JP2012050343A - Method for producing enzyme-immobilized hydrogel - Google Patents
Method for producing enzyme-immobilized hydrogel Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012050343A JP2012050343A JP2010193106A JP2010193106A JP2012050343A JP 2012050343 A JP2012050343 A JP 2012050343A JP 2010193106 A JP2010193106 A JP 2010193106A JP 2010193106 A JP2010193106 A JP 2010193106A JP 2012050343 A JP2012050343 A JP 2012050343A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- immobilized
- polymer
- catalyst
- laccase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 81
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 68
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims abstract description 65
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 60
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 41
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims abstract description 35
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 92
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 claims description 24
- 108700022290 poly(gamma-glutamic acid) Proteins 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 10
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 10
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 10
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 10
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 8
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 claims description 8
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims description 7
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims description 7
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 claims description 7
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims description 7
- 229920000805 Polyaspartic acid Polymers 0.000 claims description 4
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 claims description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 claims description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 2
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 2
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 claims description 2
- 229920003175 pectinic acid Polymers 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 34
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 39
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N Tyramine Natural products NCCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 229960003732 tyramine Drugs 0.000 description 32
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O tyraminium Chemical compound [NH3+]CCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 32
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M (4-nitrophenyl)acetate Chemical compound [O-]C(=O)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 17
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 16
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 7
- DCQWRDUXRZSWHI-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) propanoate Chemical compound CCC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 DCQWRDUXRZSWHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 4
- LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N guaiacol Chemical compound COC1=CC=CC=C1O LHGVFZTZFXWLCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000005691 oxidative coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YCCILVSKPBXVIP-UHFFFAOYSA-N 2-(4-hydroxyphenyl)ethanol Chemical compound OCCC1=CC=C(O)C=C1 YCCILVSKPBXVIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 2
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 2
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 etc.) Polymers 0.000 description 2
- 229960001867 guaiacol Drugs 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- BVJSUAQZOZWCKN-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=C(O)C=C1 BVJSUAQZOZWCKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- SYHVBRQKMHIAJQ-UHFFFAOYSA-N 3-(2-aminoethyl)benzene-1,2-diol Chemical compound NCCC1=CC=CC(O)=C1O SYHVBRQKMHIAJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBFALTGHGHULNL-UHFFFAOYSA-N 3-(hydroxymethyl)benzene-1,2-diol Chemical compound OCC1=CC=CC(O)=C1O UBFALTGHGHULNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound CN(C)CCCN=C=N ISCMYZGMRHODRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJBLUNHMOKFZQX-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-1,2,3-benzotriazin-4-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N(O)N=NC2=C1 HJBLUNHMOKFZQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 241000222490 Bjerkandera Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000222511 Coprinus Species 0.000 description 1
- 241000222356 Coriolus Species 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- 241000222350 Pleurotus Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241001581437 Polystictus Species 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 241000222644 Pycnoporus <fungus> Species 0.000 description 1
- 241000231139 Pyricularia Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N pectic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)O[C@H](C(O)=O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)C(O)=O)O)[C@@H](C(O)=O)O1 LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、酵素固定化ハイドロゲルの製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing an enzyme-immobilized hydrogel.
水中で酵素を触媒として物質変換を行う場合、酵素と反応混合物等の分離の容易さから、固定化された酵素が好ましい。固定化酵素としては、粒子や粉体等の担体に固定化するものが知られているが、その担体が、水媒体、酵素および／または親水性基質との親和性が低い場合が多く、固定化により酵素の触媒活性が十分に発揮できない場合が多い。この問題を解決するため、ハイドロゲルに酵素を固定化する方法が知られている。このハイドロゲルに酵素を固定化する方法としては、包括法が代表的である。また、一般にバイオリアクター等によく使用される担体としては、アルギン酸カルシウムやカラギナンカルシウム、アガロース等のゲルが知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。これらのゲルを使用して得られる包括固定化担体は、繰り返して使用されることを前提とするため、このゲルは機械的強度に優れ、しかも酵素の反応性は維持される必要がある。担体としてアルギン酸カルシウムを用いる場合は、カルシウム塩濃度が高いために固定化された酵素の活性低下を引起こす場合がある。また、担体としてアガロースを用いる場合には、ゲルから固定化された酵素が漏出する場合がある。前記以外に機械的強度に優れた包括固定化担体としては、ポリエチレンイミン等のカチオン性高分子化合物をグルタルアルデヒド等の多官能性架橋試薬で架橋してより強固にする方法やゲル中にポリビニルアルコールを共存せしめ、凍結、解凍を繰り返す方法により得られる単体等が報告されている。しかし、例えば多官能性架橋試薬を用いた方法は、架橋処理の際に酵素活性の失活等が起こるために、固定化された酵素の反応性が低下する場合がある。さらにこの方法には、使用する薬剤の残留等による安全性に関する問題点もある。
When substance conversion is performed using an enzyme as a catalyst in water, an immobilized enzyme is preferable because of the ease of separating the enzyme and the reaction mixture. Immobilized enzymes are known to be immobilized on a carrier such as particles or powder, but the carrier often has low affinity with an aqueous medium, enzyme and / or hydrophilic substrate, and is immobilized. In many cases, the catalytic activity of the enzyme cannot be fully exhibited due to the conversion. In order to solve this problem, a method of immobilizing an enzyme on a hydrogel is known. As a method for immobilizing an enzyme on this hydrogel, a comprehensive method is typical. In general, gels such as calcium alginate, carrageenan calcium, and agarose are known as carriers often used in bioreactors and the like (see, for example,
そこで、本発明は、固定化される酵素の触媒活性には影響を及ぼさず、かつ、固定化された担体からの酵素の漏出が抑制される、酵素が固定化されたハイドロゲルの製造方法を提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention provides a method for producing an enzyme-immobilized hydrogel that does not affect the catalytic activity of the enzyme to be immobilized, and that prevents leakage of the enzyme from the immobilized carrier. The purpose is to provide.
本発明は、酵素を固定化したハイドロゲルを得る製造方法であって、
フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素とを、フェノール基どうしを結合させて架橋させる架橋触媒の存在下に反応させ、前記ポリマーを架橋させると共に前記酵素を前記ポリマーに固定化させる工程を含み、
前記架橋触媒は、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼであり、
前記架橋触媒がペルオキシダーゼの場合、前記架橋触媒と共に過酸化水素を用い、
前記架橋触媒がラッカーゼまたはチロシナーゼの場合、前記架橋触媒と共に酸素を用いる。
The present invention is a production method for obtaining a hydrogel having an enzyme immobilized thereon,
A polymer containing a carboxyl group containing a phenol group and an enzyme are reacted in the presence of a crosslinking catalyst that bonds the phenol groups together to crosslink, thereby crosslinking the polymer and immobilizing the enzyme on the polymer. Including the step of
The cross-linking catalyst is peroxidase, laccase or tyrosinase;
When the crosslinking catalyst is peroxidase, hydrogen peroxide is used together with the crosslinking catalyst,
When the crosslinking catalyst is laccase or tyrosinase, oxygen is used together with the crosslinking catalyst.
本発明により、固定化される酵素の触媒活性には影響を及ぼさず、かつ、固定化された担体からの酵素の漏出が抑制される、酵素を固定化したハイドロゲル（本明細書中、「酵素固定化ハイドロゲル」と呼ぶ場合がある。）を提供することが可能である。 According to the present invention, an enzyme-immobilized hydrogel that does not affect the catalytic activity of the immobilized enzyme and suppresses leakage of the enzyme from the immobilized carrier (herein, “ It may be referred to as “enzyme-immobilized hydrogel”).
本発明は、前記のように、酵素を固定化したハイドロゲルを得る製造方法であって、フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素とを、フェノール基どうしを結合させて架橋させる架橋触媒の存在下に反応させ、前記ポリマーを架橋させると共に前記酵素を前記ポリマーに固定化させる工程を含み、前記架橋触媒は、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼであり、前記架橋触媒がペルオキシダーゼの場合、前記架橋触媒と共に過酸化水素を用い、前記架橋触媒がラッカーゼまたはチロシナーゼの場合、前記架橋触媒と共に酸素を用いる。 As described above, the present invention is a production method for obtaining a hydrogel having an enzyme immobilized thereon, wherein a phenol group-introduced polymer containing a carboxyl group and the enzyme are crosslinked by bonding the phenol groups together. Reacting in the presence of a cross-linking catalyst to cause cross-linking of the polymer and immobilizing the enzyme to the polymer, wherein the cross-linking catalyst is peroxidase, laccase or tyrosinase, and when the cross-linking catalyst is peroxidase, Hydrogen peroxide is used together with the crosslinking catalyst, and oxygen is used together with the crosslinking catalyst when the crosslinking catalyst is laccase or tyrosinase.
本発明の製造方法において、前記カルボキシル基を含有するポリマーは、ポリ（γ−グルタミン酸）、アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ポリアスパラギン酸、タンパク質（例えば、コラーゲン、ゼラチン等）、ポリアクリル酸、およびポリメタクリル酸からなる群から選択される１種以上であるのが好ましく、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸、アルギン酸がより好ましく、ポリ（γ−グルタミン酸）、ポリアクリル酸、ポリアスパラギン酸がさらに好ましい。本発明において、前記ポリマーの分子量は限定されないが、重量平均分子量が、例えば、３千〜１千万であり、好ましくは５千〜８００万であり、より好ましくは１万〜５００万である。 In the production method of the present invention, the polymer containing a carboxyl group is poly (γ-glutamic acid), alginic acid, hyaluronic acid, pectic acid, polyaspartic acid, protein (eg, collagen, gelatin, etc.), polyacrylic acid, and It is preferably at least one selected from the group consisting of polymethacrylic acid, poly (γ-glutamic acid), polyacrylic acid, polyaspartic acid and alginic acid are more preferred, poly (γ-glutamic acid), polyacrylic acid, Polyaspartic acid is more preferred. In the present invention, the molecular weight of the polymer is not limited, but the weight average molecular weight is, for example, 3,000 to 10,000,000, preferably 5,000 to 8,000,000, and more preferably 10,000 to 5,000,000.
