JP2011229425A - Production of pdc by gene transfer of 3-methylgallate 3,4-dioxygenase - Google Patents

Production of pdc by gene transfer of 3-methylgallate 3,4-dioxygenase Download PDF

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for fermentation production of PDC (2-pyrronic-4,6-dicarboxylic acid) from syringaldehyde on an industrial scale.SOLUTION: The recombinant vector includes 3MGA 3,4-dioxygenase (DesZ) gene, a benzaldehyde dehydrogenase (LigV2) gene having a specific base sequence and a vanillate/syringate demethylase (VanA, VanB) gene having another specific amino acid sequence. The transformant is provided. The method for producing PDC is provided.

Description

本発明は、リグニンの低分子分解物であるシリンガアルデヒドなどから、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸を発酵生産するための組換えベクター、形質転換体、及びそれを用いる2-ピロン-4,6-ジカルボン酸（以下、「PDC」と略す場合がある）の工業的製造法に関する。   The present invention relates to a recombinant vector for transforming and producing 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid from syringaldehyde, which is a low-molecular-weight degradation product of lignin, and 2-pyrone- The present invention relates to an industrial production method of 4,6-dicarboxylic acid (hereinafter sometimes abbreviated as “PDC”).

植物主要成分であるリグニンは、芳香族高分子化合物として植物細胞壁に普遍的に含まれており、樹木では30％ 、イネやトウモロコシ稈では15％を占めるバイオマス資源である。その他にも植物は多様な芳香族化合物を構成成分として含んでいる。しかし、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分は化学構造が多様な成分で構成されている事や複雑な高分子構造を持つため有効な利用技術が開発されていない。従来の利用技術として挙げられるのは、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分をアルカリ分解などの化学分解で生成する低分子芳香族分解物から、香料原料であるバニリンを分離製造する実用化技術がある。しかし、化学分解で生成するバニリン以外の多量の低分子芳香族物質の有効な利用方法はないのが現状である。そのため製紙工程で大量に生成するリグニンは有効利用される事無く重油の代替え品として燃焼されている。   Lignin, a major plant component, is a biomass resource that is universally contained in plant cell walls as an aromatic polymer, accounting for 30% of trees and 15% of rice and corn straw. In addition, plants contain various aromatic compounds as constituents. However, an effective utilization technique has not been developed for aromatic components derived from plants mainly composed of lignin because they are composed of components having various chemical structures and complex polymer structures. Examples of conventional technologies include the practical use of separating and producing vanillin, a fragrance raw material, from low-molecular-weight aromatic degradation products produced by chemical decomposition such as alkaline decomposition of plant-derived aromatic components mainly composed of lignin. Technology. However, there is currently no effective method for utilizing a large amount of low-molecular aromatic substances other than vanillin produced by chemical decomposition. For this reason, lignin produced in large quantities in the papermaking process is burned as a substitute for heavy oil without being effectively used.

今日の石油化学工業の発展を支えたのは、多様な化学成分の混合物である原油を触媒分解と分溜によってベンゼンやエチレンなどの単一な中間物質に一旦変換し、それらを原料に多様な機能性プラスチックスを製造するという原理である。この石油化学工業の発展を支えた基本原理は、化学構造の多様さや複雑な高分子構造を持つリグニンなど植物芳香族成分の利用技術においても適用可能な普遍的原理である。リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分利用の技術を開発する上で、石油化学の触媒分解に相当するプロセスとして、リグニンなど植物芳香族成分の加水分解や酸化分解、可溶媒分解などの化学的分解法や、超臨界水や超臨界有機溶媒による物理化学的分解法など多くの低分子化技術が既に数多く研究され開発されている。しかしもう一つの技術である、各種分解法により生成する植物成分由来低分子混合物から、様々な機能性プラスチックス原料や化学製品の原料と成りうる有用な単一の中間物質（石油化学においてはエチレンやベンゼン） への変換分離技術は開発されていなかった。この技術が開発されれば、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分利用が、石油化学に匹敵する技術として発展する可能性がある。_   Supporting the development of the petrochemical industry today is the conversion of crude oil, which is a mixture of various chemical components, into a single intermediate substance such as benzene and ethylene by catalytic cracking and fractionation. The principle is to manufacture functional plastics. The basic principle that supported the development of the petrochemical industry is a universal principle that can also be applied in the utilization technology of plant aromatic components such as lignin having diverse chemical structures and complex polymer structures. In developing technologies for the use of plant-derived aromatic components based on lignin, processes equivalent to catalytic decomposition of petrochemicals include hydrolysis, oxidative decomposition, and solvent decomposition of plant aromatic components such as lignin. Many low molecular weight technologies such as chemical decomposition methods and physicochemical decomposition methods using supercritical water or supercritical organic solvents have already been studied and developed. However, another intermediate technology, a low-molecular mixture derived from plant components produced by various decomposition methods, can be used as a raw material for various functional plastic materials and chemical products. No conversion / separation technology has been developed. If this technology is developed, the use of plant-derived aromatic components mainly composed of lignin may develop as a technology comparable to petrochemistry. _

本発明者らは、リグニンの分解物であるバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸、又はその混合物等から、バイオリアクターにより、2-ピロン-4,6-ジカルボン酸に変換する方法を報告している。図１に、これらの分解物からPDCへの変換経路の一例を示す。リグニン分解物であるシリンガアルデヒドやシリンガ酸などを効率良く酸化して、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換する酵素は重要であり、現在この酸化反応は、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（LigV2）、バニリン酸・シリンガ酸ディメチラーゼ（VanA, VanB）遺伝子、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼ（LigA，LigB又はPmdA, PmdB）遺伝子、４−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(LigC又はPmdC）遺伝子などがその役割を果たしている。   The present inventors convert lignin degradation product vanillin, syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid, protocatechuic acid, or a mixture thereof into 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid by a bioreactor. Reporting method. In FIG. 1, an example of the conversion path | route from these decomposition products to PDC is shown. An enzyme that efficiently oxidizes lignin degradation products such as syringaldehyde or syringic acid and converts it into 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid is important. Currently, this oxidation reaction is performed by benzaldehyde dehydrogenase (LigV2), Vanillic acid / syringate dimethylase (VanA, VanB) gene, protocatechuic acid 4,5-dioxygenase (LigA, LigB or PmdA, PmdB) gene, 4-carboxy-2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde dehydrogenase (LigC Or PmdC) gene plays the role.

特開２００５−２７８５４９号公報JP 2005-278549 A

すでに従来発明で、シリンガアルデヒド、シリンガ酸から、２-ピロン−４，６-ジカルボン酸の発酵生産が可能になっているが、中間代謝物質である３−Ｏ−メチルガリック酸（3MGA）が蓄積することで２-ピロン−４，６−ジカルボン酸生産量の減少が起こっていた。3MGAが夾雑していると、その毒性により菌の生育が阻害されたり、GA等との重合物により培養液が着色され、精製品質に悪影響が及ぼされる。一方で、3MGAのPDCへの変換効率を向上できれば、収量が増加し、経済的に有利である。そこで、本発明では、3MGAを２-ピロン−４，６−ジカルボン酸へと変換する3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ（DesZ）をコードする遺伝子を追加することで、効率的に２−ピロン−４，６-ジカルボン酸を発酵生産することを目的とした。   Already in the conventional invention, 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid can be fermented and produced from syringaldehyde or syringic acid, but the intermediate metabolite 3-O-methylgallic acid (3MGA) is Accumulation reduced 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid production. When 3MGA is contaminated, the growth of bacteria is inhibited due to its toxicity, or the culture solution is colored by a polymer with GA or the like, and the purified quality is adversely affected. On the other hand, if the conversion efficiency of 3MGA to PDC can be improved, the yield increases, which is economically advantageous. Therefore, in the present invention, by adding a gene encoding 3MGA 3,4-dioxygenase (DesZ) that converts 3MGA into 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid, 2-pyrone-4 can be efficiently produced. The purpose was to produce fermented 6-dicarboxylic acid.

植物芳香族成分の低分子化処理混合物に含まれる、シリンガアルデヒド、シリンガ酸から、効率的に単一の中間物質２-ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換する発酵生産プロセスを構築した。従来は２−ピロン−４，６−ジカルボン酸までの変換に必要な遺伝子（LigV2, LigV, PobA, VanAB, LigABC）を適当なプロモーター配列の下流に連結した遺伝子組換えベクターおよびそれを保有する形質転換体細胞を作製し発酵生産を行ったが、本発明ではさらにDesZを有するベクターを同一の形質転換体細胞に共存させた。DesZはLigABよりも3MGAに対して約17倍高いジオキシゲナーゼ活性を示すことから、LigAB単独時よりもシリンギル核リグニン由来芳香族化合物からの効率的な２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の量産プロセスが確立できた。   A fermentation production process for efficiently converting syringaldehyde and syringic acid contained in a low molecular weight processing mixture of plant aromatic components into a single intermediate substance 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid was constructed. Conventionally, a gene recombination vector in which genes necessary for conversion to 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid (LigV2, LigV, PobA, VanAB, LigABC) are linked downstream of an appropriate promoter sequence, and a trait possessing the gene Transformant cells were prepared and fermented and produced. In the present invention, a vector having DesZ was also allowed to coexist in the same transformant cell. Since DesZ exhibits about 17 times higher dioxygenase activity than 3MGA than LigAB, more efficient mass production of 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid from aromatic compounds derived from syringyl nuclear lignin than LigAB alone The process was established.

すなわち、
（１）本発明は、好ましくはプロモーターとターミネーターとの間に、下記のDNA分子
（a−1）配列番号１記載の3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ（DesZ）遺伝子のDNA分子;
（a−2）配列番号２記載の3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ（DesZ）のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ａ−３）配列番号１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ａ−４）配列番号２記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
を含む組換えベクターを提供する。 That is,
(1) The present invention is preferably a DNA molecule of 3MGA 3,4-dioxygenase (DesZ) gene described in the following DNA molecule (a-1) SEQ ID NO: 1 between a promoter and a terminator;
(A-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence of 3MGA 3,4-dioxygenase (DesZ) described in SEQ ID NO: 2;
(A-3) A DNA molecule that hybridizes with a DNA molecule comprising SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof under highly stringent conditions and encodes a polypeptide having 3MGA 3,4-dioxygenase activity Or (a-4) a polypeptide having an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are deleted, substituted and / or added, and having 3MGA 3,4-dioxygenase activity; A DNA molecule encoding
A recombinant vector comprising

（２）本発明はさらに、好ましくはプロモーターとターミネーターとの間に、下記のDNA分子群を有する（１）に記載の組換えベクターを提供する：
ここで、前記DNA分子群は、（ｂ）LigV2遺伝子と、（ｃ）VanAB遺伝子及び／又はVanA及びVanB遺伝子との組み合わせから成る群より選ばれ；
（ｂ）LigV2遺伝子は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｂ−１）配列番号３記載のDNA分子；
（ｂ−２）配列番号４記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｂ−３）配列番号３記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｂ−４）配列番号４記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、
（ｃ）VanA及びVanB遺伝子はそれぞれ下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｃ−１）配列番号５及び７記載のDNA分子；
（ｃ−２）配列番号６及び８記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｃ−３）配列番号５及び７記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号５及び７記載のDNA分子又はそれぞれの相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつシリンガ酸、バニリン酸に対してディメチラーゼ活性を有する２本のポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｃ−４）配列番号６及び８記載のアミノ酸配列の変異体、即ち、配列番号６及び８記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつシリンガ酸、バニリン酸に対してディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドのいずれか一方又は両方をコードするDNA分子。 (2) The present invention further provides the recombinant vector according to (1), preferably having the following DNA molecule group between a promoter and a terminator:
Here, the DNA molecule group is selected from the group consisting of (b) LigV2 gene and (c) a combination of VanAB gene and / or VanA and VanB gene;
(B) The LigV2 gene is one of the following DNA molecules:
(B-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 3;
(B-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
(B-3) a DNA molecule that hybridizes with the DNA molecule of SEQ ID NO: 3 or its complementary sequence under highly stringent conditions and encodes a polypeptide having benzaldehyde dehydrogenase activity; or (b- 4) a DNA molecule encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 have been deleted, substituted and / or added, and having benzaldehyde dehydrogenase activity;
(C) Each of the VanA and VanB genes is one of the following DNA molecules:
(C-1) DNA molecules described in SEQ ID NOs: 5 and 7;
(C-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 6 and 8;
(C-3) a hybrid of a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NOs: 5 and 7, that is, a DNA molecule described in SEQ ID NOs: 5 and 7, or a DNA molecule consisting of a complementary sequence thereof, under highly stringent conditions; And a DNA molecule encoding two polypeptides having dimethylase activity against syringic acid and vanillic acid; or (c-4) a variant of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 6 and 8, ie, SEQ ID NO: 6 and 8. Any one of the two polypeptides having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added and having dimethylase activity against syringic acid and vanillic acid. A DNA molecule that encodes one or both.

