JP2012031108A - Lumen formation inhibitor of endothelial cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、デオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体を有効成分とする、血管内皮細胞の管腔形成抑制剤に関する。更に詳しくは、デオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体を有効成分として、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを特徴とする管腔形成抑制剤に関する。 The present invention relates to a vascular endothelial cell tube formation inhibitor containing a deoxy sugar derivative or a sugar alcohol derivative as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a luminal formation inhibitor characterized by having a deoxy sugar derivative or a sugar alcohol derivative as an active ingredient and does not substantially inhibit the proliferation of vascular endothelial cells.
血管新生は、新しい血管が形成される現象である。血管形成において血管を構築する血管内皮細胞の増殖と、遊走と、血管内皮細胞による管腔の形成が主要な役割を果たしている。そのため、血管新生阻害剤の評価は、血管内皮細胞の増殖と遊走と管腔形成に対する阻害剤の作用を観察することで行われている。血管新生は組織の発達や創傷治癒過程などの正常な生命活動の他に、関節リウマチ、糖尿病網膜症、癌の増殖や転移の際などにおいても活発化し、疾患の進行に深くかかわっている。したがって、このような病的な血管新生を阻害することが、前述の疾患の治療につながることから、血管新生に関連した治療薬の研究開発が多くの企業等で行われてきた。（非特許文献１参照） Angiogenesis is a phenomenon in which new blood vessels are formed. In angiogenesis, the proliferation and migration of vascular endothelial cells that form blood vessels and the formation of lumens by vascular endothelial cells play a major role. Therefore, evaluation of angiogenesis inhibitors is performed by observing the effects of inhibitors on the proliferation and migration of vascular endothelial cells and tube formation. In addition to normal life activities such as tissue development and wound healing processes, angiogenesis is also activated during rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, cancer growth and metastasis, and is deeply involved in the progression of the disease. Therefore, inhibiting such pathological angiogenesis leads to the treatment of the aforementioned diseases, and therefore, research and development of therapeutic agents related to angiogenesis have been carried out by many companies. (See Non-Patent Document 1)
血管新生を阻害する物質としては、アバスチン、インターフェロンα、マリマスタット、ネオバスタット、サリドマイド、ＴＮＰ−４７０など多くの化合物が報告されている（非特許文献１、２参照）。しかし、副作用の問題や、病的な血管新生だけを選択的に阻害することが難しいなどの問題があり、新たな血管新生阻害剤候補の開発が強く求められている。
血管新生阻害剤候補の開発において、単糖やデオキシ糖による血管新生に対する効果が検討された。単糖やデオキシ糖などの糖質は生体内に広く存在し様々な生命現象に関与していることから、血管新生に対して何らかの作用を及ぼすものと期待された。
As substances that inhibit angiogenesis, many compounds such as Avastin, interferon α, marimastat, neobasstat, thalidomide, TNP-470 have been reported (see Non-Patent
In the development of angiogenesis inhibitor candidates, the effects of monosaccharides and deoxysugars on angiogenesis were examined. Since sugars such as monosaccharides and deoxy sugars are widely present in the living body and are involved in various life phenomena, they are expected to have some effect on angiogenesis.
まず、２−デオキシ−Ｄ−リボースは、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）による血管新生の活性を有するが、その立体異性体である２−デオキシ−Ｌ−リボース、２−デオキシ−Ｌ−リボースのヒドロキシル基のメチル化および／またはアシル化誘導体、並びに２−デオキシ−Ｄ−リボースのヒドロキシル基のメチル化および／またはアシル化誘導体が、血管内皮細胞の遊走実験と、マウスでの血管新生阻害実験により血管新生阻害剤であることが開示された（特許文献１参照）。 First, 2-deoxy-D-ribose has angiogenic activity by thymidine phosphorylase (TP), but the stereoisomers of 2-deoxy-L-ribose and 2-hydroxy-L-ribose have hydroxyl groups. Methylated and / or acylated derivatives and methylated and / or acylated derivatives of the hydroxyl group of 2-deoxy-D-ribose inhibited angiogenesis by migration experiments of vascular endothelial cells and angiogenesis inhibition experiments in mice It was disclosed that it is an agent (see Patent Document 1).
一方、多数の希少糖、単糖について血管内皮細胞の増殖や管腔形成に及ぼす効果を検討した結果、Ｄ−アロース、Ｄ−マンノース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｌ−ソルボース、２−デオキシ−Ｄ−リボースと２−デオキシ−Ｌ−リボースに血管内皮細胞の増殖抑制が見られた。管腔形成の抑制は、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グロース、Ｄ−タロース、Ｌ−アロース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−リボース、Ｌ−リボース、２−デオキシ−Ｄ−リボースと２−デオキシ−Ｌ−リボースに認められた。（２−デオキシ−Ｄ−リボースの効果が前記の特許文献１と一致しないが理由は不明である。）Ｄ−アロース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、３−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−リボースと２−デオキシ−Ｌ−リボースは、増殖と管腔形成の両方の阻害作用を有していた。これらの結果から血管新生阻害作用という生理活性発現の原因は、Ｄ−グルコースの２位や３位の水酸基の不在にあると考えられた。（特許文献２、非特許文献３参照）
On the other hand, as a result of investigating the effects of many rare sugars and monosaccharides on proliferation and lumen formation of vascular endothelial cells, D-allose, D-mannose, 2-deoxy-D-glucose, 3-deoxy-D-glucose L-sorbose, 2-deoxy-D-ribose and 2-deoxy-L-ribose were found to inhibit the proliferation of vascular endothelial cells. Inhibition of tube formation is performed by D-allose, D-altrose, D-gulose, D-talose, L-allose, 2-deoxy-D-glucose, 3-deoxy-D-glucose, D-ribose, L- It was found in ribose, 2-deoxy-D-ribose and 2-deoxy-L-ribose. (The reason is unclear although the effect of 2-deoxy-D-ribose does not agree with the above-mentioned
本発明の課題は、デオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体を有効成分として、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを特徴とする管腔形成抑制剤を提供することである。 An object of the present invention is to provide a tube formation inhibitor characterized by having a deoxy sugar derivative or a sugar alcohol derivative as an active ingredient and not substantially inhibiting the proliferation of vascular endothelial cells.
