JP2011515493A - 抗原受容体により誘導されるＮＦ−κＢの活性化の阻害剤 - Google Patents

Abstract

抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化の選択的阻害薬を同定する方法、並びにそれら阻害剤の１つ又は複数を有する組成物、及びそれら阻害剤の使用方法を提供する。
【選択図】図２

Description

関連出願

本出願は、２００８年３月２７日にJohn
C. Reedらにより出願された「INHIBITORS OF antigen receptor-induced
NF-κB activation」と題する米国特許仮出願第６１／０４０，０６９号の優先権を主張するものであり、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

政府の権利に関する宣言

本発明は、少なくとも部分的には、アメリカ合衆国政府からの助成金（国立衛生研究所（ＮＩＨ）助成金１Ｘ０１ ＭＨ０７７６３３−０１）により支援された。合衆国政府は、本発明に関する特定の権利を有する。

本発明は、医薬品の分野に関し、具体的には抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化を選択的に阻害する化合物、それらを同定するためのハイスループットアッセイ、及びそれらの使用方法の分野に関する。

転写因子である核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）ファミリーのメンバーは、宿主防御、免疫応答、炎症、及び癌を含む多くの生理学的及び病理学的プロセスの制御に重大な役割を果たしている。哺乳動物では、ＮＦ−κＢ活性化に結びつく経路が少なくとも９つ解明されており、それらには以下が含まれる：（ｉ）ＮＦ−κＢ−アルファ（ＩκＢ−ａ）の阻害剤の分解及びｐ６５−５０ＮＦ−κＢヘテロ二量体の放出を伴う、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び多くのＴＮＦファミリーサイトカイン受容体により誘導される「古典的」経路；（ｉｉ）ＮＦ−κＢファミリーメンバーＲｅｌＢの好ましいヘテロ二量体化パートナーであるｐ５２を産生するｐ１００ ＮＦ−κＢ２タンパク質分解プロセシングを伴う、選択されたＴＮＦファミリー受容体（例えば、ＣＤ４０、リンホトキシン−β受容体、ＢＡＦＦ受容体）により活性化される「代替」経路；（ｉｉｉ）ＴＩＲドメイン含有アダプター及びＩＲＡＫファミリープロテインキナーゼを伴う、ＮＦ−κＢ誘導用のトール様受容体経路；（ｉｖ）ウイルスに対する宿主防御に重要な、Ｈｅｌｉｃａｒｄ／Ｍｄａ５、ＲＩＧ−１、及びミトコンドリアタンパク質ＭＡＶＳを伴う、外来性ＲＮＡにより活性化される経路；（ｖ） ｐ５３の標的であるＰＩＤＤを伴うＤＮＡ損傷経路；（ｖｉ）微生物由来分子に応答し、多量体化してＮＦ−κＢ活性化タンパク質複合体を形成するサイトゾルタンパク質であるＮＬＲ／ＮＯＤファミリータンパク質；（ｖｉｉ）ＴＡＢ／ＴＡＫ複合体に結合してＮＦ−κＢ活性化を刺激するＸ連鎖アポトーシスタンパク質阻害剤（ＸＩＡＰ）を含む、アポトーシスタンパク質（ＩＡＰ）の阻害剤；（ｖｉｉｉ）カスパーゼ動員ドメイン含有膜結合型グアニル酸キナーゼタンパク質１（ＣＡＲＭＡ１、Ｂｉｍｐ３）、Ｂｃｌ−１０、及びＭＡＬＴ（パラカスパーゼ）、カスパーゼ８、並びに他のタンパク質を含む相互作用タンパク質のカスケードを伴う、ＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ６との相互作用によるＮＦ−κＢ活性化並びにＢ細胞及びＴ細胞抗原受容体により誘導される経路を駆動する、ｃＩＡＰ２及び粘膜関連リンパ組織１（ＭＡＬＴ１）の部分で構成される腫瘍形成性融合タンパク質。これら９つのＮＦ−κＢ活性化経路が収束するコア事象は、ＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β、及び骨格タンパク質ＩＫＫ−γ／ＮＥＭＯの複合体で典型的に構成されるκＢキナーゼ（ＩＫＫ）の阻害剤の活性化である。「代替的」ＮＦ−κＢ経路以外の全てでは、ＩＫＫ活性化は結果としてＩκＢ−αのリン酸化をもたらし、このタンパク質をユビキチン化及びプロテアソーム依存性破壊の標的とし、したがってｐ６５／ｐ５０ ＮＦ−ＩκＢヘテロ二量体が細胞質ゾルのＩκＢ−αから放出され、それらが核内に移行して種々の標的遺伝子の転写を開始することが可能になる。

抗原受容体により活性化されるＮＦ−κＢ経路は、後天性（先天性に対して）免疫に重要であり、Ｔリンパ球及びＢリンパ球活性化、増殖、生存、及びエフェクター機能に寄与する。リンパ球におけるＮＦ−κＢ活性化の調節異常は、自己免疫、慢性炎症、及びリンパ性悪性疾患の発症に寄与する場合がある。抗原受容体関連ＮＦ−κＢ活性化経路には、ＣＡＲＭＡファミリータンパク質、Ｂｃｌ−１０、ＭＡＬＴ（パラカスパーゼ）、ＴＲＡＦ６、Ｕｂｃ１３、及びカスパーゼ８を最低限含むアダプター及びシグナル伝達タンパク質のカスケードが伴う。この複合体の形成は、ＣＡＲＭＡタンパク質のＰＫＣ媒介性リン酸化により開始される。Ｔ細胞及びＢ細胞では、この経路は、それぞれプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）シータ及びＰＫＣベータにより開始され、恐らくはＩＫＫ−γの６３位リジン結合ポリユビキチン化を伴う機序によるＩＫＫ活性化に最終的には結びつく。したがって、ＮＦ−κＢ活性化の該抗原受容体経路は、プロテインキナーゼ、すなわちそれぞれＰＫＣ及びＩＫＫの活性化により開始及び終結する。ＰＫＣで活性化されるＮＦ−κＢ活性化機序には、ｃ−ＦＬＩＰとヘテロ二量体を形成し、ｃ−ＦＬＩＰのタンパク質分解プロセシングを誘導することが明らかであるカスパーゼ８も寄与している。ＩＫＫは、創薬に有望な論理的標的であるが、ＩＫＫの化学阻害は、既知のＮＦ−κＢ活性化経路を全て抑制し、したがって先天性免疫を妨害せず同時にリンパ球応答を阻害するのに必要な選択性が欠如しており、したがって高い感染リスクを伴う広範な免疫抑制を引き起こす。

本明細書で開示されるのは、式Ｉ又は式ＩＩの化合物
又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグであり、式中、
Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
ｎが０〜１０の整数である化合物、
及びそれを含む医薬組成物である。

本明細書では、抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化を選択的に阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）ＮＦ−κＢ応答性プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子で形質移入した細胞を含む水溶液を準備すること；（ｂ）この溶液に試験化合物を添加すること；（ｃ）この溶液にＮＦ−κＢを誘導する刺激を加えること；及び（ｄ）該試験化合物が該刺激に対する細胞応答を低減するかどうかを決定することを含む方法も開示される。幾つかの実施形態では、該試験化合物は、本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの化合物である。

加えて、本明細書では、細胞の抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化を選択的に阻害する方法であって、本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの化合物と該細胞を接触させることを含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、該細胞は、そのような阻害を必要性とする対象体内にある。

さらに、本明細書では、対象体の抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化に関連する疾患を治療する方法であって、その必要性のある対象体を同定することと、本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの化合物を対象体に投与又は対象体と接触させることとを含む方法が開示される。

抗原受容体誘導性ＮＦ−κＢ経路の選択的阻害薬のスクリーニング及びカウンタースクリーニングのフローチャートである。合計１１４，８８９個の化合物をスクリーニングした。５３，２８０個の市販化合物のスクリーニング（左の列）から、５１９ヒットを取得し、そのうち２４８個を、同じ一次スクリーニングアッセイを使用して再確認した。次に、同じＨＥＫ２９３−ＮＦ−κＢレポーター遺伝子細胞系をＴＮＦで刺激し、阻害しなかった４６個の化合物が残った。これら化合物のうち４個が細胞毒性活性を示し、４２個の化合物が残り、そのうちの１１個は、新しい在庫品を注文して試験した際に活性を示した。これら１１個の活性化合物からの１つのヒットであるＣＩＤ−２８５８５２２は、ＨＥＫ２９３細胞系によるＰＭＡ／イオノマイシン誘導性のサイトカインＩＬ−８産生を阻害した。その後、ＣＩＤ−２８５８５２２を特徴付けた（右の列）。ＰＭＡをＰＤＢに置換して、代替的ＰＫＣ活性化因子の抑制を確認した。経路選択性を、ＨＥＫ２９３細胞から始まる一団の細胞系を使用して評価し、これらの細胞では、残りのＮＦ−κＢ活性化経路の各々を刺激し、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性のみの阻害が示された（パネル１）。この後で、種々の細胞系又は初代培養脾細胞を使用して一団の二次アッセイ（パネル２）を行って、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子活性（「Ｌｕｃ」）、サイトカイン分泌、及び３Ｈチミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を含む種々のエンドポイントを測定し、その後、ＴＣＲ（ジャーカット細胞、脾細胞には抗ＣＤ３／ＣＤ２８）、ＢＣＲ（脾細胞には抗ＩｇＭ）、ＴＬＲ（ＴＨＰ．１単球にはＬＰＳ）、「代替」経路によりシグナル伝達するＴＮＦＲ（ヒーラ細胞にはＬＴβＲ抗体）、及びＮＬＲ（それぞれＭｃＦ−７乳癌及びＴＨＰ．１単球では、ＮＯＤ１活性化にはγＴｒｉＤＡＰ、及びＮＯＤ２活性化にはムラミル−ジペプチド［ＭＤＰ］）のアゴニストを含む、ＮＦ−κＢシグナル伝達の特異的上流活性化因子の種々の誘導因子で刺激した。ＣＩＤ−２８５８２２は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した脾細胞及び抗ＩｇＭで刺激した脾細胞のみを阻害した。種々のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを使用したが、阻害は示されず、その後ＡＴＰの競合的置換を使用してキノームスクリーニングを行った。 ＣＩＤ−２８５８５２２が、ＰＭＡ／Ｉｏｎ及びＰＤＢｕで誘導したＮＦκＢ活性化及びＩＬ−８産生を阻害することを示す図である。（Ａ）２つのヒット化合物、ＣＩＤ−２８５８５２２（左）及びＣＩＤ−２９９８２３７（右）の構造が示されている；（Ｂ、Ｃ）２９３−ＮＦ―κＢ−ｌｕｃ細胞を、種々の濃度のＣＩＤ−２８５８５２２（Ｂ）又はＣＩＤ−２９９８２３８７（Ｃ）のいずれかで２時間前処理し、その後ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）又はＰＭＡ／イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ；５ｎｇ／ｍＬ）で１６時間刺激した。ルシフェラーゼ活性を測定し、データを、ＤＭＳＯのみで処理した対照に対するパーセントとして表した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。（Ｄ）２９３−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ細胞を、種々の濃度のＣＩＤ−２８５８５２２又はＣＩＤ−２９９８２３７で２時間前処理し、その後ＰＭＡ／イオノマイシンで１６時間刺激した。培地へのＩＬ−８放出を測定し、データを、ＤＭＳＯのみで処理した対照培養に対するパーセントとして表した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。（Ｅ）２９３−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ細胞を、ＣＩＤ−２８５８５２２で前処理し、その後ＰＤＢｕで１６時間刺激し、ＩＬ−８産生及びＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性を上記のように測定した。（Ｆ）２９３−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ細胞を、種々の濃度のＣＩＤ−２８５８５２２又は１μＭのＰＫＣ阻害剤（ビスインドリルマレイミドＩ）で２時間前処理し、その後ＰＭＡ／イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ）で２時間刺激し、その後核抽出物（１０μｇのタンパク質）中でのｐ６５−ＤＮＡ結合活性を測定し、データを未刺激細胞に対する増加倍数として表した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。 ＣＩＤ−２８５８５２２が、他のＮＦκＢ誘導因子で誘導したＮＦκＢ経路を阻害しないことを示す図である。図３（Ａ〜Ｆ）：ＨＥＫ２９３−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ細胞を、ＣＩＤ−２８５８５２２（４μＭ）、ＩＫＫ阻害剤ＢＭ−３３５５４１（１０μＭ）、又はＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩ（１μＭ）で２時間前処理し、その後ＣＤ４／ＴＬＲ４（Ａ）、ＣＤ４０（Ｂ）、ＮＯＤ１（Ｃ）、ＮＯＤ２（Ｄ）、ｃＩＡＰ２−ＭＡＬＴ１（Ｅ）、又はＸＩＡＰ及びＴＡＢ（Ｆ）をコードするプラスミドで、又は対照としてｐｃＤＮＡで形質移入した（化合物を除去しなかった）。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を測定し、データを、未刺激細胞に対する増加倍数として表した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。（Ｇ〜Ｈ）：ＨＥＫ２９３−ＮＦ―κＢ−ｌｕｃ細胞を、ＣＩＤ−２８５８５２２（４μＭ）、又はＩＫＫ阻害剤ＢＭ−３３５５４１（１０μＭ）で２時間前処理し、その後２μＭのドキソルビシン（Ｇ）又は１６μＭのレチノイン酸（Ｈ）と共に培養した。４８時間後、ルシフェラーゼ活性を上記のように測定した。 ＣＩＤ−２８５８５２２が、ジャーカット細胞で、抗ｃｄ３／ｃｄ２８又はＰＭＡ／Ｉｏｎにより誘導したＩＬ−２産生を阻害することを示す図である。図４Ａ：ジャーカットＴ細胞を、抗ｃｄ３／抗ｃｄ２８／抗マウスＩｇＧ（６μｇ／ｍＬ）又はＰＭＡ／Ｉｏｎ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、培地中のＩＬ−２産生をＥＬＩＳＡキットにより測定した。図４Ｂ〜Ｅ：ジャーカットＴ細胞を、ＩＫＫ阻害剤（Ｂ）、ＰＫＣ阻害剤（Ｃ）、ＣＩＤ−２８５８５２２（Ｄ）で２時間前処理し、その後、抗ｃｄ３／抗ｃｄ２８／抗マウスＩｇＧ（６μｇ／ｍＬ）又はＰＭＡ／Ｉｏｎ（１０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理し、培地中のＩＬ−２産生をＥＬＩＳＡキットにより測定した；Ｅでは、ジャーカット細胞をＣＩＤ−２８５８５２２、ＰＫＣ阻害剤、及びＩＫＫ阻害剤で２４時間処理し、細胞生存率をＡＴＰｌｉｔｅキットにより測定した。 ＣＩＤ−２８５８５２２が、抗ＩｇＭ誘導性ＮＦ−κＢ活性化及びβリンパ球の増殖を阻害することを示す図である。（Ａ）単離したマウス初代脾細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（各々、０．３μｇ／ｍＬ）又は抗ＩｇＭ（３μｇ／ｍＬ）と共に４８時間培養し、その後１μＣｉの３Ｈチミジンを１２時間添加してＤＮＡへの取込みを測定し、データを、上記のように未刺激細胞に対する増加倍数として表した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。（Ｂ〜Ｄ）初代脾細胞を、ＩＫＫ阻害剤ＢＭ−３３５５４１（Ｂ）、ＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩ（Ｃ）、又はＣＩＤ−２８５８５２２（Ｄ）で２時間前処理し、その後、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（０．３μｇ／ｍＬ）又は抗ＩｇＭ（３μｇ／ｍＬ）で４８時間刺激した。１μＣｉの３Ｈチミジンを１２時間添加し、ＤＮＡへの取込みを測定し、データを、ＤＭＳＯで処理した対照細胞に対する阻害パーセントとして表した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。（Ｅ）ヒトＣＬＬ Ｂ細胞試料（ｎ＝３）を、化合物ＣＩＤ−２８５８５２２又は不活性類似体ＭＬＳ−０２９２１２３と共に１２時間培養し、その後、ビオチン抗ＩｇＭ（１０μｇ／ｍＬ）で２４時間刺激した。ＴＲＡＦ１及びβ−アクチンのレベルをイムノブロッティングにより評価し、デンシトメトリーにより定量化し、ＴＲＡＦ１の結果を、β−アクチンに対して正規化した後で対照細胞と比較して報告した（平均±ＳＤ）。（Ｆ）ヒトＣＬＬ Ｂ細胞を、種々の濃度のＣＩＤ−２８５８２２又はその不活性類似体ＭＬＳ−０２９２１２３で１２時間処理し、その後ビオチン抗ＩｇＭ（１０μｇ／ｍＬ）及びアビジン（１０μｇ／ｍＬ）で１２時間処理した。その後、核抽出物を調製し、ｐ６５−ＤＮＡ結合活性を測定した（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。 ＣＩＤ−２８５８５２２が、ＩＫＫキナーゼ活性又はＰＫＣキナーゼ活性を阻害しないことを示す図である。ＣＩＤ−２８５８５２２（８μＭ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏＩＫＫベータ（Ａ）、ＰＫＣベータ（Ｂ）、又はＰＫＣシータ（Ｃ）キナーゼアッセイで、キットを使用して試験した。ＳＴＳ（０．５μＭ）、ＩＫＫ阻害剤（１０μＭ）、及びＰＫＣ阻害剤（１μＭ）を陽性対照として使用した。 ＣＩＤ−２８５８５２が、ＰＫＣ活性化因子で誘導したＩＫＫβリン酸化を阻害することを示す図である。（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞を０．５％ＦＢＳ培地中で２４時間培養し、その後ＣＩＤ−２８５８５２２（４μＭ）又はＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩ（１μＭ）で２時間処理し、その後ＰＭＡ／イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ；５ｎｇ／ｍＬ）で２時間処理した。細胞溶解産物を、抗ＣＡＲＭＡ１抗体を使用して免疫沈降にかけ、抗ホスホＣＡＲＭＡ１抗体又は抗ＣＡＲＭＡ１抗体を用いてイムノブロッティングにより分析した。（Ｂ〜Ｅ）カスパーゼ８（ｃｙｓ２８７ａｌａ）（Ｂ）、ＨＡ−ＩＫＫ−γ（Ｃ）、ＨＡ−ＴＡＫ１（Ｄ）、及びＴＲＡＦ６（Ｅ）を含む種々の他のタンパク質をコードするプラスミドと併用して、ｍｙｃ−ＣＡＲＭＡ１をコードするプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞を形質移入した。３６時間後、細胞を０．５％ＦＢＳ培地中で１２時間培養し、その後ＣＩＤ−２８５８５２２（４μＭ）又はビスインドリルマレイミドＩ（１μＭ）で２時間処理し、その後ＰＭＡ／イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ；５ｎｇ／ｍＬ）で２時間処理した。抗ｍｙｃ抗体を使用して細胞溶解産物を免疫沈降し、抗カスパーゼ８抗体（Ｂ）、抗ＨＡ抗体（Ｃ、Ｄ）、又は抗ＴＲＡＦ６抗体（Ｅ）を使用したイムノブロッティングにより分析した。（Ｆ）ＨＥＫ２９３細胞を、ＣＩＤ−２８５８５２２（４μＭ）又はＰＫＣ阻害剤（１μＭ）で処理し、その後ＰＭＡ／イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ；５ｎｇ／ｍＬ）で２時間処理した。細胞溶解産物をタンパク質含量に対して正規化し、抗ＦＬＩＰ及び抗アルファチューブリン抗体を使用したイムノブロッティングにより分析した。（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞を０．５％ＦＢＳ培地中で２４時間培養し、その後ＣＩＤ−２８５８５２２（４μＭ）又はその不活性類似体ＭＬＳ−０２９２１２３（４μＭ）又はＰＫＣ阻害剤（１μＭ）で処理し、その後ＰＭＡ／イオノマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ；５ｎｇ／ｍＬ）又はＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）で５分間処理した。抗ＩＫＫ−βを使用して細胞溶解産物を免疫沈殿し、抗ホスホＩＫＫ−β抗体又は抗ＩＫＫ−β抗体（負荷対照として）を使用したイムノブロッティングにより分析した。タンパク質の近似的分子量は全て、キロダルトンで示されている。

