JP2011232172A - METHOD FOR DIAGNOSTIC ASSISTANCE TO PATHOLOGICAL CONDITION ASSOCIATED WITH β-AMYLOID - Google Patents

METHOD FOR DIAGNOSTIC ASSISTANCE TO PATHOLOGICAL CONDITION ASSOCIATED WITH β-AMYLOID Download PDF

Info

Publication number
JP2011232172A
JP2011232172A JP2010102682A JP2010102682A JP2011232172A JP 2011232172 A JP2011232172 A JP 2011232172A JP 2010102682 A JP2010102682 A JP 2010102682A JP 2010102682 A JP2010102682 A JP 2010102682A JP 2011232172 A JP2011232172 A JP 2011232172A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
value
measurement
pathological condition
amount
diagnosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2010102682A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP5747444B2 (en
JP2011232172A5 (en
Inventor
Naoko Kameshima
直子 亀島
Toshibumi Nanjo
俊文 南條
Takaomi Fukuhara
崇臣 福原
Ikuo Toyama
育夫 遠山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Panasonic Corp
Shiga University of Medical Science NUC
Original Assignee
Panasonic Corp
Shiga University of Medical Science NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Panasonic Corp, Shiga University of Medical Science NUC filed Critical Panasonic Corp
Priority to JP2010102682A priority Critical patent/JP5747444B2/en
Publication of JP2011232172A publication Critical patent/JP2011232172A/en
Publication of JP2011232172A5 publication Critical patent/JP2011232172A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5747444B2 publication Critical patent/JP5747444B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide useful information for the diagnosis of pathological condition associated with β-amyloid (Aβ) such as Alzheimer's disease with simplicity and great accuracy by using a specimen which is collected easily.SOLUTION: A method includes: a first measurement step for obtaining a first Aβ measurement value by measuring the amount of Aβ in a liquid specimen collected from a subject; a second measurement step for obtaining a second Aβ measurement value by measuring the amount of Aβ in a mixed liquid of the liquid specimen and a solubilizing agent after preparing the mixed liquid; a calculation step for calculating a relation value between the first Aβ measurement value and the second Aβ measurement value; and an estimation step for estimating the amount of Aβ in the subject based on the relation value.

Description

本発明は、アルツハイマー病等の、βアミロイドに関連する病的状態の診断を補助する方法に関する。   The present invention relates to methods for assisting in the diagnosis of pathological conditions associated with β-amyloid, such as Alzheimer's disease.

アルツハイマー病は、初老期から老年期に起こる進行性の痴呆(認知症)を特徴とする疾患であり、現在、国内の患者数は100万人以上と言われている。今後人口の高齢化に伴いその数は確実に増加すると予想される。アルツハイマー病の臨床症状は、記憶障害、高次脳機能障害(失語、失行、失認、構成失行)などであり、その症状は他の痴呆疾患でも共通して見られることが多く、臨床症状だけでアルツハイマー病と確定診断することは極めて困難である。   Alzheimer's disease is a disease characterized by progressive dementia (dementia) that occurs from early age to old age. Currently, the number of patients in Japan is said to be over 1 million. The number is expected to increase steadily as the population ages. Clinical symptoms of Alzheimer's disease include memory impairment and higher brain dysfunction (aphasia, aphasia, agnosia, constitutive apraxia), and the symptoms are often seen in other dementia diseases. It is extremely difficult to make a definitive diagnosis of Alzheimer's disease based on symptoms alone.

アルツハイマー病はこれまで根本治療法がなかったが、1999年にワクチン療法がモデルマウスで成功して以来、根本治療法開発への期待が高まっている(非特許文献1)。また、既存のアルツハイマー病治療薬の多くは対症療法薬であるが、初期から中期に使用することで高い効果が得られることが示されており、早期の処方が望まれる。これらの治療法を有効に活用するためにも、早期にアルツハイマー病を診断する必要がある。さらには、軽度認知症障害(MCI)の患者が高頻度にアルツハイマー病に移行することが示され、MCIがアルツハイマー病に移行するかどうかの予測診断法の確立にも期待が高まっている。   Alzheimer's disease has never had a fundamental treatment, but since 1999, when vaccine therapy was successful in model mice, expectations for development of the fundamental treatment have increased (Non-patent Document 1). In addition, many of the existing Alzheimer's disease therapeutic drugs are symptomatic treatment drugs, but it has been shown that high effects can be obtained by using them from the early stage to the middle stage, and early prescription is desired. In order to effectively use these treatment methods, it is necessary to diagnose Alzheimer's disease at an early stage. Furthermore, it has been shown that patients with mild dementia disorder (MCI) frequently shift to Alzheimer's disease, and expectations are rising for the establishment of a predictive diagnostic method for whether MCI will shift to Alzheimer's disease.

アルツハイマー病の特徴的な病理組織所見としては、老人斑と神経原線維変化がある。前者の主構成成分はβシート構造をとったβアミロイド(以下Aβともいう)の凝集体であり、後者のそれは過剰にリン酸化されたタウ蛋白である。現在、アルツハイマー病の発症には、Aβが蓄積することが最初におこる病理変化である、というアミロイド仮説が有力である(非特許文献2)。すなわち、アルツハイマー病においては臨床症状が発症するかなり前から、脳内ではAβが蓄積する等の上記病理的組織変化が進行することが知られている。   Characteristic histopathological findings of Alzheimer's disease include senile plaques and neurofibrillary tangles. The former main component is an aggregate of β amyloid (hereinafter also referred to as Aβ) having a β sheet structure, and the latter is an excessively phosphorylated tau protein. At present, the amyloid hypothesis that accumulation of Aβ is the first pathological change to develop Alzheimer's disease is effective (Non-patent Document 2). That is, it is known that in Alzheimer's disease, the pathological tissue changes such as Aβ accumulation progress in the brain long before clinical symptoms develop.

アルツハイマー病に係る診断、治療の研究では、APPsweマウスがよく用いられる。前記APPsweマウスは、1996年にHsiauらによって確立され、Sweden型の突然変異APPを過剰発現する。前記APPsweマウスのアルツハイマー病様の主な症状としては12ヶ月齢頃から脳内に老人斑がみられるようになり、13ヶ月齢頃に行動異常を発症し、16−18ヶ月では脳内の老人斑が急激に増加し、24ヶ月齢前後で死亡する。月齢に依存して行動異常や老人斑の形成を確認できることからアルツハイマー病研究の有用なモデル動物とされている。非特許文献3では、前記APPsweマウスにおいて、月齢に対する、脳内Aβ濃度、髄液、血液等のAβ濃度の変化が報告されている。   APPswe mice are often used in studies of diagnosis and treatment related to Alzheimer's disease. The APPswe mouse was established in 1996 by Hsiau et al. And overexpresses the Swedish type of mutant APP. The main symptoms of Alzheimer's disease in the APPswe mouse began to show senile plaques in the brain from the age of 12 months, developed behavioral abnormalities at the age of 13 months, and the elderly in the brain at 16-18 months Spots increase rapidly and die around 24 months of age. It is considered to be a useful model animal for Alzheimer's disease research because it can confirm behavioral abnormalities and senile plaque formation depending on age. Non-Patent Document 3 reports changes in brain Aβ concentrations, cerebrospinal fluid, blood and other Aβ concentrations with respect to age in the APPswe mice.

近年、脳内の老人斑の量すなわちAβ沈着量を診断する画像診断法が注目されており、脳内に入ってAβに選択的に結合する、ポジトロン断層撮影法(PET)用や核磁気共鳴(MR)画像用の造影剤の研究が進められている(特許文献1)。   In recent years, imaging diagnostic methods for diagnosing the amount of senile plaques in the brain, that is, the amount of Aβ deposition, have attracted attention. Research on contrast agents for (MR) images is underway (Patent Document 1).

研究用試薬としては、Aβに対する特異抗体を用いたELISA法が広く用いられている。ELISA法によれば、脳脊髄液では、アルツハイマー病の進行に伴い、42アミノ酸型のAβ(以下Aβ(42))が減少することが、ほぼ確立されている(特許文献2および非特許文献4)。この減少が大脳皮質のアミロイド蓄積と相関があることが示され、早期のアルツハイマー病への移行予測や発症前診断に有用と考えられている。血液などの体液では、血漿中のAβ(42)と40アミノ酸型のAβ(以下Aβ(40))の比(Aβ(42)/Aβ(40))がアルツハイマー病の進行に伴い減少することが示された。   As a research reagent, an ELISA method using a specific antibody against Aβ is widely used. According to the ELISA method, it is almost established that 42 amino acid type Aβ (hereinafter referred to as Aβ (42)) decreases in cerebrospinal fluid with the progress of Alzheimer's disease (Patent Document 2 and Non-Patent Document 4). ). This decrease has been shown to correlate with amyloid accumulation in the cerebral cortex, and is thought to be useful for predicting early transition to Alzheimer's disease and prediagnosis diagnosis. In body fluids such as blood, the ratio (Aβ (42) / Aβ (40)) of Aβ (42) in plasma to Aβ of 40 amino acids (hereinafter referred to as Aβ (40)) may decrease as Alzheimer's disease progresses. Indicated.

