JP2011239710A - Method for producing butanol with clostridium bacterium - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、クロストリジウム属細菌を用いたブタノールの生産方法に関し、より具体的には、クロストリジウム属細菌の混合培養によるセルロースを基質としたブタノールの生産方法に関する。 The present invention relates to a method for producing butanol using Clostridium bacteria, and more specifically, to a method for producing butanol using cellulose as a substrate by mixed culture of Clostridium bacteria.
近年、化石燃料への依存による地球温暖化問題がクローズアップされている。同時に、石油の枯渇が指摘されており、エネルギー確保が人類共通の重要課題となっている。そこで、石油由来の燃料生産に代わりバイオマス由来の燃料生産が求められている。殊に、食物と競合しない非食料バイオマス由来のバイオマス燃料への期待が高まっている。 In recent years, the issue of global warming due to dependence on fossil fuels has been highlighted. At the same time, oil depletion has been pointed out, and securing energy is an important issue common to all humankind. Therefore, there is a demand for biomass-derived fuel production instead of petroleum-derived fuel production. In particular, there is an increasing expectation for a biomass fuel derived from non-food biomass that does not compete with food.
バイオマス燃料としてはバイオエタノールが知られているが、バイオマス燃料としてのブタノールも注目されている。ブタノールは燃焼エネルギー効率がエタノールよりも高く、既存の化石燃料へ高い比率で混合することができる。また、溶剤としても従来よりよく利用されているなど、利用用途の広さという観点でも、エタノールよりも優れているといえる。 Bioethanol is known as a biomass fuel, but butanol as a biomass fuel is also attracting attention. Butanol has a higher combustion energy efficiency than ethanol and can be mixed with existing fossil fuels in a higher ratio. Moreover, it can be said that it is superior to ethanol also from the viewpoint of the wide range of usage, such as being more commonly used as a solvent.
これまで知られているバイオマス燃料としてのブタノール生産技術としては、例えば、特開２００５−３２８８０１号公報に開示されている、食品残渣と焼酎粕に水を配合したものを用いて培養液を調製し、当該培養液をＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ Ｎ１−４やＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ ＡＴＣＣ ２７０２１Ｔのブタノール生産菌によりブタノール発酵を行うブタノールの生産方法（特許文献１）や、特開２００５−２６１２３９号公報に開示されている、セルロース系物質及び／又はセルロース系物質由来の糖質を含む培地で、ジオバシラス属に属し、セルロース系物質及び／又はセルロース系物質由来の糖質から１−ブタノールなどの低級アルコールを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から１−ブタノールなどの低級アルコールを採取する低級アルコールの製造法（特許文献２）が知られている。 As a known butanol production technique as a biomass fuel, a culture solution is prepared using, for example, a food residue and shochu mixed with water as disclosed in JP-A-2005-328801. And a method for producing butanol in which butanol is fermented by Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 or Clostridium saccharoperbutericum ATCC 27021 T butanol-producing bacteria (Patent Document 1), and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-261239. A medium containing a saccharide derived from a cellulosic material and / or a cellulosic material, belonging to the genus Geobacillus, Culturing a microorganism having the ability to produce lower alcohols such as Le, the preparation of lower alcohols collecting lower alcohol such as from the culture 1-butanol (Patent Document 2) are known.
ブタノール生産菌としては、代表的なものとしてクロストリジウム（Clostridium）属細菌が知られている。しかしながら、ブタノール生産菌はセルロースを資化することができず、また、セルロース資化菌は高ブタノール生産能を有しない。そのため、クロストリジウム（Clostridium）属細菌による高ブタノール生産技術の開発が望まれていた。 As typical butanol-producing bacteria, bacteria belonging to the genus Clostridium are known. However, butanol-producing bacteria cannot assimilate cellulose, and cellulose-assimilating bacteria do not have high butanol-producing ability. Therefore, development of high butanol production technology by Clostridium bacteria has been desired.
そこで本発明は、クロストリジウム（Clostridium）属細菌の異なる性質を利用して、セルロースの糖化とブタノールの生産をクロストリジウム（Clostridium）属細菌のみで実施することが可能なブタノール生産技術を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention aims to provide a butanol production technique capable of carrying out saccharification of cellulose and butanol production using only the Clostridium bacteria by utilizing the different properties of Clostridium bacteria. And
本発明者は、セルロース資化菌によるセルロース糖化と、高ブタノール生産菌によるブタノール発酵を１つの系で行う混合培養法を実施したところ、セルロース基質からのブタノール生産を効率よく実施することができるとの知見を得た。 The present inventor conducted a mixed culture method in which cellulose saccharification by a cellulose-assimilating bacterium and butanol fermentation by a high butanol-producing bacterium were carried out in one system, and as a result, it was possible to efficiently produce butanol from a cellulose substrate. I got the knowledge.
