JP2011196879A - Detection method and kit of target biomolecule - Google Patents
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Abstract
Description
生体分子を検出する方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and a kit for detecting a biomolecule.
近年、腫瘍マーカーに代表されるような、疾病に関連する生体分子を容易にモニターする方法が求められている。一般的にタンパク質を始めとする生体分子は、抗原抗体反応を利用したセンシングを行うことが知られている。実際の医療現場においても、抗原抗体反応を原理とするイムノクロマトグラフィキットが用いられている。抗原抗体反応を利用する場合、抗原を検出するには抗体を、抗体を検出するには抗原を、生物学的にセンサーとして準備する必要がある。しかしながら、いずれもマウスやうさぎ等の生体に免疫して生物学的に生成する必要があり、大量生産や品質バラツキが発生する恐れがある。 In recent years, there has been a demand for a method for easily monitoring a biomolecule related to a disease, such as a tumor marker. In general, biomolecules including proteins are known to perform sensing using an antigen-antibody reaction. In an actual medical field, an immunochromatography kit based on an antigen-antibody reaction is used. When using an antigen-antibody reaction, it is necessary to prepare an antibody as a biological sensor to detect an antigen and an antigen to detect an antibody. However, it is necessary to immunize living organisms such as mice and rabbits and generate them biologically, and there is a risk of mass production and quality variations.
近年、抗原抗体反応と同じように、タンパク質を始めとする生体分子を認識し、特異的に結合する核酸分子であるアプタマーが知られてきている。アプタマーは、核酸分子であるため、化学合成が可能であり、品質管理された物質を、工業的に大量生産することが出来る。従って、アプタマーを用いて、必要な生体分子を容易に検出することができれば有用であると考えられる。 In recent years, aptamers that are nucleic acid molecules that recognize and specifically bind to biomolecules such as proteins have been known, as in the case of antigen-antibody reactions. Since aptamers are nucleic acid molecules, chemical synthesis is possible, and quality-controlled substances can be industrially mass-produced. Therefore, it is considered useful if necessary biomolecules can be easily detected using an aptamer.
特許文献1には、アプタマーを用いた生体分子の検出方法が開示されている。ところが、いずれの場合も、蛍光標識・誘電体・インターカレーターにより、事前にアプタマーが標識されていることが必要であり、これらの物質により、標的生体分子との相互作用に影響を受けてしまい、検出が困難であったり、検出感度が低下してしまう危険性があった。
本発明は、化学合成可能なアプタマーを用いて、生体分子を感度良く、簡便に検出する装置及び方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an apparatus and a method for easily detecting a biomolecule with high sensitivity using a chemically synthesized aptamer.
本発明の第1の標的生体分子の検出方法は、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第1及び第2の電極と、前記第1の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第1の核酸鎖と、前記第2の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖と、を具備する装置を準備する工程と、前記反応セルに、前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第4の核酸鎖、を供給する工程と、前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、前記反応セルに、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第1の核酸鎖と前記第6の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、前記第1の電極から、前記第1の核酸鎖及び前記第5の核酸鎖と、前記第6の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第1の電気化学信号、及び、前記第2の電極から前記第2の核酸鎖及び前記第3の核酸鎖と、前記第4の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第2の電気化学的信号を検出する工程と、 前記第1の電気化学的信号と、前記第2の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする。前記反応セルに、前記第3の核酸鎖と、前記第4の核酸鎖、を供給する前記工程と、前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく前記工程とは同時に行われても良い。 The first target biomolecule detection method of the present invention includes a reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, and one end immobilized on the first electrode. A first nucleic acid chain that functions as an aptamer and binds to the target biomolecule, and a second nucleic acid that has one end immobilized on the second electrode and does not function as an aptamer for the target biomolecule A device comprising: a strand; and a third nucleic acid strand that does not form a double strand with the first and second nucleic acid strands and their complementary strands in the reaction cell, and the second A step of supplying a region forming a double strand with a nucleic acid strand and a fourth nucleic acid strand having a region forming a double strand with the third nucleic acid strand, and may include the target biomolecule A target sample solution is supplied, and the target biomolecule and the first nucleic acid strand are bound to each other. A step of combining them, a fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands, and a double strand with the first nucleic acid strand can be formed in the reaction cell A first nucleic acid strand that is not bound to the target biomolecule, and a sixth nucleic acid strand having a single-stranded region and a region that forms a double strand with the fifth nucleic acid strand And a step of forming a double strand with the single-stranded region of the sixth nucleic acid strand, from the first electrode, the first nucleic acid strand and the fifth nucleic acid strand; A first electrochemical signal derived from a double strand formed between the sixth nucleic acid strands, the second and third nucleic acid strands from the second electrode, and the fourth Detecting a second electrochemical signal derived from a double strand formed between the nucleic acid strands of the first nucleic acid strand, the first electrochemical signal, and the second electrical signal. From the difference between the chemical signal, and performing the step of calculating the amount of the target biomolecule. Supplying the third nucleic acid strand and the fourth nucleic acid strand to the reaction cell; supplying a sample solution that may contain the target biomolecule; and The above-described step that is performed under the condition that one nucleic acid chain binds may be performed simultaneously.
また、本発明の第2の標的核酸の検出方法は、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第1及び第2の電極と、前記第1の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第1の核酸鎖と、前記第2の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖と、前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第4の核酸鎖、を具備する装置を準備する工程と、前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、前記反応セルに、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第1の核酸鎖と前記第6の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、前記第1の電極から、前記第1の核酸鎖及び前記第5の核酸鎖と、前記第6の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第1の電気化学信号、及び、前記第2の電極から前記第2の核酸鎖及び前記第3の核酸鎖と、前記第4の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第2の電気化学的信号を検出する工程と、前記第1の電気化学的信号と、前記第2の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする。前記第2の核酸鎖と前記第3の核酸鎖とが連結していてもよい。 The second target nucleic acid detection method of the present invention includes a reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, one end immobilized on the first electrode, and a target living body. A first nucleic acid chain that functions as an aptamer for a molecule, can bind to the target biomolecule, and a second nucleic acid that has one end immobilized on the second electrode and does not function as an aptamer for the target biomolecule. A nucleic acid strand, a third nucleic acid strand that does not form a double strand with the first and second nucleic acid strands and their complementary strands, a region that forms a double strand with the second nucleic acid strand, and Providing a device comprising a fourth nucleic acid strand having a region forming a double strand with a third nucleic acid strand, and supplying a sample solution that may contain the target biomolecule, A step of subjecting the target biomolecule and the first nucleic acid strand to a binding condition; In the reaction cell, a fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands, a single-stranded region that can form a double strand with the first nucleic acid strand, and the fifth nucleic acid strand A first nucleic acid strand that has a region that forms a double strand with the nucleic acid strand, and that is not bound to the target biomolecule and the one of the sixth nucleic acid strand Formed between the first nucleic acid strand, the fifth nucleic acid strand, and the sixth nucleic acid strand from the first electrode, under the condition of forming a double strand with the single strand region. First electrochemical signal derived from the double strand, and two formed from the second electrode between the second nucleic acid strand and the third nucleic acid strand and the fourth nucleic acid strand Detecting a second electrochemical signal derived from a chain, and the difference between the first electrochemical signal and the second electrochemical signal, And performing the step of calculating the amount of body molecules. The second nucleic acid chain and the third nucleic acid chain may be linked.
