JP2012060901A - Oligonucleotide and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、オリゴヌクレオチド及びその利用に関する。 The present invention relates to oligonucleotides and uses thereof.
潜在的な又は将来における疾病の発症可能性や薬剤の有効性や副作用を予め知得しておくことは、患者のQOL向上とともに医療経済的にも好ましい。このようなヒトや動物の各個体の特有の特性の検査には、遺伝子検査が適している。現在、遺伝子的な検査は、主として、一つの塩基が他の塩基に置換している一塩基多型(SNPs)を指向している。しかしながら、ヒトなどにおける遺伝子多型は、SNPsに限らず、一塩基の欠失や挿入に関するもの、及び二以上の塩基の挿入や欠失に広く及んでいる。SNPs以外の多型が、ヒトにおける遺伝子多型の75%を占めているという報告もある(非特許文献1)。 It is preferable from the viewpoint of medical economics as well as improving the patient's QOL to know in advance the possibility of developing a disease in the future or the effectiveness and side effects of drugs. Genetic testing is suitable for testing such unique characteristics of humans and animals. Currently, genetic testing is primarily directed to single nucleotide polymorphisms (SNPs) in which one base is replaced with another base. However, gene polymorphisms in humans and the like are not limited to SNPs, but are widely related to deletions and insertions of one base and insertions and deletions of two or more bases. There is also a report that polymorphisms other than SNPs account for 75% of gene polymorphisms in humans (Non-patent Document 1).
一方、SNPsを含めて遺伝子多型や変異を検出する方法は各種知られている(非特許文献2、非特許文献3)。また、蛍光色素としてペリレンを用い、1塩基欠失及び2塩基欠失を、2つのペリレンのそれぞれのモノマー発光から2分子会合によるエキシマー発光による波長シフトにより検出できることも報告されている(非特許文献4) On the other hand, various methods for detecting gene polymorphisms and mutations including SNPs are known (Non-patent Documents 2 and 3). In addition, it has been reported that perylene is used as a fluorescent dye, and that 1-base deletion and 2-base deletion can be detected by wavelength shift due to excimer emission by bimolecular association from monomer emission of each of two perylenes (non-patent document). 4)
しかしながら、従来の方法では、塩基の欠失や挿入に関し、必ずしも容易に精度よく検出できるわけではなかった。また、こうした変異に対しても効果的対応できるオリゴヌクレオチドも存在していなかった。 However, in the conventional method, it has not always been possible to easily and accurately detect base deletion and insertion. There were also no oligonucleotides that could effectively cope with such mutations.
本発明者らは、蛍光色素としてペリレンの新たな誘導体化による変異の検出系の構築を試みた。その結果、オリゴヌクレオチドの主鎖とのペリレン基との間の構造を異ならせた2つのペリレン誘導体を組み合わせて用いることで、1塩基のみならず、1塩基又は2塩基以上の欠失や挿入変異をターゲットとできることを見出した。また、こうしたペリレン誘導体は、それ自体、シグナル部位として有用であることを見出した。本明細書の開示によれば、こうした知見に基づき、以下の手段が提供される。 The present inventors tried to construct a mutation detection system by new derivatization of perylene as a fluorescent dye. As a result, by using a combination of two perylene derivatives with different structures between the oligonucleotide main chain and the perylene group, not only one base but also one or more base deletions or insertion mutations I found that I can be targeted. Further, it has been found that such a perylene derivative itself is useful as a signal site. According to the disclosure of the present specification, the following means are provided based on such findings.
本明細書の開示によれば、オリゴヌクレオチドであって、1塩基又は2塩基以上のヌクレオチドで離間されて、第1のユニット;
、第2のユニット:
The second unit:
前記第1のユニットは、以下の式で表されるものであってもよい。
前記第2のユニットは、以下の式で表されるものであってもよい。
前記オリゴヌクレオチドは、1塩基又は2塩基以上の欠失変異又は挿入変異の検出用プローブとして用いることができる。特に、3塩基以上の欠失変異又は挿入変異の検出用プローブとして用いることができる。また、モレキュラービーコンを形成可能であって、モレキュラービーコン形成時におけるステムの一方の鎖に前記第1のユニット及び前記第2のユニットを備えるとともに、前記第1のユニット及び前記第2にユニットに対するクエンチャーを前記ステムの他方の鎖に備えるようにしてもよい。 The oligonucleotide can be used as a probe for detecting a deletion mutation or insertion mutation of 1 base or 2 bases or more. In particular, it can be used as a probe for detecting deletion mutations or insertion mutations of 3 or more bases. In addition, a molecular beacon can be formed, and the first unit and the second unit are provided on one strand of the stem when the molecular beacon is formed, and the first unit and the second unit are coupled to the unit. Char may be provided on the other strand of the stem.
本明細書の開示によれば、以下の式(3)及び(4)で化合物も提供される。これらの化合物は、いずれも、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドを合成するためのアミダイトモノマーとして有用である。
本明細書の開示によれば、オリゴヌクレオチドプローブ固定化体であって、
請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして固相担体に固定化された固定化体が提供される。
According to the disclosure of the present specification, an oligonucleotide probe immobilized body comprising:
There is provided an immobilized body immobilized on a solid phase carrier using the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 5 as a probe.
本明細書の開示によれば、欠失変異又は挿入変異の検査方法であって、前記欠失変異又は前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドと、被験DNA含有試料とを接触させる工程、を備える、検出方法が提供される。前記被験DNA含有試料は、ヒト又は動物から採取したDNAを含んでいてもよい。また、疾病の発症可能性の有無の検査方法であってもよい。 According to the disclosure of the present specification, there is provided a method for testing a deletion mutation or an insertion mutation, wherein the presence or absence of the deletion mutation or the insertion mutation is distinguishable from each wild type. There is provided a detection method comprising the step of bringing the disclosed oligonucleotide into contact with a test DNA-containing sample. The test DNA-containing sample may contain DNA collected from a human or an animal. Moreover, the inspection method of the presence or absence of the onset possibility of a disease may be used.
本明細書の開示によれば、欠失変異又は挿入変異の検査キットであって、1塩基又は2塩基以上の前記欠失変異又は前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した請求項1〜8のオリゴヌクレオチドプローブを含む、キットが提供される。 According to the disclosure of the present specification, it is a test kit for a deletion mutation or an insertion mutation, and the presence or absence of the deletion mutation or the insertion mutation having one or more bases can be distinguished from each wild type. A kit is provided comprising the oligonucleotide probe of claims 1-8 configured as above.
本明細書の開示によれば、前記第1のユニット及び前記第2のユニットのいずれか一方又は双方を備える、オリゴヌクレオチドが提供される。 According to the disclosure of the present specification, an oligonucleotide comprising one or both of the first unit and the second unit is provided.
本明細書の開示は、オリゴヌクレオチド及びその利用に関する。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、1塩基又は2塩基以上離間されて第1のユニット、第2のユニット及びクエンチャーから選択される2種を備えている。すなわち、本明細書の開示は、第1のユニット及び第2のユニットを備えるオリゴヌクレオチド、第1のユニットとクエンチャーユニットとを備えるオリゴヌクレオチド、及び第2のユニットとクエンチャーユニットとを備えるオリゴヌクレオチドに関する。 The disclosure herein relates to oligonucleotides and uses thereof. The oligonucleotide disclosed in the present specification comprises two types selected from a first unit, a second unit, and a quencher separated by one base or two or more bases. That is, the present disclosure discloses an oligonucleotide comprising a first unit and a second unit, an oligonucleotide comprising a first unit and a quencher unit, and an oligonucleotide comprising a second unit and a quencher unit. Relates to nucleotides.
図1及び図2に示すように、例えば、第1のユニット及び第2のユニットを備えるオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、1塩基又は2塩基以上の欠失を備えるターゲットとハイブリダイズさせるとき、1塩基又は2塩基以上を含むバルジが形成されることにより第1のユニット中のトレオニノール鎖に連結されるシグナル部位と第2のユニット中のトレオニノール鎖に連結されるシグナル部位とが正常なハイブリダイズ時とは異なって配向されて所定の配列状態が形成される。第1のユニットと第2のユニットとは、それぞれペリレン基を含むシグナル部位を有するが、主鎖との間にそれぞれ所定の構造を備えているために、前記欠失を備えないターゲットとハイブリダイズするときとは異なる配列状態となる。同時に、こうした配列状態に基づく特有の励起光を発光可能な状態となり、前記欠失を備えないターゲットとハイブリダイズするときとは異なる特有のシグナルを呈することとなる。 As shown in FIG. 1 and FIG. 2, for example, when an oligonucleotide comprising a first unit and a second unit is used as a probe, it is hybridized with a target having a deletion of 1 base or 2 bases or more. When a bulge containing a base or two or more bases is formed and the signal site linked to the threoninol chain in the first unit and the signal site linked to the threoninol chain in the second unit are normally hybridized Different from the orientation, a predetermined arrangement state is formed. Each of the first unit and the second unit has a signal site containing a perylene group, but has a predetermined structure between the first unit and the main chain. Therefore, the first unit and the second unit hybridize with a target that does not have the deletion. It will be in a different arrangement state than when you do. At the same time, a unique excitation light based on such a sequence state can be emitted, and a unique signal different from that when hybridizing with a target not having the deletion is exhibited.
また、第1のユニットとクエンチャーユニットを1塩基又は2塩基以上離間して備えるオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、1塩基又は2塩基以上の欠失を備えるターゲットとハイブリダイズさせるとき、プローブにおいて1塩基又は2塩基以上を含むバルジが形成される。このとき、第1のユニットのシグナル部位とクエンチャーユニットのククエンチャーとがバルジ形成に伴って配向されて所定の配列状態が形成される。一方、前記欠失を備えないターゲットとハイブリダイズするときには、こうしたバルジは形成されないで、第1のユニットとクエンチャーユニットとは1塩基又は2塩基以上離間されて配列される。この結果、バルジ形成時とバルジ非形成時とでは、第1のユニットのシグナル部位に対するクエンチャーの配列状態が異なり、第1のユニットのシグナル部位に対するクエンチャーの作用が異なることになる。このため、こうしたプローブは、欠失を有するターゲットに対して欠失を有しないターゲットとのハイブリダイズ時とは異なる特有のシグナルを呈することになる。同様の現象が第2のユニットとクエンチャーユニットとを1塩基又は2塩基以上離間して備えるオリゴヌクレオチドにおいても生じ得る。 In addition, when an oligonucleotide having a first unit and a quencher unit separated by 1 base or 2 bases or more is used as a probe and hybridized with a target having a deletion of 1 base or 2 bases or more, 1 in the probe A bulge containing a base or two or more bases is formed. At this time, the signal portion of the first unit and the quencher of the quencher unit are oriented along with bulge formation to form a predetermined arrangement state. On the other hand, when hybridizing with a target not having the deletion, such a bulge is not formed, and the first unit and the quencher unit are arranged separated by one base or two or more bases. As a result, when the bulge is formed and when the bulge is not formed, the arrangement state of the quencher with respect to the signal site of the first unit is different, and the action of the quencher with respect to the signal site of the first unit is different. For this reason, such a probe will exhibit a unique signal different from that at the time of hybridization with a target having no deletion against a target having a deletion. A similar phenomenon can occur in an oligonucleotide having a second unit and a quencher unit separated by one base or two or more bases.
