JP2011250728A - Method of screening skin barrier function recovery-promoting substance using ryanodine receptor - Google Patents
Method of screening skin barrier function recovery-promoting substance using ryanodine receptor Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011250728A JP2011250728A JP2010125822A JP2010125822A JP2011250728A JP 2011250728 A JP2011250728 A JP 2011250728A JP 2010125822 A JP2010125822 A JP 2010125822A JP 2010125822 A JP2010125822 A JP 2010125822A JP 2011250728 A JP2011250728 A JP 2011250728A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- skin
- barrier function
- skin barrier
- ryanodine receptor
- recovery
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Abstract
Description
本発明は、リアノジン受容体の阻害活性を指標とする皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a screening method for a skin barrier function recovery promoting substance using the inhibitory activity of a ryanodine receptor as an index.
種々の皮膚疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等に見られる肌荒れ症状においては、皮膚からの水分の消失が、健常な皮膚に比べて盛んであることが知られている。このいわゆる経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の増加には、皮膚内において水分の保持やバリアーとしての機能を担っていると考えられる成分の減少が関与しているものと考えられてきた。 It is known that the loss of moisture from the skin is more prominent than that of healthy skin in various skin diseases such as atopic dermatitis, psoriasis, and contact dermatitis. . It has been considered that the increase in the so-called transdermal moisture transpiration (TEWL) is associated with a decrease in components that are thought to be responsible for moisture retention and as a barrier in the skin.
これまでに、皮膚バリアー機能の低下に伴い皮膚の皮膚機能が低下し、その結果皮膚増殖性異常等が起こることが報告されている。特に高齢者の場合、低下した皮膚バリアー機能の回復には長い時間がかかるため、加齢に伴う皮膚の皮膚機能の低下による皮膚増殖性異常等を防止するのに有効な、新たな皮膚バリアー機能回復剤が要望されている。 So far, it has been reported that the skin function of the skin is reduced with the reduction of the skin barrier function, and as a result, abnormal skin proliferation occurs. Especially for elderly people, it takes a long time to recover the reduced skin barrier function, so a new skin barrier function that is effective in preventing skin proliferative abnormalities due to a decrease in skin function due to aging. A recovery agent is desired.
皮膚バリアー機能回復促進製剤等の化粧料に含めることが検討される物質は、動物実験においてその効果が確認される必要がある。しかしながら、近年化粧品開発の現場においては、倫理上の観点から動物実験が制限される傾向にあり、動物に適用することなく候補物質をスクリーニングする方法についての要求も高まっている。 Substances that are considered to be included in cosmetics such as skin barrier function recovery promoting preparations need to be confirmed in animal experiments. However, in recent years, in the field of cosmetic development, animal experiments tend to be limited from the ethical point of view, and there is an increasing demand for methods for screening candidate substances without applying them to animals.
本発明者らは以前、特定のイオンチャネル型受容体、例えばグルタミン酸受容体、ＧＡＢＡ受容体を介した表皮ケラチノサイト内へのカルシウムイオンの流入が皮膚バリアー機能回復促進を阻害することを明らかにしている（Denda M, et al., "Influx of Calcium and Chloride Ions into Epidermal Keratinocytes Regulates Exocytosis of Epidermal Lamellar Bodies and Skin Permeability Barrier Homeostasis", The Journal of Investigative Dermatology, (2003) 121, pp. 362-367）。例えば、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸は皮膚バリアー機能の回復を遅らせるが、グルタミン酸受容体のアゴニストとして知られているＭＫ−８０１（ジゾシルピン）は、当該回復を促進させる。グルタミン酸受容体を始めとして、皮膚バリアー機能回復に関与することが知られているイオンチャネル型受容体はいずれも皮膚細胞に存在していることが知られている。 The present inventors have previously shown that influx of calcium ions into epidermal keratinocytes via specific ion channel receptors, such as glutamate receptors and GABA receptors, inhibits the promotion of recovery of skin barrier function. (Denda M, et al., “Influx of Calcium and Chloride Ions into Epidermal Keratinocytes Regulates Exocytosis of Epidermal Lamellar Bodies and Skin Permeability Barrier Homeostasis”, The Journal of Investigative Dermatology, (2003) 121, pp. 362-367). For example, glutamate, an excitatory neurotransmitter, delays the recovery of skin barrier function, whereas MK-801 (dizocilpine), known as an agonist of glutamate receptors, promotes the recovery. It is known that all ion channel type receptors known to be involved in recovery of skin barrier function, including glutamate receptors, are present in skin cells.