上記の第1及び第2の標的核酸の検出方法において、前記第1及び第2の電気化学的信号を検出する工程は、前記反応セルに二本鎖特異的に結合する挿入剤溶液を供給し、前記反応性セル内の二本鎖に挿入剤を結合させる工程と、前記挿入剤が酸化もしくは還元反応することにより発生する電気化学信号を前記第1の電極及び第2の電極で各々検出する工程を行うことが望ましい。 In the first and second target nucleic acid detection methods described above, the step of detecting the first and second electrochemical signals supplies an intercalating agent solution that specifically binds to the reaction cell in a double-stranded manner. A step of binding an intercalating agent to the double strand in the reactive cell, and an electrochemical signal generated by oxidation or reduction reaction of the intercalating agent is detected by the first electrode and the second electrode, respectively. It is desirable to perform the process.
また、本発明の第1の標的生体分子検出用キットは、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第1及び第2の電極と、前記第1の電極に固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第1の核酸鎖と、前記第2の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖と、を具備する装置と、前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域とを有する第4の核酸鎖と、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、を具備することを特徴とする。 In addition, the first target biomolecule detection kit of the present invention is a target biomolecule immobilized on a reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, and the first electrode. A first nucleic acid chain that functions as an aptamer and binds to the target biomolecule, and a second nucleic acid that has one end immobilized on the second electrode and does not function as an aptamer for the target biomolecule A first nucleic acid strand, a third nucleic acid strand that does not form a double strand with the first and second nucleic acid strands and their complementary strands, and a double strand with the second nucleic acid strand. A fourth nucleic acid strand having a single-stranded region and a region that forms a double strand with the third nucleic acid strand, and the first to fourth nucleic acid strands do not form a double strand. 5 nucleic acid strands, a single-stranded region capable of forming a double strand with the first nucleic acid strand, and the fifth nucleic acid strand with two Characterized by comprising a sixth nucleic acid strand having a region forming the chain, the.
本発明の第2の標的生体分子検出用キットは、反応セルと、前記反応セル内に設けられた第1及び第2の電極と、前記第1の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第1の核酸鎖と、前記第2の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖と、前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第4の核酸鎖と、を具備する装置と、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、を具備することを特徴とする。前記第2の核酸鎖と前記第3の核酸鎖とが連結していても良い。 The second target biomolecule detection kit of the present invention comprises a reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, one end immobilized on the first electrode, and a target biomolecule A first nucleic acid chain that functions as an aptamer and binds to the target biomolecule, and a second nucleic acid that has one end immobilized on the second electrode and does not function as an aptamer for the target biomolecule A strand, a third nucleic acid strand that does not form a double strand with the first and second nucleic acid strands and their complementary strands, a region that forms a double strand with the second nucleic acid strand, and the first A fourth nucleic acid chain having a region forming a double strand with three nucleic acid strands, and a fifth nucleic acid that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands A strand, a single-stranded region capable of forming a double strand with the first nucleic acid strand, and a fifth strand with the fifth nucleic acid strand Characterized by comprising a sixth nucleic acid strand having a region that forms the. The second nucleic acid chain and the third nucleic acid chain may be linked.
上記第1及び第2のキットにおいて、さらに二本鎖特異的に結合する挿入剤溶液を具備するものであることが望ましい。 The first and second kits preferably further comprise an intercalating agent solution that specifically binds to double strands.
本発明によれば、アプタマーを用いて、生体分子を感度よく、簡便に検出することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to detect a biomolecule with high sensitivity and ease using an aptamer.
本発明は、生体分子に特異的に結合するアプタマーをプローブとして、サンプル中の標的生体分子を電気化学的に検出する方法にかかわる。 The present invention relates to a method for electrochemically detecting a target biomolecule in a sample using an aptamer that specifically binds to a biomolecule as a probe.
本明細書において、アプタマーとは、特定の生体分子と特異的な結合する機能を持った核酸分子である。前記核酸分子としては、DNAまたはRNA、PNAなどが挙げられる。 In the present specification, an aptamer is a nucleic acid molecule having a function of specifically binding to a specific biomolecule. Examples of the nucleic acid molecule include DNA, RNA, PNA and the like.
標的とする生体分子としては、タンパク質、細胞、細胞組織、微生物、ウィルス、細菌、毒素などがある。
以下、図面を参照しながら本発明の方法の好適な実施形態について説明する。
Examples of target biomolecules include proteins, cells, cell tissues, microorganisms, viruses, bacteria, and toxins.
Hereinafter, a preferred embodiment of the method of the present invention will be described with reference to the drawings.
