JP2012041271A - Composition having effect of inhibiting thrombogenesis - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、血栓形成を抑制する作用を有する組成物に関し、より詳しくは炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物に関する。 The present invention relates to a composition having an action of inhibiting thrombus formation, and more particularly to a composition having an action of inhibiting thrombus formation, which contains a compound that suppresses the function of inflammatory cytokines.
生体内において血栓形成の原因となる多細胞プロセスは、個々の血小板及びそれらの形態の変化を同定できるほどに十分な高い解像度をもって直接可視化できる技術が無かったため、未だ十分に理解されていない。部検又は吸引によって得られた急性冠症候群患者（非特許文献１）の血栓の組織学的解析によって、血栓の発達においては、血小板、白血球、フォン ヴィレブランド因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）及び組織因子が存在していることが明らかになっている（非特許文献２〜３）。しかしながら、血栓塊の正確な性状を得る為の多細胞構造は損なわれており、そして生体内の血栓形成中の血小板の動態についてはほとんど解明されていない。 The multicellular processes responsible for thrombus formation in vivo are not yet fully understood because there was no technique that could directly visualize individual platelets and their morphological changes with high enough resolution to be identified. According to the histological analysis of the thrombus of an acute coronary syndrome patient (Non-patent Document 1) obtained by a section examination or aspiration, in the development of the thrombus, platelets, leukocytes, von Willebrand factor and tissue factor are It is clear that it exists (Non-Patent Documents 2 to 3). However, the multicellular structure for obtaining the exact properties of the thrombus is impaired, and little has been clarified about the dynamics of platelets during thrombus formation in vivo.
また、血栓形成に関しては、二段階説、すなわち、円盤状血小板が高せん断条件下で成長中の血栓に組み込まれている間に、活性化血小板は低せん断条件下で形態を変化させることによって血栓形成を調節するという説が提唱されているが（非特許文献４）、生体内において、円盤状血小板がどのように形成中の血栓に取り込まれるのかは不明である。 In addition, with regard to thrombus formation, there is a two-stage theory: activated platelets change their morphology under low shear conditions while the platelets are incorporated into the growing thrombus under high shear conditions. Although the theory of regulating formation has been proposed (Non-Patent Document 4), it is unclear how discoid platelets are taken into the thrombus that is being formed in vivo.
また、血小板は、炎症、血栓形成、ホメオスタシス及びアテローム発生の間の重要なつながりを示す因子として考えられており（非特許文献５〜６）、炎症は、白血球、内皮細胞、及び血小板の間の相互作用によって特徴づけられている（非特許文献７）。例えば、活性化血小板において炎症性サイトカインの１種であるＩＬ−１βが発現しており（非特許文献８）、ＩＬ−１αもＩＬ−１β同様に血小板において発現していることが報告されている（非特許文献９）。また、ＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡは巨核球の細胞質に存在し、断片化によって放出した血小板自身もＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡを保持しており（非特許文献１０）、炎症反応状態に血小板自体の産生するＩＬ−１βが関与することが推測されている。さらには、ＩＬ−１βの合成を介して炎症シグナルを調節していることも既に示されている（非特許文献１１）。また、炎症性サイトカインの１種であるＩＬ−６は、血小板産生のサイトカインとしても知られており（非特許文献１２）、さらには、血小板血栓が形成された以降に活性化する凝固系において、ＩＬ−６はトロンビンの産生を亢進させることが知られており、かかる産生亢進を介して、血小板の活性化を二次的に促進する事などが示されてきている（非特許文献１３）。 In addition, platelets are considered as factors showing an important link between inflammation, thrombus formation, homeostasis and atherogenesis (Non-Patent Documents 5 to 6), and inflammation is between leukocytes, endothelial cells, and platelets. It is characterized by interaction (Non-patent Document 7). For example, IL-1β, which is a kind of inflammatory cytokine, is expressed in activated platelets (Non-patent Document 8), and it has been reported that IL-1α is also expressed in platelets like IL-1β. (Non-patent document 9). In addition, IL-1β pre-mRNA is present in the cytoplasm of megakaryocytes, and the platelets released by fragmentation also retain IL-1β pre-mRNA (Non-patent Document 10), and the platelets themselves are in an inflammatory reaction state. It is speculated that the produced IL-1β is involved. Furthermore, it has already been shown that inflammatory signals are regulated through the synthesis of IL-1β (Non-patent Document 11). In addition, IL-6, which is a kind of inflammatory cytokine, is also known as a platelet-producing cytokine (Non-patent Document 12). Furthermore, in the coagulation system activated after the formation of platelet thrombus, IL-6 is known to enhance the production of thrombin, and it has been shown that the activation of platelets is secondarily promoted through such enhanced production (Non-patent Document 13).
しかしながら、炎症性サイトカインによるシグナル伝達と血小板が関与する血栓形成との関連の詳細、特に瞬間的な発生を特徴とする円盤状血小板による血小板血栓の形成及び血管内皮細胞への接着に関しては未だ明らかになっていない。 However, details regarding the relationship between signal transduction by inflammatory cytokines and thrombus formation involving platelets, especially regarding platelet thrombus formation and adhesion to vascular endothelial cells, characterized by instantaneous development, are still unclear is not.
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体内における血栓形成の機序を分子レベルで解明し、見出された血栓形成に関与する分子を標的として、臨床的には瞬間的に発症して血管閉塞まで引き起こすような血栓形成を抑制することを可能とする組成物を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and its purpose is to elucidate the mechanism of thrombus formation in vivo at the molecular level and target the molecules involved in thrombus formation as found. The object of the present invention is to provide a composition that can suppress thrombus formation that develops instantaneously and causes vascular occlusion clinically.
本発明者らは、血栓形成の開始から血管閉塞に至る血小板の動態を一細胞レベルで明らかにするため、生体内の血栓形成を評価することができ、ハイスループットな解析が可能な直接可視化手法を独自に開発した。次いで、この手法を用い、生体内における血栓形成の機序を分子レベルで解明すべく鋭意研究を重ねた。その結果、本発明者らは、血栓の誘発及び成長、特に、血小板の取り込み（初期の血管内皮細胞への付着）において、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１），インターロイキン−６（ＩＬ−６）等による炎症性サイトカインシグナルが瞬間的な円盤状血小板血栓の形成に必要不可欠であることを見出した。これら知見に基づき、本発明者らは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物が、血栓形成を抑制するための組成物として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。 In order to clarify the dynamics of platelets from the start of thrombus formation to vascular occlusion at the single cell level, the present inventors can evaluate the thrombus formation in the living body and enable a high-throughput analysis. Developed independently. Then, using this technique, we conducted extensive research to elucidate the mechanism of thrombus formation in vivo at the molecular level. As a result, the present inventors have shown that tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1 (IL-) in the induction and growth of thrombus, particularly platelet uptake (adherence to early vascular endothelial cells). 1) It was found that inflammatory cytokine signals by interleukin-6 (IL-6) and the like are indispensable for instantaneous discoid platelet thrombus formation. Based on these findings, the present inventors have found that a compound that suppresses the function of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1, and IL-6 is useful as a composition for suppressing thrombus formation. The headline and the present invention were completed.
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物。
（２）前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、及びＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも一つの生体分子であることを特徴とする（１）に記載の血栓形成を抑制する作用を有する組成物。
More specifically, the present invention provides the following inventions.
(1) A composition having an action of suppressing thrombus formation, comprising a compound that suppresses the function of inflammatory cytokines.
(2) The inflammatory cytokine is at least one biomolecule selected from the group consisting of TNF-α, IL-1, and IL-6, and suppresses thrombus formation according to (1) The composition which has the effect | action which acts.
これまでの血栓症に対する医薬は、形成された血栓の安定化を阻害するという視点で開発がなされてきたが、本発明の組成物によれば、血栓が形成される段階を抑制する作用、特に円盤状血小板による血小板血栓の形成及び血管内皮細胞への接着を抑制する作用を有する。従って、本発明の組成物は、特に、血栓症を含む血栓形成に起因する疾患に対する予防剤として優れた効果を発揮することが可能である。また、血栓形成を予防するために日常的に摂取する飲食品として、あるいは、研究目的で血栓形成を抑制するための試薬としても、優れた効果を発揮することが可能である。 So far, drugs for thrombosis have been developed from the viewpoint of inhibiting the stabilization of the formed thrombus. According to the composition of the present invention, the action of suppressing the stage of thrombus formation, particularly It has the effect of suppressing platelet thrombus formation and adhesion to vascular endothelial cells by discoid platelets. Therefore, the composition of the present invention can exhibit an excellent effect as a preventive agent for diseases caused by thrombus formation including thrombosis. Moreover, it is possible to exert excellent effects as a food and drink that is taken daily to prevent thrombus formation or as a reagent for suppressing thrombus formation for research purposes.
本発明は、炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物を含有することを特徴とする血栓形成を抑制する作用を有する組成物を提供する。 This invention provides the composition which has the effect | action which suppresses thrombus formation characterized by including the compound which suppresses the function of an inflammatory cytokine.
本発明において、「炎症性サイトカイン」とは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす因子として関与するサイトカインを意味する。本発明において機能を抑制する対象となる炎症性サイトカインとしては、その機能の抑制により、血栓形成を抑制しうるものであれば特に制限はなく、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、及びＩＬ−６が挙げられる。 In the present invention, “inflammatory cytokine” means a cytokine involved as a factor causing various inflammatory symptoms in vivo. Inflammatory cytokines whose functions are to be suppressed in the present invention are not particularly limited as long as thrombus formation can be suppressed by suppressing their functions. For example, TNF-α, IL-1, and IL- 6 is mentioned.
ＴＮＦ−αは、ＮＦ−ｋＢシグナルの制御に働き、炎症シグナルを惹起する因子として知られている（「Ｓａｖｅｓ Ｔａｙ，ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、２０１０年７月８日、４６６巻、２６７−２７２ページ」等参照）。典型的には、ヒトＴＮＦ−αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０００５８５．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５９４．２）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＴＮＦ−αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３８７２１．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０１３６９３．２）で特定される蛋白質（遺伝子）である。 TNF-α is known as a factor that acts on the regulation of the NF-kB signal and induces an inflammatory signal (“Saves Tay, et al, Nature, July 8, 2010, 466, 267-272”). Etc.). Typically, human TNF-α is an ACCESSION No. NP_000585.2 (No. NM_000594.2) is a protein (gene) specified by mouse NF-α, ACCESSION No. It is a protein (gene) specified by NP — 038721.1 (No. NM — 03693.2).
