JP2011231085A - Cyclic peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、環状ペプチドに関する。より詳細には本発明は、ヘリックス・ループ・へリックスで構成される立体構造を有し、顆粒球コロニー刺激因子受容体に結合する環状ペプチドに関する。 The present invention relates to cyclic peptides. More specifically, the present invention relates to a cyclic peptide that has a three-dimensional structure composed of a helix loop helix and binds to a granulocyte colony stimulating factor receptor.
関節リウマチは、関節炎を主な臨床症状とする全身性の炎症性自己免疫疾患である。関節リウマチの発症にはIL-6やTNF-αなどが関与することが知られているが、顆粒球コロニー刺激因子（以下、「G-CSF」ともいう）も関与することが近年報告されている（非特許文献１）。 Rheumatoid arthritis is a systemic inflammatory autoimmune disease with arthritis as the main clinical symptom. It is known that IL-6 and TNF-α are involved in the development of rheumatoid arthritis, but it has recently been reported that granulocyte colony-stimulating factor (hereinafter also referred to as “G-CSF”) is also involved. (Non-Patent Document 1).
G-CSFは、骨髄好中球前駆細胞の分化および増殖の制御に関与するサイトカインの一種である。また、G-CSFは医薬分野において、癌の化学療法の副作用により生じる顆粒球減少症や再生不良性貧血の治療薬として使用されている。
G-CSFと関節リウマチとの関連が明らかになった後、G-CSFのアンタゴニストが、関節リウマチを含む炎症性自己免疫疾患の治療に有用であることが報告されている（非特許文献２）。
G-CSF is a type of cytokine involved in the regulation of bone marrow neutrophil progenitor cell differentiation and proliferation. G-CSF is used in the pharmaceutical field as a therapeutic agent for granulocytopenia and aplastic anemia caused by side effects of cancer chemotherapy.
After the relationship between G-CSF and rheumatoid arthritis has been clarified, it has been reported that antagonists of G-CSF are useful for the treatment of inflammatory autoimmune diseases including rheumatoid arthritis (Non-patent Document 2). .
現在、関節リウマチの治療には化学療法剤に加えて、IL-6およびTNF-αの中和抗体のような抗体医薬も用いられているが、上記の文献の知見から、G-CSFの中和抗体も関節リウマチの治療に有効であると考えられている。 Currently, in addition to chemotherapeutic agents, antibody drugs such as IL-6 and TNF-α neutralizing antibodies are used for the treatment of rheumatoid arthritis. Japanese antibodies are also considered effective in the treatment of rheumatoid arthritis.
しかしながら、抗体を医薬として用いる場合にはさまざまな問題が存在する。例えば、抗体は分子量が非常に大きく、複雑な高次構造を有するタンパク質であるので、化学合成は不可能である。また、抗体の製造には動物から得た細胞を用いることが必須であるので、得られた抗体を医薬品として使用可能とするためにはコストが高くなる。 However, various problems exist when antibodies are used as pharmaceuticals. For example, since an antibody is a protein having a very large molecular weight and a complex higher order structure, chemical synthesis is impossible. Moreover, since it is essential to use cells obtained from animals for the production of antibodies, it is expensive to make the obtained antibodies usable as pharmaceuticals.
近年、サイトカインなどのシグナル伝達を調節し得る、抗体に代わる分子として、特定の立体構造を有するペプチドが注目されている。そのようなペプチドは、サイトカインなどの受容体に直接結合してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する。
本発明者も、ヘリックス・ループ・へリックス構造を有し、G-CSF受容体に結合できるペプチドをこれまでに見出している（特許文献１参照）。
In recent years, a peptide having a specific three-dimensional structure has attracted attention as a molecule replacing an antibody that can regulate signal transduction such as cytokines. Such peptides bind directly to receptors such as cytokines and act as agonists or antagonists.
The present inventor has also found a peptide having a helix loop helix structure and capable of binding to a G-CSF receptor (see Patent Document 1).
しかしながら、特許文献１に開示されるペプチドは、いずれもG-CSF受容体に結合できるが、該受容体に対する親和性および血清中での安定性について十分に満足できるものではなかった。
したがって、これらのペプチドを用いて生体内のG-CSFシグナル伝達を調節するためには、１回当たりの投与量を多くするか、または複数回の投与が必要となる。
However, although all of the peptides disclosed in Patent Document 1 can bind to the G-CSF receptor, the affinity for the receptor and the stability in serum were not fully satisfactory.
Therefore, in order to regulate in vivo G-CSF signal transduction using these peptides, it is necessary to increase the dose per administration or to administer multiple doses.
そこで本発明者は、G-CSF受容体に対する親和性および血清中での安定性が向上したG-CSF受容体に結合可能なペプチドを提供することを目的とした。 Accordingly, the present inventor aimed to provide a peptide capable of binding to the G-CSF receptor having improved affinity for G-CSF receptor and stability in serum.
本発明者は上記のペプチドを環化させることによって、G-CSF受容体に対する高い親和性およびペプチド分子としては驚異的な安定性を有する環状ペプチドが得られることを予期せぬことに見出して、本発明を完成するに至った。 The present inventors have unexpectedly found that by cyclizing the above peptide, a cyclic peptide having high affinity for the G-CSF receptor and tremendous stability as a peptide molecule can be obtained. The present invention has been completed.