本発明者らは、単糖の六員環に結合する１つの水酸基を不在としたデオキシ糖よりも、２つの水酸基を不在とした六員環構造を有するデオキシ糖誘導体、または糖アルコール誘導体の方が更に強い血管新生阻害作用を示す可能性があると着想し、Ｄ−Ｇｌｕｃａｌ（下式（１））と、２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ、下式（２））、Ｍｅｔｈｙｌ ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−α−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＭＤＥＨ、下式（３））、および１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ、下式（４））について、血管内皮細胞の増殖と管腔形成に及ぼす効果を調べたところ、最後のＡＤＡＨは管腔形成も細胞増殖も阻害しなかったのに対して、前３者は驚くべきことに血管内皮細胞による管腔形成を阻害するが、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを見出して、本発明を完成するに至った。 The present inventors have found that a deoxy sugar derivative having a six-membered ring structure in which two hydroxyl groups are absent, or a sugar alcohol derivative, rather than a deoxy sugar in which one hydroxyl group bonded to a six-membered ring of a monosaccharide is absent. Have the potential to exhibit a stronger angiogenesis inhibitory action, D-Glucal (the following formula (1)), 2,3-Dideoxy-D-erythro-hexose (DEH, the following formula (2)), About Methyl 2,3-deoxy-α-D-erythro-hexanoside (MDEH, the following formula (3)) and 1,5-Anhydro-2-deoxy-D-arabino-hexitol (ADAH, the following formula (4)) The final ADAH did not inhibit luminal formation or cell proliferation when examined for its effects on vascular endothelial cell proliferation and luminal formation. On the other hand, the former three surprisingly found that it inhibits luminal formation by vascular endothelial cells, but does not substantially inhibit proliferation of vascular endothelial cells, and has completed the present invention. .
すなわち、本発明は、以下の通りの管腔形成抑制剤を提供するものである。
（１） デオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ、下式（４））を除く糖アルコール誘導体を有効成分として、血管内皮細胞の増殖を実質的に阻害しないことを特徴とする管腔形成抑制剤。
（２） 糖アルコール誘導体がＤ−Ｇｌｕｃａｌ（下式（１））である、もしくはデオキシ糖誘導体が２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ、下式（２））、またはＡｌｋｙｌ ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡＤＥＨ、下式（５））である、（１）に記載の管腔形成抑制剤。
That is, this invention provides the lumen formation inhibitor as follows.
(1) Substantial growth of vascular endothelial cells using a deoxy sugar derivative or a sugar alcohol derivative excluding 1,5-Anhydro-2-deoxy-D-arabino-hexitol (ADAH, the following formula (4)) as an active ingredient A lumen formation inhibitor characterized by not inhibiting.
(2) The sugar alcohol derivative is D-Glucal (the following formula (1)), or the deoxy sugar derivative is 2,3-Dideoxy-D-erythro-hexose (DEH, the following formula (2)), or Alkyl 2, The tube formation inhibitor according to (1), which is 3-deoxy-D-erythro-hexanopyranide (ADEH, the following formula (5)).
本発明の管腔形成抑制剤は、血管内皮細胞による管腔形成を阻害するが、血管内皮細胞の増殖を阻害しないことから、細胞毒性のない血管新生阻害剤として有用である可能性が期待できる。 The tube formation inhibitor of the present invention inhibits tube formation by vascular endothelial cells, but does not inhibit the growth of vascular endothelial cells, so it can be expected to be useful as an angiogenesis inhibitor without cytotoxicity. .
本発明の管腔形成抑制剤は、デオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）を除く糖アルコール誘導体を有効成分とする。好ましくは、糖アルコール誘導体としてＤ−Ｇｌｕｃａｌ、もしくはデオキシ糖誘導体として２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ）、またはＡｌｋｙｌ ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡＤＥＨ）を有効成分とする。ＡＤＥＨのアルキル基は、炭素数１〜５が好ましく、炭素数１（メチル基）が特に好ましい。炭素数が６以上では、溶解性が悪くなり好ましくない。 The tube formation inhibitor of the present invention contains a deoxy sugar derivative or a sugar alcohol derivative excluding 1,5-Anhydro-2-deoxy-D-arabino-hexitol (ADAH) as an active ingredient. Preferably, D-Glucal as a sugar alcohol derivative, or 2,3-Dideoxy-D-erythro-hexose (DEH) as a deoxy sugar derivative, or Alkyl 2,3-dideoxy-D-erythro-hexanoside (ADEH) as an active ingredient And The alkyl group of ADEH preferably has 1 to 5 carbon atoms, and particularly preferably 1 carbon atom (methyl group). When the number of carbon atoms is 6 or more, the solubility is deteriorated, which is not preferable.
Ｄ−Ｇｌｕｃａｌは、試薬として市販されている（シグマ−アルドリッチ、４６４０５８）。２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ）は、Ｓ．Ｙ−Ｋ．Ｔａｍ ａｎｄ Ｂ．Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４５（１），２９−４３（１９７５）に記載の方法により合成することができる。Ｍｅｔｈｙｌ ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−α−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＭＤＥＨ）を含むＡｌｋｙｌ ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡＤＥＨ）は、Ｓ．Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｅｒｂ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６６（８），４９９−５０５（２００１）に記載の方法により合成できる。また、これらは公知の合成方法を組合せた別の方法により合成することも可能である。 D-Glucal is commercially available as a reagent (Sigma-Aldrich, 464058). 2,3-Dideoxy-D-erythro-hexose (DEH) YK. Tam and B.B. It can be synthesized by the method described in Fraser-Reid, Carbohydrate Research, 45 (1), 29-43 (1975). Alkyl 2,3-dideoxy-D-erythro-hexanoside (ADEH), including Methyl 2,3-dideoxy-α-D-erythro-hexanoside (MDEH), is Konstantinovic et al. , J .; Serb. Chem. Soc. 66 (8), 499-505 (2001). These can also be synthesized by another method combining known synthesis methods.