本発明の製造方法において、「フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマー」は、例えば、前記カルボキシル基を含有するポリマーのカルボキシル基と、フェノール基と一級アミノ基を有する化合物のアミノ基とでアミド結合を形成することにより、得ることができる。前記「フェノール基と一級アミノ基を有する化合物」としては、例えば、チロシン、チラミン、３−（２−アミノエチル）カテコールおよび３、４-ジヒドロキシ−L−フェニルアラニンが挙げられる。例えば、チラミン由来の「フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマー」は、以下のスキーム１に従い、「カルボキシル基を含有するポリマー」としての「ポリ（γ−グルタミン酸）」と、「フェノール基と一級アミノ基を有する化合物」としてのチラミンとから、製造することができる。
In the production method of the present invention, the “polymer having a carboxyl group into which a phenol group has been introduced” includes, for example, the carboxyl group of the polymer having a carboxyl group, and the amino group of a compound having a phenol group and a primary amino group. Can be obtained by forming an amide bond. Examples of the “compound having a phenol group and a primary amino group” include tyrosine, tyramine, 3- (2-aminoethyl) catechol, and 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine. For example, a “polymer containing a carboxyl group into which a phenol group has been introduced” derived from tyramine is expressed in accordance with the following
スキーム１中、「γ−ＰＧＡ」は「ポリ（γ−グルタミン酸）」を、「ＥＤＣ］は、「１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド」を、「ＮＨＳ」は「Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド」を意味する。
In
また、本発明の製造方法において、「フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマー」は、例えば、前記カルボキシル基を含有するポリマーのカルボキシル基と、フェノール基と一級水酸基を有する化合物の水酸基とでエステル結合を形成することにより、得ることができる。前記「フェノール基と一級水酸基を有する化合物」としては、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）フェノール、４−ヒドロキシメチルフェノール、３−（２−ヒドロキシエチル）カテコールおよび３−ヒドロキシメチルカテコールが挙げられる。 In the production method of the present invention, the “polymer having a carboxyl group into which a phenol group has been introduced” includes, for example, the carboxyl group of the polymer containing the carboxyl group, the hydroxyl group of the compound having a phenol group and a primary hydroxyl group, and Can be obtained by forming an ester bond. Examples of the “compound having a phenol group and a primary hydroxyl group” include 4- (2-hydroxyethyl) phenol, 4-hydroxymethylphenol, 3- (2-hydroxyethyl) catechol and 3-hydroxymethylcatechol. .
「フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマー」において、フェノール基の導入の程度は、特に限定されない。カルボキシル基を含有するポリマーのカルボキシル基の、例えば０．５モル％〜５０モル％、好ましくは０．８モル％〜３０モル％、より好ましくは１モル％〜２０モル％に、フェノール基が導入されていてもよい。 In the “polymer containing a carboxyl group having a phenol group introduced”, the degree of introduction of the phenol group is not particularly limited. A phenol group is introduced into, for example, 0.5 mol% to 50 mol%, preferably 0.8 mol% to 30 mol%, more preferably 1 mol% to 20 mol% of the carboxyl group of the polymer containing a carboxyl group. May be.
アミド結合あるいはエステル結合を介して、カルボキシル基を含有するポリマーへフェノール基を導入する方法は、当該分野で公知の方法をいずれも用いることができる。例えば、カルボキシル基を含有するポリマーと、前記フェノール基と一級アミノ基を有する化合物または、前記フェノール基と一級水酸基を有する化合物とを水あるいは中性の有機溶媒あるいはそれらの混合溶媒に溶解させ、そこへ縮合剤を添加して室温〜６０℃において、１時間〜３日混合することにより、カルボキシル基を含有するポリマーのカルボキシル基と、前記フェノール基と一級アミノ基を有する化合物のアミノ基との間にアミド結合または、前記フェノール基と一級水酸基を有する化合物の一級水酸基との間にエステル結合をそれぞれ形成することができる。前記縮合剤として、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）等が挙げられる。また、前記有機溶媒として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等が挙げられる。なお、前記縮合剤と合わせて、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）等の酸性添加剤を用いるのが、反応効率向上の観点から好ましい。 As a method for introducing a phenol group into a polymer containing a carboxyl group via an amide bond or an ester bond, any method known in the art can be used. For example, a polymer containing a carboxyl group, a compound having a phenol group and a primary amino group, or a compound having a phenol group and a primary hydroxyl group are dissolved in water, a neutral organic solvent, or a mixed solvent thereof. By adding a condensing agent to the mixture and mixing at room temperature to 60 ° C. for 1 hour to 3 days, the carboxyl group of the polymer containing the carboxyl group and the amino group of the compound having the phenol group and the primary amino group An amide bond or an ester bond can be formed between the phenol group and the primary hydroxyl group of the compound having a primary hydroxyl group. Examples of the condensing agent include 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC), and the like. Examples of the organic solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO), tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMAc), N-methylpyrrolidone (NMP), and the like. In addition, together with the condensing agent, N-hydroxybenzotriazole (HOBt), 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (HOOBt), N-hydroxysuccinimide It is preferable to use an acidic additive such as (NHS) from the viewpoint of improving reaction efficiency.
具体的には、カルボキシル基を含有するポリマーと、縮合剤（ポリマーに含まれるカルボキシル基に対して０.０１〜１当量）と、酸性添加剤（ポリマーに含まれるカルボキシル基に対して０.０１〜１当量）とを、溶媒中に溶解させ、室温〜６０℃において、１時間〜３日、攪拌させる。次いで、その混合物に前記フェノール基と一級アミノ基を有する化合物または、前記フェノール基と一級水酸基を有する化合物を、ポリマーに含まれるカルボキシル基に対して０.００５〜０.８当量添加し、室温〜６０℃において、１時間〜３日、更に攪拌させる。得られた混合物に、縮合剤および酸性添加剤が溶解可能であるが、生成物が溶解しない溶剤（例えば、縮合剤がＥＤＣであり、縮合補助剤がＮＨＳの場合、エタノール）を添加して生成したポリマーを沈殿させ、沈殿物を回収する。その沈殿物を溶媒に溶解させ、その溶液をイオン交換樹脂（例えば陽イオン交換樹脂）を用いて精製する。陽イオン交換樹脂により精製した場合は、得られた生成物にアルカリ化合物（例えばＮａＨＣＯ3）を添加して塩（例えばＮａ塩）の形態にしてから、凍結乾燥する。
Specifically, a polymer containing a carboxyl group, a condensing agent (0.01 to 1 equivalent to the carboxyl group contained in the polymer), and an acidic additive (0.01 to the carboxyl group contained in the polymer). ˜1 equivalent) in a solvent and allowed to stir at room temperature to 60 ° C. for 1 hour to 3 days. Next, 0.005 to 0.8 equivalent of the compound having the phenol group and the primary amino group or the compound having the phenol group and the primary hydroxyl group is added to the mixture with respect to the carboxyl group contained in the polymer. The mixture is further stirred at 60 ° C. for 1 hour to 3 days. Generated by adding a solvent in which the condensing agent and acidic additive can be dissolved but the product does not dissolve in the resulting mixture (for example, ethanol when the condensing agent is EDC and the condensing aid is NHS). The polymer is precipitated and the precipitate is collected. The precipitate is dissolved in a solvent, and the solution is purified using an ion exchange resin (for example, a cation exchange resin). In the case of purification with a cation exchange resin, an alkali compound (for example, NaHCO 3 ) is added to the obtained product to form a salt (for example, Na salt), and then lyophilized.
本発明の製造方法において、前記酵素は、炭酸脱水酵素（ＣＡＢ）、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群からなる群から選択される１種以上であるのが好ましく、炭酸脱水酵素（ＣＡＢ）、リパーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼがより好ましい。本発明において用いられるペルオキシダーゼは、種々の起源のペルオキシダーゼが含まれる。好ましいペルオキシダーゼとしては、植物由来のもの、細菌由来のもの、坦子菌類由来のものが挙げられ、とくに好ましいものとして西洋わさび由来のもの（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）、大豆由来のもの、Coprinus cineris由来のものが挙げられる。また、本発明において用いられるラッカーゼは、種々の起源のラッカーゼが使用でき、特に制限はなく全てのラッカーゼが含まれる。好ましいラッカーゼとしては、植物由来のもの、細菌由来のもの、坦子菌類由来のものが挙げられる。前記ラッカーゼとしては、例えばウルシの木から得られるラッカーゼ、Pyricularia, Pleurotus, Pycnoporus, Polystictus, Coriolus, Bjerkandera, Neurospora属の微生物から得られるラッカーゼを挙げることができる。 In the production method of the present invention, the enzyme is a group consisting of carbonic anhydrase (CAB), lipase, amylase, protease, cellulase, glucose oxidase, glucosidase, hyaluronidase, xanthine oxidase, transglutaminase, laccase, tyrosinase and peroxidase. One or more selected from the group consisting of carbonic anhydrase (CAB), lipase, amylase, and peroxidase are more preferable. The peroxidase used in the present invention includes peroxidases of various origins. Preferred peroxidases include those derived from plants, bacteria, and basidiomycetes. Particularly preferred are those derived from horseradish (horseradish peroxidase), soybeans, and Coprinus cineris. Things. The laccase used in the present invention can be laccase of various origins, and is not particularly limited and includes all laccases. Preferred laccases include those derived from plants, those derived from bacteria, and those derived from basidiomycetes. Examples of the laccase include laccase obtained from urushi trees and laccase obtained from microorganisms belonging to the genus Pyricularia, Pleurotus, Pycnoporus, Polystictus, Coriolus, Bjerkandera, and Neurospora.