国際公開第2003/106439号International Publication No. 2003/106439 特表平10−509797号公報Japanese National Patent Publication No. 10-509797

Schenk D, Seubert P, et al.Nature 400:p.173−177,1999.Schenk D, Seubert P, et al. Nature 400: p. 173-177, 1999. Hardy J, Selkoe DJ. Science 297:p.353−356,2002.Hardy J, Selkoe DJ. Science 297: p. 353-356, 2002. Takeshi Kawarabayashi,et al.The Jounal of Neuroscience, 21(2):p.372−381,2001.Takeshi Kawarabayashi, et al. The Journal of Neuroscience, 21 (2): p. 372-381, 2001. Hansson O, Zetterberg H, Buchhave P, et al. Lancet Neurol.5:228−234,2006.Hansson O, Zetterberg H, Buchhave P, et al. Lancet Neurol. 5: 228-234, 2006.

上述の如く従来は、アルツハイマー病等の早期診断を行うために脳の断層撮影を行ったり、あるいは髄液を採取して髄液中のAβ量を測定したりしていた。   As described above, conventionally, tomographic imaging of the brain has been performed for early diagnosis of Alzheimer's disease or the like, or cerebrospinal fluid has been collected and the amount of Aβ in the spinal fluid has been measured.

しかし、これらの検査は高い専門性が必要であるため、アルツハイマー病等の診断における最初の判定(スクリーニング)として選択されることは極めて稀であり、これらの検査で早期診断判定をすることは極めて困難であった。   However, because these tests require high expertise, it is extremely rare to be selected as the first decision (screening) in the diagnosis of Alzheimer's disease, etc. It was difficult.

そこで本発明は、採取しやすい検体を用いて簡便に、しかも高精度で、アルツハイマー病等の、Aβに関連する病的状態の診断に有用な情報を提供することを課題とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide information useful for diagnosis of a pathological condition related to Aβ such as Alzheimer's disease simply and with high accuracy using a sample that can be easily collected.

本発明者らが鋭意検討した結果、体液や生体組織等の検体に含まれるAβの一部は凝集又は他物質と結合又は吸着しており、免疫学的測定法で全てのAβを測定するのは困難であることが判明した。しかし、検体に可溶化剤を添加した後Aβ量を測定すると、Aβの測定感度が向上することも判明した。さらに、可溶化剤を添加する前後のAβ測定値から求めた関係値は、被験者中Aβ量と相関しており、この関係値に基づき、被験者中Aβ量を推定することが可能となることを見出した。   As a result of intensive studies by the present inventors, a part of Aβ contained in a specimen such as a body fluid or a biological tissue is aggregated or bound or adsorbed with another substance, and all Aβ is measured by an immunoassay. Proved difficult. However, it has also been found that measuring the Aβ amount after adding a solubilizer to the specimen improves the Aβ measurement sensitivity. Further, the relationship value obtained from the measured Aβ values before and after the addition of the solubilizer correlates with the Aβ amount in the subject, and based on this relationship value, it is possible to estimate the Aβ amount in the subject. I found it.

すなわち本発明は、被験者から採取された液性検体においてβアミロイド(以下Aβという)の量を測定して、第1のAβ測定値を得る第1の測定工程と、
前記液性検体と可溶化剤を混合して混合液を調製した後、当該混合液においてAβの量を測定して、第2のAβ測定値を得る第2の測定工程と、
前記第1のAβ測定値と前記第2のAβ測定値との関係値を算出する算出工程と、
前記関係値に基づき、前記被験者中Aβ量を推定する推定工程と、
を包含する、Aβに関連する病的状態の診断を補助する方法に関する。
That is, the present invention includes a first measurement step of measuring the amount of β amyloid (hereinafter referred to as Aβ) in a liquid sample collected from a subject to obtain a first Aβ measurement value;
A second measurement step of obtaining a second measured value of Aβ by measuring the amount of Aβ in the mixed solution after preparing the mixed solution by mixing the liquid specimen and the solubilizer;
A calculation step of calculating a relation value between the first Aβ measurement value and the second Aβ measurement value;
An estimation step of estimating the amount of Aβ in the subject based on the relationship value;
A method for assisting in the diagnosis of a pathological condition associated with Aβ.

前記算出工程が、前記第1のAβ測定値と前記第2のAβ測定値との差を、前記関係値として求める算出工程からなることが好ましい。   It is preferable that the calculation step includes a calculation step of obtaining a difference between the first Aβ measurement value and the second Aβ measurement value as the relation value.

前記算出工程が、前記第1のAβ測定値と前記第2のAβ測定値との差を、第1の算出値として求める第1の算出工程と、前記第1のAβ測定値に対する前記第1の算出値の比率を、前記関係値として求める第2の算出工程と、からなることが好ましい。   The calculation step includes a first calculation step of obtaining a difference between the first Aβ measurement value and the second Aβ measurement value as a first calculation value, and the first Aβ measurement value with respect to the first Aβ measurement value. And a second calculation step of obtaining a ratio of the calculated values as the relation value.

前記可溶化剤がギ酸であることが好ましい。   The solubilizer is preferably formic acid.

前記液性検体は、血液、脳脊髄液(CSF)、鼻粘液、及び、尿からなる群より選択される1種であることが好ましい。   The liquid sample is preferably one type selected from the group consisting of blood, cerebrospinal fluid (CSF), nasal mucus, and urine.

前記液性検体は、生体組織の懸濁液であることが好ましい。   The liquid specimen is preferably a suspension of biological tissue.

前記第1の測定工程及び前記第2の測定工程において測定される前記Aβは、42個のアミノ酸残基からなるAβ、及びそのアミノ基末端が切断又は修飾されたAβであることが好ましい。   The Aβ measured in the first measurement step and the second measurement step is preferably Aβ consisting of 42 amino acid residues and Aβ having its amino group cleaved or modified.

本発明によれば、採取が容易な体液や生体組織を検体として用いて、簡便に、かつ精度よく、被験者中Aβ量を判定することが可能となる。当該Aβ量を判断材料として用いることで、アルツハイマー病等の、Aβに関連する病的状態の早期診断若しくはスクリーニング、又は、当該病的状態を患う患者に投薬した場合の当該病的状態の治療効果のモニターを簡易に行うことができる。   ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to determine the amount of Aβ in a subject simply and accurately using a bodily fluid or biological tissue that can be easily collected as a specimen. By using the amount of Aβ as a judgment material, early diagnosis or screening of a pathological condition related to Aβ such as Alzheimer's disease, or therapeutic effect of the pathological condition when administered to a patient suffering from the pathological condition Can be easily monitored.

本発明の一実施形態であるAβ測定フローAβ measurement flow according to an embodiment of the present invention 本発明の一実施形態であるAβ測定フローにおける(a)第1の測定工程の対象となる液性検体中の状態、(b)第2の測定工程の対象となる液性検体中の状態、(c)本発明の指標の意味を説明する概念図。In the Aβ measurement flow according to one embodiment of the present invention, (a) the state in the liquid sample that is the target of the first measurement step, (b) the state in the liquid sample that is the target of the second measurement step, (C) The conceptual diagram explaining the meaning of the parameter | index of this invention. 実証例における可溶化剤の効果を確認する測定フローMeasurement flow to confirm the effect of the solubilizer in the demonstration example 実施例1の測定フローMeasurement flow of Example 1 実施例1の測定結果に基づいた、4グループの月齢に対する指標(D)の関係を示すグラフThe graph which shows the relationship of the parameter | index (D) with respect to the age of 4 groups based on the measurement result of Example 1. 非特許文献3で示される4グループの月齢に対する脳内Aβ濃度の関係を示すグラフThe graph which shows the relationship of the brain A (beta) density | concentration with respect to the age of 4 groups shown by the nonpatent literature 3. 非特許文献3で示される4グループの月齢に対する髄液中Aβ濃度の関係を示すグラフThe graph which shows the relationship of the Abeta density | concentration in cerebrospinal fluid with respect to the age of 4 groups shown by nonpatent literature 3 非特許文献3で示される4グループの月齢に対する血漿中Aβ濃度の関係を示すグラフThe graph which shows the relationship of the plasma A (beta) density | concentration with respect to the age of 4 groups shown by a nonpatent literature 3.

本発明は、アルツハイマー病等の、Aβに関連する病的状態の診断を補助する方法に関するものであり、被験者中Aβ量を判定することが可能となる。これにより判定されたAβ量を判断材料の1つとして用いて、Aβに関連する病的状態を診断することが可能となるため、Aβに関連する病的状態の早期診断、治療効果のモニター、又は、スクリーニングを行う際に有用である。   The present invention relates to a method for assisting diagnosis of a pathological condition related to Aβ, such as Alzheimer's disease, and it is possible to determine the amount of Aβ in a subject. Since it is possible to diagnose a pathological condition related to Aβ by using the determined Aβ amount as one of judgment materials, early diagnosis of a pathological condition related to Aβ, monitoring of therapeutic effect, Or it is useful when screening.