ＩＬ−１は、血小板と炎症とアテローム発生等との関連性を示唆する因子としても知られている（「Ｂｏｉｌａｒｄ Ｅ．，ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１０年１月２９日、３２７巻、５９６５号、５８０−５８３ページ」、「Ｋｕｌｋａｒｎｉ Ｓ Ｅ．，ｅｔ ａｌ、Ｂｌｏｏｄ、２００７年９月１５日、１１０巻、６号、１８７９−１８８６ページ」、「Ｐｉｌｌｉｔｔｅｒｉ Ｄ．，ｅｔ ａｌ、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ、２００７年３月、１８巻、２号、１１９−１２７ページ」、非特許文献８〜１１等参照）。本発明におけるＩＬ−１には、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βが含まれる。また、典型的には、ヒトＩＬ−１αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０００５６６．３（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５７５．３）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＩＬ−１αは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３４６８４．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０１０５５４．４）で特定される蛋白質（遺伝子）である。さらに、典型的には、ヒトＩＬ−１βは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０００５６７．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５７６．２）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＩＬ−１βは、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３２３８７．１（Ｎｏ．ＮＭ＿００８３６１．３）で特定される蛋白質（遺伝子）である。 IL-1 is also known as a factor that suggests a relationship between platelets, inflammation, and atherogenesis (“Boilerd E., et al, Science, Jan. 29, 2010, 327, 5965, 580-583 ”,“ Kulkarni S E., et al, Blood, September 15, 2007, 110, 6, pp. 1879-1886 ”,“ Pilliteri D., et al, Platelets, March 2007. , Vol. 18, No. 2, pp. 119-127 ”, Non-Patent Documents 8 to 11). IL-1 in the present invention includes IL-1α and IL-1β. Typically, human IL-1α is expressed as ACCESSION No. NP_000566.3 (No. NM_000575.3) is a protein (gene) specified by the mouse, IL-1α is an ACCESSION No. It is a protein (gene) specified by NP_03484.2 (No. NM_0105544.4). In addition, human IL-1β is typically ACCESSION No. It is a protein (gene) specified by NP_000567.1 (No. NM_000576.2), and mouse IL-1β is an ACCESSION No. It is a protein (gene) specified by NP_032387.1 (No. NM_008361.3).
また、ＩＬ−６も、炎症性サイトカインとして広く知られており，慢性関節リューマチの増悪、動脈硬化病変を合併する心血管系疾患（特に冠動脈疾患の発症）において、重要な役割を担っている事などが示唆されている（「Ｙｕｄｋｉｎ ＪＳ．，ｅｔ ａｌ、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、２０００年２月、１４８巻、２０９−２１４」、「Ｓｈｅｎｈａｒ−Ｔｓａｒｆａｔｙ Ｓ．，ｅｔ ａｌ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｏｋｅ、２０１０年２月、５巻、１号、１６−２０ページ」等参照）。典型的には、ヒトＩＬ−６は、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０００５９１．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００６００．２）で特定される蛋白質（遺伝子）であり、マウスＩＬ−６は、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿１１２４４５．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０３１１６８．１）で特定される蛋白質（遺伝子）である。 IL-6 is also widely known as an inflammatory cytokine, and plays an important role in the deterioration of rheumatoid arthritis and the cardiovascular disease (particularly the onset of coronary artery disease) associated with arteriosclerotic lesions. ("Yudkin JS., Et al, Atherosclerosis, February 2000, 148, 209-214", "Shenhar-Tsarfaty S., et al, International journal of Stroke, February 2010, Vol. 5, No. 1, pp. 16-20 "). Typically, human IL-6 is expressed in ACCESSION No. NP_000591.1 (No. NM — 06600.2), which is a protein (gene) specified by mouse NP-6, ACCESSION No. It is a protein (gene) specified by NP_1122445.1 (No. NM_031168.1).
しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において機能を抑制する対象となる「炎症性サイトカイン」には、このような天然の変異体も含まれる。 However, the amino acid sequence of a protein can be mutated in nature (ie, non-artificially). Therefore, such “naturally occurring mutants” are also included in “inflammatory cytokines” whose functions are to be suppressed in the present invention.
なお、これらの炎症性サイトカインに関しては、冠動脈のプラーク破裂やびらん（ｅｒｏｓｉｏｎ）などによる冠動脈閉塞の最初の機構において，動脈硬化病変を基盤とする血管平滑筋やマクロファージ産生のサイトカイン（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）として、ＩＬ−６、ＩＬ−１、及びＴＮＦ−αが連動して作用することが示唆され、また、冠動脈疾患患者に対してのカテーテルを介したステント挿入治療後にＩＬ−１βとともにＩＬ−６の血中濃度が上昇することでステント血栓症（金属であるステントを挿入した後の冠動脈の再閉塞）がおきうること（Ｓａｒｄｅｌｌａ Ｇ．，ｅｔ ａｌ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、１１７巻、６号、６５９−６６４ページ）も知られている。 Regarding these inflammatory cytokines, in the initial mechanism of coronary artery occlusion due to coronary plaque rupture or erosion, vascular smooth muscle and macrophage-producing cytokines based on arteriosclerotic lesions (pro-inflammatory cytokines) IL-6, IL-1, and TNF-α are suggested to act in conjunction with each other, and IL-6 together with IL-1β after catheterized stenting treatment for patients with coronary artery disease Stent thrombosis (reocclusion of coronary artery after insertion of metal stent) can occur due to increased blood concentration (Sardella G., et al, Thrombosis Research, 2006, 117, No. 6, Pp. 659-664) are also known
本発明における「炎症性サイトカインの機能の抑制」には、機能の完全な抑制（阻害）および部分的な抑制の双方が含まれる。また、炎症性サイトカインの活性の抑制および発現の抑制の双方が含まれる。炎症性サイトカインの活性の抑制は、炎症性サイトカインを標的とする分子、炎症性サイトカインの受容体を標的とする分子、および炎症性サイトカインのシグナル伝達に関与するその他の蛋白質を標的とする分子、のいずれによって達成されてもよい。また、炎症性サイトカインの発現の抑制は、転写における抑制および翻訳における抑制のいずれによって達成されてもよい。 In the present invention, “suppression of inflammatory cytokine function” includes both complete suppression (inhibition) and partial suppression of function. Also included are both suppression of inflammatory cytokine activity and suppression of expression. Inhibition of the activity of inflammatory cytokines includes molecules targeting inflammatory cytokines, molecules targeting inflammatory cytokine receptors, and molecules targeting other proteins involved in inflammatory cytokine signaling. It may be achieved by either. Moreover, suppression of the expression of inflammatory cytokines may be achieved by either suppression of transcription or suppression of translation.
炎症性サイトカインの機能を抑制するために標的とするＴＮＦ−αの受容体としては、例えば、１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１、ＴＮＦＲ１）が挙げられる。典型的には、ヒトＴＮＦＲ１として、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０５６．１（Ｎｏ．ＮＭ＿００１０６５．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、マウスＴＮＦＲ１としては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３５７３９．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０１１６０９．３）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。 Examples of TNF-α receptors targeted for suppressing the function of inflammatory cytokines include type 1 TNF receptors (TNF-receptor-1, TNFR1). Typically, as TNFR1, ACCESSION No. The protein (gene) specified by NP_001056.1 (No. NM_001065.2) can be mentioned. As mouse TNFR1, ACCESSION No. A protein (gene) specified by NP — 035739.2 (No. NM — 011609.3) can be mentioned.
また、ＩＬ−１の受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＬ−１Ｒ）としては、典型的には、ヒトＩＬ−１Ｒとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０００８６８．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００８７７．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、マウスＩＬ−１Ｒとしては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３２３８８．１（Ｎｏ．ＮＭ＿００８３６２．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。 In addition, as an IL-1 receptor (interleukin 1 receptor, IL-1R), typically as human IL-1R, ACCESSION No. The protein (gene) specified by NP_000868.1 (No. NM_000877.2) is mentioned. As mouse IL-1R, ACCESSION No. Examples thereof include a protein (gene) specified by NP_032388.1 (No. NM_008362.2).
さらに、ＩＬ−６の受容体としては、膜結合型ＩＬ−６受容体（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩＬ−６Ｒ）や可溶性ＩＬ−６受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｓＩＬ−６Ｒ）が挙げられ、典型的には、ヒトＩＬ−６Ｒとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０００５５６．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０００５６５．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられ、マウスＩＬ−６Ｒとしては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０３４６８９．２（Ｎｏ．ＮＭ＿０１０５５９．２）で特定される蛋白質（遺伝子）が挙げられる。 Furthermore, as a receptor of IL-6, a membrane-bound IL-6 receptor (interleukin 6 receptor, IL-6R) and a soluble IL-6 receptor (soluble IL-6 receptor, sIL-6R) can be mentioned, Typically, as human IL-6R, ACCESSION No. The protein (gene) specified by NP_000556.1 (No. NM_000565.2) is mentioned. As mouse IL-6R, ACCESSION No. A protein (gene) specified by NP — 03469.2 (No. NM — 0105599.2) can be mentioned.
しかしながら、蛋白質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。従って、本発明において、炎症性サイトカインの機能を抑制するために標的とする受容体には、このような天然の変異体も含まれる。 However, the amino acid sequence of a protein can be mutated in nature (ie, non-artificially). Therefore, in the present invention, such natural mutants are also included in the receptors targeted for suppressing the function of inflammatory cytokines.
炎症性サイトカインのシグナル伝達に関与するその他の蛋白質としては、ＴＮＦ−αに関しては、例えば、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ又はＡＤＡＭ１７とも称する）が挙げられる。なお、ＴＮＦ−α変換酵素は、膜型蛋白質として産生されるＴＮＦα前駆体をシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）することによって、ＴＮＦαの活性化を誘引する因子として知られている（「Ｂｒｉｌｌ Ａ．，ｅｔ ａｌ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００９年、１０月１日、８４巻、１号、１３７−１４４ページ」、「Ｍｕｒｔｈｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ、Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ＥＧＦＲ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ＴＮＦＲ１ ｄｉｃｔａｔｅｓ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｆｕｌｍｉｎａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（電子版）、２０１０年７月１２日」、「Ｋｉｌｌｏｃｋ ＤＪ．，ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１０年５月１３日、４２８巻、２号、２９３−３０４ページ」、「Ｃｈａｌａｒｉｓ Ａ．，ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、２０１０年２月、１８０３巻、２号、２３４−２４５ページ」等参照）。 Examples of other proteins involved in inflammatory cytokine signaling include TNF-α converting enzyme (also referred to as TACE or ADAM17) with respect to TNF-α. TNF-α converting enzyme is known as a factor that induces the activation of TNFα by shedding the TNFα precursor produced as a membrane protein (“Brill A., et al. , Cardiovascular Research, Oct. 1, 2009, 84, 1 pp. 137-144 ”,“ Murthy A., et al, Ectodomain shaded of EGFR ligands and TNFR1 dictates the hepatitepetics hepatoid. "Journal of Clinical Investigation (electronic version), July 12, 2010", "K illrock DJ., et al, Biochemical Journal, May 13, 2010, 428, 2, 293-304 "," Chalaris A., et al, Biochimica et Biophysica Acta, February 2010, 1803, No. 2, pages 234-245 ").
