃で7日間撹拌した。その後、エチレンジアミンを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム（溶離液：メタノール）によって精製することで、DG5を薄黄色で粘性のある液体として得た。
1. Synthesis of polyamine amine dendrons of various generations
tert-Butyl N- (2-aminoethyl) carbamic acid 3.012 g (1.880 × 10 −2 mol) was dissolved in 451 ml (11.1 mol) of methanol. To this was added 1000 ml (11.1 mol) of methyl acrylate under Ar atmosphere, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 7 days. After that, the crude product obtained by distilling off methyl acrylate under reduced pressure was purified by a column using silica gel (eluent: chloroform: methanol = 10: 1, v / v), pale yellow and viscous A liquid was obtained. Dissolve 5.954 g (1.791 × 10 -2 mol) of the resulting liquid in 12 ml of methanol, and in an Ar atmosphere, distilled ethylenediamine 1200 ml (17.911 mol) and sodium cyanide 0.351 g (7.16 × 10 -3 mol) ) And then stirred at 40 ° C. for 8 days. Thereafter, ethylenediamine was distilled off under reduced pressure and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain DG1 as a light yellow viscous liquid. 2.290 g (5.895 × 10 −3 mol) of DG1 was dissolved in 476 ml of methanol, 1062 ml (11.79 mol) of methyl acrylate was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 4 days. Thereafter, the crude product obtained by distilling off methyl acrylate under reduced pressure was purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain a light yellow viscous liquid. 2.540 g (3.466 × 10 -3 mol) of the resulting liquid was dissolved in 10 ml of methanol, and 465 ml (6.93 mol) of distilled ethylenediamine and 0.1359 g (2.773 × 10 -3 mol) of sodium cyanide were distilled in an Ar atmosphere. ) Was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 6 days. Thereafter, ethylenediamine was distilled off under reduced pressure and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain DG2 as a light yellow viscous liquid. DG2 1.543 g (1.826 × 10 −3 mol) was dissolved in 295 ml of methanol, methyl acrylate 658 ml (7.303 mol) was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 7 days. Thereafter, the crude product obtained by distilling off methyl acrylate under reduced pressure was purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain a light yellow viscous liquid. 2.610 g (1.702 × 10 -3 mol) of the resulting liquid was dissolved in 10 ml of methanol and 915 ml (13.66 mol) of ethylenediamine distilled in an Ar atmosphere and 0.2678 g (5.464 × 10 -3 mol) of sodium cyanide After stirring, the mixture was stirred at 35 ° C. for 7 days. Thereafter, ethylenediamine was distilled off under reduced pressure and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain DG3 as a light yellow viscous liquid. DG3 1.605 g (9.13 × 10 −4 mol) was dissolved in 300 ml of methanol, 658 ml (7.303 mol) of methyl acrylate was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 7 days. Thereafter, the crude product obtained by distilling off methyl acrylate under reduced pressure was purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain a light yellow viscous liquid. 1.057 g (3.371 × 10 -4 mol) of the resulting liquid was dissolved in 5 ml of methanol, and 361 ml (5.388 mol) of distilled ethylenediamine and 0.106 g (2.158 × 10 -3 mol) of sodium cyanide were distilled in an Ar atmosphere. ) And then stirred at 40 ° C. for 6 days. Then, ethylenediamine was distilled off under reduced pressure and purified by Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain DG4 as a light yellow viscous liquid. DG4 0.299 g (8.341 × 10 −5 mol) was dissolved in 20 ml (0.493 mol) of methanol, 46 ml (0.511 mol) of methyl acrylate was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 6 days. Thereafter, the crude product obtained by distilling off methyl acrylate under reduced pressure was purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain a light yellow viscous liquid. 0.122 g (1.924 × 10 -5 mol) of the resulting liquid was dissolved in 6 ml of methanol, and 41 ml (0.616 mol) of distilled ethylenediamine and 0.012 g (2.464 × 10 -4 mol) of sodium cyanide were obtained in an Ar atmosphere. ) And then stirred at 40 ° C. for 7 days. Thereafter, ethylenediamine was distilled off under reduced pressure and purified by a Sephadex LH-20 column (eluent: methanol) to obtain DG5 as a light yellow viscous liquid.
２．ポリアミドアミンデンドロン先端部へのポリエチレングリコール鎖の導入
α-methoxy-ω-hydroxy-poly(ethylene glycol)（Mn=2000）39.80 g（19.90×10-3 mol）とTEA 12.5 ml（89.68×10-3 mol）をTHF 670 mlへ溶解させた溶液に、クロロ蟻酸-4-ニトロフェニル12.033 g（59.70×10-3mol）をTHF 130 mlへ溶解させた溶液を氷冷下で1時間かけて滴下した。さらに氷冷下で2時間撹拌後、室温で48時間撹拌した。得られた溶液を濾過した後、THFを減圧留去して、クロロホルム200 mlに溶解させた。この溶液を飽和塩化ナトリウム水溶液を用いて分液洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムによって乾燥させた。有機層をジエチルエーテル3 Lに対して再沈殿した。得られた沈殿を吸引濾過した後、減圧下で乾燥させた。乾燥固体をベンゼン 100 mlに溶解させ、凍結乾燥してα-methoxy-ω-(p-nitrophenylcarbonate)-poly(ethylene glycol)（PEG-NPC）を白色固体として得た。
2. Introduction of Polyethylene Glycol Chain into Polyamideamine Dendron Tip Part α-methoxy-ω-hydroxy-poly (ethylene glycol) (Mn = 2000) 39.80 g (19.90 × 10 -3 mol) and TEA 12.5 ml (89.68 × 10 -3 mol) was dissolved in 670 ml of THF, and a solution of 12.033 g (59.70 × 10 -3 mol) of chloroformate-4-nitrophenyl in 130 ml of THF was added dropwise over 1 hour under ice cooling. . The mixture was further stirred for 2 hours under ice cooling and then for 48 hours at room temperature. After filtering the obtained solution, THF was distilled off under reduced pressure and dissolved in 200 ml of chloroform. This solution was separated and washed with a saturated aqueous sodium chloride solution, and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The organic layer was reprecipitated against 3 L of diethyl ether. The resulting precipitate was filtered with suction and then dried under reduced pressure. The dried solid was dissolved in 100 ml of benzene and freeze-dried to obtain α-methoxy-ω- (p-nitrophenylcarbonate) -poly (ethylene glycol) (PEG-NPC) as a white solid.