リアノジン受容体（ＲｙＲ）は、横紋筋小胞体に存在するタンパク質であり、カルシウムチャネルとして作用する。しかしながら、リアノジン受容体が皮膚に存在することは従来知られていなかった。 The ryanodine receptor (RyR) is a protein present in the striated sarcoplasmic reticulum that acts as a calcium channel. However, it has not been conventionally known that the ryanodine receptor is present in the skin.
本発明者は、免疫組織化学的方法によりリアノジン受容体が皮膚に存在すること、そしてそのアンタゴニストが皮膚バリアー機能の回復を促進させることを見出し、本願発明を完成させるに至った。 The present inventor has found that the ryanodine receptor is present in the skin by an immunohistochemical method, and that the antagonist promotes the recovery of the skin barrier function, and has completed the present invention.
即ち、本願発明は以下の発明を包含する：
［１］候補化合物がリアノジン受容体の活性を有意に阻害する場合に、当該候補化合物は皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価する、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法。
［２］候補化合物とリアノジン受容体とを接触させる工程、リアノジン受容体の活性を阻害する候補化合物を皮膚バリアー機能回復促進物質として選定する工程を含んで成る、［１］に記載の方法。
［３］候補化合物がリアノジン受容体を発現する細胞と接触され、その細胞内のカルシウム濃度の低下がリアノジン受容体活性の阻害として評価される、[２]に記載の方法。
That is, the present invention includes the following inventions:
[1] A screening method for a skin barrier function recovery-promoting substance, which evaluates that the candidate compound promotes recovery of the skin barrier function when the candidate compound significantly inhibits the activity of the ryanodine receptor.
[2] The method according to [1], comprising a step of bringing a candidate compound into contact with a ryanodine receptor, and a step of selecting a candidate compound that inhibits the activity of the ryanodine receptor as a skin barrier function recovery promoting substance.
[3] The method according to [2], wherein the candidate compound is contacted with a cell expressing a ryanodine receptor, and a decrease in intracellular calcium concentration is evaluated as inhibition of ryanodine receptor activity.
本発明によれば、新たに皮膚に存在することが明らかとなったリアノジン受容体を指標とすることで、皮膚に存在する公知のイオンチャネル型チャネルを介してスクリーニングすることができなかった物質を皮膚バリアー機能回復促進物質として選定することが可能となる。 According to the present invention, a substance that could not be screened via a known ion channel channel existing in the skin by using as an index the ryanodine receptor that was newly found to be present in the skin. It can be selected as a substance for promoting the recovery of skin barrier function.
本発明は、候補化合物がリアノジン受容体の活性を有意に阻害する場合に、当該候補化合物は皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価する、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法する。 The present invention provides a screening method for a skin barrier function recovery-promoting substance that evaluates that a candidate compound promotes recovery of skin barrier function when the candidate compound significantly inhibits the activity of a ryanodine receptor.
リアノジン受容体は、植物アルカロイドの一種であるリアノジンが特異的に結合する受容体である。リアノジン受容体には、主に骨格筋に存在する１型，主に心筋に存在する２型、そして脳組織に存在する３型のサブタイプが存在している。本発明以前、リアノジン受容体が皮膚に存在しているとの報告はない。今回、リアノジン受容体抗体を用いた皮膚の免疫染色の結果、１型及び３型リアノジン受容体は皮膚に存在することが明らかとなった（図１）。 The ryanodine receptor is a receptor to which ryanodine, a kind of plant alkaloid, specifically binds. The ryanodine receptor has subtypes of type 1 mainly present in skeletal muscle, type 2 mainly present in cardiac muscle, and type 3 present in brain tissue. Prior to the present invention, there has been no report that the ryanodine receptor is present in the skin. As a result of immunostaining of skin using a ryanodine receptor antibody, it was revealed that type 1 and type 3 ryanodine receptors are present in the skin (FIG. 1).