（３）本発明はさらに、任意的にプロモーターとターミネーターとの間に、ｄ）LigA遺伝子、（ｅ）LigB遺伝子、（ｆ）LigC遺伝子及びその組み合わせから成る群より選ばれるDNA分子群を有する（１）又は（２）に記載の組換えベクターを提供する：
ここで、前記DNA分子群は、；
（ｄ）LigA遺伝子は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｄ−１）配列番号９記載のDNA分子；
（ｄ−２）配列番号１０記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｄ−３）配列番号９記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号９記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼαサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｄ−４）配列番号１０記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１０記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼαサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子（αサブユニット）；
（ｅ）LigB遺伝子は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｅ−１）配列番号１１記載のDNA分子；
（ｅ−２）配列番号１２記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｅ−３）配列番号１１記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼβサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｅ−４）配列番号１２記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１２記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼβサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子（βサブユニット）；
（ｆ）DNA分子（LigC遺伝子）は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｆ−１）配列番号１３記載のDNA分子；
（ｆ−２）配列番号１４記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｆ−３）配列番号１３記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１３記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｆ−４）配列番号１４記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１４記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子。 (3) The present invention further includes a DNA molecule group selected from the group consisting of d) LigA gene, (e) LigB gene, (f) LigC gene, and combinations thereof, optionally between a promoter and a terminator ( A recombinant vector according to 1) or (2) is provided:
Here, the DNA molecule group includes:
(D) The LigA gene is one of the following DNA molecules:
(D-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 9;
(D-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(D-3) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 9, ie, a DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 9 or a complementary molecule thereof under high stringency conditions, and protocatechuic acid 4, A DNA molecule encoding a polypeptide having 5-dioxygenase α subunit activity; or (d-4) a variant of the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 10, ie, one or several amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 10 A DNA molecule (α subunit) consisting of an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted and / or added, and encoding a polypeptide having protocatechuic acid 4,5-dioxygenase α subunit activity;
(E) LigB gene is one of the following DNA molecules:
(E-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 11;
(E-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(E-3) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 11, ie, a DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 11 or a complementary sequence thereof under high stringency conditions, and protocatechuic acid 4, A DNA molecule encoding a polypeptide having 5-dioxygenase β subunit activity; or (e-4) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 12, ie, one or several amino acid sequences described in SEQ ID NO: 12 A DNA molecule (β subunit) consisting of an amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted and / or added, and encoding a polypeptide having protocatechuic acid 4,5-dioxygenase β subunit activity;
(F) The DNA molecule (LigC gene) is one of the following DNA molecules:
(F-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 13;
(F-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(F-3) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 13, ie, a DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 13 or a complementary DNA sequence under highly stringent conditions, and 4-carboxy- A DNA molecule encoding a polypeptide having 2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde dehydrogenase activity; or (f-4) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 14, ie, one of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 14 Alternatively, a DNA molecule consisting of an amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted and / or added, and encoding a polypeptide having 4-carboxy-2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde dehydrogenase activity.

（４）本発明はさらに、任意的にプロモーターとターミネーターとの間に、下記のDNA分子群を有する（１）〜（３）のいずれかに記載の組換えベクターを提供する：
ここで、前記DNA分子群は、（ｇ）PmdA遺伝子、（ｈ）PmdB遺伝子、（ｉ）PmdC遺伝子及びその組み合わせから成る群より選ばれ；
（ｇ）PmdA遺伝子は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｇ−１）配列番号１５記載のDNA分子；
（ｇ−２）配列番号１６記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｇ−３）配列番号１５記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１５記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼαサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｇ−４）配列番号１６記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１６記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼαサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
（ｈ）PmdB遺伝子は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｈ−１）配列番号１７記載のDNA分子；
（ｈ−２）配列番号１８記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｈ−３）配列番号１７記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１７記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼβサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｈ−４）配列番号１８記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１８記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼβサブユニット活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
（ｉ）DNA分子（PmdC遺伝子）は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｉ−１）配列番号１９記載のDNA分子；
（ｉ−２）配列番号２０記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｉ−３）配列番号１９記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号１９記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｉ−４）配列番号２０記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号２０記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子。 (4) The present invention further provides the recombinant vector according to any one of (1) to (3), optionally having the following DNA molecule group between a promoter and a terminator:
Here, the DNA molecule group is selected from the group consisting of (g) PmdA gene, (h) PmdB gene, (i) PmdC gene, and combinations thereof;
(G) The PmdA gene is one of the following DNA molecules:
(G-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 15;
(G-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16;
(G-3) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 15, ie, a DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 15 or a complementary sequence thereof under a highly stringent condition, and protocatechuic acid 4, A DNA molecule encoding a polypeptide having 5-dioxygenase α subunit activity; or (g-4) a variant of the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 16, ie, one or several amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 16 A DNA molecule encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which amino acids have been deleted, substituted and / or added, and having protocatechuate 4,5-dioxygenase α subunit activity;
(H) The PmdB gene is one of the following DNA molecules:
(H-1) a DNA molecule described in SEQ ID NO: 17;
(H-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
(H-3) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 17, that is, hybridizes with a DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 17 or a complementary sequence thereof under highly stringent conditions, and protocatechuic acid 4, A DNA molecule encoding a polypeptide having 5-dioxygenase β subunit activity; or (h-4) a variant of the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 18, ie, one or several amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 18 A DNA molecule encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted and / or added, and having protocatechuic acid 4,5-dioxygenase β subunit activity;
(I) The DNA molecule (PmdC gene) is one of the following DNA molecules:
(I-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 19;
(I-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20;
(I-3) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 19, that is, a DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 19 or a complementary DNA sequence under highly stringent conditions, and 4-carboxy- A DNA molecule encoding a polypeptide having 2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde dehydrogenase activity; or (i-4) a variant of the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 20, ie, one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 20 Alternatively, a DNA molecule encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which several amino acids are deleted, substituted and / or added, and having 4-carboxy-2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde dehydrogenase activity.

（５）本発明はさらに、任意的にプロモーターとターミネーターとの間に、下記のDNA分子群を有する（１）〜（４）のいずれかに記載の組換えベクターを提供する：
ここで、前記DNA分子群は、（ｊ）LigV遺伝子、（ｋ）PobA遺伝子及びその組み合わせから成る群より選ばれ；
（ｊ）LigV遺伝子は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｊ−１）配列番号２１記載のDNA分子；
（ｊ−２）配列番号２２記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｊ−３）配列番号２１記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号２１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｊ−４）配列番号２２記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号２２記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
（ｋ）PobA遺伝子は下記のいずれかのDNA分子であり、
（ｋ−１）配列番号２３記載のDNA分子；
（ｋ−２）配列番号２４記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｋ−３）配列番号２３記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号２３記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｉ−４）配列番号２４記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号２４記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子。 (5) The present invention further provides the recombinant vector according to any one of (1) to (4), optionally having the following DNA molecule group between a promoter and a terminator:
Here, the DNA molecule group is selected from the group consisting of (j) LigV gene, (k) PobA gene and combinations thereof;
(J) The LigV gene is one of the following DNA molecules:
(J-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 21;
(J-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22;
(J-3) A variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 21, that is, hybridizes with a DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 21 or a complementary sequence thereof under highly stringent conditions and has benzaldehyde dehydrogenase activity A DNA molecule encoding the polypeptide; or (j-4) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 22, ie, one or several amino acids of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 22 are deleted, substituted and / or added. A DNA molecule that encodes a polypeptide comprising a sequence of amino acids and having benzaldehyde dehydrogenase activity;
(K) The PobA gene is one of the following DNA molecules:
(K-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 23;
(K-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24;
(K-3) A variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 23, that is, a hybridized DNA molecule consisting of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 23 or a complementary molecule thereof under highly stringent conditions, and p-hydroxybenzoic acid A DNA molecule encoding a polypeptide having acid hydroxylase activity; or (i-4) a variant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 24, ie, deletion of one or several amino acids of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 24 A DNA molecule encoding a polypeptide consisting of a substituted and / or added amino acid sequence and having p-hydroxybenzoate hydroxylase activity.

（６）本発明は、前記3MGA 3，4−ジオキシゲナーゼ遺伝子が、スフィンゴビウム・パウシモビリス（Sphingobium paucimobilis）SYK-6株由来である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の組換えベクターを提供する。
（７）本発明は、（１）〜（６）のいずれか１に記載の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
（８）本発明は、（７）に記載の形質転換体を培養し、該培養物からPDCを採取することを特徴とする、PDCの製造方法を提供する。
（９）本発明は、（１）〜（６）のいずれか１に記載の組換えベクターの発現により得られるタンパク質を提供する。 (6) The set according to any one of (1) to (5), wherein the 3MGA 3,4-dioxygenase gene is derived from Sphingobium paucimobilis SYK-6 strain. A replacement vector is provided.
(7) The present invention provides a transformant comprising the recombinant vector according to any one of (1) to (6).
(8) The present invention provides a method for producing PDC, which comprises culturing the transformant according to (7) and collecting PDC from the culture.
(9) The present invention provides a protein obtained by expressing the recombinant vector according to any one of (1) to (6).

本発明は、化学構造の多様性や複雑な高分子構造を持ち利用が困難なリグニンなどの植物芳香族成分の加水分解や酸化分解、可溶媒分解などの化学的分解法や、超臨界水や超臨界有機溶媒による物理化学的分解法などの低分子化技術で生成する、シリンガアルデヒド、シリンガ酸、バニリン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、バニリン酸、p-ヒドロキシ安息香酸、プロトカテク酸等の混合物から、微生物機能を利用することにより、単一の化合物、２-ピロン−４，６-ジカルボン酸を発酵生産することを可能とした。
特に、従来発明では変換が不十分であったシリンガアルデヒド、シリンガ酸からの効率的な変換を実証した。 The present invention relates to chemical decomposition methods such as hydrolysis, oxidative decomposition, and solvolysis of plant aromatic components such as lignin, which have a variety of chemical structures and complex polymer structures, which are difficult to use, supercritical water, From a mixture of syringaldehyde, syringic acid, vanillin, p-hydroxybenzaldehyde, vanillic acid, p-hydroxybenzoic acid, protocatechuic acid, etc., produced by low molecular weight technology such as physicochemical decomposition method with supercritical organic solvent, By utilizing the microbial function, it was possible to fermentatively produce a single compound, 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid.
In particular, efficient conversion from syringaldehyde or syringic acid, which was insufficient in the conventional invention, was demonstrated.

シリンガアルデヒド、バニリン又はp-ヒドロキシベンズアルデヒドからPDCへの変換工程図である。It is a conversion process diagram from syringaldehyde, vanillin or p-hydroxybenzaldehyde to PDC. DesZの塩基配列である。This is the base sequence of DesZ. DesZのアミノ酸配列である。Amino acid sequence of DesZ. 組換えベクターpJBV2Zの作製方法を示す図である。It is a figure which shows the preparation methods of recombinant vector pJBV2Z. 実施例２におけるPDCの生産を示すTLCである。4 is a TLC showing production of PDC in Example 2. 実施例２における培養時間に対するPDCの生成濃度を示すグラフである。4 is a graph showing the production concentration of PDC with respect to the culture time in Example 2. 実施例３におけるPDCの生産を示すTLCである。4 is a TLC showing production of PDC in Example 3. 実施例３における培養時間に対するPDCの生成濃度を示すグラフである。6 is a graph showing the production concentration of PDC with respect to the culture time in Example 3. 比較例１におけるPDCの生産を示すTLCである。3 is a TLC showing the production of PDC in Comparative Example 1. 比較例２におけるPDCの生産を示すTLCである。4 is a TLC showing production of PDC in Comparative Example 2. 比較例２における培養時間に対するPDCの生成濃度を示すグラフである。6 is a graph showing the production concentration of PDC with respect to the culture time in Comparative Example 2.

