JP2012016517A - Bone regeneration material and method for manufacturing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、骨の再生に使用される骨再生材料（骨補填剤）及びその製造方法に関する。 The present invention relates to a bone regeneration material (bone filler) used for bone regeneration and a method for producing the same.
従来、βリン酸三カルシウム（β‐ＴＣＰ）等のリン酸カルシウムは、骨腫瘍を摘出した部位や、骨折により骨が欠損した部位に補填され、骨補填材として使用されることが知られている。当該骨補填材は、生体に移植補填後に吸収されて自家骨に置換される性質を有する。したがって、従来の人工骨のように生体内部に残留しないという利点を有する（特許文献１）。 Conventionally, it has been known that calcium phosphate such as β-tricalcium phosphate (β-TCP) is used as a bone prosthetic material by being supplemented to a site where a bone tumor has been removed or a site where bone has been lost due to a fracture. The bone prosthetic material has a property of being absorbed and replaced by autologous bone after transplantation in the living body. Therefore, it has the advantage that it does not remain inside the living body unlike conventional artificial bones (Patent Document 1).
従来のβ−ＴＣＰを用いた骨再生材料は多孔体構造を有しているが、スラリー発泡法により製造されており、当該セル（気泡）は一応連通しているものの、これらのセルの連通の程度が十分でなく、骨芽細胞が定着し骨形成するために必要な血管が十分に形成されないという問題があった。そこで、本発明は、リン酸カルシウム多孔体構造を有する骨再生材料において、セルとセルが十分に連通した骨再生材料を提供することを目的とする。 Although the conventional bone regeneration material using β-TCP has a porous structure, it is manufactured by a slurry foaming method, and although the cells (bubbles) are connected for the time being, There was a problem that the degree of blood was not sufficient and the blood vessels necessary for osteoblasts to settle and form bone were not formed sufficiently. Therefore, an object of the present invention is to provide a bone regeneration material having a cell and a cell sufficiently communicated with each other in a bone regeneration material having a calcium phosphate porous body structure.
本発明（１）は、骨格がリン酸カルシウムを主成分とする部材から構成されるリン酸カルシウム多孔体を含有する骨再生材料において、
前記リン酸カルシウム多孔体が連通孔を有しており、
前記リン酸カルシウム多孔体は、パームポロメーターによる気体通過試験において、気体流量５０Ｌ／ｍｉｎにおける圧力損失が１００ｋＰａ以下であることを特徴とする、骨再生材料である。
The present invention (1) is a bone regeneration material containing a calcium phosphate porous body whose skeleton is composed of a member mainly composed of calcium phosphate.
The calcium phosphate porous body has communication holes;
The calcium phosphate porous material is a bone regeneration material characterized by having a pressure loss of 100 kPa or less at a gas flow rate of 50 L / min in a gas passage test using a palm porometer.
本発明（２）は、前記リン酸カルシウム多孔体の空隙率が、８０〜９９％である、前記発明（１）記載の骨再生材料である。 The present invention (2) is the bone regeneration material according to the invention (1), wherein the porous body of calcium phosphate has a porosity of 80 to 99%.
本発明（３）は、前記リン酸カルシウム多孔体が、生分解性補強材料により被覆されている、前記発明（１）又は（２）の骨再生材料である。 The present invention (3) is the bone regeneration material according to the invention (1) or (2), wherein the calcium phosphate porous body is coated with a biodegradable reinforcing material.
本発明（４）は、前記リン酸カルシウム多孔体のセルの大きさが、０．１〜２ｍｍである、前記発明（１）〜（３）のいずれか一つの骨再生材料である。 The present invention (4) is the bone regeneration material according to any one of the inventions (1) to (3), wherein the cell size of the calcium phosphate porous body is 0.1 to 2 mm.
本発明（５）は、前記リン酸カルシウムが、β‐リン酸三カルシウムである、前記発明（１）〜（４）のいずれか一つの骨再生材料である。 The present invention (5) is the bone regeneration material according to any one of the inventions (1) to (4), wherein the calcium phosphate is β-tricalcium phosphate.
本発明（６）は、前記リン酸カルシウム多孔体が、骨格内マイクロポアを有する、前記発明（１）〜（５）のいずれか一つの骨再生材料である。 The present invention (6) is the bone regeneration material according to any one of the inventions (1) to (5), wherein the calcium phosphate porous material has an intraskeletal micropore.
本発明（７）は、前記骨格内マイクロポアの径が、５〜２００μｍである、前記発明（６）の骨再生材料である。 This invention (7) is the bone regeneration material of the said invention (6) whose diameter of the said intraskeleton micropore is 5-200 micrometers.
本発明（８）は、前記リン酸カルシウム多孔体の骨格表面に、壁面マイクロポアが形成されており、前記骨格内マイクロポアが外部に対して連通している、前記発明（１）〜（７）のいずれか一つの骨再生材料である。 According to the present invention (8), wall surface micropores are formed on the skeleton surface of the calcium phosphate porous body, and the skeleton micropores communicate with the outside of the invention (1) to (7). Any one bone regeneration material.
本発明（９）は、前記壁面マイクロポアの開口径が、１０〜１００μｍである、前記発明（８）の骨再生材料である。 This invention (9) is the bone regeneration material of the said invention (8) whose opening diameter of the said wall surface micropore is 10-100 micrometers.
本発明（１０）は、開口径が５０〜１００μｍである壁面マイクロポアが、５個／１０ｍｍ２以上存在する、前記発明（８）又は（９）の骨再生材料である。 The present invention (10) is the bone regeneration material according to the invention (8) or (9), wherein wall micropores having an opening diameter of 50 to 100 μm are present at 5/10 mm 2 or more.
本発明（１１）は、更に、フィブリン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、コラーゲン、ゼラチン、キチン−キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸およびこれらの変性体からなる群から選ばれる一又は二種類以上のスキャフォールドを含有する、前記発明（１）〜（１０）のいずれか一つの骨再生材料である。 The present invention (11) is further selected from the group consisting of fibrin, polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid-glycolic acid copolymer, collagen, gelatin, chitin-chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, and modified products thereof. Or it is any one bone regeneration material of the said invention (1)-(10) containing 2 or more types of scaffolds.
本発明（１２）は、更に、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子‐β（ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群から選ばれる一又は二種類以上の増殖因子を含有する、前記発明（１）〜（１１）のいずれか一つの骨再生材料である。 The present invention (12) further comprises fibroblast growth factor (FGF), bone morphogenetic protein (BMP), transforming growth factor-β (TGF-β), vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived growth factor (PDGF), any one of the above inventions (1) to (11), containing one or more growth factors selected from the group consisting of hepatocyte growth factor (HGF) Bone regeneration material.
本発明（１３）は、リン酸カルシウムを分散させたスラリーを、有機多孔体内に含浸させる含浸工程と、
前記含浸工程後、含浸させたスラリーに含まれる溶媒を除去する溶媒除去工程と、
前記溶媒除去工程後、加熱して前記有機多孔体を取り除く脱脂工程と、
前記脱脂工程後、リン酸カルシウムを焼結する焼結工程と、
を有することを特徴とする、骨再生材料の製造方法である。
The present invention (13) includes an impregnation step of impregnating an organic porous body with a slurry in which calcium phosphate is dispersed;
After the impregnation step, a solvent removal step of removing the solvent contained in the impregnated slurry;
A degreasing step of removing the organic porous body by heating after the solvent removing step;
After the degreasing step, a sintering step of sintering calcium phosphate;
It is a manufacturing method of the bone regeneration material characterized by having.
本発明（１４）は、前記焼結工程により得られたリン酸カルシウム多孔体内に生分解性補強材料の溶液を含浸させて、溶媒を除去する生分解性補強材料被覆工程を有する、前記発明（１３）の骨再生材料の製造方法である。 The present invention (14) includes the biodegradable reinforcing material coating step of impregnating the calcium phosphate porous body obtained by the sintering step with a solution of the biodegradable reinforcing material to remove the solvent. This is a method for producing a bone regeneration material.
本発明（１５）は、前記生分解性補強材料被覆工程において、前記骨再生材料を生分解性補強材料の溶液中に含浸させた系を減圧にする工程を含む、前記発明（１４）の製造方法である。 The present invention (15) includes the step of depressurizing a system in which the bone regeneration material is impregnated in a solution of the biodegradable reinforcement material in the biodegradable reinforcement material coating step. Is the method.
