JP2011507817A - マラリア用ワクチン - Google Patents
マラリア用ワクチン Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011507817A JP2011507817A JP2010538785A JP2010538785A JP2011507817A JP 2011507817 A JP2011507817 A JP 2011507817A JP 2010538785 A JP2010538785 A JP 2010538785A JP 2010538785 A JP2010538785 A JP 2010538785A JP 2011507817 A JP2011507817 A JP 2011507817A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- csv
- protein
- particles
- composition
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6075—Viral proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10123—Virus like particles [VLP]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
a. プラスモディウム・ビバックス(P.vivax)のCSタンパク質に由来する配列とB型肝炎のS抗原に由来する配列を含む融合タンパク質(CSV-S)、および
b. B型肝炎ウイルスに由来するS抗原
を含み、SのCSV-Sに対する比が0.1〜1の範囲であることを特徴とする、免疫原性タンパク質粒子を提供する。
配列番号1 ハイブリッドタンパク質CSVのヌクレオチド配列(大腸菌(E Coli)での発現用に最適化されている)
配列番号2 ハイブリッドタンパク質CSVのアミノ酸配列
配列番号3 ハイブリッドタンパク質CSVのヌクレオチド配列(酵母での発現用に最適化されている)
配列番号4 ハイブリッド融合タンパク質CSV-Sのヌクレオチド配列
配列番号5 ハイブリッド融合タンパク質CSV-Sのアミノ酸配列
配列番号6および7 RTS発現カセットのヌクレオチド配列および推定RTSタンパク質
配列番号8 CSV-S融合遺伝子(pHIL-D2組込みピキア・パストリス(Pichia pastoris)発現ベクター中にクローン化したもの)のヌクレオチド配列
配列番号9 ピキア・パストリスにおいて発現されるCSV-S融合タンパク質のアミノ酸配列
配列番号10 S遺伝子(pPICZ-A組込みピキア・パストリスベクター中にクローン化したもの)のヌクレオチド配列
配列番号11 配列番号10によってコードされるアミノ酸配列。
本発明で用いられる融合タンパク質CSV-Sは、プラスモディウム・ビバックスのCSタンパク質(CSV)に由来する部分を含む。このCSV抗原は、プラスモディウム・ビバックスのI型CSタンパク質および/またはプラスモディウム・ビバックスのII型タンパク質に見られるような天然(native)タンパク質であり得る。別法として、このCSVタンパク質は、該I型およびII型のCSタンパク質に由来するエレメント(要素)を含むハイブリッドタンパク質またはキメラタンパク質であってよい。後者がS抗原に融合される場合、本明細書中ではこれを「ハイブリッド融合タンパク質」と呼ぶ。
プラスモディウム・ビバックスのI型スポロゾイト周囲タンパク質の中央反復部分に由来する少なくとも1つの反復ユニット、および
プラスモディウム・ビバックスのII型スポロゾイト周囲タンパク質の中央反復部分に由来する少なくとも1つの反復ユニット
を含む。
酵母発現用の適切なコドン使用頻度を有するCSV合成遺伝子を構築し、pUC57ベクター中にサブクローニングした(GenBank/EMBLアクセッション番号Y14837)。結果として得られたプラスミドpUC57/CSVと酵母発現ベクターpGf1-S2を、いずれも適切な酵素で制限消化した。ベクターpGf1-S2は、多段階クローニング法により(GSKにおいて)構築した。S発現カセットを既に担持するこのベクターは、B型肝炎ウイルスのS遺伝子とのN末端インフレーム融合での融合遺伝子の構築を可能とする。配列確認後の最終的な発現ベクターは、pRIT15546と名付けた(図8)。
