JP2011160674A

JP2011160674A - New antisense rna stem loop

Info

Publication number: JP2011160674A
Application number: JP2010023781A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Harada; 和雄原田; Tetsuo Suzuki; 哲郎鈴木; Takaji Wakita; 隆字脇田; Ichiro Hirao; 一郎平尾; Iwao Nozawa; 巌野澤
Original assignee: TAGCYX BIO KK; National Institute of Infectious Diseases
Current assignee: TAGCYX BIO KK; National Institute of Infectious Diseases
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2011-08-25

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an antisense RNA stem loop molecule inhibiting the replication of HCV, and to provide an effective method for treating type C hepatitis. <P>SOLUTION: The nucleic acid contains the antisense RNA stem loop targeting SL IIIf of HCV IRES. The expression vector can express the nucleic acid in a cell. The medicinal composition contains the nucleic acid and/or the expression vector. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を標的とする核酸分子に関するものであり、具体的には、ＩＲＥＳドメインIIIのステム・ループIIIｆ（ステム・ループIIIｆ）にループ・ループ相互作用により結合し、翻訳活性を阻害するアンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸分子に関する。本発明はまた、該アンチセンスＲＮＡステム・ループを細胞内で発現することができる発現ベクターに関する。本発明は更に、該アンチセンスＲＮＡステム・ループ、或いは該アンチセンスＲＮＡステム・ループを細胞内で発現することができる発現ベクターを含む医薬組成物に関する。当該医薬組成物は、Ｃ型肝炎の予防又は治療に利用することができる。 The present invention relates to a nucleic acid molecule that targets the internal ribosome binding site (IRES) of hepatitis C virus (HCV), specifically, stem loop IIIf (stem loop IIIf) of IRES domain III. The present invention relates to a nucleic acid molecule comprising an antisense RNA stem loop that binds by loop-loop interaction and inhibits translation activity. The present invention also relates to an expression vector capable of expressing the antisense RNA stem loop in a cell. The present invention further relates to a pharmaceutical composition comprising the antisense RNA stem loop or an expression vector capable of expressing the antisense RNA stem loop in a cell. The pharmaceutical composition can be used for prevention or treatment of hepatitis C.

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、慢性肝炎疾患の主要な原因ウイルスであり、感染者数は世界では１億７千万人と見られている。現在、インターフェロン（及びリハビリンとの併用）が唯一の効果的な治療法であるが、その著効率は５割以下であり、新規治療薬の開発が急務となっている。特に、ウイルスゲノムの変異率が高く、分子標的薬の開発障壁となっている。 Hepatitis C virus (HCV) is a major causative virus for chronic hepatitis, and the number of infected people is estimated to be 170 million worldwide. Currently, interferon (and combined use with rehabillin) is the only effective treatment, but its remarkable efficiency is 50% or less, and the development of a new therapeutic agent is urgently needed. In particular, the virus genome has a high mutation rate, which is a barrier to the development of molecular targeted drugs.

ＨＣＶはフラビウイルス科、ヘパシウイルス属に属する（＋）鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。約９．６ｋｂのＲＮＡゲノムは、約３,０００のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする翻訳領域（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）と、その両末端の非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）から構成される。５末端の約３４１ヌクレオチドからなる非翻訳領域には、内部リボソーム結合領域 (ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍａｌｅｎｔｒｙｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ )と呼ばれる構造体が存在し、ウイルスＲＮＡの非キャップ依存性翻訳を仲介する（図１Ａ）。 HCV is a (+) strand single-stranded RNA virus belonging to the Flaviviridae family, the hepacivirus genus. The RNA genome of about 9.6 kb is composed of a translation region (ORF) encoding a polyprotein precursor of about 3,000 amino acids and an untranslated region (UTR) at both ends thereof. The A structure called an internal ribosome binding site (IRES) exists in the untranslated region consisting of about 341 nucleotides at the 5 terminal, and mediates non-cap-dependent translation of viral RNA (FIG. 1A).

多くの真核細胞やその感染性ウイルスは、ｍＲＮＡの５’末端に７−メチルグアノシンキャップ構造があり、これにｅＩＦ４、ｅＩＦ４Ｇ、４０Ｓリボソームサブユニットなど多くの翻訳開始因子や細胞性タンパク質が関与して翻訳が開始される。これに対し、ＨＣＶのＩＲＥＳ構造は、４０ＳサブユニットやｅＩＦ３が直接結合し、上記キャップ依存性翻訳と比較してよりわずかな翻訳開始因子で翻訳が可能となる（非特許文献１）。 Many eukaryotic cells and infectious viruses have a 7-methylguanosine cap structure at the 5 ′ end of mRNA, and many translation initiation factors and cellular proteins such as eIF4, eIF4G, and 40S ribosomal subunit are involved in this. Translation begins. In contrast, the IRES structure of HCV binds directly to the 40S subunit and eIF3, enabling translation with fewer translation initiation factors than the cap-dependent translation (Non-patent Document 1).