本発明の製造方法において、前記架橋触媒は、フェノール基どうしを結合させて前記ポリマーを架橋させる。このような架橋触媒としては、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼである。なお、本発明の製造方法において、前記酵素は、例えば前記架橋触媒としても作用する場合がある。この場合、前記酵素はハイドロゲルに固定化され、かつ、前記ポリマーと前記酵素自身とを反応させるよう作用する。具体的には、酵素を固定化したハイドロゲルを得る製造方法であって、フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素とを、反応させ、前記ポリマーを架橋させると共に前記酵素を前記ポリマーに固定化させる工程を含み、前記酵素は、フェノール基どうしを結合させて架橋させる架橋触媒としても作用し、前記架橋触媒は、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼであり、前記架橋触媒がペルオキシダーゼの場合、前記架橋触媒と共に過酸化水素を用い、前記架橋触媒がラッカーゼまたはチロシナーゼの場合、前記架橋触媒と共に酸素を用いる。 In the production method of the present invention, the cross-linking catalyst cross-links the polymer by bonding phenol groups together. Such crosslinking catalysts are peroxidase, laccase or tyrosinase. In the production method of the present invention, the enzyme may act as the crosslinking catalyst, for example. In this case, the enzyme is immobilized on a hydrogel and acts to react the polymer with the enzyme itself. Specifically, it is a production method for obtaining a hydrogel in which an enzyme is immobilized, wherein a polymer containing a phenol group and containing a carboxyl group is reacted with the enzyme to crosslink the polymer and the enzyme. Including a step of immobilizing the polymer, wherein the enzyme also acts as a crosslinking catalyst for bonding phenol groups to each other, and the crosslinking catalyst is peroxidase, laccase or tyrosinase, and the crosslinking catalyst is peroxidase In the case where hydrogen peroxide is used together with the crosslinking catalyst and the crosslinking catalyst is laccase or tyrosinase, oxygen is used together with the crosslinking catalyst.
本発明の製造方法において、フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素とを、前記架橋触媒の存在下に反応させる工程は、以下のようにして行うことができる。本発明の製造方法において、前記架橋触媒がペルオキシダーゼの場合、前記架橋触媒と共に過酸化水素を用いる。この場合、前記反応させる工程は、フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、前記酵素と、ペルオキシダーゼを、溶媒中で攪拌して混合して行うことができる。その混合液に、過酸化水素を加え、さらに静置または攪拌することにより、前記ポリマーのフェノール基どうしの酸化カップリングが起こる。その結果、前記ポリマー間（分子内および分子間）で架橋され、前記ポリマーをゲル化することができる。また、同時に、前記酵素に一般的に含まれているチロシン残基と、前記ポリマーのフェノール基との間でも酸化カップリングが起きる。その結果、得られる酵素固定化ハイドロゲルにおいて、前記酵素は前記ゲルへ共有結合的に固定化されることができる。なお、この架橋反応はフェノール基が選択的に反応するため、固定化された酵素の活性には影響が少ない。また、本発明の製造方法において、前記酵素もペルオキシダーゼである場合、固定化される酵素がペルオキシダーゼであり、かつ、架橋触媒もペルオキシダーゼである。すなわち、ペルオキシダーゼは、一つで二つの機能を果たすことができる。 In the production method of the present invention, the step of reacting a carboxyl group-containing polymer into which a phenol group has been introduced and an enzyme in the presence of the crosslinking catalyst can be carried out as follows. In the production method of the present invention, when the crosslinking catalyst is peroxidase, hydrogen peroxide is used together with the crosslinking catalyst. In this case, the step of reacting can be performed by stirring and mixing a polymer containing a carboxyl group into which a phenol group has been introduced, the enzyme, and peroxidase in a solvent. Hydrogen peroxide is added to the mixture, and the mixture is further allowed to stand or stir to cause oxidative coupling between the phenol groups of the polymer. As a result, the polymer is cross-linked (intramolecular and intermolecular), and the polymer can be gelled. At the same time, oxidative coupling occurs between a tyrosine residue generally contained in the enzyme and the phenol group of the polymer. As a result, in the resulting enzyme-immobilized hydrogel, the enzyme can be covalently immobilized on the gel. Note that this crosslinking reaction has a small effect on the activity of the immobilized enzyme because the phenol group selectively reacts. In the production method of the present invention, when the enzyme is also peroxidase, the enzyme to be immobilized is peroxidase, and the cross-linking catalyst is also peroxidase. That is, peroxidase can perform two functions by itself.
例えば、チラミン由来のフェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリ（γ−グルタミン酸）は、ゲル化により、以下のスキーム２に示すような構造に変換される。
For example, poly (γ-glutamic acid) containing a carboxyl group into which a phenol group derived from tyramine is introduced is converted into a structure as shown in
スキーム２中、「γ−ＰＧＡ」は「ポリ（γ−グルタミン酸）」を意味する。
In
酵素がペルオキシダーゼ以外の酵素である場合、前記酵素の量は、（フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーの重量）：（前記酵素の重量）が、例えば、１〜２００：１であり、５〜１５０：１が好ましく、１０〜１００：１がより好ましい。また、架橋触媒としての前記ペルオキシダーゼの量は、（フェノール基を導入した、カルボン酸基を含有するポリマーの重量）：（前記ペルオキシダーゼの重量）が、例えば、１〜１５０，０００：１であり、１０〜１００，０００：１が好ましく、１００〜８０，０００：１がより好ましい。また、過酸化水素の量は、（フェノール基を導入したカルボキシル基を含有するポリマーの重量）：（過酸化水素の重量）が、例えば、５〜１，０００：１であり、１０〜８００：１が好ましく、１５〜６００：１がより好ましい。 When the enzyme is an enzyme other than peroxidase, the amount of the enzyme is (weight of the polymer containing a carboxyl group having a phenol group introduced) :( weight of the enzyme) is, for example, 1 to 200: 1. 5 to 150: 1 is preferable, and 10 to 100: 1 is more preferable. Further, the amount of the peroxidase as a crosslinking catalyst is (weight of polymer having a carboxylic acid group introduced with a phenol group) :( weight of the peroxidase), for example, 1 to 150,000: 1, 10-100,000: 1 are preferable and 100-80,000: 1 are more preferable. The amount of hydrogen peroxide is, for example, (weight of polymer containing a carboxyl group having a phenol group introduced) :( weight of hydrogen peroxide) is, for example, 5 to 1,000: 1, and 10 to 800: 1 is preferable, and 15 to 600: 1 is more preferable.
一方、酵素がペルオキシダーゼである（すなわち、ペルオキシダーゼは固定化されるべき酵素であり、かつ、架橋触媒としても作用する）場合、前記ペルオキシダーゼの量は、（フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーの重量）：（前記ペルオキシダーゼの重量）が、例えば、１〜５００：１であり、３〜４００：１が好ましく、５〜３００：１がより好ましい。また、過酸化水素の量は、（フェノール基を導入したカルボキシル基を含有するポリマーの重量）：（過酸化水素の重量）が、例えば、５〜１，０００：１であり、１０〜８００：１が好ましく、１５〜６００：１がより好ましい。 On the other hand, when the enzyme is a peroxidase (ie, the peroxidase is an enzyme to be immobilized and also acts as a crosslinking catalyst), the amount of the peroxidase contains a carboxyl group (phenol group introduced, carboxyl group) Polymer weight): (weight of the peroxidase) is, for example, 1 to 500: 1, preferably 3 to 400: 1, and more preferably 5 to 300: 1. The amount of hydrogen peroxide is, for example, (weight of polymer containing a carboxyl group having a phenol group introduced) :( weight of hydrogen peroxide) is, for example, 5 to 1,000: 1, and 10 to 800: 1 is preferable, and 15 to 600: 1 is more preferable.
前記ポリマーと前記酵素と前記ペルオキシダーゼとを混合する際、反応混合物の温度は、例えば１０〜４５℃であり、１５〜３５℃が好ましい。前記ポリマーと前記酵素と前記ペルオキシダーゼとを混合する際、混合時間は、例えば１０秒以上であり、３０秒〜１０時間が好ましい。 When mixing the polymer, the enzyme, and the peroxidase, the temperature of the reaction mixture is, for example, 10 to 45 ° C, and preferably 15 to 35 ° C. When mixing the polymer, the enzyme, and the peroxidase, the mixing time is, for example, 10 seconds or more, and preferably 30 seconds to 10 hours.
過酸化水素を加えて混合する際、反応混合物の温度は、例えば０〜５０℃であり、１０〜３０℃が好ましい。過酸化水素を加えて混合する際、混合時間は、例えば１秒〜１時間であり、２秒〜３０分が好ましい。 When adding and mixing hydrogen peroxide, the temperature of a reaction mixture is 0-50 degreeC, for example, and 10-30 degreeC is preferable. When mixing by adding hydrogen peroxide, the mixing time is, for example, 1 second to 1 hour, and preferably 2 seconds to 30 minutes.
前記ポリマーと前記酵素と前記ペルオキシダーゼとを混合する際、および過酸化水素を加えて混合する際、用いられる溶媒は、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液等が挙げられる。 Examples of the solvent used when mixing the polymer, the enzyme, and the peroxidase, and adding hydrogen peroxide for mixing include a phosphate buffer, an acetate buffer, and a TRIS buffer.