本発明は、シリンガアルデヒドやシリンガ酸などといったリグニン分解物からPDCを製造するプロセスを触媒するための酵素遺伝子を含む組換えベクターを提供する。本発明の組換えベクターは、具体的には、３−Ｏ−メチルガリック酸（3MGA）を２−ピロン−４，６-ジカルボン酸へと酸化することで、シリンガアルデヒドやシリンガ酸からPDCを製造するプロセスを触媒する配列番号１に示す塩基配列から成る3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ（DesZ）遺伝子を含むことを特徴とする。DesZ遺伝子配列は既知配列であり、Accession Number: AB110976として登録され、スフィンゴビウム・パウシモビリス（S. paucimobilis）SYK-6株に由来する(J. Bacteriol 2004 186(15):4951-9)。   The present invention provides a recombinant vector containing an enzyme gene for catalyzing the process of producing PDC from a lignin degradation product such as syringaldehyde or syringic acid. Specifically, the recombinant vector of the present invention oxidizes 3-O-methylgallic acid (3MGA) to 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid, thereby converting PDC from syringaldehyde or syringic acid. It contains a 3MGA 3,4-dioxygenase (DesZ) gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 that catalyzes the production process. The DesZ gene sequence is a known sequence, registered as Accession Number: AB110976, and derived from S. paucimobilis SYK-6 strain (J. Bacteriol 2004 186 (15): 4951-9).

本発明の組換えベクターはさらに好ましくは、DesZ遺伝子に加え、シリンガアルデヒドをシリンガ酸に変換するバニリン、シリンガアルデヒド・p−ヒドロキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（LigV2）遺伝子（配列番号３）と、シリンガ酸を３−Ｏ−メチルガリック酸に変換するバニリン酸・シリンガ酸ディメチラーゼ（VanA, VanB）遺伝子（配列番号５、配列番号７）とを含む。このように、本発明に係る組換えベクターはDesZ遺伝子と、LigV2遺伝子と、VanA及びVanB遺伝子とを含むことで、シリンガアルデヒド→シリンガ酸→3GMA→PDCに至る変換過程を触媒できる。     More preferably, the recombinant vector of the present invention contains, in addition to the DesZ gene, vanillin for converting syringaldehyde to syringate, a syringaldehyde / p-hydroxybenzaldehyde dehydrogenase (LigV2) gene (SEQ ID NO: 3), and syringate. And vanillic acid / syringate demethylase (VanA, VanB) genes (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7) to be converted into 3-O-methylgallic acid. Thus, the recombinant vector according to the present invention can catalyze the conversion process of syringaldehyde → syringic acid → 3GMA → PDC by including the DesZ gene, the LigV2 gene, and the VanA and VanB genes.

また、本発明の組換えベクターはさらに好ましくは、3MGAを、DesZほど効率的ではないが、PDCへと酸化する、プロトカテク酸4,5−ジオキシゲナーゼ（LigA，LigB又はPmdA, PmdB）遺伝子、４−カルボキシ−2−ヒドロキシムコン酸−6−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(LigC又はPmdC）遺伝子を更に含んでよい。これにより、シリンガアルデヒド→シリンガ酸→3GMＡ→PDCに至る変換過程はなお一層触媒される。   In addition, the recombinant vector of the present invention is more preferably a protocatechuate 4,5-dioxygenase (LigA, LigB or PmdA, PmdB) gene that oxidizes 3MGA to PDC, although it is not as efficient as DesZ. -Carboxy-2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde dehydrogenase (LigC or PmdC) gene may further be included. This further catalyzes the conversion process of syringaldehyde → syringic acid → 3GMA → PDC.

なおさらに、本発明の組換えベクターは好ましくは、リグニン分解物であるバニリンをバニリン酸へと酸化する、あるいはリグニン分解物であるｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドをｐ−ヒドロキシ安息香酸へと酸化する、あるいはシリンガアルデヒドをシリンガ酸へと酸化するベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ（LigV）遺伝子、及び／又はｐ−ヒドロキシ安息香酸をプロトカテク酸へと酸化するp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（PobA）遺伝子を更に含んでよい。これにより、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸（PCA）→PDCに至る変換過程や、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド→ｐ−ヒドロキシ安息香酸→PCA→PDCに至る変換過程は一層触媒される。   Still further, the recombinant vector of the present invention preferably oxidizes vanillin, which is a lignin degradation product, to vanillic acid, or oxidizes p-hydroxybenzaldehyde, which is a lignin degradation product, to p-hydroxybenzoic acid, or It may further comprise a benzaldehyde dehydrogenase (LigV) gene that oxidizes lingaldehyde to syringate and / or a p-hydroxybenzoate hydroxylase (PobA) gene that oxidizes p-hydroxybenzoate to protocatechuic acid. Thereby, the conversion process from vanillin → vanillic acid → protocatechuic acid (PCA) → PDC and the conversion process from p-hydroxybenzaldehyde → p-hydroxybenzoic acid → PCA → PDC are further catalyzed.

DesZ、VanA, VanB, LigA, LigB, LigC, LigV, PobA遺伝子及びその遺伝子産物は全て公知である。VanA, VanB はそれぞれ特開2005-278549号公報に記載の配列番号１、２、３で示されるDNA分子からなる遺伝子に相当し、LigA、LigB、LigCは、それぞれ、同公報に記載の配列番号14、16、18で示されるDNA分子からなる遺伝子に相当し、LigVは同広報に記載の配列番号21で示されるDNA分子からなる遺伝子に相当する。また、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440由来のPobA遺伝子は、Accession No．NC 002947としてNCBIに登録されている。これらの各遺伝子には、上記の各配列番号又はAccession No．で特定されたDNA分子の他に、そのDNA分子と相補的な塩基配列からなるDNAと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつそのDNA分子と同一の活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子も含まれる。 The DesZ, VanA, VanB, LigA, LigB, LigC, LigV, PobA genes and their gene products are all known. VanA and VanB correspond to genes consisting of DNA molecules represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 described in JP-A-2005-278549, respectively. LigA, LigB, and LigC are respectively SEQ ID NOs described in the same publication LigV corresponds to a gene consisting of a DNA molecule represented by SEQ ID NO: 21 described in the publication. The PobA gene derived from Pseudomonas putida KT2440 is Accession No. NC It is registered with NCBI as 002947. Each of these genes has the above SEQ ID No. or Accession No. In addition to the DNA molecule specified in 1., a DNA molecule that hybridizes with a DNA comprising a complementary base sequence to the DNA molecule under highly stringent conditions and encodes a polypeptide having the same activity as the DNA molecule Is also included.

LigV2は特願2009-221306に記載されている新規遺伝子である。LigV2は、添付の図１においてLigVが触媒する酸化反応、すなわちシリンガアルデヒドからシリンガ酸への反応、及びp-ヒドロキシベンズアルデヒドからp-ヒドロキシ安息香酸への反応を、LigVよりも効率良く進行させる。   LigV2 is a novel gene described in Japanese Patent Application No. 2009-221306. LigV2 advances the oxidation reaction catalyzed by LigV in FIG. 1, that is, the reaction from syringaldehyde to syringic acid and the reaction from p-hydroxybenzaldehyde to p-hydroxybenzoic acid more efficiently than LigV.

LigV2遺伝子は、配列番号３や４の配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により製造、取得することができる。具体的には、本発明の遺伝子が発現される微生物、例えばスフィンゴビウム・パウシモビリス（S. paucimobilis）SYK-6株より、常法に従ってゲノムDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブ等を用いて所望クローンを選択することにより製造することができる。上記において、SYK-6株からの全RNAの分離、mRNAの分離及び精製、ゲノムDNAの取得及びそのクローニングなどは、いずれも常法に従って行うことができる。 The LigV2 gene can be produced and obtained by a general genetic engineering technique based on the sequence information of SEQ ID NOs: 3 and 4. Specifically, a genomic DNA library is prepared from a microorganism in which the gene of the present invention is expressed, for example, S. paucimobilis SYK-6 strain according to a conventional method. It can be produced by selecting a desired clone using an appropriate probe specific to the gene. In the above, isolation of total RNA from SYK-6 strain, isolation and purification of mRNA, acquisition of genomic DNA, cloning thereof, and the like can be performed according to conventional methods.

LigV2遺伝子をゲノムDNAライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の各種方法に従うことができる。具体的方法としては、例えば、目的の該酸配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法など、及びこれらの組合せを例示することができる。   The method for screening the LigV2 gene from a genomic DNA library is not particularly limited, and various conventional methods can be used. Specific examples include a plaque hybridization method using a probe that selectively binds to the target acid sequence, a colony hybridization method, and a combination thereof.

上記方法において用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたDNAなどが一般的に使用できる。また、本発明の遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー及びアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることができる。   As the probe used in the above method, DNA chemically synthesized based on information on the base sequence of the gene of the present invention can be generally used. In addition, sense primers and antisense primers set based on the nucleotide sequence information of the gene of the present invention can be used as screening probes.

本発明の遺伝子の取得に際しては、PCR法（Science，230，1350（1985））によるDNA増幅法が好適に利用できる。増幅させたDNA断片の単離精製は、常法に従って行うことができる。例えばゲル電気泳動法などが挙げられる。上記方法に従って得られる本発明の遺伝子は、常法、例えばジデオキシ法（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA.，74，5463（1977））、マキサム−ギルバート法（Methods in Enzymology，65，499（1980））などに従って、その塩基配列を決定することができる。また、簡便には、市販のシークエンスキットなどを用いて、その塩基配列を決定することができる。   In obtaining the gene of the present invention, a DNA amplification method by PCR (Science, 230, 1350 (1985)) can be suitably used. Isolation and purification of the amplified DNA fragment can be performed according to a conventional method. Examples thereof include gel electrophoresis. The gene of the present invention obtained according to the above method can be obtained by conventional methods such as the dideoxy method (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)), the Maxam-Gilbert method (Methods in Enzymology, 65, 499). (1980)) and the like, the base sequence can be determined. For convenience, the base sequence can be determined using a commercially available sequence kit or the like.

PmdA、PmdB及びPmdC遺伝子も特願2009-221306に記載され、LigA遺伝子、LigB遺伝子、LigC遺伝子と同様に、プロトカテク酸を効率良くPDCに変換する。したがって、本発明の組換えベクターは、LigA遺伝子と、LigB遺伝子と、LigC遺伝子とを含む代わりに、あるいはそれに加えて、PmdA、PmdB及びPmdC遺伝子又はその変異体を含んでよい。
配列番号１４に示すPmdA遺伝子（プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ αサブユニット遺伝子）は、プロトカテク酸 4,5-環を開裂し、プロトカテク酸を4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドに変換するジオキシゲナーゼのα-サブユニットをコードし、配列番号１６に示すPmdB遺伝子（プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ βサブユニット遺伝子）は、該酵素のβ-サブユニットをコードする。PmdA遺伝子及びPmdB遺伝子の塩基配列はいずれも、Accession No．AF459635としてNCBIに登録されている。また、配列番号１８に示すPmdC遺伝子（4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）は、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを開環してPDCに変換するデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、Accession No．AF305325としてNCBIに登録されている。 PmdA, PmdB and PmdC genes are also described in Japanese Patent Application No. 2009-221306, and protocatechuic acid is efficiently converted to PDC in the same manner as the LigA gene, LigB gene and LigC gene. Therefore, the recombinant vector of the present invention may contain PmdA, PmdB, and PmdC genes or variants thereof instead of or in addition to the LigA gene, the LigB gene, and the LigC gene.
The PmdA gene (protocatechuic acid 4,5-dioxygenase α subunit gene) shown in SEQ ID NO: 14 cleaves the protocatechuic acid 4,5-ring and converts protocatechuic acid to 4-carboxy-2-hydroxymuconate-6-semi The PmdB gene (protocatechuic acid 4,5-dioxygenase β subunit gene) shown in SEQ ID NO: 16 encodes the β-subunit of the enzyme, which encodes the α-subunit of dioxygenase that converts to aldehyde. The base sequences of the PmdA gene and the PmdB gene are both Accession No. It is registered with NCBI as AF459635. The PmdC gene (4-carboxy-2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde dehydrogenase gene) shown in SEQ ID NO: 18 opens 4-carboxy-2-hydroxymuconic acid-6-semialdehyde to PDC. Accession No. is a gene encoding a dehydrogenase to be converted. It is registered with NCBI as AF305325.