すなわち、本発明によれば、
式：X1AAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYX2（配列番号１）
（式中、
X1は天然アミノ酸残基、またはα-アミノ基がアセチル化したグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、トリプトファンおよびスレオニンからなる群より１つ選択されるN-アセチル化アミノ酸残基であり、
ただし、
X1が天然アミノ酸残基である場合、X2も天然アミノ酸残基であり、
X1がN-アセチル化アミノ酸残基である場合、X2はシステイン残基である）
で表されるアミノ酸配列からなり、X1残基およびX2残基の官能基間に分子内結合を形成した環状ペプチドが提供される。
That is, according to the present invention,
Formula: X 1 AAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYX 2 (SEQ ID NO: 1)
(Where
X 1 is a natural amino acid residue, or an N-acetylated amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, serine, tryptophan and threonine with an α-amino group acetylated Residue,
However,
When X 1 is a natural amino acid residue, X 2 is also a natural amino acid residue,
When X 1 is an N-acetylated amino acid residue, X 2 is a cysteine residue)
A cyclic peptide having an intramolecular bond formed between the functional groups of the X 1 residue and the X 2 residue is provided.
本発明の環状ペプチドはG-CSF受容体に結合して、G-CSFのシグナル伝達を阻害できる。また、本発明の環状ペプチドは、非環状ペプチドよりも高いG-CSF受容体への親和性を有し、かつ血清中で長期間安定であるので、より低い濃度およびより少ない投与回数で生体内のG-CSFのシグナル伝達を阻害できる。
したがって、本発明の環状ペプチドは、関節リウマチなどを含むG-CSFが関与すると考えられている疾患を予防もしくは治療するための薬剤、またはG-CSFシグナル伝達系の研究用試薬として有用である。
The cyclic peptides of the present invention can bind to the G-CSF receptor and inhibit G-CSF signaling. In addition, the cyclic peptide of the present invention has a higher affinity for the G-CSF receptor than the non-cyclic peptide and is stable in serum for a long period of time, so that it can be administered in vivo at a lower concentration and a lower number of administrations. Can inhibit G-CSF signaling.
Therefore, the cyclic peptide of the present invention is useful as an agent for preventing or treating a disease thought to involve G-CSF including rheumatoid arthritis and the like, or a reagent for research of G-CSF signal transduction system.
本明細書においては、各種アミノ酸残基を常法に従って一文字表記で記載する。すなわち、Aはアラニン、Eはグルタミン酸、Lはロイシン、Gはグリシン、Kはリジン、Mはメチオニン、Rはアルギニン、Yはチロシン、Cはシステインを表す。
また、本明細書においては、ペプチドのアミノ酸配列を常法に従って、N末端からC末端方向へ左から右に記載する。
In the present specification, various amino acid residues are described in a single letter according to a conventional method. That is, A represents alanine, E represents glutamic acid, L represents leucine, G represents glycine, K represents lysine, M represents methionine, R represents arginine, Y represents tyrosine, and C represents cysteine.
Moreover, in this specification, the amino acid sequence of a peptide is described from the N terminal to the C terminal from the left to the right according to a conventional method.
本明細書において、「天然アミノ酸」とは、天然に存在するタンパク質中に通常見出される未修飾のL-アミノ酸を意味する。
また、本明細書において、「N末端」および「N末端側」とは便宜上それぞれ、各配列番号で表されるアミノ酸配列の最も左に示されるアミノ酸残基および左側に示されるアミノ酸配列を意味する。同様に「C末端」および「C末端側」とは、それぞれ各配列番号で表されるアミノ酸配列の最も右に示されるアミノ酸残基および右側に示されるアミノ酸配列を意味する。
As used herein, “natural amino acid” means an unmodified L-amino acid normally found in naturally occurring proteins.
In the present specification, “N-terminal” and “N-terminal” mean, for convenience, the amino acid residue shown on the left side and the amino acid sequence shown on the left side of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. . Similarly, “C-terminal” and “C-terminal side” mean the amino acid residue shown on the right side and the amino acid sequence shown on the right side of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO.
本発明の環状ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有することにより、ヘリックス・ループ・ヘリックスで構成される立体構造を形成する（図１参照）。ここで、ヘリックス・ループ・ヘリックスで構成される立体構造とは、N末端側およびC末端側の２つのαヘリックス構造が、複数のアミノ酸からなるループで連結されている高次構造を意味する。
本発明の環状ペプチドにおいては、N末端側およびC末端側の各ヘリックスに存在するロイシン残基によってロイシンジッパーが形成されるので、ループにより連結された２つのヘリックスが平行に並んだ状態でペプチドの立体構造が安定化する。この立体構造の安定化には、N末端側のヘリックスに存在するグルタミン酸残基とC末端側のヘリックスに存在するリジン残基との間の静電的相互作用も関与している。
The cyclic peptide of the present invention has a three-dimensional structure composed of a helix, a loop, and a helix by having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (see FIG. 1). Here, the three-dimensional structure composed of a helix, a loop, and a helix means a higher order structure in which two α-helix structures on the N-terminal side and the C-terminal side are connected by a loop composed of a plurality of amino acids.
In the cyclic peptide of the present invention, the leucine zipper is formed by the leucine residues present in the N-terminal and C-terminal helices, so that the two helices linked by the loop are aligned in parallel. The three-dimensional structure is stabilized. The stabilization of this three-dimensional structure also involves electrostatic interaction between glutamic acid residues present in the N-terminal helix and lysine residues present in the C-terminal helix.