本発明の製造方法において、前記架橋触媒がラッカーゼまたはチロシナーゼの場合、フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素とを、前記架橋触媒の存在下に反応させる工程は、前記架橋触媒と共に酸素を用いる。この場合、前記反応させる工程は、フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素と、ラッカーゼまたはチロシナーゼを、酸素（例えば、空気）存在下、溶媒中で攪拌して混合することにより行うことができる。この際、前記ポリマーのフェノール基どうしの酸化カップリングが起こる。その結果、前記ポリマー間（分子内および分子間）で架橋され、前記ポリマーをゲル化することができる。また、同時に、酵素に一般的に含まれているチロシン残基と、前記ポリマーのフェノール基との間で酸化カップリングが起きる。その結果、得られる酵素固定化ハイドロゲルにおいて、前記酵素は前記ゲルへ共有結合的に固定化されることができる。なお、この架橋反応はフェノール基が選択的に反応するため、固定化された酵素の活性には影響が少ない。また、本発明の製造方法において、前記酵素がラッカーゼまたはチロシナーゼである場合、固定化される酵素がラッカーゼまたはチロシナーゼであり、かつ、架橋触媒もラッカーゼまたはチロシナーゼである。すなわち、ラッカーゼまたはチロシナーゼは、一つで二つの機能を果たすことができる。 In the production method of the present invention, when the cross-linking catalyst is laccase or tyrosinase, the step of reacting a polymer containing a carboxyl group with a phenol group and an enzyme in the presence of the cross-linking catalyst is the cross-linking catalyst. Together with oxygen. In this case, the step of reacting is carried out by mixing a polymer having a carboxyl group introduced with a phenol group, an enzyme, laccase or tyrosinase with stirring in a solvent in the presence of oxygen (for example, air). It can be carried out. At this time, oxidative coupling between the phenol groups of the polymer occurs. As a result, the polymer is cross-linked (intramolecular and intermolecular), and the polymer can be gelled. At the same time, oxidative coupling occurs between a tyrosine residue generally contained in an enzyme and the phenol group of the polymer. As a result, in the resulting enzyme-immobilized hydrogel, the enzyme can be covalently immobilized on the gel. Note that this crosslinking reaction has a small effect on the activity of the immobilized enzyme because the phenol group selectively reacts. In the production method of the present invention, when the enzyme is laccase or tyrosinase, the enzyme to be immobilized is laccase or tyrosinase, and the crosslinking catalyst is also laccase or tyrosinase. That is, a single laccase or tyrosinase can perform two functions.
酵素がラッカーゼまたはチロシナーゼ以外の酵素である場合、前記酵素の量は、（フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーの重量）：（前記酵素の重量）が、例えば、１〜２００：１であり、５〜１５０：１が好ましく、１０〜１００：１がより好ましい。また、前記ラッカーゼまたはチロシナーゼの量は、（フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーの重量）：（前記ラッカーゼまたはチロシナーゼの重量）が、例えば、１〜１５０，０００：１であり、１０〜１００，０００：１が好ましく、１００〜８０，０００：１がより好ましい。 When the enzyme is an enzyme other than laccase or tyrosinase, the amount of the enzyme is (weight of polymer containing a carboxyl group into which a phenol group has been introduced): (weight of the enzyme), for example, 1 to 200: 1. 5 to 150: 1 is preferable, and 10 to 100: 1 is more preferable. The amount of the laccase or tyrosinase is (weight of the polymer containing a carboxyl group having a phenol group introduced) :( weight of the laccase or tyrosinase) is, for example, 1 to 150,000: 1. ˜100,000: 1 is preferable, and 100 to 80,000: 1 is more preferable.
一方、酵素がラッカーゼまたはチロシナーゼである場合、前記ラッカーゼまたはチロシナーゼの量は、（フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーの重量）：（前記ラッカーゼまたはチロシナーゼの重量）が、例えば、１〜５００：１であり、３〜４００：１が好ましく、５〜３００：１がより好ましい。 On the other hand, when the enzyme is laccase or tyrosinase, the amount of the laccase or tyrosinase is (weight of polymer having a carboxyl group introduced with a phenol group): (weight of the laccase or tyrosinase), for example, 1 to 500: 1, preferably 3 to 400: 1, more preferably 5 to 300: 1.
前記ポリマーと前記酵素と前記ラッカーゼまたはチロシナーゼとを空気（酸素）存在下で混合する際、温度は、例えば０〜５０℃であり、１０〜４０℃が好ましい。前記ポリマーと前記酵素と前記ラッカーゼまたはチロシナーゼとを空気（酸素）存在下で混合する際、混合時間は、例えば１時間〜５日であり、３時間〜２日が好ましい。「前記酸素存在下」としては、例えば空気存在下、酸素存在下が挙げられ、空気存在下が好ましい。 When the polymer, the enzyme, and the laccase or tyrosinase are mixed in the presence of air (oxygen), the temperature is, for example, 0 to 50 ° C, and preferably 10 to 40 ° C. When the polymer, the enzyme, and the laccase or tyrosinase are mixed in the presence of air (oxygen), the mixing time is, for example, 1 hour to 5 days, and preferably 3 hours to 2 days. Examples of the “in the presence of oxygen” include the presence of air and the presence of oxygen, and the presence of air is preferred.
前記ポリマーと前記酵素と前記ラッカーゼまたはチロシナーゼとを空気（酸素）存在下で混合する際、用いられる溶媒は、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液等が挙げられる。 Examples of the solvent used when mixing the polymer, the enzyme, and the laccase or tyrosinase in the presence of air (oxygen) include a phosphate buffer, an acetate buffer, and a TRIS buffer.
本発明の製造方法においては、酵素固定化ハイドロゲルを製造するために、前記ポリマーと酵素との共有結合形成に、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼという触媒を用いている。そのため、本発明の製造方法においては、前記触媒による選択的な固定化が可能である。また、前記ポリマーと酵素との共有結合形成に、少量のペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼ（酵素）を用いているため、固定化される酵素の触媒活性には影響を及ぼさない。さらに、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼを用いる架橋反応は穏和かつ選択的（フェノール基のみと反応）であるため、前記ポリマーと酵素との共有結合形成時に、固定化される酵素の活性低下を抑制することができる。さらに、本発明の製造方法によれば、前記ポリマーのゲル中に共有結合を介して酵素が固定されるため、得られる酵素固定化ハイドロゲルから、酵素が漏出することを抑制することができる。 In the production method of the present invention, in order to produce an enzyme-immobilized hydrogel, a catalyst called peroxidase, laccase, or tyrosinase is used to form a covalent bond between the polymer and the enzyme. Therefore, in the production method of the present invention, selective immobilization with the catalyst is possible. Further, since a small amount of peroxidase, laccase or tyrosinase (enzyme) is used for the covalent bond formation between the polymer and the enzyme, the catalytic activity of the immobilized enzyme is not affected. Furthermore, since the cross-linking reaction using peroxidase, laccase or tyrosinase is mild and selective (reacts only with phenol group), it suppresses the decrease in the activity of the immobilized enzyme during the covalent bond formation between the polymer and the enzyme. Can do. Furthermore, according to the production method of the present invention, since the enzyme is immobilized through a covalent bond in the polymer gel, the enzyme can be prevented from leaking out from the obtained enzyme-immobilized hydrogel.
本発明の製造方法により得られる酵素固定化ハイドロゲルは、繰り返し使用しても酵素活性が低下しない。また、この酵素固定化ハイドロゲルは、酵素活性が安定的に持続する。具体的には、水溶液中の酵素はその活性が短期間で低下することが知られているが、この酵素固定化ハイドロゲルは、酵素活性が短期間ではほとんど低下しない。 Even if the enzyme-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention is used repeatedly, the enzyme activity does not decrease. Moreover, this enzyme-immobilized hydrogel stably maintains the enzyme activity. Specifically, it is known that the activity of an enzyme in an aqueous solution decreases in a short period of time. However, in this enzyme-immobilized hydrogel, the enzyme activity hardly decreases in a short period of time.
また、本発明は、フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素とを、フェノール基どうしを結合させて前記ポリマーを架橋させる触媒の存在下に反応させ、前記ポリマーを架橋させると共に前記酵素を前記ポリマーに固定化させる工程を含み、前記触媒は、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼであり、前記触媒がペルオキシダーゼの場合、前記触媒と共に過酸化水素を用い、前記触媒がラッカーゼまたはチロシナーゼの場合、前記触媒と共に酸素を用いる製造方法により得られた酵素を固定化したハイドロゲルである。 The present invention also includes a polymer having a carboxyl group introduced with a phenol group and an enzyme in the presence of a catalyst that bonds the phenol groups together to crosslink the polymer to crosslink the polymer. Immobilizing the enzyme to the polymer, wherein the catalyst is peroxidase, laccase or tyrosinase, and when the catalyst is peroxidase, hydrogen peroxide is used together with the catalyst, and when the catalyst is laccase or tyrosinase, It is a hydrogel which fixed the enzyme obtained by the manufacturing method using oxygen with the said catalyst.
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
γ−ＰＧＡ：ポリ（γ−グルタミン酸）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
ＨＲＰ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
ＣＡＢ：Bovine erythrocytes由来のcarbonic anhydrase
ｐＮＰＡ：ｐ−ニトロフェニルアセテート
ｐＮＰＰ：プロピオン酸ｐ−ニトロフェニル
リパーゼ：Amano Lipase AK from Pseudomonas fluorescens
アミラーゼ：α-Amylase type VI-B from porcine pancreas（シグマ）
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by the following examples.
γ-PGA: poly (γ-glutamic acid)
DMSO: dimethyl sulfoxide EDC: 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide NHS: N-hydroxysuccinimide HRP: horseradish peroxidase CAB: carbonic anhydrase from Bovine erythrocytes
pNPA: p-nitrophenyl acetate pNPP: p-nitrophenyl propionate lipase: Amano Lipase AK from Pseudomonas fluorescens
Amylase: α-Amylase type VI-B from porcine pancreas (Sigma)
本明細書において、測定機器は以下の機器を用いた。
1Ｈ−ＮＭＲ：ブルッカー製、商品名：ＤＰＸ ４００
ＵＶ：ＨＩＴＡＣＨＩ分光光度計Ｕ-２８１０
蛍光吸光プレートリーダー：ＢＩＯ-ＴＥＫ社製ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ−ＳＩＡＦＲ−４型
In this specification, the following devices were used as measuring devices.