なお、前記の特許文献２、非特許文献３に記載された希少糖、単糖のうち、増殖抑制効果を有さないが管腔形成阻害効果を有するものとして、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グロース、Ｄ−タロース、Ｌ−アロース、Ｄ−リボース、Ｌ−リボースが記載されている。前４つはアルドヘキソースであり、後２つはアルドペントースであるから、これらはデオキシ糖でも糖アルコールでもない。従って本発明は、特許文献２、非特許文献３には開示されていないし、これらの記載から容易に発明できるものでもないと考える。 Of the rare saccharides and monosaccharides described in Patent Document 2 and Non-Patent Document 3, those having no growth inhibitory effect but having a lumen formation inhibitory effect include D-altrose and D-gulose. , D-talose, L-allose, D-ribose, L-ribose. Since the first four are aldohexoses and the last two are aldopentoses, they are neither deoxy sugars nor sugar alcohols. Therefore, the present invention is not disclosed in Patent Document 2 and Non-Patent Document 3, and is not considered to be easily invented from these descriptions.
本発明において管腔形成を評価する方法に用いる血管内皮細胞としては、例えば、ヒト、ウシ、マウス、ラット由来の血管内皮細胞が挙げられる。さらに詳しくは、例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、ウシ大動脈内皮細胞、マウス脳内皮細胞、ラット肝類洞内皮細胞が挙げられる。臍帯静脈内皮細胞、及びその他の血管内皮細胞の単離および培養方法は、当業者によく知られており、いずれの方法を用いて得られたものであってもよい。また、臍帯静脈血管内皮細胞由来の培養細胞は市販されており、これを用いるのが簡便である。本発明において管腔形成アッセイには、例えば、２％のウシ胎児血清を添加した市販の内皮細胞増殖培地中で、継代培養した臍帯由来血管内皮細胞が好適に用いられ、採取した後、３〜８代の細胞が特に好適に用いられる。 Examples of vascular endothelial cells used in the method for evaluating lumen formation in the present invention include human, bovine, mouse, and rat vascular endothelial cells. More specifically, examples include human umbilical vein endothelial cells, bovine aortic endothelial cells, mouse brain endothelial cells, and rat hepatic sinusoidal endothelial cells. Methods for isolating and culturing umbilical vein endothelial cells and other vascular endothelial cells are well known to those skilled in the art, and may be obtained by any method. In addition, cultured cells derived from umbilical vein vascular endothelial cells are commercially available, and it is easy to use them. In the present invention, for example, umbilical cord-derived vascular endothelial cells subcultured in a commercially available endothelial cell growth medium supplemented with 2% fetal bovine serum are preferably used for the tube formation assay. Cells of -8th generation are particularly preferably used.
本発明の管腔形成抑制剤は、血管新生を伴う疾患、例えば糖尿病性網膜症、又は加齢黄斑変性症による視力低下および失明、固形腫瘍の増殖、慢性関節リューマチの特に関節腔内におけるパンヌス形成、関節症における滑膜の増殖等の疾患、又は乾癬等病的血管新生を伴う疾患などの予防および治療において、甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料として利用できる可能性がある。
予防剤または治療剤は、これらのみで用いるほか、一般的賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤等の適当な添加剤を配合し、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤等の適宜な剤型を選んで製剤し、経口的あるいは経腸的に投与することができる。
The tube formation inhibitor of the present invention is used for diseases associated with angiogenesis, such as diabetic retinopathy or age-related macular degeneration, decreased visual acuity and blindness, growth of solid tumors, rheumatoid arthritis, particularly pannus formation in the joint space In the prevention and treatment of diseases such as synovial proliferation in arthropathy or diseases associated with pathological angiogenesis such as psoriasis, sweeteners, seasonings, food additives, food materials, food and drink, health food and drink, pharmaceuticals・ It may be used as a quasi-drug and feed.
Prophylactic or therapeutic agents are used alone, and are formulated with appropriate additives such as general excipients, stabilizers, preservatives, binders, disintegrants, etc. to provide solutions, capsules, granules, pills An appropriate dosage form such as a powder or tablet can be selected and formulated, and can be administered orally or enterally.
本発明を飼料として用いる場合、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料であって、本発明のデオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）を除く糖アルコール誘導体（以下、「本発明の誘導体」と略す。）を配合した組成物が本発明の誘導体として飲食品中の炭水化物量（糖質量）に対して０．１〜５０重量％となるように配合されていることを特徴とする。このような飼料を家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料動物に投与した場合、肥満傾向が緩和される。したがって、本発明の飼料は、ペットの肥満防止、糖尿病防止や、脂肪付の少ない肉を持つ食用獣肉を得るために有用な飼料である。 When the present invention is used as a feed, it is a feed for domestic animals, poultry, other bees, sharks, fish, and other domestic animals, and the deoxysugar derivative of the present invention, or 1,5-Anhydro-2-deoxy-D- A composition containing a sugar alcohol derivative excluding arabino-hexitol (ADAH) (hereinafter abbreviated as “derivative of the present invention”) is added to the amount of carbohydrate (sugar mass) in the food and drink as the derivative of the present invention. It mix | blends so that it may become 1 to 50 weight%, It is characterized by the above-mentioned. When such feed is administered to feed animals for domestic animals, poultry, and other domestic animals such as bees, rabbits, and fish, the tendency to obesity is alleviated. Therefore, the feed of the present invention is a useful feed for preventing pet obesity, preventing diabetes, and obtaining edible animal meat having meat with little fat.
甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料に、本発明の誘導体を配合した組成物の形態で含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で本発明の誘導体として０．１重量％以上、望ましくは０．５重量％以上含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化などの公知の方法が適宜選ばれる。 The method of adding the derivative of the present invention to a sweetener, seasoning, food additive, food material, food / beverage product, health food / beverage product, pharmaceutical / quasi drug, and feed, The derivative of the present invention may be contained in an amount of 0.1% by weight or more, preferably 0.5% by weight or more until completion, for example, mixing, kneading, dissolution, melting, dipping, infiltration, spraying, application, Known methods such as coating, spraying, pouring, crystallization, and solidification are appropriately selected.