「Aβに関連する病的状態」とは、Aβが脳内に蓄積することで発症すると考えられている病的状態を意味し、例えば、アルツハイマー病、ダウン症候群、およびオランダタイプのアミロイド症を伴う遺伝性脳出血(Hereditary Cerebral Hemorrhage with Amyloidosis of the Dutch−Type:HCHWA−D)性の病態が挙げられる。Aβは、前記「Aβに関連する病的状態」の患者において、患者の脳で発見される老人斑及び血管アミロイド沈着(アミロイドアンギオパシー)の主要な化学的成分である。   “Aβ-related morbidity” means a morbidity that is thought to develop as Aβ accumulates in the brain, eg, with Alzheimer's disease, Down's syndrome, and Dutch type amyloidosis Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis of the drug-type (HCHWA-D). Aβ is a major chemical component of senile plaques and vascular amyloid deposits (amyloid angiopathy) found in the patient's brain in patients with the “pathological conditions associated with Aβ”.

本発明におけるAβとは、「アミロイドベータ蛋白質」、「アミロイドベータペプチド」、「Aベータ」、「ベータAP」、「Aベータペプチド」又は「Aβペプチド」と呼称される物質である。Aβは、様々な数のアミノ酸をもつペプチドであり、一般的に39〜43のアミノ酸を含む。Aβは、ベータ−アミロイド前駆体蛋白質(以降APPとする)の断片として生成され、APP正常遺伝子のAβ領域の突然変異から生じる多形型を含む場合もある。   Aβ in the present invention is a substance called “amyloid beta protein”, “amyloid beta peptide”, “Abeta”, “beta AP”, “Abeta peptide” or “Aβ peptide”. Aβ is a peptide having various numbers of amino acids and generally contains 39 to 43 amino acids. Aβ is produced as a fragment of a beta-amyloid precursor protein (hereinafter referred to as APP), and may contain a polymorphic form resulting from a mutation in the Aβ region of the normal APP gene.

本発明におけるAβのうち、特にAβ(42)は重要であり、好適に本発明の測定対象とすることができる。従来、実際の臨床現場においても、髄液中のAβ(42)とAβ(40)が測定対象とされている。Aβ(42)とAβ(40)は、前記老人斑の主要な化学的成分であるAβの大部分を占める。また、Aβ(42)はその凝集性の高さから初期の段階から老人斑の形成に関与しているものと報告されている。ここで、「Aβ(42)」とは、42個のアミノ酸残基を有する全長のAβ(42)、及び全長Aβ(42)の一部が断片化又は修飾されたAβ(42)を総称して指す。「Aβ(40)」とは、40個のアミノ酸残基を有する全長のAβ(40)、及び全長Aβ(40)の一部が断片化又は修飾されたAβ(40)を総称して示す。   Among Aβs in the present invention, Aβ (42) is particularly important, and can be suitably used as the measurement target of the present invention. Conventionally, Aβ (42) and Aβ (40) in the cerebrospinal fluid have been measured in actual clinical settings. Aβ (42) and Aβ (40) occupy most of Aβ which is a main chemical component of the senile plaque. Aβ (42) has been reported to be involved in the formation of senile plaques from the early stage due to its high aggregation property. Here, “Aβ (42)” is a general term for Aβ (42) having a full-length Aβ (42) having 42 amino acid residues and Aβ (42) in which a part of the full-length Aβ (42) is fragmented or modified. Point to it. “Aβ (40)” is a generic term for the full-length Aβ (40) having 40 amino acid residues, and Aβ (40) in which a part of the full-length Aβ (40) is fragmented or modified.

測定対象とするAβ(42)は、検体内に様々な形態で含まれている。これは、Aβ(42)の凝集性が高いことによる。「Aβ(42)の凝集性が高い」ということは、Aβ(42)自身が会合して凝集する性質を有すること、及び、Aβ(42)を核として、Aβ(40)を含む他のAβペプチドと会合して凝集する性質を有することを意味する。一般的に、疎水性の強いAβ(42)は、水溶液中で凝集物として存在するほうが安定である。ここで、凝集前のAβ(42)及びAβ(40)を含む他のAβペプチドを、Aβ単量体又はAβモノマー(以降Aβモノマーとする)という。また、凝集しているが、生理食塩水中などの水溶液に溶解状態にあるAβを、可溶性Aβ多量体又は可溶性Aβオリゴマー(以降可溶性Aβオリゴマーとする)という。さらに、前記可溶性Aβオリゴマーの状態から凝集が進み、前記水溶液中で不溶性となったAβを、不溶性Aβ多量体又は不溶性Aβ(以降不溶性Aβとする)という。   Aβ (42) to be measured is included in various forms in the specimen. This is due to the high aggregation property of Aβ (42). “Aβ (42) has a high aggregation property” means that Aβ (42) itself aggregates and aggregates, and other Aβs including Aβ (40) with Aβ (42) as a nucleus. It means having the property of being aggregated in association with a peptide. Generally, Aβ (42) having a strong hydrophobicity is more stable when present as an aggregate in an aqueous solution. Here, other Aβ peptides including Aβ (42) and Aβ (40) before aggregation are referred to as Aβ monomer or Aβ monomer (hereinafter referred to as Aβ monomer). Aβ that is aggregated but is dissolved in an aqueous solution such as physiological saline is referred to as a soluble Aβ multimer or a soluble Aβ oligomer (hereinafter referred to as a soluble Aβ oligomer). Furthermore, Aβ that has become aggregated from the state of the soluble Aβ oligomer and becomes insoluble in the aqueous solution is referred to as insoluble Aβ multimer or insoluble Aβ (hereinafter referred to as insoluble Aβ).

一方で、Aβ(42)はAβ以外の物質と結合又は吸着する性質を持つ。Aβ以外の物質とは、例えば、血漿蛋白や膜脂質、細胞表面である。あるいは、Aβ(42)を内部に含む容器の表面でもある。前記結合又は吸着の原因としては、Aβ以外の物質の疎水性領域とAβ(42)の疎水性領域との疎水相互作用が考えられる。本発明では、特に断りのない限り、「Aβ」は、Aβモノマー、可溶性Aβオリゴマー、不溶性Aβ、及び、Aβ以外の物質と結合又は吸着したAβを総称して指す。特に断りのない限り、「Aβ凝集体」は、可溶性Aβオリゴマー及び不溶性Aβを総称して指す。   On the other hand, Aβ (42) has a property of binding or adsorbing to substances other than Aβ. Substances other than Aβ are, for example, plasma proteins, membrane lipids, and cell surfaces. Or it is also the surface of the container which contains A (beta) (42) inside. As a cause of the binding or adsorption, a hydrophobic interaction between a hydrophobic region of a substance other than Aβ and a hydrophobic region of Aβ (42) can be considered. In the present invention, unless otherwise specified, “Aβ” collectively refers to Aβ monomer, soluble Aβ oligomer, insoluble Aβ, and Aβ bound to or adsorbed to a substance other than Aβ. Unless otherwise specified, “Aβ aggregate” refers collectively to soluble Aβ oligomers and insoluble Aβ.

本発明における液性検体とは、Aβを含み得る検体であり、被験者から採取された体液、又は、被験者から採取された体液又は生体組織を測定に適した状態に調整した液体をいう。具体的には、血液、脳脊髄液(CSF)、鼻粘液(鼻汁)、尿、涙、唾液などの体液が挙げられる。あるいは、鼻粘膜や細胞等の生体組織の懸濁液が挙げられる。当該懸濁液は、生理食塩水などの、生理的条件を満たす液体を用いて調製することができる。前記懸濁液は、例えば、鼻粘膜を生理食塩水で洗浄して得られる洗浄液、又は、当該洗浄液を所定容量に調製した懸濁液であってもよい。   The liquid sample in the present invention is a sample that may contain Aβ, and refers to a body fluid collected from a subject, or a fluid obtained by adjusting a body fluid or biological tissue collected from a subject to a state suitable for measurement. Specific examples include body fluids such as blood, cerebrospinal fluid (CSF), nasal mucus (nasal discharge), urine, tears, saliva and the like. Alternatively, suspensions of biological tissues such as nasal mucosa and cells can be mentioned. The suspension can be prepared using a liquid that satisfies physiological conditions, such as physiological saline. The suspension may be, for example, a washing solution obtained by washing the nasal mucosa with physiological saline, or a suspension prepared by preparing the washing solution in a predetermined volume.