本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、クロストリジウム（Clostridium）属細菌の混合培養によるセルロース基質からのブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌によりセルロース基質を糖化する工程と、ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌によりブタノールを生産する工程と、を有する、ブタノール生産方法を提供するものである。 The present invention has been made on the basis of such findings, and is a method for producing butanol from a cellulose substrate by mixed culture of Clostridium bacteria, wherein the cellulose substrate is obtained by Clostridium bacteria having the ability to assimilate cellulose. The present invention provides a butanol production method comprising a saccharification step, and a step of producing butanol by a Clostridium bacterium having butanol production ability.
本発明のブタノール生産方法によれば、セルロース資化菌によるセルロース糖化と、高ブタノール生産菌を組み合わせた混合培養により、１つの系でセルロース基質の糖化を行いつつブタノールを生産することができるため、セルロース基質を用いたブタノール生産を効率よく実施することができる。 According to the butanol production method of the present invention, butanol can be produced while performing saccharification of a cellulose substrate in one system by a mixed culture in which cellulose saccharification by cellulose-assimilating bacteria and high butanol-producing bacteria are combined. Butanol production using a cellulose substrate can be carried out efficiently.
本発明の実施形態について詳細に説明する。本発明のブタノール生産方法は、クロストリジウム（Clostridium）属細菌の混合培養によるセルロース基質からのブタノール生産方法であって、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌によりセルロース基質を糖化する工程と、ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌によりブタノールを生産する工程と、を有する。 Embodiments of the present invention will be described in detail. The butanol production method of the present invention is a method for producing butanol from a cellulose substrate by mixed culture of Clostridium bacteria, the step of saccharifying the cellulose substrate with Clostridium bacteria having cellulose assimilation ability, Producing butanol by a Clostridium bacterium having butanol-producing ability.
セルロース基質としては、セルロース系バイオマスであればその種類に限定されない。ここで、セルロース系バイオマスとは、セルロースを含む物質を意味し、例えば、レーヨン、綿、麻などの植物系の繊維のわた、糸、布帛などの繊維類；新聞紙、ろ紙、雑誌、コピー紙やダンボールなどの紙類；稲わら、野菜くずなどの農産廃棄物のほか、結晶性セルロースなどを挙げることができる。 As a cellulose substrate, if it is cellulose biomass, it will not be limited to the kind. Here, the cellulosic biomass means a substance containing cellulose, for example, fiber of cotton fiber such as rayon, cotton, hemp, etc., fiber such as cotton, thread, fabric; newspaper, filter paper, magazine, copy paper, Paper such as cardboard; agricultural waste such as rice straw and vegetable waste, crystalline cellulose and the like can be mentioned.
セルロース基質の濃度は、ブタノールの生産効率の観点からは、0.5〜10％（w/w）であることが好ましく、2〜8％（w/w）であることがより好ましく、3〜5％（w/w）であることがさらに好ましい。 The concentration of the cellulose substrate is preferably 0.5 to 10% (w / w), more preferably 2 to 8% (w / w) from the viewpoint of butanol production efficiency, and 3 to 5%. More preferably, it is (w / w).
なお、前記セルロース基質には、ヘミセルラーゼを添加することが好ましい。ヘミセルラーゼを添加することにより、ヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスの糖化が促進され、ブタノール生産菌が資化するためのセロビオースやグルコースの量が増加する結果、ブタノール生産量を増加させることができる。ヘミセルラーゼの添加量は任意に設定することができるが、添加量が多ければ糖化をより促進させることができる。 In addition, it is preferable to add hemicellulase to the cellulose substrate. By adding hemicellulase, saccharification of cellulosic biomass containing hemicellulose is promoted, and the amount of cellobiose and glucose for assimilating butanol-producing bacteria is increased. As a result, butanol production can be increased. Although the addition amount of hemicellulase can be set arbitrarily, saccharification can be further promoted if the addition amount is large.
前記ヘミセルロースを含むセルロース系バイオマスとしては、木質系バイオマスが挙げられる。本実施形態において木質系バイオマスとは、植物体の一部をなしていた木質系部分を含む材料であって、家畜等の動物の消化管を通ったことがなく、かつ、工業的に食品または飼料とするために加工又は分解工程を受けたことがなく、かつ、食品又は食品原料として不適である、主としてセルロース、ヘミセルロースおよびリグニンから構成されるバイオマスをいう。具体的には、例えば、間伐材、剪定枝葉、木材チップ、おが屑や籾殻、製材工場等の残廃材、建築廃材、建築解体材などが挙げられる。 The cellulosic biomass containing hemicellulose includes woody biomass. In this embodiment, the woody biomass is a material containing a woody part that was part of a plant body, has never passed through the digestive tract of animals such as livestock, and industrially food or Biomass composed mainly of cellulose, hemicellulose, and lignin, which has not been processed or decomposed to become feed and is unsuitable as a food or food ingredient. Specifically, for example, thinned wood, pruned branches, wood chips, sawdust and rice husks, residual materials such as sawmills, construction waste materials, and building demolition materials.