本発明の環状ペプチドは、N末端およびC末端のアミノ酸残基の官能基間に分子内結合を形成することによって環状となっている。そのような分子内結合は共有結合であれば特に限定されず、例えばジスルフィド結合、チオエーテル結合、ペプチド結合、エーテル結合、エステル結合などが挙げられる。
好ましくは、本発明の環状ペプチドは、
N末端のアミノ酸残基が、α-アミノ基がアセチル化したグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、トリプトファンおよびスレオニンからなる群より１つ選択されるN-アセチル化アミノ酸残基であり、且つC末端のアミノ酸残基がシステイン残基である場合はチオエーテル結合により、
N末端およびC末端のアミノ酸残基がどちらもシステイン残基である場合はジスルフィド結合により、
N末端およびC末端のアミノ酸残基がどちらも天然アミノ酸残基である場合はペプチド結合により、環状となっている。
The cyclic peptide of the present invention is cyclic by forming an intramolecular bond between functional groups of N-terminal and C-terminal amino acid residues. Such an intramolecular bond is not particularly limited as long as it is a covalent bond, and examples thereof include a disulfide bond, a thioether bond, a peptide bond, an ether bond, and an ester bond.
Preferably, the cyclic peptide of the present invention is
N-acetylated amino acid residue selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, serine, tryptophan and threonine, wherein the N-terminal amino acid residue is an acetylated α-amino group Group and when the C-terminal amino acid residue is a cysteine residue,
When both the N-terminal and C-terminal amino acid residues are cysteine residues,
When both the N-terminal and C-terminal amino acid residues are natural amino acid residues, they are cyclic due to peptide bonds.
したがって、本発明の環状ペプチドとしては、以下の環状ペプチドが好ましい：
アミノ酸配列が、
XAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC（配列番号２）
（XはN-アセチルグリシン残基を示す）
であり、N-アセチルグリシン残基のアセチル基とシステイン残基のチオール基との間にチオエーテル結合を形成した環状ペプチド、
アミノ酸配列が、
CAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC（配列番号３）
であり、システイン残基のチオール基間にジスルフィド結合を形成した環状ペプチド、および
アミノ酸配列が、
X3AAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYX4（配列番号４）
（X3およびX4は天然アミノ酸残基である）
であり、X3残基のアミノ基とX4残基のカルボキシル基との間にペプチド結合を形成した環状ペプチド。
Accordingly, the following cyclic peptides are preferred as the cyclic peptide of the present invention:
The amino acid sequence is
XAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC (SEQ ID NO: 2)
(X represents an N-acetylglycine residue)
A cyclic peptide in which a thioether bond is formed between the acetyl group of the N-acetylglycine residue and the thiol group of the cysteine residue,
The amino acid sequence is
CAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC (SEQ ID NO: 3)
A cyclic peptide in which a disulfide bond is formed between thiol groups of cysteine residues, and an amino acid sequence,
X 3 AAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYX 4 (SEQ ID NO: 4)
(X 3 and X 4 are natural amino acid residues)
, And the formed cyclic peptides a peptide bond between the carboxyl group of the amino group and X 4 residue of X 3 residues.
より好ましくは、本発明の環状ペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなり、N-アセチルグリシン残基のアセチル基とシステイン残基のチオール基との間にチオエーテル結合を形成した環状ペプチドである。 More preferably, the cyclic peptide of the present invention has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and has a thioether bond formed between the acetyl group of the N-acetylglycine residue and the thiol group of the cysteine residue. It is.
本発明の環状ペプチドは、当該技術においてそれ自体公知のペプチド合成方法により非環状ペプチドを得た後、これを環化させることにより製造できる。
非環状ペプチドの合成方法としては、例えばFmoc法のような固相合成法、フラグメント縮合法のような液相合成法などが挙げられるが、操作が簡便である点から固相合成法が好ましい。なお、固相合成法については、R.B. Merrifieldの文献（J. Am. Chem. Soc., vol.85, p.2149-2154 (1963)）に記載の技術を用いることができる。
The cyclic peptide of the present invention can be produced by obtaining an acyclic peptide by a peptide synthesis method known per se in the art and then cyclizing it.
Examples of the synthesis method of the acyclic peptide include a solid phase synthesis method such as the Fmoc method and a liquid phase synthesis method such as the fragment condensation method, but the solid phase synthesis method is preferable from the viewpoint of simple operation. In addition, about the solid-phase synthesis method, the technique as described in the literature of RB Merrifield (J. Am. Chem. Soc., Vol. 85, p.2149-2154 (1963)) can be used.
Fmoc法による固相合成法は、次のようにして行われる。まず、合成しようとするペプチドのC末端に該当するアミノ酸の９-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）誘導体（第１のFmoc-アミノ酸）を、Rinkアミドレジンのアミノ基に連結する。次いで、Fmoc基を除去した後、該レジン上のアミノ酸の遊離したアミノ基に第２のFmoc-アミノ酸を連結する。この操作を繰り返して、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを合成した後、全保護基を除くとともに該ペプチドをレジンから切り離す。このペプチド合成法は、市販の自動合成機を用いて行うこともできる。 The solid phase synthesis method by the Fmoc method is performed as follows. First, the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) derivative (first Fmoc-amino acid) of the amino acid corresponding to the C-terminus of the peptide to be synthesized is linked to the amino group of Rink amide resin. Next, after removing the Fmoc group, a second Fmoc-amino acid is linked to the free amino group of the amino acid on the resin. This operation is repeated to synthesize a peptide having a desired amino acid sequence, and then remove all protecting groups and cleave the peptide from the resin. This peptide synthesis method can also be performed using a commercially available automatic synthesizer.