本発明の第1の測定工程及び第2の測定工程におけるAβ量の測定では、液性検体中においてAβモノマーを特異的に検出できる測定法を用いる。より具体的には、42個のアミノ酸残基からなるAβ及びそのアミノ基末端が切断又は修飾されたAβ(これらをAβ(x−42)という)を液性検体中において特異的に検出できる測定法を用いる。具体的には、本発明におけるAβ量の測定は、免疫学的測定法により実施できる。免疫学的測定法は、検出するペプチド又は蛋白質に特異的である抗体などの結合物質を使用する免疫学的測定法であって、当該分野で公知である。免疫学的測定法の例としては、ELISA法、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ等が含まれる。以下の実施例で用いた和光純薬(株)製の測定キットは、ELISA法を基本原理としたものである。   In the measurement of the Aβ amount in the first measurement step and the second measurement step of the present invention, a measurement method capable of specifically detecting Aβ monomer in a liquid sample is used. More specifically, Aβ consisting of 42 amino acid residues and Aβ whose amino group terminal is cleaved or modified (these are referred to as Aβ (x-42)) can be specifically detected in a liquid sample. Use the law. Specifically, the amount of Aβ in the present invention can be measured by an immunological measurement method. An immunoassay is an immunoassay that uses a binding substance such as an antibody that is specific for the peptide or protein to be detected and is known in the art. Examples of immunological measurement methods include ELISA, Western blotting, radioimmunoassay and the like. The measurement kit manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. used in the following examples is based on the ELISA method.

本発明でAβを測定する際に免疫学的測定法で使用する抗体は、Aβと特異的に反応及び結合する抗体である。抗体の作製法は数種類確立されており、既に公知である。代表的な作製法としては、マウスに測定対象物を抗原として免疫し、その後マウスの脾臓を取り出し、マウスの脾臓と癌細胞であるミエローマーとを融合することにより、ハイブリドーマ(抗体産生細胞)を作製する方法がある。この方法における抗原として、本発明ではAβモノマーを使用する。具体的には、Aβ(42)である。さらに、抗原と結合する抗体は、Aβのどの領域を認識して結合するかが重要である。例えば、抗体がAβ(42)とAβ(40)を区別するには、Aβ(42)とAβ(40)とで異なる領域のアミノ酸配列を認識する必要がある。即ち、Aβ(42)に関しては、Aβ(42)のアミノ酸配列のC末端側の2つのアミノ酸を含むアミノ酸配列を認識できる抗体がAβ(42)に特異的な抗体といえ、当該配列を認識できない抗体がAβ(40)に特異的な抗体であるといえる。また、Aβ(42)とAβ(40)のN末端側は、同じアミノ酸配列から構成されるため、N末端側のアミノ酸配列を認識できる抗体は、Aβ(42)とAβ(40)のいずれとも結合する抗体である。前述の和光純薬(株)の測定キットでは、これらの抗体が適切に組み合わされて使用されており、Aβ(x−42)を特異的に測定するキットである
図1は、本発明の一実施形態であるAβ測定フローを示す。本実施形態は、第1の測定工程11及び第2の測定工程12からなる。
The antibody used in the immunoassay when measuring Aβ in the present invention is an antibody that specifically reacts and binds to Aβ. Several methods for producing antibodies have been established and are already known. As a typical production method, a mouse is immunized with a measurement object as an antigen, and then the mouse spleen is removed, and the mouse spleen and myeloma, which is a cancer cell, are fused to produce a hybridoma (antibody-producing cell). There is a way to do it. As an antigen in this method, Aβ monomer is used in the present invention. Specifically, it is Aβ (42). Furthermore, it is important which region of Aβ recognizes and binds to an antibody that binds to an antigen. For example, in order for an antibody to distinguish between Aβ (42) and Aβ (40), it is necessary to recognize the amino acid sequences of different regions between Aβ (42) and Aβ (40). That is, regarding Aβ (42), an antibody that can recognize an amino acid sequence containing two amino acids on the C-terminal side of the amino acid sequence of Aβ (42) can be said to be an antibody specific to Aβ (42) and cannot recognize the sequence. It can be said that the antibody is an antibody specific to Aβ (40). In addition, since the N-terminal side of Aβ (42) and Aβ (40) is composed of the same amino acid sequence, antibodies capable of recognizing the N-terminal amino acid sequence are both Aβ (42) and Aβ (40). It is an antibody that binds. In the above-mentioned measurement kit of Wako Pure Chemical Industries, Ltd., these antibodies are used in an appropriate combination, and the kit specifically measures Aβ (x-42). FIG. The A (beta) measurement flow which is embodiment is shown. The present embodiment includes a first measurement process 11 and a second measurement process 12.

第1の測定工程11では、免疫学的測定法を用いて液性検体中のAβ濃度を測定する。測定の前には、必要に応じて、免疫学的測定法に適した濃度に液性検体を希釈してよい。以下では、AβとしてAβ(42)濃度を測定する場合について説明する。具体的には、液性検体中のAβ(42)濃度をELISA法により測定する。Aβの少なくとも一部は、前述するように、水溶液中でその凝集性及び吸着性の高さに起因して、可溶性Aβオリゴマー又は不溶性Aβを形成しているか、あるいは、Aβ以外の物質と結合又は吸着していると考えられる。本発明の一実施様態である免疫学的測定法では、可溶性Aβオリゴマー又は不溶性Aβを形成しているAβモノマーのうち、免疫学的測定法で使用される抗体の認識部位が可溶性Aβオリゴマー又は不溶性Aβの内部に埋もれているAβモノマーは測定できない。また、Aβ以外の物質と結合又は吸着しているAβのうち、免疫学的測定法で使用される抗体の認識部位が前記結合又は吸着により内部に埋もれているAβモノマーについても測定できない。第1の測定工程11において測定できるのは、以上のAβモノマー以外のAβモノマーである。従って、液性検体を直接測定対象とする本発明の第1の測定工程11で得られるAβ(42)濃度は、実際の総Aβ(42)濃度よりも低くなる。この点については後の実証例で実証している。   In the first measurement step 11, the Aβ concentration in the liquid sample is measured using an immunological measurement method. Prior to the measurement, the liquid sample may be diluted to a concentration suitable for the immunoassay as necessary. Hereinafter, a case where the Aβ (42) concentration is measured as Aβ will be described. Specifically, the Aβ (42) concentration in the liquid specimen is measured by the ELISA method. As described above, at least a part of Aβ forms a soluble Aβ oligomer or insoluble Aβ in an aqueous solution due to its high aggregation and adsorption properties, or binds to a substance other than Aβ, or It is thought that it is adsorbed. In the immunological assay that is one embodiment of the present invention, among the Aβ monomers forming soluble Aβ oligomers or insoluble Aβ, the antibody recognition site used in the immunoassay is soluble Aβ oligomer or insoluble. Aβ monomer buried in Aβ cannot be measured. Further, among Aβs that are bound or adsorbed to substances other than Aβ, it is not possible to measure Aβ monomers in which the recognition sites of antibodies used in immunological measurement methods are buried by the binding or adsorption. What can be measured in the first measurement step 11 is an Aβ monomer other than the above Aβ monomers. Therefore, the Aβ (42) concentration obtained in the first measurement step 11 of the present invention in which a liquid specimen is directly measured is lower than the actual total Aβ (42) concentration. This point is demonstrated in a later demonstration example.

本発明の第2の測定工程12では、第1の測定工程でAβ濃度を測定した後、同じ液性検体に対し、Aβを可溶化できる可溶化剤を添加して混合液を調製した後、その混合液について再度、同じ手法によりAβ濃度を測定する。本発明者らは、前記液性検体に可溶化剤を添加することで、Aβの測定値が大きくなることを見いだした(後の実証例を参照)。これは、可溶化剤の添加により、液性検体中に存在する、Aβ凝集体、又は、Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているAβからAβモノマーが遊離し、第1の測定工程では認識されなかったAβのC末端又はN末端を抗体が認識できるようになったと考えられる。より具体的には、Aβ凝集体、又は、Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているAβがAβモノマーにより近い状態になったと考えられる。可溶化剤を添加する前後のAβの測定値の変化は、第1の測定工程で液性検体に含まれる、Aβ凝集体、又は、Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているAβの量が多いほど大きくなると予想される。従って、本発明によれば、液性検体中のAβ凝集体、又は、Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているAβの存在量を間接的に測定することができる。   In the second measurement step 12 of the present invention, after measuring the Aβ concentration in the first measurement step, after preparing a mixed solution by adding a solubilizing agent capable of solubilizing Aβ to the same liquid sample, The Aβ concentration is again measured for the mixed solution by the same method. The present inventors have found that the measured value of Aβ is increased by adding a solubilizer to the liquid specimen (see a later demonstration example). This is because the Aβ monomer is released from the Aβ aggregates present in the liquid sample or Aβ bound to or adsorbed to substances other than Aβ by the addition of the solubilizing agent, and is recognized in the first measurement step. It is thought that the antibody became able to recognize the C-terminal or N-terminal of Aβ that was not performed. More specifically, it is considered that Aβ bound to or adsorbed to Aβ aggregates or substances other than Aβ is closer to the Aβ monomer. The change in the measured value of Aβ before and after the addition of the solubilizer is based on the amount of Aβ bound to or adsorbed to the Aβ aggregate or a substance other than Aβ contained in the liquid sample in the first measurement step. The more it is expected, the larger it will be. Therefore, according to the present invention, it is possible to indirectly measure the amount of Aβ aggregated in a liquid sample or Aβ bound to or adsorbed to a substance other than Aβ.