DG4 0.365 g（0.102×10-3 mol）をDMSO 4 mlへ溶解させ、そこへDMSO 46 mlへ溶解させたPEG-NPC 20.337 g（9.393×10-3mol）を加えた。室温で5日間撹拌した後、反応溶液をジエチルエーテル1.5 Lに対して再沈殿した。得られた沈殿を吸引濾過した後、減圧下で乾燥させた。残渣をメタノール50 mlへ溶解させ、未反応のPEG-NPCをPEG-OHに変換するためにTEA 10.5 ml（7.533×10-2 mol）と蒸留水1.353 ml（7.514×10-2 mol）を加えて、水浴下で20時間攪拌した。反応溶液をジエチルエーテル1.5 Lに対して再沈殿した後、得られた沈殿を吸引濾過し、減圧下で乾燥させた。残渣を1M NaCl水溶液に対して分画14000の透析膜を用い精製した後、さらに蒸留水に対して精製を行い、凍結乾燥してPEG鎖１６本を有するDG4（16PEG-DG4）とPEG-OHの混合物を白色固体として得た。16PEG-DG4とPEG-OHの混合物0.842gを氷冷下でTFA 7 ml（9.086×10-2 mol）に溶解させ、6時間撹拌した。反応後、ジエチルエーテル 350 ml に対して再沈殿し、吸引濾過したのち減圧下で乾燥させた。残渣を蒸留水に溶解させ、 NaOH水溶液で中和し、溶液を減圧濃縮した。蒸留水に対して分画14000 の透析膜を用いて精製した後、凍結乾燥をして白色固体を得た。得られた固体を50 mM 酢酸緩衝溶液（pH 4.5）に溶解させ、CM Sepharoseカラムに吸着させた後、1M NaCl含有50 mM酢酸緩衝溶液（pH 4.5）を溶出液として回収した。減圧濃縮した後、蒸留水に対して分画 14000 の透析膜を用いて精製し、凍結乾燥して16PEG-DG4を白色固体として得た。
DG4 0.365 g (0.102 × 10 −3 mol) was dissolved in DMSO 4 ml, and PEG-NPC 20.337 g (9.393 × 10 −3 mol) dissolved in DMSO 46 ml was added thereto. After stirring at room temperature for 5 days, the reaction solution was reprecipitated against 1.5 L of diethyl ether. The resulting precipitate was filtered with suction and then dried under reduced pressure. The residue was dissolved in
DG5 0.225 g（3.082×10-5 mol）をDMSO 11 mlに溶解させ、そこへDMSO 20 mlに溶解させたPEG-NPC 10.68 g（4.931×10-3mol）を加えた。室温で7日間撹拌した後、反応溶液をジエチルエーテル1 Lに対して再沈殿した。得られた沈殿を吸引濾過した後、減圧下で乾燥させた。残渣をメタノール31 mlへ溶解させ、未反応の PEG-NPC を PEG-OH に変換するために、TEA 5.5 ml（3.945×10-2mol）と蒸留水710μl（3.945×10-2 mol）を加えて、水浴下で3日間攪拌した。反応溶液をジエチルエーテル1 Lに対して再沈殿した後、得られた沈殿を吸引濾過し、減圧下で乾燥させた。残渣を1M NaCl水溶液に対して分画2000の透析膜を用い精製した後、さらに蒸留水に対して精製を行い、凍結乾燥してPEG鎖３２本を有するDG5（32PEG-DG5）とPEG-OHの混合物を白色固体として得た。32PEG-DG5.0とPEG-OHの混合物0.774 gを氷冷下でTFA 6.45 ml（8.372×10-2 mol）に溶解させ、12時間撹拌した。反応後、ジエチルエーテル 200 ml に対して再沈殿し、吸引濾過したのち減圧下で乾燥させた。残渣を蒸留水に溶解させ、 NaOH水溶液で中和し、溶液を減圧濃縮した。蒸留水に対して分画2000 の透析膜を用いて精製した後、凍結乾燥をして白色固体を得た。得られた固体を10 mM 酢酸緩衝溶液（pH 4.5）に溶解させ、CM Sepharoseカラムに吸着させた後、1M NaCl含有10 mM酢酸緩衝溶液（pH 4.5）を溶出液として回収した。減圧濃縮した後、蒸留水に対して分画 2000 の透析膜を用いて精製し、凍結乾燥して32PEG-DG5を白色固体として得た。
DG5 0.225 g (3.082 × 10 −5 mol) was dissolved in DMSO 11 ml, and PEG-NPC 10.68 g (4.931 × 10 −3 mol) dissolved in
３．ポリリシン部の重合
16PEG-DG4 0.231 gを開始剤として、Ar雰囲気下においてDMF 1.5 mlへ溶解させた。ここへDMF 0.5 mlに溶解させたε-benzyloxycarbonyl-L-lysine N-カルボン酸無水物（Lys(Z)-NCA） 0.14 gを加え、40℃で24時間撹拌することで、Lys(Z)-NCAを重合させた。重合終了後、氷冷下でジエチルエーテルに対して反応溶液を再沈殿し、減圧乾燥を行うことで白色固体を得た。得られた固体 0.227 gをトリフルオロ酢酸 3.5mlへ溶解させた後、30 %臭化水素-酢酸溶液 4.7mlを加え、4時間撹拌した。これをジエチルエーテルに対して再沈殿した。残渣を1M NaCl水溶液に対して分画2000の透析膜を用い精製した後、さらに蒸留水に対して精製を行い、凍結乾燥して白色固体を得た。蒸留水に溶解し、1 M塩化ナトリウム水溶液、蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥することで16PEG-PLL（PLL重合度 75）を得た。
3. Polymerization of polylysine moiety
16PEG-DG4 0.231 g was used as an initiator and dissolved in 1.5 ml of DMF under Ar atmosphere. Here, 0.14 g of ε-benzyloxycarbonyl-L-lysine N-carboxylic acid anhydride (Lys (Z) -NCA) dissolved in 0.5 ml of DMF was added and stirred at 40 ° C for 24 hours. Lys (Z)- NCA was polymerized. After completion of the polymerization, the reaction solution was reprecipitated against diethyl ether under ice-cooling, and dried under reduced pressure to obtain a white solid. After 0.227 g of the obtained solid was dissolved in 3.5 ml of trifluoroacetic acid, 4.7 ml of 30% hydrogen bromide-acetic acid solution was added and stirred for 4 hours. This was reprecipitated against diethyl ether. The residue was purified against a 1M NaCl aqueous solution using a dialysis membrane of fraction 2000, further purified against distilled water, and lyophilized to obtain a white solid. It was dissolved in distilled water, dialyzed against 1 M aqueous sodium chloride solution and distilled water, and then freeze-dried to obtain 16PEG-PLL (PLL polymerization degree 75).