非環状ペプチドは、上記の化学合成の他に遺伝子工学的技術を用いることによっても得ることができる。例えば、上記のアミノ酸配列をコードする核酸を適切な発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターにより適切な宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌を形質転換する。そして、該宿主細胞をペプチドの発現に適する条件下で培養することにより、培養物からペプチドを得ることができる。 Acyclic peptides can be obtained by using genetic engineering techniques in addition to the chemical synthesis described above. For example, a nucleic acid encoding the above amino acid sequence is incorporated into an appropriate expression vector, and an appropriate host cell such as a mammalian cell, an insect cell, or E. coli is transformed with the obtained expression vector. The peptide can be obtained from the culture by culturing the host cell under conditions suitable for the expression of the peptide.
得られた非環状ペプチドを環化させる方法は、当該技術において公知である。そのような方法としては、例えばN末端側およびC末端側のシステイン残基のチオール基どうしを反応させてジスルフィド結合を形成させる方法、N末端のアミノ基とC末端のカルボキシル基とを反応させてペプチド結合を形成させる方法などが挙げられる。
また、ペプチドのN末端が、例えばN-クロロアセチルグリシンのようなハロゲン化アセチル基でα-アミノ基が修飾されたアミノ酸残基である場合は、該残基のハロゲン化アセチル基とC末端側のシステイン残基のチオール基とを反応させてチオエーテル結合を形成させることにより環化させる方法も挙げられる。
Methods for cyclizing the resulting acyclic peptide are known in the art. Examples of such a method include a method in which thiol groups of cysteine residues on the N-terminal side and C-terminal side are reacted with each other to form a disulfide bond, and an amino group at the N-terminal is reacted with a carboxyl group at the C-terminal. Examples thereof include a method for forming a peptide bond.
In addition, when the N-terminus of the peptide is an amino acid residue in which the α-amino group is modified with a halogenated acetyl group such as N-chloroacetylglycine, the halogenated acetyl group and the C-terminal side of the residue There is also a method of cyclization by reacting with a thiol group of a cysteine residue to form a thioether bond.
ペプチド結合によりペプチドを環化させる方法としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどを用いる脱水縮合反応、対称酸無水物法、活性エステル法などが挙げられる。ジスルフィド結合によりペプチドを環化させる方法としては、例えば空気酸化法、フェリシアン化カリウムを用いる酸化法が挙げられる。
また、N末端のハロゲン化アセチル基でα-アミノ基が修飾されたアミノ酸残基とシステイン残基との間のチオエーテル結合形成によるペプチドの環化は、例えば該ペプチドを塩基性の緩衝液中で反応させることにより行うことができる。
Examples of the method for cyclizing a peptide by peptide bond include dehydration condensation reaction using dicyclohexylcarbodiimide, a symmetric acid anhydride method, an active ester method, and the like. Examples of the method for cyclizing a peptide by a disulfide bond include an air oxidation method and an oxidation method using potassium ferricyanide.
In addition, cyclization of a peptide by forming a thioether bond between an amino acid residue whose α-amino group is modified with an N-terminal halogenated acetyl group and a cysteine residue, for example, the peptide in a basic buffer solution. It can be performed by reacting.
上記の環化反応では、反応条件によっては環状ペプチド以外に、複数の非環状ペプチドが分子間結合により連結したオリゴマーが形成される場合がある。したがって、環状ペプチドのみを得るために、環化反応後のペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィーなどにより精製することが好ましい。 In the above cyclization reaction, an oligomer in which a plurality of non-cyclic peptides are linked by intermolecular bonds may be formed in addition to the cyclic peptide depending on the reaction conditions. Therefore, in order to obtain only the cyclic peptide, it is preferable to purify the peptide after the cyclization reaction by reverse phase high performance liquid chromatography or the like.
上記のとおり、本発明の環状ペプチドはG-CSF受容体に結合してG-CSFのシグナル伝達を阻害できるので、本発明の環状ペプチドは、関節リウマチを含むG-CSFが関与すると考えられている疾患の予防もしくは治療のための薬剤、またはG-CSFシグナル伝達系の研究用試薬として利用可能である。
本発明の環状ペプチドをそのような薬剤または試薬として用いる場合は、例えば本発明の環状ペプチドを水、生理食塩水または適切な緩衝液に溶解して適切な濃度の溶液とすることにより、ヒトを含む哺乳動物に投与または生細胞を培養している培地に添加すればよい。
As described above, since the cyclic peptide of the present invention can bind to the G-CSF receptor and inhibit G-CSF signaling, the cyclic peptide of the present invention is considered to involve G-CSF including rheumatoid arthritis. It can be used as a drug for the prevention or treatment of certain diseases, or as a reagent for studying the G-CSF signal transduction system.
When the cyclic peptide of the present invention is used as such a drug or reagent, for example, the cyclic peptide of the present invention is dissolved in water, physiological saline or an appropriate buffer to obtain a solution having an appropriate concentration. What is necessary is just to add to the culture medium which administers to the containing mammal or culture | cultivates a living cell.