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌は、セルロース基質中のセルロースを資化（糖化）する能力が高いという観点から、クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）NBRC 103400株であることが好ましい。クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）は、セルロースを嫌気的条件下で糖化してセロビオース及びグルコースを生成する。また、好熱性菌としても知られ、その至適温度は55〜60℃と、他のクロストリジウム（Clostridium）属細菌の至適温度と比較すると高い。 From the viewpoint that the bacterium belonging to the genus Clostridium having the ability to assimilate cellulose has a high ability to assimilate (saccharify) cellulose in the cellulose substrate, it is preferably Clostridium thermocellum NBRC 103400 strain. Clostridium thermocellum saccharifies cellulose under anaerobic conditions to produce cellobiose and glucose. It is also known as a thermophilic bacterium, and its optimum temperature is 55 to 60 ° C., which is higher than the optimum temperature of other Clostridium bacteria.
また、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌として、遺伝子組み換えにより、セルロース資化能が高められた組み換え体を用いることもできる。従って、本実施形態においては、セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌には、遺伝子組み換えにより、セルロース資化能が高められた組み換え体も含まれる。 In addition, as the bacterium belonging to the genus Clostridium having the ability to assimilate cellulose, a recombinant having enhanced ability to assimilate cellulose by genetic recombination can also be used. Therefore, in this embodiment, the Clostridium bacterium having cellulose assimilation ability includes recombinants whose cellulose assimilation ability is enhanced by genetic recombination.
前記ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌は、ブタノール生産能が高いという観点から、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）N1-4株であることが好ましい。クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）は、前記クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）NBRC 103400株がセルロースを糖化して生成したセロビオース及び／又はグルコースを基質として嫌気的条件下でブタノール発酵を行い、主にブタノールを生産するほか、エタノール、酢酸、酪酸、アセトンなどを生産する。また、至適温度は25〜34℃であり、37℃を超えるとブタノール生産を停止してしまうという性質を有している。 From the viewpoint of high butanol-producing ability, the Clostridium bacterium having butanol-producing ability is preferably Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 strain. Clostridium saccharoperbutylacetonicum is produced by subjecting butanol fermentation under anaerobic conditions using cellobiose and / or glucose produced by saccharification of cellulose from the Clostridium thermocellum NBRC 103400 strain as a substrate. In addition to producing butanol, it produces ethanol, acetic acid, butyric acid, and acetone. Further, the optimum temperature is 25 to 34 ° C, and when it exceeds 37 ° C, butanol production is stopped.
また、前記ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌として、遺伝子組み換えにより、ブタノール生産能が高められた組み換え体を用いることもできる。従って、本実施形態においては、ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌には、遺伝子組み換えにより、ブタノール生産能が高められた組み換え体も含まれる。 Moreover, as a bacterium belonging to the genus Clostridium having the ability to produce butanol, a recombinant having an increased ability to produce butanol by genetic recombination can be used. Therefore, in this embodiment, Clostridium bacteria having butanol-producing ability include recombinants whose butanol-producing ability is enhanced by genetic recombination.
クロストリジウム（Clostridium）属細菌の混合培養は、前記セルロース基質を糖化する工程を開始してから少なくとも24時間経過後に、前記ブタノールを生産する工程を実施することにより行われる。 The mixed culture of Clostridium bacteria is carried out by carrying out the step of producing the butanol at least 24 hours after the step of saccharifying the cellulose substrate.
すなわち、前記ブタノール生産菌はセルロース基質を直接資化することができないため、前記ブタノール生産菌がブタノールを生産するためには、前記セルロース資化菌がセルロース基質を糖化する工程が前提として必要となる。そのため、仮に前記セルロース資化菌と前記ブタノール生産菌を同時に培地に添加しても、所望量のブタノールを生産することができない。 That is, since the butanol-producing bacterium cannot directly assimilate the cellulose substrate, in order for the butanol-producing bacterium to produce butanol, it is necessary on the premise that the cellulose-assimilating bacterium saccharifies the cellulose substrate. . Therefore, even if the cellulose-assimilating bacterium and the butanol-producing bacterium are simultaneously added to the medium, a desired amount of butanol cannot be produced.