本発明は、抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化を選択的に阻害する化学化合物を同定するための化学生物学的戦略を提供する。本明細書には、他のＮＦ−κＢ活性化経路を阻止せずにＰＫＣとＩＫＫとの間のＮＦ−κＢ活性化経路を阻害する２−アミノベンズイミダゾール化合物も記載されている。したがって、これら化合物は、ＰＫＣで開始される及び抗原受容体で開始されるＮＦ−κＢ誘導経路を調査するための唯一の研究ツールを提供する。本化合物は、自己免疫及び幾つかのタイプのリンパ性悪性疾患に有用な経路選択的薬物でもある。

定義
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が、その酸性塩又は塩基性塩を作製することにより修飾されている開示化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機塩又は有機酸塩、及びカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩には、従来の無毒性塩、又は例えば無毒性の無機酸又は有機酸から形成される親化合物の第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような従来の無毒性塩には、以下のものが含まれる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、及び硝酸など無機酸に由来するもの；及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、及びイセチオン酸などの有機酸から調製される塩。

本発明に有用な化合物の薬学的に許容される塩は、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から従来の化学的方法により合成することができる。一般的に、そのような塩は、水中で又は有機溶媒中で又はその２つの混合液中で、遊離酸形態又は遊離塩基形態のこれら化合物を、化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることにより調製することができ、一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルなどの非水性媒質が好ましい。好適な塩のリストは、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed.,
Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985)に見出されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

「薬学的に許容される」という語句は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、又は他の問題を起こさずにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適であるか、又は合併症が合理的なリスク／ベネフィット比と釣合っている化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を指すために使用される。

本明細書で開示される化合物の一方のジアステレオマーは、他方のジアステレオマーと比較して優れた活性を示す場合がある。必要に応じて、ラセミ物質の分離は、キラルカラムを使用したＨＰＬＣにより、又はカンフォン酸クロリド（camphonic
chloride）などの分割剤を使用する分割より達成することができる。式Ｉ又は式ＩＩのキラル化合物は、キラル触媒又はキラルリガンドを使用して直接合成することもできる。

「治療上有効量」は、例えば、宿主の疾患又は障害を治療又は予防するか、又は疾患若しくは障害の症状を治療するための、本発明に有用な化合物の量又は特許請求した化合物の組合せの量を含むことを目的としている。化合物の組合せは、相乗効果的組合せが好ましい。相乗作用は、併用して投与した際の化合物の効果が、単一の作用剤として単独で投与した際の化合物の相加効果より大きい場合に生じる。一般的に、相乗効果は、最適濃度以下の化合物で最も明白に実証される。相乗作用は、個々の成分と比較して化合物の組合せの細胞毒性がより低く、活性が高く、又は他の幾つかの有益な効果があるという点で見つかる。

本明細書で使用される場合、「治療している」又は「治療する」は、（ｉ）病理学的状態が生じるのを防止すること（例えば、予防）；（ｉｉ）病理学的状態を阻害すること又はその進行を停止させること；（ｉｉｉ）病理学的状態を緩和すること；及び／又は病理学的状態に関連する症状を軽減させることを含む。

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本発明の方法により治療される生物を指す。そのような生物には、ヒトなどの哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。本発明の状況では、「対象体」という用語は、一般的に、癌の治療（例えば、本発明の化合物及び随意に１つ又は複数の抗癌剤の投与）を摂取することになる個体又は摂取した固体を指す。

「安定した化合物」及び「安定した構造」とは、反応混合物から有用な程度の純度への単離及び有効な治療薬への製剤化に耐えるのに十分なほど堅牢な化合物を指すことが意図されている。安定した化合物のみが本発明により企図される。

「置換された」とは、「置換された」を使用した表現で指定された原子の１つ又は複数の水素が、指定された原子の通常の原子価が超過しておらず、置換の結果として安定した化合物がもたらされる場合に、指定された基（複数可）から選ばれたものと交換されることを指すことを目的としている。好適な指定された基には以下のものが含まれる：例えば、アルキル、アルケニル、アルキリデニル（alkylidenyl）、アルケニリデニル（alkenylidenyl）、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。置換基が、ケト（つまり、＝Ｏ）又はチオキソ（つまり、＝Ｓ）基である場合、その原子の２つの水素が置換される。

「中断された」とは、「中断された」を使用した表現で指定された２つ以上の隣接する炭素原子及びそれらに結合している水素原子（例えば、メチル（ＣＨ_３）、メチレン（ＣＨ_２）、又はメチン（ＣＨ））の間に、指定された原子の各々の通常の原子価が超過しておらず、中断の結果として安定した化合物がもたらされる場合に、指定された基（複数可）から選択されたものが挿入されることを指すことを目的としている。そのような好適な指定された基には、例えば、非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルホニル（ＳＯ）、又はスルホキシド（ＳＯ_２）が含まれる。

ラジカル、置換基、及び範囲に関して下記に列挙されている具体的な及び好ましい値は例示のためだけであり、それらは、ラジカル及び置換基に関する他の定義された値又は定義された範囲内の他の値を除外しない。

「アルキル」は、第一級、第二級、第三級、又は環式の炭素原子を含有するＣ_１〜Ｃ_１８炭化水素を指す。例としては、メチル（Ｍｅ、−ＣＨ_３）、エチル（Ｅｔ、−ＣＨ_２ＣＨ_３）、１−プロピル（ｎ−Ｐｒ、ｎ−プロピル、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−プロピル（ｉ−Ｐｒ、ｉ−プロピル、−ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、１−ブチル（ｎ−Ｂｕ、ｎ−ブチル、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−メチル−１−プロピル（ｉ−Ｂｕ、ｉ−ブチル、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２−ブチル（ｓ−Ｂｕ、ｓ−ブチル、−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−Ｂｕ、ｔ−ブチル、−Ｃ（ＣＨ_３）_３）、１−ペンチル（ｎ−ペンチル、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）、２−メチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３−メチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３−メチル−１−ブチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２−メチル−１−ブチル（−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、１−ヘキシル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３−ヘキシル（−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３））、２−メチル−２−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、４−メチル−２−ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３−メチル−３−ペンチル（−Ｃ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）、２−メチル−３ペンチル（−ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２，３−ジメチル−２−ブチル（−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３，３−ジメチル−２−ブチル（−ＣＨ（ＣＨ_３）Ｃ（ＣＨ_３）_３）である。

該アルキルは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。該アルキルは、随意に、１つ又は複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）、又はスルホキシド（ＳＯ_２）で中断することができる。加えて、該アルキルは、随意に、少なくとも部分的に不飽和であってもよく、それによりアルケニルを提供する。

「アルケニル」は、少なくとも１つの不飽和部位、つまり炭素−炭素、ｓｐ^２二重結合を有する第一級、第二級、第三級、又は環式の炭素原子を含有するＣ_２〜Ｃ_１８炭化水素を指す。例には、エチレン又はビニル（−ＣＨ＝ＣＨ_２）、アリル（−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、シクロペンテニル（−Ｃ_５Ｈ_７）、及び５−ヘキセニル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）が含まれるが、これらに限定されない。

該アルケニルは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。加えて、該アルケニルは、随意に、１つ又は複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）、又はスルホキシド（ＳＯ_２）で中断することができる。

「アルキリデニル」は、第一級、第二級、第三級、又は環式の炭素原子を含有するＣ_１〜Ｃ_１８炭化水素を指す。例としては、メチリデニル（＝ＣＨ_２）、エチリデニル（＝ＣＨＣＨ_３）、１−プロピリデニル（＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_３）、２−プロピリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）_２）、１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−メチル−１−プロピリデニル（＝ＣＨＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、１−ペンチル（＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２）、３−メチル−２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、３−メチル−１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２−メチル−１−ブチリデニル（＝ＣＨＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、１−ヘキシリデニル（＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、２−ヘキシリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３）、３−ヘキシリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_２ＣＨ３）（ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３））、３−メチル−２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３）、４−メチル−２−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２−メチル−３−ペンチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_２ＣＨ_３）ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、及び３，３−ジメチル−２−ブチリデニル（＝Ｃ（ＣＨ_３）Ｃ（ＣＨ_３）_３）である。

該アルキリデニルは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。加えて、該アルキリデニルは、随意に、１つ又は複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）、又はスルホキシド（ＳＯ_２）で中断することができる。

「アルケニリデニル」は、少なくとも１つの不飽和部位、つまり炭素−炭素、ｓｐ^２二重結合を有する第一級、第二級、第三級、又は環式の炭素原子を含有するＣ_２〜Ｃ_２炭化水素を指す。例には、アリリデニリル（allylidenyl）（＝ＣＨＣＨ（ＣＨ_２）及び５−ヘキセニリデニル（5-hexenylidenyl）（＝ＣＨＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）が含まれるが、これらに限定されない。

該アルケニリデニルは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。加えて、該アルケニリデニルは、随意に、１つ又は複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）、又はスルホキシド（ＳＯ_２）で中断することができる。