本発明のハイブリッドタンパク質の発現カセットは、例えば、以下の特性を含めて構築することができる:
・例えばサッカロミセス・セレヴィシエTDH3遺伝子に由来する、プロモーター配列;
・適切な融合タンパク質をコードする配列;
・例えばサッカロミセス・セレヴィシエARG3遺伝子に由来する、配列中に含まれる転写終結配列。
本発明のハイブリッドタンパク質の発現カセットは、例えば、以下の特性を含めて構築することができる。
・適切な融合タンパク質をコードする配列。
・例えばピキア・パストリスのAOX1遺伝子調節エレメントに由来する、配列中に含まれる転写終結配列。
本明細書において、「賦形剤」は、医薬製剤中の、それ自体では治療効果を有さない構成成分を指す。希釈剤または液体担体は、賦形剤の定義の範囲に含まれる。アジュバントもまた、賦形剤の定義の範囲に含まれる。なぜならアジュバントは免疫応答を刺激することができるが、治療的成分の非存在下ではこの免疫応答は非特異的だからである。
1つの実施形態において、アジュバントはToll様受容体(TLR)4リガンドであり、例えば、リピドA誘導体(特にモノホスホリルリピドAまたは、さらに特に3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL))などのアゴニストである。
・例えばバルク組成物としての、または個人用量(例えば同一容器に入った1回用量もしくは2回用量)での医薬組成物、または
・ワクチン組成物
を提供し、該ワクチン組成物はアジュバントをさらに含む。
・例えば用量当たり10〜100μgに相当する量の本発明の粒子、
・用量当たり1〜10mgに相当する範囲のアルカリ金属塩(例えば塩化ナトリウム)、
・例えば用量当たり100〜1000μgの範囲に相当する量のリン脂質(DOPCなど)、および
・場合により、例えば用量当たり10〜250μgの範囲に相当する量のコレステロール
を含む組成物を提供する。
各ワクチン用量中に存在する本発明のタンパク質粒子の量は、標準的なワクチン中で重大な副作用を伴うことなく適切な免疫応答または免疫防御応答を誘導する量として選択される。かかる量は、どの特異的免疫源が使用されるか、及びそのワクチンがアジュバント化されているか否かによって異なる。通常、各用量は、1〜1000μgのタンパク質、例えば1〜200μg(10〜100μgなど)のタンパク質を含むことが期待される。特定のワクチンの最適量は、抗体力価および患者における他の応答の観察を含む標準的な試験によって確定することができる。最初のワクチン接種の後、被験体は、約4週間以内にブースト(追加免疫)を受け、その後、感染のリスクが存在する限り6ヶ月〜12ヶ月毎にブーストを繰り返し得る。本発明の粒子に対する免疫応答は、アジュバントおよび/または免疫賦活剤の使用により増強されると考えられる。
Y1834株の説明
酵母組換え株Y1834を使用して、本発明の融合タンパク質を発現させることができる。この株は、組換え発現ベクターpRIT15546で形質転換されたサッカロミセス・セレヴィシエ宿主株DC5からなる。
酵母発現用の適切なコドン使用頻度を有する合成遺伝子を構築し、pUC57ベクター中にサブクローニングした。結果として得られたプラスミドpUC57/CSVと酵母発現ベクターpGf1-S2は、いずれも適切な酵素で制限消化した。ベクターpGf1-S2は、多段階クローニング法により(GSKにおいて)構築した。既にS発現カセットを担持するこのベクターは、B型肝炎ウイルスのS遺伝子とのN末端インフレーム融合での融合遺伝子の構築を可能とする。配列確認後の最終的な発現ベクターは、pRIT15546と名付けた(図1)。
ロイシンおよびヒスチジン栄養要求性DC5株を、酵母標準プロトコールを用いて、組換えプラスミドpRIT15546で形質転換した。形質転換細胞を寒天選択プレート上にプレーティングした。1つの形質転換体を選択し、Y1834という公式名称を受けた。
Y1834を、8μg/mlのヒスチジンを補充したYNB(Kracker Scientific Incから入手可能な酵母窒素塩基(Yeast Nitrogen Base))最小培地中で、O.D.(620nm)が0.5になるまで30℃で増殖させる。その後細胞を回収し、細胞抽出物を調製する。
細胞を破壊緩衝液中に再懸濁し、機械的に破壊する(ガラスビーズ)。抽出物は、5000rpmで15分間遠心分離する。上清画分をSDS-PAGE(4〜20%)にかける。