<第1工程>
まず、電気化学的に標的生体分子を検出するための装置を準備する。図1は本実施形態に関わる装置の模式図である。装置は、サンプル溶液をアプタマーと反応させるための反応セル1を備えている。同一の反応セル1内には標的生体分子の検出用の第1の電極2、及び比較用の第2の電極3が設けられている。第1の電極2には、標的生体分子に対してアプタマーとして機能する第1の核酸鎖21の一端が固定化されている。第1の核酸鎖21の配列は標的生体分子の種類に応じて適宜選択される。第2の電極3には、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖22の一端が固定化されている。例えば第1の電極2及び第2の電極3は、金で作られ、第1の核酸鎖21及び第2の核酸鎖22の一端は、チオール基で修飾されていることにより核酸鎖の固定化が可能である。
<First step>
First, an apparatus for electrochemically detecting a target biomolecule is prepared. FIG. 1 is a schematic diagram of an apparatus according to this embodiment. The apparatus includes a
複数の標的生体分子を検出対象とする場合は、反応セル1内に第1の電極2を複数設け、各電極上に、各々標的生体分子に応じたアプタマーを固定化しておけばよい。その場合、異なるアプタマーが固定化された第1の電極1つ毎に、それぞれ1つの第2電極を設けても良いし、異なるアプタマーが固定化された複数の第1の電極毎に、1つの第2の電極を共有しても良い。
When a plurality of target biomolecules are to be detected, a plurality of
なお、第1の電極2と、第2の電極3との間では、物質の移動が可能な状態である。
Note that the substance can move between the
<第2工程>
次に、以下に示す第3の核酸鎖23と、第4の核酸鎖24と、を反応セル1内に供給する。図2は第3核酸鎖及び第4核酸鎖を示す模式図である。
<Second step>
Next, a third
第3の核酸鎖23は、第1及び第2の核酸鎖21、22及びそれらの相補鎖の各々と非相補的な配列を有し、それらと二本鎖は形成しない配列である。第4の核酸鎖24は、第2の核酸鎖22の少なくとも一部と相補的で、第2の核酸鎖22と二本鎖を形成可能な配列を有する領域31と、第3の核酸鎖23に相補的で第3の核酸鎖23と二本鎖を形成して結合している領域32を有する。つまり第3の核酸鎖23と第4の核酸鎖24が結合して二本鎖を形成している第1の核酸鎖対11(部分二本鎖)を反応セル1内に供給する。
The third
図3は第3核酸鎖及び第4核酸鎖を装置に供給したときの様子を示す模式図である。これにより図3に示すように第2の電極3上には第4の核酸鎖24と、第3の核酸鎖23との二本鎖、第4の核酸鎖24と第2の核酸鎖22との二本鎖が存在することとなる。
FIG. 3 is a schematic diagram showing a state when the third nucleic acid strand and the fourth nucleic acid strand are supplied to the apparatus. As a result, as shown in FIG. 3, on the
すなわち、第2の核酸鎖22には、第4の核酸鎖24が結合し二本鎖を形成する。またこの第4の核酸鎖24の、第2の核酸鎖22と二本鎖を形成していない領域には第3の核酸鎖23が結合して二本鎖を形成する。つまり第4の核酸鎖24は、第2の核酸鎖22と二本鎖を形成して結合している領域31と、第3の核酸鎖23と二本鎖を形成して結合している領域32を有する。
なお、第1工程の装置を準備する段階で、第2の電極3上の第2の核酸鎖を固定化する際に、第2の核酸鎖22及び第3の核酸鎖23と、それと相補的な配列を有する第4の核酸鎖24が二本鎖となって第2の電極3上に固定化された装置を準備してもよい。この場合は、さらなる第3の核酸鎖23と、第4の核酸鎖24を供給する第2工程は不要である。
That is, the fourth
When the second nucleic acid strand on the
第2の核酸鎖22及び第3の核酸鎖23と、それと相補的な第4の核酸鎖24の二本鎖となって第2の電極3上に固定化された装置を得るには、あらかじめ第2の核酸鎖22を固定化後、この核酸鎖に相補的な配列を有する第4の核酸鎖を供給してハイブリダイゼーションさせ、更に第3の核酸鎖23を供給してハイブリダイゼーションさせることにより得ることができる。 より好ましくは、図2に示すように、第3の核酸鎖23と第4の核酸鎖24を領域31で、二本鎖を形成している第1の核酸鎖対11をあらかじめ準備しておき、第2の電極3上に固定化されている第2の核酸鎖22とハイブリダイゼーションさせることにより得ることができる。
In order to obtain a device immobilized on the
<第3工程>
次に、反応セル1に、標的生体分子41を含む可能性のあるサンプル溶液を注入し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく。
<Third step>
Next, a sample solution that may contain the
図4は第2の電極上の第2の核酸鎖22に二本鎖が形成され、第1の核酸21に、標的生体分子41が結合した状態を示す模式図である。サンプル溶液中に標的生体分子41が含まれていた場合、第1の核酸鎖21はアプタマーとして機能し、図4に示すように、標的生体分子41は、第1の核酸鎖21に結合する。
FIG. 4 is a schematic diagram showing a state in which a double strand is formed on the second
サンプル溶液中に標的生体分子41が含まれていない場合は、当然のことながら、第1の核酸鎖21に結合する標的生体分子41はない。
When the
標的生体分子41が第1の核酸鎖21に結合する条件とは、例えば、25℃で30分〜1時間程度である。温度を25℃から37℃に上げることにより、時間をより短縮することが可能である。但し、標的生体分子がタンパク質である場合には、37℃を超えると、タンパク質が変性してしまう可能性があるため、好ましくない。
The condition for the
また、第2工程を省略して、第3工程において、サンプル溶液中に、第1の核酸鎖対11を含有させておいても良い。このようにすることにより、サンプル溶液を反応セル1中に供給したかどうかをモニターすることができる。また、この第3工程は以下に示す第4工程と同時に行われても良い。
<第4工程>
次に反応セル1に部分的に二本鎖を形成した第2の核酸鎖対12を供給する。図5は第2の核酸鎖対12の模式図である。図6は、第1の核酸鎖21に標的生体分子41が結合した場合に、反応セル1に第2の核酸鎖対12を添加した状態を示す模式図である。図7は、第1の核酸鎖21に標的生体分子41が結合しなかった場合に、反応セル1に第2の核酸鎖対12を添加した状態を示す模式図である。
Alternatively, the second step may be omitted, and the first nucleic
<4th process>
Next, the second nucleic
添加する第2の核酸鎖対12は、図5に示すような、第5の核酸鎖25と、前記第1核酸鎖21と二本鎖を形成可能な一本鎖領域33及び第5の核酸鎖25と二本鎖を形成している領域34を有する第6の核酸鎖26と、を備える。なお、前記第5の核酸鎖は第1乃至第2の核酸鎖21、22、前記第4の核酸鎖の領域31、前記第6の核酸鎖26の領域33とは二本鎖を形成しない配列である。
The second nucleic
この第2の核酸鎖対12を供給後、前記第6の核酸鎖26の一本鎖領域33と、前記第1の核酸鎖21とがハイブリダイゼーションし、第2の核酸鎖対12における前記第6の核酸鎖26の一本鎖領域33と第1の核酸鎖21とが、二本鎖を形成する条件下におく。
After supplying the second nucleic
サンプル溶液中に標的生体分子41が充分量含まれており、第3工程で、第1の核酸鎖21と標的生体分子41との結合が生じている場合は、図6に示すように、第2の核酸鎖対12における第6の核酸鎖26の一本鎖領域33は前記第1の核酸鎖21と二本鎖は形成しない。なお、ここでいう充分量とは、少なくとも、標的生体分子41の数が、第1の電極2上に固定化されている第1の核酸鎖21の数よりも多い必要がある。
When a sufficient amount of the
サンプル溶液中に標的生体分子41が含まれていない場合は、図7に示すように第1の電極2上の第1の核酸鎖21は、第2の核酸鎖対12の第6の核酸鎖26の一本鎖領域33と二本鎖を形成する。
When the
また、サンプル溶液中に標的生体分子41が含まれていても、微量の場合には、一部の第1の核酸鎖21には、標的生体分子41が結合するために、当該第1の核酸鎖21と、第2の核酸鎖対12の第6の核酸鎖26の一本鎖領域33とは二本鎖を形成せず、標的生体分子41が結合していない第1の核酸鎖21と、第2の核酸鎖対12における第6の核酸鎖26の一本鎖領域33とは二本鎖を形成する。
In addition, even if the
核酸のハイブリダイゼーション条件とは、例えば、25℃での30分保持である。 The nucleic acid hybridization conditions are, for example, holding at 25 ° C. for 30 minutes.