本明細書において使用する各種用語の意味を説明する。「セル」とは、多孔体内に形成される略球形状の孔部分を意味する。「マイクロポア」とは、多孔体内に存在する上記セル以外の孔を意味する。「骨格内マイクロポア」とは、多孔体を形成する骨格内に形成された空洞を意味する。当該骨格内マイクロポアは、本最良形態に係る製造方法により製造した場合、有機多孔体の骨格が存在していた部分が、当該有機多孔体の気化によって空洞化されてできた孔である。「壁面マイクロポア」とは、多孔体を形成する骨格表面に形成された孔であって、骨格内マイクロポアとセルをつなぐ孔を意味する。壁面マイクロポアは、例えば、本最良形態に係る製造方法により製造した場合、有機多孔体の骨格が気化して骨格外に放出される際に形成される孔である。 The meanings of various terms used in this specification will be described. The “cell” means a substantially spherical hole portion formed in the porous body. “Micropore” means pores other than the cells present in the porous body. “Intraskeleton micropore” means a cavity formed in a skeleton forming a porous body. When the intra-frame micropore is manufactured by the manufacturing method according to the best mode, the portion where the skeleton of the organic porous body is present is a hole formed by being hollowed out by vaporization of the organic porous body. The “wall micropore” means a hole formed on the surface of the skeleton forming the porous body and connecting the micropore in the skeleton and the cell. The wall surface micropore is, for example, a hole formed when the skeleton of the organic porous body is vaporized and released out of the skeleton when manufactured by the manufacturing method according to the best mode.
本発明（１）によれば、リン酸カルシウム多孔体が、高い通気度を有するため、骨格内部に細胞が入り込み定着し骨形成するために必要な血管が十分に形成されるため、骨の再生が促される。 According to the present invention (1), since the calcium phosphate porous body has a high air permeability, the blood vessels necessary for the cells to enter and settle inside the skeleton are sufficiently formed to promote bone regeneration. It is.
本発明（２）によれば、空隙率が高いため、細胞が入り込む空間が大きくなるので、骨の再生が促される。 According to the present invention (2), since the void ratio is high, the space into which the cells enter becomes large, so that bone regeneration is promoted.
本発明（３）によれば、生分解性補強材料により骨格が被覆されることによって、高い材料強度を有するため、取扱がしやすくなる。 According to the present invention (3), since the skeleton is covered with the biodegradable reinforcing material, it has a high material strength, so that it is easy to handle.
本発明（４）によれば、セルの大きさが組織の再構築に適したサイズとなる。 According to the present invention (4), the size of the cell is a size suitable for tissue reconstruction.
本発明（５）によれば、リン酸カルシウムとしてβ‐リン酸三カルシウムを選択することにより、より骨再生しやすくなる。 According to the present invention (5), it becomes easier to regenerate bone by selecting β-tricalcium phosphate as calcium phosphate.
本発明（６）によれば、骨格内マイクロポアを有するリン酸カルシウム多孔体を用いることによって、当該マイクロポア中に生分解性補強材、スキャフォールド、増殖因子等を保持させることができる、又は、骨格内マイクロポア内で細胞が増殖等することが出来るので、より骨再生に適した基盤を提供することができる。 According to the present invention (6), a biodegradable reinforcing material, scaffold, growth factor, etc. can be retained in the micropores by using a calcium phosphate porous body having intrapore micropores, or a skeleton Since cells can proliferate in the internal micropores, a base suitable for bone regeneration can be provided.
本発明（７）によれば、骨格内マイクロポアの径が５〜２００μｍであることにより、適度な強度を保持したままで骨格内マイクロポアの内部を有する骨再生材料を得ることができる。 According to the present invention (7), when the diameter of the intraskeletal micropore is 5 to 200 μm, a bone regeneration material having the inside of the intraskeletal micropore can be obtained while maintaining an appropriate strength.
本発明（８）によれば、骨格内マイクロポアとセルの内部とをつなぐ、壁面マイクロポアが形成されることとなり、骨格内マイクロポアへと細胞が侵入することができるようになるため、また、骨格内マイクロポアに保持させた増殖因子を壁面マイクロポアを通じて外部に徐放させることができるため、より効率的に骨再生が促される。 According to the present invention (8), the wall surface micropores connecting the micropores in the skeleton and the inside of the cell are formed, and the cells can enter the micropores in the skeleton. Since the growth factor held in the intraskeletal micropores can be gradually released to the outside through the wall micropores, bone regeneration is promoted more efficiently.
本発明（９）によれば、壁面マイクロポアより、骨格内マイクロポア内に生分解性補強材料や、スキャフォールドを注入することができるので、骨格内マイクロポア内を有効に活用することができる。尚、骨格内マイクロポア内に生分解性補強材料を導入することで顕著に高い強度を有する骨再生材料とすることができるので、より取り扱い易くなる。 According to the present invention (9), since the biodegradable reinforcing material and the scaffold can be injected into the intraskeleton skeleton from the wall micropore, the inside of the skeleton micropore can be effectively utilized. . In addition, since a bone regenerating material having a remarkably high strength can be obtained by introducing a biodegradable reinforcing material into the micropores in the skeleton, it becomes easier to handle.
本発明（１０）によれば、５０〜１００μｍの開口径を有する壁面マイクロポアであれば、骨格内マイクロポア内に細胞が侵入することが可能となるため、骨格内マイクロポアにおいても、骨再生が促進される。 According to the present invention (10), if the wall surface micropore has an opening diameter of 50 to 100 μm, it becomes possible for cells to invade into the intraskeletal micropore. Is promoted.
本発明（１１）によれば、スキャフォールドを導入することにより、骨再生が促進される。 According to the present invention (11), bone regeneration is promoted by introducing a scaffold.
本発明（１２）によれば、増殖因子を含有することにより、骨再生が促進される。 According to the present invention (12), bone regeneration is promoted by containing a growth factor.
本発明（１３）によれば、高い空隙率及び高い通気度を有し、更に、リン酸カルシウム多孔体に骨格内マイクロポア及び壁面マイクロポアを導入することができるため、骨再生がより促進される骨再生材料が得られる。 According to the present invention (13), a bone having a high porosity and a high air permeability, and further introducing an intraskeletal micropore and a wall micropore into the calcium phosphate porous body, so that bone regeneration is further promoted. A recycled material is obtained.
本発明（１４）によれば、リン酸カルシウム多孔体の骨格が生分解性補強材料により被覆されるため、高い強度を有する骨再生材料が得られる。 According to the present invention (14), since the skeleton of the calcium phosphate porous body is covered with the biodegradable reinforcing material, a bone regeneration material having high strength can be obtained.
本発明（１５）によれば、リン酸カルシウム多孔体の骨格内に生分解性補強材料が導入され易くなると共に、骨格内マイクロポア内にも生分解性補強材料が導入されやすくなることから、より高い強度を有する骨再生材料が得られる。 According to the present invention (15), the biodegradable reinforcing material is easily introduced into the skeleton of the calcium phosphate porous body, and the biodegradable reinforcing material is easily introduced into the skeleton micropores. A bone regeneration material having strength is obtained.
本発明に係る骨再生材料は、骨格がリン酸カルシウムを主成分とする部材から構成されるリン酸カルシウム多孔体を含有する。また、本発明に係る骨再生材料は、リン酸カルシウム多孔体が連通孔を有しており、前記リン酸カルシウム多孔体は、パームポロメーターによる気体通過試験において、気体流量５０Ｌ／ｍｉｎにおける圧力損失が１００ｋＰａ以下であることを特徴とする。このような構成を有することにより、本骨再生材料の骨化が進行し易くなる。その他、任意構成として、生分解性補強材料や、スキャフォールドや、増殖因子等が含まれていてもよい。以下、本発明に係る骨再生材料の各構成について詳細に説明する。 The bone regeneration material according to the present invention contains a calcium phosphate porous body whose skeleton is composed of a member mainly composed of calcium phosphate. In the bone regeneration material according to the present invention, the calcium phosphate porous body has a communicating hole, and the calcium phosphate porous body has a pressure loss of 100 kPa or less at a gas flow rate of 50 L / min in a gas passage test using a palm porometer. It is characterized by being. By having such a configuration, ossification of the bone regeneration material easily proceeds. In addition, as an optional configuration, a biodegradable reinforcing material, a scaffold, a growth factor, or the like may be included. Hereinafter, each structure of the bone regeneration material which concerns on this invention is demonstrated in detail.