しかし、前記セルロース資化菌がセルロースを糖化し始めれば、同時並行的に前記ブタノール生産菌がブタノールを生産することが可能となる。 However, if the cellulose assimilating bacteria start to saccharify cellulose, the butanol-producing bacteria can simultaneously produce butanol.
前記セルロース基質を糖化する工程は、前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌の至適温度で実施し、前記ブタノールを生産する工程を、前記ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌の至適温度で実施することがブタノールの効率的生産の観点から好ましい。 The step of saccharifying the cellulose substrate is carried out at the optimum temperature of the bacterium belonging to the genus Clostridium having the ability to assimilate the cellulose, and the step of producing the butanol is carried out by the bacterium belonging to the genus Clostridium having the ability to produce butanol It is preferable to carry out at the optimum temperature from the viewpoint of efficient production of butanol.
前記セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌の至適温度は55〜60℃であり、前記ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌の至適温度は25〜34℃である。従って、前記セルロース基質を糖化する工程は、60℃前後で実施することが好ましく、前記ブタノールを生産する工程は、30℃前後で実施することが好ましい。 The optimum temperature of the Clostridium bacterium having the ability to assimilate cellulose is 55 to 60 ° C., and the optimum temperature of the Clostridium bacterium having the ability to produce butanol is 25 to 34 ° C. Therefore, the step of saccharifying the cellulose substrate is preferably carried out at around 60 ° C., and the step of producing butanol is preferably carried out at around 30 ° C.
ブタノール生産工程の終了後、必要に応じて、得られたブタノールを蒸留し高濃度のブタノールを分取する蒸留工程を実施する。蒸留工程では、培養液を蒸留装置等によって蒸留し、ブタノール濃度を所望の濃度に濃縮する。 After completion of the butanol production process, if necessary, a distillation process for distilling the obtained butanol and fractionating a high concentration of butanol is performed. In the distillation step, the culture solution is distilled with a distillation apparatus or the like to concentrate the butanol concentration to a desired concentration.
蒸留工程で副生された蒸留残渣はセルロース基質（セルロース系バイオマス）やクロストリジウム（Clostridium）属細菌に由来する栄養素を豊富に含み、栄養学的に優れていることから、飼料化や肥料化を行うことにより、家畜の飼料や農作物の肥料として有効利用することができる。 Distillation residue by-produced in the distillation process is rich in nutrients derived from cellulose substrates (cellulosic biomass) and bacteria belonging to the genus Clostridium, and is nutritionally superior. Therefore, it can be effectively used as feed for livestock and fertilizer for agricultural crops.
蒸留残渣を家畜の飼料として利用する場合は、例えば、蒸留残渣をそのまま又は乾燥処理を実施した上で、家畜に供給することができる。また、蒸留残渣を農作物の肥料として利用する場合は、例えば、必要に応じて炭素源又は窒素源を添加し、Ｃ／Ｎ比を適宜調整することにより、作物に有用な肥料が得られる。 When the distillation residue is used as feed for livestock, for example, the distillation residue can be supplied to livestock as it is or after performing a drying treatment. Moreover, when utilizing a distillation residue as a fertilizer of agricultural crops, a fertilizer useful for a crop is obtained by adding a carbon source or a nitrogen source as needed, and adjusting C / N ratio suitably, for example.
１．ブタノール生産菌の添加時期の検討
セルロース資化菌として、クロストリジウム サーモセラム（Clostridium thermocellum）NBRC 103400株（＝ATCC27405）（以下、「NBRC 103400株」という）を使用し、このNBRC 103400株の初発菌体量をOD600nm=0.1に調製し、2％（wt/vol）結晶性セルロース（Avicel cellulose、Sigma-Aldrich社製）を基質として植菌し、嫌気的条件下、60℃で培養した。一方、ブタノール生産菌としては、クロストリジウム サッカロパーブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum） N1-4株（以下、「N1-4株」という）を使用した。このN1-4株の初発菌体量をOD600nm=0.1に調製し、N1-4株を添加してから培地の温度を30℃に変更して、嫌気的条件下、所定期間培養した。ここで、N1-4株の添加時期を、NBRC 103400株の植菌後0h、24h（1日）、48h（2日）、72h（3日）、96h（4日）を経過した後に添加することで、適切なブタノール生産菌の添加時期を検討した。なお、NBRC 103400株の植菌後0h経過後にN1-4株を添加した場合、すなわちNBRC 103400株とN1-4株を同時に添加して混合培養した場合は、30℃で実施した。
1. Examination of the timing of addition of butanol-producing bacteria As the cellulose-assimilating bacterium, Clostridium thermocellum NBRC 103400 strain (= ATCC27405) (hereinafter referred to as “NBRC 103400 strain”) was used. Was adjusted to OD 600nm = 0.1, inoculated with 2% (wt / vol) crystalline cellulose (Avicel cellulose, Sigma-Aldrich) as a substrate, and cultured at 60 ° C. under anaerobic conditions. On the other hand, Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 strain (hereinafter referred to as “N1-4 strain”) was used as a butanol-producing bacterium. The initial cell mass of this N1-4 strain was adjusted to OD 600 nm = 0.1, and after adding the N1-4 strain, the temperature of the medium was changed to 30 ° C. and cultured under anaerobic conditions for a predetermined period. Here, N1-4 strain is added after 0h, 24h (1 day), 48h (2 days), 72h (3 days), 96h (4 days) after inoculation of NBRC 103400 strain Therefore, the timing of adding an appropriate butanol-producing bacterium was examined. In addition, when the N1-4 strain was added 0 hours after the inoculation of the NBRC 103400 strain, that is, when the NBRC 103400 strain and the N1-4 strain were added at the same time and mixed culture was carried out at 30 ° C.