なお、この第4工程は前記第3工程と同時、つまり第2の核酸鎖対12の供給とサンプル溶液の反応セル1への供給は同時に行われても良い。
The fourth step may be performed simultaneously with the third step, that is, the supply of the second nucleic
<第5工程>
次に、第1および第2の電極上に存在する二本鎖に由来する電気化学的信号を検出する。検出を行う方法としては、二本鎖に特異的に結合する挿入剤分子51を二本鎖に結合させ、挿入剤分子の酸化または還元反応を電気化学的に検出する方法が、検出効率が高く望ましいが、この方法でなくとも、二本鎖が検出できる方法であればよい。
<5th process>
Next, an electrochemical signal derived from the double strand present on the first and second electrodes is detected. As a method for detection, a method in which an
図8は第1の核酸21に標的生体分子41が結合している場合に、挿入剤分子51を添加し、二本鎖形成領域に挿入剤分子51が結合した状態を示す模式図である。図10は、第1の核酸21に標的生体分子41が結合していない場合に、挿入剤分子51を添加し、二本鎖形成領域に挿入剤分子51が結合した状態を示す模式図である。
FIG. 8 is a schematic diagram showing a state in which, when the
以下に具体的に手順を示す。 A specific procedure is shown below.
まず、二本鎖核酸に特異的に結合する挿入剤分子51を含む溶液を反応セル1に添加する。
First, a solution containing an
サンプル溶液中に標的生体分子41が充分量存在している場合、図8のように第1の電極2上には二本鎖は形成されていないので、挿入剤分子51は結合しない。一方、第2の電極3上では第2の核酸鎖22、第3の核酸鎖23、第4の核酸鎖24が二本鎖を形成しているためここに二本鎖に挿入剤分子51が結合する。
When a sufficient amount of the
サンプル溶液中に標的生体分子41が存在していない場合、図10のように第1の電極2上にも、第1の核酸鎖21、第5の核酸鎖25、第6の核酸鎖26とが二本鎖を形成する。したがってこの二本鎖に挿入剤分子51が結合する。第2の電極3上でも第2の核酸鎖22、第3の核酸鎖23、第4の核酸鎖24が二本鎖を形成している。この二本鎖にも挿入剤分子51が結合する。
When the
サンプル溶液中に標的生体分子41が微量に存在する場合には、図8のように第1の電極2上に二本鎖が形成されていない場合と、図10のように第1の電極2上に二本鎖が形成されている場合とが混在することになる。二本鎖が形成されている場合には、挿入剤分子51が結合し、二本鎖が形成されていない場合には、挿入剤分子51は結合しない。
When a small amount of the
挿入剤としては、ヘキスト33258が望ましいが、ヘキスト33258に限定されるものではない。アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどの二本鎖認識体を用いても良い。更に、これらの物質にフェロセン、ビオロゲン等の、電気化学的な応答を示す物質で修飾しても同様な検出を行うことが出来る。 As the intercalating agent, Hoechst 33258 is desirable, but it is not limited to Hoechst 33258. Double-strand recognizers such as acridine orange, quinacrine, dounomycin, metallointercalators, bisintercalators such as bisacridine, trisintercalators, and polyintercalators may be used. Furthermore, even if these substances are modified with substances showing an electrochemical response such as ferrocene and viologen, the same detection can be performed.