破壊緩衝液: 50mMリン酸ナトリウムバッファ(PH7.5)
4mM EDTA
Tween20(0.5%)
+プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete/ROCHE社)
細胞濃度: 5ml破壊緩衝液中に100ml培養物(OD 0.5) =濃度10 OD単位/ml
粗抽出物の清澄化: 抽出物は、15分間/5000rpmで遠心分離した。
清澄化した抽出物をSDS-PAGE(4〜20%)にかけ、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、免疫染色に供する。
試薬 = マウスモノクローナル抗体 抗S(GSK Biologicalsにより製造)(希釈:1/500)
市販の抗S抗体は、この方法で用いられる抗S抗体に代替することができる。別法として、抗CSV抗体、例えば米国国立衛生研究所(NIH)から入手可能な、MR4として知られる抗CSV抗体を使用することができる。
Y1835株の説明
酵母組換え株Y1835は、CSV-S融合タンパク質とS抗原とを同時に発現する。CSV-Sタンパク質とSタンパク質とを共発現する株を得るため、S発現カセットの組込みコピー5つを既に担持するサッカロミセス・セレヴィシエ株Y1295を、組換え組込み発現ベクターpRIT15582で形質転換した(図3)。
pRIT15582ベクターを構築するために使用した出発物質は、発現プラスミドpRIT15546(図1)であった。このプラスミドの構築は、実施例1に記載される。HindIIIエンドヌクレアーゼを用いたpRIT15546の消化で、完全長CSV-S発現カセット(pTDH3 + CSV-S + tARG3)に対応する、3706bpの長さのDNAフラグメントを遊離させる。このHindIII DNAフラグメント(T4 DNAポリメラーゼで充填した後)を、Tyベースの組込みベクターpRIT13144上の唯一のSalIクローニング部位に挿入した(SalI制限消化/T4処理)。結果として得られたプラスミドpRIT15582は、上記の発現カセットに加えて、選択マーカーとして酵母LEU2遺伝子を含む(図3)。XhoIエンドヌクレアーゼを用いたpRIT15582の消化は、内在性Tyエレメントを含む自由端の相同組換えによって酵母ゲノム中に組込まれ得る、図4に示す8500bpの線状フラグメントを遊離させる。
Sタンパク質とCSV-Sタンパク質の両方を発現する株を得るため、Y1295株を8500bpの線状XhoIフラグメント(図4)で形質転換し、Leu+コロニーを選抜した。様々な比でゲノム中に存在する両方の発現カセットのセットを含む幾つかの組込み体を得た。4コピーのCSV-Sカセットを担持する1つの形質転換体を選択し、公式名称Y1835を与えた。
Y1835を、YNB(Kracker Scientific Incから入手可能な酵母窒素塩基(Yeast Nitrogen Base))最小培地中で、O.D.(620nm)が約0.5(0.8)になるまで30℃で増殖させる。その後細胞を回収し、細胞抽出物を調製する。
抽出物の調製:
細胞を破壊緩衝液中に再懸濁し、機械的に破壊する(ガラスビーズ)。抽出物は、5000rpmで5〜10分間遠心分離する。上清画分をSDS-PAGE(12.5%)にかける。
破壊緩衝液: 50mMリン酸ナトリウムバッファ(PH7.5)
4mM EDTA
Tween20(0.5%)
+プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete/ROCHE社)
細胞濃度: 2.5ml破壊緩衝液中に100ml培養物(OD 0.5) =濃度20 OD単位/ml
粗抽出物の清澄化: 抽出物は、5〜10分間/5000rpmで遠心分離した。
清澄化した抽出物をSDS-PAGE(12.5%)にかけ、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、免疫染色に供する。
試薬: 1/マウスモノクローナル抗体 抗S(GSK Biologicalsにより製造)-(希釈:1/250)
2/ウサギポリクローナル抗体 抗CSV(WRAIRより好意で提供)-希釈 1/20,000
市販の抗S抗体ならびに抗プラスモディウム・ビバックス/CSP抗体は、この方法で用いられる抗S抗体ならびに抗プラスモディウム・ビバックス/CSP抗体に代替することができる。
