JP2011160677A - Microrna effective for detecting presence of liver tumor lesion in mammal for supplying specimen - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の存在を検出するために有効なマイクロＲＮＡ等に関する。 The present invention relates to a microRNA and the like effective for detecting the presence of a liver neoplastic lesion in a mammal providing a specimen.
癌が遺伝子の関わる異常を原因とする疾病であることが次第に明らかになりつつあるが、癌に対する羅患率、死亡率は未だ高い。このような状況において、様々な化学物質の発癌性の有無を事前に確認しておくための安全性試験は極めて重要である。従来、化学物質の発癌性を検定する代表的な方法としては、種々の哺乳動物（例えば、ラット）を多数用い、且つ、長期間の動物飼育を要する安全性試験において、解剖後に採取される組織等のサンプルについて、病理組織学的手法により発癌性病変の有無を評価する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。 It is becoming increasingly clear that cancer is a disease caused by genetic abnormalities, but the morbidity and mortality rates for cancer are still high. In such a situation, a safety test for confirming in advance the presence or absence of carcinogenicity of various chemical substances is extremely important. Conventionally, as a typical method for testing the carcinogenicity of chemical substances, tissues collected after dissection in a safety test that uses a large number of various mammals (for example, rats) and requires long-term animal breeding. A method for evaluating the presence or absence of a carcinogenic lesion by a histopathological technique is known (for example, see Non-Patent Document 1).
しかしながら、上記のような哺乳動物を用いた安全性試験では、病理組織学的手法を用いるために高度な専門技術レベルが不可欠となり、また経時的に発癌性病変の有無を評価する汎用的な方法はこれまでになかった。具体的には、化学物質の発癌標的となる割合の最も高い器官又は組織の一つである肝臓の場合には、良性腫瘍状態である肝細胞腺腫、又は、悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌等のような腫瘍性病変になる前段階である過形成状態の腫瘍性病変にあって、肝細胞腺腫になる直前の病変（以下、前駆病変と記すこともある。）は当該肝細胞腺腫の組織学的特徴に類似した組織変化を呈してくるため、当該病変（即ち、前駆病変）の診断は従来法のみでは場合によっては必ずしも十分に満足のゆくものではなかった。
そこで、化学物質の肝臓発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法の開発が切望されている。また、肝臓癌の素因について哺乳動物個体をスクリーニングする方法が必要とされており、またさらに、肝臓癌の治療方法も非常に望まれている。
However, in the safety test using mammals as described above, a high level of technical skill is indispensable for using histopathological techniques, and a general-purpose method for evaluating the presence or absence of carcinogenic lesions over time. Never before. Specifically, in the case of the liver, which is one of the organs or tissues with the highest rate of target for carcinogenesis of chemical substances, hepatocellular adenoma that is a benign tumor state, or a malignant tumor or liver cancer state In a hyperplastic neoplastic lesion that is a stage before becoming a neoplastic lesion such as hepatocellular carcinoma or the like, a lesion immediately before becoming a hepatocellular adenoma (hereinafter sometimes referred to as a precursor lesion) is the liver. Since the tissue changes similar to the histological characteristics of the cell adenoma, the diagnosis of the lesion (ie, the precursor lesion) is not always satisfactory in some cases by the conventional method alone.
Accordingly, development of a cancer assay method for evaluating the liver carcinogenicity of chemical substances as accurately and simply as possible is eagerly desired. In addition, a method for screening a mammal individual for a predisposition to liver cancer is required, and further, a method for treating liver cancer is highly desired.
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、肝臓腫瘍性病変が存在する哺乳動物由来の血液において、特定のマイクロＲＮＡの含有量が正常生体由来の検体に含まれる当該マイクロＲＮＡの含有量に比べ高い値を示すことを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の存在を検出するために有効なマイクロＲＮＡであり、以下のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡ（以下、本マイクロＲＮＡと記すこともある。）；
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652
２．肝臓腫瘍性病変が、過形成状態である前駆病変、良性腫瘍状態である肝細胞腺腫、又は、悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌であることを特徴とする前項１記載のマイクロＲＮＡ；
３．哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）哺乳動物が提供する検体に含まれる、以下のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの含有量を測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体に含まれるマイクロＲＮＡの含有量の測定値を当該マイクロＲＮＡの含有量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652
４．肝臓腫瘍性病変が、過形成状態である前駆病変、良性腫瘍状態である肝細胞腺腫、又は、悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌であることを特徴とする前項３記載の方法；
５．検体が、血液若しくはその内容物が含まれる生体試料であることを特徴とする前項３又は４記載の方法；
６．マイクロＲＮＡの含有量の対照値が、当該マイクロＲＮＡの正常生体由来の検体に含まれる含有量の値であることを特徴とする前項３〜５のいずれかに記載される方法；
７．第二工程において、マイクロＲＮＡの含有量の測定値が対照値の２倍以上、又は、対照値と比較し統計学的に有意な高値であることを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する工程であることを特徴とする前項３〜６のいずれかに記載される方法；
８．物質の肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性の検定方法であって、
（１）哺乳動物と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた哺乳動物が提供する検体に含まれる、以下のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの含有量を測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られたマイクロＲＮＡの含有量の測定値を当該マイクロＲＮＡの含有量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明肝発癌活性検定方法と記すこともある。）；
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652
９．マイクロＲＮＡの含有量の対照値が、当該マイクロＲＮＡの正常生体由来の検体に含まれる含有量の値であることを特徴とする前項８記載の方法；
１０．第三工程において、マイクロＲＮＡ群の含有量の測定値が対照値の２倍以上若しくは２分の１以下、又は、対照値と比較し統計学的に有意な高値若しくは低値であることを指標とし、前記被験物質の肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を評価することを特徴とする前項８又は９記載の方法；
１１．前項７〜１０のいずれかに記載される方法により評価された肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性に基づき肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質の探索方法；
１２．哺乳動物が提供する検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価するための指標を提供する試薬としての、以下のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの使用；
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652
１３．哺乳動物が提供する検体について、請求項３〜７のいずれかに記載される方法により検出された当該哺乳動物が有する肝臓腫瘍性病変の有無に係るデータ情報を入力・蓄積・管理する手段、前記データ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム；
等を提供するものである。
Under such circumstances, as a result of intensive studies, the present inventors have determined that the content of a specific microRNA contained in a specimen derived from a normal living body in blood derived from a mammal having a liver neoplastic lesion is contained. It has been found that a high value is shown compared to the amount, and the present invention has been achieved.
That is, the present invention
1. It is a microRNA effective for detecting the presence of a liver tumorous lesion in a mammal providing a specimen, and may be one or more microRNAs selected from the following group of microRNAs (hereinafter referred to as the present microRNA). );
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
2. 2. The microRNA according to item 1 above, wherein the liver neoplastic lesion is a precursor lesion that is a hyperplastic state, a hepatocellular adenoma that is a benign tumor state, or a hepatocellular carcinoma that is a malignant tumor or a liver cancer state. ;
3. A method for assaying liver neoplastic lesions in mammals, comprising:
(1) a first step of measuring a content of one or more microRNAs selected from the following microRNA group included in a sample provided by a mammal, and (2) the sample obtained in the first step A second step of comparing the measured value of the content of microRNA contained with the control value of the content of the microRNA and evaluating the presence or absence of a liver tumorous lesion in the mammal providing the specimen based on the difference A method characterized by comprising (hereinafter also referred to as the method of the present invention);
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
4). 4. The method according to item 3 above, wherein the liver neoplastic lesion is a precursor lesion that is a hyperplastic state, a hepatocellular adenoma that is a benign tumor state, or a hepatocellular carcinoma that is a malignant tumor or a liver cancer state;
5. [5] The method according to [3] or [4] above, wherein the specimen is a biological sample containing blood or its contents;
6). The method according to any one of items 3 to 5 above, wherein the control value of the content of microRNA is a value of the content contained in a specimen derived from a normal living body of the microRNA;
7). In the second step, the measured value of the content of microRNA is at least twice the control value, or a statistically significant high value compared to the control value, and based on the index, The method according to any one of 3 to 6 above, which is a step of evaluating the presence or absence of a liver neoplastic lesion;
8). A method for assaying a promoting or inhibiting activity of a substance related to liver carcinogenesis,
(1) a first step of bringing a mammal into contact with a test substance;
(2) a second step of measuring the content of one or more microRNAs selected from the following microRNA group contained in the specimen provided by the mammal contacted with the test substance in the first step; and (3 ) The measured value of the content of the microRNA obtained in the second step is compared with the control value of the content of the microRNA, and based on the difference, the promotion activity or the inhibition activity related to hepatocarcinogenesis of the test substance is evaluated. A method comprising the third step (hereinafter, also referred to as the method for assaying hepatocarcinogenic activity of the present invention);
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
9. 9. The method according to item 8 above, wherein the control value of the content of microRNA is a value of content contained in a specimen derived from a normal living body of the microRNA;
10. In the third step, the measured value of the content of the microRNA group is twice or more than half of the control value, or is a statistically significant high or low value compared to the control value. The method according to item 8 or 9, wherein the test substance is evaluated for promoting activity or inhibiting activity related to liver carcinogenesis;
11. Comprising a step of selecting a substance having a promoting or inhibiting activity related to liver carcinogenesis based on the promoting or inhibiting activity related to liver carcinogenesis evaluated by the method described in any one of 7 to 10 above. A method for searching for a substance having a promoting or inhibiting activity related to liver carcinogenesis;
12 Use of one or more microRNAs selected from the following group of microRNAs as a reagent that provides an indicator for assessing the presence or absence of liver neoplastic lesions in a specimen provided by a mammal;
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
13. Means for inputting / accumulating / managing data information relating to the presence / absence of a liver neoplastic lesion of the mammal detected by the method according to any one of claims 3 to 7 for a specimen provided by the mammal; A system comprising means for inquiring / searching data information based on conditions for obtaining a desired result, and means for displaying / outputting the inquired / searched result;
Etc. are provided.