本発明における可溶化剤は、Aβ凝集体、又は、Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているAβからAβモノマーの遊離を引き起こす成分である。可溶化剤としては、カルボキシル基又はアルデヒド基を有する化合物から選択できる。具体的には、ギ酸が挙げられる。液性検体に添加するギ酸の濃度としては、50%以上100%以下であることが好ましく、68%以上85%以下がより好ましい。ギ酸以外に、蛋白質の可溶化剤として知られるグアニジン塩酸又は尿素、あるいは、クエン酸、リンゴ酸、ギ酸アンモニウム等が可溶化剤として使用できる。また、例えば、クルクミン等の、分子内に二重結合、三重結合、及び/又は共役結合を持つ化合物も可溶化剤として使用できる。   The solubilizer in the present invention is a component that causes the release of Aβ monomer from Aβ aggregates or Aβ bound to or adsorbed to a substance other than Aβ. The solubilizer can be selected from compounds having a carboxyl group or an aldehyde group. Specific examples include formic acid. The concentration of formic acid added to the liquid sample is preferably 50% or more and 100% or less, and more preferably 68% or more and 85% or less. In addition to formic acid, guanidine hydrochloride or urea known as protein solubilizers, citric acid, malic acid, ammonium formate, or the like can be used as solubilizers. In addition, for example, a compound having a double bond, triple bond, and / or conjugated bond in the molecule, such as curcumin, can also be used as a solubilizer.

図2は、本発明の一実施形態であるAβ測定フローにおける液性検体中の状態を説明する概念図である。第1の測定工程11で測定されるAβを「存在がマスクされていないAβ」という。第1の測定工程11において測定できるAβは、Aβモノマー21、Aβ凝集体22、及び、Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているが液相中にあるAβ23であり、容器表面や細胞表面等の固体に結合又は吸着(沈着)し、液相にないAβ24は測定できない(図2a)。また、測定できるAβであっても、Aβ凝集体22は、例えば3つのAβモノマーが凝集しているにも関らず、2つのAβモノマーの認識部位が表面に現れていない場合は、1つのAβとして測定される。Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているが液相中にあるAβ23についても同様であり、実際よりも少ないAβとして測定される可能性がある。つまり、液性検体を直接免疫学的測定法の対象とすると、正確な測定を行うことができない。従って、従来は正確性の高い早期診断判断が困難であった。   FIG. 2 is a conceptual diagram illustrating a state in a liquid sample in an Aβ measurement flow according to an embodiment of the present invention. Aβ measured in the first measurement step 11 is referred to as “Aβ whose presence is not masked”. Aβ that can be measured in the first measurement step 11 is Aβ monomer 21, Aβ aggregate 22, and Aβ23 that is bonded or adsorbed to a substance other than Aβ but is in a liquid phase, such as a container surface or a cell surface. Aβ24 that is bound or adsorbed (deposited) to a solid and not in the liquid phase cannot be measured (FIG. 2a). Further, even if Aβ is measurable, the Aβ aggregate 22 has one Aβ aggregate when, for example, three Aβ monomers are aggregated, but the recognition sites for the two Aβ monomers do not appear on the surface. Measured as Aβ. The same applies to Aβ23 that is bound or adsorbed to a substance other than Aβ but is in the liquid phase, and may be measured as Aβ that is less than the actual value. That is, if a liquid sample is directly subjected to immunological measurement, accurate measurement cannot be performed. Therefore, in the past, it was difficult to make an early diagnosis with high accuracy.

これに対して、第2の測定工程12で可溶化剤を添加すると、Aβ凝集体22、Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているが液相中にあるAβ23、及び、容器表面や細胞表面等の固体に結合又は吸着(沈着)し、液相にないAβ24からAβモノマーが遊離する(図2b)。そのため、可溶化剤の添加後においてAβ濃度を測定すると、第1の測定工程では測定されなかったAβも測定することができ、Aβ総量の濃度が得られるため、より正確な定量が可能となる。   On the other hand, when a solubilizing agent is added in the second measurement step 12, Aβ aggregate 22, Aβ23 that is bound or adsorbed to a substance other than Aβ, but is in the liquid phase, and the container surface or cell surface Aβ monomer is released from Aβ24 that is not in the liquid phase by binding or adsorbing (depositing) to a solid such as (FIG. 2b). Therefore, when the Aβ concentration is measured after the addition of the solubilizer, Aβ that has not been measured in the first measurement step can also be measured, and the concentration of the total amount of Aβ can be obtained, so that more accurate quantification is possible. .

第2の測定工程12で得られたAβ濃度から第1の測定工程11で得られたAβ濃度を差し引いた値は、「存在がマスクされたAβ」(図2c中のAβモノマー21以外のAβ)の濃度といえる。   The value obtained by subtracting the Aβ concentration obtained in the first measurement step 11 from the Aβ concentration obtained in the second measurement step 12 is “Aβ whose existence is masked” (Aβ other than the Aβ monomer 21 in FIG. 2c). ) Concentration.

本発明では、前記第1の測定工程で得られた第1の測定値と、前記第2の測定工程で得られた第2の測定値とから、両者の関係値を算出し、この関係値に基づいて、被験者内Aβ量(例えば、脳内Aβ濃度、CSF中Aβ濃度)を推定する。前記関係値としては、例えば、両測定値の差、比率が挙げられる。上述したように、両測定値の差は、液性検体中の「存在がマスクされたAβ」量を示す。また、両測定値の比率は、液性検体中の「存在がマスクされたAβ」が占める割合を示す。   In the present invention, a relationship value between the first measurement value obtained in the first measurement step and the second measurement value obtained in the second measurement step is calculated, and this relationship value is calculated. Based on the above, the amount of Aβ in the subject (for example, Aβ concentration in the brain, Aβ concentration in CSF) is estimated. Examples of the relation value include a difference between both measurement values and a ratio. As described above, the difference between the two measured values indicates the amount of “Aβ whose presence is masked” in the liquid sample. The ratio between the two measured values indicates the ratio of “Aβ whose presence is masked” in the liquid sample.

本発明では、被験者内Aβ量を推察するために、以下の新たな指標を使用することができる。第1の測定工程で得られた第1の測定値を値(A)とし、第2の測定工程で得られた第2の測定値を値(B)とする。値(B)から値(A)を差し引いた値を値(C)とする。値(A)に対する値(C)の比率(C/A)を、前記関係値とすることができる(実施例1を参照)。また、値(A)に対する値(B)の比率(B/A)を算出し、これを前記関係値としてもよい。   In the present invention, the following new index can be used to infer the amount of Aβ in the subject. The first measurement value obtained in the first measurement process is defined as a value (A), and the second measurement value obtained in the second measurement process is defined as a value (B). A value obtained by subtracting the value (A) from the value (B) is defined as a value (C). A ratio (C / A) of the value (C) to the value (A) can be set as the relation value (see Example 1). Further, the ratio (B / A) of the value (B) to the value (A) may be calculated and used as the relation value.

本発明は、別の局面において、患者の脳脊髄液や血液などの液性検体中に含まれる可溶性Aβオリゴマーの有用な測定法を提供し得る。この方法は、前記第1の測定工程と、前記第2の測定工程とを含み、前記第2の測定工程で得られた第2の測定値から、前記第1の測定工程で得られた第1の測定値を差し引いて「存在がマスクされたAβ」を求めることで、他の医療的所見に貢献することができることもある。   In another aspect, the present invention can provide a useful method for measuring soluble Aβ oligomers contained in a fluid specimen such as cerebrospinal fluid or blood of a patient. This method includes the first measurement step and the second measurement step, and the second measurement value obtained in the second measurement step is used to obtain the first measurement step obtained in the first measurement step. By subtracting the measured value of 1 to obtain “Aβ with presence masked”, it may be possible to contribute to other medical findings.

本発明の診断補助方法を実施するためのキットは、少なくとも、希釈液、可溶化剤、及び、Aβに対する免疫反応試薬から構成されている。具体的には、希釈液は、血液サンプルを希釈するための溶液で血清アルブミン等を含むリン酸緩衝液である。また、可溶化剤は、ギ酸を含む溶液である。さらに、免疫反応試薬は、免疫測定方式として選択されるものに適応した形態で、例えば、ELISA方式で測定する場合は、Aβの抗体が固定化されているマイクロタイタープレートである。   The kit for carrying out the diagnosis assisting method of the present invention comprises at least a diluent, a solubilizing agent, and an immune reaction reagent for Aβ. Specifically, the diluent is a phosphate buffer containing serum albumin or the like as a solution for diluting a blood sample. The solubilizer is a solution containing formic acid. Further, the immune reaction reagent is a microtiter plate in which an antibody of Aβ is immobilized in a form adapted to the one selected as an immunoassay system, for example, when measuring by an ELISA system.