《構造》
本発明に係る骨再生材料は、連通孔を有するリン酸カルシウム多孔体である。また当該多孔体は、パームポロメーターによる気体通過試験において、気体流量５０Ｌ／ｍｉｎにおける圧力損失が１００ｋＰａ以下であることを特徴とする。このような、高い通気度を有する多孔体を使用することにより、多孔体を形成する孔と孔が高度に連通している状態となるため、血管が形成されやすくなるので骨形成のされやすい環境を提供することが可能となる。気体通過試験では、パームポロメーター（細孔径分布測定装置、例えば、西華産業、ＣＦＰ−１１０−ＡＥＸＬ）を用いて、厚み４ｍｍのサンプルについて、断面積５０ｍｍ２あたりに空気が通過する際の通過空気流量（Ｌ／ｍｉｎ）と、通過による圧力損失（ｋＰａ）を測定する（厚みが４ｍｍ、断面積が５０ｍｍ２でない場合は、測定値を当該条件に相当する値に換算する。）。これは、サンプルに空気を注入した際に生ずる圧力欠損を示しており、その値が低いほうが、より低圧で空気がサンプルに浸透する事を意味し、即ち通気度が高いことを示す。パームポロメーターによる気体通過試験において、気体流量５０Ｌ／ｍｉｎにおける圧力損失が１００ｋＰａ以下であり、５０ｋＰａ以下がより好適であり、２０ｋＰａ以下が更に好適であり、１０ｋＰａ以下が特に好適である。下限値は特に限定されないが例えば０．１ｋＰａである。尚、測定は、生分解性補強材料が含まれていてもよいが、多孔体セル内にスキャフォールド等の充填物質がない条件で測定するものとする。
"Construction"
The bone regeneration material according to the present invention is a calcium phosphate porous body having communication holes. The porous body is characterized in that, in a gas passage test using a palm porometer, a pressure loss at a gas flow rate of 50 L / min is 100 kPa or less. By using such a porous body having a high air permeability, the pores forming the porous body are in a state of being highly communicated with each other, so that blood vessels are easily formed, and thus an environment in which bone formation is likely to occur. Can be provided. In the gas passage test, using a palm porometer (pore size distribution measuring device such as Seika Sangyo Co., Ltd., CFP-110-AEXL), a sample having a thickness of 4 mm passes when air passes around a cross-sectional area of 50 mm 2. The air flow rate (L / min) and the pressure loss (kPa) due to passage are measured (when the thickness is not 4 mm and the cross-sectional area is not 50 mm 2 , the measured value is converted to a value corresponding to the condition). This indicates a pressure deficit that occurs when air is injected into the sample, and a lower value means that air penetrates the sample at a lower pressure, that is, a higher air permeability. In the gas passage test using a palm porometer, the pressure loss at a gas flow rate of 50 L / min is 100 kPa or less, more preferably 50 kPa or less, further preferably 20 kPa or less, and particularly preferably 10 kPa or less. Although a lower limit is not specifically limited, For example, it is 0.1 kPa. The measurement may include a biodegradable reinforcing material, but the measurement is performed under the condition that there is no filling substance such as a scaffold in the porous body cell.
また、本発明に係るリン酸カルシウム多孔体の空隙率は、８０〜９９％であることが好適であり、９０〜９７％であることがより好適であり、９１〜９５％であることが更に好適である。このような空隙率の範囲内で特に骨形成がされやすくなる。本発明に係るリン酸カルシウム多孔体のセルの大きさは、０．１〜２ｍｍが好適であり、０．２〜１．２ｍｍであることが好適であり、０．３〜１ｍｍであることが更に好適であり、０．４〜０．７ｍｍであることが特に好適である。尚、セルの大きさは、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）にて１０個のセルの大きさ（直径）を測定した平均値である。 The porosity of the calcium phosphate porous body according to the present invention is preferably 80 to 99%, more preferably 90 to 97%, and still more preferably 91 to 95%. is there. Bone formation is particularly easily performed within such a range of porosity. The cell size of the calcium phosphate porous material according to the present invention is preferably 0.1 to 2 mm, preferably 0.2 to 1.2 mm, and more preferably 0.3 to 1 mm. It is particularly preferable that the thickness is 0.4 to 0.7 mm. The cell size is an average value obtained by measuring the size (diameter) of 10 cells with an SEM (scanning electron microscope).
本発明に係る骨再生材料は、リン酸カルシウムを分散させたスラリーを、有機多孔体内に含浸させて溶媒を除去し、加熱して当該有機多孔体を取り除き、更に、リン酸カルシウムを焼結することにより得られるものが好適である。当該製造方法については、後で詳細に説明するが、このようにリン酸カルシウム多孔体を製造することにより、優れた骨再生機能を有するリン酸カルシウム多孔体を得ることができる。このような方法により、高い空隙率を有するリン酸カルシウム多孔体を得ることができる。また、高度に連通した孔を有するリン酸カルシウム多孔体を得ることができるため、本発明のような通気度の高い多孔体を得ることができる。 The bone regeneration material according to the present invention is obtained by impregnating a slurry in which calcium phosphate is dispersed into an organic porous body to remove the solvent, heating to remove the organic porous body, and further sintering the calcium phosphate. Those are preferred. The production method will be described in detail later. By producing the calcium phosphate porous body in this way, a calcium phosphate porous body having an excellent bone regeneration function can be obtained. By such a method, a calcium phosphate porous body having a high porosity can be obtained. Moreover, since a calcium phosphate porous body having highly communicated pores can be obtained, a porous body having a high air permeability as in the present invention can be obtained.
リン酸カルシウム多孔体の骨格の内部は、空洞化した状態となっていることが好適であり、すなわち、骨格内マイクロポアが形成されていことが好適である。先述の製造方法により得られる多孔体は、骨格内部に存在する有機多孔体していた部分が空洞化するので、当該構造を有する骨格を容易に得ることができる。骨格内マイクロポアを有することにより、当該空間に、スキャフォールドや、増殖因子などの物質が保持されて、これらの物質が細胞に供給される。骨格内の空洞は、先述の製造方法によれば、有機発泡体を使用するため、略三角柱形状を有する。骨格内マイクロポアの径は、５〜２００μｍが好適であり、１０〜１５０μｍがより好適であり、２０〜７０μｍであることが更に好適である。ここで、骨格内マイクロポアの径とは、骨格内に形成されるマイクロポアの断面の内接円の直径を意味する。骨格内マイクロポアの大きさが上記の範囲を有することにより、細胞が当該ポア内に侵入する。すると、リン酸カルシウム多孔体骨格の内部及び外部から、細胞がリン酸カルシウムを消費するため、自家骨への変換が促進される。 The inside of the skeleton of the calcium phosphate porous body is preferably in a hollow state, that is, it is preferable that an intraskeleton skeleton micropore is formed. In the porous body obtained by the above-described manufacturing method, the organic porous body existing in the skeleton is hollowed out, and thus a skeleton having the structure can be easily obtained. By having the skeletal micropores, substances such as scaffolds and growth factors are retained in the space, and these substances are supplied to the cells. According to the manufacturing method described above, the cavity in the skeleton has a substantially triangular prism shape because the organic foam is used. The diameter of the micropores in the skeleton is preferably 5 to 200 μm, more preferably 10 to 150 μm, and still more preferably 20 to 70 μm. Here, the diameter of the micropore in the skeleton means the diameter of the inscribed circle in the cross section of the micropore formed in the skeleton. When the size of the micropores in the skeleton has the above range, cells enter the pores. Then, since cells consume calcium phosphate from inside and outside of the calcium phosphate porous body skeleton, conversion to autologous bone is promoted.