本発明によって、検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の存在を検出するために有効なマイクロＲＮＡ等が提供可能となる。本発明は、化学物質の肝臓発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法となりうる。また、肝臓癌の素因について哺乳動物個体をスクリーニングする方法や、またさらに、肝臓癌の治療方法にも応用可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a microRNA and the like effective for detecting the presence of a liver tumor lesion in a mammal providing a specimen. The present invention can be a cancer assay method for evaluating the liver carcinogenicity of a chemical substance as accurately and simply as possible. It can also be applied to a method for screening a mammal individual for a predisposition to liver cancer, and further to a method for treating liver cancer.
本発明は、特定のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの含有量と肝臓腫瘍性病変の存在との間の関係を示唆する直接的エビデンスを新たに見出したことに基づくものである。見出された知見とは、具体的には例えば、（１）肝臓腫瘍性病変が存在するラットの血液において、特定のマイクロＲＮＡの含有量が、肝臓腫瘍性病変が存在しないラットの血液におけるマイクロＲＮＡの含有量と顕著に異なり、増大していること、加えて（２）その含有量の変動を示す特定のマイクロＲＮＡは、偶然にも、良性腫瘍状態である肝細胞腺腫、又は、悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌等のような腫瘍性病変になる前段階である過形成状態の腫瘍性病変にあって、肝細胞腺腫になる直前の病変（即ち、前駆病変）のみが存在するラットの血液において、特定のマイクロＲＮＡの含有量が、前駆病変を含めた肝臓腫瘍性病変が存在しないラットの血液におけるマイクロＲＮＡの含有量と異なり、増大していること、等である。 The present invention is based on the discovery of new direct evidence suggesting a relationship between the content of one or more microRNAs selected from a specific group of microRNAs and the presence of liver neoplastic lesions. Specifically, for example, (1) in the blood of a rat in which a liver tumorous lesion exists, the content of a specific microRNA in the blood of a rat in which a liver tumorous lesion does not exist The specific microRNA that shows markedly different and increased content of RNA, and (2) its content variation is, by chance, a hepatocellular adenoma or malignant tumor that is a benign tumor condition Or, there is only a lesion (ie, a precursor lesion) immediately before becoming a hepatocellular adenoma in a hyperplastic neoplastic lesion that is a stage before becoming a neoplastic lesion such as hepatocellular carcinoma that is a liver cancer state. In the blood of existing rats, the content of specific microRNAs is different from the content of microRNAs in the blood of rats that do not have liver neoplastic lesions including precursor lesions, etc. That.
本発明は、検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の存在を検出するために有効なマイクロＲＮＡであり、以下のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡ（即ち、本マイクロＲＮＡ）を含む。
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a（配列番号１：uggcagugucuuagcugguugu）、miR-331（配列番号２：gccccugggccuauccuagaa）、miR-98（配列番号３：ugagguaguaaguuguauuguu）、miR-338（配列番号４：uccagcaucagugauuuuguuga）、miR-652（配列番号５：aauggcgccacuaggguugug）
The present invention is a microRNA effective for detecting the presence of a liver tumorous lesion in a mammal providing a specimen, and one or more microRNAs selected from the following microRNA group (ie, the present microRNA) Including.
<Micro RNA group>
miR-34a (SEQ ID NO: 1 uggcagugucuuagcugguugu), miR-331 (SEQ ID NO: 2: gccccugggccuauccuagaa), miR-98 (SEQ ID NO: 3: ugagguaguaaguuguauuguu), miR-338 (SEQ ID NO: 4: uccagcaucagugauuuuguuga), miR-652 (SEQ ID NO: 5: aauggcgccacuaggguugug)
本発明において「肝臓腫瘍性病変」としては、例えば、（１）悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌等のような腫瘍性病変になる前段階である過形成状態の腫瘍性病変にあって、肝細胞腺腫になる直前の病変（即ち、過形成状態である前駆病変）、（２）良性腫瘍状態である肝細胞腺腫、又は、（３）悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌等を挙げることができる。 In the present invention, the “liver neoplastic lesion” includes, for example, (1) a hyperplastic neoplastic lesion that is a stage before becoming a neoplastic lesion such as a malignant tumor or a hepatocellular carcinoma that is in a liver cancer state. A lesion immediately before becoming a hepatocellular adenoma (ie, a precursor lesion that is a hyperplastic state), (2) a hepatocellular adenoma that is a benign tumor state, or (3) a liver that is a malignant tumor or liver cancer state Examples include cell cancer.
本発明において「マイクロＲＮＡ」（以下、ｍｉＲＮＡと記すこともある。）は、広範囲にわたる種のゲノムにおいて同定されている短い非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、１９９３年に最初にシノラディス・エレガンスにおいて発見され、その後全ての多細胞生物で発見された。マイクロＲＮＡは、遺伝子発現の負の調節因子であり、タンパク質コードｍＲＮＡの３’非翻訳領域内の塩基配列との塩基対の完全若しくは不完全な相互作用によって主に機能すると考えられている。２００６年までに３２６種のマイクロＲＮＡがヒトにおいて発見された。これらのマイクロＲＮＡのそれぞれの役割は未だ知られていないが、特定のマイクロＲＮＡは、脂肪細胞の分化、卵母細胞の成熟、多能性細胞状態の維持、インスリン分泌の調節等の多様な細胞過程の調節に関わっていると推測されている。 In the present invention, “microRNA” (hereinafter sometimes referred to as miRNA) is a short non-coding RNA that has been identified in the genomes of a wide range of species. MicroRNA was first discovered in Shinoladis Elegance in 1993 and subsequently discovered in all multicellular organisms. MicroRNAs are negative regulators of gene expression and are thought to function primarily through complete or incomplete base pairing interactions with base sequences within the 3 'untranslated region of protein-encoded mRNAs. By 2006, 326 microRNAs were discovered in humans. Although the role of each of these microRNAs is not yet known, specific microRNAs are found in diverse cells such as adipocyte differentiation, oocyte maturation, maintenance of pluripotent cell state, regulation of insulin secretion, etc. Presumed to be involved in process regulation.
本発明において「検体」とは、例えば、血液若しくはその内容物が含まれる生体試料をあげることができ、具体的には、例えば、被験哺乳動物から採取された血液そのもの、或いは、血清、血漿等の血液成分が含まれる生体試料又はそれらから分離されたマイクロＲＮＡを含む試料等をあげることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。
本発明において含有量が測定されるマイクロＲＮＡは、上記のマイクロＲＮＡ群（以下、本マイクロＲＮＡ群と記すこともある。）から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡ（即ち、本マイクロＲＮＡ）である。
尚、本発明において含有量が測定されるマイクロＲＮＡは、例えば、配列表に示される塩基配列等の公知の塩基配列と全く同一の塩基配列を有する遺伝子のほか、前記の遺伝子の塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
In the present invention, the “specimen” can include, for example, a biological sample containing blood or its contents. Specifically, for example, blood itself collected from a test mammal or serum, plasma, etc. Or a sample containing microRNA separated from these biological samples. These samples may be used as specimens as they are, or samples prepared by various operations such as separation, fractionation, and immobilization from such specimens may be used as specimens.
The microRNA whose content is measured in the present invention is one or more microRNAs selected from the above microRNA group (hereinafter sometimes referred to as the present microRNA group) (that is, the present microRNA).
In addition, the microRNA whose content is measured in the present invention includes, for example, a gene having a completely identical base sequence to a known base sequence such as the base sequence shown in the sequence listing, A gene having a base sequence in which deletion, substitution, or addition of a base due to a naturally occurring mutation due to a species difference, individual difference, organ, or tissue difference of an organism is also included.
本マイクロＲＮＡの含有量の測定は、生体試料におけるＲＮＡの含有量を測定するのに適切な方法、例えば、単位量の検体あたりの本マイクロＲＮＡの転写物量を測定する方法等の通常の方法（具体的には、増幅に基づく方法やハイブリダイゼーションに基づく方法等）を使用して測定することができる。
本マイクロＲＮＡの含有量を測定するには、例えば、マイクロＲＮＡ定量的リアルタイム−ポリメラーゼチェイン反応（以下、定量的ＲＴ−ＰＣＲと記すこともある。）、マイクロＲＮＡマイクロアレイ法等により実施することができる。
The measurement of the content of the present microRNA is an ordinary method such as a method suitable for measuring the content of RNA in a biological sample, for example, a method of measuring the amount of transcript of the present microRNA per unit amount of specimen ( Specifically, it can be measured using a method based on amplification or a method based on hybridization.
The content of the present microRNA can be measured, for example, by a microRNA quantitative real-time-polymerase chain reaction (hereinafter sometimes referred to as quantitative RT-PCR), a microRNA microarray method, or the like. .
増幅に基づく方法では、増幅反応（例えば、ポリメラーゼチェイン反応）における鋳型として、本マイクロＲＮＡを使用する。本マイクロＲＮＡの含有量は、本マイクロＲＮＡの逆転写の後、その逆転写産物のポリメラーゼチェイン反応による増幅によって測定することもできる。本マイクロＲＮＡの含有量は、内部標準、例えば、同じ試料内に存在する含有量に変動がないマイクロＲＮＡの存在量、又は、予め検体に混ぜ込んだ量が既知である検体の動物種とは異なる他の動物種由来のマイクロＲＮＡと比較して定量化することができる。定量的増幅では、濃度が既知である本マイクロＲＮＡの増幅産物の量と元の試料における鋳型の量と比較することにより試料中の含有量を求めることができる。ＴａｑＭａｎプローブを使用する定量的ＲＴ‐ＰＣＲの方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Chen C et al.(2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res.33(20):e179.、Lao K et al.(2006) Multiplexing RT-PCR for the detection of multiple miRNA species in small samples., Biochem Biophys Res Commun.343(1):85-89.等に記載されている。 In a method based on amplification, the present microRNA is used as a template in an amplification reaction (for example, a polymerase chain reaction). The content of the present microRNA can also be measured by reverse transcription of the present microRNA and then amplification of the reverse transcript by a polymerase chain reaction. The content of this microRNA is the internal standard, for example, the amount of microRNA present in the same sample with no variation, or the animal species of the sample whose amount previously mixed with the sample is known. It can be quantified in comparison to microRNA from other different animal species. In quantitative amplification, the content in the sample can be determined by comparing the amount of the amplification product of the present microRNA having a known concentration with the amount of the template in the original sample. Methods of quantitative RT-PCR using TaqMan probes are well known in the art, e.g., Chen C et al. (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20): e179., Lao K et al. (2006) Multiplexing RT-PCR for the detection of multiple miRNA species in small samples., Biochem Biophys Res Commun. 343 (1): 85-89. ing.
