JP2011209069A - High sensitivity immunoassay - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、標識物質として金属コロイドを用いた免疫測定法に関する。 The present invention relates to an immunoassay method using a metal colloid as a labeling substance.
免疫学的測定法、中でもイムノクロマト法（ＩＣＡ法）は、その高い特異性に加え、簡易、迅速を特徴とする臨床診断法として実用化されている。イムノクロマト法は、操作が煩雑で重厚な設備、機器などを必要とせず、軽便な器具を使用した簡便な操作により、目視だけでも被検出物の有無を判定できる点で好都合である。 Immunological measurement methods, especially immunochromatography (ICA method), have been put into practical use as clinical diagnostic methods characterized by simple and rapid in addition to their high specificity. The immunochromatography method is advantageous in that the presence or absence of an object to be detected can be determined only by visual observation by a simple operation using a simple instrument without requiring complicated facilities and equipment.
近年、感染症の診断にイムノクロマト法が用いられているが、その検出感度は、一般に、細菌の場合、１０５〜１０７ＣＦＵ／ｍｌである。他方、細菌の検出感度は遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）によれば１０３〜１０４ＣＦＵ／ｍｌまで達成されている。しかしながら、遺伝子増幅法は重厚な設備、機器及び煩雑な操作が必要であり、しかも、検出までに数時間という長時間を要する。 In recent years, immunochromatography has been used for diagnosis of infectious diseases, and its detection sensitivity is generally 10 5 to 10 7 CFU / ml in the case of bacteria. On the other hand, the detection sensitivity of bacteria is achieved up to 10 3 to 10 4 CFU / ml according to the gene amplification method (PCR method). However, the gene amplification method requires heavy equipment, equipment, and complicated operations, and it takes a long time of several hours until detection.
また、従来、Ｂ型肝炎ウイルスの免疫学的測定法による検出も行われているが、その感度は、最も高感度の酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）でも１０４〜１０５ＰＦＵ／ｍｌである。感染可能なウイルスの濃度は１０３ＰＦＵ／ｍｌであるため、早期の診断感染予防には、現行の１０倍から１００倍の感度を有する診断法の開発が求められている。 Conventionally, hepatitis B virus has also been detected by an immunological assay, but the sensitivity is 10 4 to 10 5 PFU / ml even in the most sensitive enzyme immunoassay (ELISA). . Since the concentration of infectable virus is 10 3 PFU / ml, the development of a diagnostic method having a sensitivity 10 to 100 times higher than the current level is required for early diagnosis infection prevention.
かかる状況の中、本発明者らは、イムノクロマト法（ＩＣＡ法）等の免疫学的簡易測定法において、金コロイド粒子の表面に白金を担持させた金属コロイド粒子を呈色標識物質として用いる方法を提案した（特許文献１参照）。また、金コロイド粒子が高価であるというコスト面の問題を解消すべく、パラジウムコロイド粒子の表面に白金を担持させた金属コロイド粒子を呈色標識物質として用い、該金属コロイド粒子上で、銅イオンを含有する増感剤溶液を還元し銅を析出させて、従来と同様の高感度を実現した方法を提案している（特許文献２参照）。 Under such circumstances, the present inventors have used a method of using metal colloid particles having platinum supported on the surface of gold colloid particles as a colored labeling substance in simple immunological measurement methods such as immunochromatography (ICA method). Proposed (see Patent Document 1). In addition, in order to eliminate the cost problem that gold colloid particles are expensive, metal colloid particles having platinum supported on the surface of palladium colloid particles are used as a colored labeling substance. A method has been proposed in which a sensitizer solution containing is reduced to precipitate copper to achieve the same high sensitivity as in the past (see Patent Document 2).
しかしながら、銅イオンを含有する増感剤溶液を還元し銅を析出させて呈色させる方法においては、増感剤溶液を適用した直後の呈色感度はよいものの、経時的に退色するという問題があった。 However, in the method of reducing the color of a sensitizer solution containing copper ions and precipitating copper, the coloration sensitivity immediately after the application of the sensitizer solution is good, but there is a problem of fading over time. there were.
本発明の課題は、増感剤溶液を適用した後も継続的に呈色状態を保持することを可能とした免疫測定法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide an immunoassay method capable of continuously maintaining a colored state even after applying a sensitizer solution.