「アルキレン」は、炭素原子が１〜１８個の飽和した分岐鎖状又は直鎖状又は環式の炭化水素ラジカルを指し、親アルカンの同一又は異なる炭素原子から２個の水素原子を除去することにより誘導された２つの一価ラジカル中心を有する。典型的なアルキレンラジカルには、メチレン（−ＣＨ_２−）１，２−エチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２−）、１，３−プロピル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−）、及び１，４−ブチル（−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ２−）などが含まれるが、これらに限定されない。

該アルキレンは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。加えて、該アルキレンは、随意に、１つ又は複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）、又はスルホキシド（ＳＯ_２）で中断することができる。さらに、該アルキレンは、随意に、少なくとも部分的に不飽和であってもよく、それによりアルケニレンを提供する。

「アルケニレン」は、炭素原子が２〜１８個の不飽和の分岐鎖状又は直鎖状又は環式の炭化水素ラジカルを指し、親アルケンの同一又は２個の異なる炭素原子から２個の水素原子を除去することにより誘導された２つの一価ラジカル中心を有する。典型的なアルケニレンラジカルには、１，２−エチレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）が含まれるが、これに限定されない。

該アルケニレンは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。加えて、該アルケニレンは、随意に、１つ又は複数の非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、スルホニル（ＳＯ）、又はスルホキシド（ＳＯ_２）で中断することができる。

「アルコキシ」という用語は、アルキル−Ｏ−基を指し、アルキルは本明細書で定義されている。好ましいアルコキシ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、及び１，２−ジメチルブトキシなどが含まれる。

該アルコキシは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルキリデニル、アルケニリデニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及びＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。

「アリール」という用語は、単環（例えば、フェニル）又は多重縮合（融合）環を有する、炭素原子が６〜２０個の不飽和芳香族炭素環基を指し、そこでは、少なくとも１つの環が芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、又はアントリル）である。好ましいアリールには、フェニル及びナフチルなどが含まれる。

該アリールは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及びＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。

「シクロアルキル」という用語は、単環式の環又は多重縮合環を有する、炭素原子が３〜２０個の環式アルキル基を指す。そのようなシクロアルキル基には、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロオクチルなどの単環式構造、又はアダマンタニルなどの多重環式構造が含まれる。

該シクロアルキルは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及びＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。

該シクロアルキルは、随意に、少なくとも部分的に不飽和であってもよく、それによりシクロアルケニルを提供する。

「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。

「ハロアルキル」は、本明細書で定義されている１〜４個のハロ基で置換された本明細書で定義されているアルキルを指し、ハロ基は同一でもよく又は異なっていてもよい。代表的なハロアルキル基には、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、及び３−ブロモ−６−クロロヘプチルなどが含まれる。

「へテロアリール」という用語は、本明細書では、１、２、又は３個の芳香族環を含有し、芳香族環に少なくとも１個の窒素、酸素、又は硫黄原子を含有する単環式、二環式、又は三環式の環系と定義され、例えば、１つ又は複数の及び特に１〜３個の、ハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、及びアルキルスルホニルのような置換基で置換されていてもよく又は置換されていなくともよい。へテロアリール基の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、４ｎＨ−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンナオリニル（cinnaolinyl）、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル（imidizolyl）、インダゾリル、インドリシニル（indolisinyl）、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、ナフト［２，３−ｂ］、オキサゾリル、ペリミジニル（perimidinyl）、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル（phenarsazinyl）、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアンスレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、及びキサンテニル。１つの実施形態では、「へテロアリール」という用語は、炭素原子、並びに非過酸化物酸素、硫黄、及びＮ（Ｚ）の群から独立して選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含有する５又は６個の環原子を含有する単環式芳香族環を指し、ここで、Ｚは存在しないか又はＨ、Ｏ、アルキル、フェニル、若しくはベンジルである。別の実施形態では、へテロアリールは、特にベンズ誘導体、又はプロピレン若しくはテトラメチレンジラジカルをそれに融合させることにより誘導されたものから誘導された、環原子が約８〜１０個のオルト融合二環式ヘテロ環を指す。

該ヘテロアリールは、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及びＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。

「ヘテロ環」という用語は、酸素、窒素、及び硫黄の群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、アルキル又はＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｂで随意に置換された飽和又は部分的に不飽和の環系を指し、ここでＲ^ｂは水素又はアルキルである。典型的には、ヘテロ環は、酸素、窒素、及び硫黄の群から選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含有する単環式、二環式、又は三環式の基である。ヘテロ環基は、その環に結合されたオキソ基（＝Ｏ）を含有することもできる。ヘテロ環基の非限定的な例には、以下のものが含まれる：１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、及びチオモルホリン。

該ヘテロ環は、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及びＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。

窒素ヘテロ環及びへテロアリールの例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、モルホリノ、ピペリジニル、及びテトラヒドロフラニルなど、並びにＮ−アルコキシ−含窒素ヘテロ環。本発明の１つの具体的な実施形態では、該窒素ヘテロ環は、３−メチル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピラジノ［３，２，１−ｊｋ］カルバゾール−３−イウムヨウ化物であり得る。

別のクラスのヘテロ環は、式［−（ＣＨ_２−）_ａＡ−］の１つ又は複数の反復単位を有する特定のクラスのヘテロ環式化合物を指す「クラウン化合物」として知られており、ここでａは２以上であり、Ａは個別の出現の各々において、Ｏ、Ｎ、Ｓ、又はＰであり得る。クラウン化合物の例には、単なる例として、［−（ＣＨ_２）_３−ＮＨ−］_３及び［−（ＣＨ_２）_２−Ｏ）_４−（（ＣＨ_２）_２−ＮＨ）_２］などが含まれる。典型的には、そのようなクラウン化合物は、４〜１０個のヘテロ原子及び８〜４０個の炭素原子を有し得る。

「アルカノイル」という用語は、Ｒが上記で定義したアルキル基であるＣ（＝Ｏ）Ｒを指す。

「アシルオキシ」という用語は、Ｒが上記で定義したアルキル基である−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指す。アシルオキシ基の例には、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、及びペンタノイルオキシが含まれるが、これらに限定されない。上記で定義した任意のアルキル基を使用して、アシルオキシ基を形成することができる。

「アルコキシカルボニル」という用語は、Ｒが上記で定義したアルキル基であるＣ（＝Ｏ）ＯＲを指す。

「アミノ」という用語は−ＮＨ_２を指し、「アルキルアミノ」という用語は−ＮＲ_２を指し、ここで少なくとも１つのＲはアルキルであり、第２のＲはアルキル又は水素である。「アシルアミノ」という用語は、Ｒがアルキル又はアリールであるＲＣ（＝Ｏ）Ｎを指す。

「イミノ」という用語は、−Ｃ＝ＮＨを指す。

「ニトロ」という用語は、−ＮＯ_２を指す。

「トリフルオロメチル」という用語は、−ＣＦ_３を指す。

「トリフルオロメトキシ」という用語は、−ＯＣＦ_３を指す。

「シアノ」という用語は、−ＣＮを指す。

「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨを指す。

「オキシ」という用語は、−Ｏ−を指す。

「チオ」という用語は、−Ｓ−を指す。

「チオキソ」という用語は、（＝Ｓ）を指す。

「ケト」という用語は、（＝Ｏ）を指す。

本明細書で使用される場合、「核酸塩基」は、平面状であり、芳香族であり、ヘテロ環である窒素含有塩基を指す。それらは、典型的には、プリン又はピリミジンのいずれか一方の誘導体である。好適な核酸塩基には、例えば、プリン、ピリミジン、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及びチミンが含まれる。

核酸塩基は、随意に以下のもので置換することができる：１つ又は複数のアルキル、アルケニル、アルキリデニル、アルケニリデニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、ＮＲ^ｘＲ^ｙ、及び／又はＣＯＯＲ^ｘ、式中各Ｒ^ｘ及びＲ^ｙは、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、へテロアリール、ヘテロ環、シクロアルキル、又はヒドロキシである。

１つ又は複数の置換基を含有する上記の基のいずれかに関して、そのような基は、立体的に非実用的な及び／又は合成的に実現不可能ないかなる置換又は置換パターンを含有しないことが当然理解される。加えて、本発明の化合物には、これら化合物の置換から生じる立体化学的異性体が全て含まれる。

本明細書に記載の化合物内の選択された置換基は、ある再帰度で存在する。この状況では、「再帰的置換基」とは、置換基が、それ自体の別の出現を繰り返してもよいことを意味する。そのような置換基の再帰的性質のため、理論的には、任意の所与の特許請求の範囲には、再帰的置換基が多数存在する場合がある。医薬品化学分野の当業者であれば、そのような置換基の総数が、目的化合物の所望の特性により合理的に制限されることを理解している。そのような特性には、限定ではなく例として、分子量、溶解度、又はｌｏｇＰなどの物理的特性、目的の標的に対する活性などの応用特性、及び合成のしやすさなどの実際的な特性が含まれる。

再帰的置換基は、本発明の目的とする態様である。医学及び有機化学分野の当業者であれば、そのような置換基の多用途性を理解している。その総数は、上記で示したように、再帰的置換基が本発明の特許請求の範囲に存在する度合いに決定されるだろう。

本明細書に記載の化合物は、親化合物、親化合物のプロドラッグ、又は親化合物の活性代謝物として投与することができる。

「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグが哺乳動物対象体に投与されると、本発明の活性親薬物又は他の方剤若しくは化合物をｉｎ ｖｉｖｏで放出する共有結合された任意の物質を含むことを目的としている。本発明の化合物のプロドラッグは、日常的な操作またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで親化合物に修飾が切断されるように、該化合物中に存在する官能基を修飾することにより調製される。プロドラッグには、プロドラッグが哺乳動物対象体に投与されると、切断されて遊離カルボニル、カルボン酸、ヒドロキシ、又はアミノ基を形成する任意の基に、カルボニル、カルボン酸、ヒドロキシ、又はアミノ基が結合されている本発明の化合物が含まれる。プロドラッグの例には、本発明の化合物にあるアルコール及びアミン官能基のアセテート、ホルメート、及びベンゾアート誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

「代謝産物」は、本発明のそのような活性親薬物又は他の方剤若しくは化合物が哺乳動物対象体に投与されると、本発明の活性親薬物又は他の方剤若しくは化合物と生細胞がｉｎ ｖｉｖｏで相互作用する生化学的プロセスに起因する任意の物質を指す。代謝産物には、任意の代謝経路に由来する産物又は中間体が含まれる。

「代謝経路」は、ある化合物を別の化合物に変換し、細胞機能に中間体及びエネルギーを提供する一連の酵素媒介性反応を指す。該代謝経路は、直線的であってもよく又は循環的であってもよい。

上記の教示に照らして、本発明には多数の改変及び変異が可能であることは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲内で、本明細書中の具体的な記載とは異なるように実施することができることが理解されるべきである。

本発明の化合物
したがって、１つの態様では、本明細書で開示されるのは、式Ｉ又は式ＩＩの化合物
又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグであり、式中、
Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
ｎが、０〜１０の整数であり、例えば、ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。

幾つかの実施形態では、Ｒ_１は、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_１は水素である。

幾つかの実施形態では、Ｒ_２及びＲ_３は、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_２及びＲ_３は水素である。

幾つかの実施形態では、Ｒ_９ａ及びＲ_９ｂは、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_９ａ及びＲ_９ｂは水素である。

幾つかの実施形態では、Ｒ_４は、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、式中、Ｒ_２０は、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、及びフェニルからなる群から選択される。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_４は、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、及び−ＯＰｈ（フェノキシ）からなる群から選択される。これらの実施形態の特定の形態では、Ｒ_４は−ＯＨである。

幾つかの実施形態では、Ｒ_５〜Ｒ_８は、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_５及びＲ_８は水素である。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_６及びＲ_７はメチルである。

幾つかの実施形態では、Ｒ_１０及びＲ_１４は、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_１０及びＲ_１４は水素である。

幾つかの実施形態では、Ｒ_１１及びＲ_１３は、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される。これらの実施形態の幾つかでは、Ｒ_１１及びＲ_１３は、ｔ−ブチルである。

幾つかの実施形態では、Ｒ_１２は、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択され、式中、Ｒ_２０は、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、及びフェニルからなる群から選択される。これらの実施形態の特定の形態では、Ｒ_２０は水素である。幾つかの実施形態では、Ｒ_１２は、−ＯＨである。

幾つかの実施形態では、ｎは、１〜５の整数であり、例えば、１、２、３、４、又は５である。これらの実施形態の幾つかでは、ｎは２であるが、他の実施形態では、ｎは３である。

別の態様では、本明細書で開示されるのは、ＣＩＤ−２８５８５２２として指定されている化合物又はその薬学的に許容される塩である。
ＣＩＤ−２８５８５２２

本発明の化合物は、周知の有機合成化学技術を使用して合成することができる。下記のスキーム１及び２は、本明細書で開示される化合物の幾つかの合成に使用される合成経路を示す。さらなる合成手順は、下記の実施例セクションに記載されている。
スキーム１
スキーム２

幾つかの実施形態では、スキーム１の最終ステップの環状アミンを非環状アルキルアミンに置換すると、２つの異なる産物：非環状ベンズイミダゾール類似体及び三環式ベンズイミダゾイミダゾール類似体が得られる。したがって、幾つかの実施形態では、式Ｉの化合物を酸性条件下で環化するか、又は加熱すると、式ＩＩの化合物を形成することができる。そのような環化反応の一例は、下記のスキーム３に示されている。式Ｉの特定の化合物を生理学的条件下で環化して、式ＩＩの類似体化合物を形成することができる。
スキーム３

本発明の化合物は、医薬組成物として製剤化し、選択した投与経路、つまり、経口、又は静脈内、筋肉内、局所的、若しくは皮下経路による非経口に適した様々な形態でヒト患者などの哺乳動物宿主に投与することができる。

本化合物は、例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体などの薬学的に許容される媒体と組み合わせて、経口で全身投与してもよい。本化合物は、硬又は軟シェルゼラチンカプセルに封入してもよく、圧縮して錠剤にしてもよく、又は患者食の食品に直接組み入れてもよい。経口投与の場合、活性化合物を１つ又は複数の賦形剤と混合してもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、及びウエハーなどの形態で使用することができる。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。該組成物及び調製物のパーセントは当然変動する場合があり、便利には、所与の単位剤形の重量の約２〜約６０％であってもよい。そのような有用組成物中の活性化合物の量は、有効用量レベルが取得される量である。