結果を図１に示す。NBRC 103400株の植菌後0h経過後にN1-4株を添加した場合、すなわちNBRC 103400株とN1-4株を同時に添加して混合培養した場合は、ブタノールの生産はほとんど認められなかった。 The results are shown in FIG. When the N1-4 strain was added 0 hours after the inoculation of the NBRC 103400 strain, that is, when the NBRC 103400 strain and the N1-4 strain were simultaneously added and mixed and cultured, almost no butanol production was observed.
NBRC 103400株の植菌後24h（1日）経過後にN1-4株を添加した場合、NBRC 103400株の植菌後48h（2日）経過後にN1-4株を添加した場合、NBRC 103400株の植菌後72h（3日）経過後にN1-4株を添加した場合、NBRC 103400株の植菌後96h（4日）経過後にN1-4株を添加した場合については、順調にブタノールの生産が認められた。 When N1-4 strain is added 24 hours (1 day) after inoculation of NBRC 103400 strain, when N1-4 strain is added 48 hours (2 days) after inoculation of NBRC 103400 strain, When N1-4 strain was added 72 hours after inoculation (3 days), but N1-4 strain was added 96 hours (4 days) after inoculation of NBRC 103400 strain, butanol production was steady Admitted.
以上の結果から、NBRC 103400株の植菌後、少なくとも24h（1日）経過後にN1-4株を添加すれば、結晶性セルロースを基質としてブタノール生産が可能であることが明らかとなった。なお、結晶性セルロースに代えて、ろ紙、新聞紙、綿、稲わらを基質とした場合でも同様の傾向が認められた。 From the above results, it has been clarified that butanol can be produced using crystalline cellulose as a substrate if N1-4 strain is added at least 24 hours (1 day) after inoculation of NBRC 103400 strain. The same tendency was observed when filter paper, newspaper, cotton, or rice straw was used as the substrate instead of crystalline cellulose.
２．ブタノール生産菌の添加量の検討
NBRC 103400株の初発菌体量をOD600nm=0.1又は1.0に調製し、2％（wt/vol）結晶性セルロース（Avicel cellulose、Sigma-Aldrich社製）を基質としてそれぞれ植菌し、24h（1日）、嫌気的条件下、60℃で培養した。培養開始から24h（1日）経過後、各培地にN1-4株をOD600nm=0.1又は1.0に調製したものを添加し、培地の温度を30℃に変更して嫌気的条件下で培養した。培養期間中、経時的にブタノール生産量を測定した。
2. Examination of the amount of butanol-producing bacteria added
The initial cell mass of NBRC 103400 strain was adjusted to OD 600nm = 0.1 or 1.0, and 2% (wt / vol) crystalline cellulose (Avicel cellulose, manufactured by Sigma-Aldrich) was inoculated as a substrate for 24h (1 Day), and cultured at 60 ° C. under anaerobic conditions. 24 hours (1 day) after the start of culture, N1-4 strain prepared with OD 600nm = 0.1 or 1.0 was added to each medium, and the medium temperature was changed to 30 ° C and cultured under anaerobic conditions . During the culture period, butanol production was measured over time.