本発明者らは、自身で考案した銅イオンを含有する増感剤溶液を使用した方法を用いて免疫測定を行っていたところ、通常は増感剤溶液使用直後に測定を行うことから認知できなかった退色の発生を、以前呈色していたテストストリップを後日偶然目にすることにより、発見した。この点についてさらに検討したところ、２時間程度で、増感剤溶液を用いない場合と同程度まで退色することが明らかとなり、例えば数多くの症例を同時に測定する場合等には測定精度に影響が生じる可能性があることが判明した。本発明者らは、この問題点を解消すべく鋭意検討した結果、増感剤溶液を接触させて呈色させた後に、保護層形成溶液と接触させて呈色部分に保護層を形成し、酸素との接触を遮断することにより、退色を防止することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors have performed immunoassay using a method using a sensitizer solution containing copper ions devised by themselves, and can usually recognize from the measurement immediately after using the sensitizer solution. The occurrence of fading that did not occur was discovered by accidentally seeing a test strip that had been colored before. Further examination of this point revealed that the color faded to the same extent as when no sensitizer solution was used in about 2 hours. For example, when measuring a large number of cases at the same time, measurement accuracy was affected. It turns out that there is a possibility. As a result of intensive studies to solve this problem, the present inventors brought the sensitizer solution into contact with the color and then brought into contact with the protective layer forming solution to form a protective layer on the colored portion. It was found that fading can be prevented by blocking contact with oxygen, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、
（１） 分析対象物質と、該分析対象物質に対して免疫学的に反応する試薬とを反応させて両者の複合体を検出することからなる免疫測定法であって、前記分析対象物質又は前記試薬の何れか一方を、白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記複合体を、銅イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記銅イオンを還元させて銅を析出させた後、該銅析出部を保護層形成液と接触させて被覆し、検出するようにしたことを特徴とする免疫測定法や、
（２） 競合法又はサンドイッチ法であることを特徴とする上記（１）記載の免疫測定法や、
（３） 分析対象物質に対して免疫学的に反応する第１及び第２の試薬を用意し、前記第１の試薬を担体に固定しておき、前記第２の試薬を白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記分析対象物質を前記第１の試薬と第２の試薬との間にサンドイッチするサンドイッチ法により行われることを特徴とする上記（２）記載の免疫測定法や、
（４） イムノクロマトグラフィー測定法であることを特徴とする上記（２）又は（３）記載の免疫測定法や、
（５） 増感剤溶液が、硫酸銅及び還元剤を含有することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の免疫測定法や、
（６） 保護層形成液が、グリセロール又はその誘導体を含有することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の免疫測定法に関する。
That is, the present invention
(1) An immunoassay method comprising detecting a complex between a substance to be analyzed and a reagent that immunologically reacts with the substance to be analyzed, and comprising the analyte or the substance Either one of the reagents is labeled with metal colloid particles carrying platinum colloid, and the complex is brought into contact with a sensitizer solution containing copper ions, whereby the copper colloid is formed on the metal colloid particles. After reducing the ions and precipitating copper, the copper precipitation portion is brought into contact with the protective layer forming solution to cover and detect the immunoassay,
(2) The immunoassay method according to (1) above, which is a competitive method or a sandwich method,
(3) First and second reagents that react immunologically with the analyte are prepared, the first reagent is immobilized on a carrier, and the second reagent is supported on a platinum colloid. The immunoassay method according to (2) above, wherein the immunoassay method is carried out by a sandwich method in which the substance to be analyzed is sandwiched between the first reagent and the second reagent. Or
(4) The immunoassay method according to (2) or (3) above, which is an immunochromatography measurement method,
(5) The immunoassay method according to any one of (1) to (4) above, wherein the sensitizer solution contains copper sulfate and a reducing agent,
(6) The immunoassay method according to any one of (1) to (5) above, wherein the protective layer-forming solution contains glycerol or a derivative thereof.
また、本発明は、
（７） 分析対象物質に対して免疫学的に反応する第１及び第２の試薬並びに膜担体を用意し、前記第１の試薬を予め前記膜担体の所定位置に固定せしめて捕捉部位を形成し、前記第２の試薬をコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識しておき、該第２の試薬と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる分析対象物質と前記第２の試薬との複合体を前記捕捉部位に捕捉させ、該捕捉部位を、銅イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記銅イオンを還元させて銅を析出させた後、該銅析出部を保護層形成液と接触させて被覆し、検出するようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法、
（８） 増感剤溶液が、硫酸銅及び還元剤を含有することを特徴とする上記（７）記載のイムノクロマトグラフィー測定法や、
（９） 保護層形成液が、グリセロール又はその誘導体を含有することを特徴とする上記（７）又は（８）記載のイムノクロマトグラフィー測定法に関する。
The present invention also provides:
(7) First and second reagents and a membrane carrier that react immunologically with the substance to be analyzed are prepared, and the first reagent is previously fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site. The second reagent is pre-labeled with metal colloid particles in which a colloid of platinum is supported, and a mixed solution of the second reagent and a predetermined amount of the test sample is directed toward the capture site. A sensitizer solution containing a copper ion, which is chromatographed on a membrane carrier, captures the complex of the analyte and the second reagent contained in the test sample at the capture site. The copper ions are reduced on the metal colloidal particles by being brought into contact with the copper colloidal particles to deposit copper, and then the copper deposits are covered with a protective layer forming liquid to be covered and detected. Immunochromatographic measurement Law,
(8) The immunochromatography measurement method according to (7) above, wherein the sensitizer solution contains copper sulfate and a reducing agent,
(9) The immunochromatographic assay method according to (7) or (8) above, wherein the protective layer forming solution contains glycerol or a derivative thereof.
さらに、本発明は、
（１０） 分析対象物質に対して免疫学的に反応する第１及び第２の試薬並びに膜担体を少なくとも備え、前記第１の試薬は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第２の試薬は白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるイムノクロマト法テストキットであって、さらに、銅イオンを含有する増感剤溶液及び保護層形成液を備え、前記クロマト展開後に該増感剤溶液を前記捕捉部位に接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記銅イオンを還元させて銅を析出させた後、該銅析出部を保護層形成液と接触させて被覆し、検出するようにしたことを特徴とするイムノクロマト法テストキットや、
（１１） 増感剤溶液が、硫酸銅及び還元剤を含有することを特徴とする上記（１０）記載のイムノクロマト法テストキットや、
（１２） 保護層形成液が、グリセロール又はその誘導体を含有することを特徴とする上記（１０）又は（１１）記載のイムノクロマト法テストキットに関する。
Furthermore, the present invention provides
(10) At least first and second reagents that immunologically react to the analyte and a membrane carrier are provided, and the first reagent is previously fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site. The second reagent is pre-labeled with colloidal metal particles carrying platinum colloid and prepared so that it can be chromatographed on the membrane carrier at a position separated from the capture site. A kit further comprising a sensitizer solution containing copper ions and a protective layer forming solution, and bringing the sensitizer solution into contact with the capture site after the chromatographic development; An immunochromatography test kit characterized in that after copper ions are reduced and copper is precipitated, the copper deposit is contacted with a protective layer forming solution to be coated and detected. ,
(11) The immunochromatographic test kit according to (10) above, wherein the sensitizer solution contains copper sulfate and a reducing agent,
(12) The immunochromatography test kit according to the above (10) or (11), wherein the protective layer forming solution contains glycerol or a derivative thereof.