錠剤、トローチ剤、丸剤、及びカプセル剤などは、下記のものを含有することもできる：トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、及びアルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース、又はアスパルテームなどの甘味料、又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはチェリー香料などの香料を添加してもよい。単位剤形がカプセルである場合、上記のタイプの物質に加えて、植物油又はポリエチレングリコールなどの液体担体を含有していてもよい。他の種々の物質が、コーティングとして、又は別様に固形単位剤形の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、又はカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラック、又は糖などでコーティングされていてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてスクロース又はフルクトース、保存剤としてメチル及びプロピルパラベン、染料、並びにチェリー又はオレンジ香料などの香料を含有してもよい。当然、任意の単位剤形の調製に使用されるあらゆる物質は、薬学的に許容されており、使用される量では実質的に無毒性であるべきである。加えて、該活性化合物は、徐放性製剤及びデバイスに導入されてもよい。

該活性化合物は、点滴又は注射により静脈内又は腹腔内に投与することもできる。該活性化合物又はその塩の溶液は、水で調製することができ、随意に無毒性の界面活性剤と混合することができる。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物、並びに油中でも調製することができる。通常の保管及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有する。

注射又は点滴に好適な医薬剤形には、随意にリポソームに封入されている無菌の注射可能な又は点滴可能な液剤又は分散剤の即時調製に適している、活性成分を含む無菌水溶性液剤若しくは分散剤又は無菌散剤が含まれてもよい。全ての場合で、最終剤形は、製造及び保管条件下で無菌であり、液状であり、及び安定しているべきである。該液体担体又は媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、無毒性グリセリルエステル、及びそれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散剤の場合は必要な粒径の維持により、又は界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌及び抗真菌物質、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによりもたらすことができる。

無菌注射剤は、必要量の活性化合物を上記で列挙した他の種々成分と共に適切な溶媒に取込み、必要に応じてその後ろ過滅菌をすることにより調製される。無菌注射剤を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これらの技術により、以前に無菌ろ過した溶液に存在する活性成分＋任意の追加的な所望の成分の粉末がもたらされる。

局所投与の場合、本化合物は、つまり本化合物が液体である場合は、純粋な形態で適用してもよい。しかしながら、一般的には、固形であってもよく又は液体であってもよい皮膚科的に許容される担体と併用して、本化合物を組成物又は製剤として皮膚に投与することが望ましいだろう。

有用な固形担体には、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、及びアルミナなどの微粉化固形物が含まれる。有用な液体担体には、随意に無毒性界面活性剤を用いて本化合物を有効なレベルに溶解又は分散することができる水、アルコール、若しくはグリコール、又は水−アルコール／グリコール混合液が含まれる。芳香剤及び追加的抗菌剤などのアジュバントを添加して、所与の使用に関する特性を至適化することができる。その結果生じる液体組成物は、吸収性パッドから適用してもよく、絆創膏及び他の包帯を含浸するために使用してもよく、又はポンプ型噴霧器若しくはエアゾール噴霧器を使用して患部にスプレーしてもよい。

合成高分子、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、変性セルロース、又は変性無機物質などの増粘剤を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接塗布するための塗布可能なペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、及び石鹸などを形成することができる。

本発明の化合物の有用な用量は、本化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及び動物モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物での有効量をヒトに外挿するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号の明細書を参照されたい。

一般的に、ローション剤などの液体組成物中の本発明の化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％、好ましくは約０．５〜１０重量％だろう。ゲル剤又は散剤などの半固形又は固形組成物中の濃度は、約０．１〜５重量％、好ましくは約０．５〜２．５重量％だろう。

本化合物又はその活性塩若しくは誘導体の、単独使用又は他の化合物との併用使用に必要な量は、選択した特定の塩だけでなく、投与経路、治療する状態の性質、並びに患者の年齢及び状態に応じても変動し、最終的には主治医又は臨床医の判断によるだろう。

しかしながら、一般的に、好適な用量は、１日当たり体重１Ｋｇ当たり約０．５〜約１００ｍｇ、例えば、１日当たり受容個体の体重１Ｋｇ当たり３〜約５０ｍｇなどの１日当たり体重１Ｋｇ当たり約１０〜約７５ｍｇの範囲、好ましくは６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、最も好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であってもよい。

本化合物は、例えば、１単位剤形当たり５〜１０００ｍｇ、便利には１０〜７５０ｍｇ、最も便利には５０〜５００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形で便利に投与することができる。

該活性成分は、約０．５〜約７５μＭ、好ましくは約１〜５０μＭ、最も好ましくは約２〜約３０μＭの活性化合物のピーク血漿中濃度を達成するように投与してもよい。これは、例えば、随意に生理食塩水中の０．０５〜５％の該活性成分溶液の静脈注射により達成されてもよく、又は約１〜１００ｍｇの該活性成分を含有するボーラスとして経口投与されてもよい。望ましい血中レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間を提供する持続点滴、又は約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの該活性成分（複数可）を含有する間欠点滴により維持することができる。

所望の用量は、単回用量で、又は適切な間隔で投与される分割用量で、例えば１日当たり２、３、又は４回以上のサブ用量として、便利に提供することができる。サブ用量自体が、例えば、吸入器からの複数回吸入又は目の中への複数回滴下投与などの、大まかに間隔をおいた多数の別々の投与にさらに分割されてもよい。

使用方法
別の態様では、抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化を選択的に阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）ＮＦ−κＢ応答性プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子で形質移入した細胞を含む水溶液を準備すること；（ｂ）この溶液に試験化合物を添加すること；（ｃ）この溶液にＮＦ−κＢを誘導する刺激を加えること；及び（ｄ）該試験化合物が該刺激に対する細胞応答を低減するかどうかを決定することを含む方法が本明細書で開示される。幾つかの実施形態では、該試験化合物は、本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの化合物である。これらの実施形態の特定の形態では、該試験化合物はＣＩＤ−２８５８５２２である。幾つかの実施形態では、該レポーター遺伝子は、ＮＦ−κＢ応答性プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子である。他の実施形態では、該試験化合物は、該刺激に対する応答を５０％を超えて低減する。

別の態様では、細胞の抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化を選択的に阻害する方法であって、本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの化合物と該細胞を接触させることを含む方法が、本明細書で開示される。これらの実施形態の特定の形態では、式Ｉの化合物はＣＩＤ−２８５８５２２である。幾つかの実施形態では、該接触はｉｎ ｖｉｖｏであるが、他の実施形態では、該接触はｉｎ ｖｉｔｒｏである。

別の態様では、対象体の抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化を選択的に阻害する方法であって、その必要性のある対象体を同定することと、本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの化合物を該対象体に投与又は該対象体と接触させることとを含む方法が、本明細書で開示される。これらの実施形態の同定の形態では、式Ｉの化合物はＣＩＤ−２８５８５２２である。幾つかの実施形態では、該対象体は哺乳動物である。これらの実施形態の特定の形態では、該対象体はヒトである。

別の態様では、対象体の抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化に関連する疾患を治療する方法であって、その必要性のある対象体を同定することと、本明細書に記載の式Ｉ又は式ＩＩの化合物を該対象体に投与又は該対象体と接触させることとを含む方法が、本明細書で開示される。これらの実施形態の特定の形態では、式Ｉの化合物はＣＩＤ−２８５８５２２である。幾つかの実施形態では、該対象体は哺乳動物である。これらの実施形態の特定の形態では、該対象体はヒトである。

化合物ライブラリースクリーニング
化合物ライブラリースクリーニングの戦略には、ホルボールエステル（ホルボールミリスチン酸アセテート［ＰＭＡ］）及びＣａ^２＋−イオノフォであるアイオノマイシンを使用して、抗原受容体経路の開始事象を模倣するＰＫＣ活性化を達成することが必要であった。便宜上、本発明者らは、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子抑制及びドミナントネガティブ突然変異体の形質移入により、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ＮＦ−κＢ活性化が、ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ−１０、及びＭＡＬＴに依存することが以前に示されているＨＥＫ２９３上皮細胞を使用した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＮＦ−κＢ応答性プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子で安定的に形質移入し、ＰＭＡ／イオノマイシン及びＴＮＦを含む種々のＮＦ−κＢ誘導性刺激に対するこの組み込まれたプロモーターの応答性を確認した。これらの細胞を使用して、良好なアッセイ性能特性（Ｚ’＞０．５）を有する、９６ウエル及び３８４ウエルプレートに基づくハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを確立した（ＰｕｂＣｈｅｍ ＡＩＤ＝１３８４）。本発明者らは、最初に、５μＭの平均濃度の５３，２８０個の化学化合物をスクリーニングし、そのうち５１９個の一次ヒットを取得した（５０％阻害のカットオフに基づく）。これらのうち、２４８個を反復試験で確認した（図１）。

図１は、一次アッセイ並びに用量−応答実験の結果を示す。ＩＣ_５０が３μＭ未満である有効なヒットを、カウンタースクリーニングでさらに特徴付けて経路選択性を評価した。ＮＩＨライブラリーからの最も強力な化合物は、内因性のＮＦ−κＢ誘導可能な遺伝子がコードするＩＬ−８を測定した二次アッセイで抑制的でなかった。その後、本発明者らはバーナム医学研究所（Burnham Institute for Medical
Research）からの５３，２８０個の化合物をスクリーニングした。５１９個の化合物のうち２４８個を、同じ一次スクリーニングアッセイを使用して再確認した。これら化合物を、カウンタースクリーニングを使用してさらに試験して、経路選択的阻害剤を同定した。１１個の化合物が、ホルボールエステルにより活性化されるがＴＮＦでは活性化されないＮＦ−κＢを選択的に阻害すると考えられた。これら１１個の活性合物から、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイを使用して、及びＮＦ−κＢ誘導性サイトカインＩＬ−８の分泌を測定するアッセイも使用して、０．１μＭ未満の細胞効力（ＩＣ_５０）でＰＭＡ／イオノマイシン活性化ＮＦ−κＢ経路を選択的に阻害する１つのヒットが同定された。このヒットは、ジャーカットＴ細胞系でＩＬ−２産生も部分的に抑制するが、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２過剰発現誘導性ＮＦ−κＢを阻害しなかった。ＣＩＤ−２８５８５２２は，ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイではＩＫＫ及びＰＫＣを阻害せず、ＣＩＤ−２８５８５２２が抗原受容体経路に特異的であることを示した。

レポーター遺伝子のＴＮＦα誘導性活性化を阻害する化合物のカウンタースクリーニングにより２０２個の化合物を除外し、ＨＥＫ２９３リポーター細胞系の細胞毒性試験により、２個の追加的化合物を差し引いて、４６個の候補が残った。これらの化学薬品の新しい在庫品を注文し、そのうち１１個がＰＭＡ誘導性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性の抑制を示した。最後に、ＨＥＫ２９３リポーター細胞系でインターロイキン８（ＩＬ−８）のＰＭＡ誘導性分泌を測定した、したがって内因性ＮＦ−κＢ標的遺伝子を検討した直交性アッセイで、これら１１個の候補を試験し、唯一の候補化合物ＣＩＤ−２８５８５２２が残った。（ＣＩＤ−１７４５０３２４又はＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ−５６５３９１４）、２−アミノベンズイミドゾール（2-aminobenzimidzole）（図１、図２Ａ）。ＣＩＤ−２８５８５２２は、別のＰＫＣ活性化因子であるホルボールジブトリエート（phorbol dibutryate）（ＰＤＢｕ）で誘導したＮＦ−κＢ活性化も、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子アッセイを使用して、及びＮＦ−κＢ誘導性サイトカインＩＬ−８の分泌を測定するアッセイを使用して、０．１μＭ以下の細胞効力（ＩＣ_５０）で阻害した（図２Ｅ）。同じＨＥＫ２９３レポーター遺伝子細胞系を３８４ウエルプレート形式の一次ＨＴＳアッセイで使用して、及び化合物を特徴付けるための同様の追跡試験戦略を使用して、ＮＩＨにより提供された６１，６０９個のライブラリーから追加的な化合物を獲得する試みは（ＰｕｂＣｈｅｍ ＡＩＤ５８６及びＡＩＤ４６５）、その結果として所望の基準を満たした化合物をもたらさなかった。

ヒットの特異性を特徴付けるため、ＣＩＤ−２８５８５２２を他の８つのＮＦ−κＢ経路でも試験した。ＣＩＤ−２８５８５２２は、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＸＩＡＰ／ＴＡＢ、ＩＡＰ２／ＭＡＬＴ１の過剰発現で誘導したＮＦ−κＢ活性化、又はドキソルビシン（ＰＩＤＤの誘導因子、ｐ５３−誘導可能デスドメイン）若しくはレチノイン酸（ＲＩＧ−１の誘導因子）のいずれかで誘導したＮＦ−κＢ活性化を阻害せず、ＣＩＤ−２８５８５２２が抗原受容体経路に特異的であることを確認した。その後、ＣＩＤ−２８５８５２２の活性及び特異性をさらに確認するために、本発明者らは、種々の刺激で刺激した他の細胞系で該化合物を試験した。ＣＩＤ−２８５８５２２は、ジャーカットＴ細胞系でのＩＬ−２産生（図４）、及び抗ＩｇＭで誘導したマウスＢ細胞脾細胞の増殖（図５）も部分的に阻害したが、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）で誘導したＮＦ−κＢ（ＩＬ−６分泌をＴＨＰ．１細胞培養で測定した）、抗リンホトキシンβ受容体で誘導したＮＦ−κＢ（ＮＦ−κＢルシフェラーゼをヒーラ細胞で測定した）、γ−Ｔｒｉ−ＤＡＰで誘導したＮＦ−κＢ（ＩＬ−８分泌をＭＣＦ−７細胞培養で測定した）、及びＭＤＰで誘導したＮＦ−κＢ（ＩＬ−６をＴＨＰ．１細胞培養で測定した）を阻害しなかった（データ非表示）。

ＨＥＫ２９３−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃリポーター細胞系を使用して、２５０個を超えるＣＩＤ−２８５８５２２の類似体を試験することにより、堅牢な構造活性相関性（ＳＡＲ）が示され、この試験では、化合物構造内の種々の部分を調査し、その結果として、活性を全く失ったか又は著しく活性を低減させた２００個を超える構造的に関連した類似体、およそ同程度の活性を有する１０個の類似体がもたらされたが、明白に優れた活性を有する類似体はなかった（データは他所で公開する）。