次に、第1の電極2及び第2の電極3を、各々作用極とし、別途設けられた対極及び参照極を用い、必要に応じて反応セル内に設けられた参照極の電位をフィードバックしながら、反応セル内の作用極と対極との間に電位を掃引して、作用極から検出される電流を測定する。 これらの二本鎖に由来する電気化学的信号の測定は、特開2004−61426号や特開2004−125777号に開示されている塩基配列自動解析装置を用いることにより、簡便に自動にて検査することが可能である。
Next, each of the
図9は第1の核酸鎖21に標的生体分子41が結合した場合に、電流検出を行った状態を示す模式図である。図11は第1の核酸鎖21に標的生体分子41が結合しなかった場合に、電流検出を行った状態を示す模式図である。
FIG. 9 is a schematic diagram showing a state in which current detection is performed when the
サンプル溶液中に標的生体分子41が充分量存在している場合、図9に示すように、検出用の第1の電極2上には二本鎖は存在しないため、第1の電極2からは、挿入剤分子51からの電気化学信号61は観測されない。比較用の第2の電極3上には二本鎖が存在するため、第2の電極3からは挿入剤分子51からの電気化学信号61が観測される。ここで、電気化学信号61の向きは、挿入剤分子として、ヘキスト33258を用いたときの電子の流れの向きを示している。
When a sufficient amount of the
サンプル溶液中に標的生体分子41が存在していない場合、図11に示すように、検出用の第1の電極2上に二本鎖が存在するので、第1の電極2からは、挿入剤分子51からの電気化学信号62が観測される。また比較用の第2の電極3上にも二本鎖が存在するため、第2の電極3から挿入剤分子51からの電気化学信号62が観測される。
When the
サンプル溶液中に標的生体分子41が微量に存在する場合には、検出用の第1の電極2上の第1の核酸鎖21の一部は、図11に示すように第2の核酸鎖対12と二本鎖を形成しており、また一部は図9に示すように二本鎖を形成していない状態になる。従って、二本鎖が形成されている核酸鎖からは電気化学信号が観測され、二本鎖が形成されていない核酸鎖からは電気化学信号が観測されないことになる。従って、この場合には、第1の電極2としては、すべての第1の核酸鎖21が二本鎖を形成している場合の電気化学信号の値と、第1の核酸鎖21が全く二本鎖を形成していない場合の電気化学信号の値の間の値を観測することになる。
When the
このように、サンプル溶液中の、標的生体分子41の存否また、存在量によって、第1の電極2から得られる電気化学信号の大きさが異なる。一方、比較用の第2の電極3から得られる電気化学信号の大きさは標的生体分子41の存否にかかわらず一定である。したがって、比較用の第2の電極3から得られる電気化学信号の大きさから、検出用の第1の電極から得られる電気化学信号の差分を算出することによって、第1の核酸21に結合した標的生体分子41の存否、更には存在量を決定することが出来る。標的生体分子の存在量が多ければ差分の値は大きく、存在量が少なければ差分の値は小さくなる。差分の大きさの判定にはあらかじめ実験等により求めた閾値との比較によって行うことが実用的である。
As described above, the magnitude of the electrochemical signal obtained from the
また、添加されるサンプル溶液中に、充分量の標的生体分子41が存在し、第1の電極2上の全ての第1の核酸鎖21に標的生体分子41が結合している場合には、理想的には電気化学信号が検出されず、第2の電極3のみから電気化学信号61が検出される。実際には標的生体分子41の数によって、標的生体分子41が結合している第1の核酸鎖21の数が変化する。第1の電極2からの電気化学信号62は、標的生体分子41が結合していない第1の核酸鎖21の量に応じた量だけ、観測されることになるため、上記の方法にてサンプル中の標的生体分子の存在量も測定することが可能である。つまり、第2の電極3から得られた電気化学信号の値と、第1の電極2から得られた電気化学信号の値の差分の値から、検出用の第1の電極2に結合した標的生体分子41の量を算出することが可能になる。差分の大きさの判定にはあらかじめ実験等により求めた検量線との比較によって行うことが実用的である。
Further, when a sufficient amount of the
図12は本実施形態の方法による検出電極からの信号値と標的生体分子の結合割合の関係図である。 FIG. 12 is a relationship diagram between the signal value from the detection electrode and the binding ratio of the target biomolecule according to the method of this embodiment.
実際の測定では、すべての第1の核酸21に標的生体分子が結合し、第1の電極2上に二本鎖が存在しない場合でも、電気化学信号は零にはならず、二本鎖以外に非特異的に吸着する挿入剤分子51の酸化・還元反応による電気化学信号が検出される。その場合には、このようなバックグランド信号を差し引いて、信号の大小を評価する必要がある。(図12)
本発明の方法では、標的生体分子41が全く存在しない状況で、挿入剤分子51を反応セル1内に供給し、電圧掃引の結果、検出用の第1の電極2から得られる電気化学信号の値と、比較用の第2の電極3から得られる電気化学信号の値がほぼ等しくなるように第1の核酸鎖対11を形成する第4及び第5の核酸鎖、また第2の核酸鎖対12を形成する第5及び第6核酸鎖、の配列及び長さを選択することが望ましい。また、原理的には、第1の核酸鎖対11は第4の核酸鎖24の領域31のみ、第2の核酸鎖対12は、第6の核酸鎖26の領域33のみでも、第1の核酸鎖21や第2の核酸鎖22が二本鎖を形成したか否かの検出は可能ではあるが、二本鎖由来の電気化学信号を明瞭に検出するため、上記のように、第1の核酸鎖対11に、予め第3の核酸鎖23と第4の核酸鎖24の領域32における二本鎖領域を、第2の核酸鎖対12に、予め第5の核酸鎖25と第6の核酸鎖26の領域34における二本鎖領域を、準備しておくことが非常に有用である。
In actual measurement, even when the target biomolecule binds to all the first
In the method of the present invention, in the situation where the
具体的には、第1の核酸鎖の長さは10塩基以上30塩基以下、さらに望ましくは13塩基以上20塩基以下、第2の核酸鎖の長さは10塩基以上30塩基以下、さらに望ましくは13塩基以上20塩基以下、であることが望ましい。 Specifically, the length of the first nucleic acid chain is 10 to 30 bases, more preferably 13 to 20 bases, and the length of the second nucleic acid chain is 10 to 30 bases, more preferably It is desirable that it is 13 bases or more and 20 bases or less.
また、第4の核酸鎖や、第6の核酸鎖は、長い方が望ましく、第3の核酸鎖は、第4の核酸鎖の内、第2の核酸鎖の相補的な領域以外と相補的に、なっていることが望ましく、第5の核酸鎖は、第6の核酸鎖の内、第1の核酸鎖の相補的な領域以外と相補的になっていることが望ましい。ここで、それぞれの二本鎖領域は、挿入剤分子が結合する領域であるため、長いほど、結合領域が多く、結果として、電気化学信号が大きくなるため、電気化学信号の大小の差を大きく取ることができ、望ましい。 The fourth nucleic acid strand or the sixth nucleic acid strand is preferably longer, and the third nucleic acid strand is complementary to the fourth nucleic acid strand other than the complementary region of the second nucleic acid strand. It is preferable that the fifth nucleic acid strand is complementary to the region other than the complementary region of the first nucleic acid strand in the sixth nucleic acid strand. Here, since each double-stranded region is a region to which an intercalator molecule binds, the longer the length, the more binding regions, resulting in a larger electrochemical signal. Can be taken and desirable.