本発明の免疫測定法によれば、高感度で検出された呈色状態を長期にわたって安定的に保持することができる。したがって、数多くの症例を同時に測定する場合にも高い測定精度で行うことが可能となり、また、増感剤溶液を適用した直後に測定する必要がなく、さらには、測定後のイムノクロマト法テストストリップ等をカルテなどに添付して保存することも可能となり、商品価値が向上する。 According to the immunoassay method of the present invention, the colored state detected with high sensitivity can be stably maintained over a long period of time. Therefore, even when many cases are measured simultaneously, it is possible to carry out with high measurement accuracy, and it is not necessary to measure immediately after applying the sensitizer solution, and further, an immunochromatographic test strip after measurement, etc. Can be attached to medical records and saved, increasing the value of the product.
本発明の免疫測定法としては、分析対象物質と、該分析対象物質に対して免疫学的に反応する試薬とを反応させて両者の複合体を検出することからなる免疫測定法であって、前記分析対象物質又は前記試薬の何れか一方を、白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記複合体を、銅イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記銅イオンを還元させて銅を析出させた後、該銅析出部を保護層形成液と接触させて被覆し、検出するようにした方法であれば特に制限されるものではなく、競合法でもサンドイッチ法でもよく、サンドイッチ法としては、例えば、分析対象物質に対して免疫学的に反応する第１及び第２の試薬を用意し、前記第１の試薬を担体に固定しておき、前記第２の試薬を白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で標識しておき、前記分析対象物質を前記第１の試薬と第２の試薬との間にサンドイッチするサンドイッチ法により行われる方法を例示することができる。具体的には、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）法、イムノクロマトグラフィー測定法を好適に例示することができる。 The immunoassay method of the present invention is an immunoassay method comprising detecting a complex of an analyte by reacting an analyte and a reagent that immunologically reacts with the analyte, Either one of the substance to be analyzed or the reagent is labeled with metal colloidal particles carrying platinum colloid, and the complex is brought into contact with a sensitizer solution containing copper ions, whereby the metal There is no particular limitation as long as it is a method in which the copper ions are reduced on the colloidal particles to deposit copper, and then the copper deposits are covered with a protective layer forming solution, coated, and detected. The competitive method or the sandwich method may be used. As the sandwich method, for example, first and second reagents that immunologically react with a substance to be analyzed are prepared, and the first reagent is immobilized on a carrier. Second Examples include a method performed by a sandwich method in which a reagent is labeled with metal colloid particles carrying platinum colloid and the analyte is sandwiched between the first reagent and the second reagent. . Specifically, an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) method and an immunochromatography measurement method can be preferably exemplified.
より具体的な本発明のイムノクロマトグラフィー測定法としては、分析対象物質に対して免疫学的に反応する第１及び第２の試薬並びに膜担体を用意し、前記第１の試薬を予め前記膜担体の所定位置に固定せしめて捕捉部位を形成し、前記第２の試薬をコロイドに白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識しておき、該第２の試薬と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる分析対象物質と前記第２の試薬との複合体を前記捕捉部位に捕捉させ、該捕捉部位を、銅イオンを含有する増感剤溶液と接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記銅イオンを還元させて銅を析出させた後、該銅析出部を保護層形成液と接触させて被覆し、検出するようにした方法を例示することができる。 As a more specific immunochromatographic measurement method of the present invention, first and second reagents and a membrane carrier that immunologically react with a substance to be analyzed are prepared, and the first reagent is previously used as the membrane carrier. The second reagent is pre-labeled with colloidal metal particles having platinum colloid supported on a colloid, and the second reagent and a predetermined amount of the test sample are mixed. The mixed solution is chromatographed on the membrane carrier toward the capture site, and the complex of the analyte and the second reagent contained in the test sample is captured at the capture site, and the capture site Is contacted with a sensitizer solution containing copper ions to reduce the copper ions on the metal colloidal particles to precipitate copper, and then contact the copper precipitates with a protective layer forming solution. Cover and detect It can be exemplified Unishi was how.
また、このイムノクロマトグラフィー測定法に用いる試薬等はキットとして製造販売等することができ、かかるキットとしては、具体的に、分析対象物質に対して免疫学的に反応する第１及び第２の試薬並びに膜担体を少なくとも備え、前記第１の試薬は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第２の試薬は白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子で予め標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるイムノクロマト法テストキットであって、さらに、銅イオンを含有する増感剤溶液及び保護層形成液を備え、前記クロマト展開後に該増感剤溶液を前記捕捉部位に接触させることにより、前記金属コロイド粒子上で前記銅イオンを還元させて銅を析出させた後、該銅析出部を保護層形成液と接触させて被覆し、検出するようにしたキットを例示することができる。 In addition, the reagents and the like used in this immunochromatography measurement method can be manufactured and sold as a kit. As such a kit, specifically, first and second reagents that react immunologically with an analyte. And at least a membrane carrier, wherein the first reagent is preliminarily fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site, and the second reagent is pre-labeled with metal colloid particles carrying platinum colloid, And an immunochromatographic test kit prepared so as to be chromatographically developed on the membrane carrier at a position separated from the capture site, and further comprising a sensitizer solution containing copper ions and a protective layer forming solution. And, after the chromatographic development, by bringing the sensitizer solution into contact with the capture site, the copper ions are reduced on the metal colloid particles to precipitate copper. After, it is possible to coat in contact with the protective layer forming solution copper deposit part, to illustrate was such that detection kit.
本発明の分析対象物質としては、免疫学的に検出できるものであれば特に限定されるものではなく、分析対象物質が抗原である場合は、上記試薬として、該分析対象物質に対して特異的に反応する抗体が使用され、分析対象物質が抗体である場合は、上記試薬として、該抗体が特異的に反応する抗原が使用される。上記試薬として用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体とすることが好ましい。 The analysis target substance of the present invention is not particularly limited as long as it can be detected immunologically. When the analysis target substance is an antigen, the reagent is specific to the analysis target substance. When the antibody to be analyzed is an antibody and the substance to be analyzed is an antibody, an antigen that specifically reacts with the antibody is used as the reagent. The antibody used as the reagent may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of reaction specificity.
