JP2011252868A - Nafldの進展度合いを判定する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)NAFLD患者から血液を採取するステップ;(b)血液試料中のオンコスタチンM濃度を測定するステップ;(c)オンコスタチンMの測定値が60pg/mlを超える場合、NAFLD activity score(NAS)が「6以上」と評価し、オンコスタチンMの測定値が20〜60pg/mlである場合、NASが5と評価し、オンコスタチンMの測定値が20pg/ml未満である場合、NASが4以下と評価するステップ;を備えたことを特徴とするNAFLDの進展度合いを判定する方法。
【選択図】なし
Description
DNAマイクロアレイ 実戦マニュアル、林崎良英 監修(羊土社);DNA Microarrays -A Practical Approach-, Edited by Mark Schene, Oxford University Press 1999;Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H, Brown EL. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays;Nat. Biotechnol. 1996 Dec. 14(13):1675-80;Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, Lockhart DJ. Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae;Nat. Biotechnol. 1997 Dec. 15(13):1359-67.
18才の男性と20才の男性の2人のNAFLD患者から、定法により調製した血清をそれぞれ試料に供した。ELISA法によるオンコスタチンMの測定には、株式会社エスアールエル社製のキット「human OSM(カタログナンバー:DY295)」を用い、添付のプロトコールにしたがって血清中のオンコスタチンM濃度を測定した。
オンコスタチンM捕捉抗体をPBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,8.1mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,pH7.2〜7.4,0.2μmフィルター滅菌)中に希釈した。96ウェルのマイクロプレートに、100μl/ウェルの希釈した捕捉抗体をコーティングし、プレートをシールして室温にて一晩静置した。各ウェルを吸引後、洗浄バッファーで洗浄し、同様のことを二回繰り返して合計三回行った。最後の洗浄後、プレートを吸引又はペーパータオルの上にインバートしてブロッティングすることにより、残存する洗浄バッファーを取り除いた。ウェル毎に300μlのブロッキングバッファー(1%BSA,5%シュークロースのPBS)でプレートをブロッキングし、1時間室温にてインキュベートした。吸引と洗浄を合計三回行い、ブロッキングバッファーを吸引後、サンプルの添加を行った。
100μlの試料又は対照試料をウェルに添加し、2時間インキュベートした。その後、プレートの調製と同様に吸引と洗浄を行った。100μlの基質溶液(発色試薬A(H2O2)と発色試薬B(Tetremethylbenzidine)の1:1混合物)をウェルに添加し、直射光を避けて室温で20分間インキュベートした。50μlのストップ溶液(2N H2SO4)を添加し、そっとたたいて十分混合した後、450nmにおける吸光度を測定した。
18才の男性のNAFLD患者の血清中のオンコスタチンM濃度は、72.9pg/ml(2009年9月8日)、68.8pg/ml(肝生検の翌日の2010年1月6日)、56.1pg/ml(2010年1月19日より小腸コレステロールトランスポーター阻害薬「EPA製剤」の内服加療開始後の2010年2月16日)であった。他方、20才の男性のNAFLD患者の血清中のオンコスタチンM濃度は、4回の測定(2009年11月24日、肝生検の翌日の2009年12月9日、2010年1月26日、2010年3月23日)とも測定感度(15.6pg/ml)未満であった。
上記の18才の男性と20才の男性の2人のNAFLD患者について、それぞれ2010年1月5日と2009年12月8日に肝生検を実施した。被検者の右肋間をイソジン(登録商標)にて消毒し、0.5%キシロカイン溶液で、穿刺部を局所麻酔した。エコーガイド下に、supercore 16G needleで肝右葉を穿刺し、微量の肝組織を採取した。採取された肝組織をホルマリン瓶に漬け、ホルマリン固定した組織からパラフィン標本を作製し、パラフィン包埋未染標本を作製し、ヘマトキシリンエオジン(HE)染色、アザン(Azan)染色及びオンコスタチンMレセプター(OSMR)を標的とした免疫抗体染色でそれぞれ染色し光学顕微鏡にて観察した。
上記のパラフィン包埋組織切片標本を、キシレンに5分間浸漬し、キシレンを蒸発させ、さらにキシレンに2回各3分間浸漬した。乾燥後同様に100%エタノール2回、95%エタノール1回、80%エタノール1回、70%エタノール1回、蒸留水1回の、各5分間の浸漬、及び乾燥処理を繰り返して脱パラフィン処理を行った。