PmdA、PmdB、及びPmdC遺伝子は、例えば、コマモナス属 E6株（Comamonas sp. E6）から、コマモナス・テストステロニ BR6020株由来のゲノム（Accession NO．AF305325）を参考にして、PCR法〔Science，230，1350（1985）〕によるDNA／RNA増幅法を用いて獲得することができる。かかるPCR法の採用に際して使用されるプライマーは、コマモナス・テストステロニ BR6020株由来の遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法に従って調製できる。 PmdA, PmdB, and PmdC gene is, for example, from Comamonas sp. E6 shares (Comamonas sp. E6), and genome derived from Comamonas testosteroni BR6020 strain (Accession NO.AF305325) as a reference, PCR method [Science, 230,1350 (1985)] can be obtained using the DNA / RNA amplification method. Primers used for adopting such a PCR method can be appropriately set based on the sequence information of the gene derived from Comamonas testosteroni strain BR6020, and can be prepared according to a conventional method.

本明細書において、「高ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。高ストリンジェントな条件としては、同一性が高いDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、例えば、Molecular cloning a Laboratory manual 2nd edition（Sambrookら、1989）に記載の条件が挙げられる。具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の条件である60℃、1×SSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1％SDSで相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。   In the present specification, “high stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Highly stringent conditions are described in conditions where DNAs with high identity hybridize and DNAs with lower identity do not hybridize, eg, Molecular cloning a Laboratory manual 2nd edition (Sambrook et al., 1989). These conditions are listed. Specifically, conditions for hybridization at a salt concentration of 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, which are washing conditions in normal Southern hybridization, can be mentioned. .

本明細書において、「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、注目の配列番号のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、具体的には、好ましくは１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を意味し、付加には、両末端への１個〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。   In the present specification, the “amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added” means an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence of the SEQ ID NO of interest, specifically, Means an amino acid sequence in which preferably 1 to 20 amino acids, more preferably 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added, and the addition includes one to several amino acids at both ends. Includes appends.

本発明に係る遺伝子群を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNAなどが挙げられる。
プラスミドDNAとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＥＴ２１、ｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられる。ファージDNAとしてはλファージなどが挙げられる。更に、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。 The vector for inserting the gene group according to the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and the like.
Plasmid DNA includes plasmids for E. coli hosts such as pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET21, pET28, pGEX-4T, pQE-30, and pQE-60, plasmids for Bacillus subtilis such as pUB110 and pTP5, YEp13, YEp24, and YCp50. And yeast cell plasmids such as pBI221 and pBI121. Examples of phage DNA include λ phage. Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can be used.

本発明に係る遺伝子群をベクターに挿入するには、まず、本発明に係る各遺伝子を有する精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。   In order to insert the gene group according to the present invention into a vector, first, the purified DNA having each gene according to the present invention is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then introduced into a restriction enzyme site or a multicloning site of an appropriate vector DNA. A method of inserting and linking to a vector is employed.

本発明に係る遺伝子群は、その遺伝子群の機能が発揮されるようにベクターに組み込むことができる。すなわち、ベクターは、本発明に係る各遺伝子、プロモーター、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列）などを含むように調製することができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを使用することができる。   The gene group concerning this invention can be integrated in a vector so that the function of the gene group may be exhibited. That is, the vector should be prepared so as to include each gene according to the present invention, a promoter, and optionally a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (Shine-Dalgarno sequence) and the like. Can do. As a selection marker, for example, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a dihydrofolate reductase gene, or the like can be used.

プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの大腸菌由来のものやＴ７プロモーターなどのファージ由来のものが用いられる。更に、ｔａｃプロモーターなどのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。   Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. For example, those derived from Escherichia coli such as trp promoter, lac promoter, PL promoter and PR promoter, and those derived from phage such as T7 promoter are used. Furthermore, an artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used.

本発明に係る遺伝子群を含む組換えベクターを、当該遺伝子群が発現し得るように宿主中に導入することにより、形質転換することができる。形質転換の方法としては、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。   The recombinant vector containing the gene group according to the present invention can be transformed by introducing it into a host so that the gene group can be expressed. Examples of transformation methods include protoplast method, competent cell method, electroporation method and the like.

宿主としては、本発明の遺伝子群を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス属、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などのバチルス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）などのリゾビウム属に属する細菌類の他に、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母；シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジンなどから株化した植物細胞や該植物から調製したプロトプラスト；ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞；及び、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞が挙げられる。好ましくは、植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、p-ヒドロキシ安息香酸の分解代謝酵素機能を消失せしめたいわゆるPDC代謝能を有しない、あるいは代謝能の弱い宿主が使用され、その典型例としてシュードモナス・プチダPpY1100株が挙げられる。 The host is not particularly limited as long as it can express the gene group of the present invention. For example, Pseudomonas putida ( Pseudomonas putida ), Escherichia coli ( Escherichia coli ) Escherichia , Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ) Bacillus, Rhizobium meliloti ( Rhizobium meliloti ) Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , Pichia pastoris and other yeasts; Arabidopsis, tobacco, corn, rice, carrots, etc. Plant cells and protoplasts prepared from the plants; animal cells such as COS cells and CHO cells; and insect cells such as Sf9 and Sf21. Preferably, so-called PDC metabolism in which the function of degradation and metabolism of plant components-derived, chemically synthesized or petroleum-derived vanillin, syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid, protocatechuic acid, p-hydroxybenzaldehyde, p-hydroxybenzoic acid is lost. A host having no ability or low metabolic ability is used, and a typical example thereof is Pseudomonas putida PpY1100.

形質転換体の選択は、用いたプラスミドの選択マーカー、例えば形質転換体のDNA組換えにより獲得する薬剤耐性を指標にすることができる。薬剤耐性マーカーとしては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。これらの形質転換体の中から目的の組換えベクターを含有する形質転換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なDNA断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。プローブの標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等を用いることができる。   Selection of transformants can be based on the selection marker of the plasmid used, for example, drug resistance acquired by DNA recombination of the transformant. Examples of drug resistance markers include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, tetracycline resistance gene and the like. Among these transformants, selection of a transformant containing the target recombinant vector is preferably performed, for example, by a colony hybridization method using a partial DNA fragment of a gene as a probe. As a probe label, for example, a radioisotope, digoxigenin, an enzyme, or the like can be used.

得られた形質転換体は、糖類の他、窒素源、金属塩、ミネラル、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。培地のpHは、形質転換体が生育し得る範囲のpHであればよく、pH ６〜８程度に調整するのが好適である。培養は、好気的条件下で、１５〜４０℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜７日間振盪又は通気攪拌培養すればよい。   What is necessary is just to culture the obtained transformant on suitable conditions using the culture medium containing nitrogen source, a metal salt, a mineral, a vitamin, etc. other than saccharides. The pH of the medium may be in a range where the transformant can grow, and is preferably adjusted to about pH 6-8. The culture may be carried out under aerobic conditions at 15 to 40 ° C., preferably 28 to 37 ° C. for 2 to 7 days with shaking or aeration and stirring.

本発明の製造法によって得られるPDCは、生分解性のプラスチック材料、化学製品材料等として利用できる。   The PDC obtained by the production method of the present invention can be used as a biodegradable plastic material, chemical product material or the like.

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。   EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples at all.

実施例１
１．１ DesZ遺伝子の獲得及びPDC生産のための組換えプラスミドpJBDZおよびpJBV2Zの作製
DesZ遺伝子配列は既知配列であり、スフィンゴビウム・パウシモビリス（S. paucimobilis ）SYK-6株に由来し、Accession Number: AB110976で登録されている(J. Bacteriol 2004 186(15):4951-9)。DesZを含む1.7-kb SmaI-SphI断片及びそのアミノ酸配列を図２及び図３に示す。
なお、図２に示しているとおり、DesZ本来の開始コドンより手前にATGが存在するが、網掛けで示した領域にSD配列が存在するため、転写後その後ろに存在する本来のATGから翻訳が開始されると予想される。
以下で活性を確認した結果、DesZをlacプロモーター下流に存在させると、その活性を十分に発揮できることがわかった。 Example 1
1.1 Construction of recombinant plasmids pJBDZ and pJBV2Z for acquisition of DesZ gene and PDC production
The DesZ gene sequence is a known sequence, derived from S. paucimobilis SYK-6 strain, and registered under Accession Number: AB110976 (J. Bacteriol 2004 186 (15): 4951-9) . The 1.7-kb SmaI-SphI fragment containing DesZ and its amino acid sequence are shown in FIGS.
As shown in Fig. 2, ATG is present before the original start codon of DesZ, but since the SD sequence is present in the shaded area, it is translated from the original ATG that exists after the transcription. Is expected to start.
As a result of confirming the activity below, it was found that when DesZ is present downstream of the lac promoter, the activity can be sufficiently exerted.

DesZ遺伝子を図４に記載のとおりにして、制限酵素処理、末端の平滑化、末端の脱リン酸化、を適宜行い連結した。なお、各遺伝子はLacZ のαフラグメントとインフレームで接続されlac promoterごと切り出され、連結された。詳しくは、以下のとおりにして組換えプラスミドを作製した。   The DesZ gene was ligated by performing restriction enzyme treatment, terminal blunting, and terminal dephosphorylation as appropriate as shown in FIG. Each gene was connected to the LacZ α-fragment in-frame and excised together with the lac promoter. Specifically, a recombinant plasmid was prepared as follows.

１．２ DesZを含むpJBDZの作成
Journal of Bacteriology, 186 (15), pp. 4951-4959(2004)に記載のとおりにして作製したpBX2FからDesZを含む2.7-kb SalI-XhoI断片をpBluescriptIIKS(+)のSalI-XhoIに挿入し、組み換えプラスミドpBXSA1を作製した（図４）。pBXSA1を制限酵素SmaI及びSphIにより切断した後末端平滑化によって得られるDNA断片（1.7 kb）と、pBluescriptIISK(+)を制限酵素NotIにより切断した後末端平滑化によって得られるDNA断片とを、Ｔ４DNAリガーゼ（ロッシュ製）により結合させることにより、組み換えプラスミドpBSDZを作製した。pBSDZを制限酵素VspI及びXbaIにより切断した後末端平滑化によって得られるDNA断片と、pJB866（U82001）を制限酵素HindIIIにより切断した後末端平滑化によって得られるDNA断片とを、Ｔ４DNAリガーゼ（ロッシュ製）により結合させることにより、組み換えプラスミドpJBDZを作製した。 1.2 Creation of pJBDZ including DesZ
Inserting a 2.7-kb SalI-XhoI fragment containing DesZ from pBX2F prepared as described in Journal of Bacteriology, 186 (15), pp. 4951-4959 (2004) into SalI-XhoI of pBluescriptIIKS (+), A recombinant plasmid pBXSA1 was prepared (FIG. 4). A DNA fragment (1.7 kb) obtained by cleaving pBXSA1 with restriction enzymes SmaI and SphI and then blunting the ends, and a DNA fragment obtained by cleaving pBluescriptIISK (+) with the restriction enzyme NotI and then blunting the ends, T4 DNA ligase Recombinant plasmid pBSDZ was prepared by ligation using (Roche). A DNA fragment obtained by cleaving pBSDZ with restriction enzymes VspI and XbaI and then blunting the end, and a DNA fragment obtained by cleaving pJB866 (U82001) with restriction enzyme HindIII and then blunting the end, T4 DNA ligase (Roche) To produce a recombinant plasmid pJBDZ.