32PEG-DG5 0.335 gを開始剤として、Ar雰囲気下においてDMF 1.5 mlへ溶解させた。ここへDMF 0.5 mlに溶解させたε-benzyloxycarbonyl-L-lysine N-カルボン酸無水物（Lys(Z)-NCA） 0.11 gを加え、40℃で24時間撹拌することで、Lys(Z)-NCAを重合させた。重合終了後、氷冷下でジエチルエーテルに対して反応溶液を再沈殿し、減圧乾燥を行うことで白色固体を得た。得られた固体 0.35 gをトリフルオロ酢酸 4.0mlへ溶解させた後、30 %臭化水素-酢酸溶液 3.8mlを加え、4時間撹拌した。これをジエチルエーテルに対して再沈殿した。残渣を1M NaCl水溶液に対して分画2000の透析膜を用い精製した後、さらに蒸留水に対して精製を行い、凍結乾燥して白色固体を得た。蒸留水に溶解し、1 M塩化ナトリウム水溶液、蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥することで32PEG-PLL（PLL重合度 72）を得た。 32PEG-DG5 0.335 g was used as an initiator and dissolved in 1.5 ml of DMF under Ar atmosphere. Add 0.11 g of ε-benzyloxycarbonyl-L-lysine N-carboxylic anhydride (Lys (Z) -NCA) dissolved in 0.5 ml of DMF and stir at 40 ° C for 24 hours. NCA was polymerized. After completion of the polymerization, the reaction solution was reprecipitated against diethyl ether under ice-cooling, and dried under reduced pressure to obtain a white solid. After 0.35 g of the obtained solid was dissolved in 4.0 ml of trifluoroacetic acid, 3.8 ml of 30% hydrogen bromide-acetic acid solution was added and stirred for 4 hours. This was reprecipitated against diethyl ether. The residue was purified against a 1M NaCl aqueous solution using a dialysis membrane of fraction 2000, further purified against distilled water, and lyophilized to obtain a white solid. It was dissolved in distilled water, dialyzed against 1 M sodium chloride aqueous solution and distilled water, and then freeze-dried to obtain 32PEG-PLL (PLL polymerization degree 72).
試験例１．本発明のTail−Linker−Head化合物のDNA凝縮能
ポリ-L-リジン等のカチオン性高分子をDNA（pDNA）と混合するとポリプレックス形成が起こり、DNAが凝集する。カチオン性高分子である本発明のTail−Linker−Head化合物をDNAと混合することによって、同様のDNA凝集が起こるかについて検討した。
Test Example 1 When a cationic polymer such as poly-L-lysine, which is a DNA condensing ability of the tail-linker-head compound of the present invention, is mixed with DNA (pDNA), polyplex formation occurs and DNA aggregates. It was examined whether the same DNA aggregation occurs when the Tail-Linker-Head compound of the present invention, which is a cationic polymer, is mixed with DNA.
16PEG-PLL、32PEG-PLL及びPLL（重合度 68）の140mM NaClを含む20 mM Tris-HCl溶液（以下トリス緩衝液）をそれぞれ調製し、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたpDNA（pCMV Luc）のトリス緩衝液溶液（0.5μg/5μl）にpDNAのリン酸エステル数に対して、種々の16PEG-PLL及びPLLのPLL部のアミノ基数になるように加えて混合し、4℃で1晩インキュベーションしてポリプレックスを調製した。このポリプレックス溶液にDNAの塩基対数に対して0.033当量のエチジウムブロマイドを加え、蛍光強度測定（励起波長 510nm、蛍光波長 590nm）を行った。pDNAとエチジウムブロマイドの混合溶液の蛍光強度を100％、エチジウムブロマイドのみの溶液の蛍光強度を0%としてrelative fluorescence intensity（RFI）を算出した。また、同様に調製したポリプレックス溶液に2.5μl の10X BlueJuiceを加え、40 mMTris/20 mM NaOAc/2mM EDTA-2Naバッファー中において、1レーン当たりDNAが0.4μgになるように10μl を0.6 wt%アガロースゲル（0.1 wt% EtBr含有）に加え、100 Vの電圧下、30分間 Mupid(登録商標)-exゲル泳動槽（ADVANCE Co.）を用いて、電気泳動を行った。泳動後、ゲルをルミノ・イメージアナライザー LAS-1000UVmini（FUJIFILM）を用いて画像化した。N/P比が3.00で調製したポリプレックス溶液については、表面を剥離した直後のマイカ（2cm×2cm）に10μlをたらし、一晩静置し乾燥した後、原子間力顕微鏡観察を行った。 Prepare 20 mM Tris-HCl solution (hereinafter referred to as “Tris buffer”) containing 140 mM NaCl of 16PEG-PLL, 32PEG-PLL and PLL (polymerization degree 68), respectively. Tris buffer solution of pDNA (pCMV Luc) encoding luciferase gene Add the solution (0.5μg / 5μl) to the number of phosphate groups of pDNA to the number of amino groups in the PLL part of various 16PEG-PLL and PLL, mix and incubate at 4 ° C overnight. Was prepared. To this polyplex solution, 0.033 equivalent of ethidium bromide was added with respect to the number of DNA base pairs, and fluorescence intensity was measured (excitation wavelength: 510 nm, fluorescence wavelength: 590 nm). The relative fluorescence intensity (RFI) was calculated with the fluorescence intensity of the mixed solution of pDNA and ethidium bromide as 100% and the fluorescence intensity of the solution containing only ethidium bromide as 0%. Also, add 2.5 μl of 10X BlueJuice to the polyplex solution prepared in the same way, and add 10 μl of 0.6 wt% agarose so that the DNA per lane is 0.4 μg in 40 mM Tris / 20 mM NaOAc / 2 mM EDTA-2Na buffer. In addition to the gel (containing 0.1 wt% EtBr), electrophoresis was performed using a Mupid (registered trademark) -ex gel electrophoresis tank (ADVANCE Co.) under a voltage of 100 V for 30 minutes. After electrophoresis, the gel was imaged using a lumino image analyzer LAS-1000UVmini (FUJIFILM). For the polyplex solution prepared with an N / P ratio of 3.00, pour 10 μl of mica (2 cm × 2 cm) immediately after peeling off the surface, let it stand overnight and dry, and then observed with an atomic force microscope .