このような骨格の表面に当該骨格内マイクロポアと連通している壁面マイクロポアが形成されていることが好適である。このように壁面マイクロポアが形成されていることによって、骨格内マイクロポアにスキャフォールドや細胞増殖因子が取り込まれ、骨格内にこれらの物質が保持されることとなる。また、このように壁面マイクロポアにより骨格内マイクロポアが外部と連通することによって、当該壁面マイクロポアの周囲で特に骨形成が促される。骨格表面に付着した細胞が骨格内マイクロポアから供給される栄養を取得できるためであると推測できる。当該壁面マイクロポアの開口径は、特に限定されないが、例えば、１〜１００μｍが好適である。また、開口径は、５０〜１００μｍがより好適であり、５０〜８０μｍが更に好適である。５０μｍ以上の開口径を有することにより、細胞が骨格内マイクロポアの中に進入することができるようになるので、骨格内マイクロポアにおいても細胞が定着する。ここで開口径とは、壁面に開口した部分の内接円を意味し、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）によって測定する。また、開口径５０〜１００μｍの壁面マイクロポア（顕微鏡視野における個数）が、５〜１００個／１０ｍｍ２（顕微鏡視野の１０ｍｍ２面積当たりの個数）形成されていることが好適であり、１０〜８０個／１０ｍｍ２形成されていることがより好適であり、１５〜６０個／１０ｍｍ２形成されていることが更に好適である。このような範囲の個数の壁面マイクロポアが形成されていることにより、細胞が骨格内マイクロポアに侵入しやすくなる。 It is preferable that wall micropores communicating with the micropores in the skeleton are formed on the surface of the skeleton. As the wall micropores are formed in this way, scaffolds and cell growth factors are taken into the micropores in the skeleton, and these substances are retained in the skeleton. In addition, the intra-skeletal micropores communicate with the outside through the wall micropores in this way, so that bone formation is particularly promoted around the wall micropores. It can be presumed that this is because the cells attached to the surface of the skeleton can acquire the nutrients supplied from the micropores in the skeleton. Although the opening diameter of the said wall micropore is not specifically limited, For example, 1-100 micrometers is suitable. Moreover, 50-100 micrometers is more suitable for an opening diameter, and 50-80 micrometers is still more suitable. By having an opening diameter of 50 μm or more, it becomes possible for cells to enter into the intraskeletal micropores, so that the cells also settle in the intraskeletal micropores. Here, the opening diameter means an inscribed circle of a portion opened on the wall surface, and is measured by an SEM (scanning electron microscope). Further, it is preferable that wall micropores having an opening diameter of 50 to 100 μm (the number in the microscope visual field) are formed to 5 to 100/10 mm 2 (the number per 10 mm 2 area in the microscope visual field). it is more preferable that the number / 10 mm 2 formed, it is further preferred that the 15 to 60 pieces / 10 mm 2 formed. By forming the number of wall micropores in such a range, cells easily enter the micropores in the skeleton.
《組成》
リン酸カルシウム多孔体
本発明に係るリン酸カルシウム多孔体は、骨格がリン酸カルシウムを主成分とする部材から構成される。ここで、主成分とは、多孔体の５０ｗｔ％以上の成分を意味する。リン酸カルシウムとしては、ハイドロキシアパタイト、炭酸アパタイト、β‐リン酸三カルシウム（β‐ＴＣＰ）が挙げられる。このようにリン酸カルシウムの材料を用いることにより、骨形成の過程で骨へと変換されるため、生体吸収性を有する骨再生材料として用いることができる。これらのリン酸カルシウムの中でも、β‐リン酸三カルシウムが、特に骨へと変換され易いので好適に用いられる。
"composition"
Calcium phosphate porous body The calcium phosphate porous body according to the present invention is composed of a member whose skeleton is mainly composed of calcium phosphate. Here, the main component means a component of 50% by weight or more of the porous body. Examples of calcium phosphate include hydroxyapatite, carbonate apatite, and β-tricalcium phosphate (β-TCP). By using the calcium phosphate material in this way, it is converted into bone in the process of bone formation, so that it can be used as a bone regeneration material having bioresorbability. Among these calcium phosphates, β-tricalcium phosphate is preferably used because it is particularly easily converted into bone.
生分解性補強材料
本発明に係る骨再生材料は、その骨格表面が生分解性補強材料（生分解性ポリマー、生分解性有機材料）により被覆されていることが好適である。従来β‐ＴＣＰ等のリン酸カルシウム単体で多孔体骨格を形成した場合には、多孔体の機械的強度に欠け、骨形成において好ましくない環境であった。生分解性補強材の被覆によって多孔体骨格の機械的強度を増すことができるため、当該問題を解決できると共に、従来のリン酸カルシウム多孔体では実現できないような高い空隙率の材料であっても、骨再生材料として耐えうるような十分な強度を有する材料を得ることができる。またこのように強度を高めることができるため、空隙率を高くすることができる。更に、材料が生分解性であることにより、生体内に埋め込んだ後、当該補強材料が長く体内に留置されること無く消滅するという利点を有する。また、本発明に係る多孔体の骨格内に空洞を有する場合、当該空洞内に生分解性補強材料が充填されていると、更に、骨格の機械的強度が増す。
Biodegradable Reinforcing Material The bone regeneration material according to the present invention preferably has a skeleton surface coated with a biodegradable reinforcing material (biodegradable polymer, biodegradable organic material). Conventionally, when a porous skeleton is formed of calcium phosphate alone such as β-TCP, the mechanical strength of the porous body is lacking, which is an unfavorable environment for bone formation. Since the mechanical strength of the porous skeleton can be increased by the coating of the biodegradable reinforcing material, this problem can be solved, and even a material with a high porosity that cannot be realized by the conventional porous calcium phosphate can be obtained. A material having sufficient strength to withstand as a recycled material can be obtained. Further, since the strength can be increased in this way, the porosity can be increased. Furthermore, since the material is biodegradable, it has an advantage that the reinforcing material disappears without being left in the body for a long time after being embedded in the living body. In addition, when a cavity is provided in the skeleton of the porous body according to the present invention, the mechanical strength of the skeleton is further increased if the cavity is filled with a biodegradable reinforcing material.
本発明に係る生分解性補強材料としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリεカプロラクトン等の合成生分解性ポリマーや、ゼラチン、澱粉等の天然の成分解性ポリマーが挙げられる。リン酸カルシウム多孔体単体は強度が低いので取り扱い難いが、これらの生分解性補強材料により、リン酸カルシウム多孔体の骨格表面を被覆することにより、補強して多孔体が崩れるのを防止する。尚、生分解性補強材料は、リン酸カルシウム多孔体の骨格表面に被覆され、溶媒を除去して乾燥した状態にあるのが好ましい。生分解性補強材料は、リン酸カルシウム多孔体の圧縮強度を増すためのものある。また、ここでゼラチンとは、変性したコラーゲンを含む材料を意味する。本発明において使用するゼラチンは、医療用のゼラチンであっても、食用のゼラチンであってもよいが、医療用ゼラチンを用いることが好適である。ここで、多孔体に対する生分解性補強材料の添着量は、乾燥状態において、リン酸カルシウム１００重量部に対して０．１〜１００重量部が好適であり、０．２〜２０重量部がより好適であり、１〜１０重量部が更に好適である。 Examples of the biodegradable reinforcing material according to the present invention include synthetic biodegradable polymers such as polylactic acid, polyglycolic acid and polyε caprolactone, and natural component degradable polymers such as gelatin and starch. The calcium phosphate porous body alone is difficult to handle because of its low strength, but by covering the skeleton surface of the calcium phosphate porous body with these biodegradable reinforcing materials, it is reinforced to prevent the porous body from collapsing. The biodegradable reinforcing material is preferably coated on the surface of the skeleton of the calcium phosphate porous material and is in a dry state after removing the solvent. The biodegradable reinforcing material is for increasing the compressive strength of the calcium phosphate porous material. Here, gelatin means a material containing modified collagen. The gelatin used in the present invention may be medical gelatin or edible gelatin, but it is preferable to use medical gelatin. Here, the amount of biodegradable reinforcing material attached to the porous body is preferably 0.1 to 100 parts by weight and more preferably 0.2 to 20 parts by weight with respect to 100 parts by weight of calcium phosphate in the dry state. Yes, 1 to 10 parts by weight is more preferred.