１．３ LigV2を含むpSKL2ifの作成
LigV2を含むpSKL2ifは特願2009-221306に準じて作成した。簡単には、配列番号３で示すLigV2遺伝子を以下のプライマー：
uni-primer：5’-GGCGCTGAAGTCCGCCGC-3’ （配列番号２５）
rev-primer：5’-CTGCAGGCCTATCTCGAGAC-3’ （配列番号２６）
を用いて、ＰＣＲ法により増幅させた。塩基配列を有するアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子LigV2を含む1.7ｋｂのBamHI-PstI遺伝子断片をpBluescriptIIKS(+)のBamHI-PstIに挿入し、組み換えプラスミドpSKL2ifを作製した（図４）。PCRの反応条件は、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜1分間（アニーリング）、72℃で２分間（伸長）から成る反応工程を１サイクルとして、30サイクル行った後、72℃で７分間反応させた。増幅したLigV2遺伝子をpBluescriptIISK(-)のMCSに挿入し、組み換えプラスミドpSKL2ifを作製した（図４）。 1.3 Creation of pSKL2if including LigV2
PSKL2if including LigV2 was created according to Japanese Patent Application No. 2009-221306. Briefly, the LigV2 gene shown in SEQ ID NO: 3 is converted into the following primers:
uni-primer: 5'-GGCGCTGAAGTCCGCCGC-3 '(SEQ ID NO: 25)
rev-primer: 5'-CTGCAGGCCTATCTCGAGAC-3 '(SEQ ID NO: 26)
Was amplified by the PCR method. A 1.7 kb BamHI-PstI gene fragment containing the aldehyde dehydrogenase gene LigV2 having a base sequence was inserted into BamHI-PstI of pBluescriptIIKS (+) to prepare a recombinant plasmid pSKL2if (FIG. 4). PCR reaction conditions were as follows: 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), 72 ° C. for 2 minutes (extension). The reaction was carried out at 72 ° C. for 7 minutes. The amplified LigV2 gene was inserted into the MCS of pBluescriptIISK (−) to prepare a recombinant plasmid pSKL2if (FIG. 4).

１．４ DesZ 及びLigV2を含むpJBV2Zの作成
次いで、pJBDZを制限酵素NotIにより切断した後末端平滑化によって得られるDNA断片と、pSKL2ifを制限酵素VspI及びSalIにより切断した後末端平滑化によって得られるDNA断片とを、T4DNAリガーゼ（ロッシュ製）により結合させることにより、組み換えプラスミドpJBV2Zを作製した（図４）。 1.4 Preparation of pJBV2Z containing DesZ and LigV2 Next, pJBDZ was cleaved with restriction enzyme NotI and then DNA fragment obtained by end blunting, and pSKL2if was cleaved with restriction enzymes VspI and SalI and DNA obtained by end blunting The fragment was ligated with T4 DNA ligase (Roche) to produce a recombinant plasmid pJBV2Z (FIG. 4).

１．５ VanA, VanB, PobA, LigV, LigA,B,Cを含むpVaPoLigVABCの作成
PobA遺伝子を以下のプライマー：
uni-primer：5’-TCGAGCAATGGCAAACCCTAACAGCAGATG-3' （配列番号２７）
rev-primer：5’-CTAGAGGCTTGGTGAAAAACGCCTGACCCG-3' （配列番号２８）
を用いて、PCR法により増幅させた。PCRの反応条件は、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜１分間（アニーリング）、72℃で２分間（伸長）から成る反応工程を１サイクルとして、30サイクル行った後、72℃で７分間反応させた。PobA遺伝子を配列番号２２に、アミノ酸配列を配列番号２３に示す。 1.5 Creation of pVaPoLigVABC including VanA, VanB, PobA, LigV, LigA, B, C
The following primers for the PobA gene:
uni-primer: 5'-TCGAGCAATGGCAAACCCTAACAGCAGATG-3 '(SEQ ID NO: 27)
rev-primer: 5'-CTAGAGGCTTGGTGAAAAACGCCTGACCCG-3 '(SEQ ID NO: 28)
Was amplified by the PCR method. PCR reaction conditions were as follows: 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), 72 ° C. for 2 minutes (extension), and 30 cycles. The reaction was carried out at 72 ° C. for 7 minutes. The PobA gene is shown in SEQ ID NO: 22, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 23.

増幅したPobA遺伝子をpBluescriptIISK(+)のMCSに挿入し、組み換えプラスミドpPobAを作製した。特開2005‐278549号公報の図16に記載のプラスミドpULVを制限酵素Vsp I及びHindIIIにより切断した後に末端を平滑化して得られるDNA断片と、pPobAを制限酵素HindIIIによって切断した後に末端を平滑化して得られるDNA断片とを、T4DNAリガーゼにより結合させることにより、組換えベクターpPobALigVを作製した。次いで、特開2005−278549号公報に記載のpKTVLABCを制限酵素Xba Iによって部分消化した後に末端を平滑化して得られるDNA断片をセルフライゲーションし、LigABC下流のXba Iサイトを欠損させて（サイトデリーション）、組換えベクターpDVZ21Xを作製した。pDVZ21Xを制限酵素Xba Iによって部分消化した後に末端を平滑化して得られるDNA断片と、前記の組換えベクターpPobALigVとを制限酵素Vsp I及びXho Iにより切断した後に末端を平滑化して得られるDNA断片とを、T4DNAリガーゼにより結合させることにより、組換えベクターpVaPoLigVABCを作製した（図４）。   The amplified PobA gene was inserted into MCS of pBluescriptIISK (+) to prepare a recombinant plasmid pPobA. A DNA fragment obtained by cutting the plasmid pULV described in FIG. 16 of JP-A-2005-278549 with restriction enzymes Vsp I and HindIII and then blunting the ends, and after cutting pPobA with the restriction enzyme HindIII and blunting the ends. The recombinant DNA pPobALigV was prepared by ligating the obtained DNA fragment with T4 DNA ligase. Next, a DNA fragment obtained by partially digesting pKTVLABC described in JP-A-2005-278549 with the restriction enzyme Xba I and then blunting the ends was self-ligated, and the Xba I site downstream of LigABC was deleted (site deletion). The recombinant vector pDVZ21X was prepared. DNA fragment obtained by partially digesting pDVZ21X with restriction enzyme Xba I and then blunting the ends, and DNA fragment obtained by cutting the recombinant vector pPobALigV with restriction enzymes Vsp I and Xho I and then blunting the ends Were combined with T4DNA ligase to prepare a recombinant vector pVaPoLigVABC (FIG. 4).

１．６ 宿主への遺伝子の導入
植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸のいずれかからの分解代謝酵素機能、及び２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物であるシュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）を、LB液体培地500mlで、28℃23時間培養し氷中で30分冷却した。4℃10分10000rpmで遠心集菌し、500mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて250mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。さらに125mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁し0℃にて保持した。 1.6 Introduction of Gene into Host Degradative metabolic enzyme function from plant component-derived, chemically synthesized or petroleum-derived vanillin, syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid, or protocatechuic acid, and 2-pyrone-4, Pseudomonas bacterium ( Pseudomonas putida PpY1100), a microorganism that has lost the function of degrading enzyme for 6-dicarboxylic acid, was cultured in LB liquid medium 500 ml at 28 ° C. for 23 hours and cooled in ice for 30 minutes. The cells were collected by centrifugation at 10000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, washed gently with 500 ml of 0 ° C. distilled water, and then collected again by centrifugation. Subsequently, the cells were gently washed with 250 ml of 0 ° C. distilled water and then collected by centrifugation. Further, the cells were gently washed with 125 ml of 0 ° C. distilled water and collected by centrifugation. The collected microbial cells were suspended in distilled water containing 10% glycerol and kept at 0 ° C.

１．４で作製した上記pJBV2Zと１．５で作製した上記pVaPoLigVABCを、上記PpY1100株に導入した。プラスミドpJBV2ZおよびpVaPoLigVABCを保持する株をPpY1100-V2Zplus株とした。プラスミドpVaPoLigVABCを保持する株をPpY1100-VaPo株とした。   The pJBV2Z prepared in 1.4 and the pVaPoLigVABC prepared in 1.5 were introduced into the PpY1100 strain. A strain carrying the plasmids pJBV2Z and pVaPoLigVABC was designated as PpY1100-V2Zplus strain. A strain carrying the plasmid pVaPoLigVABC was designated as PpY1100-VaPo strain.

実施例２
シュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）にPDC発酵生産プラスミドpJBV2ZとpVaPoLigVABCを導入した形質転換細胞によりシリンガ酸からPDCの製造に関する実施例（5リットルの培養液での変換試験）
（１）PDCを発酵生産するための多段反応プロセスの酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドpJBV2Zを大腸菌JM109株に形質転換し、25 mg/Lのテトラサイクリンを含むLB培地（10ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpJBV2Zを抽出した。また、組み換えプラスミドpVaPoLigVABCを大腸菌JM109株に形質転換し、25 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地（10ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpVaPoLigVABCを抽出した。
（２）PDC代謝能を消失せしめた微生物であるシュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）を、LB液体培地200mlで、28℃ 24時間培養し氷中で30分冷却した。4℃ 10分10000rpmで遠心集菌し、200mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて150mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。さらに100mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁し0℃にて保持した。
（３）（１）のプラスミドpJBV2ZとpVaPoLigVABCを約0.05μgを含む蒸留水4μlを0.2cmのキュベットに入れ、（２）の10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した細胞液40μlを加え、（25μF、2500V、12msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。
（４）上記処理した細胞全量を10mlのLB液体培地に接種し、28℃で6時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め25 mg/Lのカナマイシン、テトラサイクリンを含むLB平板に塗布し28℃で48時間培養し、プラスミドpJBV2ZとpVaPoLigVABCを保持するカナマイシン、テトラサイクリン耐性を示す形質転換株を得た。本菌をPseudomonas putida PpY1100-V2Zplus株と名づけた。
（５）PpY1100-V2Zplus株を、200mlのLB液体培地（25 mg/Lのカナマイシン、テトラサイクリンを含む）に接種し28℃で16時間培養し前培養菌体懸濁液とした。5 LのLB液体培地及び消泡剤（Antiform A） 3 mlを10L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したPpY1100-V2Zplus株の前培養菌体懸濁液50mlを混合し、28℃ 700 rpmの通気攪拌下、OD660＝10〜14まで培養した（10時間〜12時間）。
（６）OD660＝10〜14に達した発酵槽の培養液に、基質であるシリンガ酸50gを含む0.1NのNaOH水溶液（pH8.0に調整）500mlを、ペリスタポンプを用いて10時間かけて添加した。反応の進行に伴う２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の生成により、培養液のpHが低下する。それを防ぐためpHセンサーに連結したペリスタポンプで5NのNaOH溶液を添加して培養液のpHを維持した。
反応の進行はThin Layer Chromatography（TLC）によって確認した。図５に示す様に、添加したシリンガ酸は基質添加36時間で殆ど消失することが確認された。反応液中の２−ピロン−４，６−ジカルボン酸定量の結果は図６に示すように約49.2mM（収率97.6％）検出された。
（７）反応終了後、発酵槽の培地をプラスチック容器（バケツ）に移した。培養液から遠心分離（6000rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH3.5にし低温で保存した。２−ピロン−４，６-ジカルボン酸は、特開2008-79603号公報に示す方法に従い精製し、高純度のPDCを得た。 Example 2
Example of PDC production from syringic acid by transformed cells with PDC fermentation production plasmids pJBV2Z and pVaPoLigVABC introduced into Pseudomonas bacteria ( Pseudomonas putida PpY1100) (conversion test in 5 liter culture solution)
(1) Recombinant plasmid pJBV2Z containing the enzyme gene of the multistage reaction process for fermentative production of PDC was transformed into E. coli strain JM109, and 18 hours at 37 ° C in LB medium (10 ml) containing 25 mg / L tetracycline Recombinant plasmid pJBV2Z was extracted from cultured cells grown by shaking. In addition, the recombinant plasmid pVaPoLigVABC was transformed into E. coli strain JM109, cultured in LB medium (10 ml) containing 25 mg / L kanamycin for 18 hours at 37 ° C., and the recombinant plasmid pVaPoLigVABC was extracted from the grown cultured cells. .
(2) Pseudomonas bacteria ( Pseudomonas putida PpY1100), a microorganism that has lost its ability to metabolize PDC, was cultured in 200 ml of LB liquid medium at 28 ° C. for 24 hours and cooled in ice for 30 minutes. The cells were collected by centrifugation at 10000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, washed gently with 200 ml of 0 ° C. distilled water and then collected again by centrifugation. Subsequently, the cells were gently washed with 150 ml of 0 ° C. distilled water and collected by centrifugation. Further, after gentle washing with 100 ml of 0 ° C. distilled water, the cells were collected by centrifugation. The collected microbial cells were suspended in distilled water containing 10% glycerol and kept at 0 ° C.
(3) Put 4 μl of distilled water containing about 0.05 μg of the plasmid pJBV2Z and pVaPoLigVABC of (1) in a 0.2 cm cuvette, add 40 μl of the cell solution suspended in distilled water containing 10% glycerol of (2), ( 25 μF, 2500 V, 12 msec).
(4) The total amount of the treated cells was inoculated into 10 ml of LB liquid medium and cultured at 28 ° C. for 6 hours. After incubation, the cells were collected by centrifugation, applied to an LB plate containing 25 mg / L kanamycin and tetracycline, and cultured at 28 ° C. for 48 hours to obtain a kanamycin- and tetracycline-resistant transformant carrying the plasmids pJBV2Z and pVaPoLigVABC. . This bacterium was named Pseudomonas putida PpY1100-V2Zplus strain.
(5) The PpY1100-V2Zplus strain was inoculated into 200 ml of LB liquid medium (containing 25 mg / L kanamycin and tetracycline) and cultured at 28 ° C. for 16 hours to obtain a precultured cell suspension. Prepare 5 L of LB liquid medium and antifoaming agent (Antiform A) using 10 L capacity jar fermenter (fermentor), and then culture 50 Pml suspension of PpY1100-V2Zplus strain. Were mixed and cultured at 28 ° C. under aeration and aeration at 700 rpm until OD 660 = 10 to 14 (10 to 12 hours).
(6) To the culture solution of the fermenter that reached OD 660 = 10 to 14, 500 ml of 0.1N NaOH aqueous solution (adjusted to pH 8.0) containing 50 g of syringic acid as a substrate was added for 10 hours using a peristaltic pump. Added. Due to the production of 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid as the reaction proceeds, the pH of the culture solution decreases. To prevent this, a 5N NaOH solution was added with a peristaltic pump connected to a pH sensor to maintain the pH of the culture solution.
The progress of the reaction was confirmed by thin layer chromatography (TLC). As shown in FIG. 5, it was confirmed that the added syringic acid almost disappeared after 36 hours of substrate addition. As a result of quantification of 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid in the reaction solution, about 49.2 mM (yield 97.6%) was detected as shown in FIG.
(7) After completion of the reaction, the culture medium in the fermenter was transferred to a plastic container (bucket). The bacterial cell components were precipitated and removed from the culture by centrifugation (6000 rpm, 20 ° C.), and hydrochloric acid was added to the resulting supernatant to adjust the pH to 3.5 and stored at a low temperature. 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid was purified according to the method described in JP-A-2008-79603 to obtain highly pure PDC.