以上のことから、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドプローブによれば、1塩基又は2塩基以上の欠失を有するターゲットと当該欠失を有しないターゲットとを識別することができる。また、換言すれば、1塩基又は2塩基以上の挿入を有するターゲットと当該挿入を有しないターゲットとを識別することができる。 From the above, according to the oligonucleotide probe disclosed in the present specification, a target having a deletion of one base or two or more bases can be distinguished from a target having no such deletion. In other words, a target having an insertion of one base or two or more bases can be distinguished from a target having no such insertion.
なお、第1のユニット及び第2のユニットは、それぞれペリレンを含有するシグナル部位を有しているが、これらのシグナル部位がそれぞれ色素として機能する。これらは異なる色素であるといえる。異なる色素同士が励起二量体を形成するエキシプレックス(ヘテロエキシマー)の構造については極めて限られた報告しかなく、現状ではエキシプレックスあるいはエキシマー形成の制御は困難である。しかしペリレンのエキシマーの構造については、山崎巌著「有機量子化学と光科学」287頁に記載されているようにピレン同士が1.4Åずれた配置をとることが明らかになっている。またエキシマーとは異なるが、ケミストリー・ア・ヨーロピアンジャーナル(Chemistry A European Journal)誌2003年第9巻3466頁から3471頁によれば、色素同士がずれないで積層した構造であるH会合体では色素の発光が消光するのに対し、ずれた構造を取っているJ会合体では単量体よりも長波長側に強く発光することが記載されている。 Each of the first unit and the second unit has a signal site containing perylene, but each of these signal sites functions as a dye. These can be said to be different pigments. There are only very limited reports on the structure of exciplexes (hetero excimers) in which different dyes form excited dimers, and it is difficult to control exciplex or excimer formation at present. However, as for the structure of perylene excimer, it has been clarified that pyrenes are arranged with an offset of 1.4 cm, as described in “Organic Quantum Chemistry and Photoscience”, page 287 by Kei Yamazaki. Although different from the excimer, according to Chemistry A European Journal, Vol. 9, pp. 3466 to 3471, the dye in the H aggregate that has a layered structure without shifting the dyes. The J-aggregate having a shifted structure emits light more strongly on the longer wavelength side than the monomer.
本発明者らは、欠失多型との二重鎖形成でエキシプレックス(あるいはエキシマー)が形成されるためには、バルジ内で色素同士がずれた構造を取ることが重要であると仮定した。そのようなずれた構造を取るためには、同一の二つの色素が会合(エキシマー)するよりは、構造の異なる二つの色素が会合(エキシプレックス)することがより有利と考え鋭意検討した結果、上記のとおりの結果、すなわち、特定の第1のユニットと第2のユニットとをターゲットとなる欠失相当部分を離間して備えさせることで、欠失の有無を識別可能であるという知見を得た。 The present inventors hypothesized that it is important to take a structure in which the dyes deviate in the bulge in order to form an exciplex (or excimer) by double strand formation with the deletion polymorphism. . In order to take such a deviated structure, as a result of diligently considering that it is more advantageous for two dyes having different structures to associate (exciplex) than to associate two identical dyes (excimer), As a result of the above, that is, the knowledge that the presence or absence of the deletion can be identified by providing the specific deletion unit corresponding to the specific first unit and the second unit apart from each other. It was.
同時に、本発明者らは、第1のユニット及び第2のユニットは、いずれも、蛍光ユニットとして有用であるという知見を得た。以下、本明細書の開示に関し詳細に説明する。 At the same time, the present inventors have found that both the first unit and the second unit are useful as a fluorescent unit. Hereinafter, the disclosure of this specification will be described in detail.
(オリゴヌクレオチド及びプローブ)
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、その長さは特に限定しないが、好ましくは10塩基以上100塩基以下程度である。また、本オリゴヌクレオチドは、100塩基を超える長さであってもよい。
(Oligonucleotides and probes)
The length of the oligonucleotide disclosed in the present specification is not particularly limited, but is preferably about 10 to 100 bases. The oligonucleotide may have a length exceeding 100 bases.
本オリゴヌクレオチドでは、1塩基又は2塩基以上で離間されて第1のユニットと第2にユニットとを備えることができる。3塩基以上又は4以上の塩基で離間された第1のユニットと第2にユニットとを備えていてもよい。本オリゴヌクレオチドは、3塩基以上で離間されていても、バルジ形成時において特有の励起光を発光することができる。好ましくは3塩基以上である。また、好ましくは6以下の塩基で離間されている。離間される塩基が少なすぎると、バルジ形成時における第1のユニットと第2にユニットとの配向が制限されて、意図した識別可能なシグナルを呈しなくなるからである。離間される塩基が多すぎると、バルジを形成する場合としない場合とで識別可能なシグナルを呈しづらくなるからである。 In the present oligonucleotide, the first unit and the second unit can be provided separated by 1 base or 2 bases or more. A first unit and a second unit separated by 3 or more bases or 4 or more bases may be provided. Even when the present oligonucleotide is separated by 3 or more bases, it can emit specific excitation light during bulge formation. Preferably it is 3 bases or more. Further, they are preferably separated by 6 or less bases. This is because if too few bases are separated, the orientation of the first unit and the second unit during bulge formation is limited, and the intended discernible signal is not exhibited. This is because if too many bases are separated, it becomes difficult to provide a signal that can be discriminated whether or not a bulge is formed.
第1のユニット及び第2のユニット、第1のユニットとクエンチャーユニット、並びに第2のユニットとクエンチャーユニット、は、いずれも、1塩基又は2塩基以上のヌクレオチドで離間されて備えられる。オリゴヌクレオチドにおけるこれらの2つのユニットの配列は限定しない。すなわち、2つのユニットのうち、いずれが5’末端側に位置されていてもよい。なお、式(1)又は式(2)において、通常、A1がオリゴヌクレオチドの5’側に相当し、B1が3’側に相当する。具体的には、第1のユニットの3’側に第2のユニットを配置したものが挙げられる。 The first unit and the second unit, the first unit and the quencher unit, and the second unit and the quencher unit are all provided separated by one nucleotide or two or more nucleotides. The sequence of these two units in the oligonucleotide is not limited. That is, any of the two units may be located on the 5 ′ end side. In formula (1) or formula (2), A1 usually corresponds to the 5 'side of the oligonucleotide, and B1 corresponds to the 3' side. Specifically, a configuration in which the second unit is arranged on the 3 'side of the first unit can be mentioned.
(第1のユニット)
第1のユニットは、式(1)で表される。第1のユニットは、ペリレン基を有している。ペリレン基は、光化学的に安定であり、量子効率が高いという利点がある。ペリレン基はR1基に連結される炭素原子以外の1又は2以上の炭素原子に結合する水素原子は適宜置換されていてもよい。置換基は、特に限定されないが、例えば、それぞれ独立に、水素原子;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数1〜20のアルキル基もしくはアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数2〜20のアルケニル基もしくはアルキニル基;水酸基;ハロゲン原子;アミノ基;ニトロ基;またはカルボキシル基を表すことができる。
(First unit)
A 1st unit is represented by Formula (1). The first unit has a perylene group. The perylene group is advantageous in that it is photochemically stable and has high quantum efficiency. In the perylene group, hydrogen atoms bonded to one or more carbon atoms other than the carbon atom linked to the R1 group may be appropriately substituted. Although the substituent is not particularly limited, for example, each independently a hydrogen atom; an alkyl group or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, or a carboxyl group An unsubstituted or substituted alkenyl or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group; hydroxyl group; halogen atom; amino group; nitro group; or carboxyl group be able to.
式(1)中、R1は、炭素数が2以上4以下のアルキニレン基である。アルキニレン基としては、エチニレン基(−C≡C−)、プロピニレン基(−C≡C−C−、−C−C≡C−)、ブチニレン基(−C≡C−C−C−、−C−C≡C−C−、−C−C−C≡C−)が挙げられる。好ましくは、エチニレン基である。 In formula (1), R1 is an alkynylene group having 2 to 4 carbon atoms. Alkynylene groups include ethynylene groups (—C≡C—), propynylene groups (—C≡C—C—, —C—C≡C—), butynylene groups (—C≡C—C—C—, —C). -C≡C-C-, -C-C-C≡C-). Preferably, it is an ethynylene group.
R1のペリレンに対する連結位置は特に限定されないが、ペリレンの1位、2位及び3位等のいずれであってもよい。好ましくは、2位、4位、9位及び10位のいずれかである。 Although the connection position of R1 to perylene is not particularly limited, it may be any of 1-position, 2-position and 3-position of perylene. Preferably, it is any one of the 2nd, 4th, 9th and 10th positions.
式(1)において、R2はフェニレン基を表す。フェニレン基は、置換されていなくてもよいが、連結に関わらない1又は2以上の炭素原子に結合する水素原子は置換されていてもよい。置換基は、特に限定されないが、例えば、それぞれ独立に、水素原子;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数1〜20のアルキル基もしくはアルコキシ基;未置換またはハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基で置換された炭素原子数2〜20のアルケニル基もしくはアルキニル基;水酸基;ハロゲン原子;アミノ基;ニトロ基;またはカルボキシル基を表すことができる。 In the formula (1), R2 represents a phenylene group. The phenylene group may not be substituted, but a hydrogen atom bonded to one or more carbon atoms not involved in the connection may be substituted. Although the substituent is not particularly limited, for example, each independently a hydrogen atom; an alkyl group or alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms that is unsubstituted or substituted with a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a nitro group, or a carboxyl group An unsubstituted or substituted alkenyl or alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms substituted with a halogen atom, hydroxyl group, amino group, nitro group or carboxyl group; hydroxyl group; halogen atom; amino group; nitro group; or carboxyl group be able to.
R2のフェニレン基における連結結合部位は、特に限定しないが、R1に対する連結位置からオルト位、メタ位及びパラ位のいずれにおいて主鎖に連結されていてもよい。好ましくは、パラ位である。 Although the connection bonding site in the phenylene group of R2 is not particularly limited, it may be connected to the main chain at any of the ortho, meta, and para positions from the connection position with respect to R1. The para position is preferred.