また、ＩＬ−１に関しては、例えば、ＩＬ−１のシグナル伝達に関与する下流の分子として知られている、ＩＬ−ＲＡｃＰ（ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＹＤ８８（ｍｙｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ ８８）、ＩＲＡＫ４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ４）、ＴＲＡＦ６（ｔｕｍｏｒｅ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ６）が挙げられる（Ｗｅｂｅｒ Ａ．，ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２０１０年１月１９日、１０５巻、３号、ｃｍ１ 参照）。 Regarding IL-1, for example, IL-RAcP (IL-1 receptor accessorin protein), MYD88 (myloid differentiation primary gene 88), which is known as a downstream molecule involved in IL-1 signaling, IRAK4 (interleukin-1 receptor-activated protein kinase 4), TRAF6 (tumor necrosis factor-associated factor 6) are listed (Weber A., et al, Science, May, 10th, May, 10th, 10th, 20th cm1).
また、ＩＬ−６に関しては、例えば、ＩＬ−６のシグナル伝達に関与する下流の分子として知られている、ｇｐ１３０、ＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ３）、ＳＨＰ−２（Ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｇｉｏｎ ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−２）が挙げられる。 Regarding IL-6, for example, gp130, STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3), SHP-2 (Src homology region 2-), which are known as downstream molecules involved in IL-6 signal transduction, are known. containing protein tyrosine phosphatase-2).
本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の１つの態様は、抗体である。本発明における「抗体」は、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラスを含む。「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれ、また、抗体の機能的断片の形態も含む意である。 One embodiment of the “compound that suppresses the function of inflammatory cytokine” in the present invention is an antibody. The “antibody” in the present invention includes all classes and subclasses of immunoglobulins. “Antibody” includes polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and also includes forms of functional fragments of antibodies.
また、本発明の抗体には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および、これら抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体などが挙げられる。 The antibodies of the present invention include chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and functional fragments of these antibodies. Functional fragments of antibodies include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, variable region fragment (Fv), disulfide bond Fv, single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2, diabody, multispecific And the like, and polymers thereof.
本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用低減の観点から、キメラ抗体、ヒト化抗体、あるいはヒト抗体が望ましい。 When the antibody of the present invention is administered to a human as a pharmaceutical, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody is desirable from the viewpoint of reducing side effects.
抗体は、ポリクローナル抗体であれば、抗原（前記炎症性サイトカインなど）で免疫動物を免疫し、その抗血清から、従来の手段（例えば、塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフィーなど）によって、精製して取得することができる。また、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法等によって作製することができる。 If the antibody is a polyclonal antibody, an immunized animal is immunized with an antigen (such as the inflammatory cytokine), and from its antiserum, conventional means (eg, salting out, centrifugation, dialysis, column chromatography, etc.) It can be obtained after purification. Monoclonal antibodies can be prepared by a hybridoma method, a recombinant DNA method, or the like.
キメラ抗体は、例えば、抗原をマウスに免役し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部（可変領域）を切り出して、ヒト骨髄由来の抗体定常部（定常領域）遺伝子と結合し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入して産生させることにより取得することができる（例えば、特開平７−１９４３８４号公報、特許３２３８０４９号公報、米国特許第４８１６３９７号公報、米国特許第４８１６５６７号公報、米国特許第５８０７７１５号公報）。 A chimeric antibody, for example, immunizes an antigen to a mouse, cuts out an antibody variable region (variable region) that binds to the antigen from the mouse monoclonal antibody gene, and binds to an antibody constant region (constant region) gene derived from human bone marrow. This can be obtained by incorporating it into an expression vector and introducing it into a host for production (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-194384, Japanese Patent No. 3238049, US Pat. No. 4,816,397, US Pat. No. 4,816,567). Gazette, U.S. Pat. No. 5,807,715).
ヒト化抗体は、例えば、非ヒト由来の抗体の抗原結合部位（ＣＤＲ）の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子に移植（ＣＤＲグラフティング）することにより作製することができる（例えば、特許２９１２６１８号、特許２８２８３４０号公報、特許３０６８５０７号公報、欧州特許２３９４００号公報、欧州特許１２５０２３号公報、国際公開９０／０７８６１号公報、国際公開９６／０２５７６号公報参照）。 A humanized antibody can be produced, for example, by grafting (CDR grafting) a gene sequence of an antigen-binding site (CDR) of a non-human-derived antibody to a human antibody gene (for example, Patent No. 292618, Patent No. 28828340). No. 3068507, European Patent 239400, European Patent 125023, International Publication No. 90/07861, International Publication No. 96/02576).
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を利用して作製することができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５−２５８（１９９２）、Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １３：６５−９３（１９９５）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １５：１４６−１５６（１９９７）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７：７２２−７２７（２０００）、特開平１０−１４６１９４号公報、特開平１０−１５５４９２号公報、特許２９３８５６９号公報、特開平１１−２０６３８７号公報、特表平８−５０９６１２号公報、特表平１１−５０５１０７号公報）。 Human antibodies can be made, for example, using transgenic animals (eg, mice) that are capable of producing a repertoire of human antibodies (eg, Nature, 362: 255-258 (1992), Inter. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995), J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991), Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 722-727 (2000), JP-A-10-146194, JP-A-10-155492, JP-A-2935569, JP-A-11-206387, JP-A-8-509612, JP-A-11 -505107).
本発明において用いる抗体には、望ましい活性（炎症性サイトカインの機能を抑制する活性）を減少させることなく、そのアミノ酸配列が修飾された抗体が含まれる。本発明の抗体のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗体鎖をコードするＤＮＡへの変異導入によって、またはペプチド合成によって作製することができる。そのような修飾には、例えば、本発明の抗体のアミノ酸配列内の残基の置換、欠失、付加および／または挿入を含む。抗体のアミノ酸配列が改変される部位は、改変される前の抗体と同等の活性を有する限り、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域であってもよく、また、可変領域（フレームワーク領域およびＣＤＲ）であってもよい。ＣＤＲ以外のアミノ酸の改変は、抗原との結合親和性への影響が相対的に少ないと考えられるが、現在では、ＣＤＲのアミノ酸を改変して、抗原へのアフィニティーが高められた抗体をスクリーニングする手法が公知である（ＰＮＡＳ， １０２：８４６６−８４７１（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ２１：４８５−４９３（２００８）、国際公開第２００２／０５１８７０号、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２８０：２４８８０−２４８８７（２００５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ２１：３４５−３５１（２００８））。 The antibody used in the present invention includes an antibody whose amino acid sequence has been modified without decreasing a desired activity (activity that suppresses the function of inflammatory cytokines). Amino acid sequence variants of the antibodies of the invention can be made by introducing mutations into the DNA encoding the antibody chains of the invention or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, residue substitutions, deletions, additions and / or insertions within the amino acid sequences of the antibodies of the invention. The site where the amino acid sequence of the antibody is modified may be the constant region of the heavy chain or light chain of the antibody as long as it has an activity equivalent to that of the antibody before modification, and the variable region (framework region and CDR). Modification of amino acids other than CDR is considered to have a relatively small effect on the binding affinity with the antigen, but at present, the amino acid of the CDR is modified to screen for an antibody having an increased affinity for the antigen. Methods are known (PNAS, 102: 8466-8471 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 485-493 (2008), WO 2002/051870, J. Biol. Chem., 280: 24880-24887 (2005), Protein Engineering, Design & Selection, 21: 345-351 (2008)).
また、抗体の改変は、例えば、グリコシル化部位の数、位置、種類を変化させるなどの抗体の翻訳後プロセスの改変であってもよい。抗体のグリコシル化とは、典型的には、Ｎ−結合またはＯ−結合である。抗体のグリコシル化は、抗体を発現するために用いる宿主細胞に大きく依存する。グリコシル化パターンの改変は、糖生産に関わる特定の酵素の導入または欠失などの公知の方法で行うことができる（特開２００８−１１３６６３号公報、特許４３６８５３０号公報、特許４２９０４２３号公報、米国特許第５０４７３３５号公報、米国特許第５５１０２６１号公報、米国特許第５２７８２９９号公報、国際公開第９９／５４３４２号公報）。さらに、本発明においては、抗体の安定性を増加させる等の目的で脱アミド化されるアミノ酸若しくは脱アミド化されるアミノ酸に隣接するアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより脱アミド化を抑制してもよい。また、グルタミン酸を他のアミノ酸へ置換して、抗体の安定性を増加させることもできる。本発明において用いる抗体は、こうして安定化された抗体をも提供するものである。 Further, the modification of the antibody may be modification of a post-translational process of the antibody such as changing the number, position, or type of glycosylation sites. Antibody glycosylation is typically N-linked or O-linked. Antibody glycosylation is highly dependent on the host cell used to express the antibody. The glycosylation pattern can be modified by a known method such as introduction or deletion of a specific enzyme involved in sugar production (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-113663, Japanese Patent No. 4368530, Japanese Patent No. 4290423, US Patent). No. 5,047,335, U.S. Pat. No. 5,510,261, U.S. Pat. No. 5,278,299, and International Publication No. 99/54342). Furthermore, in the present invention, deamidation is suppressed by substituting an amino acid adjacent to the amino acid deamidated or deamidated with another amino acid for the purpose of increasing the stability of the antibody. May be. Alternatively, glutamic acid can be substituted with other amino acids to increase antibody stability. The antibody used in the present invention also provides the antibody thus stabilized.
本発明において用いられる炎症性サイトカインの機能を抑制する抗体としては、例えば、インフリキシマブ(セントコア社製）、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ・ｐｅｇｏｌ（ＵＣＢ社製）、ゴリムマブ(セントコア社製）といった抗ＴＮＦ−α抗体、トシリズマブ（中外製薬社製）等の抗ＩＬ−６Ｒ抗体を適宜選択して用いることができる。 Examples of antibodies that suppress the function of inflammatory cytokines used in the present invention include anti-TNF-α antibodies such as infliximab (manufactured by Centcore), Certolizumab pegol (manufactured by UCB) and golimumab (manufactured by Centcore), and tocilizumab ( An anti-IL-6R antibody such as Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. can be appropriately selected and used.