図２Ａに示す通り、ポリ-L-リジン（PLL）とDNAとを混合した場合、ポリリジン中のアミノ基の数（N）とpDNA中のリン酸基の数（P）の比（N/P比）の変化に伴って、relative fluorescence intensity (RFI) が低下したことから、pDNAがPLLとのポリプレックス形成により凝縮することが確認された。また、電気泳動において（図２Ｂ）、N/P比の増加により泳動している遊離のpDNA量が減少することも確認された。 As shown in FIG. 2A, when poly-L-lysine (PLL) and DNA are mixed, the ratio of the number of amino groups in polylysine (N) to the number of phosphate groups in pDNA (P) (N / P The relative fluorescence intensity (RFI) decreased with a change in the ratio), confirming that pDNA was condensed by the formation of a polyplex with PLL. Moreover, in electrophoresis (FIG. 2B), it was also confirmed that the amount of free pDNA migrating decreased as the N / P ratio increased.
ところが、本発明の化合物（16PEG-PLLおよび32PEG-PLL）をpDNAと混合させたとしても、RFIの低下は生じずpDNAは非凝縮状態であることが確認された。しかしながら、電気泳動では、N/P比の増加によりpDNAの泳動距離が短くなり、N/P比が3では泳動しなくなった。このことは、本発明の化合物（16PEG-PLLおよび32PEG-PLL）は、pDNAとポリプレックスを形成するが、pDNAの凝縮が起こらないことを示している。 However, even when the compounds of the present invention (16PEG-PLL and 32PEG-PLL) were mixed with pDNA, the RFI did not decrease and it was confirmed that the pDNA was in a non-condensed state. However, in electrophoresis, the increase in the N / P ratio shortened the migration distance of pDNA, and when the N / P ratio was 3, electrophoresis stopped. This indicates that the compounds of the present invention (16PEG-PLL and 32PEG-PLL) form a polyplex with pDNA, but no pDNA condensation occurs.
さらに、図２Ｄに示す通り、PLLとpDNAとを混合した場合には、直径約０．４〜１．０μmの球状ポリプレックスが形成されるが、本発明の化合物（16PEG-PLL）とDNAとを同様に混合した場合には、長さ約150〜200nmのより小さな棒状ポリプレックスが形成されることが分かった（図２Ｅ）。 Furthermore, as shown in FIG. 2D, when PLL and pDNA are mixed, a spherical polyplex having a diameter of about 0.4 to 1.0 μm is formed, but the compound of the present invention (16PEG-PLL) and DNA It was found that smaller rod-like polyplexes having a length of about 150 to 200 nm were formed when the same were mixed (FIG. 2E).
試験例２．DNA凝縮能と無細胞系遺伝子発現との相関
PLL及びポリエチレンイミン（PEI、分子量 25kDa）を用い、そのDNA凝集能と遺伝子発現効率との間にどのような相関関係があるかについて検討を行った。
Test Example 2 Correlation between DNA condensing capacity and cell-free gene expression
Using PLL and polyethyleneimine (PEI,
16PEG-PLL、32PEG-PLL、PLL（重合度 68）及びPEIのトリス緩衝液溶液をそれぞれ調製した後、16PEG-PLL溶液あるいは32PEG-PLL溶液と、PLLあるいはPEI溶液を、混合溶液中のPLLの比率を変化させて混合した。この混合溶液を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたpDNA（pCMV Luc）のトリス緩衝液溶液（0.5μg/5μl）にpDNAのリン酸エステル数に対するPLL部のアミノ基数がPLLの場合３．０、PEIの場合５．０になるように加えて混合し、4℃で1晩インキュベーションしてポリプレックスを調製した。このポリプレックス溶液にDNAの塩基対数に対して0.033当量のエチジウムブロマイドを加え、蛍光強度測定（励起波長 510nm、蛍光波長 590nm）を行った。また、PLLと16PEG-PLL、32PEG-PLLを混合した場合には、無細胞系遺伝子発現効率も評価した。1μgのpDNAを含むポリプレックス溶液50μLと40μLのTNT(登録商標) Quick Master Mix (Promega) と 2μLのmethionine水溶液 (1 mM)を混合し、30℃で90分間反応させた。反応溶液 5μLと 50μLのLuciferase Assay Reagent (Promega) を混合し、発光強度を測定した。ポリプレックスを形成させていていないpDNA溶液についても同様の反応を行い、発光強度を測定した。pDNAのみでの発光強度に対するポリプレックスの発光強度の比率からrelative gene expression（RGE）を算出した。 After preparing 16 PEG-PLL, 32 PEG-PLL, PLL (polymerization degree 68) and PEI Tris buffer solution respectively, 16 PEG-PLL solution or 32 PEG-PLL solution and PLL or PEI solution are mixed with the PLL in the mixed solution. The ratio was changed and mixed. When this mixed solution is added to a Tris buffer solution (0.5 μg / 5 μl) of pDNA encoding luciferase gene (0.5 μg / 5 μl), the number of amino groups in the PLL part relative to the number of phosphates in pDNA is 3.0, and in the case of PEI A polyplex was prepared by adding to 5.0 and mixing and incubating at 4 ° C. overnight. To this polyplex solution, 0.033 equivalent of ethidium bromide was added with respect to the number of DNA base pairs, and fluorescence intensity was measured (excitation wavelength: 510 nm, fluorescence wavelength: 590 nm). In addition, when PLL, 16PEG-PLL, and 32PEG-PLL were mixed, cell-free gene expression efficiency was also evaluated. 50 μL of a polyplex solution containing 1 μg of pDNA, 40 μL of TNT (registered trademark) Quick Master Mix (Promega) and 2 μL of methionine aqueous solution (1 mM) were mixed and reacted at 30 ° C. for 90 minutes. The reaction solution (5 μL) and 50 μL of Luciferase Assay Reagent (Promega) were mixed, and the luminescence intensity was measured. A similar reaction was performed on the pDNA solution in which no polyplex was formed, and the luminescence intensity was measured. Relative gene expression (RGE) was calculated from the ratio of the luminescence intensity of polyplex to the luminescence intensity of pDNA alone.