第1のユニットとしては、例えば、以下の式で表されるユニットが好適である。
(第2のユニット)
第2のユニットは式(2)で表される。第2のユニットは、第1のユニットと同様、ペリレン基を有している。第1のユニットと同様、ペリレン基は適宜置換されていてもよい。
(Second unit)
A 2nd unit is represented by Formula (2). Similar to the first unit, the second unit has a perylene group. As with the first unit, the perylene group may be optionally substituted.
式(2)において、R3は、炭素数が2以上4以下のアルキニレン基である。アルキニレン基としては、エチニレン基(−C≡C−)、プロピニレン基(−C≡C−C−、−C−C≡C−)、ブチニレン基(−C≡C−C−C−、−C−C≡C−C−、−C−C−C≡C−)が挙げられる。好ましくは、エチニレン基である。 In Formula (2), R3 is an alkynylene group having 2 to 4 carbon atoms. Alkynylene groups include ethynylene groups (—C≡C—), propynylene groups (—C≡C—C—, —C—C≡C—), butynylene groups (—C≡C—C—C—, —C). -C≡C-C-, -C-C-C≡C-). Preferably, it is an ethynylene group.
R3のペリレン基に対する連結位置は特に限定されないが、ペリレン基の1位、2位及び3位等のいずれであってもよい。好ましくは、2位、4位、9位及び10位のいずれかである。 The connection position of R3 with respect to the perylene group is not particularly limited, and may be any of the 1-position, 2-position, 3-position, etc. of the perylene group. Preferably, it is any one of the 2nd, 4th, 9th and 10th positions.
式(2)において、R4は、炭素数1以上3以下のアルキレン基である。例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基である。好ましくは、エチレン基である。 In the formula (2), R4 is an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms. For example, methylene group, ethylene group, and propylene group. Preferably, it is an ethylene group.
第2のユニットとしては、例えば、以下の式で表されるユニットが好適である。
式(1)及び式(2)において、A1は、水素原子、リン酸基、ホスホジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを表し、B1は、水素原子、リン酸基、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを表す。ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、5単糖の5’位の炭素原子にリン酸基を有している。B1がヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドのとき、これらはそのリン酸基によるホスホジエステル結合により連結されている。 In the formulas (1) and (2), A1 represents a hydrogen atom, a phosphate group, a nucleotide or an oligonucleotide linked via a phosphodiester bond, and B1 represents a hydrogen atom, a phosphate group, a nucleotide or an oligo. Represents a nucleotide. Nucleotides and oligonucleotides have a phosphate group at the carbon atom at the 5 'position of the 5 monosaccharide. When B1 is a nucleotide and an oligonucleotide, they are linked by a phosphodiester bond through their phosphate group.
本オリゴヌクレオチドの第1のユニット及び第2のユニットにおける主鎖部分は、式(1)及び式(2)に示すように、D−トレオニノール(D-threoninol)−リン酸構造を有している。当該主鎖を有することにより、第1のユニット及び第2のユニットにエキシプレックスに基づく励起状態が形成されやすくなっていると考えられる。本オリゴヌクレオチドの他のユニットにおいては、糖−リン酸主鎖を備えることができる。第1のユニット及び第2のユニット以外のユニットにおいては、塩基や糖の部分において公知の修飾や改変がなされていてもよい。 The main chain portion in the first unit and the second unit of the present oligonucleotide has a D-threoninol-phosphate structure as shown in the formulas (1) and (2). . By having the main chain, it is considered that an excited state based on exciplex is easily formed in the first unit and the second unit. In other units of the oligonucleotide, a sugar-phosphate backbone can be provided. In units other than the first unit and the second unit, known modifications and alterations may be made in the base and sugar moieties.
クエンチャーユニットは、オリゴヌクレオチドの主鎖の一部を構成できる主鎖部分にクエンチャーを備えている。クエンチャーユニットにおける主鎖部分は、通常の糖−リン酸主鎖であってもよいが、D−トレオニノール−リン酸構造を有していてもよい。例えば、以下の式で表されるユニットとしてもよい。 The quencher unit includes a quencher in the main chain part that can constitute a part of the main chain of the oligonucleotide. The main chain portion in the quencher unit may be a normal sugar-phosphate main chain, but may have a D-threoninol-phosphate structure. For example, a unit represented by the following formula may be used.
なお、上記式において、A1及びB1は式1と同義であり、Yはクエンチャーを表す。 In the above formula, A1 and B1 have the same meaning as in formula 1, and Y represents a quencher.
クエンチャーとしては、第1のユニット又は第2のユニットに対して、バルジ形成時においてこれらのユニットに由来する蛍光を消光できるものであれば特に限定されない。 The quencher is not particularly limited as long as it can quench the fluorescence derived from these units at the time of bulge formation with respect to the first unit or the second unit.
例えば、クエンチャー(Y)としては以下のものが挙げられる。なお、以下の例の各種化合物は例示であり、水素原子はいずれも適宜置換基で置換されていてもよい。また、主鎖部分に対して連結されるクエンチャーの原子は特に限定されない。 For example, the quencher (Y) includes the following. In addition, the various compounds of the following examples are illustrations, and all the hydrogen atoms may be appropriately substituted with a substituent. Further, the quencher atom linked to the main chain portion is not particularly limited.
好ましいクエンチャーとしては、アントラキノン骨格を有する化合物が挙げられる。アントラキノン骨格を有する化合物としては、アントラキノンの他、アントラキノンのベンゼン環を構成する炭素原子に結合する1個又は2個以上の水素原子を、水酸基、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、ハロゲン原子、アルキルアミノ基等から選択される1種又は2種以上の官能基で置換した各種のアントラキノン誘導体が挙げられる。各種のアントラキノン誘導体は、例えば、東京化成株式会社等からから容易に入手できる。例えば、アントラキノン誘導体としては、天然には、コチニール色素、アリザリン等のアカネ色素、ラック色素の化合物が挙げられる。好ましくはアントラキノンである。クエンチャーユニットの一例を以下の式に示す。 A preferable quencher includes a compound having an anthraquinone skeleton. As the compound having an anthraquinone skeleton, in addition to anthraquinone, one or two or more hydrogen atoms bonded to the carbon atom constituting the benzene ring of anthraquinone may be a hydroxyl group, a nitro group, an amino group, a sulfonic acid group, a halogen atom, Examples include various anthraquinone derivatives substituted with one or more functional groups selected from an alkylamino group and the like. Various anthraquinone derivatives can be easily obtained from, for example, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. For example, natural examples of the anthraquinone derivative include compounds of cochineal dyes, red dyes such as alizarin, and rack dyes. Anthraquinone is preferred. An example of a quencher unit is shown in the following formula.
本オリゴヌクレオチドは、1塩基又は2塩基以上の欠失変異又は挿入変異を検出するために構成することができる。本オリゴヌクレオチドは、ターゲットとなるDNAとハイブリダイゼーション可能な条件で接触させることにより、意図した変異を検出することができる。変異を検出するには、変異以外の部分については、少なくとも一定範囲においてターゲットDNAと相補的な塩基配列を有するように構成される。 The oligonucleotide can be configured to detect deletion mutations or insertion mutations of one or more bases. The intended mutation can be detected by bringing the oligonucleotide into contact with the target DNA under conditions that allow hybridization. In order to detect the mutation, the portion other than the mutation is configured to have a base sequence complementary to the target DNA at least within a certain range.
本オリゴヌクレオチドは、野生型又は変異型のいずれかに相補的な塩基配列を有するように構成される。すなわち、1塩基又は2塩基以上の欠失変異を検出するためには、当該欠失変異を有していない野生型の塩基配列に相補的な塩基配列を有するようにプローブが設計される。変異型において欠失される塩基で離間して第1のユニットと第2のユニットとが備えられる。また、同様にして第1のユニットとクエンチャーユニットとが備えられていてもよい。さらに、第2のユニットとクエンチャーユニットとが備えられていてもよい。 This oligonucleotide is configured to have a base sequence complementary to either a wild type or a mutant type. That is, in order to detect a deletion mutation of one base or two or more bases, a probe is designed so as to have a base sequence complementary to a wild-type base sequence that does not have the deletion mutation. A first unit and a second unit are provided separated by a base that is deleted in the variant. Similarly, the first unit and the quencher unit may be provided. Furthermore, a second unit and a quencher unit may be provided.
一方、1塩基又は2塩基以上の挿入変異を検出するためには、当該挿入変異の変異型の塩基配列に相補的な塩基配列を有するようにプローブの塩基配列が設計される。すなわち、変異型において挿入される塩基で離間して第1のユニットと第2のユニットとが備えられる。また、同様にして第1のユニットとクエンチャーユニットとが備えられていてもよい。さらに、第2のユニットとクエンチャーユニットとが備えられていてもよい。 On the other hand, in order to detect an insertion mutation of one base or two or more bases, the probe base sequence is designed so as to have a base sequence complementary to the mutant base sequence of the insertion mutation. That is, the first unit and the second unit are provided apart from each other by the base inserted in the mutant type. Similarly, the first unit and the quencher unit may be provided. Furthermore, a second unit and a quencher unit may be provided.
本オリゴヌクレオチドは、また、モレキュラービーコンを形成可能に構成できる。モレキュラービーコンは、一本鎖DNAであって、ステムループ構造を形成可能に構成されている。モレキュラービーコンは、ステムが開いてターゲットDNAとハイブリダイゼーションすることでターゲットを検出できる。本オリゴヌクレオチドプローブをモレキュラービーコンとして使用する場合、ステムの一方の鎖に第1のユニット及び第2のユニットを備えるとともに、第1のユニット及び第2にユニットに対するクエンチャーをステムの他方の鎖に備えることができる。こうすることで、ステムを閉じたときに発光をクエンチでき、ターゲットDNAとハイブリダイゼーションさせたときには、ステムにおいてバルジが形成されて、第1のユニット及び第2のユニットに特徴的な発光を呈することができる。クエンチャーとしては特に限定しないが、例えば、アントラキノン等が挙げられる。 The oligonucleotide can also be configured to form a molecular beacon. The molecular beacon is a single-stranded DNA and is configured to be able to form a stem-loop structure. The molecular beacon can detect the target by opening the stem and hybridizing with the target DNA. When this oligonucleotide probe is used as a molecular beacon, the first unit and the second unit are provided on one strand of the stem, and the quencher for the first unit and the second unit is provided on the other strand of the stem. Can be provided. By doing this, the light emission can be quenched when the stem is closed, and when hybridized with the target DNA, a bulge is formed in the stem and exhibits a characteristic light emission in the first unit and the second unit. Can do. Although it does not specifically limit as a quencher, For example, anthraquinone etc. are mentioned.