ＨＣＶＩＲＥＳの予測二次構造では、ドメインI、II、III、IVの４つの領域から構成され、翻訳開始複合体を形成する４０ＳリボソームサブユニットやｅＩＦ３翻訳開始因子はドメインIIIの広範にわたって相互作用している（非特許文献２）。ＨＣＶは、変異率の違いから６種のジェノタイプが知られているが、ＩＲＥＳの二次構造はよく保存されている。先行研究では、デコイ実験や変異解析からIIId、e、fの重要性が示唆されている（非特許文献２、非特許文献３）。 The predicted secondary structure of HCV IRES is composed of four regions, domains I, II, III, and IV. The 40S ribosomal subunit and eIF3 translation initiation factor that form a translation initiation complex interact extensively in domain III. (Non-Patent Document 2). HCV is known to have six types of genotypes due to differences in mutation rate, but the secondary structure of IRES is well preserved. In previous studies, the importance of IIId, e, and f has been suggested from decoy experiments and mutation analysis (Non-patent Documents 2 and 3).

一方、アンチセンスやｓｉＲＮＡを用いることによるＨＣＶの複製阻害も報告されている。Ｔａｌｌｅｔ−Ｌｏｐｅｚらは、IIIｄ領域に結合する２’−ＯＭｅ化アンチセンスＲＮＡが、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系において４０Ｓリボソームとの結合を阻害する（IC₅₀ <10 nM）ことを報告している（非特許文献４）。また、Ｋａｎｄａらは、IIId〜IIIeの領域を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をＪＦＨ１感染細胞（Ｈｕｈ−７）に導入することにより、ウイルス複製および感染性が阻害されることを報告している（非特許文献５）。 On the other hand, inhibition of HCV replication by using antisense or siRNA has also been reported. Tallet-Lopez et al. Have reported that 2′-OMe antisense RNA binding to the IIId region inhibits binding to 40S ribosomes in an in vitro translation system (IC ₅₀ <10 nM) (non-patented). Reference 4). Kanda et al. Also reported that viral replication and infectivity are inhibited by introducing shRNA (siRNA) targeting the region IIId to IIIe into JFH1-infected cells (Huh-7) ( Non-patent document 5).

また、アプタマーによるＨＣＶの増幅、複製の阻害に関しては、Ａｌｄａｚ−ＣａｒｒｏｌらのドメインIのステム・ループ1に結合するアプタマー（ａｐｉｃａｌｌｏｏｐ−ｉｎｔｅｒｎａｌｌｏｏｐｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（Ｋｄ＝７０ｎＭ）（非特許文献６）、ＤａＲｏｃｈａＧｏｍｅｓらのドメインIIに結合するアプタマー（ａｐｉｃａｌｌｏｏｐ−ｉｎｔｅｒｎａｌｌｏｏｐｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（Ｋｄ＝３５ｎＭ）（非特許文献７）などの報告がある。また、Ｒｏｍｅｒｏ−ＬｏｐｅｚらによってIIIf領域に結合する８１ｍｅｒアプタマー（ＨＨ３６３−１０）が報告されているが、ウイルス複製阻害活性は示されていない。また、IIIfと結合するステム・ループ領域も弱い翻訳阻害活性しか示さない（非特許文献８）。 Further, regarding the inhibition of HCV amplification and replication by aptamers, an aptamer (apical loop-internal loop interaction) (Kd = 70 nM) that binds to stem loop 1 of domain I of Aldaz-Carrol et al. There is a report of an aptamer (apical loop-internal loop interaction) (Kd = 35 nM) (Non-Patent Document 7) that binds to domain II of Da Rocha Gomes et al. In addition, although 81mer aptamer (HH363-10) binding to the IIIf region has been reported by Romero-Lopez et al., No viral replication inhibitory activity has been shown. In addition, the stem / loop region that binds to IIIf also shows only weak translation inhibitory activity (Non-patent Document 8).

一方、西川らは、リボザイムとアプタマーとからなるキメラＲＮＡによりＩＲＥＳ活性とＮＳ３プロテアーゼ活性をともに抑制可能な機能性ＲＮＡ分子を提唱した（特許文献１など）。しかしながら、目的とするキメラＲＮＡは１６０ｎｔからなる巨大分子であり、医薬品としての利用には、分子量の低下など解決すべき課題は多い。 On the other hand, Nishikawa et al. Proposed a functional RNA molecule capable of suppressing both IRES activity and NS3 protease activity by a chimeric RNA composed of a ribozyme and an aptamer (Patent Document 1, etc.). However, the target chimeric RNA is a macromolecule consisting of 160 nt, and there are many problems to be solved such as a decrease in molecular weight for use as a pharmaceutical product.