ハイブリダイゼーションに基づく方法としては、例えば、ノーザンブロット解析、溶液ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護検定（Hui Wand et al.(2007) Direct and sensitive miRNA profiling from low-input total RNA RNA 13:151-159）も当業者に周知である。 Examples of methods based on hybridization include Northern blot analysis, solution hybridization, and RNase protection assay (Hui Wand et al. (2007) Direct and sensitive miRNA profiling from low-input total RNA RNA 13: 151-159). Well known to those skilled in the art.
検体に含まれる複数の本マイクロＲＮＡの含有量を同時に測定するのに適切な方法としては、例えば、マイクロアレイに基づく方法等を挙げることができる。当該方法を使用して、例えば、本マイクロＲＮＡ群に含まれる全てのマイクロＲＮＡの含有量を測定する場合がある。このような方法は、１組の本マイクロＲＮＡに特異的な１組のプローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロチップフォーマット（即ち、マイクロアレイ）において、オリゴライブラリーを作成する手順を伴う。このようなマイクロアレイを使用して、検体に含まれる複数の本マイクロＲＮＡの含有量は、ＲＮＡを逆転写して１組の標的オリゴヌクレオチドを生成し、それらの標的オリゴヌクレオチドをマイクロアレイ上のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、ハイブリダイゼーションプロファイル又は発現プロファイルを作成することにより、測定される。次いで、検体のハイブリダイゼーションプロファイルを対照検体のハイブリダイゼーションプロファイルと比較し、どのマイクロＲＮＡにおいて含有量が変化したのかを測定することができる。因みに、マイクロアレイ法の例は、米国特許出願第2005/0277139号等に記載されている。 Examples of a method suitable for simultaneously measuring the contents of a plurality of present microRNAs contained in a specimen include a method based on a microarray. Using this method, for example, the content of all microRNAs contained in this group of microRNAs may be measured. Such a method involves creating an oligo library in a microchip format (ie, a microarray) containing a set of probe oligonucleotides specific for a set of the present microRNAs. Using such a microarray, the content of a plurality of the present microRNAs contained in a sample is obtained by reverse-trancribing the RNA to generate a set of target oligonucleotides, which are then used as probe oligonucleotides on the microarray. To produce a hybridization profile or expression profile. The sample hybridization profile can then be compared to the control sample hybridization profile to determine which microRNAs have changed content. Incidentally, examples of the microarray method are described in US Patent Application No. 2005/0277139 and the like.
また、増幅に基づく方法を使用して、本マイクロＲＮＡのコピー数を測定することもできる。当該方法において、対応するマイクロＲＮＡの塩基配列は、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）の鋳型の役割を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量が元の検体における鋳型の量に比例する。適切な対照に対する比較により、使用される特異的プローブに対応する本マイクロＲＮＡのコピー数の指標が得られる。ＴａｑＭａｎプローブを使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲの方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Heid et al., 1996, Real time quantitative PCR., Genome Res., 10:986‐994等に記載されている。 Amplification-based methods can also be used to measure the copy number of the present microRNA. In this method, the base sequence of the corresponding microRNA serves as a template for an amplification reaction (for example, PCR). In quantitative amplification, the amount of amplification product is proportional to the amount of template in the original sample. Comparison to the appropriate control gives an indication of the copy number of the microRNA corresponding to the specific probe used. Methods for quantitative RT-PCR using TaqMan probes are well known in the art and are described, for example, in Heid et al., 1996, Real time quantitative PCR., Genome Res., 10: 986-994. ing.
また、ＴａｑＭａｎに基づく方法を使用して、本マイクロＲＮＡを定量化することもできる。ＴａｑＭａｎに基づく方法では、５’蛍光色素及び３’消光剤を含む蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブが使用される。当該プローブはＰＣＲ産物にハイブリダイズするが、３’末端における遮断剤によりそれ自体は伸長することができない。次のサイクルでＰＣＲ産物が増幅されると、ポリメラーゼ（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ）の５’ヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎプローブの開裂をもたらす。当該開裂によって、５’蛍光色素と３’消光剤とが分離し、それによって増幅の機能として蛍光が増大する（例えば、http://www2.perkin‐elmer.comを参照）。 The present microRNA can also be quantified using TaqMan based methods. TaqMan-based methods use a fluorogenic oligonucleotide probe that includes a 5 'fluorescent dye and a 3' quencher. The probe hybridizes to the PCR product but cannot itself be extended by a blocking agent at the 3 'end. When the PCR product is amplified in the next cycle, the 5 'nuclease activity of the polymerase (eg, AmpliTaq) results in cleavage of the TaqMan probe. The cleavage separates the 5 'fluorescent dye and the 3' quencher, thereby increasing fluorescence as a function of amplification (see eg http://www2.perkin-elmer.com).
適切な増幅方法の他の例として、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Wu and Wallace, Genomics, 4:560, 1989、Landegren et al., Science, 241:1077, 1988、Barringer et al., Gene, 89:117, 1990）、転写増幅（Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173,1989）、自立配列複製（Guatelli et al., Proc Nat Acad Sci, USA 87:1874, 1990）、ドットＰＣＲ、リンカーアダプターＰＣＲ等が挙げられるが、これらに限定されない。 Other examples of suitable amplification methods include ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics, 4: 560, 1989, Landegren et al., Science, 241: 1077, 1988, Barringer et al., Gene, 89 : 117, 1990), transcription amplification (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173, 1989), self-sustaining sequence replication (Guatelli et al., Proc Nat Acad Sci, USA 87: 1874, 1990), dot PCR, linker adapter PCR, and the like, but are not limited thereto.
本マイクロＲＮＡのコピー数を測定する１つの効果的な方法は、マイクロアレイに基づくプラットフォームを使用する。マイクロアレイ技術は高分解能が得られるため、使用される場合がある。例えば、伝統的なＣＧＨのマッピング分解能は一般的に２０Ｍｂと限られているのに対して、マイクロアレイに基づくＣＧＨでは、マッピング分解能の向上が達成される。各種のマイクロアレイ方法の詳細は、例えば、米国特許第6,232,068号、Pollack et al., Nat. Genet., 23(1):41‐6, (1999）等に記載されている。 One effective method of measuring the copy number of the present microRNA uses a microarray-based platform. Microarray technology may be used because it provides high resolution. For example, traditional CGH mapping resolution is typically limited to 20 Mb, whereas microarray-based CGH achieves improved mapping resolution. Details of various microarray methods are described in, for example, US Pat. No. 6,232,068, Pollack et al., Nat. Genet., 23 (1): 41-6, (1999).
検体の「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、本質的には前記検体の状態のフィンガープリントであり、２つの状態にはいずれかの特定のマイクロＲＮＡが同じように発現されている場合があり、いくつかのマイクロＲＮＡの含有量を測定することによって、当該検体に固有のマイクロＲＮＡ発現プロファイルの作成が同時に可能となることがある。即ち、異なる状態の検体の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態のそれぞれにおいてどのマイクロＲＮＡがより重要であり、効果的であるかに関する情報が得られる。当該情報の使用は、例えば、特定の治療において、（例えば、特定の患者の長期の予後を改善するように化学療法薬が作用するかどうかを判定するために）評価される場合がある。同様に、診断は、患者由来の検体を既知の発現プロファイルと比較することにより実施又は確認される場合がある。更に、これらのマイクロＲＮＡ発現プロファイルによって、肝臓腫瘍性病変発現プロファイルを抑制するか又は予後不良プロファイルを予後良好プロファイルに変える医薬品のスクリーニングが可能となろう。 The “expression profile” or “hybridization profile” of a specimen is essentially a fingerprint of the state of the specimen, and in any of the two states, any particular microRNA may be expressed in the same way. Yes, by measuring the content of several microRNAs, it may be possible to simultaneously create a microRNA expression profile unique to the specimen. That is, by comparing the expression profiles of analytes in different states, information about which microRNAs are more important and effective in each of these states can be obtained. The use of this information may be evaluated, for example, in a particular treatment (eg, to determine whether a chemotherapeutic agent works to improve the long-term prognosis of a particular patient). Similarly, diagnosis may be performed or confirmed by comparing a patient-derived specimen with a known expression profile. In addition, these microRNA expression profiles may allow screening of pharmaceuticals that suppress liver tumor lesion expression profiles or change poor prognosis profiles to good prognosis profiles.
本マイクロＲＮＡの含有量の測定方法についてさらに説明する。
本マイクロＲＮＡの含有量であるｍｉＲＮＡ量は、例えば、本マイクロＲＮＡの塩基配列に基づいて設計、調製されたプローブ又はプライマーを使用して、通常の遺伝子工学的方法、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロＲＮＡマイクロアレイ法等を用いることによって測定することができる。具体的には、例えば、Chen C et al. (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20): e179.、Hui Wand et al. (2007) Direct and sensitive miRNA profiling from low-input total RNA, RNA 13: 151-159、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis著；モレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）発行、1989年等に記載された方法に準じて行うことができる。この際、検体に含まれる含有量が恒常的に一定であることが知られているマイクロＲＮＡや、検体中に予め一定量混ぜ込む人工マイクロＲＮＡ（以下、総じて内部対照ＲＮＡと記すこともある。）の量を同時に測定しても良い。そして、内部対照ＲＮＡの量若しくはその指標値あたりの本マイクロＲＮＡのｍｉＲＮＡ量又はその指標値を算出することにより、本マイクロＲＮＡの含有量を求めてもよい。
The method for measuring the content of the present microRNA will be further described.
The amount of miRNA that is the content of the present microRNA is determined by, for example, a conventional genetic engineering method such as quantitative RT-PCR using a probe or primer designed and prepared based on the base sequence of the present microRNA. It can be measured by using a microRNA microarray method or the like. Specifically, for example, Chen C et al. (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20): e179., Hui Wand et al. (2007) Direct and sensitive miRNA profiling from low-input total RNA, RNA 13: 151-159, by J. Sambrook, EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory ( Cold Spring Harbor Laboratory), published in 1989, etc. At this time, the microRNA whose content contained in the specimen is known to be constantly constant or an artificial microRNA (hereinafter, generally referred to as an internal control RNA) that is mixed with a predetermined amount in the specimen in advance. ) May be measured simultaneously. Then, the content of the present microRNA may be obtained by calculating the amount of the internal control RNA or the miRNA amount of the present microRNA per the index value or the index value thereof.