本明細書の開示によれば、第1のユニット及び第2のユニットのいずれか一方又は双方を少なくとも備えるオリゴヌクレオチドも提供される。第1のユニット及び第2のユニットに備えられるシグナル部位は、それ自体、従来のペリレンに比較して長波長側にシフトした発光が得られている。したがって、これらのユニットをシグナルユニットとして1又は2以上備えるオリゴヌクレオチドは、プローブとして有用である。これらのオリゴヌクレオチドは、第1及び第2のユニットなどを備える、上記した本明オリゴヌクレオチドの前駆体としても有用である。なお、この態様のオリゴヌクレオチドにおける第1のユニット及び第2のユニットとしては、既に説明したこれらについての各種態様が全て包含される。 According to the disclosure herein, an oligonucleotide comprising at least one or both of the first unit and the second unit is also provided. The signal sites provided in the first unit and the second unit themselves emit light that is shifted to the longer wavelength side compared to conventional perylene. Therefore, an oligonucleotide comprising one or more of these units as a signal unit is useful as a probe. These oligonucleotides are also useful as precursors of the above-described bright oligonucleotides comprising the first and second units. The first unit and the second unit in the oligonucleotide of this aspect include all the various aspects described above.
この態様のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、第1のユニットと第2のユニットを備えていてもよいし、いずれか一方を備えていてもよい。また、この態様のオリゴヌクレオチドは、第1のユニット及び第2のユニットをそれぞれ1種又は2種以上備えることができる。オリゴヌクレオチドにおけるこれらのユニットの配置も特に限定されない。シグナルを検出できる程度に、第1のユニットが連続してもよいし、第2のユニットが連続しても良い。また、第1のユニット及び第2のユニットが組み合わされて連続的に配置されていてもよい。さらに、これらのユニットは、オリゴヌクレオチドの一方の末端側にのみあってもよいし、両端にあってもよい。また、オリゴヌクレオチドの内部にあってもよい。 When the oligonucleotide of this embodiment is used as a probe, the first unit and the second unit may be provided, or one of them may be provided. Moreover, the oligonucleotide of this aspect can be equipped with 1 type, or 2 or more types of 1st units and 2nd units, respectively. The arrangement of these units in the oligonucleotide is not particularly limited. The first unit may be continuous or the second unit may be continuous so that a signal can be detected. Further, the first unit and the second unit may be combined and continuously arranged. Furthermore, these units may be located only on one terminal side of the oligonucleotide or on both ends. It may also be inside the oligonucleotide.
(オリゴヌクレオチドプローブの製造方法)
本オリゴヌクレオチドに第1のユニット及び第2にユニット、第1のユニット及びクエンチャーユニット、並びに第2のユニット及びクエンチャーユニットをそれぞれ組み込むことで本オリゴヌクレオチドを得ることができる。第1のユニット及び第2のユニット並びに既に説明した他の組み合わせのオリゴヌクレオチドへの導入は、従来公知のDNA固相合成法において、ヌクレオチドに対応するアミダイト誘導体に代えてこの種のユニットを導入なアミダイド誘導体を用いることによって可能となる。アミダイト誘導体を取得する方法としては、例えば、以下のスキームが例示される。
(Manufacturing method of oligonucleotide probe)
The present oligonucleotide can be obtained by incorporating the first unit and the second unit, the first unit and the quencher unit, and the second unit and the quencher unit, respectively, into the oligonucleotide. The introduction of the first unit and the second unit and the other combinations of the oligonucleotides already described in this case may not be carried out in the conventionally known DNA solid phase synthesis method in place of the amidite derivative corresponding to the nucleotide. This is possible by using an amidide derivative. As a method for obtaining an amidite derivative, for example, the following scheme is exemplified.
上記スキームでは、D−トレオニノールのアミノ基をトリフルオロ酢酸エチルで保護した後、DMTを導入し、脱保護して、D−トレオニノールのDMT誘導体を得る。その後、このDMT誘導体と4−ペンチン酸とを、D−トレオニノールのアミノ基にペンチン酸を導入して、ペンチン酸−DMT誘導体を得る。別途合成したハロゲン(ここではBr)化ペリレンとこのDMT誘導体とを反応させて、エチニレン基を介してペリレンを導入して、エチニルペリレンDMT誘導体とする。次いで、このエチニルペリレンDMT誘導体をアミダイト化する。
上記スキームでは、4−エチニル安息香酸を合成後、そのカルボキシル基の水酸基にD−トレオニノールのDMT誘導体を導入して、フェニルエチニルDMT誘導体を取得する。その後、ハロゲン化ペリレンと反応させて、エチニレン基を介してペリレンを導入して、フェニルエチニルペリレンDMT誘導体とする。次いで、このフェニルエチニルペリレンDMT誘導体をアミダイト化する。 In the above scheme, after synthesizing 4-ethynylbenzoic acid, a DMT derivative of D-threoninol is introduced into the hydroxyl group of the carboxyl group to obtain a phenylethynyl DMT derivative. Thereafter, it is reacted with a halogenated perylene to introduce perylene via an ethynylene group to obtain a phenylethynylperylene DMT derivative. Next, this phenylethynylperylene DMT derivative is amidated.
なお、例示はしないが、D−トレオニノール由来のアミダイド体を取得後に、当該アミダイト体を用いて第1のユニットや第2のユニットを形成して最終的なアミダイト誘導体としてもよい。 Although not illustrated, after obtaining an amidite derived from D-threoninol, the first unit or the second unit may be formed using the amidite to form a final amidite derivative.
本明細書の開示によれば、以下の式(3)及び(4)で表される、本オリゴヌクレオチドの合成に有用なアミダイト体も提供される。上記式(3)及び(4)における式(1)及び式(2)と同一の構成(R1、R2、R3、R4、Perylene等)については、式(1)及び式(2)における構成と同義である。したがって、式(1)及び式(2)において本明細書において適用可能な構造や好ましい構造は式(3)及び(4)についても適用される。 According to the disclosure of the present specification, amidites useful for the synthesis of the present oligonucleotide represented by the following formulas (3) and (4) are also provided. For the same configurations (R1, R2, R3, R4, Perylene, etc.) as in Formulas (1) and (2) in Formulas (3) and (4) above, the configurations in Formula (1) and Formula (2) It is synonymous. Therefore, the structures applicable to the present specification in Formula (1) and Formula (2) and preferred structures also apply to Formulas (3) and (4).
上記式(3)及び(4)において、C1は、水素原子又は水酸基保護基を表す。水酸基保護基は、特に限定されないが、従来公知の水酸基保護基を用いることができる。例えば、フルオレニルメトキシカルボニル基(FMOC基)、ジメトキシトリチル基(DMT基)、四級ブチルジメチルシリル基(TBDMS基)、モノメトキシトリチル基、トリフルオロアセチル基、レブリニル基、またはシリル基が挙げられる。好ましい保護基は、トリチル基であり、例えば、モノメチルトリチル(MMT)ジメトキシトリチル(DMT)及び四級ブチルジメチルシリル基(TBDMS基)から選択される。 In the above formulas (3) and (4), C1 represents a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group. The hydroxyl protecting group is not particularly limited, and a conventionally known hydroxyl protecting group can be used. Examples include fluorenylmethoxycarbonyl group (FMOC group), dimethoxytrityl group (DMT group), quaternary butyldimethylsilyl group (TBDMS group), monomethoxytrityl group, trifluoroacetyl group, levulinyl group, or silyl group. It is done. A preferred protecting group is a trityl group, for example selected from monomethyltrityl (MMT) dimethoxytrityl (DMT) and quaternary butyldimethylsilyl group (TBDMS group).
また、D1は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。D1がホスホアミダイト基である化合物(アミダイト化合物)は、ホスホアミダイト法によるホスホアミダイト試薬として用いて、オリゴヌクレオチドを合成するのに用いることができる。なお、本発明において、ホスホアミダイト基は、以下の式(5)で表すことができる。 D1 represents a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphoramidite group, or a linking group bonded to or bonded to a solid phase carrier. A compound (amidite compound) in which D1 is a phosphoramidite group can be used as a phosphoramidite reagent by the phosphoramidite method to synthesize oligonucleotides. In the present invention, the phosphoramidite group can be represented by the following formula (5).
上記式(5)において、Q1は、特に限定しないがイソプロピル基が好ましいものとして挙げられ、また、Q2としては、−OCH2CH2CN等が挙げられる。例えば、ホスホアミド基としては、式(5)の具体例として下記式の化合物が挙げられる。 In the above formula (5), Q1 is especially but not limited to be mentioned as an isopropyl group are preferred, As the Q2, -OCH 2 CH 2 CN, and the like. For example, as a phosphoamide group, the compound of a following formula is mentioned as a specific example of Formula (5).
また、式(3)及び(4)においてD1が固相担体に結合される連結基である化合物は、当該連結基とアミノ基など固相担体上の所定の官能基とを結合させることにより、固相担体に保持される。そして、式(3)及び(4)において、D1が固相担体に結合された連結基である化合物は、連結基を介して本オリゴヌクレオチドが固相担体に結合されているため、各種の核酸固相合成法の出発材料として用いることができる。この出発材料を用いることで、式(1)又は式(2)で表されるユニットを有するオリゴヌクレオチドを製造することができる。 In addition, in the formulas (3) and (4), the compound in which D1 is a linking group bonded to the solid phase carrier is obtained by binding the linking group to a predetermined functional group on the solid phase carrier such as an amino group, It is held on a solid support. In the formulas (3) and (4), the compound in which D1 is a linking group bound to a solid phase carrier is a combination of various oligonucleotides because the present oligonucleotide is bound to the solid phase carrier via the linking group. It can be used as a starting material for solid phase synthesis. By using this starting material, an oligonucleotide having a unit represented by formula (1) or formula (2) can be produced.
第1のユニット及び第2のユニットのアミダイト誘導体を取得した後は、従来公知のDNA合成法、例えばネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌2007年第2巻203ページから212ページに記載の方法にしたがって、所望の部位に第1のユニット又は第2のユニットを備えるオリゴヌクレオチドを合成することができる。 After obtaining the amidite derivatives of the first unit and the second unit, a conventionally known DNA synthesis method, for example, the method described in Nature Protocols 2007, Vol. 2, pages 203 to 212, is used. Therefore, an oligonucleotide having the first unit or the second unit at a desired site can be synthesized.