リアノジン受容体は、小胞体上のカルシウム放出チャネルとしての役割を果たす。リアノジン受容体のアゴニストである４−クロロ−３−メチルフェノールは、リアノジン受容体と結合すると小胞体内のカルシウムを細胞質内に放出し、細胞質内のカルシウム濃度を増大させる。一方、細胞質内のカルシウム濃度増大を阻害するリアノジン受容体のアンタゴニストとしては、ダントロレン（ＤＡ）、１，１’−ジヘプチル−４，４’−ビピリジニウムジブロミド（ＤＨＢＰ）(British Journal of Pharmacology (1994) 112:1216-1222) 、リアノジン、ルテニウムレッド、プロカイン、テトラカイン（Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (1994) 268:1476-1484）、マグネシウムイオン等がある。 The ryanodine receptor serves as a calcium release channel on the endoplasmic reticulum. When bound to the ryanodine receptor, 4-chloro-3-methylphenol, which is an agonist of the ryanodine receptor, releases calcium in the endoplasmic reticulum into the cytoplasm and increases the calcium concentration in the cytoplasm. On the other hand, as antagonists of ryanodine receptors that inhibit the increase in cytoplasmic calcium concentration, dantrolene (DA), 1,1′-diheptyl-4,4′-bipyridinium dibromide (DHBP) (British Journal of Pharmacology (1994)) 112: 1216-1222), ryanodine, ruthenium red, procaine, tetracaine (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (1994) 268: 1476-1484), magnesium ions, and the like.
本発明のスクリーニング方法において、リアノジン受容体の活性を有意に阻害する候補化合物は、皮膚バリアー機能の回復を促進させると評価される。本発明のスクリーニング方法は、皮膚バリアー機能回復促進物質の候補化合物とリアノジン受容体とを接触させ、リアノジン受容体の活性が阻害された場合に、当該候補化合物を皮膚バリアー機能回復促進物質として選定する工程を含んで成る。前記候補化合物としては、リアノジン受容体の競合的又は非競合的なアンタゴニストや抗体などが考えられる。当該候補化合物は、リアノジン受容体を発現している細胞自体又は細胞画分と混合することでリアノジン受容体と接触されうる。リアノジン受容体活性の阻害とは、小胞体からのカルシウム放出が抑制される状態を意味する。従って、細胞内のカルシウムイオン濃度の低下を測定することでリアノジン受容体活性の阻害を評価することができる。 In the screening method of the present invention, a candidate compound that significantly inhibits the activity of the ryanodine receptor is evaluated to promote recovery of the skin barrier function. In the screening method of the present invention, when a candidate compound of a skin barrier function recovery promoting substance is brought into contact with a ryanodine receptor, and the activity of the ryanodine receptor is inhibited, the candidate compound is selected as a skin barrier function recovery promoting substance. Comprising the steps. The candidate compound may be a ryanodine receptor competitive or non-competitive antagonist or antibody. The candidate compound can be contacted with the ryanodine receptor by mixing with the cell itself or cell fraction expressing the ryanodine receptor. Inhibition of ryanodine receptor activity means a state in which calcium release from the endoplasmic reticulum is suppressed. Therefore, the inhibition of ryanodine receptor activity can be evaluated by measuring the decrease in intracellular calcium ion concentration.
細胞内のカルシウムイオンの濃度は慣用の方法で測定することができる。例えば、特開２００２−３７２５３０においては、上皮系細胞表面上のカルシウムイオン濃度を評価することで、受容体のアゴニストをスクリーニングする方法が記載されている。詳しくは、この出願明細書においては、上皮系細胞表面上の刺激受容体であるＶＲ１受容体（バニロイド受容体サブタイプ１）やＰ２Ｘ受容体のアゴニストが細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させることから、被験物質の作用による上皮系細胞内のカルシウムイオン濃度の上昇を評価することで、上記受容体のアゴニストをスクリーニングする方法が開示されている。 The intracellular calcium ion concentration can be measured by a conventional method. For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-372530 describes a method of screening for receptor agonists by evaluating the calcium ion concentration on the surface of epithelial cells. Specifically, in this specification, VR1 receptor (vanilloid receptor subtype 1), which is a stimulating receptor on the surface of epithelial cells, and an agonist of P2X receptor increase intracellular calcium ion concentration. A method of screening for an agonist of the above receptor by evaluating an increase in calcium ion concentration in epithelial cells due to the action of a test substance is disclosed.