クエン酸一水和物2.1gと蒸留水100mlを混合して調製した、0.1Mクエン酸水溶液(A液)と、クエン酸三ナトリウム二水和物14.7gと蒸留水500mlを混合して調製した、0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液(B液)とを準備し、ビーカーに、A液9ml、B液41ml、蒸留水450mlを入れて97℃に熱し、上記脱パラフィン処理を行った組織切片標本を5分間浸漬し、抗原(オンコスタチンM受容体)を賦活化した。その後、ビーカーごと水道水の中に入れ冷却後、切片標本を取り出して蒸留水に入れて冷却した。
0.3%過酸化水素メタノール溶液に、上記抗原が賦活化された切片標本を30分浸漬し、内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行い、蒸留水で3回各3分間洗浄した。
湿潤箱に少量の水道水を加え、切片標本の水分をよく切って、渡し棒の上にのせた。
10mlのPBS(Phosphate buffered saline)にブロッキング用血清として10%ヤギ血清を添加したブロッキング溶液を、切片標本に3滴滴下し、20分間反応させた後、ブロッキング溶液を捨て、切片標本に抗オンコスタチンM受容体一次抗体(Anti OSMR, Human (Rabbit) [Catalog Number : 10982-1-AP]、Proteintech Group社製)を滴下し、4℃にて一晩静置した後、PBSで3回各5分間洗浄した。
10mlのPBSにビオチン化二次抗体を3滴添加した溶液を切片標本に滴下し、室温にて60分間反応させた後、PBSで3回各5分間洗浄し、アビジン・ビオチン複合体PBS溶液を切片標本に滴下して室温にて30分間静置し、ABC反応させた。
DAB溶液(PBS 150ml+DAB(3,3'-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride))に、30%過酸化水素溶液を30μl添加して混合した溶液に、上記ABC反応後の切片標本を入れて発色させ、顕微鏡下オンコスタチンM受容体の発現状態を観察した。
ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)は組織学で組織薄片をみるのによく使われている。上記のパラフィン包埋未染標本をキシロール槽に入れてパラフィンを除去した切片を、ヘマトキシリン溶液に10秒程度浸漬して染色し、水道水で軽く洗浄した。70%エタノールに切片を1回3分間浸漬し、80%エタノールに切片を1回3分間浸漬し、90%エタノールに切片を1回3分間浸漬し、95%エタノールに切片を1回3分間浸漬し、100%エタノールに切片を2回各3分間浸漬した後、キシレンに、切片を3回各3分間浸漬した切片標本に、オイキットを滴下し、カバーグラスを載せて、顕微鏡で撮像した。
上記のパラフィン包埋未染標本について、線維組織染色のためのアザン染色を常法に従って行った。
18才の男性のNAFLD患者の肝生検のHE染色(200倍)の結果を図1に、アザン染色(100倍)の結果を図2に、OSMRを標的とした免疫抗体染色(400倍)の結果を図3に示す。これらの病理診断の結果から、18才の男性のNAFLD患者のNASは6点と判断され、NASHと判定された。他方、20才の男性のNAFLD患者の肝生検のHE染色(200倍)の結果を図4に、アザン染色(100倍)の結果を図5に、OSMRを標的とした免疫抗体染色(400倍)の結果を図6に示す。これらの病理診断の結果から、20才の男性のNAFLD患者のNASは4点と判断された。
ヒト肝臓組織の二重免疫組織染色の結果、オンコスタチンMレセプターの発現の局在と目視による脂肪滴の局在は一致した。ウイルス性肝炎であるC型慢性肝炎が進行すると、細胞への脂肪沈着が進み、いわゆる脂肪肝の症状が現れるが、この場合も、オンコスタチンMがかかる症状のマーカーとなる可能性を強く示唆している。実際に、NAS6点と判断された18才の男性のNAFLD患者の血清中のオンコスタチンM濃度は68.8pg/ml(肝生検の翌日)であり、NAS4点と判断された20才の男性のNAFLD患者の血清中のオンコスタチンM濃度は測定感度(15.6pg/ml)未満であった。これらのことから、NAFLD患者の血清中のオンコスタチンMを測定することにより、NAFLDの進展度合いを判定しうることが示された。
Claims (3)
- 以下の(a)〜(c)のステップを備えたことを特徴とする非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の進展度合いを判定する方法。
(a)NAFLD患者から血液を採取するステップ;
(b)血液試料中のオンコスタチンM濃度を測定するステップ;
(c)オンコスタチンMの測定値が60pg/mlを超える場合、NAS(NAFLD activity score)が「6以上」と評価し、オンコスタチンMの測定値が20〜60pg/mlである場合、NASが5と評価し、オンコスタチンMの測定値が20pg/ml未満である場合、NASが4以下と評価するステップ; - NAFLD患者から経時的に採取した血液中のオンコスタチンM濃度を測定し、経時的データを収集することを特徴とする請求項1記載のNAFLDの進展度合いを判定する方法。
- オンコスタチンMの測定キットを非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の進展度合いの判定に使用する方法。
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