1 H-NMR: manufactured by Bruker, trade name: DPX 400
UV: HITACHI spectrophotometer U-2810
Fluorescence absorption plate reader: SynergyHT-SIAFR-4 manufactured by BIO-TEK
［参考例１］
１３ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の製造
無水ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）にγ−ＰＧＡ（５０ｋＤａ）（１．６２５ｇ、１２．５ユニットｍｍｏｌ）を溶かし、そこへ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）（７１２．５ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（５１０ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）を添加して、３時間、室温で攪拌した。次いで、その混合物へチラミン（３１５ｍｇ、１．８７５ｍｍｏｌ、ポリマーに対して１５ｍｏｌ％）を加え、室温で一晩攪拌した。前記混合物を大過剰のエタノール中へ滴下し、生じた沈殿物を遠心分離により単離した。得られた沈殿物にＮａＨＣＯ3（１．０５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を添加し、水に溶解させた。得られた溶液に陽イオン交換樹脂を加えて室温で６時間攪拌した。前記溶液から陽イオン交換樹脂を除いた後、その溶液を２日間脱イオン水中で透析し（ｃｕｔ−ｏｆｆ２０００）、次いで凍結乾燥した。ポリ（γ−グルタミン酸）へのチラミンの導入率を、得られた生成物の1Ｈ−ＮＭＲにより求めた。1Ｈ−ＮＭＲを図１に示す。ポリマーに対して１５ｍｏｌ％のチラミン仕込み量に対し、生成物には１３ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基が導入されていた。
[Reference Example 1]
Production of poly (γ-glutamic acid) into which 13 mol% of tyramine-derived phenol group was introduced γ-PGA (50 kDa) (1.625 g, 12.5 units mmol) was dissolved in anhydrous DMSO (50 mL), and 1- Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC) (712.5 mg, 3.75 mmol) and N-hydroxysuccinimide (NHS) (510 mg, 3.75 mmol) were added and 3 hours. Stir at room temperature. Then, tyramine (315 mg, 1.875 mmol, 15 mol% based on polymer) was added to the mixture and stirred overnight at room temperature. The mixture was dropped into a large excess of ethanol and the resulting precipitate was isolated by centrifugation. NaHCO 3 (1.05 g, 12.5 mmol) was added to the resulting precipitate and dissolved in water. A cation exchange resin was added to the resulting solution and stirred at room temperature for 6 hours. After removing the cation exchange resin from the solution, the solution was dialyzed in deionized water for 2 days (cut-off 2000) and then lyophilized. The introduction rate of tyramine into poly (γ-glutamic acid) was determined by 1 H-NMR of the obtained product. 1 H-NMR is shown in FIG. 13 mol% of tyramine-derived phenol groups were introduced into the product with respect to 15 mol% of the tyramine charge relative to the polymer.
［参考例２］
９ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の製造
ＥＤＣ（７１２．５ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（５１０ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）およびチラミン（３１５ｍｇ、１．８７５ｍｍｏｌ、ポリマーに対して１５ｍｏｌ％）の代わりに、ＥＤＣ（４７５ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（３４０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）およびチラミン（２１０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ、ポリマーに対して１０ｍｏｌ％）を用いた以外は、参考例１と同様にして行った。得られた生成物には９ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基が導入されていた。
[Reference Example 2]
Preparation of poly (γ-glutamic acid) with 9 mol% of tyramine-derived phenol group introduced EDC (712.5 mg, 3.75 mmol), NHS (510 mg, 3.75 mmol) and tyramine (315 mg, 1.875 mmol, Reference Example, except that EDC (475 mg, 2.50 mmol), NHS (340 mg, 2.50 mmol) and tyramine (210 mg, 1.25 mmol, 10 mol% relative to polymer) were used instead of 15 mol%) 1 was performed. 9 mol% of a phenol group derived from tyramine was introduced into the obtained product.
［参考例３］
４ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の製造
ＥＤＣ（７１２．５ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（５１０ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）およびチラミン（３１５ｍｇ、１．８７５ｍｍｏｌ、ポリマーに対して１５ｍｏｌ％）の代わりに、ＥＤＣ（２３７．５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（１７０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）およびチラミン（１０５ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ、ポリマーに対して５ｍｏｌ％）を用いた以外は、参考例１と同様にして行った。得られた生成物には４ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基が導入されていた。
[Reference Example 3]
Production of poly (γ-glutamic acid) by introducing 4 mol% of tyramine-derived phenol group EDC (712.5 mg, 3.75 mmol), NHS (510 mg, 3.75 mmol) and tyramine (315 mg, 1.875 mmol) Except that EDC (237.5 mg, 1.25 mmol), NHS (170 mg, 1.25 mmol) and tyramine (105 mg, 0.625 mmol, 5 mol% relative to polymer) were used instead of 15 mol%). The same operation as in Reference Example 1 was performed. In the obtained product, 4 mol% of a tyramine-derived phenol group was introduced.
［参考例４］
１ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の製造
ＥＤＣ（７１２．５ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（５１０ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）およびチラミン（３１５ｍｇ、１．８７５ｍｍｏｌ、ポリマーに対して１５ｍｏｌ％）の代わりに、ＥＤＣ（１４２．５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（１０２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびチラミン（６３ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、ポリマーに対して３ｍｏｌ％）を用いた以外は、参考例１と同様にして行った。得られた生成物には１ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基が導入されていた。
[Reference Example 4]
Preparation of poly (γ-glutamic acid) with 1 mol% of tyramine-derived phenol group introduced EDC (712.5 mg, 3.75 mmol), NHS (510 mg, 3.75 mmol) and tyramine (315 mg, 1.875 mmol, Instead of EDC (142.5 mg, 0.75 mmol), NHS (102 mg, 0.75 mmol) and tyramine (63 mg, 0.375 mmol, 3 mol% relative to polymer) instead of 15 mol%) The same operation as in Reference Example 1 was performed. In the obtained product, 1 mol% of a phenol group derived from tyramine was introduced.
［参考例５］
１５ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリアクリル酸の製造
無水ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）にポリアクリル酸（分子量：２５，０００）（３８０ｍｇ、５．０ユニットｍｍｏｌ）を溶かし、そこへ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）（２８７．６ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（１７２．５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を添加して、３時間、室温で攪拌した。次いで、その混合物へチラミン（１０２．８ｍｇ、０．７５０ｍｍｏｌ、ポリマーに対して１５ｍｏｌ％）を加え、室温で一晩攪拌した。前記混合物を大過剰のアセトン中へ滴下し、生じた沈殿物を遠心分離により単離した。得られた沈殿物にＮａＨＣＯ3（４４０ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）を添加し、水に溶解させた。得られた溶液に陽イオン交換樹脂を加えて室温で６時間攪拌した。前記溶液から陽イオン交換樹脂を除いた後、その溶液を２日間脱イオン水中で透析し（ｃｕｔ−ｏｆｆ２０００）、次いで凍結乾燥した。ポリアクリル酸へのチラミンの導入率を、得られた生成物の1Ｈ−ＮＭＲにより求めた。ポリマーに対して１５ｍｏｌ％のチラミン仕込み量に対し、生成物には１５ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基が導入されていた。
[Reference Example 5]
Production of polyacrylic acid having a phenol group derived from 15 mol% tyramine Polyacrylic acid (molecular weight: 25,000) (380 mg, 5.0 units mmol) was dissolved in anhydrous DMSO (50 mL), and 1-ethyl was dissolved therein. Add 3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC) (287.6 mg, 1.50 mmol) and N-hydroxysuccinimide (NHS) (172.5 mg, 1.50 mmol) for 3 hours. And stirred at room temperature. Then, tyramine (102.8 mg, 0.750 mmol, 15 mol% based on polymer) was added to the mixture, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The mixture was dropped into a large excess of acetone and the resulting precipitate was isolated by centrifugation. NaHCO 3 (440 mg, 5.0 mmol) was added to the resulting precipitate and dissolved in water. A cation exchange resin was added to the resulting solution and stirred at room temperature for 6 hours. After removing the cation exchange resin from the solution, the solution was dialyzed in deionized water for 2 days (cut-off 2000) and then lyophilized. The rate of introduction of tyramine into polyacrylic acid was determined by 1 H-NMR of the obtained product. 15 mol% of the tyramine-derived phenol group was introduced into the product with respect to 15 mol% of the tyramine charge relative to the polymer.
［実施例１］
（１）ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの製造
参考例１で得られた１３ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の溶液（３重量％、５０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、ＨＲＰ溶液（１０ユニット／ｍＬ（１００ユニット／ｍｇ）、１．２５μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、およびＣＡＢ溶液（８０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））を混合し、その混合物へ過酸化水素水（１．５重量％、１．２５μＬ）を滴下して、室温で静置した。析出したゲルを単離し、そのゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中に室温で一晩浸漬して、ゲルを洗浄して、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルを定量的に得た。
[Example 1]
(1) Production of CAB-immobilized hydrogel A solution of poly (γ-glutamic acid) (3 wt%, 50 μL, solvent: phosphate buffer) into which 13 mol% of the tyramine-derived phenol group obtained in Reference Example 1 was introduced (0.1 M, pH 7.4)), HRP solution (10 units / mL (100 units / mg), 1.25 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)), and CAB solution ( 80 mg / mL, 1.0 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)) is mixed, and hydrogen peroxide solution (1.5 wt%, 1.25 μL) is added dropwise to the mixture. And left at room temperature. The precipitated gel was isolated, and the gel was immersed in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) overnight at room temperature, and the gel was washed to quantitatively obtain a CAB-immobilized hydrogel. .
（２）ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの保存性評価
ＣＡＢを触媒としてｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）は加水分解され、その生成物が４００ｎｍに吸収を有することを利用して、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの酵素活性の保存性を評価した。すなわち、ゲル内に固定されたＣＡＢの量が多くなるほど、生成物に由来する吸光度は大きくなる。（１）で得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に添加し、５分後にその混合物の４００ｎｍにおける吸光度を測定した。
(2) Preservability evaluation of CAB-immobilized hydrogel Using CAB as a catalyst, p-nitrophenyl acetate (pNPA) is hydrolyzed and the product has absorption at 400 nm. The preservability of enzyme activity was evaluated. That is, the greater the amount of CAB immobilized in the gel, the greater the absorbance derived from the product. The CAB-immobilized hydrogel obtained in (1) (all the amount obtained in (1)) and pNPA in acetonitrile (100 mM, 10 μL) were mixed with phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4, 1 mL). The absorbance at 400 nm of the mixture was measured after 5 minutes.