図３Ａ及び図４に示す通り、PLL及びPEIの含有量が低い場合はpDNAが凝縮していないのに対して、含有量が高い場合はpDNAが凝縮していることが分かった。凝縮状態と非凝縮状態の境界は、PLLとPEIで異なっており、カチオン性高分子の違いによって本発明の化合物の効果が異なることが分かった。同時に遺伝子発現効率についても検討したところ、PLLの含有量が低くpDNA凝縮がみられない領域では遺伝子発現効率が高いのに対して、pDNA凝縮がみられる領域では遺伝子発現効率が低いことが分かった（図３Ｂ）。このように、pDNAの凝縮状態と遺伝子発現効率との間には相関関係があることが分かった。 As shown in FIGS. 3A and 4, it was found that pDNA was not condensed when the contents of PLL and PEI were low, whereas pDNA was condensed when the contents were high. The boundary between the condensed state and the non-condensed state is different between PLL and PEI, and it was found that the effect of the compound of the present invention differs depending on the difference in the cationic polymer. At the same time, the gene expression efficiency was examined, and it was found that the gene expression efficiency was high in the region where pDNA condensation was observed, whereas the gene expression efficiency was high in the region where the PLL content was low and pDNA condensation was not observed. (FIG. 3B). Thus, it was found that there is a correlation between the condensed state of pDNA and the gene expression efficiency.
実施例１．
PLLとDNAの凝集体を予め生じさせておき、そこへ本発明の化合物（５）を外部から添加することによって、DNA凝集がどのような影響を受けるかについて検討した。
Example 1.
An aggregation of PLL and DNA was generated in advance, and the influence of DNA aggregation on the addition of the compound (5) of the present invention from the outside was examined.
PLLのトリス緩衝液溶液を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたpDNA（pCMV Luc）のトリス緩衝液溶液（0.5μg/5μl）にpDNAのリン酸エステル数に対するPLL部のアミノ基数が１．５になるように加えて混合し、4℃で1晩インキュベーションしてポリプレックスを調製した。このポリプレックス溶液へ、16PEG-PLL、32PEG-PLLあるいはPLLのエチジウムブロマイドを含むトリス緩衝液溶液を、pDNAのリン酸エステル数に対してPLL部のアミノ基数が１．５（さきに調製したあったものとあわせると３．０）となるよう混合し、混合後の蛍光強度変化を測定した。また、16PEG-PLL、32PEG-PLLあるいはPLLのエチジウムブロマイドを含むトリス緩衝液溶液を加えて３０分経過した後、1μgのpDNAを含むポリプレックス溶液と40μL のTNT(登録商標) Quick Master Mix (Promega) と 2μLのmethionine水溶液 (1 mM)を混合し、30℃で90分間反応させた。反応溶液5μLと 50μLのLuciferase Assay Reagent (Promega) を混合し、発光強度を測定した。ポリプレックスを形成させていていないpDNA溶液についても同様の反応を行い、発光強度を測定した。pDNAのみでの発光強度に対するポリプレックスの発光強度の比率からrelative gene expression（RGE）を算出した。 The PLL tris buffer solution is added to the pDNA (pCMV Luc) tris buffer solution (0.5 μg / 5 μl) that encodes the luciferase gene so that the number of amino groups in the PLL part is 1.5 with respect to the number of phosphate esters of pDNA. In addition, the polyplex was prepared by mixing and incubating overnight at 4 ° C. To this polyplex solution, a Tris buffer solution containing 16 PEG-PLL, 32 PEG-PLL, or PLL ethidium bromide was used. When combined with the above, the mixture was mixed to give 3.0), and the change in fluorescence intensity after mixing was measured. In addition, after adding Tris buffer solution containing 16 PEG-PLL, 32 PEG-PLL or PLL ethidium bromide for 30 minutes, polyplex solution containing 1 μg of pDNA and 40 μL of TNT (registered trademark) Quick Master Mix (Promega ) And 2 μL of methionine aqueous solution (1 mM) were mixed and reacted at 30 ° C. for 90 minutes. 5 μL of the reaction solution and 50 μL of Luciferase Assay Reagent (Promega) were mixed, and the luminescence intensity was measured. A similar reaction was performed on the pDNA solution in which no polyplex was formed, and the luminescence intensity was measured. Relative gene expression (RGE) was calculated from the ratio of the luminescence intensity of polyplex to the luminescence intensity of pDNA alone.
図５Ａに示す通り、本発明の化合物（16PEG-PLL及び32PEG-PLL）を添加することによって、凝縮していたpDNAが脱凝縮した。同時に遺伝子導入効率についても検討したところ、PLLとpDNAの凝集体の状態に比べ、化合物（16PEG-PLL及び32PEG-PLL）を添加して脱凝縮させた状態のほうが格段に高い遺伝子導入効率を示すことがわかった（図５Ｂ）。なお、この効果は、16PEG-PLLよりも32PEG-PLLを用いた場合のほうがより優れていた。 As shown in FIG. 5A, the condensed pDNA was decondensed by adding the compounds of the present invention (16PEG-PLL and 32PEG-PLL). At the same time, the efficiency of gene transfer was also examined. Compared to the state of PLL and pDNA aggregates, the compound (16PEG-PLL and 32PEG-PLL) added and decondensed showed much higher gene transfer efficiency. It was found (FIG. 5B). This effect was more excellent when 32PEG-PLL was used than when 16PEG-PLL was used.