（１．マイクロＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
本マイクロＲＮＡの含有量を測定しようとする検体から以下の方法でｍｉＲＮＡを調製する。
例えば、まず、マイクロＲＮＡが含まれる検体から、塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の汎用的な方法によってｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出する。例えばISOGEN（ニッポンジーン製）等の市販のキットを利用して全ＲＮＡを抽出してもよい。
抽出された全ＲＮＡから、例えば、以下のようにしてｍｉＲＮＡを調製する。まず、オリゴｄＴをリガンドとして有するポリＡカラムを5倍カラム容量以上のLoading buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.5M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］を用いて、平衡化し、続いて前述の方法で調製された全ＲＮＡをカラムにかけ、10倍カラム容量のloading bufferで洗浄する。さらに５倍カラム容量のWashing buffer［20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％(w/v)SDS］で洗浄する。続いて、３倍カラム容量のelution buffer［10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.6）、1mM EDTA、0.05％(w/v)SDS］でｍＲＮＡを溶出させることによってｍｉＲＮＡを得る。
また、例えば、PARISTMキット（Applied Biosystems）等の市販のキットを利用して全ＲＮＡを抽出してもよい。当該方法は検体が血液若しくはその内容物が含まれる生体試料の場合に特に好ましい。
尚、前記の全ＲＮＡの抽出において、目的のマイクロＲＮＡの含有量の測定を邪魔しない人工マイクロＲＮＡを一定量混ぜ込み、目的のマイクロＲＮＡの含有量を測定する際の内部対照として使用してもよい。このような人工マイクロＲＮＡとしては、例えば、ショウジョウバエのマイクロＲＮＡ（例えば、miR-3、miR-6）等を挙げることができる。
抽出された全ＲＮＡからのマイクロＲＮＡの含有量の測定は、例えば、TaqManTM MicroRNA Assays（Applied Biosystems）等の市販キットを利用して、目的のマイクロＲＮＡと混ぜ込んだ人工マイクロＲＮＡのCt値を求め、得られたCt値を元に市販キットの説明に従い測定値を算出すればよい。
(1. Quantitative RT-PCR of microRNA)
MiRNA is prepared from the sample to be measured for the content of the microRNA by the following method.
For example, first, total RNA containing miRNA is extracted from a sample containing microRNA by a general-purpose method such as guanidine hydrochloride / phenol method, SDS-phenol method, guanidine thiocyanate / CsCl method or the like. For example, total RNA may be extracted using a commercially available kit such as ISOGEN (manufactured by Nippon Gene).
For example, miRNA is prepared from the extracted total RNA as follows. First, a poly A column having oligo dT as a ligand is used with a loading buffer [20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% (w / v) SDS] having a column volume of 5 times or more. Equilibrate and then apply the total RNA prepared by the method described above to the column and wash with 10 column loading buffer. Further, the column is washed with a 5-fold column volume of Washing buffer [20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% (w / v) SDS]. Subsequently, miRNA is obtained by eluting the mRNA with 3 column volumes of elution buffer [10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6), 1 mM EDTA, 0.05% (w / v) SDS].
For example, total RNA may be extracted using a commercially available kit such as PARIS ™ kit (Applied Biosystems). This method is particularly preferred when the specimen is a biological sample containing blood or its contents.
In the extraction of total RNA, a certain amount of artificial microRNA that does not interfere with the measurement of the target microRNA content may be mixed and used as an internal control when measuring the target microRNA content. Good. Examples of such artificial microRNA include Drosophila microRNA (eg, miR-3, miR-6) and the like.
Measurement of the content of microRNA from the extracted total RNA is performed by, for example, using a commercially available kit such as TaqMan ™ MicroRNA Assays (Applied Biosystems) to determine the Ct value of the artificial microRNA mixed with the target microRNA. What is necessary is just to calculate a measured value according to description of a commercially available kit based on the obtained Ct value.
（２．マイクロＲＮＡマイクロアレイ解析）
本マイクロＲＮＡの含有量の測定には、例えば、ナイロンメンブラン等のメンブランフィルター等に本マイクロＲＮＡのｃＤＮＡをスポットして作製されるマクロアレイ、スライドガラス等に、本マイクロＲＮＡのｃＤＮＡをスポットして作製されるマイクロアレイ、スライドガラス上に本マイクロＲＮＡの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチド（通常18〜25merの鎖長）を光化学反応を利用して固定して作製されるプローブアレイ等、公知の技術に基づいたマイクロアレイを利用することができる。これらのマイクロアレイの作製は、例えばゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて行うことができる。またAffymetrix社等から市販されているGenechip等を利用することもできる。
また、例えば、Rat マイクロＲＮＡ Microarray Kit (8x15K)（Agilent Technologies）等の市販キットを利用して、当該キットに添付される説明書に記載される方法に従い、目的のマイクロＲＮＡのシグナルを数値化し、含有量を測定してもよい。当該方法は検体がラット由来の血液若しくはその内容物が含まれる生体試料の場合に適する。
(2. MicroRNA microarray analysis)
For the measurement of the content of the microRNA, for example, the microRNA cDNA is spotted on a macroarray or a slide glass produced by spotting the microRNA cDNA on a membrane filter such as a nylon membrane. Known microarrays such as probe arrays prepared by immobilizing oligonucleotides having a partial sequence of the base sequence of this microRNA on a slide glass (usually 18-25mer chain length) using a photochemical reaction, etc. Technology-based microarrays can be used. These microarrays can be prepared in accordance with, for example, the method described in the Genome Function Research Protocol, Experimental Medicine Separate Volume (published by Yodosha). Moreover, Genechip etc. which are marketed from Affymetrix etc. can also be utilized.
In addition, for example, using a commercially available kit such as Rat microRNA Microarray Kit (8x15K) (Agilent Technologies), the signal of the target microRNA is quantified according to the method described in the instructions attached to the kit, The content may be measured. This method is suitable when the specimen is a biological sample containing rat-derived blood or its contents.
以下、マイクロアレイを用いて本マイクロＲＮＡの含有量を測定する方法の一例を示す。
（２−１．サンプル調製）
本マイクロＲＮＡの含有量を測定しようとする検体から上記（１．マイクロＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ）に記載された方法と同様の方法でｍｉＲＮＡを調製する。調製されたｍｉＲＮＡ100ngに、例えばmiRNA Complete Labeling and Hyb Kit（Agilent社）中のCIP 0.5μL及び10xCIP Buffer 0.4uLを添加し、さらに全量が4μLとなるようにDnase/Rnase free水を加え、37℃、30分間脱リン酸化する。次いで、2.8μlのDMSOを添加し、100℃、5-10分間熱変性させた後、直ちに2分間氷冷する。上記Kitに含まれる10xT4 LigaseBuffer 1.0uL,Cyanine-pCp 3.0μL及びT4 RNA Ligase 0.5μLを混合しておき、氷冷後のサンプルに添加する。16℃、2時間ライゲーション反応を行った後、真空濃縮機を用いてサンプルを完全乾固させる。これにDnase/Rnase free水 18μLを加え、乾固したRNAを完全に溶解させる。これに上記Kitに含まれる10xGene Expression Blocking Agent 4.5μLと2xHi-RPM Hybridization Buffer 22.5μLを加え、100℃、5分間保温後、直ちに5分間氷冷する。卓上遠心機でスピンダウンした後、全量をアレイとのハイブリダイゼーションに使用する。予め55℃にセットしたオーブン中でアレイを回転（回転数：20rpm）させながら20時間ハイブリダイゼーションさせる。
Hereinafter, an example of a method for measuring the content of the present microRNA using a microarray will be described.
(2-1. Sample preparation)
MiRNA is prepared from a sample to be measured for the content of the present microRNA in the same manner as described in (1. Quantitative RT-PCR of microRNA). To 100 ng of prepared miRNA, for example, CIP 0.5 μL and 10 × CIP Buffer 0.4 uL in miRNA Complete Labeling and Hyb Kit (Agilent) are added, and further, Dnase / Rnase free water is added so that the total amount becomes 4 μL, 37 ° C., Dephosphorylate for 30 minutes. Next, 2.8 μl of DMSO is added, heat-denatured at 100 ° C. for 5-10 minutes, and then immediately ice-cooled for 2 minutes. 10 × T4 LigaseBuffer 1.0 uL, Cyanine-pCp 3.0 μL and T4 RNA Ligase 0.5 μL contained in the kit are mixed and added to the ice-cooled sample. After ligation reaction at 16 ° C for 2 hours, the sample is completely dried using a vacuum concentrator. To this, add 18 μL of Dnase / Rnase free water to completely dissolve the dried RNA. To this is added 4.5 μL of 10 × Gene Expression Blocking Agent and 22.5 μL of 2 × Hi-RPM Hybridization Buffer contained in the above Kit, and the mixture is incubated at 100 ° C. for 5 minutes and then immediately ice-cooled for 5 minutes. After spinning down on a tabletop centrifuge, the entire volume is used for hybridization with the array. Hybridization is performed for 20 hours while rotating the array (rotation speed: 20 rpm) in an oven set in advance at 55 ° C.