以下の抗原を評価した:
1. CSV-S,S:サッカロミセス・セレヴィシエにおいて生成され、B型肝炎ウイルスに由来するS抗原に融合させたCSV構築物(すなわち、反復領域中の多型に向けられ、CSVタンパク質のN末端部分およびC末端部分を含むハイブリッドCSV分子。さらに、この構築物は公知のTエピトープおよびBエピトープを含む。)(CSV-S)からなる混合粒子。さらに、これらの粒子中には遊離S抗原が存在する。
・単純粒子(CSV-S)と、QS21とMPLとを含むリポソームアジュバント製剤(0日目、14日目、および28日目)、または
・混合粒子(CSV-S,S)と、QS21とMPLとを含むリポソームアジュバント製剤(0日目、14日目、および28日目)
を注射した。
抗体応答(各群の動物個体それぞれに由来する血清に対してELISAを行った):
- 2つの時点で測定した:14pIIおよび14pIII
- 2つの血清学的検査を測定した:a)CSVに対する抗体応答
b)HBsに対する抗体応答
- 各時点において、それぞれ4匹〜5匹のいずれかのマウスからなる4つのプールからデータを集めた。
結果は、図7〜16に示される。
Y1840株の説明
ピキア・パストリス株Y1840は、CSV-S融合タンパク質を発現する。Y1840株は、ゲノム中に組み込まれた、4コピーのCSV-S融合遺伝子を含む。CSV-S融合タンパク質を発現する株を得るため、ピキア・パストリス株GS115を、CSV-Sカセットと機能的HIS4遺伝子を担持する組込み線状DNAフラグメントで形質転換した。
pRIT15546上に存在するCSV-S融合遺伝子をPCRで増幅し、pGEM-T Easy中間ベクター(Promega、カタログNo:#A1360)中にクローン化した。配列確認後、組換えプラスミドを適当な制限酵素で消化し、pHIL-D2 ピキア・パストリス組込みベクター中にクローン化した。配列確認後の最終的な発現ベクターを、pRIT15607と名付けた(図18)。NotIエンドヌクレアーゼを用いたpRIT15607の消化は、内在性AOX1遺伝子座における相同組換えによって酵母ゲノム中に組込まれ得る、6816bpの線状フラグメントを遊離させる。
GS115宿主株を、組換えプラスミドpRIT15607で形質転換した。発現カセットとHIS4選択マーカーを担持する線状DNAフラグメントを遊離させるため、この組込みベクターを、形質転換の前にNotIで制限消化した。NotI制限消化は、AOX1遺伝子座における組込みを促す。形質転換細胞を、寒天選択プレート上にプレーティングした。多コピー組込み体クローンを、定量的ドットブロット解析によって選択した。高コピー数の組込みCSV-S発現カセットを有している選択されたクローンの中から、CSV-S組換えタンパク質について最も高い発現レベルを示す1つのクローンを選択し、公式名称Y1840を与えた。このクローンは、4コピーのCSV-S融合遺伝子を有する。
Y1840を、炭素源として1%グリセロールを補充したYNB(Kracker Scientific Incから入手可能な酵母窒素塩基(Yeast Nitrogen Base))最小培地中で、O.D.(620nm)が約0.5(この場合0.709)になるまで30℃で増殖させる。その後細胞を回収し、炭素源として(誘導物質として)1%メタノールを補充した同量のYNB培地中に再懸濁し、30℃で約16時間インキュベートする。
メタノール誘導した細胞を遠心分離し、細胞ペレットを破壊緩衝液中に再懸濁し、機械的に破壊する(ガラスビーズまたはフレンチプレス)。抽出物は、5000rpmで5〜10分間遠心分離する。上清画分をSDS-PAGE(12.5%)にかける。
破壊緩衝液: 60mM Na2HPO4
40mM NaH2PO4
1mM MgSO4
10Mm KCl
Tween-20 (0.5%)
2Mm PMSF
細胞濃度: 2.5ml破壊緩衝液中に100ml培養物(OD 0.5) =濃度20 OD単位/ml
粗抽出物の清澄化: 抽出物は、5〜10分間/5000rpmで遠心分離した。
清澄化した抽出物をSDS-PAGE(12.5%)にかけ、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、免疫染色に供する。図23を参照のこと。
ウエスタンブロット解析:
試薬 = マウスモノクローナル抗体 抗S(GSK Biologicalsにより製造)-(希釈:1/250)
市販の抗S抗体は、この方法で用いられる抗S抗体に代替することができる。別法として、抗CSV抗体、例えば米国国立衛生研究所(NIH)から入手可能な、MR4として知られる抗CSV抗体を使用することができる。
CSV-S融合タンパク質: 理論分子量(MW): 51762ダルトン
見掛けの分子量(MW): 55 kDa
実施例5:
Y1847株の説明
ピキア・パストリス株Y1847は、CSV-S融合タンパク質とS抗原とを同時に発現する。CSV-Sタンパク質とSタンパク質とを共発現する株を得るため、CSV-S発現カセットの組込みコピー4つを既に担持するピキア・パストリス株Y1840を、組換え組込み発現ベクターpRIT15478で形質転換した。
pRIT15469組換えプラスミド(このプラスミドはB型肝炎に由来するS遺伝子を有する)をテンプレートとして用いて、S遺伝子をPCRで増幅した。上流プライマー:
は、ATG開始コドン(太字)の前にEcoRIの認識配列(下線)を含む。下流プライマー:
は、終止コドン(太字)の直後にXhoIの認識配列(下線)を含む。EcoRIおよびXhoI制限酵素を用いた消化の後、PCR生成物をpPICZ-AベクターのEcoRIおよびXhoIクローニング部位の間に直接挿入した。このインサートのヌクレオチド配列の確認後、上記の組換えプラスミドをpRIT15478と名付けた。pRIT15478の物理マップは、図18に示される。
形質転換の前に、pRIT15478ベクターを、SacIを用いた制限消化によって5'AOX1領域中で線状化した。この線状化ベクターは、遺伝子挿入によって宿主の5'AOX1領域に組込まれる。
Y1847を、1%グリセロールを補充したYNB(Kracker Scientific Incから入手可能な酵母窒素塩基(Yeast Nitrogen Base))最小培地中で、O.D.(620nm)が0.5になるまで30℃で増殖させる。その後細胞を回収し、1%メタノール(誘導物質として)を添加した同量のYNB培地中に再懸濁し、30℃で16時間インキュベートする。細胞抽出物を調製する。
抽出物の調製:
細胞を破壊緩衝液中に再懸濁し、機械的に破壊する(ガラスビーズ)。抽出物は、5000rpmで15分間遠心分離する。上清画分をSDS-PAGE(12.5%)にかける。
破壊緩衝液: 50mMリン酸ナトリウムバッファ(PH7.5)
4mM EDTA
Tween20(0.5%)
+プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete/ROCHE社)
細胞濃度: 2.5ml破壊緩衝液中に100ml培養物(OD 0.5) =濃度20 OD単位/ml
粗抽出物の清澄化: 抽出物は、15分間/5000rpmで遠心分離した。
清澄化した抽出物をSDS-PAGE(12.5%)にかけ、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、免疫染色に供する。
試薬 = マウスモノクローナル抗体 抗S(GSK Biologicalsにより製造)-(希釈:1/500)
市販の抗S抗体は、この方法で使用される抗S抗体に代替することができる。別法として、抗CSV抗体を使用することができる。
Y1847株での粒子の形成を、CsCl密度勾配遠心分離によって解析した。粗抽出物(全タンパク質のおよそ20mg)を、12mlの1.5M CsCl勾配上で解析した(Beckman 70.1 Tiローター中、+8℃で、40.000rpm、88時間)。画分(およそ0.6ml)を回収し、抗S抗体を用いた免疫ブロットによって解析した。図22に示すように、ウエスタンブロットのCSV-SとSのピークは、浮遊密度1.22g/cm3に相当する勾配の同じ画分(No.10)に現われる。二重(混合)粒子の形成は、勾配解析によって裏付けられる。
(1) Harford N, Cabezon T, Colau B, et al., "Construction and Characterization of a Saccharomyces Cerevisiae Strain (RIT4376) Expressing Hepatitis B Surface Antigen", Postgrad Med J 63, Supp. 2: 65-70, 1987.