その他任意構成
本発明に係る骨再生材料は、スキャフォールドが注入されていることが好適である。スキャフォールドとしては、フィブリン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、コラーゲン、ゼラチン、キチン−キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸およびこれらの変性体が挙げられる。これらのスキャフォールドを単体で用いてもよいし、二種類以上の混合物を用いてもよい。これらのスキャフォールドの中でも、コラーゲンが好適である。コラーゲンが含まれることによって、骨形成細胞が侵入増殖しやすくなり、骨形成されやすくなる。スキャフォールドは、水分を多く含有することが好適であり、例えば、ゲル状であることが好適である。ゲル状のスキャフォールドを用いることにより、液体よりも流動性が少なく、更に、早期に吸収される吸収性が高まるため好適である。スキャフォールドの含有量は、３００〜１０００ｇ／ｍ２が好適であり、４００〜８００ｇ／ｍ２がより好適であり、５００〜７００ｇ／ｍ２が更に好適である。
Other Arbitrary Configuration It is preferable that the bone regeneration material according to the present invention is injected with a scaffold. Examples of the scaffold include fibrin, polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid-glycolic acid copolymer, collagen, gelatin, chitin-chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, and modified products thereof. These scaffolds may be used alone, or two or more kinds of mixtures may be used. Among these scaffolds, collagen is preferred. By including collagen, bone-forming cells are liable to invade and proliferate, and bone formation is facilitated. The scaffold preferably contains a large amount of moisture, and is preferably in the form of a gel, for example. By using a gel-like scaffold, the fluidity is less than that of a liquid, and the absorbability that is absorbed at an early stage is further increased. The content of scaffold, 300~1000g / m 2 being preferred, 400 to 800 / m 2 is more preferable, 500~700g / m 2 are more preferred.
本発明に係る骨再生材料は、増殖因子が含浸されていることが好適である。増殖因子が含まれることによっても、骨形成が促進される。ここで、増殖因子としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子‐β（ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等を使用できる。これらの中でも特に、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を用いるのが好適であり、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）を用いるのがより好適である。増殖因子の含有量（１ｍ３あたりの重量（ｇ））は、特に限定されないが、例えば、１０〜３００ｇ／ｍ３が好適であり、２０〜２００ｇ／ｍ３がより好適であり、５０〜１００ｇ／ｍ３が更に好適である。 The bone regeneration material according to the present invention is preferably impregnated with a growth factor. Bone formation is also promoted by including a growth factor. Here, the growth factors include bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth factor (FGF), transforming growth factor-β (TGF-β), vascular endothelial growth factor (VEGF), insulin-like growth factor ( IGF), platelet-derived growth factor (PDGF), hepatocyte growth factor (HGF) and the like can be used. Among these, it is preferable to use fibroblast growth factor (FGF), and it is more preferable to use basic fibroblast growth factor (FGF2). The content of the growth factor (weight (g) per 1 m 3 ) is not particularly limited, but for example, 10 to 300 g / m 3 is preferable, 20 to 200 g / m 3 is more preferable, and 50 to 100 g. / M 3 is more preferable.
《性質》
本発明に係る骨再生材料の圧縮強度は、０．１０〜２ＭＰａが好適であり、０．１５〜１ＭＰａがより好適であり、０．２〜０．５ＭＰａが更に好適である。このような強度を有することにより、生体内に移植しても、骨格が潰れずに十分な大きさのセルを保持するため好適である。
"nature"
The compressive strength of the bone regeneration material according to the present invention is preferably 0.10 to 2 MPa, more preferably 0.15 to 1 MPa, and still more preferably 0.2 to 0.5 MPa. By having such strength, even when transplanted in a living body, the skeleton is not crushed and a sufficiently large cell is retained.
《製造方法》
本発明に係る製造方法は、含浸工程と、溶媒除去工程と、脱脂工程と、焼結工程と、生分解性補強材料被覆工程と有する。これらの工程は、当該記載順に行なわれる。このように、有機多孔体を用いた含浸法によりリン酸カルシウム多孔体を製造することにより、高い通気度や空隙率を有する多孔体を得ることができる。以下、各工程について詳細に説明する。
"Production method"
The production method according to the present invention includes an impregnation step, a solvent removal step, a degreasing step, a sintering step, and a biodegradable reinforcing material coating step. These steps are performed in the order described. Thus, by producing a calcium phosphate porous body by an impregnation method using an organic porous body, a porous body having high air permeability and porosity can be obtained. Hereinafter, each step will be described in detail.
含浸工程
含浸工程では、リン酸カルシウムを分散させたスラリーを有機多孔体内に含浸させる。以下、スラリー及び有機多孔体の詳細について説明する。
In the impregnation step , the organic porous body is impregnated with a slurry in which calcium phosphate is dispersed. Hereinafter, the details of the slurry and the organic porous material will be described.
本工程において使用するスラリーは、リン酸カルシウムを分散させたスラリーを用いる。ここでスラリーとしては、発泡していない非発泡のスラリーを用いることが好適である。ここで「非発泡」とは、スラリー発泡法においてスラリーを発泡させるように意図的に発泡させたスラリーでないものを意味する。すなわち、気泡が全く無いことを意味しているわけではなく、一部に気泡が発生している場合も、当該「非発泡」の概念に含まれるものとする。非発泡のスラリーを用いることにより、有機多孔体の骨格表面にリン酸カルシウムをより均一、且つ、密に定着させることができる。ここで本工程において使用する有機多孔体としては、特に限定されないが、例えば、発泡ポリウレタン等のポリマー発泡体を使用することができる。 The slurry used in this step is a slurry in which calcium phosphate is dispersed. Here, as the slurry, it is preferable to use a non-foamed slurry that is not foamed. Here, “non-foaming” means a slurry that is not intentionally foamed so as to foam the slurry in the slurry foaming method. That is, it does not mean that there are no bubbles at all, and a case where bubbles are partially generated is also included in the concept of “non-foaming”. By using a non-foamed slurry, calcium phosphate can be fixed more uniformly and densely on the skeleton surface of the organic porous material. Although it does not specifically limit as an organic porous body used in this process here, For example, polymer foams, such as a foaming polyurethane, can be used.
溶媒除去工程
溶媒除去工程では、前記含浸工程後、含浸させたスラリーに含まれる溶媒を除去する。ここで溶媒除去は、例えば、減圧下に配することや、加熱によって行なわれる。乾燥後のスラリー固形分の有機多孔体に対する添着量は、有機多孔体１００質量部に対して、１０００〜３０００質量部程度が好適である。
Solvent removal step In the solvent removal step, the solvent contained in the impregnated slurry is removed after the impregnation step. Here, the solvent is removed by, for example, arranging under reduced pressure or heating. The amount of the slurry solid content after drying is preferably about 1000 to 3000 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the organic porous body.
脱脂工程
脱脂工程では、前記溶媒除去工程後、材料が被覆された前記有機多孔体を加熱して、有機多孔体を除去する。脱脂工程に際に、有機多孔体は燃焼され二酸化炭素や水等といった気体となって外部に放出される。本工程により、有機多孔体が除去されるためリン酸カルシウム多孔体の骨格内に空洞が形成される。放出の際に、有機多孔体表面に形成されたリン酸カルシウムの皮膜の一部を破壊して、内部の有機多孔体に由来する気体が放出される。すなわち、有機多孔体が気化して除去されるために、リン酸カルシウム多孔体の骨格表面に当該気体が放出されるための孔が形成される。当該孔が先述のマイクロポアになると考えられる。また、当該孔は、リン酸カルシウム多孔体の骨格の内部に形成される空洞と連通しており、当該孔が形成されることにより、骨形成が好適に行なわれる。脱脂工程は、特に限定されないが、例えば、４００〜１０００℃で行なうことが好適である。
In the degreasing step, after the solvent removing step, the organic porous body covered with the material is heated to remove the organic porous body. In the degreasing process, the organic porous body is burned and becomes a gas such as carbon dioxide or water and is released to the outside. By this step, the organic porous body is removed, so that a cavity is formed in the skeleton of the calcium phosphate porous body. During the release, a part of the calcium phosphate coating formed on the surface of the organic porous body is destroyed, and the gas derived from the organic porous body inside is released. That is, since the organic porous body is vaporized and removed, a hole for releasing the gas is formed on the surface of the skeleton of the calcium phosphate porous body. It is considered that the hole becomes the aforementioned micropore. Moreover, the said hole is connected with the cavity formed inside the frame | skeleton of a calcium-phosphate porous body, and bone formation is performed suitably by forming the said hole. Although a degreasing process is not specifically limited, For example, it is suitable to perform at 400-1000 degreeC.