（２−２．マイクロアレイによる定量）
上記のサンプルを卓上遠心機でスピンダウンした後、全量を用いて、予め55℃にセットしたオーブン中でアレイを回転（回転数：20rpm）させながら20時間ハイブリダイゼーションさせる。Gene Expression Wash Pack(Agilent社）に含まれる洗浄バッファー1の中でアレイを室温で5分間洗浄する。このとき、バッファーはスターラーで中程度の回転数で撹拌しておく。さらに、予め37℃に温めておいた洗浄バッファー2の中でアレイを5分間洗浄する。このときも同様にバッファーはスターラーで中程度の回転数で撹拌しておく。アレイを洗浄バッファーから引き上げる。マイクロアレイ上のシグナル量をスキャナーにより測定することによって、本マイクロＲＮＡの量、即ち、本マイクロＲＮＡの発現量を測定することができる。上記のほかに、市販のマイクロアレイ及びサンプル調整用キット(アフィメトリックス社)等を用いることもできる。
(2-2. Quantification by microarray)
The above sample is spun down with a tabletop centrifuge, and then the entire amount is used for hybridization for 20 hours while rotating the array (rotation number: 20 rpm) in an oven set at 55 ° C. in advance. The array is washed for 5 minutes at room temperature in wash buffer 1 included in Gene Expression Wash Pack (Agilent). At this time, the buffer is stirred with a stirrer at a medium rotational speed. In addition, the array is washed for 5 minutes in wash buffer 2 previously warmed to 37 ° C. Also at this time, the buffer is stirred with a stirrer at a medium rotation speed. Lift array from wash buffer. By measuring the signal amount on the microarray with a scanner, the amount of the present microRNA, that is, the expression level of the present microRNA can be measured. In addition to the above, commercially available microarrays and sample preparation kits (Affymetrix) can also be used.
本発明検出方法においては、前記のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの含有量を、上述のようにして測定する。含有量を測定するマイクロＲＮＡを複数選ぶ場合には、前記のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡを複数選んでもよい。 In the detection method of the present invention, the content of one or more microRNAs selected from the group of microRNAs is measured as described above. When selecting a plurality of microRNAs whose content is to be measured, a plurality of one or more microRNAs selected from the group of microRNAs may be selected.
本マイクロＲＮＡの含有量の測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本マイクロＲＮＡの含有量を測定する方法等により行うことができる。 The content of the present microRNA can be measured by a method for measuring the content of the present microRNA per unit amount of the sample as described above.
上記のようにして得られた前記検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の測定値を、当該マイクロＲＮＡの含有量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する。 The measured value of the content of the present microRNA contained in the specimen obtained as described above is compared with the control value of the content of the microRNA, and based on the difference, the liver tumor lesion in the specimen is compared. Evaluate presence or absence.
本マイクロＲＮＡの含有量の対照値としては、例えば、前記被験物質と接触させていない正常生体由来の検体に含まれる含有量の値をあげることができる。正常生体由来の検体は、正常生体由来の血液若しくはその内容物が含まれる生体試料における当該マイクロＲＮＡの含有量の値を好ましくあげることができる。ここで正常生体とは、例えば、被験物質と接触していない生体で病理組織学的検査において異常の認められない生体を意味する。かかる対照値は、正常生体由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量を、被験物質と接触させた哺乳動物由来の検体に含まれる当該マイクロＲＮＡの含有量と併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験物質と接触させる前の哺乳動物由来の検体の一部を採取して本マイクロＲＮＡの含有量を測定し、得られた値を対照値とすることもできる。
例えば、被験物質と接触させた哺乳動物由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の測定値が、正常生体由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の値の２倍以上、又は、対照値と比較し統計学的に有意な高値であれば、検体中に肝臓腫瘍性病変を有すると評価することができる。
Examples of the control value for the content of the present microRNA include the value of the content contained in a specimen derived from a normal living body that has not been brought into contact with the test substance. A specimen derived from a normal living body can preferably increase the value of the content of the microRNA in a biological sample containing blood derived from a normal living body or its contents. Here, the normal living body means, for example, a living body that is not in contact with the test substance and has no abnormality in histopathological examination. Such a control value is obtained by measuring the content of the present microRNA contained in a specimen derived from a normal organism in parallel with the content of the microRNA contained in a specimen derived from a mammal contacted with a test substance. Alternatively, it may be obtained by measuring separately. For example, a part of a mammal-derived specimen before contact with the test substance can be collected to measure the content of the present microRNA, and the obtained value can be used as a control value.
For example, the measured value of the content of the present microRNA contained in a mammal-derived specimen brought into contact with the test substance is at least twice the value of the content of the present microRNA contained in a specimen derived from a normal organism, or A statistically significant high value compared to the control value can be evaluated as having a liver neoplastic lesion in the sample.
本発明肝発癌活性検定方法においては、まず、哺乳動物と被験物質とを接触させる。哺乳動物としては、例えば、イヌ、ネコ等の愛玩動物、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜、ラット、マウス、ウサギ等の実験動物、サル、ヒト等の霊長類等を挙げることができる。
本発明肝発癌活性検定方法において、哺乳動物と被験物質との接触は、例えば、哺乳動物に被験物質を投与することにより行ってもよい。哺乳動物は、天然の動物のほか、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物等であってもよい。哺乳動物への被験物質の投与方法としては、例えば、経口（強制又は飲料水や餌に混じ）、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、経気道等により行うことができる。投与量、投与回数及び投与期間は、例えば、全身状態、全身諸器官組織等に重篤な影響を及ぼさない範囲内（例えば投与量は、最大耐量）とすればよい。
In the method for assaying hepatocarcinogenic activity of the present invention, first, a mammal is brought into contact with a test substance. Examples of mammals include pets such as dogs and cats, domestic animals such as cows, horses and sheep, laboratory animals such as rats, mice and rabbits, and primates such as monkeys and humans.
In the method for assaying hepatocarcinogenic activity of the present invention, the contact between the mammal and the test substance may be performed, for example, by administering the test substance to the mammal. Mammals may be natural animals, transgenic animals, gene knockout animals, and the like. As a method for administering a test substance to a mammal, for example, oral (forcibly or mixed with drinking water or food), intramuscular, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, trans-airway, etc. can be used. The dose, the number of doses, and the administration period may be within a range that does not seriously affect the general state, systemic organ tissues, etc. (eg, the dose is the maximum tolerated dose).
次に、上記のようにして被験物質と接触させた哺乳動物由来の検体に含まれる、前記のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの含有量を、上述のようにして測定する。含有量を測定するマイクロＲＮＡを複数選ぶ場合には、前記のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡを複数選んでもよい。
本マイクロＲＮＡの含有量の測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本マイクロＲＮＡの含有量を測定する方法等により行うことができる。
Next, the content of one or more microRNAs selected from the group of microRNAs contained in the mammal-derived specimen brought into contact with the test substance as described above is measured as described above. When selecting a plurality of microRNAs whose content is to be measured, a plurality of one or more microRNAs selected from the group of microRNAs may be selected.
The content of the present microRNA can be measured by a method for measuring the content of the present microRNA per unit amount of the sample as described above.
対照値に比較した、検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の変化によって、検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変が存在することが示される。いくつかの実施形態において、検体に含まれる目的のマイクロＲＮＡの含有量は、対照値よりも高い。本明細書で使用される通り、検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量が対照値よりも多い場合、本マイクロＲＮＡの含有量は「増加」される。 A change in the content of the present microRNA contained in the sample compared to the control value indicates the presence of a liver neoplastic lesion in the mammal providing the sample. In some embodiments, the content of the target microRNA contained in the specimen is higher than the control value. As used herein, the content of the microRNA is “increased” when the content of the microRNA contained in the specimen is greater than the control value.
複数の本マイクロＲＮＡの含有量が肝臓腫瘍性病変と関連していることから、肝臓腫瘍性病変の存在は、本マイクロＲＮＡの含有量のいずれか１つを測定することによって、または測定の際に本マイクロＲＮＡの含有量のいずれかの組み合わせを測定することによって、検定することができる。 Because the content of multiple microRNAs is associated with liver neoplastic lesions, the presence of liver neoplastic lesions can be determined by measuring any one of the microRNA contents or during measurement. It can be assayed by measuring any combination of the content of the present microRNA.
本マイクロＲＮＡの含有量の変化は、検体を提供する哺乳動物における過形成状態である前駆病変、良性腫瘍状態である肝細胞腺腫、又は、悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌を検出することができる。そのため、本発明はまた、良性腫瘍状態である肝細胞腺腫、又は、悪性腫瘍若しくは肝がん状態である肝細胞癌を生じる危険性がある哺乳動物が提供する検体をスクリーニングする方法であって、前記検体において肝臓腫瘍性病変に関連する少なくとも１つの本マイクロＲＮＡの含有量又は本マイクロＲＮＡの含有量の組合せを評価する手順を含む方法も提供する。従って、前記検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量又は本マイクロＲＮＡの含有量の組合せが、対照値に比較して変化することは、前記検体を提供する哺乳動物に肝臓腫瘍性病変を生じる危険性があることを示す。このようなスクリーニングのために使用される検体は、正常であるかまたは前癌性であることが疑われるかのいずれかの肝臓組織を含む哺乳動物から提供されるものでよい。 Changes in the content of this microRNA detect precursor lesions that are hyperplastic in mammals that provide specimens, hepatocellular adenomas that are benign tumors, or hepatocellular carcinomas that are malignant or liver cancer can do. Therefore, the present invention is also a method for screening a specimen provided by a mammal at risk of developing a hepatocellular adenoma that is a benign tumor state, or a hepatocellular carcinoma that is a malignant tumor or a liver cancer state, Also provided is a method comprising evaluating a content of at least one present microRNA or a combination of present microRNA content associated with liver neoplastic lesions in said specimen. Therefore, when the content of the present microRNA or the combination of the present content of the microRNA contained in the specimen changes compared to the control value, the risk of causing a liver tumorous lesion in the mammal providing the specimen Indicates that there is sex. The specimen used for such screening may be provided from a mammal containing liver tissue that is either normal or suspected of being precancerous.