OD600nmの値と菌株の組み合わせを表１に示す。また、ブタノール生産量の経時的変化の結果を図２に示し、最終発酵産物量の比較を図３に示す。図２、図３に示すように、NBRC 103400株の初発の菌体量が多いほどブタノール生産量が増加する傾向が認められた。これはNBRC 103400株の初発の菌体量が多いほどブタノール生産菌が資化するためのセロビオースやグルコースの量が増加するためと推察される。なお、結晶性セルロースに代えて、ろ紙、新聞紙、綿、稲わらを基質とした場合でも同様の傾向が認められた。 Table 1 shows combinations of OD 600 nm values and strains. Moreover, the result of the time-dependent change of butanol production amount is shown in FIG. 2, and the comparison of the amount of final fermentation products is shown in FIG. As shown in FIG. 2 and FIG. 3, there was a tendency that the amount of butanol produced increased as the initial amount of NBRC 103400 strain increased. This is probably because the amount of cellobiose and glucose for butanol-producing bacteria to be assimilated increases as the initial amount of NBRC 103400 strain increases. The same tendency was observed when filter paper, newspaper, cotton, or rice straw was used as the substrate instead of crystalline cellulose.
３．ブタノール生産菌添加後の培養温度の検討
NBRC 103400株の初発菌体量をOD600nm=1.0に調製し、2％（wt/vol）結晶性セルロース（Avicel cellulose、Sigma-Aldrich社製）を基質として植菌し、嫌気的条件下、24h（1日）、60℃で培養した。培養開始から24h（1日）経過後、各培地にN1-4株をOD600nm=1.0に調製したものを添加し、培地の温度を下げて嫌気的条件下で培養した。
3. Examination of culture temperature after addition of butanol-producing bacteria
The initial bacterial mass of NBRC 103400 strain was adjusted to OD 600nm = 1.0, inoculated with 2% (wt / vol) crystalline cellulose (Avicel cellulose, Sigma-Aldrich) as a substrate, and anaerobic condition, 24h (1 day), cultured at 60 ° C. 24 hours (one day) after the start of culture, N1-4 strain prepared at OD 600nm = 1.0 was added to each medium, and the temperature of the medium was lowered and cultured under anaerobic conditions.
ここで、N1-4株の培養温度を、25℃、30℃、34℃、37℃、42℃に設定することで、ブタノール生産菌添加後の適切な培養温度を検討した。 Here, the culture temperature of the N1-4 strain was set to 25 ° C., 30 ° C., 34 ° C., 37 ° C., and 42 ° C., so that an appropriate culture temperature after addition of the butanol-producing bacteria was examined.
図４にブタノール生産量の経時的変化を測定した結果を示し、図５に最終発酵産物量の比較データを示す。図４、図５に示すように、ブタノール生産菌添加後の培養温度を30℃に設定した場合に最もブタノール生産性が高くなることが判明した。また、高温になるにつれて酪酸生成量が増加する傾向が認められた。なお、結晶性セルロースに代えて、ろ紙、新聞紙、綿、稲わらを基質とした場合でも同様の傾向が認められた。 FIG. 4 shows the results of measuring changes in butanol production over time, and FIG. 5 shows comparative data of the final fermentation product amount. As shown in FIGS. 4 and 5, it was found that butanol productivity was highest when the culture temperature after addition of butanol-producing bacteria was set to 30 ° C. Moreover, the tendency for butyric acid production to increase as the temperature increased was observed. The same tendency was observed when filter paper, newspaper, cotton, or rice straw was used as the substrate instead of crystalline cellulose.
４．基質濃度の検討
NBRC 103400株の初発菌体量をOD600nm=1.0に調製し、結晶性セルロース（Avicel cellulose、Sigma-Aldrich社製）を基質として植菌し、嫌気的条件下、24h（1日）、60℃で培養した。培養開始から24h（1日）経過後、N1-4株の初発菌体量をOD600nm=1.0に調製したものを添加し、培地の温度を30℃に変更して嫌気的条件下で培養した。
4). Examination of substrate concentration
The initial bacterial mass of NBRC 103400 strain was adjusted to OD 600nm = 1.0, inoculated with crystalline cellulose (Avicel cellulose, Sigma-Aldrich) as a substrate, and anaerobic condition, 24h (1 day), 60 ° C In culture. 24 hours (1 day) after the start of culture, the initial bacterial mass of N1-4 was adjusted to OD 600nm = 1.0, and the temperature of the medium was changed to 30 ° C and cultured under anaerobic conditions .
ここで、基質濃度が0.5％（wt/vol）、1％（wt/vol）、2％（wt/vol）、3％（wt/vol）、4％（wt/vol）、5％（wt/vol）のものを調製し、適切な基質濃度を検討した。 Here, the substrate concentration is 0.5% (wt / vol), 1% (wt / vol), 2% (wt / vol), 3% (wt / vol), 4% (wt / vol), 5% (wt / vol) and the appropriate substrate concentration was examined.