また、本発明の環状ペプチドはG-CSF受容体に対して高い親和性を有するので、該受容体を発現している細胞を検出するための試薬としても利用可能である。そのような検出用試薬として本発明の環状ペプチドを用いる場合、該ペプチドを、酵素、色素、蛍光物質、放射性同位元素などの当該技術において公知の標識物質で標識してもよい。
G-CSF受容体発現細胞の検出は、標識された本発明の環状ペプチドと該細胞が含まれる疑いのある試料とを混合した後、該ペプチドと結合した細胞を標識に由来するシグナルに基づいて検出することにより行うことができる。
Further, since the cyclic peptide of the present invention has high affinity for the G-CSF receptor, it can be used as a reagent for detecting cells expressing the receptor. When the cyclic peptide of the present invention is used as such a detection reagent, the peptide may be labeled with a labeling substance known in the art such as an enzyme, a dye, a fluorescent substance, or a radioisotope.
G-CSF receptor-expressing cells can be detected based on a signal derived from the label after mixing the labeled cyclic peptide of the present invention with a sample suspected of containing the cells. This can be done by detecting.
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Ｉ 本発明の環状ペプチドの製造
（１）非環状ペプチドの合成
配列番号５〜７で表される各アミノ酸配列からなる非環状ペプチドを、ペプチド合成機（Model 433A Peptide Synthesizer；Applied Biosystems社製）を用いて、FastMoc法により0.1 mmolスケールで合成した。なお、操作の詳細な手順については、該合成機に付属のマニュアルの記載に従った。
I Production of Cyclic Peptide of the Present Invention (1) Synthesis of Acyclic Peptide A non-cyclic peptide consisting of each amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 5 to 7 is prepared using a peptide synthesizer (Model 433A Peptide Synthesizer; manufactured by Applied Biosystems) And synthesized on a 0.1 mmol scale by the FastMoc method. The detailed procedure of the operation was as described in the manual attached to the synthesizer.
該合成機に、Fmocアミドレジン（Applied Biosystems社）240 mgおよび各種のFmoc-アミノ酸（nova biochem社）0.5 mmolをセットして、ペプチドを合成させた。合成後、レジンをジエチルエーテルで洗浄した。レジンをカラムろ過により回収した後、真空乾燥した。乾燥したレジンをチューブに移し、クリベージ溶液（93％トリフルオロ酢酸（TFA）と７％ 1, 2-エタンジチオール：アニソール：エチレンジアミン四酢酸＝１：３：３（v/v）との混合液）10 mlを加えて攪拌して、３〜４時間反応させた。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、フロースルー（ペプチド溶液）を別のチューブに移した。チューブにジエチルエーテルを50 mlになるまで加えた後、氷上に10分間置いてペプチドを析出させた。析出したペプチドを、4200 rpm、４℃で12分間遠心分離することにより沈殿させた。上清を除いた後、ペプチドを洗浄するために冷ジエチルエーテルを加えて撹拌し、同じ条件の遠心分離によりペプチドを再び沈殿させた。この洗浄操作を３回繰り返した後、ペプチドを乾燥させた。 Fmoc amide resin (Applied Biosystems) 240 mg and various Fmoc-amino acids (nova biochem) 0.5 mmol were set in the synthesizer to synthesize peptides. After synthesis, the resin was washed with diethyl ether. The resin was recovered by column filtration and then vacuum dried. Transfer dried resin to a tube and cleaved solution (mixture of 93% trifluoroacetic acid (TFA) and 7% 1,2-ethanedithiol: anisole: ethylenediaminetetraacetic acid = 1: 3: 3 (v / v)) 10 ml was added and stirred and reacted for 3-4 hours. After completion of the reaction, the resin in the tube was filtered through a synthesis column to remove the resin, and the flow-through (peptide solution) was transferred to another tube. Diethyl ether was added to the tube until it reached 50 ml, and then placed on ice for 10 minutes to precipitate the peptide. The precipitated peptide was precipitated by centrifugation at 4200 rpm, 4 ° C. for 12 minutes. After removing the supernatant, cold diethyl ether was added and stirred to wash the peptide, and the peptide was precipitated again by centrifugation under the same conditions. This washing operation was repeated three times, and then the peptide was dried.
乾燥させたペプチドを精製水に溶解し、得られたペプチド溶液を逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（L-2310 Pump；HITACHI製）により精製して、配列番号５〜７で表される各アミノ酸配列からなる非環状ペプチドを得た。収量はそれぞれ16.8 mg、34.9 mgおよび23.1 mgであった。
なお、HPLCに用いたバッファーおよび条件は、以下のとおりである。
カラム：YMC-Pack ODS-AM AM323 250×10.0 mmI.D.（YMC社）
溶出剤：A）0.1％TFA、B）アセトニトリル（ナカライテスク）
20-50%B（0-30分、リニア）
流速：3.0 ml/分
検出：UV 280 nm
The dried peptide was dissolved in purified water, and the resulting peptide solution was purified by reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) (L-2310 Pump; manufactured by HITACHI) to obtain each of SEQ ID NOs: 5 to 7 An acyclic peptide consisting of the amino acid sequence was obtained. Yields were 16.8 mg, 34.9 mg and 23.1 mg, respectively.
The buffers and conditions used for HPLC are as follows.