上記のようにして被験物質と接触させた哺乳動物が提供する検体から得られた本マイクロＲＮＡの含有量の測定値を、当該マイクロＲＮＡの含有量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を評価する。
本マイクロＲＮＡの含有量の対照値としては、例えば、前記被験物質と接触させていない正常生体由来の検体に含まれる含有量の値をあげることができる。正常生体由来の検体は、正常生体由来の血液若しくはその内容物が含まれる生体試料における当該マイクロＲＮＡの含有量の値を好ましくあげることができる。ここで正常生体とは、例えば、被験物質と接触していない生体で病理組織学的検査において異常の認められない生体を意味する。かかる対照値は、正常生体由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量を、被験物質と接触させた哺乳動物由来の検体に含まれる当該マイクロＲＮＡの含有量と併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験物質と接触させる前の哺乳動物由来の検体の一部を採取して本マイクロＲＮＡの含有量を測定し、得られた値を対照値とすることもできる。
例えば、被験物質と接触させた哺乳動物由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の測定値が、正常生体由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の値の２倍以上、又は、対照値と比較し統計学的に有意な高値であれば、前記被験物質との接触による肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞の発生を意味し、当該被験物質は肝発癌に係る促進活性を有すると評価することができる。
一方、例えば、被験物質と接触させた哺乳動物由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の測定値が、正常生体由来の検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量の２分の１以下、又は、対照値と比較し統計学的に有意な低値であれば、前記被験物質との接触による肝臓腫瘍性病変組織を構成する肝細胞の発生抑制を意味し、当該被験物質は肝発癌に係る抑制活性を有すると評価することができる。因みに、このような場合の実施形態において、検体に含まれる目的の本マイクロＲＮＡの含有量は、対照値よりも低い。本明細書で使用される通り、検体に含まれる本マイクロＲＮＡの含有量が対照値よりも少ない場合、本マイクロＲＮＡの含有量は「減少」する。対照値における相対的な本マイクロＲＮＡの含有量は、１つ以上の本マイクロＲＮＡの含有量に対して測定することができる。
The measured value of the content of the present microRNA obtained from the specimen provided by the mammal contacted with the test substance as described above is compared with the control value of the content of the microRNA, and based on the difference. The test substance is evaluated for promoting activity or inhibiting activity related to hepatocarcinogenesis.
Examples of the control value for the content of the present microRNA include the value of the content contained in a specimen derived from a normal living body that has not been brought into contact with the test substance. A specimen derived from a normal living body can preferably increase the value of the content of the microRNA in a biological sample containing blood derived from a normal living body or its contents. Here, the normal living body means, for example, a living body that is not in contact with the test substance and has no abnormality in histopathological examination. Such a control value is obtained by measuring the content of the present microRNA contained in a specimen derived from a normal organism in parallel with the content of the microRNA contained in a specimen derived from a mammal contacted with a test substance. Alternatively, it may be obtained by measuring separately. For example, a part of a mammal-derived specimen before contact with the test substance can be collected to measure the content of the present microRNA, and the obtained value can be used as a control value.
For example, the measured value of the content of the present microRNA contained in a mammal-derived specimen brought into contact with the test substance is at least twice the value of the content of the present microRNA contained in a specimen derived from a normal organism, or If the value is statistically significant compared to the control value, it means the generation of hepatocytes constituting the liver tumorous lesion tissue by contact with the test substance, and the test substance has a promoting activity related to liver carcinogenesis. It can be evaluated as having.
On the other hand, for example, the measured value of the content of the present microRNA contained in a mammal-derived specimen brought into contact with the test substance is not more than half the content of the present microRNA contained in a specimen derived from a normal living body, Or, if it is a statistically significant low value compared to the control value, it means suppression of the generation of hepatocytes constituting the liver tumorous lesion tissue by contact with the test substance, and the test substance is responsible for liver carcinogenesis. It can be evaluated that it has such inhibitory activity. Incidentally, in the embodiment in such a case, the content of the target microRNA contained in the specimen is lower than the control value. As used herein, the content of the present microRNA is “decreased” when the content of the present microRNA in the sample is less than the control value. The relative content of the present microRNA in a control value can be measured relative to the content of one or more present microRNAs.
さらに、上記のような本発明肝発癌活性検定方法は、「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」の探索等に利用することができる。具体的には、本発明肝発癌活性検定方法により評価された肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性に基づき「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」を選抜することによって、「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」を探索することができる。
選抜された肝発癌に係る促進活性を有する物質は、例えば、肝癌モデル哺乳動物の作製等に利用することもできる。また選抜された肝発癌に係る抑制活性を有する物質は、例えば、肝発がん予防剤、肝発がん治療剤等に利用することもできる。
Furthermore, the method for assaying hepatocarcinogenic activity of the present invention as described above can be used for searching for “a substance having a promoting or inhibiting activity related to hepatocarcinogenesis”. Specifically, by selecting a “substance having a promoting or inhibiting activity related to liver carcinogenesis” based on the promoting or inhibiting activity related to liver carcinogenesis evaluated by the method for assaying hepatocarcinogenesis of the present invention, It is possible to search for “substances having promoting activity or inhibiting activity”.
The selected substance having a promoting activity related to liver carcinogenesis can be used, for example, for preparing a liver cancer model mammal. The selected substance having inhibitory activity related to liver carcinogenesis can also be used, for example, as a hepatocarcinogenesis preventive agent, liver carcinogenesis therapeutic agent, and the like.
本発明肝発癌活性検定方法により評価された肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性に基づき選抜された「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」は、当該技術分野で既知の技法に従って、哺乳動物への投与前に、「医薬品」と通常呼ばれる薬学的組成物として調製することができる。従って、本発明は、肝臓腫瘍を治療するための薬学的組成物を包含する。 The `` substance having a promoting or suppressing activity related to liver carcinogenesis '' selected based on the promoting or suppressing activity related to liver carcinogenesis evaluated by the method for assaying hepatocarcinogenesis of the present invention, according to a technique known in the art, Prior to administration to mammals, it can be prepared as a pharmaceutical composition commonly referred to as a “pharmaceutical”. Accordingly, the present invention includes pharmaceutical compositions for treating liver tumors.
本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌であり且つ発熱物質がないことを特徴とする。本明細書で使用される場合、薬学的「組成物」又は「製剤」は、ヒト及び獣医学的使用のための製剤を包含する。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載されている。 The pharmaceutical composition of the present invention is characterized in that it is at least sterile and free of pyrogens. As used herein, a pharmaceutical “composition” or “formulation” includes formulations for human and veterinary use. Methods for preparing the pharmaceutical compositions of the present invention are described, for example, in Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985).
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体と混合された少なくとも１つの「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」（例えば、０．１〜９０重量％）又はその生理的に許容される塩を含む。また、本発明の薬学的組成物は、リポソーム又は薬学的に許容される担体によってカプセル化された少なくとも１つの「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」を含んでよい。 The pharmaceutical composition of the present invention comprises at least one “substance having a promoting or suppressing activity related to liver carcinogenesis” (for example, 0.1 to 90% by weight) or a mixture thereof mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. Contains physiologically acceptable salts. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may contain at least one “substance having a promoting or inhibiting activity related to liver carcinogenesis” encapsulated by liposomes or a pharmaceutically acceptable carrier.
適切な薬学的に許容される担体としては、例えば、水、緩衝用水、生理食塩液、０．４重量％生理食塩水、０．３重量％グリシン、ヒアルロン酸等を挙げることができる。 Suitable pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, buffered water, physiological saline, 0.4% by weight physiological saline, 0.3% by weight glycine, hyaluronic acid and the like.
本発明の薬学的組成物は、従来の薬学的賦形剤及び／又は添加剤を含んでもよい。適切な薬学的賦形剤としては、例えば、安定剤、抗酸化剤、モル浸透圧調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤等を挙げることができる。適切な添加剤としては、例えば、生理的に生体適合性を有する緩衝剤（例えば、塩酸トロメタミン）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡやＤＴＰＡ‐ビスアミド）、カルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ‐ビスアミド）の添加剤、場合により、カルシウム塩又はナトリウム塩（例えば、塩酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム）の添加剤等を挙げることができる。本発明の薬学的組成物は、液体形態で使用するためにパッケージすることができ、また凍結乾燥することもできる。 The pharmaceutical composition of the present invention may comprise conventional pharmaceutical excipients and / or additives. Suitable pharmaceutical excipients include, for example, stabilizers, antioxidants, osmolarity adjusting agents, buffers, pH adjusting agents and the like. Suitable additives include, for example, physiologically biocompatible buffers (eg, tromethamine hydrochloride), chelating agents (eg, DTPA and DTPA-bisamide), calcium chelate complexes (eg, calcium DTPA, CaNaDTPA-bisamide) ) Additives, and optionally, calcium salts or sodium salts (for example, calcium hydrochloride, calcium ascorbate, calcium gluconate, calcium lactate). The pharmaceutical compositions of the invention can be packaged for use in liquid form and can be lyophilized.
本発明の固体の薬学的組成物としては、例えば、従来の無毒性で固体の薬学的に許容される担体（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレード）等を使用することができる。 The solid pharmaceutical compositions of the present invention include, for example, conventional non-toxic solid pharmaceutically acceptable carriers such as mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, talc, cellulose, glucose, Pharmaceutical grades such as sucrose and magnesium carbonate) can be used.
例えば、経口投与のための固体の薬学的組成物は、上記の担体及び賦形剤のいずれか、並びに１０重量％〜９５重量％、好ましくは２５重量％〜７５重量％の少なくとも１つの「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」を含んでよい。エアゾール（吸入）投与のための薬学的組成物は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の、上記の通りのリポソーム及び噴射剤の中にカプセル化した少なくとも１つの「肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を有する物質」を含んでよい。また、例えば、鼻腔内送達のためのレシチン等の担体を所望により含んでよい。 For example, a solid pharmaceutical composition for oral administration comprises any of the above carriers and excipients, and at least one “liver” of 10% to 95%, preferably 25% to 75% by weight. A substance having a promoting or suppressing activity related to carcinogenesis ”may be included. A pharmaceutical composition for aerosol (inhalation) administration is at least 0.01% to 20%, preferably 1% to 10% by weight encapsulated in liposomes and propellants as described above. One “substance having a promoting or suppressing activity related to liver carcinogenesis” may be included. Also, for example, a carrier such as lecithin for intranasal delivery may optionally be included.
本発明は、上記説明の如く、検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の有無を評価するための指標を提供する試薬としての、前記のマイクロＲＮＡ群（即ち、miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652）から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの使用
を含み、またさらに、哺乳動物が提供する検体について、本発明方法により検出された当該哺乳動物が有する肝臓腫瘍性病変の有無に係るデータ情報を入力・蓄積・管理する手段（以下、手段ａと記すこともある。）、前記データ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段（以下、手段ｂと記すこともある。）、及び、照会・検索された結果を表示・出力する手段（以下、手段ｃと記すこともある。）を具備することを特徴とするシステムをも含むものである。
As described above, the present invention provides the microRNA group (ie, miR-34a, miR-331) as a reagent that provides an index for evaluating the presence or absence of liver tumorous lesions in a mammal that provides a specimen. , MiR-98, miR-338, miR-652), and further, the liver of the mammal detected by the method of the present invention for the specimen provided by the mammal Means for inputting / accumulating / managing data information related to the presence / absence of neoplastic lesions (hereinafter also referred to as means a), means for querying / searching the data information based on conditions for obtaining a desired result ( And a system characterized by comprising means (hereinafter also referred to as means c) for displaying and outputting the inquiry / search results. It is a waste.