図６にブタノール生産量の経時的変化を測定した結果を示し、図７に培養９日後の発酵産物量の比較データを示す。図６、図７に示すように、基質濃度が増加するにつれてブタノール生産量も増加する傾向が認められた。また、基質濃度は4％（wt/vol）のときが最も高いブタノール生産量であることが明らかとなった。なお、結晶性セルロースに代えて、ろ紙、新聞紙、綿、稲わらを基質とした場合でも同様の傾向が認められた。 FIG. 6 shows the results of measuring changes in butanol production over time, and FIG. 7 shows comparative data on the amount of fermentation products after 9 days of culture. As shown in FIG. 6 and FIG. 7, it was recognized that the amount of butanol produced increased as the substrate concentration increased. It was also revealed that the highest butanol production was obtained when the substrate concentration was 4% (wt / vol). The same tendency was observed when filter paper, newspaper, cotton, or rice straw was used as the substrate instead of crystalline cellulose.
５．種々のブタノール生産菌を用いた発酵生産
NBRC 103400株の初発菌体量をOD600nm=1.0に調製し、4％（wt/vol）結晶性セルロース（Avicel cellulose、Sigma-Aldrich社製）を基質として植菌し、嫌気的条件下、24h（1日）、60℃で培養した。培養開始から24h（1日）経過後、ブタノール生産菌の初発菌体量をOD600nm=1.0に調製したものを添加し、培地の温度を30℃に変更して嫌気的条件下で培養した。
5). Fermentative production using various butanol-producing bacteria
The initial cell mass of NBRC 103400 strain was adjusted to OD 600nm = 1.0, inoculated with 4% (wt / vol) crystalline cellulose (Avicel cellulose, Sigma-Aldrich) as a substrate, and anaerobic condition, 24h (1 day), cultured at 60 ° C. 24 hours (one day) after the start of the culture, a butanol-producing bacterium having an initial cell mass adjusted to OD 600 nm = 1.0 was added, and the temperature of the medium was changed to 30 ° C., followed by culturing under anaerobic conditions.
ここで、ブタノール生産菌として、N1-4株のほか、比較対照として、クロストリジウム アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）ATCC824株（以下、「ATCC824株」という）およびクロストリジウム ベイジェリンキー（Clostridium beijerinckii）NCIMB8052株（以下、「NCIMB8052株」という）を使用し、ブタノール生産菌の違いによるブタノール生産性を検討した。なお、これらのブタノール生産菌は、グルコースを基質としてブタノール生産を行った場合は、その生産量に大きな差異はないことを確認している。 Here, as butanol-producing bacteria, in addition to N1-4 strain, Clostridium acetobutylicum ATCC824 strain (hereinafter referred to as “ATCC824 strain”) and Clostridium beijerinckii NCIMB8052 strain (hereinafter referred to as “Crostridium beijerinckii”) "NCIMB8052 strain") was used to examine butanol productivity due to differences in butanol-producing bacteria. These butanol-producing bacteria have been confirmed to have no significant difference in production when butanol is produced using glucose as a substrate.
図８にブタノール生産量の経時的変化を測定した結果を示し、図９に培養１１日後の発酵産物量の比較データを示す。図８、図９に示すように、試験したブタノール生産菌の中では、N1-4株が最もブタノール生産量が多く、混合培養によるブタノール生産に最も適している菌株であることが判明した。一方、ATCC824株およびNCIMB8052株ではブタノールではなく酪酸が主生産物となることが判明した。なお、結晶性セルロースに代えて、ろ紙、新聞紙、綿、稲わらを基質とした場合でも同様の傾向が認められた。 FIG. 8 shows the results of measuring changes in butanol production over time, and FIG. 9 shows comparative data on the amount of fermentation products after 11 days of culture. As shown in FIGS. 8 and 9, among the butanol-producing bacteria tested, the N1-4 strain had the highest butanol production and was found to be the most suitable strain for butanol production by mixed culture. On the other hand, it was found that butyric acid was the main product, not butanol, in the ATCC824 and NCIMB8052 strains. The same tendency was observed when filter paper, newspaper, cotton, or rice straw was used as the substrate instead of crystalline cellulose.
６．基質の検討
NBRC 103400株の初発菌体量をOD600nm=1.0に調製し、濃度4％（wt/vol）の基質に植菌し、嫌気的条件下、24h（1日）、60℃で培養した。培養開始から24h（1日）経過後、N1-4株の初発菌体量をOD600nm=1.0に調製したものを添加し、培地の温度を30℃に変更して嫌気的条件下で所定期間培養した。
6). Substrate review
The initial bacterial mass of the NBRC 103400 strain was adjusted to OD 600 nm = 1.0, inoculated on a substrate with a concentration of 4% (wt / vol), and cultured at 60 ° C. for 24 hours (1 day) under anaerobic conditions. After 24 hours (1 day) from the start of culture, add N1-4 strain with initial microbial mass adjusted to OD 600nm = 1.0, change medium temperature to 30 ° C for anaerobic condition for a predetermined period Cultured.