(2) Jacobs E, Rutgers T, Voet P, et al., "Simultaneous Synthesis and Assembly of Various Hepatitis B Surface Proteins in Saccharomyces cerevisiae", Gene 80: 279-291, 1989.
(3) Vieira J and Messing J, "The pUC plasmids, an M13mp7-Derived System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers", *_Gene 19: 259-268, 1982.
(4) Hinnen A, Hicks JB, and Fink GR, "Transformation of Yeast", Proc Nat1 Acad Sci USA 75: 1929-1933, 1980.
(5) Broach JR, Strathern JN, and Hicks JB, "Transformation in Yeast Development of a Hybrid Cloning Vector and Isolation of the CAN 1 Gene", Gene 8: 121-133, 1979.
(6) Zhang H, et al., "Double Stranded SDNA Sequencing as a Choice for DNA Sequencing", Nucleic Acids Research 16: 1220, 1988.
(7) Dame JB, Williams JL. Mc Cutchan TF, et al., "Structure of the Gene Encoding the Immunodominant Surface Antigen on the Sporozoites of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum", Science 225: 593-599, 1984.
(8) Valenzuela P, Gray P, Quiroga M, et al., "Nucleotide Sequences of the Gene Coding for the Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen", Nature 280: 815-819, 1979.
(9) In SS, Kee-Hoyung L, Young RK, et al., “ comparison of Immunological responses to Various Types of Circumsporozoite Proteins of Plasmodium vivax in Malaria Patients of Korea”, Microbiol. Immunol. 48(2): 119-123, 2004;Microbiol. Immunol. 2004; 48(2): 119-123.
(10) Rathore D, Sacci JB, de la Vega P, et al., ”Binding and Invasion of Liver Cells by Plasmodium falciparum Sporozoites”, J. Biol. Chem. 277(9): 7092-7098, 2002.Rathore et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 7092-8
Claims (35)
- 以下の単量体:
a. プラスモディウム・ビバックス(P.vivax)のCSタンパク質に由来する配列とB型肝炎のS抗原に由来する配列を含む融合タンパク質(CSV-S)、および
b. B型肝炎ウイルスに由来するS抗原
を含み、SのCSV-Sに対する比が0.1〜1の範囲であることを特徴とする、免疫原性タンパク質粒子。 - SのCSVS-Sに対する比が0.19〜0.30の範囲である、請求項1に記載の粒子。
- 比が0.2〜0.25の範囲である、請求項2に記載の粒子。
- 比が約0.24である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の粒子。
- SのCSV-Sに対する比が0.68〜0.80の範囲である、請求項1に記載の粒子。
- 前記比が約0.73である、請求項1または請求項5に記載の粒子。
- B型肝炎抗原がadw血清型に由来する、請求項1〜6のいずれかに記載の粒子。
- CSV-S成分が配列番号5に示される配列を有する、請求項1〜7のいずれかに記載の粒子。
- 粒子がピキア・パストリス(Pichia pastoris)において調製された、請求項1〜8のいずれか1つに記載の粒子。
- 粒子がサッカロミセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)において調製された、請求項1〜8のいずれか1つに記載の粒子。
- 粒子が免疫原性である、請求項1〜10のいずれか1つに記載の粒子。
- 請求項1〜11のいずれか1つに記載の粒子と、賦形剤とを含む医薬組成物。
- 賦形剤がアジュバントである、請求項12に記載の組成物。
- アジュバントがサポニンを含む、請求項13に記載の組成物。
- サポニンがQS21である、請求項14に記載の組成物。
- アジュバントが3D-MPLを含む、請求項13〜15のいずれか1つに記載の組成物。
- 3D-MPLが小粒子MPLとして存在する、請求項16に記載の組成物。
- アジュバントがリポソーム製剤である、請求項13〜17のいずれか1つに記載の組成物。
- アジュバントが水中油型エマルションである、請求項13〜17のいずれか1つに記載の組成物。
- 以下:
・用量当たり10〜100μgの請求項1〜11のいずれか1つに記載の粒子、
・用量当たり1〜10mgのアルカリ金属塩、例えば塩化ナトリウム、
・用量当たり100〜1000μgのリン脂質、例えばDOPC、および
・場合により用量当たり10〜250μgのコレステロール
を含む、請求項12〜19のいずれか1つに記載の組成物。 - プラスモディウム・ファルシパルムおよび/またはプラスモディウム・ビバックスに由来する1つまたはそれ以上のさらなる抗原を混合してさらに含む、請求項12〜20のいずれか1つに記載の組成物。
- 混合したさらなる抗原がRTS,Sである、請求項21に記載の組成物。
- 組成物が非経口用ワクチンである、請求項12〜22のいずれか1つに記載の組成物。
- 治療における使用のための、請求項1〜11のいずれか1つに記載の粒子または請求項12〜23のいずれか1つに記載の組成物。