ＣＩＤ−２８５８５２２は、ホルボールエステル刺激性ＮＦ−κＢ活性を強力に及び選択的に阻害する。化合物ＣＩＤ−２８５８５２２は、２−アミノベンズイミダゾールである（図２Ａ）。代表的なデータは図２に示されており、ＣＩＤ−２８５８５２２の活性が、ライブラリースクリーニングからの別の化合物であるＣＩＤ−２９９８２３７（図２Ａ）及びＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩと対比されている。一次スクリーニングで使用したＨＥＫ２９３細胞系では、ＣＩＤ−２８５８５２２は、濃度依存的様式でＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性を抑制し、ＩＣ_５０は約７０ｎＭであり、最大阻害は０．２５〜０．５μＭで達成された（図２Ｂ）。対照的に、この化合物は、４μＭの高濃度でもＴＮＦ誘導性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性を阻害せず、したがってＰＭＡ／イオノマイシンで活性化されたＮＦ−κＢ経路に対する選択性が示された（図２Ｂ）。細胞生存率アッセイにより、ＣＩＤ−２８５８５２２が８μＭ以下の濃度ではＨＥＫ２９３細胞に対して毒性がないこと、及び精製ルシフェラーゼを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイで測定されたほどルシフェラーゼ活性を抑制しなかったことが示され（非表示）、ＮＦ−κＢ阻害活性に関するこれらの瑣末な説明を除外した。さらに、ＣＩＤ−２８５８５２２は、エピゾームプラスミドからのＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定した一過性形質移入アッセイにおいて、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性も強力に阻害し（非表示）、したがって測定した活性に対する染色体統合部位の影響は除外された。類似の結果が別の「ヒット」化合物ＣＩＤ−２９９８２３７で取得されたが、この化合物は、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性レポーター遺伝子活性の抑制がそれほど強力でなく、ＴＮＦ誘導性ＮＦ−κＢ活性のある程度の阻害を示した（図２Ｃ）。

一次スクリーニングに使用したＨＥＫ２９３遺伝子操作細胞系でのＰＭＡ／イオノマイシン刺激性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性の直交性アッセイは、真陽性化合物と偽陽性化合物を区別する重要なアッセイであることが判明し、ルシフェラーゼに基づくレポーター遺伝子に排他的に依存しないことが重要であることが示された。図２Ｄでは、ＣＩＤ−２８５８５２２と偽陽性化合物ＣＩＤ−２９９８２３７が比較されており、ＣＩＤ−２８５８５２２がＰＭＡ／イオノマイシン刺激性ＩＬ−８産生を濃度依存的様式で抑制し、ＩＣ５０は０．１μＭ未満であり、最大抑制は約１μＭで達成されたが、ＣＩＤ−２９９８２３７は、４μＭの高濃度でもＩＬ−８産生に最小限の影響しか及ぼさなかったことを示している。ライブラリースクリーニングからの幾つかの化合物が、ＰＭＡ／イオノマイシンにより誘導されるがＴＮＦでは誘導されないＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性の抑制に関して同様の特徴を示したが（スクリーニングした５３，２８０個の総化合物のうち、ｎ＝１８）、ＣＩＤ−２８５８５２２のみが、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ＩＬ−８分泌を抑制した。

ホルボールジブトリエート（ＰＤＢ）をＰＭＡに置換した際に、同様の結果がＣＩＤ−２８５８５２２について取得され（図２Ｅ）、したがってこの観察は代替的ＰＫＣ活性化ホルボールエステルにまで拡張された。ＰＤＢ誘導性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性及びＨＥＫ２９３細胞によるＰＤＢ誘導性ＩＬ−８産生の抑制に関するＩＣ_５０値は、それぞれ約７０ｎＭ及び約１００ｎＭであった。

ＣＩＤ−２８５８５２２は、核内ＮＦ−κＢファミリータンパク質が、ＮＦ−κＢ結合部位を有するオリゴヌクレオチドを提示するビーズで捕獲され、ｐ６５Ｒｅｌ−Ａが特異的抗体を使用して検出されるイムノアッセイで測定したところ、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激性ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性も抑制した（図２Ｆ）。抑制は、０．１μＭの最低濃度でも明白であり、約１μＭで最大だった。しかしながら、ＣＩＤ−２８５８５２２は、本明細書で対照として使用したＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩと比較して、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ｐ６５−ＲｅｌＡ ＤＮＡ結合活性を部分的に阻害したにすぎなかった。ＰＭＡ／イオノマイシン駆動性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性及びＩＬ−８産生のより完全な抑制と比較すると、この観察は、ｐ６５−ＲｅｌＡに加えてＮＦ−κＢファミリーの追加的メンバーのＰＭＡ／イオノマイシン誘導性活性化が、ＨＥＫ２９３細胞ではＣＩＤ−２８５８５２２により阻害され、これら他のＮＦ−κＢファミリーメンバーが、測定された総ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性及びＩＬ−８遺伝子活性に寄付する可能性があることを示唆している。ＣＩＤ−２８５８５２２は、ＴＮＦで誘導したｐ６５−ＤＮＡ結合活性を阻止せず（データ非表示）、したがって経路選択性を示した。

ＣＩＤ−２８５８５２２は、他のＮＦ−κＢ経路を阻害しない。ＮＦ−κＢは少なくとも９つの既知経路により活性化され得るため、本発明者らは、次に、プラスミドでの適切なサイトカイン形質移入による刺激、又は各ＮＦ−κＢ活性化経路を開始させる種々の作用剤による刺激のいずれかにより、ＨＥＫ２９３細胞のこれらの経路の各々を誘発させた（図３）。ＣＩＤ−２８５８５２２の活性を、ＮＦ−κＢ活性化経路を全て阻止するというＩＫＫ化学阻害剤の能力に依存して、対照としてのＩＫＫ阻害剤ＢＭＳ−３４５５４１と比較した。第１に、本発明者らは、ＣＤ４の細胞外ドメインがＴＬＲ４の膜貫通及び細胞質ドメインと融合されたＣＤ４−ＴＬＲ４融合タンパク質での形質移入によりＴＬＲ経路を刺激し、それにより抗ＣＤ４抗体（天然リガンドであるリポポリサッカリド［ＬＰＳ］ではなく）を使用して、ＴＬＲ４を活性化する。ＴＬＲ４は、堅牢なＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性を誘導し（５０倍を超える増加）、該活性は、ＩＫＫ阻害剤ＢＭＳ−３４５５４１により抑制されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２及びＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩでは抑制されなかった。第２に、「代替的」ＮＦ−κＢ経路を、ＨＥＫ２９３細胞内でＣＤ４０を過剰発現することにより刺激した。ＣＤ４０誘導性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性は、ＩＫＫ阻害剤により強力に抑制されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２又はＰＫＣ阻害剤では抑制されなかった。第３に、本発明者らは、ＨＥＫ２９３ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ細胞でＮＯＤ１（ＮＬＲＣ１）又はＮＯＤ２（ＮＬＲＣ２）を過剰発現することにより、ＮＬＲ依存性ＮＦ−κＢ経路を刺激した。ＮＯＤ１及びＮＯＤ２は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の６〜７倍の増加を誘導し、該活性は、ＩＫＫ阻害剤により阻害されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２では阻害されなかった。第４に、ＮＦ−κＢ活性化のＩＡＰ開始経路を、ｃＩＡＰ２／ＭＡＬＴ腫瘍性タンパク質又はＸＩＡＰ＋ＴＡＢのいずれかをコードするプラスミドで２９３−ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ細胞を形質移入することにより誘導した。ＩＫＫ阻害剤は、これらのＩＡＰ駆動性経路を効果的に抑制したが、ＣＩＤ−２８８５２２は抑制しなかった。第５に、ＨＥＫ２９３−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ細胞をドキソルビシンで刺激することにより、ＮＦ−κＢ活性化のＤＮＡ損傷誘導可能経路を誘発し、これにより、ＮＦ−κＢ活性の約１２倍の増加がこれら細胞で誘導された。この場合もまた、ＩＫＫ阻害剤は、ＮＦ−κＢ活性を抑制したが、ＣＩＤ−２８５８５２２は抑制しなかった。最後に、レチノイン酸（ＲＡ）誘導可能経路を、オールトランス型レチノイン酸で細胞を処理することにより誘導した。ＲＡは、ＨＥＫ２９３細胞でＮＦ−κＢ活性のあまり大きくない約３倍増加を誘導し、該活性は、ＩＫＫ阻害剤により著しく抑制されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２では抑制されなかった。したがって、ＴＮＦで活性化した「古典的」ＮＦ−κＢ経路がＣＩＤ−２８５８５２２により阻害されないことを示すデータ（図２）と一緒にすると、これらのデータは、本発明者らの化合物が、ＰＫＣ活性化因子により開始されるＮＦ−κＢ経路を特異的に抑制することを示す。

ＣＩＤ−２８５８５２２は、ジャーカットＴ細胞によるＴＣＲ刺激性ＩＬ−２産生を部分的に抑制する。Ｔ細胞では、抗原受容体は、ＮＦ−κＢ、ＮＦ−ＡＴ、及びＡＰ−１含む、ＩＬ−２遺伝子プロモーターに収束する幾つかのシグナル伝達経路を刺激する。リンパ球のＴＣＲ開始性のＮＦ−κＢ駆動性事象に対するＣＩＤ−２８５８５２２の効果を評価するために、本発明者らは、ＩＬ−２遺伝子発現に結びつくＴＣＲシグナル伝達を研究するためのモデルとして広範に利用されているジャーカットＴ−白血病細胞を使用した。これらの実験の場合、ジャーカット細胞を、ＣＩＤ−２８５８５２２、ＩＫＫ阻害剤、又はＰＫＣ阻害剤の存在下又は非存在下で、抗ＣＤ３（ＴＣＲ複合体を活性化するため）及び抗ＣＤ２８（共刺激剤）又はＰＭＡ／イオノマイシンのいずれかで刺激し、次いで培養液上清中のＩＬ−２産生を２４時間後に測定した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＰＭＡ／イオノマイシンは両方とも、ジャーカットＴ細胞によるＩＬ−２産生の著しい増加を刺激し、ＣＤ３／ＣＤ２８はＰＭＡ／イオノマイシンよりも強力だった（図４Ａ）。ＩＫＫ阻害剤は、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ＩＬ−２産生を部分的に抑制し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８誘導性ＩＬ−２産生を１０μＭ以下の濃度で本質的に完全に抑制した（約９０％抑制）（図４Ｂ）。ＰＫＣ阻害剤は、ＣＤ３／ＣＤ２８又はＰＭＡ／イオノマイシンのいずれかで刺激したジャーカット細胞で、ＩＬ−２産生を０．５μＭ未満の濃度で８０〜９０％抑制した（図４Ｃ）。対照的に、ＣＩＤ−２８５８５２２は、ＣＤ３／ＣＤ２８及びＰＭＡ／イオノマイシンで刺激したジャーカット細胞によるＩＬ−２産生を、１０μＭ未満の濃度でおよそ半分（ＩＣ_５０）に抑制した（図４Ｄ）。ＣＩＤ−２８５８５２２、ＩＫＫ阻害剤、又はＰＫＣ阻害剤によるジャーカット細胞でのＩＬ−２産生の抑制は、細胞毒性によるものではなかった（図４Ｅ）。

ＣＩＤ−２８５８５２２は、ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したジャーカットＴ細胞によるＩＬ−２産生のその抑制とは対照的に、ＴＬＲ４アゴニストＬＰＳで刺激したＴＨＰ．１単球によるＩＬ−６産生、ＮＯＤ１アゴニストγ−ＴｒｉＤＡＰで刺激したＭＣＦ７乳癌細胞でのＩＬ−８産生、又は抗リンホトキシンβで誘導したヒーラ細胞でのＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性を抑制せず（図１に要約されているように）、これらの全てに他のＮＦ−κＢ活性化経路が関与している。したがって、ＣＩＤ−２８５８５２２は、遺伝子形質移入に依存するのではなく、幾つかのＮＦ−κＢ活性化経路の内因性構成要素を誘発する際の経路選択性も示した。

ＣＩＤ−２８５８５２２は、抗ＩｇＭで誘導したマウス初代Ｂ細胞増殖を阻害する。ＮＦ−κＢは、抗原受容体駆動性リンパ球増殖に役割を果たす。したがって、本発明者らは、^３Ｈチミジン取込みを測定することにより、抗ＣＤ３／ＣＤ２８又は抗ＩｇＭ抗体で誘導したマウスリンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞の両方）の増殖に対するＣＩＤ−２８５８５２２の効果を試験した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８及び抗ＩｇＭは、マウスリンパ球培養におけるＤＮＡ合成の約８０倍及び約８倍の増加をそれぞれ著しく誘導した（図５Ａ）。ＩＫＫ及びＰＫＣ阻害剤は、濃度依存的様式でリンパ球増殖を抑制し、Ｂ細胞（抗ＩｇＭ）（ＩＫＫ阻害剤のＩＣ_５０は約２μＭ；ＰＫＣ阻害剤の場合、約０．２μＭ）を、Ｔ細胞（抗ＣＤ３／ＣＤ２８）より強力に阻害した（ＩＫＫ阻害剤の場合、ＩＣ_５０は約４μＭ；ＰＫＣ阻害剤の場合、約１．５μＭ）（図５Ｂ、Ｃ）。対照的に、ＣＩＤ−２８５８２８８は、濃度依存的様式で抗ＩｇＭ−誘導性リンパ球増殖を阻害し、ＩＣ_５０は約２μＭであったが、抗ＣＤ３／ＣＤ２８に対しては最小限の効果を示し、ＣＩＤ−２８５８２８８のＮＦ−κＢ抑制機序は、Ｔ細胞よりＢ細胞でより優れていることが示唆された。しかしながら、ＣＤ３／ＣＤ２８は抗ＩｇＭより強力な増殖応答を刺激するため、本発明者らは、この観察については定性的ではない定量的な説明を除外することができない。