こうした方法に準じてクエンチャーユニットのアミダイト誘導体も取得でき、クエンチャーユニットを備えるオリゴヌクレオチドを製造することができる。 According to such a method, an amidite derivative of a quencher unit can be obtained, and an oligonucleotide having a quencher unit can be produced.
(オリゴヌクレオチドプローブ固定化体)
本明細書の開示によれば、オリゴヌクレオチドプローブ固定化体であって、固相担体に本オリゴヌクレオチドがプローブとして固定化されている。本オリゴヌクレオチドはモレキュラービーコンを形成可能であってもよい。
(Immobilized oligonucleotide probe)
According to the disclosure of the present specification, an oligonucleotide probe is immobilized, and the oligonucleotide is immobilized as a probe on a solid phase carrier. The oligonucleotide may be capable of forming a molecular beacon.
固相担体は、例えばビーズであってもよいし平板であってもよく、材質は特に限定されないが、ガラス製又はプラスチック製の固相担体を用いることができる。好ましくは、固相担体は平板状であり、2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブが一定の配列で固定されたアレイである。アレイは、多数個のオリゴヌクレオチドプローブを固定でき、同時に網羅的に各種の多型や変異を検出するのに都合がよい。また、アレイは、一つの固相担体上に複数個の区画された個別のアレイ領域を備えていてもよい。これらの個別のアレイ領域は、それぞれ同一のセットのオリゴヌクレオチドプローブが固定化されていてもよいし、それぞれ別のセットのオリゴヌクレオチドプローブが固定化されていてもよい。 The solid phase carrier may be, for example, a bead or a flat plate, and the material is not particularly limited, but a solid phase carrier made of glass or plastic can be used. Preferably, the solid support is a flat plate and is an array in which two or more kinds of oligonucleotide probes are fixed in a fixed sequence. The array can fix a large number of oligonucleotide probes, and is convenient for comprehensively detecting various polymorphisms and mutations. In addition, the array may include a plurality of partitioned individual array regions on a single solid phase carrier. In these individual array regions, the same set of oligonucleotide probes may be immobilized, or different sets of oligonucleotide probes may be immobilized.
オリゴヌクレオチドプローブの固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは、従来公知の各種の方法で固相担体表面に固定化することができる。また、固相担体表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。 The immobilization form of the oligonucleotide probe is not particularly limited. It may be covalent or non-covalent. The oligonucleotide probe can be immobilized on the surface of the solid phase carrier by various conventionally known methods. An appropriate linker sequence may be provided on the surface of the solid phase carrier.
このようなプローブ固定化体の用途は特に限定されない。1塩基又は2塩基以上の欠失又は挿入変異に好適である。特に3塩基以上の欠失変異や挿入変異に好適である。具体的には、小口病、複合下垂体ホルモン欠乏症、膿疱性繊維症、劣性先天性ミオトニーなどの欠失変異が原因とされる遺伝病の検査用途が挙げられる。また、DNA上の変異と発症や重症度が判明している疾病の診断、発症予測や予後予測の検査用途が挙げられる。 The use of such a probe immobilization body is not particularly limited. Suitable for deletion or insertion mutation of 1 base or 2 bases or more. It is particularly suitable for deletion mutations and insertion mutations of 3 or more bases. Specific examples include testing for genetic diseases caused by deletion mutations such as small mouth disease, complex pituitary hormone deficiency, pustular fibrosis, and recessive congenital myotony. Moreover, the test | inspection use of the diagnosis of the disease with which the variation | mutation on DNA, onset, and severity are known, onset prediction, and prognosis prediction is mentioned.
(検査方法)
本明細書の開示によれば、欠失変異又は挿入変異の検査方法であって、欠失変異又は挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した本オリゴヌクレオチドプローブと、被験DNA含有試料とを接触させる工程、を備える、検出方法が提供される。本検査方法によれば、1塩基又は2塩基以上の欠失や挿入に係る変異を通常のハイブリダイゼーション操作で簡易に検出することができる。本検査方法の用途は、プローブ固定化体と同様、各種疾病の診断、発症予測、予後予測等が挙げられる。
(Inspection method)
According to the disclosure of the present specification, there is provided a method for examining a deletion mutation or an insertion mutation, wherein the oligonucleotide probe is configured such that the presence or absence of a deletion mutation or an insertion mutation can be distinguished from each wild type, There is provided a detection method comprising a step of contacting a test DNA-containing sample. According to this test method, a mutation associated with a deletion or insertion of one base or two or more bases can be easily detected by a normal hybridization operation. Applications of this test method include diagnosis of various diseases, onset prediction, prognosis prediction and the like, as with the probe-immobilized body.
被験DNA含有試料は、検査すべきDNAを含んでいれば足り、各種の生物から採取されたものとすることができる。典型的には、ヒト又は動物の血液などの体液や組織から採取され、核酸を抽出して得られたもの、あるいはPCR等によりDNAを増幅したものなどが挙げられる。 The test DNA-containing sample is sufficient if it contains the DNA to be examined, and can be collected from various organisms. Typically, examples include those obtained from body fluids or tissues such as human or animal blood and extracted from nucleic acids, or those obtained by amplifying DNA by PCR or the like.
本検査方法は、プローブアレイなどのオリゴヌクレオチドプローブ固定化体などを用いて実施されるのが好ましい。例えば、3塩基欠失変異を検出しようとするときの本検査方法は、以下の工程として実施される。
(1)検出しようとする変異型を野生型と識別可能に構成したオリゴヌクレオチドプローブを固定化したアレイを準備する。オリゴヌクレオチドプローブは、欠失を有しない野生型の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、変異により欠失される1塩基又は2以上の塩基で離間して第1のユニット、第2にユニット及びクエンチャーユニットから選択される2種を含んでいる。
(2)アレイに対して、被験DNA含有試料(以下、単に被験試料という。)を供給し、所定のハイブリダイゼーション条件下、ハイブリダイゼーション反応を実施する。
(3)所定時間経過後、アレイを洗浄し、被験試料中のDNAとオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを、ペリレンの発する蛍光シグナルを検出することによって行う。
(4)被験試料が、ターゲットDNAを含むとき、すなわち、変異型DNAを含むとき、変異型DNAは、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする。しかし、変異型DNAの欠失箇所にプローブ側にバルジが形成される。この結果、このプローブにおいては、第1のユニットと第2にユニットとによるエキシプレックス発光による蛍光を観察することができる。エキシプレックス発光は、バルジを形成しない野生型とのハイブリダイゼーション時における蛍光よりも長波長側にシフトしており、両者を区別することができる。なお、蛍光シグナルの検出は、蛍光スキャナー等により行うことができる。
This inspection method is preferably carried out using an oligonucleotide probe immobilized body such as a probe array. For example, this test method for detecting a three-base deletion mutation is performed as the following steps.
(1) An array is prepared on which oligonucleotide probes are constructed so that the mutant type to be detected can be distinguished from the wild type. The oligonucleotide probe has a base sequence that is complementary to a wild-type base sequence that does not have a deletion, and is separated from the first unit, second by two or more bases that are deleted by mutation. It includes two types selected from a unit and a quencher unit.
(2) A test DNA-containing sample (hereinafter simply referred to as a test sample) is supplied to the array, and a hybridization reaction is performed under predetermined hybridization conditions.
(3) After elapse of a predetermined time, the array is washed, and hybridization between DNA in the test sample and the oligonucleotide probe is performed by detecting a fluorescent signal emitted by perylene.
(4) When the test sample contains target DNA, that is, when it contains mutant DNA, the mutant DNA hybridizes with the oligonucleotide probe. However, a bulge is formed on the probe side at the deletion site of the mutant DNA. As a result, in this probe, fluorescence due to exciplex light emission by the first unit and the second unit can be observed. Exciplex emission is shifted to a longer wavelength side than fluorescence during hybridization with a wild type that does not form a bulge, and both can be distinguished. The fluorescent signal can be detected by a fluorescent scanner or the like.
また、第1のユニット(又は第2のユニット)及びクエンチャーユニットを備えるオリゴヌクレオチドプローブの場合には、ハイブリダイゼーションの結果、バルジが形成されると、第1のユニット(又は第2のユニット)のシグナル部位に対するクエンチャーによる消光が強化され、バルジが形成されないときには、逆にクエンチャーによる消光は抑制される。これにより、変異を検出することができる。 In the case of an oligonucleotide probe comprising a first unit (or second unit) and a quencher unit, if a bulge is formed as a result of hybridization, the first unit (or second unit) is formed. When quenching by the quencher with respect to the signal site is enhanced and no bulge is formed, quenching by the quencher is suppressed. Thereby, a mutation can be detected.
(検査キット)
本明細書に開示される検査キットは、欠失変異又は挿入変異の検査キットであって、1塩基又は2塩基以上の前記欠失変異又は3塩基以上の前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した本オリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。本キットは、オリゴヌクレオチドプローブとして固定化体を含んでいてもよい。
(Inspection kit)
The test kit disclosed in this specification is a test kit for a deletion mutation or an insertion mutation, and the presence or absence of the deletion mutation of 1 base or 2 bases or more or the insertion mutation of 3 bases or more is determined for each wild type. The oligonucleotide probe can be included so as to be distinguishable from each other. This kit may contain an immobilized product as an oligonucleotide probe.
以下、本明細書の開示を実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本明細書の開示を限定するものではない。 Hereinafter, the disclosure of the present specification will be specifically described with reference to examples. However, the following examples do not limit the disclosure of the present specification.
(1)Ethynylperyleneのアミダイトモノマー(4)の合成(スキーム1)
本実施例では、以下のスキームに従い、エチニルペリレン(以下、Fともいう。)をオリゴヌクレオチドに導入するためのアミダイトモノマーを合成した。
(1) Synthesis of Ethynylperylene amidite monomer ( 4 ) (Scheme 1)
In this example, an amidite monomer for introducing ethynylperylene (hereinafter also referred to as F) into an oligonucleotide was synthesized according to the following scheme.