本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、内因性の炎症性サイトカインに対してドミナントネガティブの形質を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドとしては、内在性の炎症性サイトカインの機能を抑制する作用を有する、これら炎症性サイトカインの変異体や欠失体が挙げられる。例えば、ＴＮＦαに関しては、エタネルセプト（ワイス社製、可溶性ＴＮＦ−α受容体）、ＷＰ９ＱＹ（Ｗ９）ペプチド（ＴＮＦ−α受容体の部分ペプチド変異体）が挙げられ、ＩＬ−１に関しては、ＩＬ−１ＲＡ（インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（典型的には、ヒトＩＬ−１ＲＡとして、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ＿７７６２１５．１（Ｎｏ．ＮＭ＿１７３８４３．１）で示される蛋白質（遺伝子）、マウスＩＬ−１ＲＡとしては、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ ＮＰ＿１１２４４４．１（Ｎｏ．ＮＭ＿０３１１６７．３）で示される蛋白質（遺伝子））が挙げられる。このようなドミナントネガティブ体は、組換えＤＮＡ法、化学合成等によって作製することができる。 Another embodiment of the “compound that suppresses the function of inflammatory cytokines” in the present invention is a polypeptide having a dominant-negative trait with respect to endogenous inflammatory cytokines. Examples of such polypeptides include mutants and deletions of these inflammatory cytokines that have an action of suppressing the function of endogenous inflammatory cytokines. For example, for TNFα, Etanercept (manufactured by Wyeth, soluble TNF-α receptor), WP9QY (W9) peptide (partial peptide variant of TNF-α receptor) can be mentioned, and for IL-1, IL-1RA (Interleukin-1 receptor antagonist (typically, protein (gene) represented by ACCESSION NP_776215.1 (No. NM — 173843.1) as human IL-1RA), ACCESSION NP — 1121444.1 as mouse IL-1RA) (A protein (gene) represented by No. NM_031167.3)) Such a dominant negative body can be produced by a recombinant DNA method, chemical synthesis, or the like.
本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、ＲＮＡ干渉により、炎症性サイトカインの機能を抑制する分子である。例えば、標的遺伝子（炎症性サイトカインをコードする遺伝子、炎症性サイトカインの受容体をコードする遺伝子、あるいは炎症性サイトカインのシグナル伝達に関与するその他のタンパク質をコードする遺伝子）の転写産物と相補的なｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）または該ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡが挙げられる。 Another embodiment of the “compound that suppresses the function of inflammatory cytokine” in the present invention is a molecule that suppresses the function of the inflammatory cytokine by RNA interference. For example, a dsRNA complementary to a transcript of a target gene (a gene encoding an inflammatory cytokine, a gene encoding a receptor for an inflammatory cytokine, or a gene encoding another protein involved in inflammatory cytokine signal transduction) (Double-stranded RNA) or DNA encoding the dsRNA.
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）のいずれかの領域に対するアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスＤＮＡと、該ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンスＲＮＡをコードしたセンスＤＮＡを含み、該アンチセンスＤＮＡおよび該センスＤＮＡより、それぞれアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させることができる。また、これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡよりｄｓＲＮＡを作製することができる。 DNA encoding dsRNA includes antisense DNA encoding antisense RNA for any region of the transcript (mRNA) of the target gene, and sense DNA encoding sense RNA for any region of the mRNA, Antisense RNA and sense RNA can be expressed from the antisense DNA and the sense DNA, respectively. Moreover, dsRNA can be produced from these antisense RNA and sense RNA.
ｄｓＲＮＡの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。 A configuration in which a dsRNA expression system is held in a vector or the like includes a case where antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector, and a case where antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively. As a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from the same vector, for example, an antisense RNA expression cassette in which a promoter capable of expressing a short RNA such as a polIII system is linked upstream of the antisense DNA and the sense DNA. And sense RNA expression cassettes are constructed, and these cassettes are inserted into the vector in the same direction or in the opposite direction.
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスＤＮＡとセンスＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスＲＮＡコード鎖とセンスＲＮＡコード鎖とが対となった一つの二本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。 It is also possible to construct an expression system in which antisense DNA and sense DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands. In this configuration, one double-stranded DNA (siRNA-encoding DNA) in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA from each strand are provided on both sides thereof. A promoter is provided oppositely so that it can be expressed. In this case, in order to avoid adding extra sequences downstream of the sense RNA and the antisense RNA, a terminator is added to the 3 ′ end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide. As this terminator, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used. Further, in this palindromic style expression system, the two promoter types are preferably different.
また、異なるベクターからアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよびセンスＤＮＡの上流にそれぞれｐｏｌIII系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットとセンスＲＮＡ発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。 In addition, as a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from different vectors, for example, antisense RNA expression in which a promoter capable of expressing a short RNA such as a pol III system is linked upstream of the antisense DNA and the sense DNA. A cassette and a sense RNA expression cassette are constructed, and these cassettes are held in different vectors.
なお、上記ｄｓＲＮＡは、当業者であればそれぞれの鎖を化学合成して調製することも可能である。 In addition, those skilled in the art can prepare the dsRNA by chemically synthesizing each strand.
本発明に用いるｄｓＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。標的遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。ｄｓＲＮＡの鎖長は、例えば、１５〜４９塩基対であり、好適には１５〜３５塩基対であり、さらに好適には２１〜３０塩基対である。 As the dsRNA used in the present invention, siRNA is preferable. siRNA means double-stranded RNA consisting of short strands in a range that does not show toxicity in cells. The chain length is not particularly limited as long as the expression of the target gene can be suppressed and it does not show toxicity. The chain length of dsRNA is, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 to 30 base pairs.
ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムにより決定することができる。 The DNA encoding dsRNA need not be completely identical to the base sequence of the target gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% or more). Sequence identity can be determined by the BLAST program.
本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、標的遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）や標的遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ（リボザイム）をコードするＤＮＡである。 Other embodiments of the “compound that suppresses the function of inflammatory cytokine” in the present invention are specific to a DNA (antisense DNA) encoding an antisense RNA complementary to a transcription product of the target gene or a transcription product of the target gene. DNA encoding an RNA (ribozyme) having a ribozyme activity that is cleaved into two.
上記の炎症性サイトカインの機能を抑制する核酸分子は、公知の形質転換技術、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター法などの方法により、宿主動物細胞に導入することができる。 The nucleic acid molecule that suppresses the function of the inflammatory cytokine can be introduced into a host animal cell by a known transformation technique, for example, a lipofection method, an electroporation method, a viral vector method, or the like.
本発明における「炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物」の他の態様は、炎症性サイトカインの機能を抑制する合成低分子化合物であり、例えば、ＴＮＦ−α変換酵素の
酵素活性を阻害する化合物であるＧＭ６００１、ＴＡＰＩ−１、ＴＡＰＩ−２、ＴＡＰＩ−３が挙げられる。
Another embodiment of the “compound that suppresses the function of inflammatory cytokine” in the present invention is a synthetic low molecular compound that suppresses the function of inflammatory cytokine, for example, a compound that inhibits the enzyme activity of TNF-α converting enzyme. There are certain GM6001, TAPI-1, TAPI-2, and TAPI-3.
本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、インビトロやインビボの実験）に用いられる試薬の形態であり得る。 The composition of the present invention may be in the form of a pharmaceutical composition, a food or drink (including animal feed), or a reagent used for research purposes (eg, in vitro or in vivo experiments).
本発明の組成物は、血栓形成を抑制する作用、円盤状血小板による血小板血栓の形成及び血管内皮細胞への接着を抑制する作用を有するため、血栓形成に起因する疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、心原性血栓塞栓症、静脈血栓塞栓症、動脈血栓症、並びに、慢性炎症を来すメタボリックシンドローム、癌、持続性の腸炎、神経疾患といった動脈血栓症等が認められる疾患などの予防のために投与される医薬組成物として、また、血栓形成の予防のために（上記疾患の予防を含む）、日常的に摂取される飲食品として好適に用いることができる。 The composition of the present invention has an action of suppressing thrombus formation, an action of suppressing platelet thrombus formation by discoid platelets and adhesion to vascular endothelial cells, and therefore a disease caused by thrombus formation, for example, atherosclerosis , Cardiogenic thromboembolism, venous thromboembolism, arterial thrombosis, and metabolic syndrome that causes chronic inflammation, cancer, persistent enterocolitis, diseases with arterial thrombosis such as neurological diseases, etc. In addition, it can be suitably used as a food / drink that is taken daily, as a pharmaceutical composition to be administered to the patient, and for the prevention of thrombus formation (including prevention of the above-mentioned diseases).
本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。 The composition in the present invention can be formulated by a known pharmaceutical method. For example, capsule, tablet, pill, liquid, powder, granule, fine granule, film coating, pellet, troche, sublingual, chewing agent, buccal, paste, syrup, suspension, To be used orally or parenterally as elixirs, emulsions, coatings, ointments, plasters, cataplasms, transdermal preparations, lotions, inhalants, aerosols, injections, suppositories, etc. Can do.
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。 In these preparations, carriers that are acceptable pharmacologically or as foods and beverages, specifically, sterile water and physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspensions, surfactants, stabilizers, Flavoring agent, fragrance, excipient, vehicle, preservative, binder, diluent, tonicity agent, soothing agent, extender, disintegrant, buffering agent, coating agent, lubricant, colorant, sweetness Can be suitably combined with an agent, a thickening agent, a flavoring agent, a solubilizing agent or other additives.
本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、血栓形成に起因する疾患の予防に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。 When using the composition of this invention as a pharmaceutical composition, you may use together with the well-known pharmaceutical composition used for prevention of the disease resulting from thrombus formation.