イムノクロマトグラフィー測定法等のサンドイッチ式免疫測定法においては、そこで使用する第１の試薬及び第２の試薬としては、分析対象物質が抗原である場合、抗体が使用される。この場合、第１の試薬及び第２の試薬は、それぞれ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、一般に、少なくとも一方の抗体をモノクローナル抗体とすることが好ましく、両方の抗体をモノクローナル抗体とすることが特に好ましい。 In a sandwich immunoassay such as an immunochromatography assay, an antibody is used as the first reagent and the second reagent used there when the substance to be analyzed is an antigen. In this case, each of the first reagent and the second reagent may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. From the viewpoint of reaction specificity, generally, at least one of the antibodies is a monoclonal antibody. It is particularly preferred that both antibodies be monoclonal antibodies.
本発明において、分析対象物質及び上記試薬の何れか一方を金属コロイド粒子で標識すればよいが、上記のような第１の試薬及び第２の試薬を用いるイムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法の場合、第１の試薬及び第２の試薬の何れか一方が金属コロイド粒子で標識される。 In the present invention, either one of the analyte and the reagent may be labeled with metal colloid particles, but sandwich immunoassay such as immunochromatographic assay using the first reagent and the second reagent as described above. In the case of the method, one of the first reagent and the second reagent is labeled with metal colloid particles.
本発明における金属コロイド粒子としては、白金コロイドを担持させた金属コロイド粒子（複合金属コロイド粒子）が用いられる。この複合金属コロイド粒子は、銅イオンの還元を触媒して銅を析出させる能力を有する。この複合金属コロイド粒子としては、金コロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなるものや、パラジウムコロイド粒子の表面に白金コロイドを担持させてなるものが好ましい。金コロイド粒子及びパラジウム粒子の平均粒径としては、３０〜１００ｎｍであることが好ましく、４０〜８０ｎｍであることがより好ましい。また、複合金属コロイド粒子の平均粒径としては、４０〜２００ｎｍであることが好ましい。イムノクロマトグラフィー測定法の場合、複合金属コロイド粒子の平均粒径は６０〜１００ｎｍであることが好ましい。 As the metal colloid particles in the present invention, metal colloid particles (composite metal colloid particles) carrying platinum colloid are used. This composite metal colloidal particle has the ability to catalyze the reduction of copper ions to precipitate copper. The composite metal colloidal particles are preferably those in which platinum colloid is supported on the surface of gold colloidal particles or those in which platinum colloid is supported on the surface of palladium colloidal particles. The average particle size of the gold colloid particles and the palladium particles is preferably 30 to 100 nm, and more preferably 40 to 80 nm. Further, the average particle size of the composite metal colloid particles is preferably 40 to 200 nm. In the case of the immunochromatography measurement method, the average particle diameter of the composite metal colloid particles is preferably 60 to 100 nm.
本発明の増感剤溶液としては、銅イオンの供給源となる硫酸銅等の塩を必須成分として含有し、好ましくは還元剤を含有する。さらに、必要に応じて、錯化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定剤等を含有してもよい。このような増感剤溶液としては、従来公知の無電解めっき溶液を使用することもできる。 The sensitizer solution of the present invention contains a salt such as copper sulfate as a supply source of copper ions as an essential component, and preferably contains a reducing agent. Furthermore, you may contain a complexing agent, a pH adjuster, a buffering agent, a stabilizer, etc. as needed. As such a sensitizer solution, a conventionally known electroless plating solution can also be used.
還元剤としては、次亜リン酸ナトリウム、抱水ヒドラジン、硫酸ヒドラジン、水素化ホウ素ナトリウム、ジメチルアミンボラン、ホルムアルデヒド、ロッシェル塩、ブドウ糖等を例示することができ、次亜リン酸ナトリウム、ホルムアルデヒドが好ましく、ホルムアルデヒドが最も好ましい。 Examples of the reducing agent include sodium hypophosphite, hydrazine hydrate, hydrazine sulfate, sodium borohydride, dimethylamine borane, formaldehyde, Rochelle salt, glucose, etc. Sodium hypophosphite and formaldehyde are preferred. Most preferred is formaldehyde.
また、錯化剤としては、アンモニア、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等を例示することができる。ｐＨ調製剤としては、酢酸塩、プロピオン酸塩、アンモニウム塩等を例示することができる。安定剤としては、各種の界面活性剤を例示することができる。 Examples of complexing agents include ammonia, citrate, tartrate, lactate, and the like. Examples of the pH adjuster include acetate, propionate, ammonium salt and the like. As the stabilizer, various surfactants can be exemplified.
本発明の保護層形成液としては、銅析出部を被覆する保護層を形成して酸素を遮断することができるものであれば特に制限されるものではなく、かかる保護層形成液の主成分としては、銅析出部（捕捉部位）を被覆しかつその場に留まることができる物質であればよく、白金コロイドとの反応性を示さない物質であることが好ましい。また、溶液調製の観点から、水溶性であることが好ましい。具体的に、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールに代表される水溶性の合成高分子や、ヒアルロン酸等の多糖類に代表される天然高分子や、水溶性でかつ粘性のあるグリセロールやエチレングリコール等の多価アルコール又はその誘導体（低級アルキルエステル）等を例示することができる。また、油脂等を使用することも可能である。これらの中でも、グリセロールやその誘導体が特に好ましい。 The protective layer forming liquid of the present invention is not particularly limited as long as it can form a protective layer that covers the copper deposit portion and can block oxygen, and as a main component of the protective layer forming liquid. Any material can be used as long as it can cover the copper deposit (capture site) and remain in place, and preferably does not exhibit reactivity with the platinum colloid. Moreover, it is preferable that it is water-soluble from a viewpoint of solution preparation. Specifically, for example, water-soluble synthetic polymers represented by polyethylene glycol and polyvinyl alcohol, natural polymers represented by polysaccharides such as hyaluronic acid, water-soluble and viscous glycerol, ethylene glycol, etc. Examples thereof include polyhydric alcohols or derivatives thereof (lower alkyl esters). Oils and fats can also be used. Of these, glycerol and its derivatives are particularly preferable.