以下の詳細な実施例は、単に例示するものであって、本開示および特許請求の範囲を決して限定するものではない。当業者が、前述の記載を使用して、本発明を最大限実行することができる。また、当業者は、適した変更を行なうことができる。   The following detailed examples are merely illustrative and do not limit the disclosure and the claims in any way. One skilled in the art can use the above description to best perform the invention. Also, those skilled in the art can make suitable changes.

本実施の形態において使用した市販の試薬は、特記しない限り製造元の説明書に従って用いられた。検出対象のAβの測定はELISA法により行った。   Commercially available reagents used in this embodiment were used according to the manufacturer's instructions unless otherwise specified. Measurement of Aβ to be detected was performed by ELISA.

(実証例)
液性サンプル中における可溶化剤の効果
図3は、実証例における測定フローを示す。
(Demonstration example)
Effect of Solubilizer in Liquid Sample FIG. 3 shows a measurement flow in the demonstration example.

1.サンプルの調製
市販のAβ(42)合成ペプチド((株)ペプチド研究所製;商品番号4349−V)をDMSO(ジメチルスルフォキサイド)に溶解して100umol/Lとした。次いで濃度10mMのリン酸緩衝液pH7.4を加えて1000倍に希釈してサンプル41を調製した。
1. Preparation of sample Commercially available Aβ (42) synthetic peptide (manufactured by Peptide Institute, Inc .; product number 4349-V) was dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) to give 100 umol / L. Next, a phosphate buffer solution pH 7.4 having a concentration of 10 mM was added and diluted 1000 times to prepare Sample 41.

サンプル41の一部を、pH8.2の1%BSAを含むTBS溶液42で希釈して、Aβの濃度が5又は10pmol/Lとなる2種類のサンプルaを調製した。   A part of the sample 41 was diluted with a TBS solution 42 containing 1% BSA having a pH of 8.2 to prepare two types of samples a having an Aβ concentration of 5 or 10 pmol / L.

一方で、サンプル41の一部を100倍量の70%ギ酸(可溶化剤)溶液43と混合し、さらに24倍量の濃度1MのTris(pH未調整)溶液により中和した。その後、1%BSAを含むTBS溶液(pH8.2)で希釈して、Aβ(42)の濃度が5又は10pmol/Lとなる2種類のサンプルbを調製した。   On the other hand, a part of the sample 41 was mixed with a 100-fold amount of a 70% formic acid (solubilizing agent) solution 43 and further neutralized with a 24-fold amount of 1 M Tris (pH unadjusted) solution. Thereafter, the sample was diluted with a TBS solution (pH 8.2) containing 1% BSA to prepare two types of samples b in which the concentration of Aβ (42) was 5 or 10 pmol / L.

2.Aβ量の測定
測定は、和光純薬(株)製の、Aβを測定するELISAの測定キット(Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、High−Sensitive;商品番号292−64501)を用い、製造元の説明書に従って行った。
2. Measurement of Aβ amount Measurement is performed using an ELISA measurement kit (Human / Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive; product number 292-64501) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Went according to.

サンプルaとサンプルbのAβ濃度を上記キットを用いて測定した。結果を(表1)に示す。   The Aβ concentrations of sample a and sample b were measured using the kit. The results are shown in (Table 1).

Figure 2011232172

(表1)中の既定値とは、サンプルaとbが示す理論上の設定濃度のことである。上述のとおり、サンプルaとbの濃度は5又は10pmol/Lに調整している。
Figure 2011232172

The default value in (Table 1) is a theoretical set concentration indicated by samples a and b. As described above, the concentrations of samples a and b are adjusted to 5 or 10 pmol / L.

(表1)から、希釈のみを行ったサンプルaでは既定値の30から38%と低い値を示すのに対して、ギ酸処理を行ったサンプルbでは既定値の96から100%と、既定値とほぼ同等の値を示していることが分かる。   (Table 1) shows that the sample a subjected to dilution only shows a low value of 30 to 38% of the default value, whereas the sample b subjected to formic acid treatment has a default value of 96 to 100% and the default value. It can be seen that the values are almost equivalent.

従って、可溶化剤を含んでいない液性サンプル(サンプルa)では、Aβの一部は測定されず、サンプルaの測定値とサンプルbの測定値を比較することにより、液性サンプル中に存在する凝集体や吸着Aβなどの「存在がマスクされたAβ」の量を推測できることが確認された。   Therefore, in the liquid sample containing no solubilizer (sample a), a part of Aβ is not measured and is present in the liquid sample by comparing the measured value of sample a with the measured value of sample b. It was confirmed that the amount of “Aβ whose presence was masked” such as aggregates to be adsorbed and adsorbed Aβ could be estimated.

(実施例1)
血清サンプルを用いた実施例
図4は、実施例1における測定フローを示す。
Example 1
Example Using Serum Sample FIG. 4 shows a measurement flow in Example 1.

1.血清サンプルの調製
月齢の異なるAPPsweマウスの21検体から血液を採取した。該21検体は異なった日に測定を行った。まず、APPsweマウスより採血を行い、採取した血液を氷上にて1−4時間インキュベートし、3,000×rpm、4度、15分間の遠心処理をした後、上澄みである血清サンプル71を採取した。
1. Preparation of serum samples Blood was collected from 21 specimens of APPswe mice of different ages. The 21 specimens were measured on different days. First, blood was collected from APPswe mice, the collected blood was incubated on ice for 1-4 hours, centrifuged at 3,000 × rpm, 4 degrees for 15 minutes, and then a serum sample 71 as a supernatant was collected. .

血清サンプルの希釈には、特に断りのない限り、Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、High−Sensitive;商品番号292−64501に添付されたスタンダード希釈液72を用いた。   For dilution of serum samples, Standard Diluent 72 attached to Human / Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive; product number 292-64501 was used unless otherwise specified.

最初に、血清サンプル71を希釈液72にて単に希釈したサンプルAを調製した。   First, sample A was prepared by simply diluting serum sample 71 with diluent 72.

一方で、血清サンプル71と95%ギ酸(可溶化剤)73を1:3の割合で、ギ酸の終濃度が71%となるように混合した。得られた混合液を、24倍量の濃度1MのTris(pH未調整)溶液により中和し、サンプルBとした。なお、サンプルA、Bとも同等の希釈率とした。本実施例1では100倍及び200倍希釈であった。   On the other hand, serum sample 71 and 95% formic acid (solubilizer) 73 were mixed at a ratio of 1: 3 so that the final concentration of formic acid was 71%. The obtained mixed solution was neutralized with 24 times volume of 1M Tris (pH unadjusted) solution to obtain Sample B. Samples A and B have the same dilution rate. In Example 1, the dilution was 100 times and 200 times.

2.サンプルA、B中のAβ量の測定
サンプルAとサンプルBのAβ濃度を、和光純薬(株)製の、Aβを測定するELISAの測定キット(Human/Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako、 High−Sensitive;商品番号292−64501)を用い、製造元の説明書に従って測定した。
2. Measurement of Aβ amount in samples A and B The Aβ concentration of sample A and sample B was measured by ELISA kit for measuring Aβ (Human / Rat βAmyloid42 ELISA Kit wako, High-Sensitive; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; The product number was measured according to the manufacturer's instructions.

12.4ヶ月齢、16.7ヶ月齢、21.7ヶ月齢のAPPsweマウス各1匹の計3検体のAβ(42)に関する測定結果について(表2)に示す。   The measurement results on Aβ (42) of a total of 3 specimens of 12.4-month-old, 16.7-month-old, and 21.7-month-old APPswe mice each are shown in (Table 2).

Figure 2011232172

(表2)より、Aβ(42)濃度は、サンプルAに比べサンプルBが1.2から2.9倍高い値を示すことが分かる。従って、血清中のAβ(42)についても、前記(表1)に示した結果と同様、サンプルAとサンプルBの測定値を比較することにより、液性サンプル中に存在する凝集体や吸着Aβなどの「存在がマスクされたAβ」の量を推測できることが確認された。
Figure 2011232172

From Table 2, it can be seen that the Aβ (42) concentration of Sample B is 1.2 to 2.9 times higher than that of Sample A. Therefore, as for the Aβ (42) in the serum, the aggregates and adsorbed Aβ present in the liquid sample can be obtained by comparing the measured values of the sample A and the sample B, similarly to the results shown in the above (Table 1). It was confirmed that the amount of “Aβ whose presence was masked” can be estimated.