更には、ここでは、一本鎖である第4の核酸鎖と一本鎖である第3の核酸鎖により、第1の核酸鎖対を形成させ、また、一本鎖である第6の核酸鎖と一本鎖である第5の核酸鎖により、第2の核酸鎖対を形成させ、それぞれを、第2の核酸鎖や第1の核酸鎖とハイブリダイゼーションさせる構成を記述してきたが、これに限定される訳ではない。即ち、第1の核酸鎖対は、第2の核酸鎖と相補的な一本鎖領域と、二本鎖領域が存在していればよいのであるから、第2の核酸鎖と相補的な領域が一本鎖になっている構造を持つLAMP(Loop−Mediated Isothermal Amplification: 栄研化学)増幅された核酸でも良い。第2の核酸鎖対も同様に、第1の核酸鎖と相補的な領域が一本鎖になっている構造を持つLAMP増幅された核酸でも良い。 Further, here, a fourth nucleic acid strand that is a single strand and a third nucleic acid strand that is a single strand form a first nucleic acid strand pair, and a sixth nucleic acid that is a single strand. A configuration has been described in which a second nucleic acid strand pair is formed by a fifth nucleic acid strand that is a single strand and a strand, and each is hybridized with the second nucleic acid strand or the first nucleic acid strand. It is not necessarily limited to. That is, the first nucleic acid strand pair only needs to have a single-stranded region complementary to the second nucleic acid strand and a double-stranded region. Therefore, the first nucleic acid strand pair is a region complementary to the second nucleic acid strand. May be a nucleic acid amplified by LAMP (Loop-Mediated Isolation Amplification) having a single-stranded structure. Similarly, the second nucleic acid strand pair may be a LAMP-amplified nucleic acid having a structure in which a region complementary to the first nucleic acid strand is a single strand.
本実施形態の方法では、標的生体分子を反応させる際に、予め標的生体分子や第2の核酸鎖対に蛍光色素等の標識をする必要がない。従って、これらの標識物質が反応を阻害することによる検出不能、検出感度低下等の問題が発生する心配がない。また、第1及び第2の核酸鎖以外に第3乃至第6の核酸鎖を用い、電極上に形成される二本鎖の絶対量を多くし、各電極から得られる信号量をいわば増幅して測定しているため、精度のよい測定が可能である。 In the method of this embodiment, when reacting a target biomolecule, it is not necessary to label the target biomolecule or the second nucleic acid chain pair with a fluorescent dye or the like in advance. Therefore, there is no fear that problems such as undetectability and detection sensitivity decrease due to inhibition of the reaction by these labeling substances. In addition to the first and second nucleic acid strands, the third to sixth nucleic acid strands are used, the absolute amount of the double strand formed on the electrode is increased, and the amount of signal obtained from each electrode is amplified. Therefore, accurate measurement is possible.
本発明の方法を実施するに当たり、本発明にかかる装置と供給する核酸鎖、試薬類をキット化しておくことが実用上望ましい。キットの形態としては以下のキットA、Bが例示される。 In carrying out the method of the present invention, it is practically desirable to make a kit of the apparatus according to the present invention and the nucleic acid chain and reagents to be supplied. Examples of kit forms include the following kits A and B.
[キットA] 装置A、核酸鎖セットA、その他試薬
装置A:反応セルと、前記反応セル内に設けられた第1及び第2の電極と、前記第1の電極に固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第1の核酸鎖と、前記第2の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖と、を具備する。
[Kit A] Device A, nucleic acid chain set A, other reagents
Apparatus A: Reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, immobilized on the first electrode, functions as an aptamer for a target biomolecule, A first nucleic acid strand capable of binding, and a second nucleic acid strand which is immobilized on the second electrode and does not function as an aptamer with respect to the target biomolecule.
核酸鎖セットA: 第1の核酸鎖対として、前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域とを有する第4の核酸鎖、
第2の核酸鎖対として、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖、とを具備する核酸鎖セット。
Nucleic acid strand set A: As the first nucleic acid strand pair, the first nucleic acid strand and the third nucleic acid strand that does not form a double strand with the complementary strand thereof, and the second nucleic acid strand and the second nucleic acid strand A fourth nucleic acid strand having a single-stranded region capable of forming a strand and a region forming a double strand with the third nucleic acid strand;
As a second nucleic acid strand pair, a fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands, a single-stranded region that can form a double strand with the first nucleic acid strand, and A nucleic acid chain set comprising: a sixth nucleic acid chain having a region forming a double strand with the fifth nucleic acid chain.
試薬類:挿入剤溶液(挿入剤を用いた測定を行う場合)、バッファー類など。
[キットB] 装置B、核酸鎖セットB、その他試薬
装置B:反応セルと、前記反応セル内に設けられた第1及び第2の電極と、前記第1の電極に一端が固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第1の核酸鎖と、前記第2の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖と、第1の核酸鎖対として、前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第4の核酸鎖と、を具備する装置(第2の核酸鎖と第3の核酸が連結された連結核酸鎖であってもよい。)
核酸鎖セットB:第2の核酸鎖対として、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、を具備する核酸鎖セット。
Reagents: intercalating agent solution (when measuring using intercalating agent), buffers, etc.
[Kit B] Device B, nucleic acid chain set B, other reagents
Apparatus B: a reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, one end fixed to the first electrode, functioning as an aptamer for a target biomolecule, and the target living body A first nucleic acid strand that can bind to a molecule, a second nucleic acid strand that has one end immobilized on the second electrode and does not function as an aptamer for the target biomolecule, and a first nucleic acid strand pair, A third nucleic acid strand that does not form a double strand with the first and second nucleic acid strands and their complementary strand, a region that forms a double strand with the second nucleic acid strand, and the third nucleic acid And a fourth nucleic acid chain having a region forming a double strand with the chain (may be a linked nucleic acid chain in which the second nucleic acid chain and the third nucleic acid are linked).
Nucleic acid strand set B: As a second nucleic acid strand pair, a fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands and a double strand with the first nucleic acid strand can be formed A nucleic acid chain set comprising a single nucleic acid region and a sixth nucleic acid strand having a region forming a double strand with the fifth nucleic acid strand.
試薬類:挿入剤溶液(挿入剤を用いた測定を行う場合)、バッファー類など。 Reagents: intercalating agent solution (when measuring using intercalating agent), buffers, etc.
その他、本発明の要素を具備し、当業者が適宜設計変更しうる全ての方法、キットは、本発明の範囲に包含される。 In addition, all methods and kits that include elements of the present invention and that can be appropriately modified by those skilled in the art are included in the scope of the present invention.
以下に、上述の検出装置を用いて、標的生体分子としてトロンビンを検出した具体例を説明する。 Below, the specific example which detected thrombin as a target biomolecule using the above-mentioned detection apparatus is demonstrated.