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、食品添加物、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品；みそ、発酵飲料等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ，インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。 When the composition of the present invention is used as a food or drink, the food or drink is, for example, a health food, a functional food, a food for specified health use, a dietary supplement, a food for a sick person, a food additive, or an animal feed. obtain. The food / beverage products of this invention can be ingested as a composition as described above, and can also be ingested as various food / beverage products. Specific examples of food and drink products include edible oils, dressings, mayonnaise, margarine and other oils; soups, milk drinks, soft drinks, tea drinks, alcoholic drinks, drinks, jelly drinks, functional drinks, etc. Liquid foods; Carbohydrate-containing foods such as rice, noodles, breads; Livestock processed foods such as ham and sausages; Fish processed foods such as kamaboko, dried fish, and salted vegetables; Vegetable processed foods such as pickles; Semis such as jelly and yogurt Solid foods; Fermented foods such as miso and fermented beverages; Various confectionery such as Western confectionery, Japanese confectionery, candy, gums, gummi, frozen confectionery, ice confectionery; Retort products such as curry, sauce, Chinese soup; Instant soup Examples include instant foods such as instant miso soup and foods for microwave ovens. Furthermore, health foods and drinks prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules, liquid, paste or jelly are also included. The composition of the present invention can be used for animals including humans, but is not particularly limited as animals other than humans, and may be used for various domestic animals, poultry, pets, laboratory animals, and the like. it can. Specific examples include but are not limited to pigs, cows, horses, sheep, goats, chickens, ducks, ostriches, ducks, dogs, cats, rabbits, hamsters, mice, rats, monkeys, and the like.
本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、血栓形成の抑制のために有効な１種もしくは２種以上の成分を添加してもよい。また、血栓形成の抑制以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。 Manufacture of the food-drinks in this invention can be implemented with a manufacturing technique well-known in the said technical field. In the said food-drinks, you may add the 1 type, or 2 or more types of component effective for suppression of thrombus formation. Moreover, it is good also as multifunctional food-drinks by combining with the other component which exhibits functions other than suppression of thrombus formation, or another functional food.
本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの本発明の組成物の投与量または摂取量は、一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明は、このように、本発明の組成物を対象に投与もしくは摂取させることを特徴とする、対象における血栓形成を抑制する方法をも提供するものである。また、本発明の組成物を対象に投与することを特徴とする、対象における血栓形成に起因する疾患の予防の方法をも提供するものである。 When the composition of the present invention is administered or ingested, the dose or intake is appropriately selected according to the age, weight, symptom, health condition of the subject, type of composition (pharmaceutical, food and drink, etc.), etc. The For example, the dose or intake of the composition of the present invention per one time is generally 0.01 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight. Thus, the present invention also provides a method for suppressing thrombus formation in a subject, characterized by administering or ingesting the composition of the present invention to the subject. The present invention also provides a method for preventing a disease caused by thrombus formation in a subject, which comprises administering the composition of the present invention to the subject.
本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、血栓形成を抑制するために用いられる旨の表示を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。血栓形成を予防するために用いられる旨の表示においては、本発明の組成物を投与もしくは摂取することにより血栓形成が抑制される機序についての情報を含むことができる。機序としては、例えば、血栓形成初期において、血小板の血管内皮への付着を抑制すること、に関する情報が挙げられる。また、血栓形成を抑制するために用いられる旨の表示においては、血栓形成に起因する疾患の予防のために用いられること、に関する情報を含むことができる。 The product of the composition of the present invention (pharmaceutical product, food / drink product, reagent) or instructions thereof may be labeled with an indication that it is used to inhibit thrombus formation. Here, “labeled product or instructions” means that the product body, container, packaging, etc. are marked, or instructions, package inserts, promotional materials, or other printed materials that disclose product information. It means that the display is attached to. The indication that it is used to prevent thrombus formation may include information on the mechanism by which thrombus formation is suppressed by administering or ingesting the composition of the present invention. As the mechanism, for example, information on suppressing adhesion of platelets to the vascular endothelium in the early stage of thrombus formation can be mentioned. In addition, the display indicating that it is used for suppressing thrombus formation may include information regarding the use for prevention of diseases caused by thrombus formation.
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example and a comparative example, this invention is not limited to a following example.
なお、本実施例で用いた実験動物及び試薬は以下のようにして用意した。 The experimental animals and reagents used in this example were prepared as follows.
＜実験動物及び試薬＞
１２週齢 雄 野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスはチャールズリバー研究所から購入した。また、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−受容体、ＩＬ−１α／β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、及びＩＬ−６の各々の欠損マウス、並びにそれらのコントロール同腹仔は「Ｈｏｒａｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、１８７巻、１４６３−１４７５ページ」、「Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９９７年、７７巻、６４７−６５８ページ」、「Ｐｆｅｆｆｅｒ， Ｋ．，ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、７３巻、１９９３年、４５７−４６７ページ」、「Ｋｏｐｆ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年３月２４日、３６８巻、６４６９号、３３９−４２ページ」に記載のものを各々用意した。なお、全ての動物及び組み換えＤＮＡ実験は動物実験委員会によって承認を受けたものである。そして、全ての試薬は、特に断りのない限り、シグマ−アルドリッチ社製のものを用いた。
<Experimental animals and reagents>
Twelve week-old male wild-type C57BL / 6J mice were purchased from Charles River Laboratories. In addition, mice lacking each of TNF-α, TNF-receptor, IL-1α / β, IL-1 receptor antagonist, and IL-6, and their control littermates were described in “Horai, R., et al. , The Journal of Experimental Medicine, 1998, 187, 1463-1475 ”,“ Taniguchi, T., et al., Laboratory Investigation, 1997, 77, 647-658 ”,“ Pfefer. et al., Cell, 73, 1993, pp. 457-467 ”,“ Kopf M., et al., Nature, March 24, 1994, 368, 6469, pp. 339-42 ”. Each one was prepared. All animal and recombinant DNA experiments were approved by the Animal Experiment Committee. All reagents were made by Sigma-Aldrich unless otherwise specified.
また、本実施例において、前記実験動物及び試薬を用いて、下記の通りに実験動物の体内に血栓を形成させ、その過程を生体顕微鏡で観察した。さらに、得られた観察結果の画像解析又は統計解析は下記の通りに行った。 In this example, thrombus was formed in the body of the experimental animal as described below using the experimental animal and the reagent, and the process was observed with a living microscope. Furthermore, image analysis or statistical analysis of the obtained observation results was performed as follows.
＜生体顕微鏡検査及び血栓形成＞
生きているマウスの腸間膜の微小循環における血栓形成を視覚的に解析するため、従来の手法を改変して発展させた可視化技術による生体レーザー傷害手法を用いた（「Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００８年２月１日、１１８巻、２号、７１０−７２１ページ」、「Ｔａｋｉｚａｗａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２０１０年１月４日、１２０巻、１号、１７９−１９０ページ」参照）。すなわち、ウレタン注射（１．５ｇ／ｋｇ）によって麻酔した後、腸間膜を露出することなく観察するために雄マウスに小切開を施した。そして、細胞動態を可視化するために、ＦＩＴＣ（２０ｍｇ／ｋｇ体重）又はテキサス−レッド−デキストラン（蛍光標識デキストラン）（２０ｍｇ／ｋｇ体重）を注入した。また、レーザー照射時にＲＯＳ（活性酸素種）を産生させるため、ヘマトポルフィリン（１．８ｍｇ／ｇ）を注入した。結果、マウスをこのように処理することにより、血球動態及び血栓産生は、レーザー励起及びＲＯＳ産生（波長４８８ｎｍ、３０ｍＷ出力）の間、可視化されることになる。さらに、かかる可視化に関するシークエンシャル画像は、回転ディスク共焦点顕微鏡（横河電機株式会社製、ＣＳＵ−Ｘ１）及びＥＭ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ）−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ、Ａｎｄｏｒ社製）、又は共鳴スキャンシステム付共焦点レーザー顕微鏡システム（Ａ１Ｒシステム、ニコン社製、３０フレーム／秒、２０〜６０秒間）を用いて、２０〜４０秒間、１０〜３０フレーム／秒で撮影することにより得た。なお、横河電機システムにおいて用いた励起波長は４０８、４８８及び５６８ｎｍであり、ニコンシステムにおいて用いた４０５、４８８及び５６１ｎｍであった。
<Biological examination and thrombus formation>
In order to visually analyze thrombus formation in the microcirculation of the mesentery of a living mouse, a bio-laser injury technique using a visualization technique developed by modifying a conventional technique was used ("Nishimura, S., et. al., The Journal of Clinical Investigation, February 1, 2008, 118, 2, 710-721, “Takizawa, H., et al., The Journal of Clinical Investigation, January 4, 2010. 120, No. 1, pp. 179-190 ”). That is, after anesthesia by urethane injection (1.5 g / kg), a small incision was made in male mice to observe without exposing the mesentery. And in order to visualize cell dynamics, FITC (20 mg / kg body weight) or Texas-red-dextran (fluorescent labeled dextran) (20 mg / kg body weight) was injected. In addition, hematoporphyrin (1.8 mg / g) was injected to produce ROS (reactive oxygen species) during laser irradiation. As a result, by treating mice in this way, hemodynamics and thrombus production will be visualized during laser excitation and ROS production (wavelength 488 nm, 30 mW power). Further, the sequential images related to the visualization are obtained by using a rotating disk confocal microscope (CSU-X1 manufactured by Yokogawa Electric Corporation) and an EM (Electron Multiplexing) -CCD camera (iXon, manufactured by Andor) or a resonance scanning system. Using a focused laser microscope system (A1R system, manufactured by Nikon Corporation, 30 frames / second, 20-60 seconds), it was obtained by photographing at 10-30 frames / second for 20-40 seconds. The excitation wavelengths used in the Yokogawa system were 408, 488 and 568 nm, and 405, 488 and 561 nm used in the Nikon system.
また、ＲＯＳ産生を検出するために、マウスに蛍光指示薬 ２−［６−（４'−ａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｏｘｙ−３Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−３−ｏｎ−９−ｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＰＦ（Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、積水メディカル株式会社製）０．８ｍｇ／ｋｇを投与した。さらに、内皮細胞層を可視化するために、蛍光標識（ＦＩＴＣ結合）ＩＢ４（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ由来のイソレクチンＢ４、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）２．０ｍｇ／ｋｇを投与した。また、血小板の動態を特異的に可視化するために、蛍光標識された抗ＧＰＩｂ−β抗体（Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８ ａｎｔｉ−ＧＰＩｂβ、Ｅｍｆｒｅｔ ＡＮＡＬＹＴＩＣＳ社製）０．２ｍｇ／ｋｇを、可視化試験１５分前に静脈内に投与した。さらに、白血球及び内皮細胞の核を可視化するために、ヘキスト３３３４２（インビトロジェン社製）２．５ｍｇ／ｋｇを投与した。 Further, in order to detect ROS production, mice were treated with a fluorescent indicator 2- [6- (4′-amino) phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl] benzoic acid (APF (Aminophenyl Fluorescein), Sekisui Medical). Co., Ltd.) 0.8 mg / kg was administered. Furthermore, in order to visualize the endothelial cell layer, fluorescent labeling (FITC binding) IB 4 ( Griffonia simplicifolis- derived isolectin B 4 , manufactured by Vector Laboratories) 2.0 mg / kg was administered. In order to specifically visualize the kinetics of platelets, 0.2 mg / kg of fluorescently labeled anti-GPIb-β antibody (Dylight 488 anti-GPIbβ, manufactured by Emfret ANALYTICS) was intravenously administered 15 minutes before the visualization test. Administered. Further, Hoechst 33342 (manufactured by Invitrogen) 2.5 mg / kg was administered to visualize the nuclei of leukocytes and endothelial cells.