焼結工程
焼結工程では、前記脱脂工程後、リン酸カルシウムを焼結する。これにより、リン酸カルシウム多孔体骨格の強度が増す。尚、焼結工程は、前記脱脂工程と連続的に行なわれてもよい。焼結工程は、特に限定されないが、例えば、１０００〜２０００℃で行なうことが好適である。
In the sintering step , the calcium phosphate is sintered after the degreasing step. This increases the strength of the calcium phosphate porous body skeleton. In addition, a sintering process may be performed continuously with the said degreasing process. Although a sintering process is not specifically limited, For example, it is suitable to carry out at 1000-2000 degreeC.
生分解性補強材料被覆工程
生分解性補強材料被覆工程では、前記焼結工程後、生分解性補強材料の溶液を含浸させて、溶媒を除去する。これにより、リン酸カルシウム多孔体の骨格表面を生分解性補強材料により補強して、骨再生材料の強度を高める。
Biodegradable reinforcing material coating step In the biodegradable reinforcing material coating step, after the sintering step, the solution of the biodegradable reinforcing material is impregnated to remove the solvent. Thereby, the skeleton surface of the calcium phosphate porous body is reinforced by the biodegradable reinforcing material, and the strength of the bone regeneration material is increased.
ここで当該工程において、前記骨再生材料を生分解性補強材料の溶液中に含浸させた系を減圧にする工程を含むことが好適である。このような工程を経ることにより、リン酸カルシウム多孔体の内部に含まれる気泡が放出されて、多孔体内の奥にまで生分解性補強材料が行き渡るため、当該材料による被覆が十分に行なわれ高い機械的強度を有する骨再生材料を得ることができる。また、骨格内に形成されている空洞内にも生分解性補強材料が浸透し易くなるので、これにより更に高い機械的強度を有する骨再生材料を得ることができる。 In this step, it is preferable to include a step of reducing the pressure of a system in which the bone regeneration material is impregnated in a solution of the biodegradable reinforcing material. By passing through such a process, the bubbles contained in the porous calcium phosphate body are released, and the biodegradable reinforcing material is spread to the back of the porous body. A bone regeneration material having strength can be obtained. In addition, since the biodegradable reinforcing material can easily penetrate into the cavity formed in the skeleton, a bone regeneration material having higher mechanical strength can be obtained.
（製造例）
水１００重量部、β‐ＴＣＰ３８．３６重量部のスラリーを各ポリウレタンフォーム｛ＭＦ−８（製造例１）、ＭＦ−１３（製造例２）、ＭＦ−２０（製造例３）、ＭＦ−３０（製造例４）（尚、各ウレタンの数値は１インチ立方あたりの気泡の数を示す。）、サイズ６×６×５ｍｍ｝へ含浸させた。続いて５０℃にて乾燥した後、２５〜６００℃、５０℃／ｈの昇温スピードで加熱した後、６００〜１５００℃、２００℃／ｈの昇温スピードで加熱して、１５００℃で一時間保持することにより酸素雰囲気下で脱脂及び焼結工程を行なった。その後、自然冷却によって、常温に戻した。これにより、製造例１〜４に係るリン酸カルシウム多孔体を得ることができた（以下、各製造例に係るリン酸カルシウム多孔体を単に用いたウレタンの型により表す場合がある。具体的には、製造例１：「ＭＦ−８」、製造例２：「ＭＦ−１３」、製造例３：「ＭＦ−２０」、製造例４：「ＭＦ−３０」）。
(Production example)
Each polyurethane foam {MF-8 (Production Example 1), MF-13 (Production Example 2), MF-20 (Production Example 3), MF-30 (100 parts by weight of water and 38.36 parts by weight of β-TCP) Production Example 4) (The numerical value of each urethane indicates the number of bubbles per inch cubic), and impregnated into a size 6 × 6 × 5 mm}. Subsequently, after drying at 50 ° C., heating at a temperature increase rate of 25 to 600 ° C. and 50 ° C./h, followed by heating at a temperature increase rate of 600 to 1500 ° C. and 200 ° C./h, The degreasing and sintering steps were performed in an oxygen atmosphere by maintaining the time. Then, it returned to normal temperature by natural cooling. Thereby, the calcium-phosphate porous body which concerns on manufacture examples 1-4 was able to be obtained (Hereafter, it may represent with the type | mold of the urethane which used the calcium-phosphate porous body which concerns on each manufacture example. Specifically, a manufacture example. 1: “MF-8”, Production Example 2: “MF-13”, Production Example 3: “MF-20”, Production Example 4: “MF-30”).
上記製造例１〜４のリン酸カルシウム多孔体のそれぞれのセルサイズと空隙率を表１に示す。セルサイズ（セルの大きさ）は、ＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）にて１０個のセルの大きさ（直径）を測定した平均値である。
得られた各種リン酸カルシウム多孔体の構造および組成を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及びＸ線回折（ＸＲＤ）により確認した。得られた各種リン酸カルシウム多孔体の写真を図１に示し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を図２、図３に示す。このように図２の電子顕微鏡写真によれば、骨格表面にマイクロポアが形成されている様子が見て取れる。１０ｍｍ２あたりのＳＥＭ写真の視野における開口径が５０〜１００μｍの壁面マイクロポアの数を数えた。結果を表２に示した。 The structure and composition of the obtained various calcium phosphate porous bodies were confirmed by a scanning electron microscope (SEM) and X-ray diffraction (XRD). The photograph of the obtained various calcium-phosphate porous bodies is shown in FIG. 1, and a scanning electron microscope (SEM) photograph is shown in FIG. 2, FIG. Thus, according to the electron micrograph of FIG. 2, it can be seen that micropores are formed on the surface of the skeleton. The number of wall surface micropores having an aperture diameter of 50 to 100 μm in the field of view of the SEM photograph per 10 mm 2 was counted. The results are shown in Table 2.
図３は、ＭＦ２０の骨格表面を拡大した電子顕微鏡写真であり、この写真によれば骨格表面には、スラリーに含まれるリン酸カルシウム粒子が融着した集合体が形成されている様子が観察できる。また得られたリン酸カルシウム多孔体の骨格はβ−ＴＣＰであることを、Ｘ線回折（ＸＲＤ）により確認した（図４）。 FIG. 3 is an electron micrograph obtained by enlarging the skeleton surface of MF20. According to this photograph, it can be observed that aggregates formed by fusion of calcium phosphate particles contained in the slurry are formed on the skeleton surface. Further, it was confirmed by X-ray diffraction (XRD) that the skeleton of the obtained calcium phosphate porous material was β-TCP (FIG. 4).
製造例３のリン酸カルシウム多孔体を電界放射型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ、ＪＳＭ−７６００Ｆ，ＪＥＯＬ）に低加速電圧（１．０ｋＶ）で、金属などの被覆をしないで骨格の断面を観察した。図５は、当該リン酸カルシウム多孔体のＦＥ−ＳＥＭ写真である。これによれば、骨格の内部に空洞が形成されていることが観察できる。更に、当該リン酸カルシウムに対して、エポキシ樹脂を含浸させて固めた後に、当該試料をミクロトロームで切断出しをして当該切断をＦＥ−ＳＥＭにて観察した。図６は、当該断面の二次電子像である。二次電子像により表面の状態がわかり、当該写真で骨格内に空洞が形成されている様子が見て取れる。図７は、試料断面反射電子像である。反射電子では元素が重いほど濃く電子を出すので異なる組成であることがわかる。また、当該写真においても骨格内部に空隙が形成されていることは明らかである。電子顕微鏡写真から骨格内マイクロポアを任意に５個選択して内接円の平均直径を求めた。結果を以下の表３に示す。 The calcium phosphate porous material of Production Example 3 was observed with a field emission scanning electron microscope (FE-SEM, JSM-7600F, JEOL) at a low accelerating voltage (1.0 kV) and a cross section of the skeleton without coating with metal or the like. . FIG. 5 is an FE-SEM photograph of the calcium phosphate porous body. According to this, it can be observed that a cavity is formed inside the skeleton. Further, after the calcium phosphate was impregnated with an epoxy resin and hardened, the sample was cut out by a microtome, and the cut was observed with an FE-SEM. FIG. 6 is a secondary electron image of the cross section. The state of the surface can be seen from the secondary electron image, and it can be seen in the photograph that cavities are formed in the skeleton. FIG. 7 is a sample cross-section reflected electron image. It can be seen that the composition of the reflected electrons is different because the heavier the element, the deeper the electrons emitted. Also, it is clear that voids are formed inside the skeleton in the photograph. Five in-frame micropores were arbitrarily selected from the electron micrograph, and the average diameter of the inscribed circle was determined. The results are shown in Table 3 below.