実施例２．
培養細胞に対する遺伝子導入効率を検討した。
Example 2
The gene transfer efficiency for cultured cells was examined.
16PEG-PLL、32PEG-PLL、PLL（重合度 68）及びPEIのトリス緩衝液溶液をそれぞれ調製した後、16PEG-PLL溶液あるいは32PEG-PLL溶液と、PLLあるいはPEI溶液を、混合溶液中のPLLの比率を変化させて混合した。この混合溶液を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたpDNA（pCMV Luc）のトリス緩衝液溶液（0.5μg/5μl）にpDNAのリン酸エステル数に対するPLL部のアミノ基数がPLLの場合３．０、PEIの場合５．０になるように加えて混合し、4℃で1晩インキュベーションしてポリプレックスを調製した。２４穴マルチプレートに１穴あたり５万個のヒト子宮頸がん由来HeLa細胞を播種し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。培地を除去し、0.36 mM CaCl2と0.42 mM MgCl2を含むリン酸緩衝液で洗浄した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地１ｍｌを加えた。そこへpDNAを1μg含むポリプレックス溶液を加え、３７℃で培養した。４８時間後、ルシフェラーゼアッセイとタンパク質定量により遺伝子導入効率を評価した。 After preparing 16 PEG-PLL, 32 PEG-PLL, PLL (polymerization degree 68) and PEI Tris buffer solution respectively, 16 PEG-PLL solution or 32 PEG-PLL solution and PLL or PEI solution are mixed with the PLL in the mixed solution. The ratio was changed and mixed. When this mixed solution is added to a Tris buffer solution (0.5 μg / 5 μl) of pDNA encoding luciferase gene (0.5 μg / 5 μl), the number of amino groups in the PLL part relative to the number of phosphates in pDNA is 3.0, and in the case of PEI A polyplex was prepared by adding to 5.0 and mixing and incubating at 4 ° C. overnight. 50,000 human cervical cancer-derived HeLa cells were seeded per well in a 24-well multiplate and cultured in DMEM medium containing 10% FCS for 24 hours. After removing the medium and washing with a phosphate buffer containing 0.36 mM CaCl 2 and 0.42 mM MgCl 2 , 1 ml of DMEM medium containing 10% FCS was added. A polyplex solution containing 1 μg of pDNA was added thereto, and the mixture was cultured at 37 ° C. After 48 hours, gene transfer efficiency was evaluated by luciferase assay and protein quantification.
図６Ａに示す通り、16PEG-PLL又は32PEG-PLLをPLLと組み合わせることによって、PLLのみを用いる場合に比べて遺伝子発現効率が向上した。また、図６Ｂに示す通り、32PEG-PLLをPEIと組み合わせることによっても、PEIのみを用いる場合に比べて遺伝子発現効率が向上した。 As shown in FIG. 6A, by combining 16PEG-PLL or 32PEG-PLL with PLL, gene expression efficiency was improved as compared with the case using only PLL. In addition, as shown in FIG. 6B, the combination of 32PEG-PLL and PEI also improved the gene expression efficiency compared to the case where only PEI was used.
以上のように、本発明では化合物（１）〜（５）とポリプレックス形成カチオン性高分子を組み合わせて用いることによって、ポリプレックス形成カチオン性高分子を単独で用いる場合よりも優れた遺伝子導入効率を達成できることが分かった。 As described above, in the present invention, by using a combination of the compounds (1) to (5) and the polyplex-forming cationic polymer, the gene transfer efficiency is superior to the case where the polyplex-forming cationic polymer is used alone. It was found that can be achieved.
実施例３．
ポリプレックス形成カチオン性高分子として、樹状高分子であるポリアミドアミンデンドリマー（PAMAM dendrimer：エチレンジアミンコアの第4世代デンドリマー、Sigma-Aldrich製）との組み合わせで用いる効果を検討した。
Example 3 FIG.
As a polyplex-forming cationic polymer, the effect of using it in combination with a dendritic polymer polyamidoamine dendrimer (PAMAM dendrimer: a fourth generation dendrimer of ethylenediamine core, manufactured by Sigma-Aldrich) was examined.
16PEG-PLL、32PEG-PLL、及びPAMAM dendrimerのトリス緩衝液溶液をそれぞれ調製した後、16PEG-PLL溶液あるいは32PEG-PLL溶液と、PAMAM dendrimer溶液を、混合溶液中のPAMAM dendrimerの第一級アミノ基数が、16PEG-PLLあるいは32PEG-PLLの第一級アミノ基数の3倍となるよう混合した。この混合溶液を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたpDNA（pCMV Luc）のトリス緩衝液溶液（0.5μg/5μl）にpDNAのリン酸エステル数に対する第一級アミノ基数が１０になるように加えて混合し、4℃で1晩インキュベーションしてポリプレックスを調製した。２４穴マルチプレートに１穴あたり５万個のヒト子宮頸がん由来HeLa細胞を播種し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。培地を除去し、0.36 mM CaCl2と0.42 mM MgCl2を含むリン酸緩衝液で洗浄した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地１ｍｌを加えた。そこへpDNAを1μg含むポリプレックス溶液を加え、３７℃で培養した。４８時間後、ルシフェラーゼアッセイとタンパク質定量により遺伝子導入効率を評価した。 After preparing a tris buffer solution of 16PEG-PLL, 32PEG-PLL, and PAMAM dendrimer, respectively, the 16PEG-PLL solution or 32PEG-PLL solution and the PAMAM dendrimer solution are combined with the number of primary amino groups of PAMAM dendrimer in the mixed solution. However, they were mixed so that the number of primary amino groups of 16PEG-PLL or 32PEG-PLL was 3 times. This mixed solution is added to a Tris buffer solution (0.5 μg / 5 μl) of pDNA encoding luciferase gene (0.5 μg / 5 μl) so that the number of primary amino groups relative to the number of phosphates of pDNA is 10, and mixed. Polyplexes were prepared by overnight incubation at 4 ° C. 50,000 human cervical cancer-derived HeLa cells were seeded per well in a 24-well multiplate and cultured in DMEM medium containing 10% FCS for 24 hours. After removing the medium and washing with a phosphate buffer containing 0.36 mM CaCl 2 and 0.42 mM MgCl 2 , 1 ml of DMEM medium containing 10% FCS was added. A polyplex solution containing 1 μg of pDNA was added thereto, and the mixture was cultured at 37 ° C. After 48 hours, gene transfer efficiency was evaluated by luciferase assay and protein quantification.