本発明の誘導体を配合した組成物において、本発明の誘導体は、組成物中に０．１〜５０重量％含まれるように配合されている。好ましくは０．５〜３０重量％、より好ましくは１〜１０重量％である。組成物中において、本発明の誘導体が０．１重量％未満だと、血糖値の急上昇の抑制作用が充分ではない。また、組成物中において、本発明の誘導体が５０重量％を越えると、経済的な意味で好ましくない。 In the composition in which the derivative of the present invention is blended, the derivative of the present invention is blended so that it is contained in an amount of 0.1 to 50% by weight. Preferably it is 0.5-30 weight%, More preferably, it is 1-10 weight%. If the derivative of the present invention is less than 0.1% by weight in the composition, the effect of suppressing the rapid increase in blood glucose level is not sufficient. Further, if the derivative of the present invention exceeds 50% by weight in the composition, it is not preferable in an economical sense.
本発明のデオキシ糖誘導体、または１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）を除く糖アルコール誘導体、あるいはその薬理的に許容される塩、又は／及び水和物（以下、「本発明の化合物」と略す。）の製剤についてさらに詳細に説明する。 The deoxy sugar derivative of the present invention, or a sugar alcohol derivative other than 1,5-Anhydro-2-deoxy-D-arabino-hexitol (ADAH), or a pharmacologically acceptable salt or / and hydrate thereof (hereinafter referred to as “deoxy sugar derivative”) And abbreviated as “compound of the present invention”).
本発明の化合物の剤型としては、有効成分を医学的に許容される担体、賦形剤、滑沢剤、結合剤等の添加物を含有する種々の形態、例えば水または各種の輸液用製剤に溶解させた液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、注射剤、坐剤、又は外用製剤等が、公知の製剤技術により製造できる。本発明の化合物を人体用の医薬として使用する場合にその投与量は、一般的には、成人の経口一日量として０．１−１００ｍｇ、通常０．１−１０ｍｇが適当で、漸減していくのが好ましいことがある。前記の１日量は、１日に１回、又は適当な間隔をおいて１日２もしくは３回に分けて、あるいは食前、食後あるいは食事とともに投与することが可能である。注射による投与の場合は通常経口の１／５量が適当であるが、必要に応じて漸減あるいは漸増することができる。また、病巣局所に投与する場合、例えば関節腔内、又は眼球内等に投与する場合はさらに投与量を減ずることができ、全身に対する作用を減弱させ、有効に用いることが可能である。またその投与量は、患者の症状、年齢、又は体重等により適宜増減してもよい。 The dosage form of the compound of the present invention includes various forms containing additives such as medically acceptable carriers, excipients, lubricants, binders and the like as active ingredients, such as water or various infusion preparations. Liquids, powders, granules, tablets, injections, suppositories, or external preparations dissolved in can be produced by known preparation techniques. When the compound of the present invention is used as a medicine for the human body, the dosage is generally 0.1-100 mg, usually 0.1-10 mg as an oral daily dose for an adult, It may be preferable to go. The daily dose can be administered once a day, divided into two or three times a day at an appropriate interval, or before, after or with a meal. In the case of administration by injection, an oral 1/5 amount is usually appropriate, but it can be gradually decreased or increased as necessary. In addition, when administered locally, for example, when administered intraarticularly or intraocularly, the dosage can be further reduced, and the action on the whole body can be attenuated and used effectively. The dose may be appropriately increased or decreased depending on the patient's symptoms, age, weight, or the like.
本発明の化合物を注射で投与する場合、水性注射剤、水性懸濁注射剤、脂肪乳剤、又はリポソーム注射剤等が可能である。水性注射剤、又は水性懸濁注射剤においては、本発明の化合物を、精製水と混合し、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、又は保存剤などを加え、混合して、必要に応じて加熱しながら溶解乃至懸濁させ、滅菌して注射剤容器に充填密封し、水性注射剤、又は水性懸濁注射剤とする。水性注射剤は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、又は関節腔内等に投与することができる。また、水性懸濁注射剤は皮下、筋肉内、皮内、又は関節腔内等に服用することができる。また経口でも投与することができる。 When the compound of the present invention is administered by injection, an aqueous injection, an aqueous suspension injection, a fat emulsion, a liposome injection or the like is possible. In an aqueous injection or aqueous suspension injection, the compound of the present invention is mixed with purified water, and if necessary, a water-soluble or water-swellable polymer, a pH adjuster, a surfactant, an osmotic pressure adjuster. , Preservatives, preservatives, etc., mixed, dissolved or suspended while heating if necessary, sterilized, filled and sealed in an injection container, aqueous injection or aqueous suspension injection To do. The aqueous injection can be administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly, intradermally, intraarticularly, or the like. In addition, the aqueous suspension injection can be taken subcutaneously, intramuscularly, intradermally, or in a joint cavity. It can also be administered orally.
水溶性あるいは水膨潤性高分子としては、ゼラチン、セルロース誘導体、アクリル酸誘導体、ポビドン、マクロゴール、ポリアミノ酸誘導体、又は多糖体類が好ましく、ゼラチン類では精製ゼラチンが好ましく、セルロース誘導体では、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９１０、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２２０８、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６、ヒドロキシプロピルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、アクリル酸誘導体として、アミノアクリルメタアクリレートコポリマー、メタアクリル酸コポリマー、ポリアミノ酸誘導体としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸が好ましい。多糖体としては、ヒアルロン酸、デキストラン、又はデキストリンが特に好ましい。水溶性あるいは水膨潤性高分子の添加量は、エスクレチン、その誘導体、あるいはその薬理的に許容される塩の性質、量、並びに水溶性あるいは水膨潤性高分子の性質、分子量、適用部位によって異なるが概ね製剤全量に対し、０．０１％乃至１０％の範囲で使用可能である。 As the water-soluble or water-swellable polymer, gelatin, cellulose derivatives, acrylic acid derivatives, povidone, macrogol, polyamino acid derivatives, or polysaccharides are preferable, purified gelatin is preferable for gelatins, methylcellulose, for cellulose derivatives, Hydroxypropylmethylcellulose 2910, hydroxypropylmethylcellulose 2208, hydroxypropylmethylcellulose 2906, hydroxypropylcellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose, carmellose sodium, acrylic acid derivative, aminoacryl methacrylate copolymer, methacrylic acid copolymer, polyamino acid derivative Are preferably polylysine and polyglutamic acid. As the polysaccharide, hyaluronic acid, dextran, or dextrin is particularly preferable. The amount of water-soluble or water-swellable polymer added varies depending on the nature and amount of esculetin, its derivatives, or pharmacologically acceptable salts, and the nature, molecular weight, and application site of the water-soluble or water-swellable polymer. However, it can be used in the range of 0.01% to 10% with respect to the total amount of the preparation.