また、このように蛍光色素（又は指示薬）で染色した試料から、回転ディスク共焦点顕微鏡 ＣＳＵ−Ｘ１を用いて、緑色シグナル及び赤色シグナルを同時に得るために、ＣＳＵ−Ｘ１のセカンドポート及びＥＭ−ＣＣＤカメラ ｉＸｏｎ一対を用いた。すなわち、試料をＡｒ−Ｋｒレーザー（４８８ｎｍ及び５６８ｎｍ）によって励起させ、発生したシグナルはダイクロイックミラーを用いて検出し、赤色及び緑色のシグナルはセカンド５６５ｎｍダイクロイックミラーによって分離し、さらに、５１０−ｎｍバンド−パスバリアフィルターを用いて緑色シグナルを検出し、一方、６００−ｎｍロングパスフィルターを用いて赤色シグナルを検出した。 In addition, in order to obtain a green signal and a red signal simultaneously from a sample stained with a fluorescent dye (or indicator) in this way using a rotating disk confocal microscope CSU-X1, a second port of CU-X1 and an EM-CCD A camera iXon pair was used. That is, the sample was excited by an Ar-Kr laser (488 nm and 568 nm), the generated signal was detected using a dichroic mirror, the red and green signals were separated by a second 565 nm dichroic mirror, and the 510-nm band- A green signal was detected using a pass barrier filter, while a red signal was detected using a 600-nm long pass filter.
＜画像解析＞
血小板の動態を定量化するために、前記の通りにして得られたシークエンシャル画像を次のように解析した。すなわち、レーザー傷害から１０秒後に、内皮との断続的な相互作用を示したものを付着血小板と定義し、また、血栓の発達を定量化するために、血栓内の血小板数は、ＩＱソフトウェア（Ａｎｄｏｒ社製）を用いて、盲検観察者達によって測定した。
<Image analysis>
In order to quantify the kinetics of platelets, the sequential images obtained as described above were analyzed as follows. That is, 10 seconds after laser injury, those that showed intermittent interaction with the endothelium were defined as adherent platelets, and in order to quantify thrombus development, the platelet count in the thrombus was calculated using IQ software ( Measured by blind observers using Andor).
＜統計解析＞
実験動物とコントロール動物との差は両側（２−ｔａｉｌｅｄ）スチューデントｔ検定によって解析し、Ｐ値＜０．０５を有意としてみなした。
<Statistical analysis>
Differences between experimental and control animals were analyzed by 2-tailed Student's t-test and P values <0.05 were considered significant.
また、実施例において用いた血小板機能評価システム（レーザー傷害モデル）について、その観察例を挙げながら、以下において説明する。 The platelet function evaluation system (laser injury model) used in the examples will be described below with reference to observation examples.
＜血小板機能評価システム（レーザー傷害モデル）＞
まず、前述のレーザー誘起反応と、高速共焦点システムに基づく生体内イメージング手法とを組み合わせた生体イメージングによる血小板機能評価システムを用いて、通常条件下における血小板等の動態を確認した。すなわち、白血球、血小板、及び赤血球を、各々ヘキスト３３３４２、蛍光標識された抗ＧＰＩｂ−β抗体、及び蛍光標識デキストランを用いて染色することにより、生体内におけるこれらの動態を可視化した。得られた結果を図１に示す。なお図１中、緑色の（緑色の矢印で示されている）部位は抗ＧＰＩｂ−β抗体で染色された血小板を示し、赤色の（赤色の矢印で示されている）部位は蛍光標識デキストランで染色された赤血球を示し、青色の（青色の矢印で示されている）部位はヘキスト３３３４２で染色された白血球の核を示し、橙色の矢印で示されている部位はヘキスト３３３４２で染色された血管内皮細胞の核を示す。また図１中の数字は観察時間（０〜１０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示している。図１に示した結果から明らかなように、本評価システムは血管内おける血小板等の動態を単一血球レベルで観察することができることが確認された。
<Platelet function evaluation system (laser injury model)>
First, the dynamics of platelets and the like under normal conditions were confirmed by using a platelet function evaluation system based on in vivo imaging that combines the aforementioned laser-induced reaction and in vivo imaging techniques based on a high-speed confocal system. That is, white blood cells, platelets, and red blood cells were stained with Hoechst 33342, fluorescently labeled anti-GPIb-β antibody, and fluorescently labeled dextran, respectively, to visualize their dynamics in vivo. The obtained results are shown in FIG. In FIG. 1, the green site (indicated by the green arrow) indicates platelets stained with anti-GPIb-β antibody, and the red site (indicated by the red arrow) is fluorescently labeled dextran. Shows stained red blood cells, blue sites (shown with blue arrows) show nuclei of white blood cells stained with Hoechst 33342, and sites shown with orange arrows show blood vessels stained with Hoechst 33342 Shows the nucleus of endothelial cells. The numbers in FIG. 1 indicate the observation time (0 to 10 seconds), and the white arrow indicates the direction of blood flow. As is clear from the results shown in FIG. 1, it was confirmed that this evaluation system can observe the dynamics of platelets and the like in blood vessels at a single blood cell level.
次に、へマトポルフィリンにレーザーを照射して産生されたＲＯＳによって腸間膜の毛細血管を損傷させ、その後に続く血栓形成の過程を観察した。得られた結果を図２に示す。なお、図２中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜１６秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図２に示した結果から明らかなように、前記レーザー傷害に引き続いて、血小板が最初に血管壁に付着し、その後、最終的に血管が赤血球及び／又は白血球からなる栓によって塞がれるまでずっと血小板はその数を増やし積み上がり（ｐｉｌｌｉｎｇ ｕｐ）、血流は遅くなっていくことが確認された。なお、本評価システムを用いてテストした血管の９０．５±２．４％（ｎ＝動物５匹から得た５０血管）において血管の閉塞が確認され、再現性の高さも実証された。さらに、発達中の血栓内において、血小板は円盤状の形態を保ったまま、細胞外マトリックスではなく、血管の内皮壁に付着しているということが明らかになった。 Next, mesenteric capillaries were damaged by ROS produced by irradiating hematoporphyrin with laser, and the subsequent thrombus formation process was observed. The obtained results are shown in FIG. 2 indicate the observation time (0 to 16 seconds after laser irradiation), the white arrow indicates the direction of blood flow, and the scale bar indicates 10 μm. As can be seen from the results shown in FIG. 2, following the laser injury, platelets initially attached to the vessel wall and then eventually until the vessel was plugged by a plug of red blood cells and / or white blood cells. It was confirmed that the platelets increased in number and piled up, and the blood flow slowed down. In addition, occlusion of the blood vessel was confirmed in 90.5 ± 2.4% (n = 50 blood vessels obtained from 5 animals) of the blood vessels tested using this evaluation system, and the high reproducibility was also demonstrated. Furthermore, it was revealed that platelets in the developing thrombus were attached to the endothelial wall of the blood vessel, not to the extracellular matrix, while maintaining a discoid shape.
さらに、レーザー傷害後における血栓内の細胞集団をより明確にするために、血小板を特異的に同定する蛍光標識抗ＧＰＩｂβ抗体の存在下において、血栓形成プロトコールに従って実験を前記同様に行った。得られた結果を図３に示す。なお図３中、赤色の部位は抗ＧＰＩｂ−β抗体で染色された血小板を示し、緑色の部位は蛍光標識デキストランで染色された赤血球を示す。また図３中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜２０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図３に示した結果から明らかなように、血栓内のその殆どが血小板から構成されていることが確認され、血栓内の９２．８±１．１％が血小板であることが明らかになった（ｎ＝動物５匹から得た３０血管）。 Furthermore, in order to clarify the cell population in the thrombus after the laser injury, the experiment was performed in the same manner as described above according to the thrombus formation protocol in the presence of a fluorescently labeled anti-GPIbβ antibody that specifically identifies platelets. The obtained results are shown in FIG. In FIG. 3, the red site indicates platelets stained with anti-GPIb-β antibody, and the green site indicates red blood cells stained with fluorescently labeled dextran. The numbers in FIG. 3 indicate the observation time (0 to 20 seconds after laser irradiation), the white arrow indicates the direction of blood flow, and the scale bar indicates 10 μm. As is clear from the results shown in FIG. 3, it was confirmed that most of the thrombus was composed of platelets, and 92.8 ± 1.1% of the thrombus was platelets. (N = 30 vessels obtained from 5 animals).
なお、これらの実験に用いた抗ＧＰＩｂβ抗体の濃度（０．２ｍｇ／ｋｇ）は、レーザー照射後最初の１０秒間又は血栓発達中の２０秒間における血小板の血管壁への付着に有意な影響を与えないことは確認している（図４及び図５参照）。また、アクリヂンオレンジダイを用いて白血球及び血小板を追跡することにより、閉塞された血管内における血栓に白血球が存在していることも確認している（図６参照）。なお図４中、縦軸はレーザー照射後最初の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示し、「ｎｓ」は抗ＧＰＩｂ−β抗体の添加の有無によって血小板の血管壁への付着に有意な差が生じていないことを示す。また図５中、縦軸は血栓内の血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示し、「ｎｓ」は抗ＧＰＩｂ−β抗体の添加の有無によって血小板の血管壁への付着に有意な差が生じていないことを示す。さらに図６中、赤色の部位はアクリヂンオレンジで染色された白血球及び血小板を示し、赤色の矢印で示されている部位は血管閉塞部を示し、緑色の部位は蛍光標識デキストランで染色された赤血球を示す。また図６中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜２０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。 The concentration of anti-GPIbβ antibody (0.2 mg / kg) used in these experiments significantly affected the adhesion of platelets to the blood vessel wall during the first 10 seconds after laser irradiation or 20 seconds during thrombus development. It has been confirmed that there is no such (see FIGS. 4 and 5). It has also been confirmed that leukocytes are present in the thrombus in the occluded blood vessel by tracking leukocytes and platelets using an Acridin Orange dye (see FIG. 6). In FIG. 4, the vertical axis is obtained by dividing the number of platelets per unit time (ms) adhered to the blood vessel wall in the first 10 seconds after laser irradiation by the length of the blood vessel being observed (μm). Numerical values are shown, and “ns” indicates that there is no significant difference in the adhesion of platelets to the blood vessel wall depending on the presence or absence of the addition of anti-GPIb-β antibody. In FIG. 5, the vertical axis indicates the value obtained by dividing the number of platelets in the thrombus by the length (μm) of the blood vessel being observed, and “ns” indicates the presence or absence of anti-GPIb-β antibody. It is shown that there is no significant difference in the adhesion of the blood vessel to the blood vessel wall. Further, in FIG. 6, the red part indicates leukocytes and platelets stained with acridin orange, the part indicated by the red arrow indicates a vascular occlusion, and the green part indicates red blood cells stained with fluorescently labeled dextran. Indicates. The numbers in FIG. 6 indicate the observation time (0 to 20 seconds after laser irradiation), the white arrow indicates the direction of blood flow, and the scale bar indicates 10 μm.