図７に示すように、本発明の化合物と組み合わせることによって、ポリプレックス形成カチオン性樹状高分子であるPAMAM dendrimerの遺伝子導入効率の増強が確認された。線状高分子であるPEIだけでなくPAMAM dendrimerに対しても有効であったことから高分子鎖の形状を問わずポリプレックス形成カチオン性高分子の遺伝子導入効率の増強に本発明の化合物が有効であることが分かった。 As shown in FIG. 7, by combining with the compound of the present invention, it was confirmed that the gene introduction efficiency of PAMAM dendrimer, which is a polyplex-forming cationic dendritic polymer, was enhanced. Since it was effective not only for PEI, a linear polymer, but also for PAMAM dendrimer, the compound of the present invention was effective in enhancing the gene transfer efficiency of polyplex-forming cationic polymers regardless of the shape of the polymer chain It turns out that.
実施例４．
リポプレックス形成カチオン性脂質と組み合わせた場合の培養細胞に対する遺伝子導入効率を検討した。リポプレックス形成カチオン性脂質として市販されているLipofectamineTM Reagent（カチオン性脂質である2,3-dioleyloxy-N- [2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetateと中性脂質であるdioleoyl phosphatidylethanolamineの３：１（重量比）混合物：Invitrogen製）との組み合わせを検討した。16PEG-PLL、32PEG-PLL及びPLL（重合度 68）のトリス緩衝液溶液をそれぞれ調製した後、16PEG-PLL溶液、32PEG-PLL溶液あるいはPLL溶液を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードしたpDNA（pCMV Luc）のトリス緩衝液溶液（0.5μg/5μl）にpDNAのリン酸エステル数に対するPLL部のアミノ基数が０．５、１．０、２．０になるように加えて混合した後、トリス緩衝液を加えることにより、pDNA濃度が0.25μg/25μlの混合溶液を得た。比較のためにポリマー溶液の代わりにトリス緩衝液を加え希釈を行ったpDNA溶液も調製した。この混合溶液25μlに、LipofectamineTM Reagent溶液 2μlにトリス緩衝液23μlを加え希釈した溶液25μlを加え、室温で３０分間インキュベーションしてポリプレックスを調製した。２４穴マルチプレートに１穴あたり５万個のヒト子宮頸がん由来HeLa細胞を播種し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。培地を除去し、0.36 mM CaCl2と0.42 mM MgCl2を含むリン酸緩衝液で洗浄した後、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地１ｍｌを加えた。そこへpDNAを0.5μg含むポリプレックス溶液を加え、３７℃で培養した。２４時間後、ルシフェラーゼアッセイとタンパク質定量により遺伝子導入効率を評価した。
Example 4
The gene transfer efficiency for cultured cells when combined with lipoplex-forming cationic lipids was examined. Lipofectamine TM Reagent (a cationic lipid, 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate and neutral lipids) And dioleoyl phosphatidylethanolamine 3: 1 (weight ratio) mixture: manufactured by Invitrogen). After preparing Tris buffer solutions of 16PEG-PLL, 32PEG-PLL and PLL (polymerization degree 68), respectively, 16PEG-PLL solution, 32PEG-PLL solution or PLL solution was added to pDNA (pCMV Luc) encoding luciferase gene. Add to Tris buffer solution (0.5 μg / 5 μl) and mix so that the number of amino groups in the PLL part is 0.5, 1.0, 2.0 relative to the number of phosphates in pDNA, then add Tris buffer As a result, a mixed solution having a pDNA concentration of 0.25 μg / 25 μl was obtained. For comparison, a pDNA solution diluted with Tris buffer instead of polymer solution was also prepared. To 25 μl of this mixed solution, 25 μl of a solution diluted by adding 23 μl of Tris buffer to 2 μl of Lipofectamine ™ Reagent solution was added, and incubated at room temperature for 30 minutes to prepare a polyplex. 50,000 human cervical cancer-derived HeLa cells were seeded per well in a 24-well multiplate and cultured in DMEM medium containing 10% FCS for 24 hours. After removing the medium and washing with a phosphate buffer containing 0.36 mM CaCl 2 and 0.42 mM MgCl 2 , 1 ml of DMEM medium containing 10% FCS was added. A polyplex solution containing 0.5 μg of pDNA was added thereto, and the mixture was cultured at 37 ° C. After 24 hours, gene transfer efficiency was evaluated by luciferase assay and protein quantification.
図８に示すように、lipofectamine単独に比べて16PEG-PLL及び32PEG-PLLとの組み合わせは明らかな遺伝子導入効率の増強が確認された。PLLでの組み合わせでは、このような増強は確認されないことから、カチオン性高分子との組み合わせで生じる増強ではなく、本発明の化合物との組み合わせによる効果である。 As shown in FIG. 8, it was confirmed that the combination of 16PEG-PLL and 32PEG-PLL clearly increased the gene transfer efficiency compared to lipofectamine alone. Since such enhancement is not confirmed in the combination with the PLL, it is not the enhancement caused by the combination with the cationic polymer but the effect by the combination with the compound of the present invention.
以上のように本発明の化合物は、ポリプレックス形成カチオン性高分子だけでなくリポプレックス形成カチオン性脂質との組み合わせによっても遺伝子導入効率を向上させる効果をもつことが分かった。 As described above, it has been found that the compound of the present invention has the effect of improving gene transfer efficiency not only by a polyplex-forming cationic polymer but also by a combination with a lipoplex-forming cationic lipid.