前記ＣＡＢ固定化ハイドロゲルとしては、１日、２日、３日、４日、５日、６日および７日２５℃で保存後のものを用いた。得られた結果を図２に示す。また、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの代わりに、１日、２日、３日、４日、５日、６日および７日２５℃で保存後のＣＡＢ水溶液（１．６ｍｇ／ｍＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、１ｍＬ）を用いた。酵素活性は、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を加えてから１分間の４００ｎｍにおける吸光度を測定し吸光度の傾きから評価した。得られた結果を図２に示す。 As the CAB-immobilized hydrogel, one that was stored at 25 ° C. for 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, and 7 days was used. The obtained results are shown in FIG. Further, instead of the CAB-immobilized hydrogel, an aqueous CAB solution (1.6 mg / mL, solvent: phosphoric acid) after storage at 25 ° C. for 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, and 7 days Buffer (0.1 M, pH 7.4), 1 mL) was used. The enzyme activity was evaluated from the absorbance gradient by measuring the absorbance at 400 nm for 1 minute after adding acetonitrile solution (100 mM, 10 μL) of pNPA. The obtained results are shown in FIG.
図２に示すように、本発明の製造方法により得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲルは、水溶液中のＣＡＢと比較して、酵素活性が著しく安定であることが確認できた。 As shown in FIG. 2, it was confirmed that the CAB-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention has significantly stable enzyme activity as compared with CAB in an aqueous solution.
（３）ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの繰り返し使用評価
（１）で得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に添加し、加水分解生成物を生じさせた。その後、前記ゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に浸漬させてゲルを洗浄した。洗浄したゲルに、再度、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液を、リン酸緩衝液に添加して、加水分解反応生成物を生じさせた。このように前記ゲルを加水分解反応の触媒として用い、次いで洗浄しという操作を繰り返した。この操作の回数と、その際の酵素活性を図３に示す。
(3) Evaluation of repeated use of CAB-immobilized hydrogel CAB-immobilized hydrogel obtained in (1) (all amounts obtained in (1)) and pNPA in acetonitrile (100 mM, 10 μL) were treated with phosphoric acid. Add to buffer (0.1 M, pH 7.4, 1 mL) to give the hydrolysis product. Thereafter, the gel was washed by immersing the gel in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4). To the washed gel, again, an acetonitrile solution of pNPA was added to the phosphate buffer to generate a hydrolysis reaction product. Thus, the operation of using the gel as a catalyst for the hydrolysis reaction and then washing was repeated. The number of operations and the enzyme activity at that time are shown in FIG.
図３に示すように、本発明の製造方法により得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲルは、１０回程度繰り返し使用しても、その酵素活性の減少はわずかであることが確認できた。 As shown in FIG. 3, it was confirmed that the CAB-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention had a slight decrease in enzyme activity even after repeated use about 10 times.
（４）ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの温度安定性評価
各温度で１０分間加熱後、室温まで冷却した、（１）で得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に添加し、５分後にその混合物の４００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果を図４に示す。また、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの代わりに、各温度で１０分間加熱後、室温まで冷却したＣＡＢ水溶液（１．６ｍｇ／ｍＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、１ｍL）を用いて、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を加えてから１分間の４００ｎｍにおける吸光度を測定し吸光度の傾きから活性を評価した。得られた結果を図４に示す。
(4) Temperature stability evaluation of CAB-immobilized hydrogel After heating at each temperature for 10 minutes, the CAB-immobilized hydrogel obtained in (1) (all amounts obtained in (1)) cooled to room temperature and PNPA in acetonitrile (100 mM, 10 μL) was added to phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4, 1 mL) and the absorbance at 400 nm of the mixture was measured after 5 minutes. The obtained results are shown in FIG. Also, instead of CAB-immobilized hydrogel, an aqueous CAB solution (1.6 mg / mL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4), 1 mL) cooled to room temperature after heating at each temperature for 10 minutes. Was used to measure the absorbance at 400 nm for 1 minute after adding an acetonitrile solution (100 mM, 10 μL) of pNPA, and the activity was evaluated from the slope of the absorbance. The obtained results are shown in FIG.
図４に示すように、本発明の製造方法により得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲルは、高温に対しても比較的安定であることが確認できた。 As shown in FIG. 4, it was confirmed that the CAB-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention is relatively stable even at high temperatures.
［実施例２］
（１）リパーゼ固定化ハイドロゲルの製造
参考例１で得られた１３ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の溶液（３重量％、５０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、ＨＲＰ溶液（１０ユニット／ｍＬ（１００ユニット／ｍｇ）、１．２５μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、およびリパーゼ溶液（８０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））を混合し、その混合物へ過酸化水素水（１．５重量％、１．２５μＬ）を滴下して、室温で静置した。析出したゲルを単離し、そのゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中に室温で一晩浸漬して、ゲルを洗浄して、リパーゼ固定化ハイドロゲルを定量的に得た。
[Example 2]
(1) Production of lipase-immobilized hydrogel Poly (γ-glutamic acid) solution (3 wt%, 50 μL, solvent: phosphate buffer solution) introduced with 13 mol% of tyramine-derived phenol group obtained in Reference Example 1 (0.1 M, pH 7.4)), HRP solution (10 units / mL (100 units / mg), 1.25 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)), and lipase solution ( 80 mg / mL, 1.0 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)) is mixed, and hydrogen peroxide solution (1.5 wt%, 1.25 μL) is added dropwise to the mixture. And left at room temperature. The precipitated gel was isolated, and the gel was immersed in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) overnight at room temperature, and the gel was washed to obtain a lipase-immobilized hydrogel quantitatively. .
（２）リパーゼ固定化ハイドロゲルの繰り返し使用評価
（１）で得られたリパーゼ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、プロピオン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）のアセトニトリル溶液（５０ｍＭ、５μＬ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に添加し、加水分解生成物を生じさせた。加水分解物の生成量はＣＡＢと同様に測定した。その後、前記ゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に浸漬させてゲルを洗浄した。洗浄したゲルに、再度、ｐＮＰＰのアセトニトリル溶液を、リン酸緩衝液に添加して、加水分解反応生成物を生じさせた。このように前記ゲルを加水分解反応の触媒として用い、次いで洗浄しという操作を繰り返した。この操作の回数と、その際の酵素活性を図５に示す。
(2) Evaluation of repeated use of lipase-immobilized hydrogel The lipase-immobilized hydrogel obtained in (1) (all amounts obtained in (1)) and an acetonitrile solution of p-nitrophenyl propionate (pNPP) ( 50 mM, 5 μL) was added to phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4, 1 mL) to give a hydrolysis product. The amount of hydrolyzate produced was measured in the same manner as CAB. Thereafter, the gel was washed by immersing the gel in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4). To the washed gel, an acetonitrile solution of pNPP was again added to the phosphate buffer to generate a hydrolysis reaction product. Thus, the operation of using the gel as a catalyst for the hydrolysis reaction and then washing was repeated. The number of operations and the enzyme activity at that time are shown in FIG.
図５に示すように、本発明の製造方法により得られたリパーゼ固定化ハイドロゲルは、１０回程度繰り返し使用しても、その酵素活性の減少はわずかであることが確認できた。 As shown in FIG. 5, it was confirmed that the lipase-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention had a slight decrease in enzyme activity even after repeated use about 10 times.
（３）リパーゼ固定化ハイドロゲルの温度安定性評価
各温度で１０分間加熱後、室温まで冷却した、（１）で得られたリパーゼ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、ｐＮＰＰのアセトニトリル溶液（５０ｍＭ、５μＬ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に添加し、５分後にその混合物の４００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた結果を図６に示す。また、リパーゼ固定化ハイドロゲルの代わりに、各温度で１０分間加熱後、室温まで冷却したリパーゼ水溶液（１．６ｍｇ／ｍＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、１ｍＬ）を用いて、ｐＮＰＰのアセトニトリル溶液（５０ｍＭ、５μＬ）を加えてから１分間の４００ｎｍにおける吸光度を測定し吸光度の傾きから活性を評価した。得られた結果を図６に示す。
(3) Temperature stability evaluation of lipase-immobilized hydrogel After heating at each temperature for 10 minutes and cooling to room temperature, the lipase-immobilized hydrogel obtained in (1) (all amounts obtained in (1)) and PNPP in acetonitrile (50 mM, 5 μL) was added to phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4, 1 mL), and the absorbance at 400 nm of the mixture was measured after 5 minutes. The obtained result is shown in FIG. Further, instead of the lipase-immobilized hydrogel, a lipase aqueous solution (1.6 mg / mL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4), 1 mL) cooled to room temperature after heating for 10 minutes at each temperature. Was used to measure the absorbance at 400 nm for 1 minute after adding an acetonitrile solution (50 mM, 5 μL) of pNPP, and the activity was evaluated from the slope of the absorbance. The obtained result is shown in FIG.
図６に示すように、本発明の製造方法により得られたリパーゼ固定化ハイドロゲルは、高温に対しても比較的安定であることが確認できた。 As shown in FIG. 6, it was confirmed that the lipase-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention is relatively stable even at high temperatures.
［実施例３］
（１）アミラーゼ固定化ハイドロゲルの製造
参考例１で得られた１３ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の溶液（３重量％、５０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、ＨＲＰ溶液（１０ユニット／ｍＬ（１００ユニット／ｍｇ）、１．２５μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、およびアミラーゼ溶液（８０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））を混合し、その混合物へ過酸化水素水（１．５重量％、１．２５μＬ）を滴下して、室温で静置した。析出したゲルを単離し、そのゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中に室温で一晩浸漬して、ゲルを洗浄して、アミラーゼ固定化ハイドロゲルを定量的に得た。
[Example 3]
(1) Production of amylase-immobilized hydrogel Poly (γ-glutamic acid) solution (3 wt%, 50 μL, solvent: phosphate buffer solution, introduced with 13 mol% of the tyramine-derived phenol group obtained in Reference Example 1 (0.1 M, pH 7.4)), HRP solution (10 units / mL (100 units / mg), 1.25 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)), and amylase solution ( 80 mg / mL, 1.0 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)) is mixed, and hydrogen peroxide solution (1.5 wt%, 1.25 μL) is added dropwise to the mixture. And left at room temperature. The precipitated gel was isolated, and the gel was immersed in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) overnight at room temperature, and the gel was washed to obtain an amylase-immobilized hydrogel quantitatively. .