Column: YMC-Pack ODS-AM AM323 250 × 10.0 mm I.D. (YMC)
Eluent: A) 0.1% TFA, B) Acetonitrile (Nacalai Tesque)
20-50% B (0-30 minutes, linear)
Flow rate: 3.0 ml / min Detection: UV 280 nm
（２）ペプチドの環化（分子内結合の形成）
上記の（１）で得られた配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの水溶液を、35 mlの30 mM Tris-HCl（pH 8.5）にゆっくりと滴下して、一晩反応させることによりチオエーテル結合を形成させた。反応終了後、上記の（１）と同様にHPLCによりペプチドを精製して、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明の環状ペプチドを得た。収量は5.9 mgであった。
また、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの水溶液についても同様に、70 mlの30 mM Tris-HCl（pH 8.5）にゆっくりと滴下して、一晩反応させることによりジスルフィド結合を形成させた。反応終了後、上記の（１）と同様にHPLCによりペプチドを精製して、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる本発明の環状ペプチドを得た。収量は4.4 mgであった。
なお、上記のチオエーテル結合およびジスルフィド結合の形成反応の終了は、5, 5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）を用いるチオール基の定量法により確認した。
(2) Cyclization of peptides (formation of intramolecular bonds)
By slowly dropping an aqueous solution of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 obtained in (1) above into 35 ml of 30 mM Tris-HCl (pH 8.5) and allowing it to react overnight. A thioether bond was formed. After completion of the reaction, the peptide was purified by HPLC in the same manner as in (1) above to obtain the cyclic peptide of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The yield was 5.9 mg.
Similarly, an aqueous solution of a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is also slowly dropped into 70 ml of 30 mM Tris-HCl (pH 8.5) and reacted overnight to form a disulfide bond. I let you. After completion of the reaction, the peptide was purified by HPLC in the same manner as in (1) above to obtain the cyclic peptide of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. The yield was 4.4 mg.
The completion of the above thioether bond and disulfide bond formation reaction was confirmed by a thiol group quantification method using 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB).
ＩＩ 本発明の環状ペプチドのG-CSF受容体に対する親和性の検討
表面プラズモン共鳴（SPR）法を利用するBIACORE（登録商標）T100（BIACORE社製）により、配列番号２および３で表される各アミノ酸配列からなる本発明の環状ペプチド（以下、それぞれ「P8-2KA-S(TE)」および「P8-2KA-S(DS)」ともいう）のG-CSF受容体に対する親和性を調べた。また、比較例として、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる非環状ペプチド（以下、「P8-2KA」ともいう）についても同様に親和性を調べた。なお、P8-2KAは特許文献１に開示されるペプチドの一つと同じものである。
II Examination of Affinity of Cyclic Peptide of the Present Invention for G-CSF Receptor Using BIACORE (registered trademark) T100 (manufactured by BIACORE) using surface plasmon resonance (SPR) method, The affinity of the cyclic peptide of the present invention comprising the amino acid sequence (hereinafter also referred to as “P8-2KA-S (TE)” and “P8-2KA-S (DS)”) to the G-CSF receptor was examined. As a comparative example, the affinity of an acyclic peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (hereinafter also referred to as “P8-2KA”) was similarly examined. P8-2KA is the same as one of the peptides disclosed in Patent Document 1.
アミンカップリング法により、センサーチップ（Series S Sensor Chip CM5：BIACORE社）にG-CSF受容体（20μg/ml）を固定化した。なお、用いたG-CSF受容体は、Aritomi, M.らによる文献（Acta Cryst. (2000). D56, 751-753）の記載に従って調製した。
センサーチップのフローセル２に、N-エチルN'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸（EDC）とN-ヒドロキシサクシンイミド（NHS）との等量混合液をインジェクトし、流速10μl/分で７分間反応させてカルボキシル基を活性化させた。次いで、G-CSF受容体溶液をインジェクトして、流速10μl/分で７分間反応させて固定化した。そして、１Mエタノールアミン-HCl（pH8.5）をインジェクトし、流速10μl/分で７分間反応させて、未反応のカルボキシル基をキャッピングした。リファレンスセルとして用いるフローセル１には、EDC/NHSによる活性化およびエタノールアミン-HClによるキャッピングを行った。なお、反応は全て25℃で行い、ランニングバッファーとしてHBS-EP buffer（10 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM NaCl、３mM EDTA、0.005％界面活性剤P20；BIACORE社）を用いた。
HBS-EP bufferを用いて種々の濃度の各ペプチド溶液を調製した。これらをインジェクトし、流速30μl/分で２分間反応させてSPRを測定した。得られた結果をBIACORE（登録商標）T100のEvaluationソフトウェアにより解析した。解析の結果を表１に示す。
G-CSF receptor (20 μg / ml) was immobilized on a sensor chip (Series S Sensor Chip CM5: BIACORE) by the amine coupling method. The G-CSF receptor used was prepared according to the description by Aritomi, M. et al. (Acta Cryst. (2000). D56, 751-753).
An equal volume mixture of N-ethyl N '-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) is injected into the flow cell 2 of the sensor chip, and the flow rate is 10 μl / min. For 7 minutes to activate the carboxyl group. Next, the G-CSF receptor solution was injected and reacted at a flow rate of 10 μl / min for 7 minutes for immobilization. Then, 1M ethanolamine-HCl (pH 8.5) was injected and reacted at a flow rate of 10 μl / min for 7 minutes to cap unreacted carboxyl groups. The flow cell 1 used as a reference cell was activated with EDC / NHS and capped with ethanolamine-HCl. All reactions were performed at 25 ° C., and HBS-EP buffer (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfactant P20; BIACORE) was used as a running buffer.
Various peptide solutions of various concentrations were prepared using HBS-EP buffer. These were injected and reacted at a flow rate of 30 μl / min for 2 minutes to measure SPR. The obtained results were analyzed with BIACORE® T100 Evaluation software. The results of the analysis are shown in Table 1.