限定することを意図するものではないが、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニングは、下記の通りにして、細胞内のカルシウムイオン濃度を評価することで行なうことができる。
１）被験物質による細胞の刺激
まず、表皮細胞、例えば表皮角化細胞を適当な細胞培養培地、例えばＫＧＭ培地で常法に従い培養する。カルシウムイオンの測定を行なう前日に、この培養細胞を９６穴ウェルプレートに適当な細胞濃度（例えば２×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ個程度）において播種する。翌日、細胞が剥がれないようにして、上記の培養液を静かにピペットで吸い取る。次に、適当な緩衝液、例えば、ＢＢＳ（Ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及びカルシウム感受性蛍光色素、例えばＦｌｕｏ３−ＡＭ（大日本製薬製）を、上記培養表皮角化細胞に添加し（例えば、ウェル内に５μＭとなるように添加）、適当な条件下でインキュベーション（例えば３７℃で６０分）を行い、この蛍光色素を上記培養表皮角化細胞内への取込みを行なう。色素としては、他にＱｕｉｎ２、Ｑｕｉｎ２−ＡＭ、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ、Ｉｎｄｏ−１、Ｆｌｕｏ−３、Ｒｈｏｄ−２等のカルシウム感受性蛍光色素、エクオリン等のカルシウム感受性発光タンパク質、５−ＦＢＡＰＴＡ等の19Ｆによる核磁気共鳴法に用いる試薬等を使用してよい。取込み終了後、細胞を洗浄し、新鮮な同緩衝液（ＢＢＳ）を加え、放置する（例えば１５分）。その後、緩衝液を上記培養表皮角化細胞から取り除き、同緩衝液に溶解した候補化合物を細胞に添加し、細胞を候補化合物で刺激する。コントロールとして、候補化合物の溶解していない同緩衝液を細胞に添加する。
Although not intended to be limited, screening for a substance for promoting the restoration of skin barrier function can be performed by evaluating the intracellular calcium ion concentration as follows.
1) Stimulation of cells by test substance First, epidermal cells such as keratinocytes are cultured in a suitable cell culture medium such as KGM medium according to a conventional method. The day before the calcium ion measurement, the cultured cells are seeded in a 96-well plate at an appropriate cell concentration (for example, about 2 × 10 5 cells / well). On the next day, gently pipette the culture broth, keeping the cells from coming off. Next, an appropriate buffer such as BBS (Balanced salt solution) and a calcium sensitive fluorescent dye such as Fluo3-AM (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) is added to the cultured epidermal keratinocytes (for example, 5 μM in the well). Incubation is performed under appropriate conditions (for example, at 37 ° C. for 60 minutes), and the fluorescent dye is incorporated into the cultured epidermal keratinocytes. Other dyes include calcium-sensitive fluorescent dyes such as Quin2, Quin2-AM, Fura-2, Fura-2-AM, Indo-1, Fluo-3, and Rhod-2, calcium-sensitive photoproteins such as aequorin, 5- Reagents used for 19 F nuclear magnetic resonance method such as FBAPTA may be used. After the uptake, the cells are washed, and the same buffer (BBS) is added and left standing (for example, 15 minutes). Thereafter, the buffer is removed from the cultured epidermal keratinocytes, the candidate compound dissolved in the buffer is added to the cells, and the cells are stimulated with the candidate compounds. As a control, the same buffer in which the candidate compound is not dissolved is added to the cells.
２）細胞内のカルシウムイオン濃度の測定
蛍光測定は、常法に従い、蛍光マイクロプレートリーダーで、色素に応じた励起及び発光波長において、例えば経時的に測定することで行なう。
細胞内のカルシウムイオン濃度は下記の式に従って算出できる。
Ｃａ2+（ｎＭ）＝（ΔＦ−Ｆmin／Ｆmax−ΔＦ）Ｋｄ
Ｆmin：ＥＤＴＡを加え、Ｃａ2+をブロックしたときの色素の蛍光値（最小蛍光強度）
Ｆmax：Ｃａ2+の過剰存在下での色素の蛍光値（界面活性剤により細胞膜を破壊）（最大蛍光強度）
Ｋｄ：色素とＣａ2+の解離定数（例えば色素がＦｌｕｏ３−ＡＭの場合、３９０ｎＭ）
これにより、細胞内のカルシウムイオン濃度を有意に減少させれば、候補化合物は皮膚バリアー機能回復促進物質であると評価される。例えば、コントロールを細胞に添加した場合の細胞内カルシウム濃度と比較して、候補化合物がカルシウム濃度を２０％以上、好ましくは４０％以上低下させた場合、当該候補化合物を皮膚バリアー機能回復促進物質とみなすことができる。
2) Measurement of intracellular calcium ion concentration Fluorescence measurement is performed by, for example, measuring with time using a fluorescence microplate reader at an excitation and emission wavelength according to the dye, for example, with time.