- マラリアの治療または予防のための医薬の製造のための、請求項1〜11のいずれか1つに記載の粒子または請求項12〜23のいずれか1つに記載の組成物の使用。
- 請求項1〜11のいずれか1つに定義されるタンパク質または請求項12〜23のいずれか1つに記載の組成物の有効量を特にワクチンとして投与するステップを含んでなる、プラスモディウム感染症にかかりやすい患者を治療する方法。
- CSV-SのDNA配列と、S抗原をコードする少なくとも1つのDNA配列とをコードするピキア・パストリス宿主。
- CSV-SのDNA配列と、S抗原をコードする少なくとも1つのDNA配列とをコードするサッカロミセス・セレヴィシエ宿主。
- 請求項1〜11のいずれか1つに記載の粒子の調製のための、請求項27または請求項28に記載の宿主の使用。
- 前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を酵母ピキア・パストリスまたはサッカロミセス・セレヴィシエにおいて発現させ、その生成物を回収することを含む、請求項1〜11のいずれか1つに記載の粒子の製造方法。
- 酵母が組換え株Y1847である、請求項30に記載の方法。
- 酵母が組換え株Y1835である、請求項30に記載の方法。
- 生成物が、界面活性剤を含む好適な組成物を用いた処理による宿主細胞の溶解によって回収される、請求項30〜32のいずれか1つに記載の方法。
- 界面活性剤が、Tween(例えばTween20および/またはTween80)を含む群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 請求項30〜34のいずれか1つに記載の方法によって得られる生成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US1652207P | 2007-12-24 | 2007-12-24 | |
US1652507P | 2007-12-24 | 2007-12-24 | |
PCT/EP2008/068130 WO2009080803A1 (en) | 2007-12-24 | 2008-12-22 | Vaccines for malaria |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011507817A true JP2011507817A (ja) | 2011-03-10 |
Family
ID=40560235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010538785A Pending JP2011507817A (ja) | 2007-12-24 | 2008-12-22 | マラリア用ワクチン |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8999347B2 (ja) |
EP (1) | EP2234638A1 (ja) |
JP (1) | JP2011507817A (ja) |
KR (1) | KR20100111281A (ja) |
CN (1) | CN101951947A (ja) |
AP (1) | AP2010005294A0 (ja) |
AR (1) | AR069936A1 (ja) |
AU (1) | AU2008339969A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0821531A2 (ja) |
CA (1) | CA2709041A1 (ja) |
CL (1) | CL2008003875A1 (ja) |
CO (1) | CO6300962A2 (ja) |
CR (1) | CR11585A (ja) |
DO (1) | DOP2010000186A (ja) |
IL (1) | IL206311A0 (ja) |
MA (1) | MA32029B1 (ja) |
PE (1) | PE20091529A1 (ja) |
TW (1) | TW200940087A (ja) |
UY (1) | UY31574A1 (ja) |
WO (1) | WO2009080803A1 (ja) |
ZA (1) | ZA201004414B (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2007276217B2 (en) * | 2006-07-18 | 2013-08-29 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccines for malaria |
GB201022007D0 (en) | 2010-12-24 | 2011-02-02 | Imp Innovations Ltd | DNA-sensor |
GB201608821D0 (en) | 2016-05-19 | 2016-07-06 | Isis Innovation | Vaccines |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006088597A2 (en) * | 2005-01-18 | 2006-08-24 | Walter Read Army Institute Of Research | A plasmodium vivax hybrid circumsporozoite protein and vaccine |
WO2007003384A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Anti-malaria vaccine |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG48390A1 (en) * | 1991-11-16 | 1998-04-17 | Smithkline Beecham Biolog | Hybrid protein between cs from plasmodium and hbs ag |
GB9616351D0 (en) * | 1996-08-02 | 1996-09-11 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine composition |
AU2007276217B2 (en) * | 2006-07-18 | 2013-08-29 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccines for malaria |
-
2008
- 2008-12-22 CL CL2008003875A patent/CL2008003875A1/es unknown
- 2008-12-22 EP EP08865243A patent/EP2234638A1/en not_active Withdrawn