ガラス基板上に、溝が形成されたシリコーン樹脂構造体を、この溝が基板上に配置されるよう積載し、反応セル1とした。検出用第1の電極2及び比較用第2の電極3はいずれも反応セル1内に収まるように配置されている。ガラス基板上に成膜された金で構成されており、直径200μmの円形の電極とした。ガラス基板上には、12個の電極を形成した。
A silicone resin structure having a groove formed on a glass substrate was loaded so that the groove was disposed on the substrate, and the
電極番号1〜4は、ネガティブコントロール用電極に、電極番号5〜8は、比較用の第2の電極3に、電極番号9〜12は、検出用の第1の電極2として割り当てた。
第1の電極2には、第1の核酸鎖21として、トロンビンアプタマープローブ(配列番号1)を固定化した。これは、トロンビンのフィブリノーゲン結合部位に結合することが知られているアプタマー配列である。
A thrombin aptamer probe (SEQ ID NO: 1) was immobilized on the
第2の電極3には、トロンビンアプタマープローブ(配列番号1)とは異なる配列である第2の核酸鎖22として、ポジティブコントロールプローブ(配列番号2)を固定化した。
A positive control probe (SEQ ID NO: 2) was immobilized on the
更に、ネガティブコントロール用電極には、トロンビンアプタマープローブ(配列番号1)ともポジティブコントロールプローブ(配列番号2)とも異なる配列を持つネガティブコントロールプローブ(配列番号3)を固定化した。 Furthermore, a negative control probe (SEQ ID NO: 3) having a different sequence from the thrombin aptamer probe (SEQ ID NO: 1) and the positive control probe (SEQ ID NO: 2) was immobilized on the negative control electrode.
ここでは、いずれの核酸鎖も3’末端に、チオール基を修飾することにより、金電極上に固定化した。表1に使用した核酸プローブ配列を示す。
このようなチップを反応セル内に設置し、トロンビンを2.7μMの濃度で含有する溶液をチップ上に供給し、25℃で60分間放置した。なお、トロンビンは、10mM Tris HCl、150mM NaCl、5mM KCl、0.05%Tweenによるバッファに溶解させている。 Such a chip was placed in a reaction cell, and a solution containing thrombin at a concentration of 2.7 μM was supplied onto the chip and left at 25 ° C. for 60 minutes. Thrombin is dissolved in a buffer of 10 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.05% Tween.
その後、第6の核酸鎖として検出電極用ターゲット核酸1(配列番号4)、第5の核酸鎖及び第3の核酸鎖として共通なターゲット核酸2(配列番号5)及び第4の核酸鎖としてポジティブコントロールターゲット核酸3(配列番号6)を混合した溶液をチップ上に供給した。これらの核酸は、2×SSC、10mM Tris HCl、5mM KCl、0.05%Tweenによるバッファに溶解させ、ターゲット核酸の終濃度は、それぞれ、ターゲット核酸1が0.4μM、ターゲット核酸2が1.6μM、ターゲット核酸3が0.4μMとなるように調製している。
その後、特開2004−61426号や特開2004−125777号に開示されている塩基配列自動解析装置を用いて、25℃で30分間放置した後に、挿入剤ヘキスト33258をチップ上に供給後、電気化学測定を行った。 Thereafter, using an automatic base sequence analyzer disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-61426 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-125777, after being left at 25 ° C. for 30 minutes, an insertion agent Hoechst 33258 is supplied onto the chip, Chemical measurements were taken.
図13には、上記の方法による測定結果を示す。電極番号1〜4は、バックグラウンド電流としてネガティブコントロールプローブから固定化されている電極からの電流を検出している。電極番号5〜8は、比較用としてポジティブコントロールプローブが固定化されている電極からの電流を示す。電極番号9〜12は、検出用として、アプタマープローブが固定化されている電極からの電流を示す。(a)は、標的生体分子であるトロンビンが含まれていない場合を、(b)には、トロンビンが含まれている場合の実験結果を示している。これを見て分かるように、トロンビンが含まれていると、電流値が低下することが示されており、本手法による検出の効果が実証された。
In FIG. 13, the measurement result by said method is shown.
1: 反応セル
2: 第1の電極(検出用)
3: 第2の電極(比較用)
11: 第1の核酸鎖対
12: 第2の核酸鎖対
21: 第1の核酸鎖
22: 第2の核酸鎖
23: 第3の核酸鎖
24: 第4の核酸鎖
25: 第5の核酸鎖対
26: 第6の核酸鎖
41: 標的生体分子
51: 挿入剤分子
61,62: 電気化学信号
1: Reaction cell 2: First electrode (for detection)
3: Second electrode (for comparison)
11: first nucleic acid strand pair 12: second nucleic acid strand pair 21: first nucleic acid strand 22: second nucleic acid strand 23: third nucleic acid strand 24: fourth nucleic acid strand 25: fifth nucleic acid Strand pair 26: Sixth nucleic acid strand 41: Target biomolecule 51:
Claims (9)
前記反応セルに、前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成している領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第4の核酸鎖、を供給する工程と、
前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、
前記反応セルに、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第1の核酸鎖と前記第6の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、
前記第1の電極から、前記第1の核酸鎖及び前記第5の核酸鎖と、前記第6の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第1の電気化学信号、及び、前記第2の電極から前記第2の核酸鎖及び前記第3の核酸鎖と、前記第4の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第2の電気化学的信号を検出する工程と、
前記第1の電気化学的信号と、前記第2の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする標的生体分子の検出方法。 A reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, one end fixed to the first electrode, function as an aptamer for a target biomolecule, and bind to the target biomolecule Providing a device comprising: a possible first nucleic acid strand; and a second nucleic acid strand, one end of which is immobilized on the second electrode and not functioning as an aptamer for the target biomolecule;
In the reaction cell, a first nucleic acid strand that does not form a double strand with the first and second nucleic acid strands and a complementary strand thereof, a region that forms a double strand with the second nucleic acid strand, and Supplying a fourth nucleic acid strand having a region forming a double strand with the third nucleic acid strand;
Supplying a sample solution that may contain the target biomolecule, and subjecting the target biomolecule and the first nucleic acid strand to a binding condition;
In the reaction cell, a fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands, a single-stranded region that can form a double strand with the first nucleic acid strand, and the fifth strand A first nucleic acid strand that has a region forming a double strand with the first nucleic acid strand, and the first nucleic acid strand not bound to the target biomolecule and the sixth nucleic acid strand A step of forming a double strand with a single-stranded region; and
From the first electrode, a first electrochemical signal derived from a double strand formed between the first nucleic acid strand and the fifth nucleic acid strand and the sixth nucleic acid strand, and the first Detecting a second electrochemical signal derived from a double strand formed between the second nucleic acid strand and the third nucleic acid strand from the second electrode and the fourth nucleic acid strand;
A method for detecting a target biomolecule, comprising the step of calculating an amount of the target biomolecule from a difference between the first electrochemical signal and the second electrochemical signal.