実施例３
３．１ シュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）にPDC発酵生産プラスミドpJBV2ZとpVaPoLigVABCを導入した形質転換細胞によりシリンガアルデヒドからPDCの製造に関する実施例
（１）ＰＤＣを発酵生産するための多段反応プロセスの酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドpJBV2Zを大腸菌JM109株に形質転換し、25 mg/Lのテトラサイクリンを含むLB培地（10ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpJBV2Zを抽出した。また、組み換えプラスミドpVaPoLigVABCを大腸菌JM109株に形質転換し、25 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地（10ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpVaPoLigVABCを抽出した。
（２）植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、p-ヒドロキシ安息香酸の分解代謝酵素機能を消失せしめた微生物であるシュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）を、LB液体培地200mlで、28℃ 24時間培養し氷中で30分冷却した。4℃ 10分10000rpmで遠心集菌し、200mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて150mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。さらに100mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁し0℃にて保持した。
（３）（１）のプラスミドpJBV2ZとpVaPoLigVABCを約0.05μgを含む蒸留水4μlを0.2cmのキュベットに入れ、（２）の10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した細胞液40μlを加え、（25μF、2500V、12msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。
（４）上記処理した細胞全量を10mlのLB液体培地に接種し、28℃で6時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め25 mg/Lのカナマイシン、テトラサイクリンを含むLB平板に塗布し28℃で48時間培養し、プラスミドpJBV2ZとpVaPoLigVABCを保持するカナマイシン、テトラサイクリン耐性を示す形質転換株を得た。本菌をPseudomonas putida PpY1100-V2Zplus株と名づけた。
（５）PpY1100-V2Zplus株を、200mlのLB液体培地（25 mg/Lのカナマイシン、テトラサイクリンを含む）に接種し28℃で16時間培養し前培養菌体懸濁液とした。５LのLB液体培地及び消泡剤（Antiform A） 3 mlを10 L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したPpY1100-V2Zplus株の前培養菌体懸濁液50mlを混合し、28℃ 700 rpm/minの通気攪拌下、OD660＝10〜14まで培養した（10時間〜12時間）。
（６）OD660＝10〜14に達した発酵槽の培養液に、基質であるシリンガアルデヒド25 gを含む10%のEtOH水溶液（EtOHの終濃度1%）500mlを、ペリスタポンプを用いて10時間かけて添加した。反応の進行に伴う２-ピロン−４，６-ジカルボン酸の生成により、培養液のpHが低下する。それを防ぐためpHセンサーに連結したペリスタポンプで5NのNaOH溶液を添加して培養液のpHを維持した。
反応の進行はThin Layer Chromatography（TLC）によって確認した。図７に示す様に、添加したシリンガアルデヒドは基質添加22時間で殆ど消失することが確認された。反応液中の２−ピロン−４，６−ジカルボン酸定量の結果は図８に示すように約28.7mM（収率98.5％）検出された。
（７）反応終了後、発酵槽の培地をプラスチック容器（バケツ）に移した。培養液から遠心分離（6000rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えpH3.5にし低温で保存した。２-ピロン−４，６-ジカルボン酸は、特開2008-79603号広報に示す方法に従い精製し高純度のPDCを得た。 Example 3
3.1 Example of PDC production from syringaldehyde by transformed cells introduced with PDC fermentation production plasmids pJBV2Z and pVaPoLigVABC into Pseudomonas bacterium ( Pseudomonas putida PpY1100) (1) Multistage reaction process for producing PDC by fermentation Recombinant plasmid pJBV2Z containing the enzyme gene was transformed into E. coli strain JM109, cultured in LB medium (10 ml) containing 25 mg / L tetracycline with shaking at 37 ° C for 18 hours. Extracted. In addition, the recombinant plasmid pVaPoLigVABC was transformed into E. coli strain JM109, cultured in LB medium (10 ml) containing 25 mg / L kanamycin for 18 hours at 37 ° C., and the recombinant plasmid pVaPoLigVABC was extracted from the grown cultured cells. .
(2) Microorganisms that have lost the functions of plant components-derived, chemically synthesized or petroleum-derived vanillin, syringaldehyde, vanillic acid, syringic acid, protocatechuic acid, p-hydroxybenzaldehyde, and p-hydroxybenzoic acid. Pseudomonas bacteria ( Pseudomonas putida PpY1100) were cultured in 200 ml of LB liquid medium at 28 ° C. for 24 hours and cooled in ice for 30 minutes. The cells were collected by centrifugation at 10000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, washed gently with 200 ml of 0 ° C. distilled water and then collected again by centrifugation. Subsequently, the cells were gently washed with 150 ml of 0 ° C. distilled water and collected by centrifugation. Further, after gentle washing with 100 ml of 0 ° C. distilled water, the cells were collected by centrifugation. The collected microbial cells were suspended in distilled water containing 10% glycerol and kept at 0 ° C.
(3) Put 4 μl of distilled water containing about 0.05 μg of the plasmid pJBV2Z and pVaPoLigVABC of (1) in a 0.2 cm cuvette, add 40 μl of the cell solution suspended in distilled water containing 10% glycerol of (2), ( 25 μF, 2500 V, 12 msec).
(4) The total amount of the treated cells was inoculated into 10 ml of LB liquid medium and cultured at 28 ° C. for 6 hours. After incubation, the cells were collected by centrifugation, applied to an LB plate containing 25 mg / L kanamycin and tetracycline, and cultured at 28 ° C. for 48 hours to obtain a kanamycin- and tetracycline-resistant transformant carrying the plasmids pJBV2Z and pVaPoLigVABC. . This bacterium was named Pseudomonas putida PpY1100-V2Zplus strain.
(5) The PpY1100-V2Zplus strain was inoculated into 200 ml of LB liquid medium (containing 25 mg / L kanamycin and tetracycline) and cultured at 28 ° C. for 16 hours to obtain a precultured cell suspension. Prepare 5 L of LB liquid medium and 3 ml of antifoam (Antiform A) using a 10 L jar fermenter (fermentor), and culture 50 Pml of PpY1100-V2Zplus strain precultured there. Were mixed and cultured at 28 ° C. under aeration and agitation at 700 rpm / min until OD 660 = 10 to 14 (10 to 12 hours).
(6) 500 ml of 10% EtOH aqueous solution (final concentration of EtOH 1%) containing 25 g of syringaldehyde as a substrate was added to the culture solution of the fermenter that reached OD 660 = 10-14 using a perista pump. Added over time. The production of 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid accompanying the progress of the reaction lowers the pH of the culture solution. To prevent this, a 5N NaOH solution was added with a peristaltic pump connected to a pH sensor to maintain the pH of the culture solution.
The progress of the reaction was confirmed by thin layer chromatography (TLC). As shown in FIG. 7, it was confirmed that the added syringaldehyde almost disappeared after 22 hours of substrate addition. As a result of quantification of 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid in the reaction solution, about 28.7 mM (yield 98.5%) was detected as shown in FIG.
(7) After completion of the reaction, the culture medium in the fermenter was transferred to a plastic container (bucket). The bacterial cell components were precipitated and removed from the culture by centrifugation (6000 rpm, 20 ° C.), and hydrochloric acid was added to the resulting supernatant to adjust the pH to 3.5 and stored at a low temperature. 2-Pyrone-4,6-dicarboxylic acid was purified according to the method disclosed in JP 2008-79603 A to obtain high-purity PDC.