- 2008-12-22 AU AU2008339969A patent/AU2008339969A1/en not_active Abandoned
- 2008-12-22 KR KR1020107016675A patent/KR20100111281A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-12-22 BR BRPI0821531-6A patent/BRPI0821531A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-12-22 PE PE2008002176A patent/PE20091529A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-12-22 TW TW097150072A patent/TW200940087A/zh unknown
- 2008-12-22 CN CN2008801275502A patent/CN101951947A/zh active Pending
- 2008-12-22 AP AP2010005294A patent/AP2010005294A0/en unknown
- 2008-12-22 UY UY31574A patent/UY31574A1/es unknown
- 2008-12-22 JP JP2010538785A patent/JP2011507817A/ja active Pending
- 2008-12-22 CA CA2709041A patent/CA2709041A1/en not_active Abandoned
- 2008-12-22 US US12/810,364 patent/US8999347B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-12-22 WO PCT/EP2008/068130 patent/WO2009080803A1/en active Application Filing
- 2008-12-22 AR ARP080105670A patent/AR069936A1/es not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-06-10 IL IL206311A patent/IL206311A0/en unknown
- 2010-06-11 CO CO10071043A patent/CO6300962A2/es not_active Application Discontinuation
- 2010-06-18 DO DO2010000186A patent/DOP2010000186A/es unknown
- 2010-06-22 ZA ZA2010/04414A patent/ZA201004414B/en unknown
- 2010-07-19 MA MA33034A patent/MA32029B1/fr unknown
- 2010-07-23 CR CR11585A patent/CR11585A/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006088597A2 (en) * | 2005-01-18 | 2006-08-24 | Walter Read Army Institute Of Research | A plasmodium vivax hybrid circumsporozoite protein and vaccine |
WO2007003384A1 (en) * | 2005-06-30 | 2007-01-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Anti-malaria vaccine |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CL2008003875A1 (es) | 2010-02-05 |
BRPI0821531A2 (pt) | 2015-06-16 |
ZA201004414B (en) | 2014-11-26 |
US20100272788A1 (en) | 2010-10-28 |
TW200940087A (en) | 2009-10-01 |
AU2008339969A1 (en) | 2009-07-02 |
CR11585A (es) | 2010-09-03 |
CA2709041A1 (en) | 2009-07-02 |
UY31574A1 (es) | 2009-08-03 |
MA32029B1 (fr) | 2011-01-03 |
AP2010005294A0 (en) | 2010-06-30 |
CN101951947A (zh) | 2011-01-19 |
EP2234638A1 (en) | 2010-10-06 |
IL206311A0 (en) | 2010-12-30 |
AR069936A1 (es) | 2010-03-03 |
CO6300962A2 (es) | 2011-07-21 |
WO2009080803A1 (en) | 2009-07-02 |
US8999347B2 (en) | 2015-04-07 |
DOP2010000186A (es) | 2010-09-30 |
KR20100111281A (ko) | 2010-10-14 |
PE20091529A1 (es) | 2009-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5592110B2 (ja) | マラリア用ワクチン | |
US20100272786A1 (en) | Vaccine | |
US20100272745A1 (en) | Vaccines for malaria | |
US8999347B2 (en) | Vaccines for malaria | |
AU2008333208A1 (en) | Vaccine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111205 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130702 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130925 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20131002 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140311 |