表１より、環状ペプチドであるP8-2KA-S(TE)およびP8-2KA-S(DS)のG-CSF受容体に対する親和性は、非環状ペプチドであるP8-2KAよりも非常に高いことがわかる。 From Table 1, the affinity of the cyclic peptides P8-2KA-S (TE) and P8-2KA-S (DS) to the G-CSF receptor is much higher than that of the acyclic peptide P8-2KA. I understand.
ＩＩＩ 本発明の環状ペプチドの血清中の安定性の検討
本発明の環状ペプチドとマウス血清とを混合して、本発明の環状ペプチドの血清中における安定性を検討した。
（１）血清の調製
5匹のマウスから血液を採取し、これを37℃で１時間インキュベートした。次いで、血液を４℃で一晩静置した。これを13000 rpm、４℃で、10分間遠心分離して血球成分を分離し、血清を500μl得た。
（２）安定性試験
P8-2KA-S(TE)、P8-2KA-S(DS)およびP8-2KAの各溶液100μlと血清100μlとを混合して、37℃でインキュベートを開始した。測定時間ごとに、各混合液から20μlを取り出してチューブに移した。これらに抽出液（0.1% TFA：アセトニトリル＝１：１）を100μl加えて、13000 rpmで10分間遠心分離し、上清を別のチューブに移した。これらに抽出液を100μl加えて、アセトンおよびドライアイスにより凍結して、全てのサンプル採取が終わるまで−４℃で保管した。全サンプル採取後、実施例１と同様にしてHPLCによりペプチドを定量した。時間0でのピーク積分値を100%として、各時間のペプチド量の変化をグラフにプロットした。結果を図１に示す。また、各ペプチドの血清中での半減期を表２に示す。
III . Examination of the stability of the cyclic peptide of the present invention in serum The cyclic peptide of the present invention was mixed with mouse serum to examine the stability of the cyclic peptide of the present invention in serum.
(1) Preparation of serum
Blood was collected from 5 mice and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The blood was then allowed to stand overnight at 4 ° C. This was centrifuged at 13000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes to separate blood cell components, and 500 μl of serum was obtained.
(2) Stability test
100 μl of each solution of P8-2KA-S (TE), P8-2KA-S (DS) and P8-2KA was mixed with 100 μl of serum, and incubation was started at 37 ° C. At each measurement time, 20 μl was taken from each mixture and transferred to a tube. 100 μl of the extract (0.1% TFA: acetonitrile = 1: 1) was added to these, centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was transferred to another tube. 100 μl of the extract was added thereto, frozen with acetone and dry ice, and stored at −4 ° C. until all samples were collected. After collecting all samples, peptides were quantified by HPLC in the same manner as in Example 1. The peak integrated value at time 0 was taken as 100%, and the change in peptide amount at each time was plotted on a graph. The results are shown in FIG. In addition, Table 2 shows the half-life of each peptide in serum.
図１および表２より、環状ペプチドであるP8-2KA-S(TE)およびP8-2KA-S(DS)の血清中での安定性は非環状ペプチドであるP8-2KAよりも非常に高いことがわかる。特に半減期についてはP8-2KA-S(TE)およびP8-2KA-S(DS)はいずれも10日間以上であり、ペプチドとしては驚異的な値を示した。 1 and Table 2, the stability of the cyclic peptides P8-2KA-S (TE) and P8-2KA-S (DS) in serum is much higher than that of the acyclic peptide P8-2KA. I understand. In particular, as for the half-life, both P8-2KA-S (TE) and P8-2KA-S (DS) were 10 days or more, and the peptide showed surprising values.
ＩＶ 本発明の環状ペプチドのG-CSF受容体に対するアンタゴニスト活性の検討
G-CSF受容体を細胞表面に発現し、G-CSF濃度に依存して増殖するNFS60細胞を用いて、本発明の環状ペプチドのアンタゴニスト活性を検討した。
IV. Examination of antagonistic activity of cyclic peptides of the present invention against G-CSF receptor
The antagonistic activity of the cyclic peptide of the present invention was examined using NFS60 cells that express the G-CSF receptor on the cell surface and proliferate depending on the concentration of G-CSF.
NFS60細胞（東レ株式会社）をアッセイ用培地（10％FCS、400 pM G-CSF、１％ペニシリン、１％L-グルタミンおよび0.1％２-メルカプトエタノールを含むRPMI培地）に、４×105 cells / mlの濃度となるよう懸濁した。この細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに50μlずつ入れた後、種々の濃度の各ペプチド溶液を50μlずつ添加した。そして、細胞を37℃、５％CO2下で２日間培養した。
なお、ペプチドの終濃度は、P8-2KA-S(TE)およびP8-2KA-S(DS)が0.625 nM〜20μM、P8-2KAが0.03μM〜250μMであった。また、各ウェルの細胞濃度およびG-CSF濃度は、それぞれ２×105 cells / mlおよび200 pMであった。
培養後、MTT（M2128；SIGMA社）のPBS溶液（５mg/ml）を各ウェルに20μlずつ添加して、37℃、５％CO2雰囲気下で４時間インキュベーションした。その後、10％SDS／0.01 N HCl溶液を各ウェルに100μlずつ添加して、さらに一晩インキュベーションした。そして、マイクロプレートリーダー（Model 680；BIO-RAD社製）で570 nmにおける吸光度を測定した。
測定結果から、以下の計算式を用いて細胞の増殖率（OD570）を算出した。
（細胞の増殖率）＝（検体の吸光度）−（培地のみの吸光度）
結果を図２示す。また、各ペプチドの増殖阻害活性をIC50（nM）として表３に示す。
NFS60 cells (Toray Industries, Inc.) in assay medium (RPMI medium containing 10% FCS, 400 pM G-CSF, 1% penicillin, 1% L-glutamine and 0.1% 2-mercaptoethanol) at 4 × 10 5 cells Suspended to a concentration of / ml. After 50 μl of this cell suspension was added to each well of a 96-well plate, 50 μl of each peptide solution having various concentrations was added. The cells were then cultured for 2 days at 37 ° C. and 5% CO 2 .