リンパ球の抗原受容体シグナル伝達に対するＣＩＤ−２８５８５２２の効果をさらに評価するため、本発明者らは、末梢血リンパ球の９０％超が腫瘍性Ｂ細胞である慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）の患者に由来するＢ細胞を使用した。ビオチン化抗ＩｇＭ（ストレプトアビジンを使用して架橋されている）による刺激は、その結果としてＮＦ−κＢの内因性標的であるＴＲＡＦ１の発現をもたらした（図５Ｅ）。抗ＩｇＭで刺激したＣＬＬ Ｂ細胞の培養にＣＩＤ−２８５２５２を添加することにより、刺激の２４時間後に測定した３つの事例のうち３例で、ＴＲＡＦ１誘導が阻害された（図５Ｅ）。ＮＦ−κＢでは制御されないアクチン及びＴＲＡＦ６のレベルは、いかなる変化も示さず、したがって選択性が示され、等しいタンパク質負荷が確認された。対照として、ＣＬＬ Ｂ細胞を、ＨＥＫ２９３細胞のＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性化又はＩＬ−８産生を阻害しない、構造的に関連しているが不活性である２−アミノベンズイミダゾール類似体ＭＬＳ−０２９２１２３でも処理し、ＭＬＳ−０２９２１２３がＴＲＡＦ１発現を阻害しなかったことが示された（図５Ｅ、５Ｆ）。陽性対照として、ＣＬＬ Ｂ細胞を、ＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩでも処理し、これはＴＲＡＦ１発現も阻害した。抗ＩｇＭで刺激したＴＲＡＦ１発現に対するＣＩＤ−２８５８５２２の効果は、ＡＴＰレベルの測定により確認したところ、分析した期間中は細胞毒性によるものではなかった。ＴＲＡＦ１発現を使用したＮＦ−κＢ活性化の間接証拠に加えて、ＣＩＤ−２８５８５２２は、抗ＩｇＭで誘導したヒトＣＬＬ Ｂ細胞のｐ６５−ＤＮＡ結合活性に対して直接的抑制も示したが、その不活性類似体ＭＬＳ−０２９２１２３は抑制しなかった（図５Ｅ）。したがって、ＣＩＤ−２８５８５２２は、Ｂ細胞抗原受容体により刺激されるＮＦ−κＢ活性化を阻害する。

ＣＩＤ−２８５８５２２は、強力なプロテインキナーゼ阻害剤ではない。プロテインキナーゼは、ＮＦ−κＢ活性化に重大な役割を果たす。ＰＫＣは、ＰＭＡ／イオノマイシン並びにＴ及びＢ細胞抗原受容体により活性化されるＮＦ−κＢ経路の近位キナーゼであるが、ＩＫＫは、これら及び他のＮＦ−κＢ経路の末端セグメントで機能する遠位キナーゼである。したがって、本発明者らは、ＣＩＤ−２８５８５２２が、これらキナーゼファミリーのメンバーを阻害するかどうかをｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイで試験した。これらの実験の場合、本発明者らは、ＰＫＣベータ及びＰＫＣシータ（ＴＣＲ／ＢＣＲシグナル伝達に関与するＰＫＣファミリー）、並びにＩＫＫベータ（ＩＫＫ複合体の構成要素）を試験した（図６）。８μＭまでの濃度では、ＣＩＤ−２８５８５２２はこれらキナーゼを抑制しなかったが、既知のＰＫＣ及びＩＫＫ阻害剤並びに広域性キナーゼ阻害剤スタウロスポリン（ＳＴＳ）は、強力な阻害を示した。したがって、ＣＩＤ−２８５８５２２は、ＰＫＣベータ、ＰＫＣシータ、又はＩＫＫベータを直接阻害しない。従来のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイによるこれら３つのキナーゼの評価に加えて、目的のヒトキナーゼが固有な標識（Ａｍｂｉｔ）に融合されている活性部位依存的競合結合アッセイであるハイスループットスクリーニング法、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）を使用して、キノームスクリーニングを実施した。固定化された活性部位特異的リガンドに結合したキナーゼの量を、試験化合物の存在下及び非存在下で測定する。ＣＩＤ−２８５８５２２は、調査した３５３のプロテインキナーゼのうち３つのプロテインキナーゼ：Ｒａｆ（５７％阻害）、ＴＬＫ１（７０％阻害）、及びＪＡＫ２（５３％阻害）のみを１０μＭで５０％を超えて抑制したが、これらはいずれも明らかにＮＦ−κＢ制御に関与していない。したがって、ＣＩＤ−２８５８５２２は、以前にＮＦ−κＢ制御に関連していると考えられているプロテインキナーゼをどれも阻害しない。

抗原受容体活性化ＮＦ−κＢ経路におけるＣＩＤ−２８５８５２２の作用部位のマッピング。これらキナーゼのスクリーニングに基づいて、本発明者らは、ＣＩＤ−２８５８５２２がＰＫＣとＩＫＫとの間のどこかに作用して、ＣＡＲＭＡファミリータンパク質、Ｂｃｌ−１０、ＭＡＬＴ、ＴＲＡＦ６（Ｕｂｃ１３に結合して、ＩＫＫγ／ＮＥＭＯの６３位リジン結合ポリユビキチン化を誘導する）、ＩＫＫγ、及びカスパーゼ８を誘導することが知られている抗原受容体シグナル伝達に関与するＮＦ−κＢ経路を阻害すると推定した。ＮＦ−κＢを活性化のこれら考え得る抗原受容体経路の標的に対するＣＩＤ−２８５８５２２の効果を特徴付けるために、本発明者らは、まずＣａｒｍａ１のＰＭＡ誘導性リン酸化をリン酸特異抗体イムノブロッティングにより評価したところ、ＣＢＭ複合体の形成を開始させるこの分子的事象に対するＣＩＤ−２８５８５２２の効果は見出されなかった（図７Ａ）。次に、本発明者らは、共免疫沈降（共ＩＰ）実験を実施し、形質移入したＨＥＫ２９３細胞のＣＡＲＭＡ１又はＣＡＲＭＡ３のいずれかとＢｃｌ−１０、ＭＡＬＴ、ＴＲＡＦ６、ＩＫＫγ、及びカスパーゼ８との相互作用を、ＰＭＡによる刺激前後で評価した。ＰＭＡは、ＣＡＲＭＡ１又はＣＡＲＭＡ３とこれらタンパク質の各々との結合を誘導又は増加させ、それは、ＰＫＣ阻害剤ビスインドリルマレイミドＩで阻害されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２では阻害されなかった（図７Ｂ〜Ｅ）。ＣＩＤ−２８５８５２２は、細胞又は溶解産物の双方で、ＰＭＡ／イオノマイシンで誘導したＣＡＲＭＡ／ＭＡＬＴ１／Ｂｃｌ−１０（ＣＭＢ）複合体の形成を妨害しなかった。

カスパーゼ８は、抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化に本質的な役割を果たす。ＭＡＬＴ１がカスパーゼ８と相互作用し、抗原受容体活性化の際にこのプロテアーゼを活性化することが最近報告された。本発明者らは、特異的カスパーゼ８阻害剤であるｚ−ＩＴＥＤ−ｆｍｋ、又はカスパーゼ８ｓｉＲＮＡが、ＰＭＡ／Ｉｏｎにより誘導されるＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性化を著しく阻害することができるため、ＨＥＫ２９３細胞でも、カスパーゼ８活性化がＮＦ−κＢ活性化に必要だったことを確認した。その後、本発明者らは、この時点でＣＩＤ−２８５８５２２がこの経路に影響を与えるかどうかを調べた。ＰＭＡは、Ｆｌａｇ−ＭＡＬＴ１及びカスパーゼ８を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞で、ＭＡＬＴ１−カスパーゼ８相互作用を著しく誘導した。この相互作用は、ＰＫＣ阻害剤により阻害されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２では阻害されなかった。カスパーゼ８ ｐ４３／４１プロセシング中間体が、ＰＭＡ／Ｉｏｎ処理後にＨＥＫ２９３細胞で産生された。しかしながら、それは、ＰＫＣ阻害剤により阻害されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２では阻害されなかった（データ非表示）。その後、本発明者らは、抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化に必要であると最近になって示されたカスパーゼ８媒介性の事象であるｃ−ＦＬＩＰのＰＭＡ誘導性タンパク質分解プロセシングに対するＣＩＤ−２８５８５２２の効果を評価した。ＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激後のＨＥＫ２９３細胞に由来する溶解産物の免疫ブロット分析は、ｃ−ＦＬＩＰプロセシングを示し（図７Ｆ）、該プロセシングはＰＫＣ阻害剤により完全に阻害されたが、ＣＩＤ−２８５８５２２によっては影響を受けなかった。したがって、ＣＩＤ−２８５８５２２は、カスパーゼ８活性化及びｃ−ＦＬＩＰプロセシングを阻害しなかった。

最後に、本発明者らは、ＩＫＫ−βリン酸化を調べた。ＩＫＫ−βのリン酸化は、ＨＥＫ２９３細胞ではＰＭＡ／イオノマイシンにより誘導され、ＣＩＤ−２８５８５２２により著しく阻害されたが、その不活性類似体ＭＬＳ−０２９２１２３では阻害されなかった（図７Ｇ）。対照的に、ＣＩＤ−２８５８５２２は、ＴＮＦα誘導性ＩＫＫ−βリン酸化を阻害せず、経路選択性を示した。本発明者らは、これらの研究から、ＣＩＤ−２８５８５２２が、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性ＮＦ−κＢを、ＣＢＭ複合体形成、カスパーゼ８活性化、及びｃ−ＦＬＩＰプロセシングの下流の、しかしＩＫＫ−βリン酸化の上流のポイントで阻害すると結論付けた。

ＮＦ−κＢの化学阻害剤は、自己免疫、炎症、及び癌用の治療薬としての潜在的使用に広く探究されてきた。しかしながら、薬学的に最も扱いやすいＮＦ−κＢ活性化の標的であるＩＫＫは、既知のＮＦ−κＢ活性化経路全てに共有されている構成要素であり、したがって選択性を欠如している。この点に関して、ＮＦ−κＢ活性は、微生物並びに種々のウイルス性及び細菌性病原体に対する先天性免疫及び宿主防御に必要である。宿主防御障害に加えて、ＮＦ−κＢ経路の広域性抑制は、基礎的ＮＦ−κＢ活性を低減し、生存因子としてのＮＦ−κＢの機能を妨害する可能性があり、潜在的に毒性副作用に結びつく。例えば、ＩＫＫ−βノックアウトマウスは、制御されない肝臓アポトーシスにより妊娠中期で死亡する。さらに、基礎研究用の研究ツール化合物を生成するという観点から、どのような細胞状況で特定の経路が特定の細胞応答に重要であるかを明らかにする経路選択的阻害剤を有することは有用だろう。

化学生物学的戦略を使用して、本発明者らは、ＰＫＣ及び抗原受容体により誘導されるＮＦ−κＢ活性化経路を選択的に阻害する阻害剤の化学ライブラリースクリーニングを考案した。この経路は、後天性免疫（先天性免疫ではなく）に特異的に関与しており、多数の自己免疫疾患並びに幾つかのタイプのリンパ腫及びリンパ性白血病に関連している。また、ＰＫＣ機能亢進は幾つかの固形腫瘍に関連しているため、本明細書で調査した経路も様々な悪性疾患に関連している可能性がある。ＰＫＣ及び抗原受容体と関連するＮＦ−κＢ活性化経路には、９つの既知ＮＦ−κＢ活性化経路の中のこの経路に特異的なタンパク質、すなわちＣＡＲＭＡ（Ｂｉｍｐ）ファミリータンパク質Ｂｃｌ−１０及びＭＡＬＴが必要であることが知られている。抗原受容体シグナル伝達の状況下でＰＫＣによりＣＡＲＭＡ１がリン酸化されると同時に、これらタンパク質は複合体を形成し、該複合体は、Ｕｂｃ１３に結合するＥ３リガーゼであるＴＲＡＦ６を動員し、その結果ＩＫＫγ／ＮＥＭＯの６３位リジン結合ポリユビキチン化がもたらされ、その結果としてＩＫＫ活性化がもたらされる。カスパーゼ８も動員され、その結果としてＮＦ−κＢの抗原受容体誘導性活性化に必要な事象であるｃ−ＦＬＩＰのタンパク質分解プロセシングがもたらされる。ＩＫＫ活性化に必要なこの複合体の構成要素は完全には知られていない場合があり、活性複合体は、精製された構成要素を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成されておらず、したがって生化学的スクリーニングが困難になる。このため、細胞に基づく化学ライブラリースクリーニング戦略が、唯一の実用的な選択であった。

ＰＭＡ／イオノマイシンにより刺激されるＮＦ−κＢ駆動性レポーター遺伝子を含有するＨＥＫ２９３細胞を使用し、その後本発明者らが、これら同じ細胞により分泌された内因性ＮＦ−κＢ標的遺伝子のタンパク質産物（例えばＩＬ−８）レベルを測定した直交性スクリーニングを使用して、本発明者らは、１１４，８８９個の化合物をスクリーニングし、その結果として所望の特性を有する唯一の化合物、ＣＩＤ−２８５８５２２がもたらされた。この２−アミノベンズイミダゾール化合物は、ＨＥＫ２９３細胞のＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性及びＰＫＣ活性化因子で誘導したＩＬ−８産生を強力に阻害し、ＩＣ_５０は０．１μＭ未満であったが、他の８つのＮＦ−κＢ活性化経路のアゴニストによるＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性化を阻害しなかった（図１）。ＣＩＤ−２８５８５２２は、ジャーカットＴ細胞によるＣＤ３／ＣＤ２８及びＰＭＡ／イオノマイシンで刺激したＩＬ−２産生、及び抗ＩｇＭで刺激した初代マウスリンパ球の増殖も部分的に抑制し（図４及び５）、これは抗原受容体により活性化されるＮＦ−κＢ活性化経路の選択的アンタゴニストに予測される表現型である。