まず、手段ａについて説明する。手段ａは、前記のとおり、本発明方法により検出された当該哺乳動物が有する肝臓腫瘍性病変の有無に係るデータ情報を入力した後、入力された当該情報を蓄積・管理する手段である。かかる情報は、入力手段１により入力され、通常記憶手段２に記憶される。入力手段としては、例えばキーボード、マウス等の当該情報の入力可能なものが挙げられる。当該情報の入力及び蓄積・管理が完了すれば、次の手段ｂに進む。尚、当該情報の蓄積・管理には、コンピュータ等のハードウェアとＯＳ及びデータベース管理等のソフトウエアとを用いて、データ構造を有する情報を入力し、適当な記憶装置、例えば、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスク等のコンピュータ読取可能な記録媒体に蓄積することにより、大量のデータを効率良く蓄積し管理すればよい。 First, the means a will be described. As described above, the means a is means for storing and managing the input information after inputting the data information related to the presence or absence of the liver tumor lesion of the mammal detected by the method of the present invention. Such information is input by the input unit 1 and stored in the normal storage unit 2. As an input means, what can input the said information, such as a keyboard and a mouse | mouth, is mentioned, for example. When the input, storage, and management of the information are completed, the process proceeds to the next means b. The information is stored and managed by inputting information having a data structure using hardware such as a computer and software such as OS and database management, and using an appropriate storage device such as a flexible disk, an optical disk, or the like. By storing in a computer-readable recording medium such as a magnetic disk, CD-ROM, DVD-ROM, or hard disk, a large amount of data may be stored and managed efficiently.
手段ｂについて説明する。手段ｂは、前記のとおり、手段ａにより蓄積・管理された前記データ情報を所望の結果を得るための条件に基づき照会・検索する手段である。かかる情報は、入力手段１により照会・検索のための条件が入力され、通常記憶手段２に記憶された上記情報の中で当該条件に合致したものを選択すれば、次の手段ｃに進む。選択された結果は、通常、記憶手段２に記憶され、さらに表示・出力手段３により表示可能となっている。 The means b will be described. The means b is a means for inquiring and searching the data information stored and managed by the means a based on conditions for obtaining a desired result as described above. For such information, if the condition for inquiry / search is input by the input means 1 and the information that matches the condition is selected from the information stored in the normal storage means 2, the process proceeds to the next means c. The selected result is normally stored in the storage unit 2 and can be displayed by the display / output unit 3.
手段ｃについて説明する。手段ｃは、前記のとおり、照会・検索された結果を表示・出力する手段である。表示・出力手段３としては、例えばディスプレイ、プリンタ等が挙げられ、当該結果をコンピュータのディスプレイ装置に表示するか、印刷等により紙上に出力するか等すればよい。 The means c will be described. The means c is a means for displaying and outputting the result of inquiry / search as described above. Examples of the display / output means 3 include a display, a printer, and the like, and the result may be displayed on a display device of a computer or output on paper by printing or the like.
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these.
実施例１ フェノバルビタール誘発肝細胞癌を有するラットの血液を検体とする肝臓腫瘍性病変の検定方法
（１）血液の採取
５週齢のFisher344ラット（以下、F344ラットと記すこともある。）にN-nitrosodiethylamine （以下、NDENと記すこともある。）200mg/kgを腹腔内へ投与した後、２週間後から３６週間、Sodium Phenobarbital（フェノバルビタール）500ppmを基礎飼料に混じ投与した。投与後、これらの薬剤が投与されたF344ラットとこれらの薬剤が投与されず基礎飼料のみが与えられたF344ラットとの両者から血液を採血した。採取された血液から通常の方法により、血清を調製した。
（２）全ＲＮＡの採取
（１）で得られた各血清からPARISTMキット（Applied Biosystems）を用いて全RNAを抽出した。
（３）マイクロＲＮＡマイクロアレイ解析
（２）で抽出した全ＲＮＡからRat miRNA Microarray Kit (8x15K)（Agilent Technologies）等の市販キットを用い、標準プロトコールに従い、目的のマイクロＲＮＡのシグナルを数値化し、抽出した全ＲＮＡ中に含まれる目的のマイクロＲＮＡの含有量を測定した。
（４）肝臓腫瘍性病変の有無の評価
検体中での本マイクロＲＮＡ全て（miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652）の含有量は、正常な肝臓を有するF344ラットと肝細胞癌を有するF344ラットとは明確に区別され、当該含有量の差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無が評価可能であることが判明した。
Example 1 Assay Method for Liver Tumor Lesions Using Blood of Rats with Phenobarbital-Induced Hepatocellular Carcinoma as Sample (1) Collection of Blood Five-week-old Fisher344 rats (hereinafter sometimes referred to as F344 rats) After 200 mg / kg of N-nitrosodiethylamine (hereinafter also referred to as NDEN) was administered intraperitoneally, 500 ppm of Sodium Phenobarbital (phenobarbital) was mixed with the basic feed for 2 to 36 weeks. After administration, blood was collected from both F344 rats to which these drugs were administered and F344 rats to which these drugs were not administered and only a basal feed was given. Serum was prepared from the collected blood by a conventional method.
(2) Collection of total RNA Total RNA was extracted from each serum obtained in (1) using a PARIS ™ kit (Applied Biosystems).
(3) MicroRNA microarray analysis Using the commercially available kit such as Rat miRNA Microarray Kit (8x15K) (Agilent Technologies) from the total RNA extracted in (2), the target microRNA signal was digitized and extracted according to the standard protocol. The content of the target microRNA contained in the total RNA was measured.
(4) Evaluation of the presence or absence of liver neoplastic lesions The content of all the microRNAs (miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652) in the sample has a normal liver It was found that F344 rats and F344 rats with hepatocellular carcinoma were clearly distinguished and the presence or absence of liver neoplastic lesions in the specimen could be evaluated based on the difference in the contents.
実施例２ DDT誘発肝細胞癌を有するラットの血液を検体とする肝臓腫瘍性病変の検定方法
（１）血液の採取
５週齢のF344ラットにNDEN 200mg/kgを腹腔内へ投与した後、２週間後から３６週間、1,1-bis(p-chlorophenyl)-2,2,2-trichloroethane（以下、DDTと記すこともある。）500ppmを基礎飼料に混じ投与した。投与後、これらの薬剤が投与されたF344ラットとこれらの薬剤が投与されず基礎飼料のみが与えられたF344ラットとの両者から血液を採血した。採取された血液から通常の方法により、血清を調製した。
（２）全RNAの採取
（１）で得られた各血清からPARISTMキット（Applied Biosystems）を用いて全RNAを抽出した。
（３）マイクロＲＮＡマイクロアレイ解析
（２）で抽出した全ＲＮＡからRat miRNA Microarray Kit (8x5K)（Agilent Technologies）等の市販キットを用い、標準プロトコールに従い、目的のマイクロＲＮＡのシグナルを数値化し、抽出した全ＲＮＡ中に含まれる目的のマイクロＲＮＡの含有量を測定した。
（４）肝臓腫瘍性病変の有無の評価
検体中での本マイクロＲＮＡ全て（miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652）の含有量は、正常な肝臓を有するF344ラットと肝細胞癌を有するF344ラットとは明確に区別され、当該含有量の差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無が評価可能であることが判明した。
Example 2 Assay Method for Liver Tumor Lesion Using Blood of Rat Having DDT-Induced Hepatocellular Carcinoma as Sample (1) Blood Collection After administration of NDEN 200 mg / kg intraperitoneally to 5-week-old F344 rats, 2 After 36 weeks, 500 ppm of 1,1-bis (p-chlorophenyl) -2,2,2-trichloroethane (hereinafter sometimes referred to as DDT) was mixed with the basic feed and administered for 36 weeks. After administration, blood was collected from both F344 rats to which these drugs were administered and F344 rats to which these drugs were not administered and only a basal feed was given. Serum was prepared from the collected blood by a conventional method.
(2) Collection of total RNA Total RNA was extracted from each serum obtained in (1) using a PARIS ™ kit (Applied Biosystems).
(3) MicroRNA microarray analysis From the total RNA extracted in (2), using a commercially available kit such as Rat miRNA Microarray Kit (8x5K) (Agilent Technologies), the target microRNA signal was digitized and extracted according to the standard protocol. The content of the target microRNA contained in the total RNA was measured.
(4) Evaluation of the presence or absence of liver neoplastic lesions The content of all the microRNAs (miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652) in the sample has a normal liver It was found that F344 rats and F344 rats with hepatocellular carcinoma were clearly distinguished and the presence or absence of liver neoplastic lesions in the specimen could be evaluated based on the difference in the contents.
実施例３ クロフィブレート誘発肝細胞腺腫を有するラットの血液を検体とする肝臓腫瘍性病変の検定方法
（１）血液の採取
５週齢のF344ラットにNDEN 200mg/kgを腹腔内へ投与した後、２週間後から３６週間、Clofibrate（クロフィブレート）3000ppmを基礎飼料に混じ投与した。投与後、これらの薬剤が投与されたF344ラットとこれらの薬剤が投与されず基礎飼料のみが与えられたF344ラットとの両者から血液を採血した。採取された血液から通常の方法により、血清を調製した。
（２）全ＲＮＡの採取
（１）で得られた各血清からPARISTMキット（Applied Biosystems）を用いて全RNAを抽出した。
（３）マイクロＲＮＡマイクロアレイ解析
（２）で抽出した全RNAからRat miRNA Microarray Kit (8x15K)（Agilent Technologies）等の市販キットを用い、標準プロトコールに従い、目的のマイクロＲＮＡのシグナルを数値化し、抽出した全ＲＮＡ中に含まれる目的のマイクロＲＮＡの含有量を測定した。
（４）肝臓腫瘍性病変の有無の評価
検体中での本マイクロＲＮＡ全て（miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652）の含有量は、正常な肝臓を有するF344ラットと肝細胞腺腫を有するF344ラットとは明確に区別され、当該含有量の差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無が評価可能であることが判明した。
Example 3 Assay Method for Liver Tumor Lesion Using Blood of Rats with Clofibrate-Induced Hepatocellular Adenoma (1) Blood Collection After intraperitoneal administration of NDEN 200 mg / kg to 5-week-old F344 rats From 2 weeks to 36 weeks, Clofibrate (clofibrate) 3000 ppm was mixed with the basic feed and administered. After administration, blood was collected from both F344 rats to which these drugs were administered and F344 rats to which these drugs were not administered and only a basal feed was given. Serum was prepared from the collected blood by a conventional method.