（２）アミラーゼ固定化ハイドロゲルの酵素活性評価
アミラーゼの活性評価はEnzChek Ultra Amylase Assay Kit (Molecular Probes, USA)を用いて行った。リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１００μＬ）に（１）で得たアミラーゼ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、アミラーゼ基質溶液（２００μｇ／ｍＬ、１００μＬ）を加え、遮光して３０分後、放置した。その後、蛍光吸光プレートリーダーを用いて溶液の蛍光強度を測定した（λex＝５０５ｎｍ，λem＝５１２ｎｍ）。比較のため、アミラーゼ固定化ハイドロゲルを用いずに、前記と同様にして溶液の蛍光強度を測定した。なお、アミラーゼ基質溶液は、酢酸ナトリウム溶液（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）に溶解させたＤＱトウモロコシデンプン（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、モレキュラー・プローブ社製、１ｍｇ／ｍＬ）をリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で５倍に希釈して使用した。
(2) Enzyme activity evaluation of amylase-immobilized hydrogel Amylase activity was evaluated using EnzChek Ultra Amylase Assay Kit (Molecular Probes, USA). Amylase-immobilized hydrogel obtained in (1) in phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4, 100 μL) (all amounts obtained in (1)) and amylase substrate solution (200 μg / mL, 100 μL) After 30 minutes from light shielding, it was allowed to stand. Thereafter, the fluorescence intensity of the solution was measured using a fluorescence absorption plate reader (λ ex = 505 nm, λ em = 512 nm). For comparison, the fluorescence intensity of the solution was measured in the same manner as described above without using the amylase-immobilized hydrogel. As the amylase substrate solution, DQ corn starch (BODIPY (registered trademark) FL conjugate, manufactured by Molecular Probes, 1 mg / mL) dissolved in a sodium acetate solution (50 mM, pH 4.0) was added to a phosphate buffer solution (0 .1M, pH 7.4) diluted 5 times and used.
アミラーゼ固定化ハイドロゲル存在下での溶液の蛍光強度は１２１００であり、アミラーゼ固定化ハイドロゲル不在下での溶液の蛍光強度は６１５０であった。このことより、アミラーゼ固定化ハイドロゲル中のアミラーゼは、酵素活性が有ることが確認できた。 The fluorescence intensity of the solution in the presence of amylase-immobilized hydrogel was 12100, and the fluorescence intensity of the solution in the absence of amylase-immobilized hydrogel was 6150. From this, it was confirmed that the amylase in the amylase-immobilized hydrogel has enzyme activity.
［実施例４］
（１）ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの製造
参考例５で得られた１５ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリアクリル酸の溶液（１０重量％、５０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、ＨＲＰ溶液（１０ユニット／ｍＬ（１００ユニット／ｍｇ）、１．２５μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、およびＣＡＢ溶液（８０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））を混合し、その混合物へ過酸化水素水（１．５重量％、１．２５μＬ）を滴下して、室温で静置した。析出したゲルを単離し、そのゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中に室温で一晩浸漬して、ゲルを洗浄して、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルを定量的に得た。
[Example 4]
(1) Production of CAB-immobilized hydrogel Polyacrylic acid solution (10 wt%, 50 μL, solvent: phosphate buffer solution (0. 0%) introduced with 15 mol% of tyramine-derived phenol group obtained in Reference Example 5. 1M, pH 7.4)), HRP solution (10 units / mL (100 units / mg), 1.25 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)), and CAB solution (80 mg / mL) , 1.0 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)), and hydrogen peroxide solution (1.5 wt%, 1.25 μL) was added dropwise to the mixture at room temperature. Left to stand. The precipitated gel was isolated, and the gel was immersed in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) overnight at room temperature, and the gel was washed to quantitatively obtain a CAB-immobilized hydrogel. .
（２）ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの保存性評価
ＣＡＢを触媒としてｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐＮＰＡ）は加水分解され、その生成物が４００ｎｍに吸収を有することを利用して、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの酵素活性の保存性を評価した。すなわち、ゲル内に固定されたＣＡＢの量が多くなるほど、生成物に由来する吸光度は大きくなる。（１）で得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に添加し、５分後にその混合物の４００ｎｍにおける吸光度を測定した。
(2) Preservability evaluation of CAB-immobilized hydrogel Using CAB as a catalyst, p-nitrophenyl acetate (pNPA) is hydrolyzed and the product has absorption at 400 nm. The preservability of enzyme activity was evaluated. That is, the greater the amount of CAB immobilized in the gel, the greater the absorbance derived from the product. The CAB-immobilized hydrogel obtained in (1) (all the amount obtained in (1)) and pNPA in acetonitrile (100 mM, 10 μL) were mixed with phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4, 1 mL). The absorbance at 400 nm of the mixture was measured after 5 minutes.
前記ＣＡＢ固定化ハイドロゲルとしては、０日および８日２５℃で保存後のものを用いた。得られた結果を図７に示す。また、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの代わりに、０日および８日２５℃で保存後のＣＡＢ水溶液（１．６ｍｇ／ｍＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）、１ｍＬ）を用いて、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を加えてから１分間４００ｎｍにおける吸光度を測定し吸光度の傾きから活性を評価した。得られた結果を図７に示す。 The CAB-immobilized hydrogel used was stored at 25 ° C. for 0 and 8 days. The obtained results are shown in FIG. Also, instead of the CAB-immobilized hydrogel, a CAB aqueous solution (1.6 mg / mL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4), 1 mL) after storage at 25 ° C. for 0 and 8 days was used. Then, after adding an acetonitrile solution (100 mM, 10 μL) of pNPA, the absorbance at 400 nm was measured for 1 minute, and the activity was evaluated from the slope of the absorbance. The obtained results are shown in FIG.
図７に示すように、本発明の製造方法により得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲルは、水溶液中のＣＡＢと比較して、酵素活性が著しく安定であることが確認できた。 As shown in FIG. 7, it was confirmed that the CAB-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention has significantly stable enzyme activity as compared with CAB in an aqueous solution.
（３）ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの繰り返し使用評価
（１）で得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）と、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液（１００ｍＭ、１０μＬ）を、リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に添加し、加水分解生成物を生じさせた。その後、前記ゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）に浸漬させてゲルを洗浄した。洗浄したゲルに、再度、ｐＮＰＡのアセトニトリル溶液を、リン酸緩衝液に添加して、加水分解反応生成物を生じさせた。このように前記ゲルを加水分解反応の触媒として用い、次いで洗浄しという操作を繰り返した。この操作の回数と、その際の酵素活性を図８に示す。
(3) Evaluation of repeated use of CAB-immobilized hydrogel CAB-immobilized hydrogel obtained in (1) (all amounts obtained in (1)) and pNPA in acetonitrile (100 mM, 10 μL) were treated with phosphoric acid. Add to buffer (0.1 M, pH 7.4, 1 mL) to give the hydrolysis product. Thereafter, the gel was washed by immersing the gel in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4). To the washed gel, again, an acetonitrile solution of pNPA was added to the phosphate buffer to generate a hydrolysis reaction product. Thus, the operation of using the gel as a catalyst for the hydrolysis reaction and then washing was repeated. The number of operations and the enzyme activity at that time are shown in FIG.
図８に示すように、本発明の製造方法により得られたＣＡＢ固定化ハイドロゲルは、１０回程度繰り返し使用しても、その酵素活性の減少はわずかであることが確認できた。 As shown in FIG. 8, it was confirmed that the CAB-immobilized hydrogel obtained by the production method of the present invention had a slight decrease in enzyme activity even after repeated use about 10 times.
［実施例５］
ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの製造
参考例２で得られた９ｍｏｌ％のチラミンで修飾されたポリ（γ−グルタミン酸）の溶液（３重量％、５０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、ＨＲＰ溶液（１０ユニット／ｍＬ（１００ユニット／ｍｇ）、１．２５μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、およびＣＡＢ溶液（８０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））を混合し、その混合物へ過酸化水素水（１．５重量％、１．２５μＬ）を添加して、室温で静置した。析出したゲルを単離し、そのゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中に室温で一晩浸漬して、ゲルを洗浄して、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルを定量的に得た。このゲル存在下にｐＮＰＡの加水分解反応が進行したことより、ゲル中のＣＡＢは活性を有していることがわかった。
[Example 5]
Production of CAB-immobilized
［実施例６］
ＣＡＢ固定化ハイドロゲルの製造
参考例３で得られた４ｍｏｌ％のチラミンで修飾されたポリ（γ−グルタミン酸）の溶液（３重量％、５０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、ＨＲＰ溶液（１０ユニット／ｍＬ（１００ユニット／ｍｇ）、１．２５μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））、およびＣＡＢ溶液（８０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））を混合し、その混合物へ過酸化水素水（１．５重量％、１．２５μＬ）を添加して、室温で静置した。析出したゲルを単離し、そのゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中に室温で一晩浸漬して、ゲルを洗浄して、ＣＡＢ固定化ハイドロゲルを定量的に得た。このゲル存在下にｐＮＰＡの加水分解反応が進行したことより、ゲル中のＣＡＢは活性を有していることがわかった。
[Example 6]
Production of CAB-immobilized
［実施例７］
（１）ＨＲＰ固定化ハイドロゲルの製造
参考例１で得られた１３ｍｏｌ％のチラミン由来のフェノール基を導入した、ポリ（γ−グルタミン酸）の溶液（３重量％、５０μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））およびＨＲＰ溶液（１０００ユニット／ｍＬ（１００ユニット／ｍｇ）、１．２５μＬ、溶媒：リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４））を混合し、その混合物へ過酸化水素水（１．５重量％、１．２５μＬ）を滴下して、室温で静置した。析出したゲルを単離し、そのゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中に室温で一晩浸漬して、ゲルを洗浄して、ＨＲＰ固定化ハイドロゲルを定量的に得た。
[Example 7]
(1) Production of HRP-immobilized hydrogel Poly (γ-glutamic acid) solution (3 wt%, 50 μL, solvent: phosphate buffer solution) introduced with 13 mol% of tyramine-derived phenol group obtained in Reference Example 1 (0.1 M, pH 7.4)) and HRP solution (1000 units / mL (100 units / mg), 1.25 μL, solvent: phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4)) Hydrogen peroxide solution (1.5 wt%, 1.25 μL) was added dropwise to the mixture and allowed to stand at room temperature. The precipitated gel was isolated, and the gel was immersed in a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4) overnight at room temperature, and the gel was washed to quantitatively obtain an HRP-immobilized hydrogel. .