比較例１
シュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）にPDC発酵生産プラスミドpVaPoLigVABCを導入した形質転換細胞によりシリンガ酸からPDCの製造に関する実施例
（１）PDCを発酵生産するための多段反応プロセスの酵素遺伝子を含む組み換えプラスミドpVaPoLigVABCを大腸菌JM109株に形質転換し、25 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地（10ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpVaPoLigVABCを抽出した。
（２）シュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）を、LB液体培地200mlで、28℃ 24時間培養し氷中で30分冷却した。4℃ 10分10000rpmで遠心集菌し、200mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて150mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。さらに100mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁し0℃にて保持した。
（３）（１）のプラスミドpVaPoLigVABCを約0.05μgを含む蒸留水4μlを0.2cmのキュベットに入れ、（２）の10％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した細胞液40μlを加え、（25μF、2500V、12msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。
（４）上記処理した細胞全量を10mlのLB液体培地に接種し、28℃で6時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め25 mg/Lのカナマイシンを含むLB平板に塗布し28℃で48時間培養し、プラスミドpVaPoLigVABCを保持するカナマイシン耐性を示す形質転換株を得た。本菌をPseudomonas putida PpY1100-VaPo株と名づけた。
（５）PpY1100-VaPo株を、200mlのLB液体培地（25 mg/Lのカナマイシンを含む）に接種し28℃で16時間培養し前培養菌体懸濁液とした。5 LのLB液体培地及び消泡剤（Antiform A） 3 mlを10 L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したPpY1100-VaPo株の前培養菌体懸濁液50mlを混合し、28℃ 700 rpmの通気攪拌下、OD660＝10〜14まで培養した（10時間〜12時間）。
（６）OD660＝10〜14に達した発酵槽の培養液に、基質であるシリンガ酸25 gを含む0.1NのNaOH水溶液（pH8.0に調整）500mlを、ペリスタポンプを用いて10時間かけて添加した。反応の進行に伴う２−ピロン−４，６-ジカルボン酸の生成により、培養液のpHが低下する。それを防ぐためpHセンサーに連結したペリスタポンプで5NのNaOH溶液を添加して培養液のpHを維持した。
反応の進行はThin Layer Chromatography（TLC）によって確認した。図９に示す様に、DesZ不在下では、基質添加40時間が経過しても3MGAの蓄積が見られ、PDCの生産量はわずかであった。 Comparative Example 1
Example of production of PDC from syringic acid by transformed cells in which PDC fermentation production plasmid pVaPoLigVABC was introduced into Pseudomonas bacterium ( Pseudomonas putida PpY1100) (1) Recombinant plasmid containing enzyme gene of multistage reaction process for fermentation production of PDC pVaPoLigVABC was transformed into Escherichia coli JM109 strain, and cultured with shaking in LB medium (10 ml) containing 25 mg / L kanamycin at 37 ° C. for 18 hours, and the recombinant plasmid pVaPoLigVABC was extracted from the grown cultured cells.
(2) Pseudomonas bacteria ( Pseudomonas putida PpY1100) were cultured in 200 ml of LB liquid medium at 28 ° C. for 24 hours and cooled in ice for 30 minutes. The cells were collected by centrifugation at 10000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, washed gently with 200 ml of 0 ° C. distilled water and then collected again by centrifugation. Subsequently, the cells were gently washed with 150 ml of 0 ° C. distilled water and collected by centrifugation. Further, after gentle washing with 100 ml of 0 ° C. distilled water, the cells were collected by centrifugation. The collected microbial cells were suspended in distilled water containing 10% glycerol and kept at 0 ° C.
(3) Put 4 μl of distilled water containing about 0.05 μg of the plasmid pVaPoLigVABC of (1) into a 0.2 cm cuvette, add 40 μl of cell suspension suspended in distilled water containing 10% glycerol of (2), (25 μF, (2500V, 12 msec).
(4) The total amount of the treated cells was inoculated into 10 ml of LB liquid medium and cultured at 28 ° C. for 6 hours. After incubation, the cells were collected by centrifugation and applied to an LB plate containing 25 mg / L kanamycin and cultured at 28 ° C. for 48 hours to obtain a kanamycin-resistant transformant carrying the plasmid pVaPoLigVABC. This bacterium was named Pseudomonas putida PpY1100-VaPo strain.
(5) The PpY1100-VaPo strain was inoculated into 200 ml of LB liquid medium (containing 25 mg / L kanamycin) and cultured at 28 ° C. for 16 hours to obtain a precultured cell suspension. Pre-cultured cell suspension of PpY1100-VaPo strain prepared by using 3 L of 5 L LB liquid medium and antifoaming agent (Antiform A) using 10 L jar fermenter (fermentor) 50 ml was mixed and cultured at 28 ° C. under aeration and agitation at 700 rpm until OD 660 = 10 to 14 (10 to 12 hours).
(6) To the culture solution of the fermenter that reached OD 660 = 10 to 14, 500 ml of 0.1N NaOH aqueous solution (adjusted to pH 8.0) containing 25 g of syringic acid as a substrate was applied for 10 hours using a peristaltic pump. Added. Due to the production of 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid as the reaction proceeds, the pH of the culture solution decreases. To prevent this, a 5N NaOH solution was added with a peristaltic pump connected to a pH sensor to maintain the pH of the culture solution.
The progress of the reaction was confirmed by thin layer chromatography (TLC). As shown in FIG. 9, in the absence of DesZ, 3MGA accumulation was observed even after 40 hours of substrate addition, and the amount of PDC produced was small.

比較例２
シュードモナス属細菌（Pseudomonas putida PpY1100）にPDC発酵生産プラスミドpJBligV2（特願2009-221306に記載）及びpVaPoLigVABCを導入した形質転換細胞によりシリンガアルデヒドからＰＤＣの製造に関する実施例 Comparative Example 2
Example of PDC production from syringaldehyde by transformed cells into which PDC fermentation production plasmid pJBligV2 (described in Japanese Patent Application No. 2009-221306) and pVaPoLigVABC were introduced into Pseudomonas bacterium (Pseudomonas putida PpY1100)

（１）pJBligV2の作成
ligV2遺伝子を以下のプライマー：
uni-primer：5’-GGCGCTGAAGTCCGCCGC-3’ （配列番号２５）
rev-primer：5’-CTGCAGGCCTATCTCGAGAC-3’ （配列番号２６）
を用いて、PCR法により増幅させた。PCRの反応条件は、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜１分間（アニーリング）、72℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、30サイクル行った後、72℃で７分間反応させた。 (1) Creation of pJBligV2
The following primers for the ligV2 gene:
uni-primer: 5'-GGCGCTGAAGTCCGCCGC-3 '(SEQ ID NO: 25)
rev-primer: 5'-CTGCAGGCCTATCTCGAGAC-3 '(SEQ ID NO: 26)
Was amplified by the PCR method. PCR reaction conditions were as follows: 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 2 minutes (extension). The reaction was carried out at 72 ° C. for 7 minutes.

増幅したligV2遺伝子をpBluescriptIISK-のMCSに挿入し、組み換えプラスミドpligV2を作製した。pligV2を制限酵素Vsp I及びSal Iにより切断した後に末端を平滑化して得られるDNA断片と、pJB866（U82001）を制限酵素BamH Iにより切断した後に末端を平滑化して得られるDNA断片とを、T4DNAリガーゼ（ロシュ製）により結合させることにより、組換えベクターpJBligV2を作製した。
（２）組換えベクターpVaPoLigVABC及び組換えベクターpJBligV2の抽出
実施例１．５で作製した組換えベクターpVaPoLigVABCを大腸菌XL-1株に形質変換し、25 mg/Lのカナマイシンを含むＬＢ培地（100 ml）にて３７℃で１８時間振とう培養し、増殖した培地細胞から組換えベクターpVaPoLigVABCを抽出した。また、pJBligV2（特願2009-221306）を同様に大腸菌XL-1株に形質転換し、25 mg/Lのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（100 ml）にて３７℃で１８時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組換えベクターpJBligV2を抽出した。 The amplified ligV2 gene pBluescriptIISK - Insert MCS to the, to prepare a recombinant plasmid PligV2. A DNA fragment obtained by cleaving pligV2 with restriction enzymes Vsp I and Sal I and then blunting the ends, and a DNA fragment obtained by cleaving pJB866 (U82001) with restriction enzyme BamH I and then blunting the ends, T4DNA A recombinant vector pJBligV2 was prepared by ligation with ligase (Roche).
(2) Extraction of Recombinant Vector pVaPoLigVABC and Recombinant Vector pJBligV2 The recombinant vector pVaPoLigVABC prepared in Example 1.5 was transformed into Escherichia coli XL-1, and LB medium containing 25 mg / L kanamycin (100 ml) ) At 37 ° C. for 18 hours, and the recombinant vector pVaPoLigVABC was extracted from the grown medium cells. Similarly, pJBligV2 (Japanese Patent Application No. 2009-221306) was transformed into Escherichia coli XL-1 strain, cultured in LB medium (100 ml) containing 25 mg / L tetracycline at 37 ° C. for 18 hours, and proliferated. Recombinant vector pJBligV2 was extracted from the cultured cells.

（３）シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PpY1100の集菌
シュードモナス・プチダPpY1100を、ＬＢ液体培地500 mlで、２８℃で２３時間培養し、氷中で３０分冷却した。４℃で１０分、10000 rpmで遠心集菌し、500 mlの０℃の蒸留水で温和に洗浄後、再び遠心集菌し、続いて250 mlの０℃の蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌し、更に、125 mlの０℃の蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PpY1100の細胞を、１０％グリセロールを含む蒸留水に懸濁し、０℃にて保持した。 (3) Pseudomonas putida (Pseudomonas putida) PpY1100 of harvested Pseudomonas putida PpY1100, LB liquid medium 500 ml, then 23 hours at 28 ° C., and then cooled for 30 minutes in ice. Centrifuge at 10 ° C. for 10 minutes at 4 ° C., gently wash with 500 ml of 0 ° C. distilled water, centrifuge again, and then gently wash with 250 ml of 0 ° C. distilled water, The cells were collected by centrifugation, further washed gently with 125 ml of distilled water at 0 ° C., and then collected by centrifugation. The collected cells of Pseudomonas putida PpY1100 were suspended in distilled water containing 10% glycerol and kept at 0 ° C.

（４）形質転換体の作製
（１）で抽出した組換えベクターpVaPoLigVABC、及び組換えベクターpJBligV2を約0.05μgずつ含む蒸留水４μｌを0.2 cmのキュベットに入れ、集菌したシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PpY1100細胞の細胞液40μｌを加え、25μF、2500 V、12 mescの条件でエレクトロポレーションにかけた。 (4) Preparation of transformant Pseudomonas putida ( Pseudomonas putida) collected by placing 4 μl of distilled water containing about 0.05 μg each of the recombinant vector pVaPoLigVABC extracted in (1) and about 0.05 μg of the recombinant vector pJBligV2 in a 0.2 cm cuvette. ) 40 μl of cell solution of PpY1100 cells was added, and electroporation was performed under the conditions of 25 μF, 2500 V, and 12 mesc.

処理した細胞全量を10 mlのＬＢ液体培地に接種し、２８℃で６時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め、25 mg/Lのカナマイシン及びテトラサイクリンを含むＬＢ平板に展開し、２８℃で４８時間培養し、組換えベクターpVaPoLigVABCとpJBligV2を保持するカナマイシン及びテトラサイクリン耐性を示す形質転換株を得た。本菌をシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PpY1100（pVaPoLigVABC，pJBligV2）株と名付けた。 The total amount of the treated cells was inoculated into 10 ml of LB liquid medium and cultured at 28 ° C. for 6 hours. After incubation, the cells are collected by centrifugation, spread on an LB plate containing 25 mg / L kanamycin and tetracycline, cultured at 28 ° C. for 48 hours, and transformed to have kanamycin and tetracycline resistance carrying the recombinant vectors pVaPoLigVABC and pJBligV2. Got the stock. This bacterium was named Pseudomonas putida PpY1100 (pVaPoLigVABC, pJBligV2) strain.

（５）形質転換体の培養
得られたシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PpY1100（pVaPoLigVABC，pJBligV2）株を、200 mlのＬＢ液体培地（25 mg/Lのカナマイシン及びテトラサイクリンを含む）に接種し、28℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。５ LのＬＢ液体培地及び消泡剤（Antiform A）３ mlを10 L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、ここに、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PpY1100（pVaPoLigVABC, pJBligV2）株の前培養菌体懸濁液200 mlを混合し、28℃で500 rpmの通気攪拌下、OD660＝１３〜１４まで１０時間〜１２時間培養した。この時点で、発酵槽から500 mlの培養液を三角フラスコに拭き取り、氷上で保存した。 (5) Culture of transformant The obtained Pseudomonas putida PpY1100 (pVaPoLigVABC, pJBligV2) strain was inoculated into 200 ml of LB liquid medium (containing 25 mg / L kanamycin and tetracycline). The cells were cultured at 0 ° C. for 16 hours to obtain a precultured cell suspension. Prepare 5 L of LB liquid medium and 3 ml of antifoaming agent (Antiform A) using 10 L capacity of jar fermenter (fermentor), where Pseudomonas putida PpY1100 (pVaPoLigVABC, pJBligV2) 200 ml of the precultured cell suspension of the strain was mixed and cultured at 28 ° C. under aeration and stirring at 500 rpm until OD 660 = 13-14 for 10-12 hours. At this point, 500 ml of the culture broth from the fermenter was wiped into an Erlenmeyer flask and stored on ice.