アンゲバンテ・ケミー・インターナショナルエディション(Angewandte Chemie International Edition)誌2010年第49巻5502頁に記載の方法で、化合物1を得た。ナスフラスコに4−ペンチン酸(0.177 g, 1.80 mmol, 1.2 eq)、PyBOP(0.937 g, 1.80 mmol, 1.2 eq)を入れ、CH2Cl2約15 ml、Et3N約7.5 mlに溶解させ、10 分間攪拌した。次にCH2Cl2約15 mlに溶解させた化合物1 (0.611 g, 1.50 mmol, 1.0 eq)を加え終夜攪拌した。反応終了後、分液漏斗を用いてNaHCO3飽和水溶液、NaCl飽和水溶液で洗浄した。これをシリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒組成:へキサン:酢酸エチル:Et3N=50:50:3)で精製し、化合物2を得た。収量:0.46 g(0.943 mmol) 収率:62.9 % Compound 1 was obtained by the method described in Angewandte Chemie International Edition, 2010, Volume 49, page 5502. Place 4-pentynoic acid (0.177 g, 1.80 mmol, 1.2 eq), PyBOP (0.937 g, 1.80 mmol, 1.2 eq) in an eggplant flask, dissolve in CH 2 Cl 2 about 15 ml, Et 3 N about 7.5 ml, Stir for 10 minutes. Next, Compound 1 (0.611 g, 1.50 mmol, 1.0 eq) dissolved in about 15 ml of CH 2 Cl 2 was added and stirred overnight. After completion of the reaction, the mixture was washed with a saturated aqueous NaHCO 3 solution and a saturated aqueous NaCl solution using a separatory funnel. This was purified by silica gel column chromatography (developing solvent composition: hexane: ethyl acetate: Et 3 N = 50: 50: 3) to obtain Compound 2 . Yield: 0.46 g (0.943 mmol) Yield: 62.9%
フラスコにペリレン(1.01 g, 4.0 mmol, 1.0eq)を、連結した滴下漏斗内にNBS(0.712 g, 4.0 mmol, 1.0eq)を入れ、窒素置換した。ペリレンを脱水 DMF約135 mlに、NBSを脱水DMF約45 mlにそれぞれ溶解させ、滴下漏斗からNBSをゆっくりと滴下し、そのまま蛍光灯を点灯させた状態で終夜反応させた。反応終了後に水 1000 mlを加えたところ、ブロモペリレンが固体として析出した。収量:1.28 g(3.87 mmol) 収率:96.8 % Perylene (1.01 g, 4.0 mmol, 1.0 eq) was placed in the flask, and NBS (0.712 g, 4.0 mmol, 1.0 eq) was placed in the connected dropping funnel, and the atmosphere was replaced with nitrogen. Perylene was dissolved in about 135 ml of dehydrated DMF and NBS was dissolved in about 45 ml of dehydrated DMF, and NBS was slowly dropped from the dropping funnel and allowed to react overnight with the fluorescent lamp turned on. When 1000 ml of water was added after completion of the reaction, bromoperylene precipitated as a solid. Yield: 1.28 g (3.87 mmol) Yield: 96.8%
ジムロート冷却器を連結した二口フラスコに、CuI(0.0036 g, 0.0189 mmol, 0.02 eq)および(Ph3P)4Pd(0.0437 g, 0.0378 mmol, 0.04 eq)を入れて窒素置換し、約5 mlの脱水 THFに溶解させた。次に梨型フラスコにブロモペリレン(0.344 g, 1.04 mmol, 1.1 eq) を入れて窒素置換し、約20 mlのpiperidineおよび約10 mlの脱水 THFに溶解させた。室温でこれを前述の二口フラスコに滴下し、60 ℃で30分攪拌した。更に別の梨フラスコに化合物2 (0.46 g, 0.943 mmol, 1.0 eq) を入れて窒素置換し、約5 mlの脱水 THFに溶解させた。これを、ブロモペリレンを活性化中の二口フラスコに滴下し、還流しつつ終夜で反応させた。これをシリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒組成:クロロホルム:へキサン:Et3N=50:50:3)で精製し、化合物3を得た。収量:0.29 g(0.393 mmol) 収率:37.8 % Put a CuI (0.0036 g, 0.0189 mmol, 0.02 eq) and (Ph 3 P) 4 Pd (0.0437 g, 0.0378 mmol, 0.04 eq) into a two-necked flask connected to a Dimroth condenser, and purge with nitrogen. Was dissolved in THF. Next, bromoperylene (0.344 g, 1.04 mmol, 1.1 eq) was placed in a pear-shaped flask and purged with nitrogen, and dissolved in about 20 ml of piperidine and about 10 ml of dehydrated THF. This was dripped at the above-mentioned two neck flask at room temperature, and it stirred at 60 degreeC for 30 minutes. Furthermore, compound 2 (0.46 g, 0.943 mmol, 1.0 eq) was put into another pear flask, and the atmosphere was purged with nitrogen, and dissolved in about 5 ml of dehydrated THF. This was dropped into a two-necked flask in which bromoperylene was being activated, and allowed to react overnight while refluxing. This was purified by silica gel column chromatography (developing solvent composition: chloroform: hexane: Et 3 N = 50: 50: 3) to obtain Compound 3 . Yield: 0.29 g (0.393 mmol) Yield: 37.8%
ナスフラスコに化合物3 (0.140 g, 0.190 mmol, 1.0eq)を入れ、窒素置換した後、脱水CH2Cl2と脱水アセトニトリルに溶解させ2回共沸した後、脱水 CH2Cl2約1 mlおよび脱水アセトニトリル約1 ml、Et3N約0.17 mlに溶解させた。氷浴上で2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト(0.0947 g, 0.40 mmol, 2.1 eq, 0.0893 ml )をゆっくり滴下し、攪拌した。20 分後氷浴をはずし、室温で約40分反応させた。この後クロロホルムを加え、分液漏斗を使用してNaHCO3飽和水溶液で二回、NaCl飽和水溶液で一回洗浄した。これをシリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒組成:へキサン:酢酸エチル:Et3N=50:50:3)で精製し、化合物4を得た。脱水アセトニトリルに溶解させ3回共沸した後、窒素環境下の瓶に保存した。収量:0.15 g(0.16 mmol) 収率:84.2 % Compound 3 (0.140 g, 0.190 mmol, 1.0 eq) was placed in an eggplant flask, purged with nitrogen, dissolved in dehydrated CH 2 Cl 2 and dehydrated acetonitrile, azeotroped twice, and about 1 ml of dehydrated CH 2 Cl 2 and It was dissolved in about 1 ml of dehydrated acetonitrile and about 0.17 ml of Et 3 N. 2-Cyanoethyldiisopropylchlorophosphoramidite (0.0947 g, 0.40 mmol, 2.1 eq, 0.0893 ml) was slowly added dropwise on an ice bath and stirred. After 20 minutes, the ice bath was removed and the reaction was allowed to proceed at room temperature for about 40 minutes. After that, chloroform was added, and the mixture was washed twice with a saturated aqueous NaHCO 3 solution and once with a saturated aqueous NaCl solution using a separatory funnel. This was purified by silica gel column chromatography (developing solvent composition: hexane: ethyl acetate: Et 3 N = 50: 50: 3) to obtain Compound 4 . After dissolving in dehydrated acetonitrile and azeotroping three times, it was stored in a bottle under a nitrogen environment. Yield: 0.15 g (0.16 mmol) Yield: 84.2%
(2)Phenylethynylperyleneのアミダイトモノマー(9)の合成(スキーム2)
本実施例では、以下のスキームに従い、フェニルエチニルペリレン(以下,Lともいう。)を導入するためのアミダイトモノマーを合成した。
(2) Synthesis of Phenylethynylperylene Amidite Monomer ( 9 ) (Scheme 2)
In this example, an amidite monomer for introducing phenylethynylperylene (hereinafter also referred to as L) was synthesized according to the following scheme.
二口フラスコにCuI(0.03 g, 0.158 mmol, 0.0158 eq)および、(Ph3P)4Pd(0.03 g, 0.025 mmol, 0.0025 eq)を4-ヨード安息香酸エチル(2.76 g, 10 mmol, 1.0 eq, 1.66 ml)入れて窒素置換し、約30 mlのEt3Nに溶解させ、エチニルトリメチルシラン(1.28 g, 13 mmol, 1.3 eq, 1.80 ml)を滴下した。この後終夜で反応を続け反応開始後から24 hで反応を止めた。反応溶液中の固体を吸引ろ過で除き、ろ液の溶媒をエバポレーターで除去した後に、シリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒組成:へキサン:酢酸エチル=1:1)で精製し、化合物5を得た。収量:2.71 g(11.0 mmol) 収率:〜100% Add CuI (0.03 g, 0.158 mmol, 0.0158 eq) and (Ph 3 P) 4 Pd (0.03 g, 0.025 mmol, 0.0025 eq) to ethyl 4-iodobenzoate (2.76 g, 10 mmol, 1.0 eq) in a two-necked flask. , 1.66 ml) and purged with nitrogen, dissolved in about 30 ml of Et 3 N, and ethynyltrimethylsilane (1.28 g, 13 mmol, 1.3 eq, 1.80 ml) was added dropwise. Thereafter, the reaction was continued overnight and stopped 24 hours after the start of the reaction. The solid in the reaction solution was removed by suction filtration, and the solvent of the filtrate was removed by an evaporator, and then purified by silica gel column chromatography (developing solvent composition: hexane: ethyl acetate = 1: 1) to obtain Compound 5 . . Yield: 2.71 g (11.0 mmol) Yield: ~ 100%
化合物5 (2.71 g, 11.0 mmol)をエタノール8 mlに溶解させ、氷浴上で12 mlの1N NaOHをゆっくり滴下した。氷浴で冷やしたまま2 h反応させた後に氷浴を除き、そのまま終夜で反応させた。次に分液漏斗で約20 mlのジエチルエーテルで2回反応液を洗浄した後、水層を1N HClで酸性条件にして約200 mlのジエチルエーテルで抽出した後、ジエチルエーテル層をNaCl飽和水溶液で洗浄してからエバポレーションによりジエチルエーテルを除去して化合物6を得た。収量:1.35 g(9.22 mmol) 収率:83.8 % Compound 5 (2.71 g, 11.0 mmol) was dissolved in 8 ml of ethanol, and 12 ml of 1N NaOH was slowly added dropwise on an ice bath. The reaction was allowed to proceed for 2 hours while cooling in an ice bath, the ice bath was removed, and the reaction was allowed to proceed overnight. Next, after washing the reaction solution twice with about 20 ml of diethyl ether with a separatory funnel, the aqueous layer was made acidic with 1N HCl and extracted with about 200 ml of diethyl ether, and the diethyl ether layer was then saturated with NaCl. Then, diethyl ether was removed by evaporation to obtain Compound 6 . Yield: 1.35 g (9.22 mmol) Yield: 83.8%