また、本評価システム（レーザー傷害モデル）においては、血管の内皮細胞層は破綻しており、血小板を直接活性化させるコラーゲン（細胞外マトリックス）が露出していることも考えられるため、内皮細胞をＧｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ由来の蛍光標識ＩＢ４（イソレクチン）で染色し、レーザー傷害後の内皮細胞層を経時観察した。得られた結果を図７に示す。なお図７中、赤色の部位は蛍光標識ＩＢ４で染色された内皮細胞を示し、緑色の部位はデキストランで染色された赤血球を示す。また図７中の数字は観察時間（レーザー照射後０〜１６秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図７に示した結果から明らかなように、レーザー照射後に蛍光色素の溢出がなかったことから、無傷の内皮上において血栓は発達していることが確認された。 In this evaluation system (laser injury model), the endothelial cell layer of the blood vessel is broken and collagen (extracellular matrix) that directly activates platelets may be exposed. The endothelial cell layer after laser injury was observed over time by staining with fluorescent-labeled IB 4 (isolectin) derived from Griffonia simplicifolia . The obtained results are shown in FIG. Note in Figure 7, the red part shows the endothelial cells stained with fluorescently labeled IB 4, green site shows the red blood cells were stained with dextran. The numbers in FIG. 7 indicate the observation time (0 to 16 seconds after laser irradiation), the white arrow indicates the direction of blood flow, and the scale bar indicates 10 μm. As is clear from the results shown in FIG. 7, since there was no overflow of the fluorescent dye after laser irradiation, it was confirmed that a thrombus was developed on the intact endothelium.
さらに、本評価システム（レーザー傷害モデル）を用いて、血栓形成はどのように開始されるのかを解析すべく、ＡＰＦ（Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を用いて、先ずはレーザー傷害後の血管内におけるＲＯＳ産生を可視化した。得られた結果を図８に示す。なお図８中、赤色（又は白色）の部位はＡＰＦにより検出されたＲＯＳ産生（蓄積）部位を示し、緑色の部位はデキストランで染色された赤血球を示す。また図８中の数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示し、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図８に示した結果から明らかなように、調べたレーザー傷害後の血管全てにおいて、ＲＯＳの蓄積が確認された。 Furthermore, in order to analyze how thrombus formation is initiated using this evaluation system (laser injury model), APF (Aminophenyl Fluorescein) is used to first produce ROS in the blood vessel after laser injury. Visualized. The obtained result is shown in FIG. In FIG. 8, the red (or white) site indicates the ROS production (accumulation) site detected by APF, and the green site indicates erythrocytes stained with dextran. The numbers in FIG. 8 indicate the observation time (0 seconds and 20 seconds after laser irradiation), the white arrows indicate the direction of blood flow, and the scale bar indicates 10 μm. As is clear from the results shown in FIG. 8, accumulation of ROS was confirmed in all the blood vessels after laser injury examined.
（実施例１） ＴＮＦ−α欠損マウスにおける血栓形成の評価
そこで、ＲＯＳ産生を促すことが知られているＴＮＦ−α（「Ｙａｚｄａｎｐａｎａｈ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、４６０巻、１１５９−１１６３ページ」参照）と血栓形成との関連性を調べるために、血小板機能評価システム（レーザー傷害モデル）を用いて、ＴＮＦ−α欠損マウス（ＴＮＦ−αノックアウトマウス（ＴＮＦα（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長等を評価した。得られた結果を図９〜１１に示す。なお図９中、縦軸は、ＴＮＦ−αノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図１０中、縦軸は、ＴＮＦ−αノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図９及び１０中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。また図１１中、赤色（又は白色）の部位はＡＰＦにより検出されたＲＯＳ産生（蓄積）部位を示し、緑色の部位はデキストランで染色された赤血球を示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示す。さらに図１１中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図９〜１１に示した結果から明らかなように、ＴＮＦ−α欠損マウスにおいて、レーザー照射後の血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長は顕著に減じており、ＲＯＳ産生も減少していることが明らかになった。
(Example 1) Evaluation of thrombus formation in TNF-α-deficient mice Therefore, TNF-α known to promote ROS production (“Yazdanpanah, B., et al., Nature, 2009, 460, 1159). In order to investigate the relationship between thrombus formation and thrombus formation, see TNF-α-deficient mice (TNF-α knockout mice (TNFα (− / −))) using a platelet function evaluation system (laser injury model). The initial adhesion of platelets and thrombus growth were evaluated. The obtained results are shown in FIGS. In FIG. 9, the vertical axis further observes the number of platelets per unit time (ms) attached to the blood vessel wall for 10 seconds after laser injury in TNF-α knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by the length (μm) of the blood vessel is shown. In FIG. 10, the vertical axis represents the length of blood vessels in which the number of platelets in the thrombus at 0 seconds, 10 seconds, and 20 seconds after the laser injury in TNF-α knockout mice and their wild-type littermates is observed. The numerical value obtained by dividing by (μm) is shown. Furthermore, the asterisks in FIGS. 9 and 10 indicate statistical significance (P <0.05). In FIG. 11, the red (or white) site indicates the ROS production (accumulation) site detected by APF, the green site indicates erythrocytes stained with dextran, and the numbers indicate the observation time (0 seconds after laser irradiation). And 20 seconds). Further, in FIG. 11, the white arrow indicates the direction of blood flow, and the scale bar indicates 10 μm. As is apparent from the results shown in FIGS. 9 to 11, in TNF-α-deficient mice, the initial adhesion of platelets and thrombus growth to the blood vessel wall after laser irradiation are significantly reduced, and ROS production is also reduced. It became clear that
（実施例２） ＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスにおける血栓形成の評価
次に、ＴＮＦ−αの受容体である１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ１、ＴＮＦ−Ｒ１）の欠損マウス（ＴＮＦ−Ｒ１ノックアウトマウス（ＴＮＦ−Ｒ１（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長を評価した。得られた結果を図１２〜１４に示す。なお図１２中、縦軸は、ＴＮＦ−Ｒ１ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図１３中、縦軸は、ＴＮＦ−Ｒ１ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図１２及び１３中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。また図１４中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示す。図１２〜１４に示した結果から明らかなように、ＴＮＦ−Ｒ１欠損マウスにおいても、レーザー照射後の血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長は顕著に減じており、実施例１に記載の結果と併せて、ＴＮＦ−α及びその受容体が介する炎症性サイトカインシグナルは、血小板の初期の付着及び血栓成長に必須の要素であることが明らかとなった。
Example 2 Evaluation of Thrombus Formation in TNF-R1 Deficient Mice Next, a type 1 TNF receptor (TNF-receptor1, TNF-R1) -deficient mouse (TNF-R1 knockout mouse (TNF-R1 knockout mouse) ( The initial platelet adhesion and thrombus growth in TNF-R1 (− / −))) was evaluated. The obtained results are shown in FIGS. In FIG. 12, the vertical axis further observed the number of platelets per unit time (ms) attached to the blood vessel wall during 10 seconds after laser injury in TNF-R1 knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by the length (μm) of the existing blood vessel is shown. In FIG. 13, the vertical axis represents the length of blood vessels in which the number of platelets in the thrombus at 0 seconds, 10 seconds, and 20 seconds after the laser injury was observed in TNF-R1 knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by (μm) is shown. Furthermore, the asterisks in FIGS. 12 and 13 indicate statistical significance (P <0.05). In FIG. 14, the white arrow indicates the direction of blood flow, and the scale bar indicates 10 μm. As is apparent from the results shown in FIGS. 12 to 14, even in the TNF-R1-deficient mice, the initial adhesion of platelets and thrombus growth to the blood vessel wall after laser irradiation are remarkably reduced. In addition to the above results, it was revealed that the inflammatory cytokine signal mediated by TNF-α and its receptor is an essential element for the initial adhesion and thrombus growth of platelets.
（実施例３） ＩＬ−１欠損マウスにおける血栓形成の評価
また、炎症性サイトカインと血小板という観点からは、活性化血小板において炎症性サイトカインの１種であるＩＬ−１βが発現しており（非特許文献８）、ＩＬ−１αもＩＬ−１β同様に血小板において発現していることが報告されている（非特許文献９）。さらに、ＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡは巨核球の細胞質に存在し、断片化によって放出した血小板自身もＩＬ−１β ｐｒｅ−ｍＲＮＡを保持しており（非特許文献１０）、炎症反応状態に血小板自体の産生するＩＬ−１βが関与することが推測されている。また、さらには、ＩＬ−１βの合成を介して炎症シグナルを調節していることも既に示されている（非特許文献１１）。そこで、ＩＬ−１と血栓形成との関連性を調べるために、本評価システムを用いて、ＩＬ−１欠損マウス（ＩＬ１α／βダブルノックアウトマウス（ＩＬ１α／β（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長を評価した。得られた結果を図１５〜１７に示す。なお図１５中、縦軸は、ＩＬ１α／βノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図１６中、縦軸は、ＩＬ１α／βノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図１５及び１６中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。また図１７中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示す。図１５〜１７に示した結果から明らかなように、ＩＬ−１欠損マウスにおいて、血栓成長における血小板の内皮細胞への初期の付着が減少していることが明らかになった。
(Example 3) Evaluation of thrombus formation in IL-1-deficient mice From the viewpoint of inflammatory cytokines and platelets, IL-1β, which is one of inflammatory cytokines, is expressed in activated platelets (non-patented). Reference 8) and IL-1α have been reported to be expressed in platelets as well as IL-1β (Non-patent Document 9). Furthermore, IL-1β pre-mRNA is present in the cytoplasm of megakaryocytes, and the platelets released by fragmentation also retain IL-1β pre-mRNA (Non-patent Document 10), and the platelets themselves are in an inflammatory reaction state. It is speculated that the produced IL-1β is involved. Furthermore, it has already been shown that inflammatory signals are regulated through the synthesis of IL-1β (Non-patent Document 11). Therefore, in order to examine the relationship between IL-1 and thrombus formation, using this evaluation system, platelets in IL-1-deficient mice (IL1α / β double knockout mice (IL1α / β (− / −))) are used. Initial adhesion and thrombus growth were evaluated. The obtained results are shown in FIGS. In FIG. 15, the vertical axis further observed the number of platelets per unit time (ms) attached to the blood vessel wall during 10 seconds after laser injury in IL1α / β knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by the length (μm) of the existing blood vessel is shown. In FIG. 16, the vertical axis represents the length of blood vessels in which the number of platelets in the thrombus observed at 0 seconds, 10 seconds, and 20 seconds after laser injury in IL1α / β knockout mice and their wild-type littermates is observed. The numerical value obtained by dividing by (μm) is shown. Furthermore, the asterisks in FIGS. 15 and 16 indicate statistical significance (P <0.05). In FIG. 17, the white arrows indicate the direction of blood flow, the scale bar indicates 10 μm, and the numbers indicate observation times (0 seconds and 20 seconds after laser irradiation). As is clear from the results shown in FIGS. 15 to 17, it was revealed that the initial adhesion of platelets to endothelial cells during thrombus growth was decreased in IL-1-deficient mice.