The intracellular calcium ion concentration can be calculated according to the following formula.
Ca 2+ (nM) = (ΔF−F min / F max −ΔF) Kd
F min : Fluorescence value of dye when EDTA is added and Ca 2+ is blocked (minimum fluorescence intensity)
F max : Fluorescence value of the dye in the presence of excess Ca 2+ (destructing the cell membrane by the surfactant) (maximum fluorescence intensity)
Kd: dissociation constant between the dye and Ca 2+ (for example, 390 nM when the dye is Fluo3-AM)
Thus, if the intracellular calcium ion concentration is significantly reduced, the candidate compound is evaluated as a skin barrier function recovery promoting substance. For example, when the candidate compound decreases the calcium concentration by 20% or more, preferably 40% or more, compared to the intracellular calcium concentration when the control is added to the cells, the candidate compound is used as a skin barrier function recovery promoting substance. Can be considered.
本発明の方法は、ＩＣ50値を測定し、よりＩＣ50値が低い化合物を皮膚バリアー機能回復促進効果が高いと評価する工程を更に含んでもよい。これにより、より有効な皮膚バリアー機能回復促進物質を選定することができる。 The method of the present invention measures an IC 50 value, the more an IC 50 value less compound may further comprise a step of evaluating a high skin barrier function recovery and promotion effect. Thereby, a more effective skin barrier function recovery promoting substance can be selected.
本明細書で使用する用語「皮膚バリアー機能」とは、皮膚のなかでも表皮による体内の水分保持及びウイルス、細菌等の進入阻止、などを意味する。ここで、当該機能は、発汗しない条件下で経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）（単位：ｇ／ｍ2・ｈ）を測定することにより評価することができる。 As used herein, the term “skin barrier function” means the retention of water in the body by the epidermis and the invasion of viruses, bacteria, and the like, among other skins. Here, the function can be evaluated by measuring the transdermal moisture transpiration (TEWL) (unit: g / m 2 · h) under the condition of not sweating.
また、本発明において、「皮膚バリアー機能の回復を促進する」とは、皮膚のテープストリッピング直後のＴＥＷＬの値を０％、テープストリッピング前の値を１００％として、各測定時間におけるＴＥＷＬの値が、コントロールと比較した場合に明らかに有意差が認められ、ＴＥＷＬ回復率を促進させる効果を有することを意味し、Ａｎｄｒｅｗらの方法（Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，８６；５９８，１９８６）に従って、４％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液をしみ込ませたＣｏｔｔｏｎ ｂａｌｌにより皮膚を処理して判定を行ういわゆる肌荒れ改善防止効果とは異なる。 In the present invention, “promoting the recovery of skin barrier function” means that the TEWL value immediately after tape stripping of the skin is 0%, the value before tape stripping is 100%, and the TEWL value at each measurement time is 4% dodecyl according to the method of Andrew et al. (J Invest Dermatol, 86; 598, 1986), which means that there is a clear significant difference when compared with the control, and that it has the effect of promoting TEWL recovery. This is different from the so-called rough skin improvement preventing effect in which the skin is treated with a cotton ball soaked with an aqueous solution of sodium sulfate (SDS) and the determination is made.
皮膚バリアー機能の回復が必要な皮膚としては、皮膚疾患、種々のストレス、そして肌荒れ等により皮膚バリアー機能が低下した肌、移植皮膚で皮膚バリアー層の形成が充分でないため皮膚バリアー機能が低い肌、あるいは移植によって皮膚バリアー機能が低下した肌等が挙げられる。従って、本発明のスクリーニング方法は、低下した皮膚バリアー機能の回復だけでなく、皮膚バリアー機能が低い肌に対してその機能を向上させる物質のスクリーニングも意図する。このように、本発明によりスクリーニングされた皮膚バリアー機能回復促進物質を適用する対象者としては、哺乳類が考えられ、特にヒトの皮膚に対して適用される。 The skin that needs to be restored to the skin barrier function includes skin diseases, various stresses, skin having a reduced skin barrier function due to rough skin, skin having a low skin barrier function because the skin barrier layer is not sufficiently formed in the transplanted skin, Or the skin etc. whose skin barrier function fell by transplant are mentioned. Therefore, the screening method of the present invention intends not only to restore a reduced skin barrier function, but also to screen for substances that improve the function of skin with a low skin barrier function. As described above, mammals are considered as subjects to which the skin barrier function recovery promoting substance screened according to the present invention is applied, and it is particularly applied to human skin.