The final peptide concentrations were 0.625 nM to 20 μM for P8-2KA-S (TE) and P8-2KA-S (DS), and 0.03 to 250 μM for P8-2KA. The cell concentration and G-CSF concentration in each well were 2 × 10 5 cells / ml and 200 pM, respectively.
After culturing, 20 μl of PBS solution (5 mg / ml) of MTT (M2128; SIGMA) was added to each well and incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 4 hours. Thereafter, 100 μl of 10% SDS / 0.01 N HCl solution was added to each well and further incubated overnight. Then, the absorbance at 570 nm was measured with a microplate reader (Model 680; manufactured by BIO-RAD).
From the measurement results, the cell proliferation rate (OD 570 ) was calculated using the following formula.
(Cell growth rate) = (Absorbance of specimen) − (Absorbance of medium only)
The results are shown in FIG. The growth inhibitory activity of each peptide is shown in Table 3 as IC 50 (nM).
図２および表３より、環状ペプチドであるP8-2KA-S(TE)およびP8-2KA-S(DS)のG-CSF受容体に対するアンタゴニスト活性は、非環状ペプチドであるP8-2KAよりも非常に高いことがわかる。
なお、P8-2KA-S(TE)、P8-2KA-S(DS)およびP8-2KA自体に毒性がないことは、ミエローマ細胞を用いた同様の増殖アッセイにより確認している。すなわち、これらのペプチドはいずれの濃度においても、ミエローマ細胞（P3X63-Ag8.653：大日本製薬05-565）の生存および増殖には影響を及ぼさなかった。
したがって、上記の増殖阻害活性は、各ペプチドが有するG-CSF受容体に対するアンタゴニスト活性によるものであることが示される。
2 and Table 3, the antagonistic activity of the cyclic peptides P8-2KA-S (TE) and P8-2KA-S (DS) on the G-CSF receptor is much higher than that of the acyclic peptide P8-2KA. It can be seen that it is expensive.
It has been confirmed by the same proliferation assay using myeloma cells that P8-2KA-S (TE), P8-2KA-S (DS) and P8-2KA itself are not toxic. That is, these peptides did not affect the survival and proliferation of myeloma cells (P3X63-Ag8.653: Dainippon Pharmaceutical 05-565) at any concentration.
Therefore, it is shown that the above growth inhibitory activity is due to the antagonistic activity of each peptide with respect to the G-CSF receptor.
Claims (4)
（式中、
X1は天然アミノ酸残基、またはα-アミノ基がアセチル化したグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、セリン、トリプトファンおよびスレオニンからなる群より１つ選択されるN-アセチル化アミノ酸残基であり、
ただし、
X1が天然アミノ酸残基である場合、X2も天然アミノ酸残基であり、
X1がN-アセチル化アミノ酸残基である場合、X2はシステイン残基である）
で表されるアミノ酸配列からなり、X1残基およびX2残基の官能基間に分子内結合を形成した環状ペプチド。 Formula: X 1 AAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYX 2 (SEQ ID NO: 1)
(Where
X 1 is a natural amino acid residue, or an N-acetylated amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, serine, tryptophan and threonine with an α-amino group acetylated Residue,
However,
When X 1 is a natural amino acid residue, X 2 is also a natural amino acid residue,
When X 1 is an N-acetylated amino acid residue, X 2 is a cysteine residue)
In represented by a protein consisting of an amino acid sequence, X 1 residues and X 2 residues of the functional groups forming the cyclic peptide intramolecular bond between.
XAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC（配列番号２）
（XはN-アセチルグリシン残基である）
であり、
前記分子内結合が、N-アセチルグリシン残基のアセチル基とシステイン残基のチオール基との間のチオエーテル結合である、請求項１に記載の環状ペプチド。 The amino acid sequence is
XAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC (SEQ ID NO: 2)
(X is an N-acetylglycine residue)
And
The cyclic peptide according to claim 1, wherein the intramolecular bond is a thioether bond between an acetyl group of an N-acetylglycine residue and a thiol group of a cysteine residue.
CAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC（配列番号３）
であり、
前記分子内結合が、システイン残基のチオール基間のジスルフィド結合である、請求項１に記載の環状ペプチド。 The amino acid sequence is
CAAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYC (SEQ ID NO: 3)
And
The cyclic peptide according to claim 1, wherein the intramolecular bond is a disulfide bond between thiol groups of cysteine residues.
X3AAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYX4（配列番号４）
（X3およびX4は天然アミノ酸残基である）
であり、
前記分子内結合が、X3残基のアミノ基とX4残基のカルボキシル基との間のペプチド結合である、請求項１に記載の環状ペプチド。 The amino acid sequence is
X 3 AAELAALEAELAALEGGGGGGGKLAMLKLKLAELKRYX 4 (SEQ ID NO: 4)
(X 3 and X 4 are natural amino acid residues)
And
The intramolecular bond is a peptide bond between the carboxyl group of the amino group and X 4 residue of X 3 residues, cyclic peptide of claim 1.
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