化合物6(0.675 g, 4.62 mmol, 1.1eq)を約20 mlのCH2Cl2と約20 mlのEt3Nに溶解させ、そこに約10 mlのCH2Cl2に溶解させた化合物1 (1.70 g, 4.17 mmol, 1.0 eq)と、約20 mlのCH2Cl2に溶解させたPyBop(2.60 g, 5.00 mmol, 1.2eq)を加えて室温で24時間撹拌した。次にこの反応溶液を分液漏斗で約70 mlのNaHCO3飽和水溶液で3回洗浄した。これをシリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒組成:へキサン:酢酸エチル:Et3N=60:40:3で精製し、化合物7を得た。収量:1.67 g(3.12 mmol) 収率:74.8 % Compound 6 (0.675 g, 4.62 mmol, 1.1eq) was dissolved in about 20 ml of CH 2 Cl 2 and approximately 20 ml of Et 3 N, compounds were dissolved therein of CH 2 Cl 2 to about 10 ml 1 ( 1.70 g, 4.17 mmol, 1.0 eq) and PyBop (2.60 g, 5.00 mmol, 1.2 eq) dissolved in about 20 ml of CH 2 Cl 2 were added and stirred at room temperature for 24 hours. The reaction solution was then washed 3 times with a separatory funnel with about 70 ml of saturated aqueous NaHCO 3 solution. This was purified by silica gel column chromatography (developing solvent composition: hexane: ethyl acetate: Et 3 N = 60: 40: 3) to obtain Compound 7. Yield: 1.67 g (3.12 mmol) Yield: 74.8%
ジムロート冷却器を連結した二口フラスコに、CuI(0.002 g, 9.6 ×10-3mmol, 0.02 eq)および、(Ph3P)4Pd(0.022 g, 19.2×10-3 mmol, 0.04 eq)を入れて窒素置換し、約2.5 mlの脱水 THFに溶解させた。別の梨型フラスコにブロモペリレン(0.159 g, 0.48 mmol, 1.0eq) を入れて窒素置換し、約10mlのpiperidineおよび約5.0 mlの脱水 THFに溶解させた。室温でこれを前述の二口フラスコに滴下し、60 ℃で30分攪拌した。また別の梨型フラスコに化合物7(0.283 g, 0.528 mmol, 1.1 eq) を入れて窒素置換し、約2.5 mlの脱水 THFに溶解させた。これを先ほどのブロモペリレンを活性化中の二口フラスコに滴下し、 3時間還流した。この後溶媒を除去し、残渣をシリカゲルカラムトグラフィー(展開溶媒組成:クロロホルム:へキサン:Et3N=50:50:3)で精製し、化合物8を得た。
収量:0.22 g(0.280 mmol) 収率:58.3 %
CuI (0.002 g, 9.6 × 10 -3 mmol, 0.02 eq) and (Ph 3 P) 4 Pd (0.022 g, 19.2 × 10 -3 mmol, 0.04 eq) were placed in a two-necked flask connected to a Dimroth condenser. The mixture was purged with nitrogen and dissolved in about 2.5 ml of dehydrated THF. Bromoperylene (0.159 g, 0.48 mmol, 1.0 eq) was placed in another pear-shaped flask and purged with nitrogen, and dissolved in about 10 ml of piperidine and about 5.0 ml of dehydrated THF. This was dripped at the above-mentioned two neck flask at room temperature, and it stirred at 60 degreeC for 30 minutes. Moreover, compound 7 (0.283 g, 0.528 mmol, 1.1 eq) was put into another pear-shaped flask, purged with nitrogen, and dissolved in about 2.5 ml of dehydrated THF. The bromoperylene was dropped into the activated two-necked flask and refluxed for 3 hours. Thereafter, the solvent was removed, and the residue was purified by silica gel column chromatography (developing solvent composition: chloroform: hexane: Et 3 N = 50: 50: 3) to obtain Compound 8 .
Yield: 0.22 g (0.280 mmol) Yield: 58.3%
ナスフラスコに化合物8(0.19 g, 0.242 mmol, 1.0eq)を入れ、窒素置換した後、脱水CH2Cl2約5 mlおよびEt3N約0.17 mlに溶解させた。氷浴上で2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト(0.115 g, 0.484 mmol, 2.0 eq, 0.108 ml )をゆっくり滴下し攪拌した。20 分後氷浴をはずし、室温で約1時間反応させた。反応終了後クロロホルムを加え、NaHCO3飽和水溶液で二回、NaCl飽和水溶液で二回反応液を洗浄し、クロロホルムをエバポレーションにより除き、化合物9を得た。脱水アセトニトリル、dry CH2Cl2に溶解させ3回共沸した後、窒素環境下の瓶に入れた。 Compound 8 (0.19 g, 0.242 mmol, 1.0 eq) was placed in an eggplant flask, purged with nitrogen, and then dissolved in about 5 ml of dehydrated CH 2 Cl 2 and about 0.17 ml of Et 3 N. 2-Cyanoethyldiisopropylchlorophosphoramidite (0.115 g, 0.484 mmol, 2.0 eq, 0.108 ml) was slowly added dropwise on an ice bath and stirred. After 20 minutes, the ice bath was removed and the reaction was allowed to proceed for about 1 hour at room temperature. After completion of the reaction, chloroform was added, the reaction solution was washed twice with a saturated aqueous solution of NaHCO 3 and twice with a saturated aqueous solution of NaCl, and chloroform was removed by evaporation to obtain Compound 9 . After dissolving in dehydrated acetonitrile and dry CH 2 Cl 2 and azeotroping three times, it was placed in a bottle under a nitrogen environment.
本実施例では、実施例1及び実施例2で合成したアミダイトモノマーを含むDNAを合成した。エチニルペリレン(F)およびフェニルエチニルペリレン(L)を導入したDNAの発光スペクトルを従来型のペリレン(E)と比較した。 In this example, DNA containing the amidite monomer synthesized in Example 1 and Example 2 was synthesized. The emission spectra of DNA into which ethynylperylene (F) and phenylethynylperylene (L) were introduced were compared with those of conventional perylene (E).
これらのアミダイトモノマーを含むDNAの合成は、4つの天然の塩基に対応する市販のホスホロアミダイトモノマーを用いてネイチャー・プロトコルズ(Nature Protocols)誌2007年第2巻203ページから212ページに記載の方法で合成・精製した。合成したDNAを以下に示す。なお従来型のペリレン導入DNAは、テトラへドロンレターズ(Tetrahedron Letters)誌2007年第49巻6759頁から6762頁に記載の方法で合成した。結果を図3に示す。 Synthesis of DNA containing these amidite monomers is described in Nature Protocols, Vol. 2, pages 203 to 212 using commercially available phosphoramidite monomers corresponding to four natural bases. It was synthesized and purified by the method. The synthesized DNA is shown below. Conventional perylene-introduced DNA was synthesized by the method described in Tetrahedron Letters 2007, Vol. 49, pages 6759 to 6762. The results are shown in FIG.
E1a : 5’-GGTATCEGCAATC-3’
F1a : 5’-GGTATCFGCAATC-3’
L1a : 5’-GGTATCLGCAATC-3’
So (native) : 5’-GATTGCGATACC-3’
E1a: 5'-GGTATCEGCAATC-3 '
F1a: 5'-GGTATCFGCAATC-3 '
L1a: 5'-GGTATCLGCAATC-3 '
So (native): 5'-GATTGCGATACC-3 '
図3に示すように、今回新たに合成したF、Lは従来型のペリレンEと比較して、二重鎖DNA中でも十分な発光強度をもつことがわかった。またF、Lのモノマー発光はそれぞれ極大発光波長を約480 nm、500 nmに持ち、共役系が広がったことで、従来型のペリレンEに比べそれぞれ約20 nm、約40 nm長波長シフトした。 As shown in FIG. 3, it was found that F and L newly synthesized this time have sufficient luminescence intensity even in double-stranded DNA as compared with conventional perylene E. In addition, the F and L monomer emissions have maximum emission wavelengths of about 480 nm and 500 nm, respectively, and the conjugation system has expanded, resulting in wavelength shifts of about 20 nm and 40 nm longer than the conventional perylene E, respectively.
本実施例では、1塩基欠失検出プローブを設計し評価した。一塩基欠失を検出するプローブには、以下に示すように、欠失を検出したい一塩基の両隣りにLまたはFを導入したDNAを設計した。この場合、図1に示すように、野生型(T1)が二重鎖形成すると、蛍光色素の間にある塩基対により接触できないのでモノマー発光のみが観察される。しかし一塩基欠失多型では三塩基バルジを形成して二つの蛍光色素がバルジ内で接触するため、エキシマー又はエキシプレックス発光することが可能になる。 In this example, a single base deletion detection probe was designed and evaluated. As a probe for detecting a single base deletion, DNA having L or F introduced on both sides of a single base whose deletion is to be detected was designed as shown below. In this case, as shown in FIG. 1, when the wild type (T1) forms a double strand, it cannot be contacted by a base pair between the fluorescent dyes, so that only monomer emission is observed. However, in the single nucleotide deletion polymorphism, a tribasic bulge is formed and the two fluorescent dyes are contacted in the bulge, so that excimer or exciplex emission can be performed.
Probe DNA
FAF : 5’-GGTATCFAFGCAATC-3
LAL : 5’-GGTATCLALGCAATC-3
FAL : 5’-GGTATCFALGCAATC-3
Target DNA
So : 5’-GATTGCGATACC-3’
T1 : 5’-GATTGCTGATACC-3’
Probe DNA
FAF: 5'-GGTATCFAFGCAATC-3
LAL: 5'-GGTATCLALGCAATC-3
FAL: 5'-GGTATCFALGCAATC-3
Target DNA
So: 5'-GATTGCGATACC-3 '
T1: 5'-GATTGC T GATACC-3 '
まずは野生型(T1)あるいは一塩基欠失(So)と二重鎖形成させた際の安定性を調べた。その結果は表1に示すように、三種類のプローブで、T1と二重鎖形成したときと比べ、欠失型のSoと二重鎖形成したときはバルジ型構造となるため大きく不安定化した。 First, the stability when double strand formation with wild type (T1) or single nucleotide deletion (So) was examined. As shown in Table 1, the results are shown in Table 1. Compared with the double-stranded formation with T1, the three types of probes have a bulge-type structure when double-stranded with deletion-type So. did.
次にFAFをプローブに用いた場合の、1)プローブ単独(FAF)、2)野生型と二重鎖形成(FAF/T1)、3)一塩基変異多型(FAF/So)の蛍光スペクトルを図4に示す。 Next, when FAF is used as a probe, the fluorescence spectra of 1) probe alone (FAF), 2) wild type and double strand formation (FAF / T1), 3) single nucleotide polymorphism (FAF / So) As shown in FIG.
図4に示すように、野生型(T1)一塩基変異多型(So)いずれの場合もモノマー発光のみが観察された。FAF/Soでは色素同士の相互作用による消光のみが観察され、欠失型ターゲットを認識してのエキシマー発光は観測できなかった。 As shown in FIG. 4, only monomer luminescence was observed in each of the wild type (T1) single nucleotide polymorphism (So). In FAF / So, only quenching due to the interaction between dyes was observed, and no excimer luminescence was recognized when the deletion target was recognized.