更に、上述の加齢に伴う皮膚機能の低下による皮膚増殖性異常等を防止する観点から、皮膚バリアー機能回復促進物質は、高齢者の皮膚に適用されることが考えられる。当該物質はまた、人工皮膚にも適用することができる。これは、生体より単離された皮膚細胞等を培養することによって得られる人工皮膚は、皮膚バリアー層の形成が不完全なことがあり、その皮膚バリアー機能は概して低いためである。 Furthermore, from the viewpoint of preventing the above-described abnormal skin growth due to a decrease in skin function accompanying aging, the skin barrier function recovery promoting substance may be applied to the skin of elderly people. The substance can also be applied to artificial skin. This is because artificial skin obtained by culturing skin cells or the like isolated from a living body may have an incomplete formation of a skin barrier layer, and its skin barrier function is generally low.
別の態様において、本発明は、リアノジン受容体の活性を阻害する物質を含んで成る皮膚バリアー機能回復促進製剤を提供する。本発明の製剤の形態には、本発明の製剤は、化粧水、クリーム、乳液、ローション、ファンデーション、パック、浴用剤、軟膏、ヘアーローション、ヘアートニック、ヘアーリキッド、シャンプー、リンス、養毛・育毛剤等を包含するものである。 In another embodiment, the present invention provides a skin barrier function recovery promoting preparation comprising a substance that inhibits the activity of a ryanodine receptor. In the form of the preparation of the present invention, the preparation of the present invention includes lotion, cream, emulsion, lotion, foundation, pack, bath preparation, ointment, hair lotion, hair tonic, hair liquid, shampoo, rinse, hair growth and hair growth. It includes agents and the like.
更に別の態様において、本発明は、皮膚バリアー機能の回復を促進させるための美容方法であって、リアノジン受容体の活性を阻害する物質を皮膚上に適用することを含んで成る方法を提供する。 In yet another aspect, the present invention provides a cosmetic method for promoting the recovery of skin barrier function, comprising applying a substance that inhibits the activity of ryanodine receptor on the skin. .
本発明の美容方法は、皮膚バリアー機能回復が必要とされる皮膚にリアノジン受容体の活性を阻害する物質を適用するものである。適用方法は特に限定されず、例えば、前記物質を含有するパック又はシートを皮膚上に載せ、あるいは貼り付けることで前記物質を皮膚に適用してもよい。その他、前記物質を有効成分として含む化粧料として皮膚に塗布されることもある。前記物質を皮膚に適用する回数、時間は、その皮膚の状態によって変化するが、セロテープ（登録商標）によるストリッピングで破壊された皮膚の場合、１時間あれば皮膚バリアー機能の回復を達成することができる。 In the cosmetic method of the present invention, a substance that inhibits the activity of ryanodine receptor is applied to the skin that is required to recover the skin barrier function. The application method is not particularly limited. For example, the substance may be applied to the skin by placing or sticking a pack or sheet containing the substance on the skin. In addition, it may be applied to the skin as a cosmetic containing the substance as an active ingredient. The number and time of applying the substance to the skin varies depending on the condition of the skin, but in the case of skin broken by stripping with cello tape (registered trademark), recovery of the skin barrier function should be achieved in 1 hour. Can do.
次に、本願発明を以下の実施例により更に具体的に説明する。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to the following examples.