OD660＝１３〜１４に達した発酵槽の培養液に、基質であるシリンガアルデヒド10 g、50 mlエタノールを含む0.1 NのNaOH水溶液（pH 8.5に調製）500 mlを、ペリスタポンプを用いて５〜７時間かけて添加し、シリンガアルデヒドが2 ｇ/L（約11mM）の終濃度となるようにした。反応の進行に伴うPDCの生成により、培養液のpHが低下するが、それを防ぐためpHセンサーに連結したペリスタポンプで0.1 NのNaOH溶液を添加して培養液のpHを維持した。 To the culture medium of the fermenter that reached OD 660 = 13 to 14, 500 ml of 0.1 N NaOH aqueous solution (adjusted to pH 8.5) containing 10 g of syringaldehyde as a substrate and 50 ml of ethanol was added using a peristaltic pump. It was added over a period of ˜7 hours so that the final concentration of syringaldehyde was 2 g / L (about 11 mM). Although the pH of the culture broth was lowered due to the generation of PDC as the reaction progressed, a 0.1 N NaOH solution was added with a peristaltic pump connected to a pH sensor to prevent the pH of the broth.

反応の進行を図10にTLCで示す。また、反応液中のPDCの定量結果を図11に示す。図11において、×はPDCを、△はシリンガ酸からPDCへの変換の中間代謝物である3-0-メチルガリク酸（3MGA）を、□はシリンガ酸（SA）を、ひし形はシリンガアルデヒド（SAL）をそれぞれ示す。反応液中の２−ピロン−４，６-ジカルボン酸定量の結果は図10、11に示すように約1.5 mMであり、収率は約14%と低かった。   The progress of the reaction is shown by TLC in FIG. In addition, FIG. 11 shows the quantitative results of PDC in the reaction solution. In FIG. 11, X indicates PDC, Δ indicates 3-0-methylgallic acid (3MGA), an intermediate metabolite of syringic acid to PDC conversion, □ indicates syringic acid (SA), and rhombus indicates syringaldehyde ( SAL). The results of quantification of 2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid in the reaction solution were about 1.5 mM as shown in FIGS. 10 and 11, and the yield was as low as about 14%.

Claims (8)

下記（ａ−１）〜（ａ−４）のDNA分子と、
（a−1）配列番号１記載の3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ（DesZ）遺伝子のDNA分子;
（a−2）配列番号２記載の3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ（DesZ）のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ａ−３）配列番号１記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ａ−４）配列番号４記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ3MGA ３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；
さらには下記のDNA分子群とを含む組換えベクター：
ここで、前記DNA分子群は、（ｂ）LigV2遺伝子と、（ｃ）VanA及びVanB遺伝子との組み合わせから成る群より選ばれ；
（ｂ）LigV2遺伝子は下記（ｂ−１）〜（ｂ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｂ−１）配列番号３記載のDNA分子；
（ｂ−２）配列番号４記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｂ−３）配列番号３記載のDNA分子又はその相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｂ−４）配列番号４記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA分子、
（ｃ）VanA及びVanB遺伝子はそれぞれ下記（ｃ−１）〜（ｃ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｃ−１）配列番号５及び７記載のDNA分子；
（ｃ−２）配列番号６及び８記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｃ−３））配列番号５及び７記載のDNA分子の変異体、即ち、配列番号５及び７記載のDNA分子又はそれぞれの相補配列からなるDNA分子と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつバニリン酸、シリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有する２本のポリペプチドをコードするDNA分子；又は
（ｃ−４）配列番号６及び８記載のアミノ酸配列の変異体、即ち、配列番号６及び８記載のアミノ酸配列それぞれにおいて、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつバニリン酸、シリンガ酸に対してディメチラーゼ活性を有する2本のポリペプチドのいずれか一方又は両方をコードするDNA分子。 DNA molecules of the following (a-1) to (a-4);
(A-1) a DNA molecule of the 3MGA 3,4-dioxygenase (DesZ) gene described in SEQ ID NO: 1;
(A-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence of 3MGA 3,4-dioxygenase (DesZ) described in SEQ ID NO: 2;
(A-3) A DNA molecule that hybridizes with a DNA molecule comprising SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof under highly stringent conditions and encodes a polypeptide having 3MGA 3,4-dioxygenase activity Or (a-4) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids of SEQ ID NO: 4 have been deleted, substituted and / or added, and having 3MGA 3,4-dioxygenase activity; A DNA molecule encoding
In addition, a recombinant vector comprising the following DNA molecules:
Wherein the DNA molecule group is selected from the group consisting of (b) a LigV2 gene and (c) a combination of VanA and VanB genes;
(B) The LigV2 gene is any one of the following DNA molecules (b-1) to (b-4):
(B-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 3;
(B-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4;
(B-3) a DNA molecule that hybridizes with the DNA molecule of SEQ ID NO: 3 or its complementary sequence under highly stringent conditions and encodes a polypeptide having benzaldehyde dehydrogenase activity; or (b- 4) a DNA molecule encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 have been deleted, substituted and / or added, and having benzaldehyde dehydrogenase activity;
(C) Each of the VanA and VanB genes is a DNA molecule of any of the following (c-1) to (c-4),
(C-1) DNA molecules described in SEQ ID NOs: 5 and 7;
(C-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 6 and 8;
(C-3)) It hybridizes under high stringency conditions with variants of the DNA molecules described in SEQ ID NOs: 5 and 7, that is, DNA molecules described in SEQ ID NOs: 5 and 7, or DNA molecules comprising their complementary sequences. A DNA molecule encoding two polypeptides having dimethylase activity against vanillic acid and syringic acid; or (c-4) a variant of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 6 and 8, ie, SEQ ID NO: 6 And two polypeptides each having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added, and having a demethylase activity against vanillic acid or syringic acid. DNA molecules encoding either or both of さらに、ｄ）LigA遺伝子、（ｅ）LigB遺伝子、（ｆ）LigC遺伝子及びその組み合わせから成る群より選ばれDNA分子群を有する請求項１記載の組換えベクター：
ここで、前記DNA分子群は、；
（ｄ）LigA遺伝子は下記（ｄ−１）〜（ｄ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｄ−１）配列番号９記載のDNA分子；
（ｄ−２）配列番号１０記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｄ−３）配列番号９記載のDNA分子の変異体；又は
（ｄ−４）配列番号１０記載のDNA分子の変異体；
（ｅ）LigB遺伝子は下記（ｅ−１）〜（ｅ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｅ−１）配列番号１１記載のDNA分子；
（ｅ−２）配列番号１２記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｅ−３）配列番号１１記載のDNA分子の変異体；又は
（ｅ−４）配列番号１２記載のDNA分子の変異体；
（ｆ）DNA分子（LigC遺伝子）は下記（ｆ−１）〜（ｆ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｆ−１）配列番号１３記載のDNA分子；
（ｆ−２）配列番号１４記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｆ−３）配列番号１３記載のDNA分子の変異体；又は
（ｆ−４）配列番号１４記載のDNA分子の変異体。 The recombinant vector according to claim 1, further comprising a DNA molecule group selected from the group consisting of d) LigA gene, (e) LigB gene, (f) LigC gene and combinations thereof:
Here, the DNA molecule group includes:
(D) The LigA gene is any of the following DNA molecules (d-1) to (d-4):
(D-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 9;
(D-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(D-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 9; or (d-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 10;
(E) The LigB gene is any one of the following DNA molecules (e-1) to (e-4):
(E-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 11;
(E-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(E-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 11; or (e-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 12;
(F) DNA molecule (LigC gene) is any one of the following (f-1) to (f-4) DNA molecules,
(F-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 13;
(F-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(F-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 13; or (f-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 14. さらに、下記のDNA分子群を有する（１）〜（３）のいずれかに記載の組換えベクター：
ここで、前記DNA分子群は、（ｇ）PmdA遺伝子、（ｈ）PmdB遺伝子、（ｉ）PmdC遺伝子及びその組み合わせから成る群より選ばれ；
（ｇ）PmdA遺伝子は下記（ｇ−１）〜（ｇ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｇ−１）配列番号１５記載のDNA分子；
（ｇ−２）配列番号１６記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｇ−３）配列番号１５記載のDNA分子の変異体；又は
（ｇ−４）配列番号１６記載のDNA分子の変異体；
（ｈ）PmdB遺伝子は下記（ｈ−１）〜（ｈ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｈ−１）配列番号１７記載のDNA分子；
（ｈ−２）配列番号１８記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｈ−３）配列番号１７記載のDNA分子の変異体；又は
（ｈ−４）配列番号１８記載のDNA分子の変異体；
（ｉ）DNA分子（PmdC遺伝子）は下記（ｉ−１）〜（ｉ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｉ−１）配列番号１９記載のDNA分子；
（ｉ−２）配列番号２０記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｉ−３）配列番号１９記載のDNA分子の変異体；又は
（ｉ−４）配列番号２０記載のDNA分子の変異体。 Furthermore, the recombinant vector according to any one of (1) to (3), which has the following DNA molecule group:
Here, the DNA molecule group is selected from the group consisting of (g) PmdA gene, (h) PmdB gene, (i) PmdC gene, and combinations thereof;
(G) The PmdA gene is any one of the following DNA molecules (g-1) to (g-4):
(G-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 15;
(G-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16;
(G-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 15; or (g-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 16;
(H) The PmdB gene is a DNA molecule of any one of (h-1) to (h-4) below,
(H-1) a DNA molecule described in SEQ ID NO: 17;
(H-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18;
(H-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 17; or (h-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 18;
(I) The DNA molecule (PmdC gene) is any one of the following (i-1) to (i-4) DNA molecules,
(I-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 19;
(I-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20;
(I-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 19; or (i-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 20. さらに、下記のDNA分子群を有する（１）〜（４）のいずれかに記載の組換えベクターを提供する：
ここで、前記DNA分子群は、（ｊ）LigV遺伝子、（ｋ）PobA及びその組み合わせから成る群より選ばれ；
（ｊ）LigV遺伝子は下記（ｊ−１）〜（ｊ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｊ−１）配列番号２１記載のDNA分子；
（ｊ−２）配列番号２２記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｊ−３）配列番号２１記載のDNA分子の変異体；又は
（ｊ−４）配列番号２２記載のDNA分子の変異体
（ｋ）PobA遺伝子は下記の（ｋ−１）〜（ｋ−４）のいずれかのDNA分子であり、
（ｋ−１）配列番号２３記載のDNA分子；
（ｋ−２）配列番号２４記載のアミノ酸配列をコードするDNA分子；
（ｋ−３）配列番号２３記載のDNA分子の変異体；又は
（ｋ−４）配列番号２４記載のDNA分子の変異体。 Furthermore, the recombinant vector according to any one of (1) to (4) having the following DNA molecule group is provided:
Wherein the DNA molecule group is selected from the group consisting of (j) LigV gene, (k) PobA and combinations thereof;
(J) The LigV gene is any of the following DNA molecules (j-1) to (j-4):
(J-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 21;
(J-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22;
(J-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 21; or (j-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 22 (k) the PobA gene is represented by the following (k-1) to (k-4): ) Any DNA molecule,
(K-1) the DNA molecule set forth in SEQ ID NO: 23;
(K-2) a DNA molecule encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24;
(K-3) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 23; or (k-4) a mutant of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 24. 前記3MGA 3，4−ジオキシゲナーゼ遺伝子が、スフィンゴビウム・パウシモビリス（Sphingobium paucimobilis）SYK-6株由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えベクター。 The recombinant vector according to any one of claims 1 to 4, wherein the 3MGA 3,4-dioxygenase gene is derived from Sphingobium paucimobilis SYK-6 strain. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む形質転換体。   A transformant comprising the recombinant vector according to any one of claims 1 to 5. 請求項６に記載の形質転換体を培養し、該培養物からPDCを採取することを特徴とする、PDCの製造方法。   A method for producing PDC, comprising culturing the transformant according to claim 6 and collecting PDC from the culture. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換ベクターの発現により得られたタンパク質。   A protein obtained by expression of the recombinant vector according to any one of claims 1 to 5.
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