3.APPマウス月齢に対する、本発明の指標の影響
前記測定により得られたサンプルAとサンプルBの測定値の比率を算出した。ここで、サンプルAの測定値が液性サンプル中で存在がマスクされていないAβ量(A)であり、サンプルBの測定値が液性サンプル中の総Aβ量(B)であり、総Aβ量(B)からAβ量(A)を差し引いた値が存在がマスクされたAβ量(C)である。次いで、存在がマスクされたAβ量(C)と存在がマスクされていないAβ量(A)との比率(C/A)を算出し、これを指標として用いた。
3. Effect of Index of the Present Invention on APP Mouse Age The ratio of the measured values of Sample A and Sample B obtained by the measurement was calculated. Here, the measured value of sample A is the Aβ amount (A) whose presence is not masked in the liquid sample, the measured value of sample B is the total Aβ amount (B) in the liquid sample, and the total Aβ A value obtained by subtracting the Aβ amount (A) from the amount (B) is the Aβ amount (C) whose existence is masked. Next, a ratio (C / A) between the Aβ amount (C) whose presence was masked and the Aβ amount (A) whose presence was not masked was calculated and used as an index.

指標である比率(C/A)を、採取したAPPsweマウスの月齢により4つのグループに分類した。   The ratio (C / A) as an index was classified into four groups according to the age of the collected APPswe mice.

月齢3から5.9ヶ月のAPPsweマウス群においては脳内でのAβ沈着はみられず、月齢6から8.9ヶ月のAPPマウス群においては、老人斑形成の核となるCored plaquesの形成がみられる。その後、月齢9から15.9ヶ月のAPPsweマウス群においては、老人斑形成初期段階となり、引き続き、月齢16から23ヶ月のAPPsweマウス群において、老人斑形成増殖期となる。非特許文献3において、APPsweマウスに関し同様の説明が記載されている。   In the group of APPswe mice aged 3 to 5.9 months, no Aβ deposition was observed in the brain, and in the groups of APP mice aged 6 to 8.9 months, the formation of cored plaques as the nucleus of senile plaque formation was observed. Be looked at. Thereafter, in the APPswe mouse group of 9 to 15.9 months of age, the senile plaque formation initial stage is reached, and subsequently, in the APPswe mouse group of 16 to 23 months of age, the senile plaque formation growth phase is reached. Non-Patent Document 3 describes the same explanation regarding the APPswe mouse.

測定の日間差を除くために比率(C/A)の標準化を行った。具体的には、まず、各実施日ごとに、グループ3の比率(C/A)の平均値を求め、同日実施した各検体の比率(C/A)を前記グループ3の比率(C/A)の平均値で割った値(D)で評価した。この結果をグラフにして図5に示す。なお、図5において、1グループは、n数が2であるので、平均値のみの記載とした。   Standardization of the ratio (C / A) was performed in order to eliminate the daily difference in measurement. Specifically, first, an average value of the ratio (C / A) of the group 3 is obtained for each implementation day, and the ratio (C / A) of each sample performed on the same day is calculated as the ratio (C / A) of the group 3. ) Was evaluated by a value (D) divided by the average value of. The result is shown as a graph in FIG. In FIG. 5, since one group has 2 n, only the average value is shown.

図6、図7及び図8は、非特許文献3から引用したグラフである。図6は、上記4グループに対する脳内のAβ(42)濃度を示すものである。また、図7は、上記4グループに対する髄液(CSF)中のAβ(42)濃度を示すものである。図6及び図7によると、グループ2からグループ3にかけて、脳内Aβ(42)量が増大し、CSF中のAβ(42)濃度が変化していることが分かる。一方、本発明の結果である図5においてもグループ2からグループ3にかけて変化が見えている。このことから、本発明で血清サンプルを用いることで、脳内Aβ濃度及びCSF中Aβ濃度を推定できることが分かる。以上より、画像診断又は髄液検査をすることなく、血液検査によって、脳内のAβ量を推定することが可能となる。   6, 7 and 8 are graphs cited from Non-Patent Document 3. FIG. FIG. 6 shows the Aβ (42) concentration in the brain for the above four groups. FIG. 7 shows the Aβ (42) concentration in the cerebrospinal fluid (CSF) for the above four groups. 6 and 7, it can be seen that the amount of Aβ (42) in the brain increases and the Aβ (42) concentration in the CSF changes from group 2 to group 3. On the other hand, also in FIG. 5 which is a result of the present invention, a change is seen from the group 2 to the group 3. From this, it can be seen that the brain Aβ concentration and the CSF Aβ concentration can be estimated by using a serum sample in the present invention. As described above, the amount of Aβ in the brain can be estimated by blood test without performing image diagnosis or cerebrospinal fluid test.

また、図8の血漿の結果をみると、グループ3からグループ4にかけてAβ濃度変化が見えるのに対して、本発明の結果である図5ではグループ2からグループ3にかけて変化が見えている。このことにより、同じ血液サンプルを測定する場合でも、指標(C/A)を用いることにより、より鋭敏に脳内Aβ濃度及びCSF中のAβ濃度を推定することができる。   In addition, in the plasma results of FIG. 8, changes in Aβ concentration are seen from group 3 to group 4, whereas in FIG. 5 which is the result of the present invention, changes are seen from group 2 to group 3. Thus, even when the same blood sample is measured, the Aβ concentration in the brain and the Aβ concentration in the CSF can be estimated more sensitively by using the index (C / A).

従って、グループ2からグループ3にかけての変化が、指標(C/A)で推定することができる。よって、本発明は、アルツハイマー病等の、Aβに関連する病的状態の早期診断、治療効果のモニター、又は、スクリーニングにおいて有用な判断材料を提供することができる。   Therefore, the change from group 2 to group 3 can be estimated by the index (C / A). Therefore, the present invention can provide a useful judgment material in early diagnosis of a pathological condition related to Aβ such as Alzheimer's disease, monitoring of therapeutic effect, or screening.

以上の実施例1で説明したように本発明を用いると、従来の血液検査で用いていた指標と比較して、より早期において、信頼性の高い診断判定を極めて簡便に行うことができる。   As described in Example 1 above, when the present invention is used, a highly reliable diagnosis determination can be performed very easily at an earlier stage than the index used in the conventional blood test.

本発明は、ヒト患者において、アルツハイマー病等の、Aβに関連する病的状態の早期診断、治療効果のモニター、又は、スクリーニングにおいて有用な判断材料を提供することができる。本実施例1では、血液検体を液性サンプルとして用いたが、その他の体液や生体組織の懸濁液を用いることもできる。これにより、ヒト患者への負担を最小限に抑え、しかも低リスクで被験者内Aβ量を判定することができる。   INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can provide a useful judgment material in early diagnosis, monitoring of therapeutic effect, or screening of Aβ-related pathological conditions such as Alzheimer's disease in human patients. In the first embodiment, a blood sample is used as a liquid sample, but other body fluids and suspensions of biological tissues can also be used. This makes it possible to determine the amount of Aβ in the subject with a low risk while minimizing the burden on the human patient.

本発明の方法は、アミロイド形成のほか、複合体形成の程度を知ることが必要な疾患の診断又はモニターを補助するための方法として応用可能である。   The method of the present invention can be applied as a method for assisting diagnosis or monitoring of diseases in which it is necessary to know the degree of complex formation in addition to amyloid formation.

Aβに関連する病的状態を診断するにあたっては、本発明の方法により得られた結果を他の臨床的徴候と合わせて考慮することができる。従って、本発明は、PETやMRIといったリスクを伴う診断を行う前のスクリーニングとして有用である。   In diagnosing a pathological condition associated with Aβ, the results obtained by the method of the present invention can be considered in conjunction with other clinical signs. Therefore, the present invention is useful as a screening before making a risky diagnosis such as PET or MRI.

本発明のAβに関連する病的状態の診断を補助する方法は、血液などの体液又は鼻粘膜若しくは細胞などの生体組織のサンプルを使用して低リスクかつ高精度の、Aβに関連する病的状態の診断を行うことを可能とし、Aβに関連する病的状態の早期診断、治療効果のモニター、又は、スクリーニングを行う際に有用な情報を提供し得る。   The method for assisting diagnosis of Aβ-related morbidity of the present invention is a low-risk and high-precision Aβ-related morbidity using a body fluid such as blood or a sample of a biological tissue such as nasal mucosa or cells. It is possible to make a diagnosis of a condition and provide information useful for early diagnosis of pathological conditions related to Aβ, monitoring of therapeutic effects, or screening.