（２）ＨＲＰ固定化ハイドロゲルの酵素活性評価
（１）で得たＨＲＰ固定化ハイドロゲル（（１）で得られた量全て）をグアイアコール水溶液（１８ｍＭ、１ｍＬ）に入れ、続いて過酸化水素（１．５重量％、５μＬ）を加え、５分後に４７０ｎｍにおける吸光度を測定して酵素反応の生成物の量を測定した。吸光度が１．１であったことから酵素活性があることがわかった。また、この反応によりゲルが茶色に呈色し、酵素反応により生じた化合物がゲル内にトラップされることがわかった。次いで、ＨＲＰ固定化ゲルをリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）で洗浄した。このゲルにグアイアコール水溶液（１８ｍＭ、１ｍＬ）と過酸化水素（１．５重量％、５μＬ）を加え、５分後に４７０ｍｎにおける吸光度を測定して酵素反応の生成物の量を測定したところ、吸光度が０．４となり、また、ゲルの呈色が強くなったことから、２回目の測定においても酵素反応が進行していることがわかった。このことより、ＨＲＰ固定化ハイドロゲル中のＨＲＰは、繰り返し使用後も酵素活性があることが確認できた。
(2) Evaluation of enzyme activity of HRP-immobilized hydrogel The HRP-immobilized hydrogel obtained in (1) (all the amount obtained in (1)) was placed in an aqueous guaiacol solution (18 mM, 1 mL), followed by hydrogen peroxide. (1.5 wt%, 5 μL) was added, and after 5 minutes, the absorbance at 470 nm was measured to determine the amount of the product of the enzyme reaction. The absorbance was 1.1, indicating that there was enzyme activity. Moreover, it turned out that a gel turns brown by this reaction and the compound produced by the enzyme reaction is trapped in the gel. Next, the HRP-immobilized gel was washed with a phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4). Guaiacol aqueous solution (18 mM, 1 mL) and hydrogen peroxide (1.5 wt%, 5 μL) were added to this gel, and after 5 minutes, the absorbance at 470 mn was measured to determine the amount of the product of the enzyme reaction. It became 0.4, and since the coloring of the gel became strong, it was found that the enzyme reaction was proceeding in the second measurement. From this, it was confirmed that the HRP in the HRP-immobilized hydrogel has enzyme activity even after repeated use.
本発明の方法により得られた酵素固定化ハイドロゲルは、固定化酵素やバイオセンサ等への利用も期待される。 The enzyme-immobilized hydrogel obtained by the method of the present invention is expected to be used for immobilized enzymes, biosensors, and the like.
Claims (5)
フェノール基を導入した、カルボキシル基を含有するポリマーと、酵素とを、フェノール基どうしを結合させて架橋させる架橋触媒の存在下に反応させ、前記ポリマーを架橋させると共に前記酵素を前記ポリマーに固定化させる工程を含み、
前記架橋触媒は、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼであり、
前記架橋触媒がペルオキシダーゼの場合、前記架橋触媒と共に過酸化水素を用い、
前記架橋触媒がラッカーゼまたはチロシナーゼの場合、前記架橋触媒と共に酸素を用いる製造方法。 A production method for obtaining a hydrogel having an enzyme immobilized thereon,
A polymer containing a carboxyl group containing a phenol group and an enzyme are reacted in the presence of a crosslinking catalyst that bonds the phenol groups together to crosslink, thereby crosslinking the polymer and immobilizing the enzyme on the polymer. Including the step of
The cross-linking catalyst is peroxidase, laccase or tyrosinase;
When the crosslinking catalyst is peroxidase, hydrogen peroxide is used together with the crosslinking catalyst,
A production method using oxygen together with the crosslinking catalyst when the crosslinking catalyst is laccase or tyrosinase.
ただし、前記架橋触媒は、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼまたはチロシナーゼであり、
前記架橋触媒がペルオキシダーゼの場合、前記架橋触媒と共に過酸化水素を用い、
前記架橋触媒がラッカーゼまたはチロシナーゼの場合、前記架橋触媒と共に酸素を用いる酵素を固定化したハイドロゲル。 A polymer containing a carboxyl group containing a phenol group and an enzyme are reacted in the presence of a crosslinking catalyst that bonds the phenol groups together to crosslink, thereby crosslinking the polymer and immobilizing the enzyme on the polymer. A hydrogel on which an enzyme obtained by immobilization is immobilized,
However, the crosslinking catalyst is peroxidase, laccase or tyrosinase,
When the crosslinking catalyst is peroxidase, hydrogen peroxide is used together with the crosslinking catalyst,
When the cross-linking catalyst is laccase or tyrosinase, a hydrogel in which an enzyme using oxygen is immobilized together with the cross-linking catalyst.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010193106A JP2012050343A (en) | 2010-08-31 | 2010-08-31 | Method for producing enzyme-immobilized hydrogel |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010193106A JP2012050343A (en) | 2010-08-31 | 2010-08-31 | Method for producing enzyme-immobilized hydrogel |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012050343A true JP2012050343A (en) | 2012-03-15 |
Family
ID=45904513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010193106A Withdrawn JP2012050343A (en) | 2010-08-31 | 2010-08-31 | Method for producing enzyme-immobilized hydrogel |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2012050343A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150196584A1 (en) * | 2013-11-08 | 2015-07-16 | The Johns Hopkins University | Oxygen-controllable and hypoxia-inducible hydrogels |
| WO2016063824A1 (en) * | 2014-10-20 | 2016-04-28 | 国立大学法人鹿児島大学 | Preparation for forming emboli, and microcatheter |
-
2010
- 2010-08-31 JP JP2010193106A patent/JP2012050343A/en not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150196584A1 (en) * | 2013-11-08 | 2015-07-16 | The Johns Hopkins University | Oxygen-controllable and hypoxia-inducible hydrogels |
| EP3065792A4 (en) * | 2013-11-08 | 2017-06-21 | The Johns Hopkins University | Oxygen-controllable and hypoxia-inducible hydrogels |
| US10987375B2 (en) | 2013-11-08 | 2021-04-27 | The Johns Hopkins University | Methods of inducing vascular morphogensis |
| WO2016063824A1 (en) * | 2014-10-20 | 2016-04-28 | 国立大学法人鹿児島大学 | Preparation for forming emboli, and microcatheter |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zahirinejad et al. | Nano-organic supports for enzyme immobilization: scopes and perspectives | |
| Grigoras | Catalase immobilization—A review | |
| Alatawi et al. | Amino functionalization of carboxymethyl cellulose for efficient immobilization of urease | |
| Li et al. | Preparation of immobilized lipase by modified polyacrylonitrile hollow membrane using nitrile-click chemistry | |
| Asmat et al. | A robust nanobiocatalyst based on high performance lipase immobilized to novel synthesised poly (o-toluidine) functionalized magnetic nanocomposite: Sterling stability and application | |
| Zou et al. | Enhancing bio-catalytic activity and stability of lipase nanogel by functional ionic liquids modification | |
| Rojas-Mercado et al. | Encapsulation and immobilization of ficin extract in electrospun polymeric nanofibers | |
| Zakharova et al. | Horseradish peroxidase: modulation of properties by chemical modification of protein and heme | |
| Prodanovic et al. | Tyramine modified alginates via periodate oxidation for peroxidase induced hydrogel formation and immobilization | |
| Cao et al. | PEI-crosslinked lipase on the surface of magnetic microspheres and its characteristics | |
| Monier et al. | Evaluation of the potential of polymeric carriers based on photo-crosslinkable chitosan in the formulation of lipase from Candida rugosa immobilization | |
| Cejudo-Sanches et al. | High stabilization of immobilized Rhizomucor miehei lipase by additional coating with hydrophilic crosslinked polymers: Poly-allylamine/Aldehyde–dextran | |
| Chen et al. | DNA directed immobilization of horseradish peroxidase on phase-transitioned lysozyme modified TiO2 for efficient degradation of phenol in wastewater | |
| Riccardi et al. | Nanoarmoring of enzymes by interlocking in cellulose fibers with poly (acrylic acid) | |
| Xia et al. | Surface modification of Fe3O4@ SiO2 magnetic nanoparticles for immobilization of lipase | |
| Liou et al. | Catalase immobilized in polypeptide/silica nanocomposites via emulsion and biomineralization with improved activities | |
| JP2012050343A (en) | Method for producing enzyme-immobilized hydrogel | |
| AU6307799A (en) | Protein-containing hydrogels | |
| Moriyama et al. | Enzymatic preparation of streptavidin-immobilized hydrogel using a phenolated linear poly (ethylene glycol) | |
| Tang et al. | Construction of porous chitosan macrospheres via dual pore-forming strategy as host for alkaline protease immobilization with high activity and stability | |
| Nagayama et al. | Catalytic properties of enzymes modified with temperature‐responsive polymer chains | |
| Vardar et al. | Synthesis of glucose oxidase-PEG aldehyde conjugates and improvement of enzymatic stability | |
| Tapdiqov | Electrostatic and hydrogen bond immobilization of trypsine onto pH-sensitive N-vinylpyrrolidone and 4-vinylpyridine radical co-grafted chitosan based on hydrogel | |
| Liu et al. | Polyethylenimine‐Grafted Silica Nanoparticles Facilitate Enzymatic Carbon Dioxide Conversion | |
| Ton et al. | Hematin-conjugated gelatin as an effective catalyst for preparing biological hydrogels |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20131105 |