(2) Collection of total RNA Total RNA was extracted from each serum obtained in (1) using a PARIS ™ kit (Applied Biosystems).
(3) MicroRNA microarray analysis Using the commercially available kit such as Rat miRNA Microarray Kit (8x15K) (Agilent Technologies) from the total RNA extracted in (2), the target microRNA signal was digitized and extracted according to the standard protocol. The content of the target microRNA contained in the total RNA was measured.
(4) Evaluation of the presence or absence of liver neoplastic lesions The content of all the microRNAs (miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652) in the sample has a normal liver The F344 rat and the F344 rat having hepatocellular adenoma were clearly distinguished, and it was found that the presence or absence of a liver tumorous lesion in the specimen could be evaluated based on the difference in the content.
実施例４ フェノバルビタール誘発肝細胞腺腫又はその前駆病変を有するラットの血液を検体とする肝臓腫瘍性病変の検定方法
（１）血液の採取
５週齢のF344ラットにNDEN 200mg/kgを腹腔内へ投与した後、２週間後から２６週間、フェノバルビタール 500ppmを基礎飼料に混じ投与した。投与後、これらの薬剤が投与されたF344ラットとこれらの薬剤が投与されず基礎飼料のみが与えられたF344ラットとの両者から血液を採血した。採取された血液から通常の方法により、血清を調製した。
（２）全ＲＮＡの採取
（１）で得られた各血清にショウジョウバエ由来miR-3と同じ塩基配列を有する人工マイクロＲＮＡを0.2fmolの濃度で混ぜ込んだ後、得られた各血清からPARISTMキット（Applied Biosystems）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
（３）マイクロＲＮＡ定量的ＲＴ−ＰＣＲによる解析
（２）で抽出した全ＲＮＡからTaqManTM MicroRNA Assays（Applied Biosystems）等の市販キットを用い、標準プロトコールに従い、目的のマイクロＲＮＡと混ぜ込んだ人工マイクロＲＮＡのCt値を求め、得られたCt値を元に測定値を算出した。
（４）肝臓腫瘍性病変の有無の評価
検体中での本マイクロＲＮＡ全て（miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652）の含有量は、正常な肝臓を有するF344ラットと、肝細胞腺腫を有するF344ラット又はその前駆病変を有するF344ラットとは明確に区別され、当該含有量の差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無が評価可能であることが判明した。
Example 4 Assay Method for Liver Tumor Lesion Using Blood of Rats with Phenobarbital-Induced Hepatocellular Adenoma or Its Precursor Lesion (1) Blood Collection NDEN 200 mg / kg into the abdominal cavity of 5-week old F344 rats After administration, 500 ppm of phenobarbital was mixed with the basic feed for 2 weeks to 26 weeks. After administration, blood was collected from both F344 rats to which these drugs were administered and F344 rats to which these drugs were not administered and only a basal feed was given. Serum was prepared from the collected blood by a conventional method.
(2) After fancy mixed at a concentration of 0.2fmol artificial micro RNA having the same nucleotide sequence as Drosophila miR-3 in the serum obtained in sampling (1) of the total RNA, PARIS from each serum obtained TM Total RNA was extracted using a kit (Applied Biosystems).
(3) Analysis by microRNA quantitative RT-PCR Using commercially available kits such as TaqMan ™ MicroRNA Assays (Applied Biosystems) from the total RNA extracted in (2), artificial micros mixed with the desired microRNA according to the standard protocol The Ct value of RNA was determined, and the measured value was calculated based on the obtained Ct value.
(4) Evaluation of the presence or absence of liver neoplastic lesions The content of all the microRNAs (miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652) in the sample has a normal liver F344 rat and F344 rat with hepatocellular adenoma or F344 rat with its precursor lesion can be clearly distinguished, and the presence or absence of liver neoplastic lesion in the specimen can be evaluated based on the difference in the content found.
実施例５ クロフィブレート誘発肝細胞腺腫又はその前駆病変を有するラットの血液を検体とする肝臓腫瘍性病変の検定方法
（１）血液の採取
５週齢のF344ラットにNDEN 200mg/kgを腹腔内へ投与した後、２週間後から２６週間、クロフィブレート 3000ppmを基礎飼料に混じ投与した。投与後、これらの薬剤が投与されたF344ラットとこれらの薬剤が投与されず基礎飼料のみが与えられたF344ラットとの両者から血液を採血した。採取された血液から通常の方法により、血清を調製した。
（２）全ＲＮＡの採取
（１）で得られた各血清にショウジョウバエ由来miR-3と同じ配列を有する人工マイクロＲＮＡを0.2fmolの濃度で混ぜ込んだ後、PARISTMキット（Applied Biosystems）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
（３）マイクロＲＮＡ定量的ＲＴ−ＰＣＲによる解析
（２）で抽出した全ＲＮＡからTaqManTM MicroRNA Assays（Applied Biosystems）等の市販キットを用い、標準プロトコールに従い、目的のマイクロＲＮＡと混ぜ込んだ人工マイクロＲＮＡのCt値を求め、得られたCt値を元に測定値を算出した。
（４）肝臓腫瘍性病変の有無の評価
検体中での本マイクロＲＮＡ全て（miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652）の含有量は、正常な肝臓を有するF344ラットと、肝細胞腺腫を有するF344ラット又はその前駆病変を有するF344ラットとは明確に区別され、当該含有量の差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変の有無が評価可能であることが判明した。
Example 5 Assay Method for Liver Tumor Lesion Using Blood of Rats with Clofibrate-Induced Hepatocellular Adenoma or Its Precursor Lesions (1) Blood Collection NDEN 200 mg / kg intraperitoneally to 5-week-old F344 rats From 2 weeks to 26 weeks, clofibrate 3000 ppm was mixed with the basic feed. After administration, blood was collected from both F344 rats to which these drugs were administered and F344 rats to which these drugs were not administered and only a basal feed was given. Serum was prepared from the collected blood by a conventional method.
(2) Collecting total RNA Artificial microRNA having the same sequence as Drosophila-derived miR-3 was mixed in each serum obtained in (1) at a concentration of 0.2 fmol, and then using the PARIS ™ kit (Applied Biosystems). Total RNA was extracted.
(3) Analysis by microRNA quantitative RT-PCR Using commercially available kits such as TaqMan ™ MicroRNA Assays (Applied Biosystems) from the total RNA extracted in (2), artificial micros mixed with the desired microRNA according to the standard protocol The Ct value of RNA was determined, and the measured value was calculated based on the obtained Ct value.
(4) Evaluation of the presence or absence of liver neoplastic lesions The content of all the microRNAs (miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652) in the sample has a normal liver F344 rat and F344 rat with hepatocellular adenoma or F344 rat with its precursor lesion can be clearly distinguished, and the presence or absence of liver neoplastic lesion in the specimen can be evaluated based on the difference in the content found.
本発明によって、検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の存在を検出するために有効なマイクロＲＮＡ等が提供可能となる。本発明は、化学物質の肝臓発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法となりうる。また、肝臓癌の素因について哺乳動物個体をスクリーニングする方法や、またさらに、肝臓癌の治療方法にも応用可能である。 According to the present invention, it is possible to provide a microRNA and the like effective for detecting the presence of a liver tumor lesion in a mammal providing a specimen. The present invention can be a cancer assay method for evaluating the liver carcinogenicity of a chemical substance as accurately and simply as possible. It can also be applied to a method for screening a mammal individual for a predisposition to liver cancer, and further to a method for treating liver cancer.
Claims (13)
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652 One or more microRNAs selected from the following group of microRNAs, which are effective microRNAs for detecting the presence of liver neoplastic lesions in a mammal providing a specimen.
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
（１）哺乳動物が提供する検体に含まれる、以下のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの含有量を測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体に含まれるマイクロＲＮＡの含有量の測定値を当該マイクロＲＮＡの含有量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体を提供する哺乳動物における肝臓腫瘍性病変の有無を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法。
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652 A method for assaying liver neoplastic lesions in mammals, comprising:
(1) a first step of measuring a content of one or more microRNAs selected from the following microRNA group included in a sample provided by a mammal, and (2) the sample obtained in the first step A second step of comparing the measured value of the content of microRNA contained with the control value of the content of the microRNA and evaluating the presence or absence of a liver tumorous lesion in the mammal providing the specimen based on the difference A method characterized by comprising.
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
（１）哺乳動物と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた哺乳動物が提供する検体に含まれる、以下のマイクロＲＮＡ群から選ばれる１以上のマイクロＲＮＡの含有量を測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られたマイクロＲＮＡの含有量の測定値を当該マイクロＲＮＡの含有量の対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌に係る促進活性若しくは抑制活性を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法。
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652 A method for assaying a promoting or inhibiting activity of a substance related to liver carcinogenesis,
(1) a first step of bringing a mammal into contact with a test substance;
(2) a second step of measuring the content of one or more microRNAs selected from the following microRNA group contained in the specimen provided by the mammal contacted with the test substance in the first step; and (3 ) The measured value of the content of the microRNA obtained in the second step is compared with the control value of the content of the microRNA, and based on the difference, the promotion activity or the inhibition activity related to hepatocarcinogenesis of the test substance is evaluated. And a third step.
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
＜マイクロＲＮＡ群＞
miR-34a、miR-331、miR-98、miR-338、miR-652 Use of one or more microRNAs selected from the following group of microRNAs as a reagent that provides an indicator for evaluating the presence or absence of liver tumorous lesions in a specimen provided by a mammal.
<Micro RNA group>
miR-34a, miR-331, miR-98, miR-338, miR-652
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