ｐＨ調整剤には、人体に無害な酸あるいはアルカリが用いられ、界面活性剤には、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が用いられる。また、浸透圧調整剤には、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が、防腐剤にはパラベン類が、保存剤にはアスコルビン酸や亜硫酸塩類が例示される。これらの使用量は、特に限定はないが、その作用がそれぞれ発揮できる範囲で用いることができる。また、必要に応じ塩酸プロカイン等の局所麻酔剤、ベンジルアルコール等の無痛化剤、キレート剤、緩衝剤、あるいは水溶性有機溶剤等を加えてもよい。 An acid or alkali that is harmless to the human body is used as the pH adjuster, and a nonionic surfactant, an anionic surfactant, or an amphoteric surfactant is used as the surfactant. Examples of the osmotic pressure regulator include sodium chloride and glucose, examples of the preservative include parabens, and examples of the preservative include ascorbic acid and sulfites. Although there are no particular limitations on the amount of these used, they can be used within a range where their effects can be exhibited. If necessary, a local anesthetic such as procaine hydrochloride, a soothing agent such as benzyl alcohol, a chelating agent, a buffering agent, or a water-soluble organic solvent may be added.
脂肪乳剤は、適当な油脂に乳化剤と本発明の化合物を配合し、精製水を加えて、必要に応じて水溶性あるいは水膨潤性高分子、ｐＨ調整剤、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤、又は保存剤などを加え、適当な乳化装置で乳化し、滅菌して注射剤容器に充填密封することによって調製される。 The fat emulsion is prepared by blending an emulsifier and the compound of the present invention in an appropriate oil and fat, adding purified water, and if necessary, a water-soluble or water-swellable polymer, a pH adjuster, a surfactant, an osmotic pressure adjuster, It is prepared by adding a preservative or preservative, emulsifying with a suitable emulsifying device, sterilizing and filling and sealing the injection container.
本発明の化合物を主剤とする経口用製剤の剤型としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤や、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、又は油性ないし水性の懸濁液等を投与法に応じ適当な製剤を選択し、通常の賦形剤、滑沢剤、結合剤等の添加物と共に、公知の製剤技術により製造できる。 Examples of the dosage form of an oral preparation comprising the compound of the present invention as a main ingredient include administration methods such as tablets, powders, granules, capsules, solutions, syrups, elixirs, or oily or aqueous suspensions. A suitable formulation can be selected according to the above, and it can be produced by a known formulation technique together with usual excipients, lubricants, binders and other additives.
固形製剤としては活性化合物とともに製剤学上許容されている添加物を含み、例えば充填剤類や増量剤類、結合剤類、崩壊剤類、溶解促進剤類、湿潤剤類、又は潤滑剤類等を必要に応じて選択して混合し、製剤化することができる。
また外用製剤として溶液剤、懸濁液、乳濁液、軟膏、ゲル、クリーム、ローション、及びスプレー等を例示できる。
Solid preparations contain pharmaceutically acceptable additives as well as active compounds, such as fillers, extenders, binders, disintegrants, dissolution promoters, wetting agents, lubricants, etc. Can be selected and mixed as necessary to prepare a preparation.
Examples of external preparations include solutions, suspensions, emulsions, ointments, gels, creams, lotions, and sprays.
医薬品・医薬部外品や食品等の開発において最も重要で大きなハードルは、本発明の化合物の安全性の検証である。変異原性、生分解度試験および３種類の急性毒性試験（経口急性毒性試験、皮膚一次刺激試験、眼一次刺激試験）が、最も基本的な安全性試験として定められている。本発明の化合物は、安全であろうとの予想はできるものの、きちんとした検証が今後必要である。
以下に記載する実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
The most important and important hurdle in the development of pharmaceuticals, quasi drugs and foods is the verification of the safety of the compound of the present invention. Mutagenicity, biodegradability test and three types of acute toxicity tests (oral acute toxicity test, primary skin irritation test, primary eye irritation test) are defined as the most basic safety tests. Although the compounds of the present invention can be expected to be safe, further verification is necessary in the future.
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
＜Ｄ−ｇｌｕｃａｌの合成＞
Ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｌ（１．１８ｇ、４．２８ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に２８％ナトリウムメトキシド―メタノール溶液（１１３μｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶かした溶液を加え、室温まで温度を上げた。５時間３０分撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和し、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１５：１）、引き続きゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０，メタノール溶出）により精製し、式（１）で示されるＤ−ｇｌｕｃａｌ（３１２．４ｍｇ、５０％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ：６．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，６．２Ｈｚ），４．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，６．２Ｈｚ），４．０７（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，６．９Ｈｚ），３．６７−３．７７（ｍ，３Ｈ），３．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，８．９Ｈｚ）．
<Synthesis of D-glucal>
Tri-O-acetyl-D-glucal (1.18 g, 4.28 mmol) was dissolved in methanol (100 ml) and cooled to 0 ° C. To this solution was added a solution of 28% sodium methoxide-methanol solution (113 μl) in methanol (20 ml), and the temperature was raised to room temperature. After stirring for 5 hours and 30 minutes, neutralization was performed using a cation exchange resin, and the reaction solution was filtered. The filtrate was concentrated, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform: methanol = 15: 1), followed by gel filtration column chromatography (Sephadex LH-20, methanol elution), and D-- Glucal (312.4 mg, 50%) was obtained.