ＣＤ３／ＣＤ２８及びＰＭＡ／イオノマイシンで刺激したジャーカットＴ細胞によるＩＬ−２産生が、ＣＩＤ−２８５８５２２により部分的に抑制されたに過ぎなかったという観察は、ＮＦ−κＢが、ＮＦ−κＢ、ＮＦＡＴ、ＡＰ−１を含むＩＬ−２遺伝子プロモーターの幾つかの転写調節因子の１つに過ぎないという知見と一致する可能性がある。同様に、ＣＤ３（ＴＣＲ）又は表面ＩｇＭ（ＢＣＲ）と架橋する抗体で培養リンパ球を刺激すると様々なＮＦ−κＢ活性化サイトカインが産生されるとすれば、ＣＩＤ−２８５８５２２が、抗ＩｇＭで刺激した初代Ｂ細胞の増殖を部分的にしか阻害せず、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＴ細胞増殖への効果が最小限であったことは驚くべきことではないと考えられる。対照的に、ＩＫＫ阻害剤は、約５μＭの濃度で本質的に完全にリンパ球増殖を抑制し、それが既知のＮＦ−κＢ活性化経路を全て中和することができることと一致する。ＣＩＤ−２８５８５２２は、ＣＬＬ Ｂ細胞の内因性ＮＦ−κＢ標的遺伝子であるＴＲＡＦ１の抗ＩｇＭ刺激性発現も阻害した。この点に関して、ＴＲＡＦ１遺伝子プロモーターは、４つのＮＦ−κＢ標的部位及びＴＡＴＡボックスを含有するが、他の認識可能な転写エレメントを本質的に含有せず、したがってこのプロモーターは初代細胞でのＮＦ−κＢ活性の良好な代用マーカーになる。Ｔ細胞及びＢ細胞での抗原受容体媒介性ＮＦ−κＢ活性化（ＰＫＣ活性化の上流）に関与する機序は異なっているが、ＰＫＣ活性化後の下流事象は著しい類似性を共有する。ＣＡＲＭＡ１、Ｂｃｌ−１０、及びＭＡＬＴ１が、抗原受容体誘導性ＮＦ−κＢ活性化、並びにＴ細胞及びＢ細胞の両方の増殖に必要であることが、ノックアウトマウスモデルにより示された。しかしながら、ＣＡＲＭＡ１突然変異マウスは、正常なＴ細胞発生を示すがＢ細胞の発生障害を示し、ＭＡＬＴ１欠損は、Ｂ細胞活性化ＭＡＬＴ１に中程度の効果を示すのみであり、抗原受容体がＴ細胞及びＢ細胞においてＰＫＣ活性化の下流でＮＦ−κＢを刺激するシグナル伝達機構は著しい類似性を共有しているが、それらは同一ではない可能性があることを示す。この点に関して、抗原受容体及びＰＫＣの他の上流活性化因子が、複数の経路によりＮＦ−κＢ活性化を誘導し、ＣＩＤ−２８５８５２２がそれらのうちの１つのみを阻害するということも可能である。例えば、本発明者らは、ＣＩＤ−２８５８５２２が、ＨＥＫ２９３細胞においてＰＭＡ／イオノマイシンで誘導したＮＦ−κＢ活性を阻害するが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においては阻害しないことを観察し、後者はＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原を発現する。したがって、ＰＫＣがＮＦ−κＢ活性を誘導する経路は、細胞の状況に依存しており、本発明者らの化合物は細胞タイプ依存性を示す。転写プロファイリング、ホスホプロテオミクス、又は他の方法によるＨＥＫ２９３細胞とＨＥＫ２９３Ｔ細胞との比較は、この細胞タイプ依存性の分子基盤に対する洞察を提供することができる。ＣＩＤ−２８５８５２２が標的とするＮＦ−κＢ経路構成要素に対する種々のリンパ球サブセットの依存性が、ＨＥＫ２９３対ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と同じように異なるかどうかを研究することも興味深いだろう。これら細胞タイプ特異的な特性により、ＣＩＤ−２８５８５２２は、治療の観点から開発できると判明していてもよく又なくともよい特徴である、生物学的な状況での種々のＮＦ−κＢ経路の役割を識別するための興味深い研究ツール化合物になる。ＣＩＤ−２８５８５２２に対するＨＥＫ２９３対ＨＥＫ２９３Ｔ細胞感受性の差は、化学生物学的実験での細胞系バイアスの影響も例示する。ＨＥＫ２９３細胞の代りにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用していれば、ＣＩＤ−２８５８５２２は同定されていなかっただろう。

ＣＩＤ−２８５８５２２がＰＫＣ誘導性ＮＦ−κＢ活性を抑制する機序は、まだ決定されていない。本発明者らは、この化合物の作用部位を、ＰＫＣの下流及びＩＫＫ−βの上流にマッピングした。ＰＫＣは、ＣＩＤ−２８５８５２２により阻害されなかった事象であるＣＡＲＭＡ１のリン酸化を誘導する。この化合物は、Ｂｃｌ−１０、ＭＡＬＴ、ＴＲＡＦ６、カスパーゼ８、又はＩＫＫγのＣＡＲＭＡ１／ＣＡＲＭＡ３へのＰＭＡ誘導性動員も阻害せず、カスパーゼ８活性化又はＦＬＩＰタンパク質分解プロセシングも阻害しなかった。哺乳動物のＣＡＲＭＡファミリータンパク質には、３つのメンバーが含まれており、それらは全て、Ｎ末端ＣＡＲＤドメイン、続いてコイルドコイルドメイン、ＰＤＺドメイン、ＳＨ３ドメイン、及びＣ末端グアニル酸キナーゼ様（ＧＵＫ）ドメインを含有する。脾臓、胸腺、及び末梢血白血球（ＰＢＬ）で主に発現されるＣＡＲＭＡ１は、抗原受容体シグナル伝達に明白に関与している。対照的に、ＣＡＲＭＡ３は、広範囲の組織で発現されるが、脾臓、胸腺、又はＰＢＬでは発現されず、ＣＡＲＭＡ２は胎盤でのみ発現される。ＣＡＲＭＡファミリーの限定的メンバーの抑制は、ＣＤ３／ＣＤ２８又はＰＭＡ／イオノマイシンで刺激したジャーカット細胞によるＩＬ−２産生、及び初代培養リンパ球の増殖などの事象のＣＩＤ−２８５８５２２による部分的阻害の別の妥当性のある説明を提供することができる。

要約すると、化学生物学的手法を使用して、本発明者らは、抗原受容体により使用されるＰＫＣ開始性ＮＦ−κＢ活性化経路の選択的化学阻害剤を同定した。この化合物及びその活性類似体は、このＮＦ−κＢ阻害剤の細胞応答における役割を解明するための新規な研究ツールを提供し、治療上有用であり経路選択的なＮＦ−κＢ阻害剤を開発するための新しい道筋を明らかにする能力を有する。

本発明を、以下の非限定的な例によりさらに説明する。

実施例１：化学反応
２−メルカプト−５，６−ジメチルベンズイミダゾール。１０ｇの４，５−ジメチルフェニレンジアミン、１６ｇのエチルキサントゲン酸カリウム、１００ｍＬのエタノール、及び１４ｍＬの水の混合液を、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに加え、加熱して還流した。３時間後、３．４ｇの木炭（Ｎｏｒｉｔ Ａ）を添加し、さらに１０分間還流した。該Ｎｏｒｉｔをろ過し、ろ過液を６０〜７０℃に加熱した。温溶液に１００ｍＬ温水道水及び８ｍＬの酢酸を１６ｍＬの水に添加し、よく撹拌した。酢酸溶液を添加すると、該混合物は泡状固形物になった。該混合物を４℃の冷蔵庫中に３時間置いておいた。固形物をろ過しＰ_２Ｏ_５で乾燥して、８．１ｇ（６２％）の黄褐色固形物を得た。この化合物をさらなる精製をせずに使用した。

２−ブロモ−５，６−ジメチルベンズイミダゾール（８）。４０ｍＬの酢酸及び４８％の４．２ｍＬ水性ＨＢｒの冷却溶液に、５ｇの１を添加した。このスラリーに、５．２ｍＬの臭素を１０分間にわたってゆっくりと滴下した。該反応物はオレンジ色になり、臭素の半分を添加した後で撹拌不能になり、固体を崩壊させるためには手作業による撹拌又は機械的撹拌が必要だった。臭素の添加後、８０ｍＬの酢酸を添加し、該混合物を室温で撹拌した。４．５時間後、該混合物を９０ｍＬの水で希釈し、０℃に冷却した。固形ＮａＯＨの添加により、該混合物のｐＨを４に調節した。塩基性化すると、溶液から固形物が析出した。それをろ過し、終夜乾燥して、薄オレンジ色の固形物として２ｇ（３２％）の産物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．２５（ｓ、６Ｈ）、７．２０（ｓ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値 Ｃ_９Ｈ_９ＢｒＮ_２ ｍ／ｚ＝２２３．９９、２２５．９９、測定値 ｍ／ｚ＝２２５．２４、２２７．２５［Ｍ＋Ｈ］。

アセトフェノン（５）の臭素化の基本手順。６ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２を含有したフラスコに、適切なアセトフェノン（３．１ｍｍｏｌ）を添加した。これに、１２ｍＬＣＨ_２Ｃｌ_２中のＢｒ_２（４．０３ｍｍｏｌ）溶液をアルゴン下で添加した。該反応液を終夜撹拌し、１５ｍＬのＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈した。該有機反応物を、飽和重炭酸ナトリウムで２回洗浄した。該有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。該粗生成物を、適切な溶媒系を使用したフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製した。

１−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−６−イル）−２−ブロモエタノン。ＥｔＯＡｃ／ヘキサン１：３を使用して、１６３ｍｇの白色固形物を単離した。（ＴＬＣ ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン １：９ Ｒ_ｆ＝０．４１）。（^１Ｈ ３００ＭＨｚ ＣＤＣｌ_３）δ４．３７（ｓ、２Ｈ）、δ６．０７（ｓ、２Ｈ）、δ６．８８（ｄ、Ｊ＝８．２、１Ｈ）、δ７．４５（ｑ、Ｊ＝２．０、１Ｈ）、δ７．５９（ｄ、Ｊ＝８．４、１．７ １Ｈ） ＭＳ（ＥＳＩ）（陰イオン）、Ｃ_９Ｈ_７ＢｒＯ_３の計算値［Ｍ−Ｈ］２４２．０６。

ブロモベンズイミダゾールのアルキル化の基本手順。フラスコに、１．２ｍＬ ＤＭＦ中の適切なブロモベンズイミダゾール（０．６ｍｍｏｌ）、臭素化アセトフェノン（０．６６ｍｍｏｌ）、及びＫ_２ＣＯ_３（１．３ｍｍｏｌ）を添加した。該溶液を、室温で終夜撹拌した。該反応混合物を１０％クエン酸に注ぎ、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。該有機層を合わせて、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。該粗物質を、適切な溶媒系を用いてカラムクロマトグラフイーで精製した。

ベンズイミダゾールライブラリー（７）合成の基本手順。１ドラムのバイアルに、適切なアルキル化ブロモベンズイミダゾール ６（０．０１ｍｍｏｌ）及び環状アミン（０．１ｍｍｏｌ）を添加し、１１０℃に加熱した。４時間後、該反応物を室温に冷却し、産物を単離した。該反応混合物を、０．５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解し、２ＮのＨＣｌ（０．５ｍＬ）で洗浄した。この酸を飽和重炭酸ナトリウムで中和し、ＥｔＯＡｃ（０．５ｍＬ）で２回抽出した。該有機層を合わせ、硫酸ナトリウム上で乾燥し、乾燥するまで濃縮した。該単離した物質をさらなる精製をせずに使用した。

３−（５，６−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イルアミノ）プロパン−１−オール（９）。５０ｍｇの８及び１００μＬの３−アミノプロパノールを１ドラムのバイアルに添加し、ＴＬＣ分析に基づいて反応が完了するまで１２５℃に加熱した。該反応液を室温に冷却し、飽和重炭酸ナトリウム／酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して褐色残渣を得た。該粗生成物を、１０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを使用して調製用ＴＬＣで精製した。Ｒ_ｆ＝０．２５で単離されたバンドから、３７．３ｍｇ（７６％）の薄褐色残渣を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値 Ｃ_１２Ｈ_１７Ｎ_３Ｏ ｍ／ｚ＝２１９．１４、測定値 ｍ／ｚ＝２２０．５６［Ｍ＋Ｈ］。

標的ベンズイミダゾール合成の基本手順。１９ｍｇの適切なアクルイルアミノベンズイミダゾール（aklylaminobenzimidazole）及び３２ｍｇの適切なブロモアセトフェノン ５を、１ドラムのバイアル中の０．５ｍＬブタノールに添加した。該反応液を、ＴＬＣ解析に基づいて反応が完了するまで１１５℃に加熱した。該ブタノールを除去し、該粗混合物を飽和重炭酸ナトリウム／酢酸エチルで抽出した。該有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまで濃縮した。該粗混合物を、５％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃを使用して調製用ＴＬＣで精製した。

２−（２−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−５，６−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）エタノン（１）。Ｒ_ｆ＝０．３。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、３００ＭＨｚ）ä ０．８７〜１．００（ｍ、２Ｈ）、１．４９（ｓ、１８Ｈ）、２．２２（ｓ、３Ｈ）、２．２６（ｓ、３Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝５．６、２Ｈ）、３．６１（ｔ、Ｊ＝５．５、２Ｈ）、５．６０（ｓ、２Ｈ）、６．８７（ｓ、１Ｈ）、７．０５（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｓ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値 Ｃ_２８Ｈ_３９Ｎ_３Ｏ_３ ｍ／ｚ＝４６５．３０、測定値 ｍ／ｚ＝４６６．８２［Ｍ＋Ｈ］。

１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェニル）−２−（２−（３−ヒドロキシプロピルアミノ）−５，６−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）エタノン。Ｒ_ｆ＝０．４。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値 Ｃ_２９Ｈ_４１Ｎ_３Ｏ_３ ｍ／ｚ＝４７９．３１、測定値 ｍ／ｚ＝４８０．５３［Ｍ＋Ｈ］。

２−（２−（３−メトキシプロピルアミノ）−５，６−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）エタノン（３３）。Ｒ_ｆ＝０．４。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、３００ＭＨｚ）δ １．４９（ｓ、１８Ｈ）、１．８９〜１．９７（ｍ、２Ｈ）、２．２８（ｓ、３Ｈ）、２．２９（ｓ、３Ｈ）、３．２５（ｓ、３Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝５．６、２Ｈ）、３．６０（ｔ、Ｊ＝５．５、２Ｈ）、５．１６（ｓ、２Ｈ）、６．７９（ｓ、１Ｈ）、７．２７（ｓ、１Ｈ）、７．９１（ｓ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値 Ｃ_２９Ｈ_４１Ｎ_３Ｏ_３ ｍ／ｚ＝４７９．３１、測定値 ｍ／ｚ＝４８０．２３［Ｍ＋Ｈ］。

２−（２−（３−メトキシプロピルアミノ）−５，６−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）−１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェニル）エタノン（３４）。Ｒ_ｆ＝０．６。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、３００ＭＨｚ）ä１．４４（ｓ、１８Ｈ）、１．８９〜１．９７（ｍ、２Ｈ）、２．２８（ｓ、３Ｈ）、２．２９（ｓ、３Ｈ）、３．２５（ｓ、３Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝５．６、２Ｈ）、３．６０（ｔ、Ｊ＝５．５、２Ｈ）、３．７２（ｓ、３Ｈ）、５．１８（ｓ、２Ｈ）、６．７９（ｓ、１Ｈ）、７．２７（ｓ、１Ｈ）、７．９５（ｓ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値 Ｃ_３０Ｈ_４３Ｎ_３Ｏ_３ ｍ／ｚ＝４９３．３３、測定値 ｍ／ｚ＝４９４．１３［Ｍ＋Ｈ］。