特にイムノクロマトグラフィー測定法においては、本発明の保護層形成液は、所定の粘性を有することが好ましい。すなわち、捕捉部位の被覆効果を確実に得るために、毛細管現象によりテストストリップの下流方向へ展開せず捕捉部位に留まることができる程度の粘性を有することが好ましい。なお、粘性が高すぎる場合には、滴下、浸漬等の操作がより容易になるように、緩衝液等で希釈することにより保護溶液の粘度を調整することが好ましい。 Particularly in the immunochromatography measurement method, the protective layer forming liquid of the present invention preferably has a predetermined viscosity. In other words, in order to reliably obtain the covering effect of the capturing site, it is preferable that the coating layer has a viscosity enough to stay at the capturing site without being developed in the downstream direction of the test strip due to capillary action. In addition, when viscosity is too high, it is preferable to adjust the viscosity of a protective solution by diluting with buffer solution etc. so that operation, such as dripping and immersion, may become easier.
上記本発明の増感剤溶液や保護層形成液を接触させる方法としては、例えば、銅析出部（捕捉部位）に液を滴下する方法や、銅析出部（捕捉部位）を液中に浸漬する方法を例示することができる。 Examples of the method for bringing the sensitizer solution and the protective layer forming liquid of the present invention into contact with each other include, for example, a method of dripping a liquid into a copper precipitation part (capture part) or a copper precipitation part (capture part) immersed in the liquid. A method can be illustrated.
続いて、イムノクロマトグラフィー測定法に用いられるテストストリップの一例を、図面を参照して説明する。図１において、符号１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示す。 Subsequently, an example of a test strip used in the immunochromatography measurement method will be described with reference to the drawings. In FIG. 1, reference numeral 1 is an adhesive sheet, 2 is an impregnation member, 3 is a membrane carrier, 31 is a capture site, 4 is an absorption member, and 5 is a sample addition member.
図１の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、第１の試薬が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。この例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる分析対象物質をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜等も使用できる。 In the example of FIG. 1, the membrane carrier 3 is made of a strip-like nitrocellulose membrane filter having a width of 5 mm and a length of 36 mm. The first reagent is fixed to the membrane carrier 3 at a position 7.5 mm from the end on the side of the chromatographic expansion start point, and a specimen capture site 31 is formed. In this example, the membrane carrier 3 uses a nitrocellulose membrane filter. However, the membrane carrier 3 can chromatograph the analysis target substance contained in the test sample and can fix the antibody forming the capture site 31. Any cellulose membrane, nylon membrane, glass fiber membrane or the like can be used.
含浸部材２は、前記第２の試薬を含浸等の方法で配置せしめた部材からなる。当該第２の試薬は、上記金属コロイド粒子で予め標識される。この例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類等も使用できる。 The impregnating member 2 is a member in which the second reagent is arranged by a method such as impregnation. The second reagent is previously labeled with the metal colloid particles. In this example, a 5 mm × 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric is used as the impregnating member 2, but is not limited thereto, and examples thereof include cellulose cloth (filter paper, nitrocellulose membrane, etc.), polyethylene, polypropylene Porous plastic cloths such as can also be used.
第２の試薬の標識物質として使用される金属コロイド粒子は、捕捉部位３１に集積することにより、肉眼で観察できる程度の色を呈し、さらに、増感剤溶液と接触することによって銅を析出させて呈色の度合いが向上するものであることが好ましい。当該含浸部材２は、標識された第２の試薬の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させること等によって作製できる。 The colloidal metal particles used as the labeling agent for the second reagent accumulate at the capture site 31 and exhibit a color that can be observed with the naked eye. Further, the metal colloid particles precipitate copper by contact with the sensitizer solution. It is preferable that the degree of coloration is improved. The impregnating member 2 can be produced by impregnating the labeled second reagent suspension into a member such as the glass fiber nonwoven fabric and drying it.
図１に示すように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（図の左側）（以下、「上流側」といい、その逆の側を「下流側」という。）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。 As shown in FIG. 1, the membrane carrier 3 is stuck in the middle of the pressure-sensitive adhesive sheet 1 and the chromatographic development start side (left side in the figure) of the membrane carrier 3 (hereinafter referred to as “upstream side” and vice versa And the downstream end of the impregnating member 2 are overlapped and connected to the end of the impregnating member 2 and the upstream portion of the impregnating member 2 is attached to the pressure-sensitive adhesive sheet 1 according to the present invention. An immunochromatographic test strip can be created.
さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置すると共に、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置すると共に、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。 Further, if necessary, the downstream portion of the sample addition member 5 may be placed on the upper surface of the impregnation member 2, and the upstream portion of the sample addition member 5 may be adhered to the adhesive sheet 1, In addition, the upstream portion of the absorbing member 4 can be placed on the upper surface of the downstream portion of the membrane carrier 3, and the downstream portion of the absorbing member 4 can be attached to the adhesive sheet 1.
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレン、多孔質ポリプロピレン等のような多孔質合成樹脂のシート又はフィルムや、濾紙、綿布等のようなセルロース製の紙、織布又は不織布を用いることができる。吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を例示することができ、濾紙が最適である。 As the sample addition member 5, for example, a sheet or film of a porous synthetic resin such as porous polyethylene or porous polypropylene, a paper made of cellulose such as filter paper or cotton cloth, a woven cloth or a non-woven cloth is used. Can do. The absorbing member 4 may be made of any material that can absorb and hold liquid quickly, and examples thereof include a cotton cloth, filter paper, porous plastic nonwoven fabric made of polyethylene, polypropylene, and the like, and filter paper is optimal.
さらに、市販品の場合、イムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供してもよい。 Further, in the case of a commercial product, the immunochromatographic test strip is provided by being accommodated in a suitable plastic case having a test sample injection part and a judgment part opened above the sample addition member 5 and the capture part 31, respectively. Also good.