次にLALをプローブに用いた場合の、1)プローブ単独(LAL)、2)野生型と二重鎖形成(LAL/T1)、3)一塩基変異多型(LAL/So)の蛍光スペクトルを図5に示す。図5に示すように、欠失型DNAを認識してのエキシマー発光は観測できなかった。プローブ一本鎖(LAL)に比較してLAL/T1、LAL/Soの方が、蛍光強度が増大した。 Next, when using LAL as a probe, the fluorescence spectra of 1) probe alone (LAL), 2) wild type and double strand formation (LAL / T1), 3) single nucleotide polymorphism (LAL / So) As shown in FIG. As shown in FIG. 5, excimer luminescence upon recognition of the deletion DNA could not be observed. Fluorescence intensity increased with LAL / T1 and LAL / So compared to probe single strand (LAL).
次に本発明のヘテロ会合型プローブFALの、1)プローブ単独(FAL)、2)野生型と二重鎖形成(FAL/T1)、3)一塩基変異多型(FAL/So)の蛍光スペクトルを図6に示す。 Next, the fluorescence spectrum of the heteroassociation probe FAL of the present invention is as follows: 1) probe alone (FAL), 2) wild type and double strand formation (FAL / T1), 3) single nucleotide polymorphism (FAL / So) Is shown in FIG.
驚くことに、Fの蛍光は完全に消光して、Lのモノマー発光のみが観測された。FからLへの高効率なFRETが起こっているためである。野生型との二重鎖(FAL/T1)と比較して一塩基欠失(FAL/So)ではわずかであるが550-600nm付近にエキシプレックス発光が観察されたことから、570nmより長波長側の発光強度はFAL/T1よりFAL/Soの方が若干大きくなった。そこでモノマー発光に基づく506nmの発光強度とエキシマー発光に基づく600nmの発光強度の比(I600/I506)を比較したところ、野生型(T1)ではI600/I506 = 0.168、欠失型(S0)ではI600/I506 = 0.245となり、明確な差が見られた。 Surprisingly, the fluorescence of F was completely quenched, and only L monomer emission was observed. This is because highly efficient FRET from F to L is occurring. Exciplex emission was observed around 550-600 nm, but it was slightly longer than 570 nm compared to the wild type duplex (FAL / T1). The emission intensity of FAL / So was slightly higher than that of FAL / T1. Therefore, when comparing the ratio of the emission intensity at 506 nm based on monomer emission to the emission intensity at 600 nm based on excimer emission (I 600 / I 506 ), I 600 / I 506 = 0.168 for the wild type (T1), deletion type ( In S0), I 600 / I 506 = 0.245, showing a clear difference.
本実施例では、三塩基欠失検出プローブの設計し、評価した。以下に示すように、三塩基欠失を検出するプローブには、欠失を検出したい三塩基の両隣りにLまたはFを導入したDNAを設計した。その原理は図2に示した一塩基欠失の場合とまったく同じである。 In this example, a three-base deletion detection probe was designed and evaluated. As shown below, as a probe for detecting a three-base deletion, DNA in which L or F was introduced on both sides of the three bases for which the deletion was to be detected was designed. The principle is exactly the same as in the case of single nucleotide deletion shown in FIG.
Probe DNA
FCTTL : 5’-AATATCATFCTTLTGGTGTTT-3
FCTTF : 5’-AATATCATFCTTFTGGTGTTT-3
LCTTL : 5’-AATATCATLCTTLTGGTGTTT-3
Target DNA
WT(野生型) : 5’-CATAGGAAACACCAAAGATGATATTTTCTTT-3’
MU(三塩基欠失型) : 5’-CATAGGAAACACCAATGATATTTTCTTT-3’
Probe DNA
FCTTL: 5'-AATATCATFCTTLTGGTGTTT-3
FCTTF: 5'-AATATCATFCTTFTGGTGTTT-3
LCTTL: 5'-AATATCATLCTTLTGGTGTTT-3
Target DNA
WT (wild type): 5'-CATAGGAAACACCA AAG ATGATATTTTCTTT-3 '
MU (Trinucleotide deletion type): 5'-CATAGGAAACACCAATGATATTTTCTTT-3 '
まずは野生型(WT)あるいは一塩基欠失(MU)と二重鎖形成させた際の安定性を調べた。その結果は表2に示すように、三種類のプローブで、WTと二重鎖形成したときと比べ、欠失型のWTと二重鎖形成したときはバルジ型構造となるため大きく不安定化した。 First, the stability when double strand formation with wild type (WT) or single nucleotide deletion (MU) was examined. As shown in Table 2, the results are shown in Table 2. Compared to the double-stranded formation with WT, the three types of probes have a bulge-type structure when double-stranded with deleted WT. did.
次にFCTTFをプローブに用いた場合の、1)プローブ単独(FCTTF)、2)野生型と二重鎖形成(FCTTF/WT)、3)三塩基変異多型(FCTTF/MU)の蛍光スペクトルを図7に示す。図7に示すように、野生型(WT)三塩基変異多型(MU)いずれの場合もモノマー発光のみが観察され、欠失型ターゲットを認識してのエキシマー発光は観測できなかった。 Next, when FCTTF is used as a probe, the fluorescence spectrum of 1) probe alone (FCTTF), 2) wild type and double strand formation (FCTTF / WT), and 3) trinucleotide polymorphism (FCTTF / MU) As shown in FIG. As shown in FIG. 7, only monomer luminescence was observed in all cases of wild type (WT) trinucleotide polymorphism (MU), and excimer luminescence upon recognition of the deletion target could not be observed.
次に、LCTTLをプローブに用いた場合の、1)プローブ単独(LCTTL)、2)野生型と二重鎖形成(LCTTL/WT)、3)三塩基変異多型(LCTTL/MU)の蛍光スペクトルを図8に示す。図8に示すように、野生型(WT)三塩基変異多型(MU)いずれの場合もモノマー発光のみが観察され、欠失型ターゲットを認識してのエキシマー発光は観測できなかった。 Next, when LCTTL is used as a probe, 1) probe alone (LCTTL), 2) wild type and double strand formation (LCTTL / WT), 3) trinucleotide polymorphism (LCTTL / MU) fluorescence spectrum Is shown in FIG. As shown in FIG. 8, only the monomer luminescence was observed in any of the wild type (WT) trinucleotide polymorphism (MU), and excimer luminescence upon recognition of the deletion target could not be observed.
次に、FCTTLをプローブに用いた場合の、1)プローブ単独(FCTTL)、2)野生型と二重鎖形成(FCTTL/WT)、3)三塩基変異多型(FCTTL/MU)の蛍光スペクトルを図8に示す。 Next, when FCTTL is used as a probe, 1) probe alone (FCTTL), 2) wild-type and double-strand formation (FCTTL / WT), and 3) trinucleotide polymorphism (FCTTL / MU) fluorescence spectrum Is shown in FIG.
図8に示すように、FALの場合と同様に、Fの蛍光は完全に消光してLの発光のみが観測された。FからLへの高効率なFRETが起こっているためである。野生型との二重鎖(FCTTL/WT)と比較して三塩基欠失(FCTTL/MU)では、550-650nmにかけて、明確なエキシプレックス発光が観察された。そこでFALと同様にモノマー発光に基づく506nmの発光強度とエキシマー発光に基づく600nmの発光強度の比(I600/I506)を比較したところ、野生型(WT)ではI600/I506 = 0.063、欠失型(MU)ではI600/I506 = 0.35となり、5倍以上の明確な差が見られた。この差は目視でも十分に観察することができ、野生型では緑色、欠失型では黄色の発光として識別することができた。 As shown in FIG. 8, as in the case of FAL, the fluorescence of F was completely quenched, and only L emission was observed. This is because highly efficient FRET from F to L is occurring. A clear exciplex emission was observed from 550 to 650 nm in the triple nucleotide deletion (FCTTL / MU) compared to the wild type duplex (FCTTL / WT). Therefore, the ratio of the emission intensity at 506 nm based on monomer emission and the emission intensity at 600 nm based on excimer emission (I 600 / I 506 ) was compared with FAL, and I 600 / I 506 = 0.063 in the wild type (WT). In the deletion type (MU), I 600 / I 506 = 0.35, and a clear difference of 5 times or more was observed. This difference could be sufficiently observed visually, and it could be identified as green emission in the wild type and yellow emission in the deletion type.
配列番号1〜7:合成オリゴヌクレオチド Sequence number 1-7: Synthetic oligonucleotide
Claims (13)
1塩基又は2塩基以上のヌクレオチドで離間されて、第1のユニット;
、第2のユニット;
クエンチャーユニットから選択される2種を備える、オリゴヌクレオチド。 An oligonucleotide comprising:
A first unit separated by one or more nucleotides;
The second unit;
請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして固相担体に固定化された固定化体。 An oligonucleotide probe-immobilized product comprising:
An immobilized body immobilized on a solid phase carrier using the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 5 as a probe.
前記欠失変異又は前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドと、被験DNA含有試料とを接触させる工程、
を備える、検出方法。 A method for testing a deletion mutation or an insertion mutation, comprising:
A step of contacting the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 5 with a test DNA-containing sample, wherein the presence or absence of the deletion mutation or the insertion mutation can be distinguished from each wild type,
A detection method comprising:
前記欠失変異又は前記挿入変異の存否をそれぞれの野生型との間で区別可能に構成した請求項1〜5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを含む、キット。 A test kit for deletion mutation or insertion mutation, comprising:
The kit containing the oligonucleotide probe in any one of Claims 1-5 comprised so that the presence or absence of the said deletion mutation or the said insertion mutation was distinguishable from each wild type.
(式(3)中、R1は、炭素数2〜4のアルキニレン基を表し、R2は、フェニレン基を表し、Peryleneは、ペリレン基を表す。C1は、水素原子又は水酸基保護基を表し、D1は、水素原子、水酸基保護基、ホスホアミダイト基又は固相担体に結合される若しくは結合された連結基を表す。) A compound represented by the following formula (3).
(In Formula (3), R1 represents an alkynylene group having 2 to 4 carbon atoms, R2 represents a phenylene group, Perylene represents a perylene group, C1 represents a hydrogen atom or a hydroxyl protecting group, and D1 Represents a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group, a phosphoramidite group, or a linking group bound to or bound to a solid phase carrier.)
第1のユニット;
及び
第2のユニット;
のいずれか一方又は双方を備える、オリゴヌクレオチド。 An oligonucleotide comprising:
First unit;
And a second unit;
An oligonucleotide comprising either or both of:
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