皮膚バリアー機能回復促進効果試験
以下の実験において、リアノジン受容体のアンタゴニスト（ダントロレン、１，１’−ジヘプチル−４，４’−ビピリジニウムジブロミド）による皮膚バリアー機能回復促進効果をアゴニストを適用した場合と比較して評価した。皮膚バリアー機能回復促進効果は、ヘアレスマウス（Ｔｙｐｅ ＨＲ−１， ＨＯＳＨＩＮＯ， Ｊａｐａｎ）の皮膚にテープストリッピングを施すことによって破壊された皮膚バリアー機能がもとの状態へ回復していく過程を経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を指標とし、以下の通り評価した。
Skin barrier function recovery promotion effect test In the following experiment, when an agonist is applied to the skin barrier function recovery promotion effect by an antagonist of ryanodine receptor (dantrolene, 1,1'-diheptyl-4,4'-bipyridinium dibromide) Evaluation was made by comparison. The skin barrier function recovery promoting effect is that the process of recovering the skin barrier function destroyed by applying tape stripping to the skin of hairless mice (Type HR-1, HOSHINO, Japan) returns to the original state. Using the amount of transpiration (TEWL) as an index, the evaluation was as follows.
１．水分蒸散量測定装置ＭＥＥＣＯ（Ｍｅｅｃｏ社製， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ， ＵＳＡ）によりヘアレスマウス背部付近の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定する。この際の値をＴＥＷＬの回復率１００％とする。
２．皮膚のバリアーを、セロファンテープを使用し、ヘアレスマウスの表皮角層を剥がすことにより破壊する。このときＴＥＷＬの値が約８００〜９００となるまでこの作業を繰り返す。角層を剥がした後の測定値から角層を剥がす前の測定値を差し引いた値を、最もダメージの深い状態、即ち回復率０％とする。
３．角層を剥がしてから所定の時間（１，３，６又は２４時間）経過後、各アンタゴニスト又はアゴニストを上記角層の上に塗布する（１００〜２５０μＭ）。何も貼り付けていない皮膚をコントロールとする。
４．１時間経過後、ＭＥＥＣＯによりＴＥＷＬを測定する。角層除去時と同様、各時間の測定値から角層除去前のＴＥＷＬ値を差し引き、回復率をもとめる。
即ち、回復率は以下の式に従い算出する。
2. The skin barrier is broken by peeling off the epidermal stratum of hairless mice using cellophane tape. At this time, this operation is repeated until the value of TEWL becomes approximately 800 to 900. The value obtained by subtracting the measured value before peeling the stratum corneum from the measured value after peeling the stratum corneum is defined as the deepest damage state, that is, the recovery rate is 0%.
3. After elapse of a predetermined time (1, 3, 6 or 24 hours) after peeling off the stratum corneum, each antagonist or agonist is applied onto the stratum corneum (100 to 250 μM). The control is skin with nothing applied.
4. After 1 hour, measure TEWL by MEECO. As in the case of removing the stratum corneum, the TEWL value before removal of the stratum corneum is subtracted from the measured value at each time to obtain the recovery rate.
That is, the recovery rate is calculated according to the following formula.
当該試験によって測定された皮膚バリアー機能の回復率（％）を図２に示す。図２から明らかなように、バリアー破壊後の皮膚は、いずれのアンタゴニストを適用した場合であっても、適用後１時間でバリアー機能が顕著に回復した。一方、アゴニストである４−クロロ−３−メチルフェノールは、無処置の皮膚と比較して皮膚バリアー機能回復を有意に遅らせた。 The recovery rate (%) of the skin barrier function measured by the test is shown in FIG. As is clear from FIG. 2, the barrier function was remarkably restored to the skin after barrier destruction 1 hour after application, regardless of which antagonist was applied. On the other hand, the agonist 4-chloro-3-methylphenol significantly delayed the recovery of skin barrier function compared to untreated skin.