Claims (10)
Ａ−２．リポプレックス形成能を有するカチオン性脂質
からなる群より選択される少なくとも一種のカチオン性化合物；並びに
Ｂ．下記式（１）〜（５）のいずれかで表される化合物
を含む、遺伝子導入用組成物
（１）R1−L−N（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2
（２）R1−L−N（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2
（３）R1−L−N（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2
（４）R1−L−N（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（５）R1−L−N（X（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（上記式中、
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を、
R1は、カチオン性高分子を、
R2は、親水性高分子を、かつ
Lは、リンカーを示す。）。 A-1. A cationic polymer having polyplex-forming ability, and A-2. B. at least one cationic compound selected from the group consisting of cationic lipids having lipoplex-forming ability; A composition for gene introduction comprising a compound represented by any one of the following formulas (1) to (5) (1) R 1 -LN (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2
(2) R 1 -L-N (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2 ) 2
(3) R 1 -L-N (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2
(4) R 1 -L-N (X (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2) 2
(5) R 1 -L-N (X (X (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2) 2
(In the above formula,
X represents -CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N-
R 1 is a cationic polymer,
R 2 is a hydrophilic polymer, and
L represents a linker. ).
Ａ−２．リポプレックス形成能を有するカチオン性脂質
からなる群より選択される少なくとも一種のカチオン性化合物；並びに
Ｂ．下記式（１）〜（５）のいずれかで表される化合物
を含む、遺伝子導入用キット
（１）R1−L−N（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2
（２）R1−L−N（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2
（３）R1−L−N（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2
（４）R1−L−N（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（５）R1−L−N（X（X（X（X（CH2CH2CONHCH2CH2NHCOR2）2）2）2）2
（上記式中、
Xは、−CH2CH2CONHCH2CH2N−を、
R1は、カチオン性高分子を、
R2は、親水性高分子を、かつ
Lは、リンカーを示す。）。 A-1. A cationic polymer having polyplex-forming ability, and A-2. B. at least one cationic compound selected from the group consisting of cationic lipids having lipoplex-forming ability; Gene introduction kit (1) R 1 -LN (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2 containing a compound represented by any of the following formulas (1) to (5)
(2) R 1 -L-N (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2 ) 2 ) 2
(3) R 1 -L-N (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2
(4) R 1 -L-N (X (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2) 2
(5) R 1 -L-N (X (X (X (X (CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 NHCOR 2) 2) 2) 2) 2
(In the above formula,
X represents -CH 2 CH 2 CONHCH 2 CH 2 N-
R 1 is a cationic polymer,
R 2 is a hydrophilic polymer, and
L represents a linker. ).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011179598A JP2012060997A (en) | 2010-08-19 | 2011-08-19 | Gene transfer composition and utilization thereof |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010184308 | 2010-08-19 | ||
| JP2010184308 | 2010-08-19 | ||
| JP2011179598A JP2012060997A (en) | 2010-08-19 | 2011-08-19 | Gene transfer composition and utilization thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012060997A true JP2012060997A (en) | 2012-03-29 |
Family
ID=46057390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011179598A Withdrawn JP2012060997A (en) | 2010-08-19 | 2011-08-19 | Gene transfer composition and utilization thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2012060997A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015005431A1 (en) * | 2013-07-12 | 2015-01-15 | 石原産業株式会社 | Composition for transferring gene to cell |
-
2011
- 2011-08-19 JP JP2011179598A patent/JP2012060997A/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015005431A1 (en) * | 2013-07-12 | 2015-01-15 | 石原産業株式会社 | Composition for transferring gene to cell |
| JPWO2015005431A1 (en) * | 2013-07-12 | 2017-03-02 | 石原産業株式会社 | Composition for gene transfer into cells |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sun et al. | Self-assembled biodegradable micellar nanoparticles of amphiphilic and cationic block copolymer for siRNA delivery | |
| Jeong et al. | Poly (L-lysine)-g-poly (D, L-lactic-co-glycolic acid) micelles for low cytotoxic biodegradable gene delivery carriers | |
| Lv et al. | Fluorination on polyethylenimine allows efficient 2D and 3D cell culture gene delivery | |
| CN105579584B (en) | Compositions for introducing RNA into cells | |
| EP1621569B1 (en) | Polyethylene glycol/polycation block copolymer | |
| JP5481614B2 (en) | Block copolymer introduced with phenylboronic acid group and use thereof | |
| Kim et al. | Comparison between arginine conjugated PAMAM dendrimers with structural diversity for gene delivery systems | |
| US8153110B2 (en) | Environment-responding siRNA carrier using disulfide-cross-linked polymeric micelle | |
| CN102971002B (en) | Delivery of nucleic acids composition and carrier compositions, pharmaceutical composition and nucleic acid delivery method using it | |
| JP4655298B1 (en) | Short chain cationic polyamino acids and uses thereof | |
| WO2006085664A1 (en) | Polycation chargeable polymer and use as carrier of nucleic acid | |
| Cheng et al. | The effect of guanidinylation of PEGylated poly (2-aminoethyl methacrylate) on the systemic delivery of siRNA | |
| Zhou et al. | PLL/pDNA/P (His-co-DMAEL) ternary complexes: assembly, stability and gene delivery | |
| JP6566936B2 (en) | Pharmaceutical composition | |
| Thomas et al. | Collapse of DNA in packaging and cellular transport | |
| EP2661454A1 (en) | Cationic polymers formed from amino group-bearing monomers and heterocyclic linkers | |
| WO2005078084A1 (en) | Polyion complex carrying double stranded oligonucleic acid, process for producing the same and pharmaceutical composition containing the same | |
| Qi et al. | Guanidinated amphiphilic cationic copolymer with enhanced gene delivery efficiency | |
| Dong et al. | Cross-linked polyethylenimine as potential DNA vector for gene delivery with high efficiency and low cytotoxicity | |
| WO2022162200A9 (en) | Nucleic Acid Delivery | |
| JP2002526456A (en) | Cationic compounds and their use as macromolecular carriers | |
| JP2012060997A (en) | Gene transfer composition and utilization thereof | |
| EP2388016A1 (en) | Non-viral nucleic acid molecules delivery systems | |
| Grillaud et al. | Polycationic adamantane-based dendrons form nanorods in complex with plasmid DNA | |
| CN111655758B (en) | Nucleic acid delivery polymers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20141104 |