上記のようなイムノクロマト法テストストリップを用いて測定を行うには、生体試料等を含む被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液をテストストリップの試料添加用部材５上に注入する。該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第２の試薬と混合する。その際、該混合液中に分析対象物質が存在すれば、抗原抗体反応により分析対象物質と第２の試薬との複合体が形成される。 In order to perform measurement using the immunochromatographic test strip as described above, a test sample including a biological sample is mixed with an appropriate developing solvent as necessary to obtain a liquid mixture that can be chromatographed, and then mixed. The liquid is injected onto the sample addition member 5 of the test strip. The mixed solution passes through the sample addition member 5 and is mixed with the labeled second reagent in the impregnation member 2. At that time, if an analyte is present in the mixed solution, a complex of the analyte and the second reagent is formed by the antigen-antibody reaction.
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第１の試薬と抗原抗体反応して捕捉される。このとき、標識物質である金属コロイド粒子の集積により捕捉部位３１が発色する。そして、該捕捉部位３１と増感剤溶液とを接触させることにより、増感剤溶液に含まれている銅イオンが金属コロイド粒子の触媒作用によって還元されて銅として析出するので、金属コロイド粒子による発色が増強される。さらに、保護層形成液を捕捉部位３１に接触させ、この増強された発色状態を長期にわたって保持する。捕捉部位３１の発色を測定機器で読み取り、定量的に測定することもできる。 This complex is chromatographed in the membrane carrier 3 to reach the capture site 31, where it is captured by an antigen-antibody reaction with the first reagent immobilized thereon. At this time, the capture site 31 is colored by the accumulation of colloidal metal particles as the labeling substance. And by making this capture | acquisition part 31 and a sensitizer solution contact, the copper ion contained in a sensitizer solution is reduce | restored by the catalytic action of a metal colloid particle, and precipitates as copper. Color development is enhanced. Further, the protective layer forming liquid is brought into contact with the capture site 31, and this enhanced color development state is maintained for a long time. It is also possible to read the color of the capture site 31 with a measuring device and measure it quantitatively.
なお、本発明では、第２の試薬又は第２の試薬を含有する前記含浸部材を膜担体上に配置せず、適当な容器に収納しておき、当該容器内で被験試料と第２の試薬を混合して膜担体に注入することにより、膜担体にてクロマト展開可能なように用意しておくこともできる。 In the present invention, the second reagent or the impregnating member containing the second reagent is not disposed on the membrane carrier, but is stored in an appropriate container, and the test sample and the second reagent are stored in the container. The mixture can be mixed and injected into the membrane carrier so that it can be chromatographed on the membrane carrier.
被験試料の調製に用いる生体試料としては、特に制限はなく、公知の免疫測定法で使用されている生体試料であれば何れも使用することができる。また、本発明の分析対象物質も生体試料由来のものに限られず、公知の免疫測定法で使用されているものであれば何れも使用できる。 There is no restriction | limiting in particular as a biological sample used for preparation of a test sample, All can be used if it is a biological sample currently used by the well-known immunoassay. In addition, the substance to be analyzed of the present invention is not limited to a substance derived from a biological sample, and any substance that is used in a known immunoassay can be used.
なお、全血を被験試料として用いる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパー等を用いることができる。 When whole blood is used as a test sample, it is preferable to arrange a blood cell capturing membrane member on the sample addition member. The blood cell trapping membrane member is preferably laminated between the impregnation member and the sample addition member. This prevents red blood cells from being developed on the membrane carrier, so that it is easy to confirm the accumulation of the colored label at the capture site of the membrane carrier. As the blood cell capturing membrane member, a carboxymethylcellulose membrane is used. Specifically, ion exchange filter paper CM (trade name) sold by Advantech Toyo Co., Ltd. or ion exchange cellulose sold by Whatman Japan Co., Ltd. Paper or the like can be used.
１．白金微粒子被覆金コロイド粒子の調製
（１）使用するガラス器具の全てを王水で洗浄した。
（２）３９０ｍｌの超純水をフラスコに入れて沸騰させ、この沸騰水に塩化金酸水溶液（水溶液１リットル当たり金として１ｇ、片山科学工業株式会社製）３０ｍｌを加え、その後、１重量％ クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、６分４５秒後に、塩化白金酸水溶液（水溶液１リットル当たり白金として１ｇ、和光純薬工業株式会社製）３０ｍｌを加えた。塩化白金酸水溶液添加から５分後に１重量％ クエン酸ナトリウム水溶液６０ｍｌを加え、４時間還流を行い、白金微粒子被覆金コロイド懸濁液を得た。
（３）次いで、この懸濁液を２００ｍＭ炭酸カリウム水溶液でｐＨ９．０に調整し、これに超純水を加えて全量を１００ｍｌとして白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液を得た。この再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイドの平均粒径を動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ−５００（（株）堀場製作所製）によって測定したところ８０ｎｍであった。
1. Preparation of colloidal gold particles coated with platinum fine particles (1) All glassware used was washed with aqua regia.
(2) 390 ml of ultrapure water is placed in a flask and boiled, and 30 ml of an aqueous chloroauric acid solution (1 g as gold per liter of an aqueous solution, manufactured by Katayama Kagaku Kogyo Co., Ltd.) is added to the boiling water. 60 ml of an aqueous sodium acid solution was added, and after 6 minutes and 45 seconds, 30 ml of an aqueous chloroplatinic acid solution (1 g of platinum per liter of aqueous solution, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. Five minutes after the addition of the chloroplatinic acid aqueous solution, 60 ml of a 1% by weight sodium citrate aqueous solution was added and refluxed for 4 hours to obtain a platinum colloidal gold colloidal suspension.
(3) Next, this suspension was adjusted to pH 9.0 with a 200 mM aqueous potassium carbonate solution, and ultrapure water was added thereto to make a total volume of 100 ml, whereby a platinum fine particle-coated gold colloid resuspension was obtained. The average particle size of the platinum fine particle-coated gold colloid in this resuspension was measured by a dynamic light scattering particle size distribution analyzer LB-500 (manufactured by Horiba, Ltd.) and found to be 80 nm.