（製造例５〜８）
次に、上記製造例１で得られたリン酸カルシウム多孔体を生分解性補強材料（ゼラチン）の水溶液中に浸して、系を減圧にして多孔体内に水溶液を十分に取り込ませた。その後、リン酸カルシウム多孔体を取り出し、溶媒を乾燥させて、生分解性補強材料が骨格表面に被覆されている製造例５に係るリン酸カルシウム多孔体を得た。製造例２（ＭＦ−１３）、製造例３（ＭＦ−２０）、製造例４（ＭＦ−３０）についても、同様にして製造例６（ＭＦ−１３）、製造例７（ＭＦ−２０）、製造例８（ＭＦ−３０）に係るリン酸カルシウム多孔体を得た。尚上記のカッコ内は使用した元のウレタンの種類を示す。
(Production Examples 5-8)
Next, the calcium phosphate porous body obtained in Production Example 1 was immersed in an aqueous solution of biodegradable reinforcing material (gelatin), and the aqueous solution was sufficiently taken into the porous body by reducing the system pressure. Then, the calcium phosphate porous body was taken out and the solvent was dried to obtain the calcium phosphate porous body according to Production Example 5 in which the biodegradable reinforcing material was coated on the skeleton surface. Production Example 2 (MF-13), Production Example 3 (MF-20), and Production Example 4 (MF-30) were similarly produced in Production Example 6 (MF-13), Production Example 7 (MF-20), A porous calcium phosphate according to Production Example 8 (MF-30) was obtained. The parentheses above indicate the type of the original urethane used.
これらの中で製造例１〜８に係る骨再生材料の圧縮強度を測定し、被覆前後の強度を比較した。ここで圧縮強度（変位２５％までの最大点）の測定方法は、島津オートグラフＡＧ−Ｘを用いて行った。試験結果を以下の表４に示した。当該結果によれば、被覆前後で、リン酸カルシウム多孔体の強度は２倍程度に向上している。また生分解性補強材料の被覆前の骨再生材料は、空隙率と圧縮強度との相関関係がほとんど観察されないが、生分解性補強材料を被覆すると空隙率と圧縮強度との相関関係が観察されるようになる。通常、空隙率が高くなればなるほど、多孔体の骨格部分の比率が小さくなるので、圧縮強度も低くなると考えられるが、生分解性補強材料を被覆しない場合、骨格を太くした場合、すなわち空隙率を低くした場合であっても、強度が上がらないが、生分解性補強材料を被覆することにより、空隙率を低くすることによって、高い圧縮強度を有する骨再生材料を得ることができる。尚、空隙率は、以下の式（１）により求めた。 Among these, the compressive strength of the bone regeneration material according to Production Examples 1 to 8 was measured, and the strength before and after coating was compared. Here, the compression strength (maximum point up to 25% of displacement) was measured using Shimadzu Autograph AG-X. The test results are shown in Table 4 below. According to the result, the strength of the calcium phosphate porous body is improved about twice before and after coating. In addition, the bone regeneration material before coating with the biodegradable reinforcing material shows little correlation between the porosity and the compressive strength, but when the biodegradable reinforcing material is coated, the correlation between the porosity and the compressive strength is observed. Become so. Usually, the higher the porosity, the smaller the ratio of the skeleton part of the porous body, so the compressive strength is also considered to be low, but when the biodegradable reinforcing material is not coated, the skeleton is thickened, that is, the porosity Even if it is made low, although intensity | strength does not increase, the bone regeneration material which has high compressive strength can be obtained by making a porosity low by coat | covering a biodegradable reinforcement material. In addition, the porosity was calculated | required by the following formula | equation (1).
また、被覆後の骨格表面の電子顕微鏡写真を図８に示した（図８（ａ）〜（ｃ））。これによれば、骨格表面にゼラチンが被覆されている様子が確認できる。また、実施例７（ＭＦ２０Ｚ）の骨格の断面写真（図８（ｃ））によれば、骨格内部の空洞にまでゼラチンが侵入している様子が確認できる。 Moreover, the electron micrograph of the frame | skeleton surface after coating | cover was shown in FIG. 8 (FIG. 8 (a)-(c)). According to this, it can be confirmed that the skeleton surface is coated with gelatin. Moreover, according to the cross-sectional photograph of the skeleton of Example 7 (MF20Z) (FIG. 8C), it can be confirmed that gelatin has penetrated into the cavity inside the skeleton.
（気体通過試験：圧力損失測定）
パームポロメーター（西華産業、ＣＦＰ−１１０−ＡＥＸＬ）を用いて、製造例５〜８の試料（厚さ４ｍｍ、直径８ｍｍの円柱形状（断面積５０ｍｍ２））における５０ｍｍ２面積当たりの空気の流量に対する圧力損失測定した。当該測定において、低い流量から高い流量へと流量を変化させて、各流量における圧力損失を測定した。この際の５０Ｌ／ｍｉｎの流量における圧力損失（ｋＰａ）の測定結果を表５に示した。
(Gas passage test: Pressure loss measurement)
Using a palm porometer (Nishihana Sangyo Co., Ltd., CFP-110-AEXL), 50 mm 2 of air per area in the samples of Production Examples 5 to 8 (thickness 4 mm, diameter 8 mm cylindrical shape (cross-sectional area 50 mm 2 )) The pressure loss with respect to the flow rate was measured. In the measurement, the flow rate was changed from a low flow rate to a high flow rate, and the pressure loss at each flow rate was measured. Table 5 shows the measurement result of the pressure loss (kPa) at a flow rate of 50 L / min.
（細胞付着性試験）
製造例３に係るリン酸カルシウム多孔体を用いて細胞付着試験を行なった。細胞にはＭＣ３Ｔ３Ｅ−１ｃｅｌｌ（骨芽細胞）を用いた。細胞数を１×１０５ｃｅｌｌに調整し、リン酸カルシウム多孔体に滴下播種して１０％ＦＢＳ、１％抗生物質添加の培地にて１昼夜培養を行った。その後ＳＥＭにて表面性状を観察した。リン酸カルシウム骨格表面のＳＥＭ写真を図９に示した。ＭＣ３Ｔ３Ｅ−１細胞が、リン酸カルシウム表面に付着して細胞突起を進展していた。これにより、リン酸カルシウム骨格表面に付着できることが明らかになり、更に、本発明に係るリン酸カルシウムは毒性を有しないことが確認できた。
(Cell adhesion test)
A cell adhesion test was performed using the calcium phosphate porous material according to Production Example 3. MC3T3E-1cell (osteoblast) was used as the cell. The number of cells was adjusted to 1 × 10 5 cells, seeded dropwise on a calcium phosphate porous material, and cultured for 1 day in a medium supplemented with 10% FBS and 1% antibiotics. Thereafter, the surface properties were observed by SEM. An SEM photograph of the surface of the calcium phosphate skeleton is shown in FIG. MC3T3E-1 cells were attached to the calcium phosphate surface and developed cell processes. Thereby, it became clear that it can adhere to the surface of a calcium phosphate skeleton, and it was further confirmed that the calcium phosphate according to the present invention has no toxicity.
（移植試験）
製造例４〜８に係るＭＦ８，１３，２０，３０の４種類のリン酸カルシウム多孔体に対してＦＧＦ２含有コラーゲンゲル溶液を注入し、ＦＧＦ２含有リン酸カルシウム多孔体を作製した。リン酸カルシウム多孔体ひとつあたりのＦＧＦ２含有量は１５μｇに設定した。
(Transplantation test)
The FGF2-containing collagen gel solution was injected into the four types of calcium phosphate porous bodies of MF8, 13, 20, 30 according to Production Examples 4 to 8, and FGF2-containing calcium phosphate porous bodies were produced. The FGF2 content per porous calcium phosphate was set to 15 μg.