1 H NMR (600 MHz, D 2 O) δ: 6.25 (dd, 1 H, J = 2.1, 6.2 Hz), 4.64 (dd, 1 H, J = 2.7, 6.2 Hz), 4.07 (td, 1H, J = 2.1, 6.9 Hz), 3.67-3.77 (m, 3H), 3.51 (dd, 1H, J = 6.9, 8.9 Hz) .
＜２，３−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｓｅ（ＤＥＨ）の合成＞
式（６）で示される化合物（１．４５３７ｇ、５．９０ｍｍｏｌ；Ｊ．Ｓｅｒｂ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、６６巻、ｐ．４９９−５０５）を無水酢酸（１００ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に４％濃硫酸―無水酢酸溶液（３．５ml）を加えた。１時間撹拌したのち、反応液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液の順に洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥した。ろ過、溶媒を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、式（７）で示される化合物（６３１．１ｍｇ、４０％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：６．１２−６．１７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１α），５．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，８．９Ｈｚ，Ｈ−１β），４．８０（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１１．０Ｈｚ，Ｈ−４α），４．６８（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，９．６Ｈｚ，Ｈ−４β），４．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６α），４．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６β），４．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，１２．４，Ｈ−６β），４．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１２．４Ｈｚ，Ｈ−６α），３．９６−４．０３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５α），３．４７−３．５２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５β），２．２０−２．３１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３β），２．１２，２．１１，２．１０，２．０８，２．０６，２．０５（ｓ×６，ＣＨ3×６），１．７２−１．８０（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２α，２β，３α），１．４５−１．５５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３β）．
<Synthesis of 2,3-Dideoxy-D-erythro-hexose (DEH)>
A compound represented by formula (6) (1.4537 g, 5.90 mmol; J. Serb. Chem. Soc., 2001, 66, p. 499-505) was dissolved in acetic anhydride (100 ml) at 0 ° C. Cooled down. To this solution was added a 4% concentrated sulfuric acid-acetic anhydride solution (3.5 ml). After stirring for 1 hour, the reaction solution was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with water and a saturated aqueous sodium bicarbonate solution in that order, and dried using anhydrous magnesium sulfate. After filtration and evaporation of the solvent, the residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 3: 1) to obtain the compound represented by the formula (7) (631.1 mg, 40%).
1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ: 6.12-6.17 (m, 1H, H-1α), 5.79 (dd, 1H, J = 2.7, 8.9 Hz, H-1β) 4.80 (dt, 1H, J = 4.8, 11.0 Hz, H-4α), 4.68 (dt, 1H, J = 4.8, 9.6 Hz, H-4β), 4.27. (Dd, 1H, J = 4.8, 12.4 Hz, H-6α), 4.20 (dd, 1H, J = 5.5, 12.4 Hz, H-6β), 4.15 (dd, 1H , J = 4.1, 12.4, H-6β), 4.10 (dd, 1H, J = 2.1, 12.4 Hz, H-6α), 3.96-4.03 (m, 1H) , H-5α), 3.47-3.52 (m, 1H, H-5β), 2.20-2.31 (m, 1H, H-3β), 2.12, 2.11, 2.. 10, 2.08, 2.06, 2 05 (s × 6, CH 3 × 6), 1.72-1.80 (m, 3H, H-2α, 2β, 3α), 1.45-1.55 (m, 1H, H-3β).
式（７）で示される化合物（６７０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をメタノール（７０ml）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に２８％ナトリウムメトキシド―メタノール溶液（１１３μｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶かした溶液を加え、室温まで温度を上げた。１９時間３０分撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和し、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝４０：１）、引き続きゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０，メタノール溶出）により精製し、式（２）で示されるＤＥＨ（２０９．１ｍｇ、５６％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：４．９０−５．２２（ｍ，１Ｈ），３．９１−４．２０（ｍ，１Ｈ），３．３２−３．９０（ｍ，３Ｈ），１．６７−２．０９（ｍ，４Ｈ）．
The compound represented by formula (7) (670 mg, 2.5 mmol) was dissolved in methanol (70 ml) and cooled to 0 ° C. To this solution was added a solution of 28% sodium methoxide-methanol solution (113 μl) in methanol (20 ml), and the temperature was raised to room temperature. After stirring for 19 hours and 30 minutes, neutralization was performed using a cation exchange resin, and the reaction solution was filtered. The filtrate was concentrated, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform: methanol = 40: 1), followed by gel filtration column chromatography (Sephadex LH-20, elution with methanol) to obtain DEH (2) represented by formula (2). 209.1 mg, 56%).
1 H NMR (600 MHz, CD 3 OD) δ: 4.90-5.22 (m, 1H), 3.91-4.20 (m, 1H), 3.32-3.90 (m, 3H) 1.67-2.09 (m, 4H).
＜Ｍｅｔｈｙｌ ２，３−ｄｉｄｅｏｘｙ−α−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｈｅｘｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＭＤＥＨ）の合成＞
式（３）のＭＤＥＨは、Ｓ．Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｅｒｂ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６６（８）,４９９−５０５（２００１）に記載の方法に従って、Ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｌ（２．７２ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）から９２６．５ｍｇ（収率３１％）を合成した。
1Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：４．６３−４．６７（ｍ，１Ｈ），３．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，１１．７Ｈｚ），３．６５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１１．７Ｈｚ），３．３９−３．５０（ｍ，２Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），１．６６−１．８５（ｍ，４Ｈ）．
<Synthesis of Methyl 2,3-deoxy-α-D-erythro-hexanoside (MDEH)>
The MDEH of formula (3) is S.I. Konstantinovic et al. , J .; Serb. Chem. Soc. , 66 (8), 499-505 (2001), 926.5 mg (yield 31%) was synthesized from Tri-O-acetyl-D-glucal (2.72 g, 9.99 mmol).