11 第1の測定工程
12 第2の測定工程
21 Aβモノマー
22 Aβ凝集体
23 Aβ以外の物質と結合若しくは吸着しているが液相中にあるAβ
24 容器表面や細胞表面等の固体に結合又は吸着(沈着)し、液相にないAβ
25 可溶化されたAβモノマー
41 市販Aβペプチド
42 1%BSA・TBSpH8.2
43 70%ギ酸
71 血清
72 希釈
73 95%ギ酸
11 First Measurement Step 12 Second Measurement Step 21 Aβ Monomer 22 Aβ Aggregate 23 Aβ that is bound or adsorbed to a substance other than Aβ but is in the liquid phase
24 Aβ that is bound or adsorbed (deposited) on a solid such as a container surface or cell surface and is not in a liquid phase
25 Solubilized Aβ monomer 41 Commercial Aβ peptide 42 1% BSA · TBS pH 8.2
43 70% formic acid 71 Serum 72 Dilution 73 95% Formic acid

Claims (7)

被験者から採取された液性検体においてβアミロイド(以下Aβという)の量を測定して、第1のAβ測定値を得る第1の測定工程と、
前記液性検体と可溶化剤を混合して混合液を調製した後、当該混合液においてAβの量を測定して、第2のAβ測定値を得る第2の測定工程と、
前記第1のAβ測定値と前記第2のAβ測定値との関係値を算出する算出工程と、
前記関係値に基づき、前記被験者中Aβ量を推定する推定工程と、
を包含する、Aβに関連する病的状態の診断を補助する方法。
A first measurement step of measuring the amount of β amyloid (hereinafter referred to as Aβ) in a liquid sample collected from a subject to obtain a first Aβ measurement value;
A second measurement step of obtaining a second measured value of Aβ by measuring the amount of Aβ in the mixed solution after preparing the mixed solution by mixing the liquid specimen and the solubilizer;
A calculation step of calculating a relation value between the first Aβ measurement value and the second Aβ measurement value;
An estimation step of estimating the amount of Aβ in the subject based on the relationship value;
A method for assisting in the diagnosis of a pathological condition associated with Aβ.
前記算出工程が、
前記第1のAβ測定値と前記第2のAβ測定値との差を、前記関係値として求める算出工程からなる、請求項1に記載のAβに関連する病的状態の診断を補助する方法。
The calculating step includes
The method for assisting diagnosis of a pathological condition related to Aβ according to claim 1, comprising a calculation step of obtaining a difference between the first Aβ measurement value and the second Aβ measurement value as the relation value.
前記算出工程が、
前記第1のAβ測定値と前記第2のAβ測定値との差を、第1の算出値として求める第1の算出工程と、
前記第1のAβ測定値に対する前記第1の算出値の比率を、前記関係値として求める第2の算出工程と、からなる、請求項1に記載のAβに関連する病的状態の診断を補助する方法。
The calculating step includes
A first calculation step of obtaining a difference between the first Aβ measurement value and the second Aβ measurement value as a first calculation value;
The second calculation step of obtaining a ratio of the first calculated value to the first Aβ measured value as the relation value assists diagnosis of a pathological condition related to Aβ according to claim 1. how to.
前記可溶化剤がギ酸である、請求項1〜3のいずれかに記載のAβに関連する病的状態の診断を補助する方法。   The method for assisting diagnosis of a pathological condition associated with Aβ according to any one of claims 1 to 3, wherein the solubilizer is formic acid. 前記液性検体は、血液、脳脊髄液(CSF)、鼻粘液、及び、尿からなる群より選択される1種である、請求項1〜4のいずれかに記載のAβに関連する病的状態の診断を補助する方法。   The pathological condition related to Aβ according to any one of claims 1 to 4, wherein the liquid sample is one selected from the group consisting of blood, cerebrospinal fluid (CSF), nasal mucus, and urine. A method to help diagnose the condition. 前記液性検体は、生体組織の懸濁液である、請求項1〜4のいずれかに記載のAβに関連する病的状態の診断を補助する方法。   The method for assisting diagnosis of a pathological condition related to Aβ according to any one of claims 1 to 4, wherein the liquid specimen is a suspension of biological tissue. 前記第1の測定工程及び前記第2の測定工程において測定される前記Aβは、42個のアミノ酸残基からなるAβ、及びそのアミノ基末端が切断又は修飾されたAβである、請求項1〜6のいずれかに記載のAβに関連する病的状態の診断を補助する方法。   The Aβ measured in the first measurement step and the second measurement step is Aβ consisting of 42 amino acid residues, and Aβ whose amino terminal is cleaved or modified. 7. A method for assisting diagnosis of a pathological condition associated with Aβ according to any one of 6.
JP2010102682A 2010-04-27 2010-04-27 Method for assisting diagnosis of pathological condition related to β-amyloid Active JP5747444B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010102682A JP5747444B2 (en) 2010-04-27 2010-04-27 Method for assisting diagnosis of pathological condition related to β-amyloid

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010102682A JP5747444B2 (en) 2010-04-27 2010-04-27 Method for assisting diagnosis of pathological condition related to β-amyloid

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2011232172A true JP2011232172A (en) 2011-11-17
JP2011232172A5 JP2011232172A5 (en) 2013-07-04
JP5747444B2 JP5747444B2 (en) 2015-07-15

Family

ID=45321628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010102682A Active JP5747444B2 (en) 2010-04-27 2010-04-27 Method for assisting diagnosis of pathological condition related to β-amyloid

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP5747444B2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015511014A (en) * 2012-03-13 2015-04-13 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー Oligomeric Aβ in the diagnosis, prognosis and monitoring of Alzheimer's disease

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003519357A (en) * 1998-02-20 2003-06-17 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア Analysis of specific strains of proteins with multiple disease-related conformations
JP2004157124A (en) * 2002-11-06 2004-06-03 F Hoffmann La Roche Ag Quantitative determination method for amyloid
JP2008519988A (en) * 2004-11-12 2008-06-12 ファイザー・インク Method for measuring amyloid-beta peptide
WO2009134942A1 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Novartis Ag. Assay for pathogenic conformers

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003519357A (en) * 1998-02-20 2003-06-17 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア Analysis of specific strains of proteins with multiple disease-related conformations
JP2004157124A (en) * 2002-11-06 2004-06-03 F Hoffmann La Roche Ag Quantitative determination method for amyloid
JP2008519988A (en) * 2004-11-12 2008-06-12 ファイザー・インク Method for measuring amyloid-beta peptide
WO2009134942A1 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Novartis Ag. Assay for pathogenic conformers

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015511014A (en) * 2012-03-13 2015-04-13 ヤンセン アルツハイマー イミュノセラピー Oligomeric Aβ in the diagnosis, prognosis and monitoring of Alzheimer's disease

Also Published As

Publication number Publication date
JP5747444B2 (en) 2015-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021201434B2 (en) Surrogate biomarker for evaluating intracerebral amyloid beta peptide accumulation and method for analysis thereof
KR101939964B1 (en) Methods, devices and kits for detecting or monitoring acute kidney injury
JP2014506244A5 (en)
JP2015511014A (en) Oligomeric Aβ in the diagnosis, prognosis and monitoring of Alzheimer's disease
JP2015514206A (en) Method and kit for detection of anti-beta amyloid antibody
EP3014279A2 (en) Method for determining protein aggregates using surface-fida
BR112012014060B1 (en) method for diagnosing alzheimer's disease in a subject, for detecting mild cognitive impairment or for differentiating alzheimer's disease from mild cognitive impairment
KR101804624B1 (en) Composition for diagnosing neurological disease using nasal mucus
JP2013512440A (en) Amyloid beta aggregates in cerebrospinal fluid as a biomarker for Alzheimer's disease
WO2011092796A1 (en) Amyloid β measurement method
JP2008547002A (en) Methods for diagnosing and treating cerebrovascular events based on NR2 peptides
JP5747444B2 (en) Method for assisting diagnosis of pathological condition related to β-amyloid
RU2019144031A (en) METHOD FOR DIAGNOSING OR MONITORING KIDNEY FUNCTION OR DIAGNOSING KIDNEY DYSFUNCTION
US20190376984A1 (en) Methods for quantifying soluble amyloid beta and amyloid beta oligomers
EP3242134A1 (en) Assay for the diagnosis of a neurological disease
TW202217316A (en) Blood-based assay for detecting tauopathy or amyloidogenic disease
JP6405549B2 (en) Acute coronary syndrome marker and its use
WO2024101329A1 (en) Method for pretreating specimen
JP6093943B2 (en) Acute coronary syndrome marker and its use
WO2012032766A1 (en) Method for diagnosing alzheimer's disease using blood-soluble gpvi
WO2023242336A1 (en) Blood-based screening of subjects for a clinical trial for treatment of tauopathy or amyloidogenic disease
WO2023220276A1 (en) METHODS TO DETECT Aβ PROTEOFORMS AND USE THEREOF
CN117007819A (en) Kit for auxiliary diagnosis of Alzheimer's disease
JP2024513401A (en) Profile of CSF phosphorylated tau and amyloid beta as biomarkers of tauopathy
WO2014007367A1 (en) Method for detecting or assaying two kinds of substances in same sample

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130423

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20130423

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20130423

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20131119

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20131120

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20131217

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20140312

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20140312

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140715

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140820

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150120

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150311

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20150331

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20150427

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5747444

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250