前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく前記工程とは同時に行われることを特徴とする請求項1記載の標的生体分子の検出方法。 Supplying the third nucleic acid strand and the fourth nucleic acid strand to the reaction cell;
2. The step of supplying a sample solution that may contain the target biomolecule and placing the target biomolecule and the first nucleic acid strand under a condition for binding is performed simultaneously. Method for detecting target biomolecules.
前記標的生体分子を含む可能性のあるサンプル溶液を供給し、前記標的生体分子と前記第1の核酸鎖が結合する条件下におく工程と、
前記反応セルに、前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、を供給し、前記標的生体分子と結合しなかった前記第1の核酸鎖と前記第6の核酸鎖の前記一本鎖領域とが二本鎖を形成する条件下におく工程と、
前記第1の電極から、前記第1の核酸鎖及び前記第5の核酸鎖と、前記第6の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第1の電気化学信号、及び、前記第2の電極から前記第2の核酸鎖及び前記第3の核酸鎖と、前記第4の核酸鎖間で形成される二本鎖に由来する第2の電気化学的信号を検出する工程と、
前記第1の電気化学的信号と、前記第2の電気化学的信号との差分から、前記標的生体分子の量を算出する工程とを行うことを特徴とする標的生体分子の検出方法。 A reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, one end fixed to the first electrode, function as an aptamer for a target biomolecule, and bind to the target biomolecule A possible first nucleic acid strand, a second nucleic acid strand, one end of which is immobilized on the second electrode, which does not function as an aptamer for the target biomolecule, the first and second nucleic acid strands, and A third nucleic acid strand that does not form a double strand with the complementary strand, a region that forms a double strand with the second nucleic acid strand, and a region that forms a double strand with the third nucleic acid strand Providing a device comprising a fourth nucleic acid strand having:
Supplying a sample solution that may contain the target biomolecule, and subjecting the target biomolecule and the first nucleic acid strand to a binding condition;
In the reaction cell, a fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands, a single-stranded region that can form a double strand with the first nucleic acid strand, and the fifth strand A first nucleic acid strand that has a region forming a double strand with the first nucleic acid strand, and the first nucleic acid strand not bound to the target biomolecule and the sixth nucleic acid strand A step of forming a double strand with a single-stranded region; and
From the first electrode, a first electrochemical signal derived from a double strand formed between the first nucleic acid strand and the fifth nucleic acid strand and the sixth nucleic acid strand, and the first Detecting a second electrochemical signal derived from a double strand formed between the second nucleic acid strand and the third nucleic acid strand from the second electrode and the fourth nucleic acid strand;
A method for detecting a target biomolecule, comprising the step of calculating an amount of the target biomolecule from a difference between the first electrochemical signal and the second electrochemical signal.
前記反応セルに二本鎖特異的に結合する挿入剤溶液を供給し、前記反応性セル内の二本鎖に挿入剤を結合させる工程と、
前記挿入剤が酸化もしくは還元反応することにより発生する電気化学信号を前記第1の電極及び第2の電極で各々検出する工程を行うことを特徴とする請求項1乃至4記載の標的生体分子の検出方法。 Detecting the first and second electrochemical signals comprises:
Supplying an intercalator solution that specifically binds to a double strand in the reaction cell, and binding the intercalator to the double strand in the reactive cell;
5. The target biomolecule according to claim 1, wherein a step of detecting an electrochemical signal generated by oxidation or reduction reaction of the intercalating agent with the first electrode and the second electrode is performed. Detection method.
前記反応セル内に設けられた第1及び第2の電極と、
前記第1の電極に固定化され、標的生体分子に対してアプタマーとして機能し、前記標的生体分子と結合可能な第1の核酸鎖と、前記第2の電極に一端が固定化され、前記標的生体分子に対してアプタマーとして機能しない第2の核酸鎖と、を具備する装置と、
前記第1、第2の核酸鎖及びそれらの相補鎖と二本鎖を形成しない第3の核酸鎖と、
前記第2の核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第3の核酸鎖と二本鎖を形成している領域とを有する第4の核酸鎖と、
前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、
前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、
を具備することを特徴とする標的生体分子検出用キット。 A reaction cell;
First and second electrodes provided in the reaction cell;
A first nucleic acid chain immobilized on the first electrode, functioning as an aptamer for a target biomolecule, and capable of binding to the target biomolecule; and one end immobilized on the second electrode; A second nucleic acid chain that does not function as an aptamer for a biomolecule, and a device comprising:
A third nucleic acid strand that does not form a double strand with the first and second nucleic acid strands and their complementary strands;
A fourth nucleic acid strand having a single-stranded region capable of forming a double strand with the second nucleic acid strand and a region forming a double strand with the third nucleic acid strand;
A fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands;
A sixth nucleic acid strand having a single-stranded region capable of forming a double strand with the first nucleic acid strand and a region forming a double strand with the fifth nucleic acid strand;
A kit for detecting a target biomolecule, comprising:
前記第1乃至第4の核酸鎖とは二本鎖を形成しない第5の核酸鎖と、
前記第1核酸鎖と二本鎖を形成可能な一本鎖領域及び前記第5の核酸鎖と二本鎖を形成している領域を有する第6の核酸鎖と、
を具備することを特徴とする標的生体分子検出用キット。 A reaction cell, first and second electrodes provided in the reaction cell, one end fixed to the first electrode, function as an aptamer for a target biomolecule, and bind to the target biomolecule A possible first nucleic acid strand, a second nucleic acid strand, one end of which is immobilized on the second electrode, which does not function as an aptamer for the target biomolecule, the first and second nucleic acid strands, and A third nucleic acid strand that does not form a double strand with the complementary strand, a region that forms a double strand with the second nucleic acid strand, and a region that forms a double strand with the third nucleic acid strand A device comprising: a fourth nucleic acid strand having:
A fifth nucleic acid strand that does not form a double strand with the first to fourth nucleic acid strands;
A sixth nucleic acid strand having a single-stranded region capable of forming a double strand with the first nucleic acid strand and a region forming a double strand with the fifth nucleic acid strand;
A kit for detecting a target biomolecule, comprising:
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