1 H NMR (600 MHz, CD 3 OD) δ: 4.63-4.67 (m, 1 H), 3.79 (d, 1 H, J = 2.7, 11.7 Hz), 3.65 (d, 1H, J = 6.2, 11.7 Hz), 3.39-3.50 (m, 2H), 3.35 (s, 3H), 1.66-1.85 (m, 4H).
＜１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏ−ｈｅｘｉｔｏｌ（ＡＤＡＨ）の合成＞
Ｔｒｉ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｌ（１．０２４０ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（６０ｍｌ）へ、１０ｗｔ％パラジウム／活性炭（７０９．４ｍｇ）をエタノール（１２ｍｌ）に懸濁させた溶液を加え、水素を充てんさせた。室温で２７時間撹拌したのち、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、式（８）で示される化合物（８７５．８ｍｇ、８５％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ：４．９４−５．０１（ｍ，２Ｈ），４．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１２．４Ｈｚ），４．１０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１２．４Ｈｚ），４．０４（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４，４．８，１１．７Ｈｚ），４．４８−４．５６（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．０７−２．１４（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．７７−１．８７（ｍ，１Ｈ）．
<Synthesis of 1,5-Anhydro-2-deoxy-D-arabino-hexitol (ADAH)>
To a solution of Tri-O-acetyl-D-glucal (1.0240 g, 3.76 mmol) in ethanol (60 ml), a solution of 10 wt% palladium / activated carbon (709.4 mg) suspended in ethanol (12 ml) was added, Filled with hydrogen. After stirring at room temperature for 27 hours, the reaction solution was filtered. The filtrate was concentrated, and the residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 4: 1) to obtain the compound represented by the formula (8) (875.8 mg, 85%).
1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ: 4.94-5.01 (m, 2H), 4.24 (dd, 1H, J = 5.5, 12.4 Hz), 4.10 (dd, 1H) , J = 2.1, 12.4 Hz), 4.04 (ddd, 1H, J = 1.4, 4.8, 11.7 Hz), 4.48-4.56 (m, 2H), 2. 10 (s, 3H), 2.07-2.14 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.77-1.87 (m, 1H) .
式（８）で示される化合物（８６５．３ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（３２ｍｌ）に溶解し０℃に冷却した。この溶液に２８％ナトリウムメトキシド−メタノール溶液（４０μｌ）を加え、室温まで温度を上げた。２時間３０分撹拌したのち、陽イオン交換樹脂を用いて中和し、反応液をろ過した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１）、引き続きゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０，メタノール溶出）により精製し、式（４）で示されるＡＤＡＨ（１．０５９１ｇ、９１％）を得た。
1Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ：３．９１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４，４．８，１１．７Ｈｚ），３．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，１１．７Ｈｚ），３．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，１１．７Ｈｚ），３．４７−３．５４（ｍ，１Ｈ），３．４０−３．４６（ｍ，１Ｈ），３．２７−３．３３（ｍ，１Ｈ），３．０９−３．１８（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．５４−１．６３（ｍ，１Ｈ）．
The compound represented by the formula (8) (865.3 mg, 3.15 mmol) was dissolved in methanol (32 ml) and cooled to 0 ° C. To this solution was added 28% sodium methoxide-methanol solution (40 μl), and the temperature was raised to room temperature. After stirring for 2 hours and 30 minutes, neutralization was performed using a cation exchange resin, and the reaction solution was filtered. The filtrate was concentrated, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform: methanol = 8: 1), followed by gel filtration column chromatography (Sephadex LH-20, methanol elution), and ADAH (4) 1.0591 g, 91%).
1 H NMR (600 MHz, CD 3 OD) δ: 3.91 (ddd, 1H, J = 1.4, 4.8, 11.7 Hz), 3.83 (dd, 1H, J = 2.1, 11 .7 Hz), 3.62 (dd, 1H, J = 5.5, 11.7 Hz), 3.47-3.54 (m, 1H), 3.40-3.46 (m, 1H), 3 .27-3.33 (m, 1H), 3.09-3.18 (m, 2H), 1.85-1.92 (m, 1H), 1.54-1.63 (m, 1H) .
＜材料＞
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ヒト繊維芽細胞、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＨｕＭｅｄｉａ ＥＧ２、ＨｕＭｅｄｉａ ＥＢ２、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子−Ａ）、血管新生キット、およびＣＤ３１用管腔染色キットは、クラボー（株）（大阪、日本）から購入した。セルカウンティングキット８は、（株）同仁化学研究所（熊本、日本）から提供された。
<Material>
HUVEC (human umbilical vein endothelial cells), human fibroblasts, FBS (fetal bovine serum), HuMedia EG2, HuMedia EB2, VEGF (vascular endothelial growth factor-A), angiogenesis kit, and luminal staining kit for CD31 are: Purchased from Kurabo Corporation (Osaka, Japan). Cell counting kit 8 was provided by Dojindo Laboratories Co., Ltd. (Kumamoto, Japan).
＜管腔形成アッセイ＞
血管新生キットを用いて、ＨＵＶＥＣをヒト繊維芽細胞と２４ウェルプレート中で１０日間、培養培地４５０μＬと添加物５０μＬでインキュベートした。培地交換は、３日毎に添加物とともに行った。１０日後、ＨＵＶＥＣを、ＣＤ３１用管腔染色キットのマウス抗ヒトＣＤ３１、ヤギ抗マウスＩｇＧ ＡｌｋＰコンジュゲート、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３‘−インドリルフォスファターゼ ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を用いて染色した。形成した管腔の面積をＩｍａｇｅＪプログラムで測定した。
<Lumen formation assay>
Using an angiogenesis kit, HUVECs were incubated with human fibroblasts in a 24-well plate for 10 days with 450 μL culture medium and 50 μL additive. Medium change was performed with additives every 3 days. After 10 days, HUVEC were immunized with CD31 luminal staining kit mouse anti-human CD31, goat anti-mouse IgG AlkP conjugate, nitroblue tetrazolium chloride (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3'-indolylphosphatase p- Stained with toluidine salt (BCIP). The area of the formed lumen was measured with the ImageJ program.