１−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−（２−（ブチルアミノ）−５，６−ジメチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−イル）エタノン（４０）。Ｒ_ｆ＝０．８。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、３００ＭＨｚ）ä０．９０〜０．９５（ｍ、３Ｈ）、１．４７（ｓ、１８Ｈ）、１．５７〜１．６８（ｍ、４Ｈ）、３．４４–３．５０（ｍ、２Ｈ）、３．６１（ｔ、Ｊ＝５．５、２Ｈ）、５．１４（ｓ、２Ｈ）、６．８２（ｓ、１Ｈ）、７．２８（ｓ、１Ｈ）、７．９２（ｓ、２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値 Ｃ_２９Ｈ_４１Ｎ_３Ｏ_２ ｍ／ｚ＝４６３．３２、測定値 ｍ／ｚ＝４６４．３５［Ｍ＋Ｈ］。

実施例２：生化学的／生物学的アッセイ
物質及び方法
試薬。ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、レチノイン酸（ＲＡ）、ドキソルビシン、及びγ−Ｔｒｉ−ＤＡＰは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（セントルイス、米国ミズーリ州）であり、ホルボールジブトリエート（ＰＤＢｕ）、ＰＫＣ阻害剤（ビスインドリルマレイミドＩ）、及びＩＫＫ阻害剤（ＢＭＳ−３４５５４１）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製（ギブスタウン、米国ニュージャージー州）だった。抗マウスＣＤ３、抗マウスＣＤ２８、抗マウス−ＩｇＭは、Ｂｉｏｍｅｄａ社（フォスターシティ、米国カリフォルニア州）から取得した。抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ２８、及び抗マウスＩｇＧ抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ社製（ミネアポリス、米国ミネソタ州）だった。抗ヒトＴＲＡＦ６抗体は、記載されている。ＨＡ−ＩＫＫ−γ、ＸＩＡＰ、ＨＡ−ＴＡＫ１、ＴＡＢ１、ＣＤ４−ＴＬＲ４ ＣＤ４０、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ｃＩＡＰ１／ＭＡＬＴ、カスパーゼ８、及びカスパーゼ８（Ｃ３６０Ｓ）、並びにＴＲＡＦ６をコードするプラスミドは、以前に記載されている。Ｍｙｃ−ＣＡＲＭＡ１及びＣＡＲＭＡ３は、Ｘｉｎ Ｌｉｎ博士（テキサス大学、Ｍ．Ｄ．、アンダーソン癌センター（Anderson Cancer Center））からの寄贈だった。

細胞工学。ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＵＣ１３−４ｘＮＦκＢ−Ｌｕｃ及びｐ−ＴＫ−ピューロマイシン耐性プラスミドで同時形質移入した。安定したクローンを、１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１μｇ／ｍＬピューロマイシンを含有する１％容積／容積のペニシリン−ストレプトマイシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）で補完したダルベッコ変法イーグル培地（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）での培養により選択した。個々のクローンを、ＰＭＡ／イオノマイシン誘導性及びＴＮＦ誘導性ＮＦ−κＢレポーター遺伝子活性に対する応答性について試験し、ＨＴＳ用のクローンを選択した。

化合物。５０，０００個の化合物を有するＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅライブラリー（サンディエゴ、米国カリフォルニア州）、２，０００個の化合物を有するＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍコレクション（グロトン、米国コネティカット州）、１，２８０個の化合物を有するＬＯＰＡＣライブラリー（Ｓｉｇｍａ社）、及び６１，６０９個の化合物を有するＮＩＨライブラリーを含む化学ライブラリーを、細胞性ＮＦ−κＢルシフェラーゼリポーターアッセイを使用してスクリーニングした。

ＨＴＳ。白色９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）においてＮＦ−κＢルシフェラーゼ発現ＨＥＫ２９３細胞を、１ウエル当たり１０^５個、９０μｌ ＤＭＥＭ中（１ウエル当たり）に播種し、終夜インキュベートした。１０μｌの化合物含有溶液を、液体ハンドラー（Ｂｉｏｍｅｋ（商標）ＦＸ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用して、各ウエルに添加した（１％ＤＭＳＯ中１．５μｇ／ｍＬの最終濃度）。２時間のインキュベーション後、ＤＭＥＭ中の１１μｌ ＰＭＡ（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）及びイオノマイシン（終濃度５０ｎｇ／ｍＬ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を使用して、細胞を刺激した。細胞プレートを１６時間インキュベートした後で培地を除去し、４０μｌの０．５×受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社製）を細胞プレートに添加した。プレートを少なくとも１５分間室温で静置させた後、４０μｌの０．１２５×ルシフェリン基質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社製）を各ウエルに添加した。ルミネセンス法（０．１秒読取り／ウエル）を使用して、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｔ（商標）を用いて３０秒以内でプレートを分析した。

カウンタースクリーニング及び２次アッセイ。ＴＮＦ経路の阻害剤についてのカウンタースクリーニングには、ＨＥＫ２９３−ＮＦκＢ−Ｌｕｃ細胞を、１ウエル当たり１０^５個の細胞で白色９６ウエルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製）の１ウエル当たり９０μＬ培地に播種し、終夜培養した後で、化合物（培地中５μＬ）を細胞に添加した。２時間のインキュベーション後、５μＬのＴＮＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、細胞を１６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して測定した。ＴＬＲ４、ＣＤ４０、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ｃＩＡＰ２／ＭＡＬＴ、又はＸＩＡＰ／ＴＡＢで誘導したＮＦ−κＢの阻害剤についてのカウンタースクリーニングには、上記のように９６ウエルプレートで培養した２９３−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ細胞を、化合物で２時間前処理し、その後１ウエル当たり１００ｎｇのＤＮＡを含む０．２μＬの形質移入試薬を使用し、ｐｃＤＮＡ３（「空ベクター」対照）又はＣＤ４−ＴＬＲ４、ＣＤ４０、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ｃＩＡＰ２／ＭＡＬＴ、ＸＩＡＰ／ＴＡＢをコードするプラスミドを含む種々のプラスミドを、リポフェクタミン２０００を使用して形質移入した。細胞をＣＩＤ−２８５８５２２化合物又は他の化合物を含有する培地で培養し、４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。或いは、２９３−ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ細胞を、１６μＭのオールトランス型レチノイン酸と共に４８時間、又は２μＭのドキソルビシンと共に４８時間培養した後で、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を測定した。ルシフェラーゼ阻害剤についてのカウンタースクリーニングを、１ウエル当たり４５μＬのＡＴＰｌｉｔｅ溶液及びルシフェラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を含有する９６ウエル白色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ社製）で実施した。５μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した化合物を、８μＭの最終濃度で添加した。その後、５０μＬのＰＢＳ中１６０ｎＭ ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ社製）の添加により反応を開始させ、ルシフェラーゼ活性を、ルミノメータ（ＬＪＬバイオシステムズ社製、サニーベール、米国カリフォルニア州）を使用して２時間後に測定した。

細胞生存率アッセイ。細胞生存率は、ＡＴＰｌｉｔｅキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して測定した細胞ＡＴＰレベルに基づいて推定した。１０^５／ｍＬの密度の細胞を、１ウエル当たり９０μＬで９６ウエル白色プレートに播種し、終夜培養した。化合物をウエルに添加し（培地中５μＬ）、細胞を１６時間培養した。最後に、５０μＬのＡＴＰｌｉｔｅ溶液を各ウエル添加し、発光活性をルミノメータ（ＬＪＬバイオシステムズ社製、サニーベール、米国カリフォルニア州）を使用して判読した。

リンホカイン測定。培地中のヒトＩＬ−２又はＩＬ−８のレベルを、９６ウエルＥＬＩＳＡプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用し、メーカーのプロトコールに従ってＢＤ ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、サンディエゴ、米国カリフォルニア州）を使用して、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０型分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用して、反応開始の３０分以内に吸光度を測定した。

ＮＦ−κＢ活性の２重ルシフェラーゼアッセイ。９６ウエル黒色プレートに播種した細胞を、リポフェクタミン２０００を使用して、ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド及びＮＦ−κＢ応答性ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドで、ｐｃＤＮＡ３対照で、又は種々の所望のタンパク質をコードするプラスミドで同時形質移入した。培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄した後で１ウエル当たり５０μＬの受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、その後、２重ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、分光蛍光計を使用してホタルルシフェラーゼ活性及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。

ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性アッセイ。核抽出物を、キット（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製、カルスバド、米国カリフォルニア州）を使用して、１０ｃｍ^２プレートのコンフルエント細胞から調製した。核分画の総タンパク質含量をブラッドフォード法で定量化し、その後−８０℃で保管した。核抽出物（１０μｇタンパク質）でのＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性を、ＮＦ−κＢコンセンサス結合部位（５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’）を含有する二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド及び抗ｐ６５抗体をコーティングした９６ウエルプレートを使用したイムノアッセイ法（ＴｒａｎｓＡＭキット［活性モチーフ］）を使用して測定し、該抗体を、分光光度計ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、サニーベール、米国カリフォルニア州）を使用して５分以内に４５０ｎｍで判読される吸光度を示す発色基質を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体で検出した。

リンパ球増殖アッセイ。脾細胞を正常Ｂａｌｂ／ｃマウスから単離し、マウス赤血球溶解キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ミネアポリス、米国ミネソタ州）を使用して赤血球を除去した。脾細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び１ｍＭ Ｌ−グルタミンで補完したＲＭＰＩ−１６４０培地に懸濁した。細胞を２×１０^６細胞／ｍＬに希釈し、２００μＬを丸底９６ウエルプレートに播種し、５％ＣＯ_２で３７℃及び９５％相対湿度でインキュベートした。培地で希釈した化合物又はＤＭＳＯで細胞を２時間前処理し、次いで抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８又は抗ＩｇＭ抗体で４８時間処理した後、１μＣｉ［^３Ｈ］−チミジン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製、ソロン、米国オハイオ州）を１２時間添加した。ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、細胞をガラス繊維フィルター（Ｗａｌｌａｃ社製、ツルク、フィンランド）に移動し、乾燥させ、ＤＮＡへの［^３Ｈ］取込みを、シンチレーション計数器Ｂｅｔａｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）並びにＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉｌｕｘ ＬＣＳ及び発光計数器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）により定量化した。

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞培養。ＣＬＬ患者に由来する末梢血単核細胞を、ＩＲＢ承認の下で、フィコール密度勾配遠心分離により全血から取得し、１０％ＦＢＳ及び抗生物質で補完したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。

Ｉｎ Ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ。ＰＫＣベータ、ＰＫＣシータ、及びＩＫＫベータｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを、メーカーのプロトコールに従ってＨＴＳｃａｎキナーゼアッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、ダンバーズ、米国マサチューセッツ州）を使用して実施した。３００個を超えるキナーゼの一団は、Ａｍｂｉｔ Ｉｎｃ．社によりスクリーニングされた。

本明細書に記載の方法により合成した幾つかの化合物を、ＮＦ−κＢ活性化阻害に関する効能について試験した。結果を下記の表１及び２に示す。

出版物、特許、及び特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書では、本発明が、その特定の好ましい実施形態に関して記載されており、多くの詳細は例示目的で示されているが、当業者であれば、本発明にはさらなる実施形態の余地があり、本明細書に記載されている特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱せずに相当変更することができることを理解しよう。

Claims (22)

1. 式Ｉ又は式ＩＩの化合物
   又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグであって、式中、
   Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
   Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
   Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
   Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
   Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
   ｎが、０〜１０の整数である化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ。
2. Ｒ_１が、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
3. Ｒ_２及びＲ_３が、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
4. Ｒ_９ａ及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
5. Ｒ_５〜Ｒ_８が、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
6. Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、Ｒ_２０が、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、及びフェニルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
7. Ｒ_４が、−ＯＨ、−ＯＣＨ_３、及び−ＯＰｈからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
8. Ｒ_５及びＲ_８が水素である、請求項１に記載の化合物。
9. Ｒ_６及びＲ_７がメチルである、請求項１に記載の化合物。
10. Ｒ_１０及びＲ_１４が、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
11. Ｒ_１１及びＲ_１３が、各々独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
12. Ｒ_１２が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、及びｔ−ブチルからなる群から選択され、Ｒ_２０が、水素、メチル、エチル、プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、及びフェニルからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
13. ｎが１〜５の整数である、請求項１に記載の化合物。
14. 前記化合物が以下の構造を有する、請求項１に記載の化合物：
    
15. 式Ｉ又は式ＩＩの化合物
    又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ、及び薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含む医薬組成物であって、
    式中、
    Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
    Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
    ｎが、０〜１０の整数である医薬組成物。
16. 抗原受容体を介したＮＦ−κＢの活性化を選択的に阻害する化合物を同定する方法であって、
    （ａ）ＮＦ−κＢ応答性プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子で形質移入した細胞を含む水溶液を準備することと、
    （ｂ）前記溶液に試験化合物を添加することと、
    （ｃ）前記溶液にＮＦ−κＢを誘導する刺激を加えることと、
    （ｄ）前記試験化合物が、前記刺激に対する細胞応答を低減するかどうかを決定することとを含み、
    前記試験化合物が、式Ｉ又は式ＩＩの化合物
    又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグであり、式中、
    Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
    Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
    ｎが、０〜１０の整数である方法。
17. 前記レポーター遺伝子が、ＮＦ−κＢ応答性プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記試験化合物が、前記刺激に対する応答を５０％を超えて低減する、請求項１６に記載の方法。
19. 抗原受容体を介したＮＦ−κＢの細胞内での活性化を選択的に阻害する方法であって、前記細胞を式Ｉ又は式ＩＩの化合物
    又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと接触させることを含み、式中、
    Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
    Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
    ｎが、０〜１０の整数である方法。
20. 前記接触が、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項３０に記載の方法。
21. 対象体で抗原受容体を介したＮＦ−κＢの活性化を選択的に阻害する方法であって、その必要性のある対象体を同定することと、式Ｉ又は式ＩＩの化合物
    又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを前記対象体に投与又は前記対象体と接触させることとを含み、式中、
    Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
    Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
    ｎが、０〜１０の整数である方法。
22. 対象体にて抗原受容体を介したＮＦ−κＢの活性化と関連する疾患を治療する方法であって、
    その必要性のある対象体を同定することと、式Ｉ又は式ＩＩの化合物
    又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを前記対象体に投与又は前記対象体と接触させることとを含み、式中、
    Ｒ_１が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_９ａ、及びＲ_９ｂが、各々独立して、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_４が、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、及び−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０からなる群から選択され、
    Ｒ_５〜Ｒ_８及びＲ_１０〜Ｒ_１４が、各々独立して、水素、−ＯＲ_２０、−ＳＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ_２０、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_２０、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、
    Ｒ_２０が、水素、アルキル、シクロアルキル、及びアリールからなる群から選択され、及び
    ｎが、０〜１０の整数である方法。