２．白金−金コロイド標識抗体の調製
抗ヒトＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白、C-reactive protein）マウスモノクローナル抗体の蛋白換算重量１μｇ（以下抗体の重量を示すとき、その蛋白換算重量を示す）と上記で得られた白金微粒子被覆金コロイド再懸濁液１ｍｌとを混合し、室温で２分間静置して、この抗体の全量を該再懸濁液中の白金微粒子被覆金コロイド粒子（以下、「白金−金コロイド粒子」という。）と結合させた。
これに最終濃度が０．２％となるように１％ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という。）水溶液を加えて、上記抗体に結合せしめられた白金−金コロイド粒子の表面をブロックした。この懸濁液を４０００×ｇで２５分間遠心分離して、白金−金コロイド粒子の表面がＢＳＡでブロックされた白金−金コロイド標識抗体を沈殿せしめて集めた。この白金−金コロイド標識抗体を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁して、精製白金−金コロイド標識抗体懸濁液を得た。
2. Preparation of anti-human CRP (C-reactive protein) mouse monoclonal antibody 1 μg protein equivalent weight (hereinafter, when the antibody weight is shown, the protein equivalent weight is obtained) and the above. 1 ml of the resulting platinum fine particle-coated colloidal gold resuspension was mixed and allowed to stand at room temperature for 2 minutes. ”Colloidal gold particles”).
A 1% bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”) aqueous solution was added thereto so as to have a final concentration of 0.2% to block the surface of the platinum-gold colloid particles bound to the antibody. This suspension was centrifuged at 4000 × g for 25 minutes to precipitate and collect a platinum-gold colloid-labeled antibody in which the surface of the platinum-gold colloidal particles was blocked with BSA. This platinum-gold colloid-labeled antibody was resuspended in 50 mM Tris hydrochloride buffer (pH 7.4) containing 0.05% Tween 20 and 1% BSA to obtain a purified platinum-gold colloid-labeled antibody suspension. .
３．イムノクロマト法テストストリップの作成
図１に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
（１）抗ＣＲＰ抗体と白金−金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位
幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体３として用意した。抗ヒトＣＲＰマウスモノクローナル抗体１．０ｍｇ／ｍｌが含有されてなる溶液０．５μｌを、このクロマト展開用膜担体３におけるクロマト展開開始点側の末端から７．５ｍｍの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、抗原であるヒトＣＲＰと白金−金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位３１とした。
（２）白金−金コロイド標識抗体含浸部材
５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布に、上記で得られた白金−金コロイド標識抗体懸濁液３７．５μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて白金−金コロイド標識抗体含浸部材２とした。
（３）イムノクロマト法テストストリップの作成
上記クロマト展開用膜担体３、上記標識抗体含浸部材２の他に、試料添加用部材５として綿布と、吸収用部材４として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図１と同様のクロマト法テストストリップを作成した。
3. Preparation of immunochromatographic test strip The immunochromatographic test strip shown in FIG. 1 was prepared by the following procedure.
(1) Capture site of complex of anti-CRP antibody and platinum-gold colloid-labeled antibody An elongated strip-shaped nitrocellulose membrane having a width of 5 mm and a length of 36 mm was prepared as a membrane carrier 3 for chromatographic development of a chromatographic medium. 0.5 μl of a solution containing 1.0 mg / ml of anti-human CRP mouse monoclonal antibody was applied in a line at a position 7.5 mm from the end of the chromatographic development start point side of the membrane carrier 3 for chromatographic development. This was dried at room temperature, and used as a capture site 31 for a complex of human CRP as an antigen and a platinum-gold colloid-labeled antibody.
(2) Platinum-gold colloid-labeled antibody-impregnated member A 5 mm × 15 mm strip-shaped glass fiber nonwoven fabric is impregnated with 37.5 μl of the platinum-gold colloid-labeled antibody suspension obtained above and dried at room temperature. A platinum-gold colloid-labeled antibody-impregnated member 2 was obtained.
(3) Preparation of immunochromatographic test strip In addition to the chromatographic development membrane carrier 3 and the labeled antibody impregnated member 2, a cotton cloth as the sample addition member 5 and a filter paper as the absorption member 4 were prepared. Then, using these members, a chromatographic test strip similar to that shown in FIG. 1 was prepared.
４．増感剤溶液（硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液）の調製
純水５００ｍｌに対し、酒石酸カリウムナトリウム（キシダ化学製）２４３ｇ、硫酸銅（和光純薬株式会社製）３４ｇ、炭酸ナトリウム（関東化学株式会社製）１５ｇ、水酸化ナトリウム１６ｇ、ＥＤＴＡ１１ｇを溶解し、硫酸銅溶液を調製した。得られた硫酸銅溶液１５ｍｌにホルムアルデヒド１．２ｍｌを添加し、硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液を調製した。混合液はテストストリップに反応させる前に調製した。
4). Preparation of sensitizer solution (copper sulfate-formaldehyde mixed solution) For 500 ml of pure water, 243 g of potassium sodium tartrate (manufactured by Kishida Chemical), 34 g of copper sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), sodium carbonate (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) ) 15 g, sodium hydroxide 16 g, and EDTA 11 g were dissolved to prepare a copper sulfate solution. 1.2 ml of formaldehyde was added to 15 ml of the obtained copper sulfate solution to prepare a copper sulfate-formaldehyde mixed solution. The mixture was prepared before reacting with the test strip.