添加物は、最終濃度の１０倍の濃度で生理食塩水溶液とし、これを１／１０容キット付属の培地に添加して管腔形成用培地を調製した。キット付属の培地のみで形成された管腔面積をコントロールに相対面積を計算し、添加物濃度０（＝生理食塩水１０％）の値（ほとんど「１」である）との間で有意差検定した。
The additive was a physiological saline solution at a
図１に示すように、管腔面積はＶＥＧＦで約２倍に増加したが、ＡＤＡＨではコントロールとほぼ同等であった。一方、ＭＤＥＨ、Ｄ−ｇｌｕｃａｌ、ＤＥＨでは濃度依存的に管腔面積が減少した。よって、ＡＤＡＨは管腔形成を阻害しないが、ＭＤＥＨ、Ｄ−ｇｌｕｃａｌ、ＤＥＨは管腔形成の阻害作用があり、特にＤＥＨが強く阻害することがわかった。（図１参照） As shown in FIG. 1, the luminal area increased about 2-fold with VEGF, but with ADAH, it was almost the same as the control. On the other hand, in MDEH, D-glucal, and DEH, the lumen area decreased in a concentration-dependent manner. Thus, ADAH did not inhibit tube formation, but MDEH, D-glucal, and DEH had an inhibitory effect on tube formation, and DEH was particularly strongly inhibited. (See Figure 1)
＜増殖アッセイ＞
ＨＵＶＥＣは、湿潤の大気圧下、ＣＯ2（５％）、３７℃で、組織培養フラスコ中で増殖した。ＨｕＭｅｄｉａ ＥＧ２を維持培地として使用した。アッセイにおいて、ＨＵＶＥＣは、ゼラチンコートした９６ウェルプレートに、維持培地１００μＬ中、典型的には３０００細胞／ウェルで播種した。播種の後、プレートを２４時間インキュベートして細胞を付着させて、それから維持培地をアッセイ培地に交換した。アッセイ培地は、２％熱不活性化ＦＢＳ添加ＨｕＭｅｄｉａ ＥＢ２を９０μＬと塩含有添加物１０μＬとからなる。ＨｕＭｅｄｉａ ＥＢ２の成分は、ＨｕＭｅｄｉａ ＥＧ２とほとんど同じであるが、ＦＢＳ、成長因子や抗生物質を含んでいない。３〜８代の間の細胞を、アッセイに使用した。
<Proliferation assay>
HUVECs were grown in tissue culture flasks at 37 ° C. with CO 2 (5%) under humid atmospheric pressure. HuMedia EG2 was used as the maintenance medium. In the assay, HUVECs were seeded in gelatin-coated 96 well plates, typically 3000 cells / well, in 100 μL of maintenance medium. After seeding, the plates were incubated for 24 hours to allow the cells to attach and then the maintenance medium was replaced with assay medium. The assay medium consists of 90 μL of HuMedia EB2 supplemented with 2% heat-inactivated FBS and 10 μL of salt-containing additive. The components of HuMedia EB2 are almost the same as HuMedia EG2, but contain no FBS, growth factors or antibiotics. Cells between 3 and 8 generations were used for the assay.
増殖アッセイは、添加物の添加４８時間後、セルカウンティングキット８を用いて行った。［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォ−フェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、１Ｎａ塩］（５ ｍＭ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウム メチル硫酸（０．２ｍＭ）およびＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含む溶液１０μLを各ウェルに添加して、１２０分後に４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（イムノミニＮＪ−２３００、システムインスツルメンツ（株）、日本）で測定した。
Proliferation assays were performed using Cell Counting Kit 8 48 hours after addition of additives. [2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfo-phenyl) -2H-tetrazolium, 1Na salt] (5 mM), 1-methoxy -5-
添加物は最終濃度の１０倍の濃度で生理食塩水溶液とし、これを１／１０容、分析用培地に添加した。分析用培地のみで培養したウェルの吸光度をコントロールに相対値を計算した。
The additive was a physiological saline solution at a
図２に示すように、細胞数はＶＥＧＦでコントロールよりも増加したが、ＡＤＡＨ、ＭＤＥＨ、Ｄ−ｇｌｕｃａｌ、ＤＥＨは濃度が高くなってもコントロールとほぼ同等であり、これらは細胞増殖をほとんど阻害しないことがわかった。ｔ−ｔｅｓｔで、ＶＥＧＦだけがｐ＜０．０１で有意差があった。（図２参照） As shown in FIG. 2, the number of cells increased with VEGF as compared to the control, but ADAH, MDEH, D-glucal, and DEH were almost the same as the control even at higher concentrations, and these hardly inhibited cell proliferation. I understood it. At t-test, only VEGF was significantly different at p <0.01. (See Figure 2)
本発明の管腔形成抑制剤は、血管新生を伴う疾患、例えば糖尿病性網膜症、又は加齢黄斑変性症による視力低下および失明、固形腫瘍の増殖、慢性関節リューマチの特に関節腔内におけるパンヌス形成、関節症における滑膜の増殖等の疾患、又は乾癬等病的血管新生を伴う疾患などの予防および治療に用いることができる、甘味料、調味料、食品添加物、食品素材、飲食品、健康飲食品、医薬品・医薬部外品および飼料として利用できる可能性がある。特に、血管新生を標的とする新しい治療薬として、癌などの疾病治療や予防に有効であることが期待され、新しい医薬品として利用できる可能性がある。 The tube formation inhibitor of the present invention is used for diseases associated with angiogenesis, such as diabetic retinopathy or age-related macular degeneration, decreased visual acuity and blindness, growth of solid tumors, rheumatoid arthritis, particularly pannus formation in the joint space , Sweeteners, seasonings, food additives, food materials, food and drink, health, which can be used for prevention and treatment of diseases such as synovial proliferation in arthropathy or diseases associated with pathological angiogenesis such as psoriasis It may be used as a food / beverage product, pharmaceutical / quasi-drug, and feed. In particular, as a new therapeutic agent targeting angiogenesis, it is expected to be effective in the treatment and prevention of diseases such as cancer, and may be used as a new pharmaceutical product.
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