以上の結果から、リアノジン受容体活性を阻害する物質と皮膚バリアー機能回復促進効果の間には相関関係が認められる。本発明によれば、皮膚バリアー機能回復促進物質をスクリーニングする際、候補化合物を動物等の皮膚に予め適用することなくその皮膚バリアー機能回復促進効果の有無を予測することができる。 From the above results, there is a correlation between the substance that inhibits ryanodine receptor activity and the skin barrier function recovery promoting effect. According to the present invention, when screening for a skin barrier function recovery promoting substance, the presence or absence of the skin barrier function recovery promoting effect can be predicted without previously applying the candidate compound to the skin of an animal or the like.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010125822A JP2011250728A (en) | 2010-06-01 | 2010-06-01 | Method of screening skin barrier function recovery-promoting substance using ryanodine receptor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010125822A JP2011250728A (en) | 2010-06-01 | 2010-06-01 | Method of screening skin barrier function recovery-promoting substance using ryanodine receptor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011250728A true JP2011250728A (en) | 2011-12-15 |
Family
ID=45415246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010125822A Withdrawn JP2011250728A (en) | 2010-06-01 | 2010-06-01 | Method of screening skin barrier function recovery-promoting substance using ryanodine receptor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2011250728A (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015087097A2 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Szegedi Tudományegyetem | Pharmaceutical compositions for facilitating wound healing |
| JP2016037470A (en) * | 2014-08-07 | 2016-03-22 | 株式会社 資生堂 | Cell activator containing orai3 gene expression inhibitor or orai3 protein functional inhibitor |
-
2010
- 2010-06-01 JP JP2010125822A patent/JP2011250728A/en not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015087097A2 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Szegedi Tudományegyetem | Pharmaceutical compositions for facilitating wound healing |
| WO2015087097A3 (en) * | 2013-12-12 | 2015-09-11 | Szegedi Tudományegyetem | Pharmaceutical composition comprising a ryanodine receptor antagonist for facilitating wound healing |
| CN105992586A (en) * | 2013-12-12 | 2016-10-05 | 赛格德大学 | Pharmaceutical compositions for facilitating wound healing |
| US9757360B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-09-12 | Szegedi Tudományegyetem | Pharmaceutical composition comprising a ryanodine receptor antagonist for facilitating wound healing |
| JP2016037470A (en) * | 2014-08-07 | 2016-03-22 | 株式会社 資生堂 | Cell activator containing orai3 gene expression inhibitor or orai3 protein functional inhibitor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes | |
| Schwartz et al. | Anion-channel blockers inhibit S-type anion channels and abscisic acid responses in guard cells | |
| CA3010395C (en) | Method of treating skin with microrna modulators | |
| US10054582B2 (en) | Compositions and methods for inhibiting HMGB1 activation of melanocytes | |
| Hashad et al. | Interplay among distinct Ca2+ conductances drives Ca2+ sparks/spontaneous transient outward currents in rat cerebral arteries | |
| Palmer et al. | Intracellular distributions of essential elements in cardiomyocytes | |
| JP2011250728A (en) | Method of screening skin barrier function recovery-promoting substance using ryanodine receptor | |
| Pescina et al. | Effect of formulation factors on the trans-scleral iontophoretic and post-iontophoretic transports of a 40 kDa dextran in vitro | |
| Mohis et al. | Aging-related increase in store-operated Ca2+ influx in human ventricular fibroblasts | |
| Kitchens et al. | T-type Ca2+ current contribution to Ca2+-induced Ca2+ release in developing myocardium | |
| Zhang et al. | Action potential-triggered somatic exocytosis in mesencephalic trigeminal nucleus neurons in rat brain slices | |
| Zhabyeyev et al. | Low-affinity block of cardiac K+ currents by nifedipine | |
| CN110022869A (en) | For skin and/or the serotonin 1B receptor stimulators of hair reparation | |
| JP5933240B2 (en) | Evaluation method, screening method, antipruritic substance and antipruritic agent | |
| Stecyk et al. | Indirect evidence that anoxia exposure and cold acclimation alter transarcolemmal Ca2+ flux in the cardiac pacemaker, right atrium and ventricle of the red-eared slider turtle (Trachemys scripta) | |
| EP2620143B1 (en) | Adrenergic beta-3-receptor agonists for use in treatment of aging-related diseases | |
| Santamaria-Herrera et al. | MDIMP, a novel cardiac Ca2+ channel blocker with atrial selectivity | |
| JPWO2003053466A1 (en) | Skin barrier function recovery accelerator | |
| Yu et al. | Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture | |
| JP2004175687A (en) | Agent for promoting recovery of skin barrier function | |
| Borisova et al. | Evidence that a Ca2+ sparks/STOCs coupling mechanism is responsible for the inhibitory effect of caffeine on electro-mechanical coupling in guinea pig ureteric smooth muscle | |
| Al-Noah et al. | Nitrergic relaxations and phenylephrine contractions are not compromised in isolated urethra in a rat model of diabetes | |
| Fischer | Effects of chlorobutanol on primary and secondary endings of isolated cat muscle spindles | |
| Medina et al. | Vasopressin receptors involved in adrenergic neurotransmission in the circular muscle of the human vas deferens | |
| Fischer et al. | Effects of calcium on the discharge pattern of primary and secondary endings of isolated cat muscle spindles recorded under a ramp-and-hold stretch |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20130806 |