実験動物は、体重３００〜３３０ｇのＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（１０週齢）７２匹を用いた。ペントバルビタールナトリウム０．６ｍｌ／ｋｇを用いた全身麻酔、及びエピネフリン（１／８００００）含有２％塩酸リドカインによる局所麻酔を施した後、頭蓋皮膚切開を行い頭蓋骨中央を露出、骨膜を剥離した。Ｎｏ．５ラウンドバーを用いて生理食塩水の注水下で矢状縫合部より前方に縦４ｍｍ、横４ｍｍの皮質骨除去を行った。生理食塩水で十分に洗浄した後、ＦＧＦ２含有リン酸カルシウム多孔体を移植し、皮膚弁を縫合して閉鎖創とし、縫合部にテトラサイクリン塩酸塩軟膏を塗布した。 As experimental animals, 72 Wistar male rats (10 weeks old) weighing 300 to 330 g were used. After general anesthesia using pentobarbital sodium 0.6 ml / kg and local anesthesia with 2% lidocaine hydrochloride containing epinephrine (1/80000), a craniocutaneous incision was performed to expose the center of the skull, and the periosteum was detached. No. Using a 5-round bar, cortical bone having a length of 4 mm and a width of 4 mm was removed in front of the sagittal suture part under injection of physiological saline. After thoroughly washing with physiological saline, an FGF2-containing calcium phosphate porous body was implanted, the skin flap was sutured to form a closed wound, and tetracycline hydrochloride ointment was applied to the sutured portion.
5週の観察期間終了後にジエチルエーテル吸引にて安楽死させ、頭蓋骨と周囲組織を一塊として採取し、１０％中性リン酸緩衝ホルマリン溶液にて固定、１０％ＥＤＴＡにて脱灰後、通法に従いパラフィン包埋を行った。その後、前頭面断で厚さ５μｍの連続切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行い、光学顕微鏡下にて組織学的観察を行った。結果を図１０〜図１５に示す。 After the observation period of 5 weeks, the animals were euthanized by inhalation with diethyl ether, the skull and surrounding tissues were collected as a lump, fixed with 10% neutral phosphate buffered formalin solution, decalcified with 10% EDTA, and the usual method Embedded in paraffin. Thereafter, a continuous section having a thickness of 5 μm was prepared by frontal section cutting, hematoxylin / eosin staining (HE staining) was performed, and histological observation was performed under an optical microscope. The results are shown in FIGS.
5週の観察期間ともに、骨形成がリン酸カルシウム多孔体の周囲や内側に頻繁に認められた（図１０）。残存するリン酸カルシウム多孔体の骨格（ロッド）は新生骨や血管、細胞の豊富な結合組織に被覆されており、すなわちリン酸多孔体の内部に組織が容易に侵入できることが明らかになった（図１１、１２）。異物巨細胞（マクロファージ様細胞）（矢印）が、β‐ＴＣＰ骨格の表面で観察された（図１２Ａ）。残っているβ‐ＴＣＰ骨格は新生骨及び／又は巨大細胞を含む細胞に富んだ結合組織に囲まれている（図１２Ｂ）。骨格は異物巨細胞によって吸収されている像が認められた（図１３）。また、β―ＴＣＰ骨格に血管（矢印）形成されていることが確認された（図１４Ａ）。また骨様組織がβ‐ＴＣＰ発泡体の骨格の内部で形成されていることが確認できた（図１４Ｂ）。なおＦＧＦ２を添加しない場合にも骨再生は認められたがその量は少なかった（図１５）。好中球やリンパ球などの炎症性細胞の浸潤はほとんど見られなかった。周囲の結合組織には活発な血管形成が認められる。 During the 5-week observation period, bone formation was frequently observed around and inside the porous calcium phosphate (FIG. 10). The remaining skeleton (rod) of the porous calcium phosphate is covered with connective tissue rich in new bones, blood vessels, and cells, that is, it is revealed that the tissue can easily enter the porous phosphate (FIG. 11). 12). Foreign body giant cells (macrophage-like cells) (arrows) were observed on the surface of the β-TCP skeleton (FIG. 12A). The remaining β-TCP scaffold is surrounded by cell-rich connective tissue including new bone and / or giant cells (FIG. 12B). The skeleton was observed to be absorbed by foreign body giant cells (FIG. 13). It was also confirmed that blood vessels (arrows) were formed in the β-TCP skeleton (FIG. 14A). It was also confirmed that the bone-like tissue was formed inside the skeleton of the β-TCP foam (FIG. 14B). Bone regeneration was also observed when FGF2 was not added, but the amount was small (FIG. 15). Infiltration of inflammatory cells such as neutrophils and lymphocytes was hardly observed. Active angiogenesis is observed in the surrounding connective tissue.
上記光学顕微鏡像を画像解析ソフトウェアを用いて新生骨面積、残存リン酸カルシウム多孔体面積を求めた。各測定値の統計学的な分析は。ＳＰＳＳ（登録商標）１１．０を用いて行い、有意水準を５％とした。結果を図１６に示す。骨面積とは観測した断面の骨の面積を意味する。また、高さとは、母床骨から垂直に骨の遠端までの距離を意味する。 The above-mentioned optical microscope image was used to determine the area of new bone and the remaining area of porous calcium phosphate using image analysis software. Statistical analysis of each measurement. SPSS (registered trademark) 11.0 was used, and the significance level was set to 5%. The results are shown in FIG. Bone area means the bone area of the observed cross section. The height means the distance from the mother bone to the distal end of the bone vertically.
ＭＦ８，１３，２０，３０（製造例４〜８）の４種類のリン酸カルシウム多孔体を移植した場合の骨再生面積はそれぞれ１．５４、２．７５、３．７８、１．２３ ｍｍ２であった。ＭＦ２０を移植した場合の骨再生面積はＭＦ８、ＭＦ３０よりも統計学的に有意に大きい値であった。またリン酸カルシウム多孔体の残存面積はＭＦ２０が最も少なく、骨形成を阻害することなく速やかに吸収していることが示唆された。 The bone regeneration areas when the four types of porous calcium phosphates of MF8, 13, 20, and 30 (Production Examples 4 to 8) were transplanted were 1.54, 2.75, 3.78, and 1.23 mm 2, respectively. It was. When MF20 was transplanted, the bone regeneration area was statistically significantly larger than MF8 and MF30. Moreover, it was suggested that the residual area of the calcium phosphate porous material had the smallest MF20, and it absorbed rapidly without inhibiting bone formation.
ＭＦ２０を用いるとＦＧＦ２の効果による骨増生が最も強く促進された。リン酸カルシウム多孔体は骨再生材料として適している可能性が示唆された。なかでもＭＦ２０は最適である可能性が明らかになった。 When MF20 was used, bone growth due to the effect of FGF2 was most strongly promoted. It was suggested that the calcium phosphate porous material may be suitable as a bone regeneration material. Among them, MF20 has become possible to be optimal.
本発明に係る骨再生材料は、例えば、骨充填材として使用される。特に、βリン酸三カルシウムを用いた場合、骨の欠陥部に本願発明に係る骨再生材料を充填することにより、当該材料が自家骨へと置換される生体吸収性骨再生材料として使用することができる。 The bone regeneration material according to the present invention is used, for example, as a bone filler. In particular, when β-tricalcium phosphate is used, it is used as a bioabsorbable bone regeneration material in which the bone defect material is filled with the bone regeneration material according to the present invention and the material is replaced with autologous bone. Can do.
Claims (15)
前記リン酸カルシウム多孔体が連通孔を有しており、
前記リン酸カルシウム多孔体は、パームポロメーターによる気体通過試験において、気体流量５０Ｌ／ｍｉｎにおける圧力損失が１００ｋＰａ以下であることを特徴とする、骨再生材料。 In a bone regeneration material containing a calcium phosphate porous body whose skeleton is composed of a member mainly composed of calcium phosphate,
The calcium phosphate porous body has communication holes;
The said calcium-phosphate porous body is a bone regeneration material characterized by the pressure loss in gas flow rate 50L / min being 100 kPa or less in the gas passage test by a palm porometer.
前記含浸工程後、含浸させたスラリーに含まれる溶媒を除去する溶媒除去工程と、
前記溶媒除去工程後、加熱して前記有機多孔体を取り除く脱脂工程と、
前記脱脂工程後、リン酸カルシウムを焼結する焼結工程と、
を有することを特徴とする、骨再生材料の製造方法。 An impregnation step of impregnating an organic porous body with a slurry in which calcium phosphate is dispersed;
After the impregnation step, a solvent removal step of removing the solvent contained in the impregnated slurry;
A degreasing step of removing the organic porous body by heating after the solvent removing step;
After the degreasing step, a sintering step of sintering calcium phosphate;
A method for producing a bone regeneration material, comprising:
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