５．保護層形成液の調製
保護層形成液としては、市販の特級グリセロール（和光純薬工業株式会社製）を用いた。
5. Preparation of Protective Layer Forming Solution As the protective layer forming solution, commercially available special grade glycerol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
６．試験
上記作成したイムノクロマト法テストストリップを使用して、抗原であるリコンビナントＣＲＰを測定した。リコンビナントＣＲＰ（オリエンタル酵母工業株式会社製）は、０．２５％Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）と混合し、リコンビナントＣＲＰの濃度を４，２，１ ｎｇ／ｍｌ及び５００，２５０，１２５，６３，３１ｐｇ／ｍｌに調製し、被験試料とした。また、抗原を含まない溶液をＢｌａｎｋとした。
6). Test Recombinant CRP as an antigen was measured using the immunochromatographic test strip prepared above. Recombinant CRP (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) was mixed with a phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.25% Tween, and the concentration of recombinant CRP was 4,2,1 ng / ml and 500,250, 125, 63, 31 pg / ml were prepared and used as test samples. A solution containing no antigen was designated as Blank.
これらの被験試料１００μｌを上記のイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に滴下して膜担体３に展開せしめ、１５分後に捕捉部位３１の呈色の度合いを肉眼で観察した。ブランクは、０．２５％Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とした。その後、イムノクロマト法テストストリップを超純水にて洗浄し、水気を切った後、捕捉部位３１を上記で作成した増感剤溶液（硫酸銅−ホルムアルデヒド混合液）に浸漬し、さらに保護層形成液（グリセロール）を滴下後、呈色の度合いを肉眼で観察した。また、保護層形成液を滴下しないこと以外、上記方法と同様の方法にて反応させたイムノクロマト法テストストリップを対照とした。 100 μl of these test samples were dropped on the sample addition member 5 of the immunochromatographic test strip and developed on the membrane carrier 3, and after 15 minutes, the degree of coloration of the capture site 31 was observed with the naked eye. The blank was a phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.25% Tween. Thereafter, the immunochromatographic test strip is washed with ultrapure water, drained, and then the capture site 31 is immersed in the sensitizer solution (copper sulfate-formaldehyde mixture) prepared above, and further a protective layer forming solution After adding (glycerol) dropwise, the degree of coloration was observed with the naked eye. Further, an immunochromatographic test strip reacted in the same manner as the above method except that the protective layer forming solution was not dropped was used as a control.
７．結果
表１に、増感剤溶液への浸漬前後の観察結果を示し、表２に、保護層形成液の添加・非添加に基づく、呈色度合いの経時的変化を示す。なお、捕捉量は、その量に比例して増減する黒色の呈色度合いを肉眼で−（着色なし）、±（微弱な着色）、±（弱い着色）、＋（明確な着色）、＋＋（強い着色）の５段階に区分して判定した。さらに、各区分における弱い反応についてｗ（ｗｅａｋ）を付記し判定した。また、図２に、抗原濃度４ｎｇ／ｍｌの被験試料を用いた場合のイムノクロマト法テストストリップの経時的な呈色度合いを表す写真を示す。
7). Results Table 1 shows the observation results before and after immersion in the sensitizer solution, and Table 2 shows changes over time in the degree of coloration based on the addition / non-addition of the protective layer forming solution. In addition, the amount of capture is determined by the naked eye with the degree of coloration of black that increases or decreases in proportion to the amount-(no coloring), ± (weak coloring), ± (weak coloring), + (clear coloring), ++ ( Judgment was made by classifying into 5 levels (strong coloring). Furthermore, w (weak) was added and judged about the weak reaction in each division. FIG. 2 shows a photograph showing the degree of coloration of the immunochromatographic test strip over time when a test sample having an antigen concentration of 4 ng / ml is used.
表１から明らかなように、白金−金コロイド標識テストストリップにおいて、増感剤溶液に浸漬前の目視判定では２５０ｐｇ／ｍｌが検出限界であったのに対し、浸漬後では３１ｐｇ／ｍｌと検出感度が向上した。また、表２及び図２から明らかなように、保護層形成液を滴下することにより、増感反応２時間後及び１日後においても、捕捉部位の呈色強度は、増感反応直後と同等に呈色強度を保つことが可能であった。他方、保護層形成液非添加の対照では、時間経過と共に退色し、反応２時間後において増感前と同等にまで呈色強度の低下が認められた。また、図２ａに示すように、グリセロールを滴下することにより、呈色感度をさらに向上させることができることが明らかとなった。
以上のように、本発明においては、増感反応後の呈色強度を長期にわたって維持することが可能となり、判定時の呈色強度の低下を防ぐことが可能となった。
As is clear from Table 1, in the platinum-gold colloid-labeled test strip, the detection sensitivity was 31 pg / ml after immersion, whereas 250 pg / ml was the detection limit in the visual judgment before immersion in the sensitizer solution. Improved. In addition, as is apparent from Table 2 and FIG. 2, the color intensity at the capturing site is the same as that immediately after the sensitization reaction even after 2 hours and 1 day after the sensitization reaction by dropping the protective layer forming solution. It was possible to maintain the color intensity. On the other hand, in the control without addition of the protective layer forming solution, the color faded with time, and after 2 hours of reaction, a decrease in color intensity was observed to the same level as before sensitization. Further, as shown in FIG. 2a, it was revealed that the coloration sensitivity can be further improved by adding glycerol dropwise.
As described above, in the present invention, the color intensity after the sensitization reaction can be maintained over a long period of time, and the color intensity at the time of determination can be prevented from being lowered.
本発明は、従来よりも高感度で測定が行える免疫測定法、とりわけ、サンドイッチ式免疫測定法、特にイムノクロマトグラフィー測定法及びイムノクロマト法テストストリップを提供するものであり、標識物質として金属コロイド粒子を用いて肉眼で簡便に判定できるようにした免疫測定法の分野で有用である。 The present invention provides an immunoassay capable of measuring with higher sensitivity than before, particularly a sandwich immunoassay, particularly an immunochromatographic assay and an immunochromatographic test strip, using metal colloidal particles as a labeling substance. It is useful in the field of immunoassays that can be easily determined with the naked eye.
１ 粘着シート
２ 標識抗体含浸部材
３ クロマト展開用膜担体
３１ 捕捉部位
４ 吸収用部材
５ 試料添加部材
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Adhesive sheet 2 Labeled antibody impregnation member 3 Chromatographic development membrane carrier 31 Capture site 4 Absorption member 5 Sample addition member
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