（実施例４） ＩＬ−１ＲＡ欠損マウスにおける血栓形成の評価
さらに、ＩＬ−１α又はβとＩＬ−１受容体との結合を競合的に阻害し、ＩＬ−１活性を抑制する因子として知られている、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）の欠損マウス（ＩＬ−１ＲＡノックアウトマウス（ＩＬ−１ＲＡ（−／−）））における血栓成長等を評価した。得られた結果を図１８〜２０に示す。なお図１８中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒、８秒、及び２０秒）を示す。また図１９中、縦軸は、ＩＬ−１ＲＡノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害後の１０秒間に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。また図２０中、縦軸は、ＩＬ−１ＲＡノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図１９及び２０中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。図１８〜２０に示した結果から明らかなように、ＩＬ−１ＲＡ欠損マウスにおいては、レーザー傷害後の、血管壁上への血小板の初期の付着及び血栓の発達が亢進しており、実施例３に記載の結果と併せて、ＩＬ−１は、ＴＮＦ−α同様、生体内の血栓形成において必須であることが明らかとなり、また、ＩＬ−１ＲＡは血栓形成を抑制する作用を有する物質であることが実証された。
(Example 4) Evaluation of thrombus formation in IL-1RA-deficient mice Furthermore, it is known as a factor that competitively inhibits the binding between IL-1α or β and IL-1 receptor and suppresses IL-1 activity. Thrombus growth in IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) -deficient mice (IL-1RA knockout mice (IL-1RA (− / −))) was evaluated. The obtained results are shown in FIGS. In FIG. 18, the white arrow indicates the direction of blood flow, the scale bar indicates 10 μm, and the numbers indicate observation times (0 seconds, 8 seconds, and 20 seconds after laser irradiation). In FIG. 19, the vertical axis further observed the number of platelets per unit time (ms) attached to the blood vessel wall during 10 seconds after laser injury in IL-1RA knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by the length (μm) of the existing blood vessel is shown. In FIG. 20, the vertical axis represents the length of blood vessels in which the platelet counts in the thrombus were observed 0 seconds, 10 seconds, and 20 seconds after the laser injury in IL-1RA knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by (μm) is shown. Furthermore, the asterisks in FIGS. 19 and 20 indicate statistical significance (P <0.05). As is clear from the results shown in FIGS. 18 to 20, in the IL-1RA-deficient mice, the initial adhesion of platelets on the blood vessel wall and the development of thrombus after the laser injury are enhanced. In addition to the results described in the above, IL-1 is clarified to be essential for thrombus formation in vivo like TNF-α, and IL-1RA is a substance having an action of suppressing thrombus formation. Has been demonstrated.
（実施例５） ＩＬ−６欠損マウスにおける血栓形成の評価
また、ＩＬ−６と血栓形成との関連性を調べるために、本評価システムを用いて、ＩＬ−６欠損マウス（ＩＬ−６ノックアウトマウス（ＩＬ−６（−／−）））における血小板の初期の付着及び血栓成長を評価した。得られた結果を図２１〜２３に示す。なお図２１中、白い矢印は血流の方向を示し、スケールバーは１０μｍを示し、数字は観察時間（レーザー照射後０秒及び２０秒）を示す。また図２２中、縦軸は、ＩＬ−６ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔におけるレーザー傷害から１０秒後に血管壁に付着した単位時間（ｍｓ）当たりの血小板数を、更に観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに図２３中、縦軸は、ＩＬ−６ノックアウトマウス、及びそれらの野生型同腹仔における、レーザー傷害から０秒、１０秒、２０秒後の血栓内における血小板数を観察している血管の長さ（μｍ）で割って得られた数値を示す。さらに、図２２及び２３中のアスタリスクは統計的に有意であることを示す（Ｐ＜０．０５）。図２１〜２３に示した結果から明らかなように、ＩＬ−６欠損マウスにおいては、レーザー傷害後の、血管壁上への血小板の初期の付着及び血栓の発達が抑制されており、ＩＬ−６は血栓形成を促進する作用を有する物質であることが明らかになった。
(Example 5) Evaluation of thrombus formation in IL-6-deficient mice Further, in order to examine the relationship between IL-6 and thrombus formation, this evaluation system was used to determine whether IL-6-deficient mice (IL-6 knockout mice). (IL-6 (− / −))) was evaluated for initial platelet adhesion and thrombus growth. The obtained results are shown in FIGS. In FIG. 21, the white arrow indicates the direction of blood flow, the scale bar indicates 10 μm, and the numbers indicate observation times (0 seconds and 20 seconds after laser irradiation). In FIG. 22, the vertical axis further observes the number of platelets per unit time (ms) attached to the blood vessel wall 10 seconds after laser injury in IL-6 knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by the length (μm) of the blood vessel is shown. Further, in FIG. 23, the vertical axis represents the length of blood vessels in which the platelet counts in the thrombus at 0 seconds, 10 seconds, and 20 seconds after the laser injury were observed in IL-6 knockout mice and their wild-type littermates. The numerical value obtained by dividing by (μm) is shown. Furthermore, the asterisks in FIGS. 22 and 23 indicate statistical significance (P <0.05). As is clear from the results shown in FIGS. 21 to 23, in IL-6-deficient mice, the initial adhesion of platelets and thrombus development on the blood vessel wall after laser injury was suppressed, and IL-6 Was revealed to be a substance having an action of promoting thrombus formation.
従って、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６といった炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物（例えば、実施例４に記載のＩＬ−１ＲＡ）を生体に投与することにより、血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長を阻害し、生体内における血栓形成を抑制することが可能となる。 Therefore, by administering to a living body a compound that suppresses the function of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1, and IL-6 (for example, IL-1RA described in Example 4), It is possible to inhibit initial adhesion and thrombus growth and suppress thrombus formation in vivo.
以上説明したように、本発明によれば、血管壁への血小板の初期の付着及び血栓成長を阻害し、血栓形成を抑制することが可能となる。したがって、本発明の炎症性サイトカインの機能を抑制する化合物は血栓形成を抑制する点において優れているため、医薬品として用いる場合には、血栓形成に起因する疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、動脈血栓症、心原性血栓塞栓症、静脈血栓塞栓症の予防において特に有用である。また、血栓形成を予防するために日常的に摂取する飲食品として、あるいは、研究目的で血栓形成を抑制するための試薬としても有用である。 As described above, according to the present invention, it is possible to inhibit the initial adhesion of platelets to the blood vessel wall and thrombus growth, thereby suppressing thrombus formation. Therefore, since the compound that suppresses the function of the inflammatory cytokine of the present invention is excellent in suppressing thrombus formation, when used as a pharmaceutical, a disease caused by thrombus formation, such as atherosclerosis, arterial thrombus It is particularly useful in the prevention of cardiomyopathy, cardiogenic thromboembolism and venous thromboembolism. It is also useful as a food or drink that is taken daily to prevent thrombus formation, or as a reagent for inhibiting thrombus formation for research purposes.
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009102390A (en) * | 2009-01-21 | 2009-05-14 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | Therapeutic agent for behcet's disease |
| WO2010065077A2 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-10 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Antagonists of il-6 to prevent or treat thrombosis |
| JP2010155787A (en) * | 2008-12-26 | 2010-07-15 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | Anti-inflammatory, anti-aging agent, antiobestic agent, hair restorer, cosmetic and food and drink for beautification |
-
2010
- 2010-08-12 JP JP2010180781A patent/JP2012041271A/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010065077A2 (en) * | 2008-11-25 | 2010-06-10 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Antagonists of il-6 to prevent or treat thrombosis |
| JP2010155787A (en) * | 2008-12-26 | 2010-07-15 | Maruzen Pharmaceut Co Ltd | Anti-inflammatory, anti-aging agent, antiobestic agent, hair restorer, cosmetic and food and drink for beautification |
| JP2009102390A (en) * | 2009-01-21 | 2009-05-14 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | Therapeutic agent for behcet's disease |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CSNC200901177005; 日本臨牀 Ｖｏｌ．５９（６） 第５９巻, 2001, ｐ．１０５３-１０５８ * |
| CSNC201100474005; 粕川 禮司 Ｒｅｉｊｉ ＫＡＳＵＫＡＷＡ: '肺高血圧症（ＭＣＴＤ）-混合性結合組織病の悪性予後因子- Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ' 別冊・医学のあゆみ 膠原病の難治性病態 , 1996, ｐ．１１-１４ * |
| JPN6014026167; 日本臨牀 Ｖｏｌ．５９（６） 第５９巻, 2001, ｐ．１０５３-１０５８ * |
| JPN6014026168; 粕川 禮司 Ｒｅｉｊｉ ＫＡＳＵＫＡＷＡ: '肺高血圧症（ＭＣＴＤ）-混合性結合組織病の悪性予後因子- Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ' 別冊・医学のあゆみ 膠原病の難治性病態 , 1996, ｐ．１１-１４ * |
| JPN6014026171; Ｂｌｏｏｄ， ｖｏｌ．１１９， ｎｏ．８， ｅ４５-ｅ５６ （２０１２） * |
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