ここで、基質としてグルコース（関東化学株式会社製）、結晶性セルロース（Avicel cellulose、Sigma-Aldrich社製）、ろ紙（アドバンテック株式会社製）、新聞紙、稲わら及び稲わらにヘミセルラーゼを添加したものを用い、基質の違いによるブタノール生産量の相違を検討した。 Here, glucose (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), crystalline cellulose (manufactured by Sigma-Aldrich), filter paper (manufactured by Advantech), newspaper, rice straw, and rice straw with hemicellulase added as a substrate The difference in butanol production due to the difference in substrate was examined.
なお、グルコースを基質に用いた場合はセルロース資化菌であるNBRC 103400株を用いる必要がないため、培地には添加しなかった。また、ろ紙、新聞紙、稲わらはミルサー（タイガー魔法瓶株式会社製）にて物理的粉砕処理を行ったものをセルロース基質として使用した。稲わらにヘミセルラーゼを添加する場合、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）由来のヘミセルラーゼ（Sigma社製）を30U/mlとなるように培地に添加した。 In addition, when glucose was used as a substrate, it was not necessary to use the NBRC 103400 strain, which is a cellulose-assimilating bacterium, so it was not added to the medium. In addition, filter paper, newspaper, and rice straw, which had been physically pulverized with Mirther (manufactured by Tiger Thermos Co., Ltd.), were used as the cellulose substrate. When adding hemicellulase to rice straw, hemicellulase (manufactured by Sigma) derived from Aspergillus niger was added to the medium at 30 U / ml.
図１０にブタノール生産量の経時的変化を測定した結果を示し、図１１に培養１１日後の発酵産物量の比較データを示す。図１０、図１１に示すように、基質の種類によって生産量の違いはあるものの、今回使用したすべての基質でブタノールが主生産物として生産されたことから、種々のセルロース系基質でクロストリジウム属の混合培養によるブタノールの生産が可能であることが示唆された。 FIG. 10 shows the results of measuring changes in butanol production over time, and FIG. 11 shows comparative data of fermentation product amounts after 11 days of culture. As shown in FIG. 10 and FIG. 11, although there is a difference in the production amount depending on the type of substrate, butanol was produced as a main product with all the substrates used this time. It was suggested that butanol can be produced by mixed culture.
また、図１１に示すように、ヘミセルラーゼを稲わら基質に添加した場合は、添加しない場合と比較して、約2.0倍ものブタノールが得られた。稲わらはセルロースのほかヘミセルロースを有している。そのため、ヘミセルロースを構成糖として含むセルロース基質を用いる場合は、ヘミセルラーゼを添加することでブタノール生産量を高められることが明らかとなった。この結果から、ヘミセルロースを含む木質系バイオマスを基質として用いた場合であっても、良好なブタノール生産が可能となることが示唆された。 Moreover, as shown in FIG. 11, when hemicellulase was added to the rice straw substrate, about 2.0 times as much butanol was obtained as compared with the case where hemicellulase was not added. Rice straw has hemicellulose in addition to cellulose. For this reason, when a cellulose substrate containing hemicellulose as a constituent sugar is used, it became clear that butanol production can be increased by adding hemicellulase. From these results, it was suggested that good butanol production is possible even when woody biomass containing hemicellulose is used as a substrate.
Claims (8)
セルロース資化能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌によりセルロース基質を糖化する工程と、
ブタノール生産能を有するクロストリジウム（Clostridium）属細菌によりブタノールを生産する工程と、
を有する、ブタノール生産方法。 A method for producing butanol from a cellulose substrate by mixed culture of bacteria belonging to the genus Clostridium,
Saccharifying a cellulose substrate with a bacterium belonging to the genus Clostridium having cellulose-assimilating ability;
Producing butanol by a Clostridium bacterium having butanol-producing ability;
A process for producing butanol.
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Citations (3)
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| JPS5831993A (en) * | 1981-08-20 | 1983-02-24 | Idemitsu Kosan Co Ltd | Preparation of butanol |
| JPS5985295A (en) * | 1982-11-09 | 1984-05-17 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | Production of compound containing oxygen from material containing cellulose |
| JPS6087796A (en) * | 1983-10-19 | 1985-05-17 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | Production of oxygen-containing organic compound containing butanol from hemicellulose |
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| JPS6087796A (en) * | 1983-10-19 | 1985-05-17 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | Production of oxygen-containing organic compound containing butanol from hemicellulose |
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