本発明は、ＨＣＶにおいてジェノタイプを超えて二次構造が保存されているＩＲＥＳドメインIIIのステム・ループIIIｆ領域に結合することにより、ＨＣＶの複製を抑制するアンチセンスＲＮＡステム・ループ分子を提供し、Ｃ型肝炎の有効な治療手段を提供するものである。 The present invention provides an antisense RNA stem-loop molecule that suppresses HCV replication by binding to the stem-loop IIIf region of IRES domain III in which secondary structure is conserved across genotypes in HCV. The present invention provides an effective therapeutic means for hepatitis C.

ＨＣＶ５’ＵＴＲＩＲＥＳのドメインIIIに存在するステム・ループ IIIe及びf領域はリボソーム４０Ｓサブユニットとの結合に重要であり、高い保存性を示す（図１Ｂ）。この中で、ステム・ループ IIIfは下流の一本鎖領域とｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ構造を形成すると考えられている（非特許文献９）。ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ形成を妨げる変異は著しく翻訳効率低下させ、再びｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ構造をｒｅｓｔｏｒｅする相補的な変異により効率は部分的にしか回復しない（非特許文献２）。このことから、ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ領域の配列と構造がいずれも翻訳活性において重要であることが分かった。また、ドメインIIIe及びf領域に相当するデコイＲＮＡ分子が特異的にＩＲＥＳからの翻訳を阻害することが示されている（非特許文献３）。以上のことから、ＨＣＶゲノムＲＮＡのIIIfに相当するステム・ループ構造への結合により翻訳を阻害することにより、ＨＣＶの増殖を抑制することができる可能性がある。 The stem loop IIIe and f regions present in domain III of the HCV 5'UTR IRES are important for binding to the ribosome 40S subunit and show high conservation (FIG. 1B). Among them, the stem loop IIIf is considered to form a pseudoknot structure with a downstream single-stranded region (Non-patent Document 9). Mutations that prevent the formation of pseudooknot significantly reduce the translation efficiency, and the efficiency is only partially restored by a complementary mutation that restores the pseudooknot structure again (Non-patent Document 2). From this, it was found that both the sequence and structure of the pseudonok region are important in translational activity. In addition, it has been shown that decoy RNA molecules corresponding to domain IIIe and f region specifically inhibit translation from IRES (Non-patent Document 3). From the above, there is a possibility that HCV proliferation can be suppressed by inhibiting translation by binding to the stem-loop structure corresponding to IIIf of HCV genomic RNA.

そこで発明者らは、上記ＲＮＡ-タンパク質相互作用を阻害する方法として、アンチセンスＲＮＡステム・ループの利用に着目し、Ｕ１Ａタンパク質とＵ１ｈｐII ＲＮＡとの相互作用などをモデルとしてその有効性を示した。また、このような方法論を用いて、ＨＣＶの翻訳に重要なゲノムＲＮＡ５’非翻訳領域に結合し、感染細胞におけるウイルス複製を抑制するアンチセンスＲＮＡステム・ループの発明に想到した。 Accordingly, the inventors focused on the use of an antisense RNA stem loop as a method for inhibiting the RNA-protein interaction, and showed the effectiveness of the interaction between U1A protein and U1hpII RNA as a model. In addition, using such a methodology, the inventors have devised an invention of an antisense RNA stem loop that binds to a genomic RNA 5 'untranslated region important for HCV translation and suppresses viral replication in infected cells.

以上、本発明の理解のため、本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。 As described above, the background to the present invention has been described for understanding the present invention. However, the scope of the present invention is not limited to the above description, and is defined by the description of the scope of claims.

本発明の要旨は以下の通りである。
（１）HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸。
（２）アンチセンスRNAステム・ループが、HCV IRESのSL IIIf RNAのループ領域と相補的な２〜８塩基の領域を持つ４〜１２塩基のループを持つ（１）記載の核酸。
（３）ループの根元にGAミスマッチ塩基対が挿入された（１）又は（２）記載の核酸。
（４）アンチセンスRNAステム・ループが２〜４８塩基対のステムを持つ（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸。
（５）アンチセンスRNAステム・ループが下記のいずれかの配列で表される（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸。
IIIf-a0:5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3'（配列番号１）
IIIf-a1:5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3'（配列番号２）
IIIf-a2:5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3'（配列番号３）
IIIf-a1-s4:5'-GGUGGCUCGCAACACC-3'（配列番号４）
IIIf-a1-s5:5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3'（配列番号５）
IIIf-a1-s6:5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3'（配列番号６）
IIIf-a1-s7:5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3'（配列番号７）
（６）化学修飾されている（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸。
（７）（１）記載の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクター。
（８）（１）記載の核酸及び/又は（７）記載の発現ベクターを含む、医薬組成物。
（９）C型肝炎の予防又は治療のために用いられる（８）記載の医薬組成物。 The gist of the present invention is as follows.
(1) A nucleic acid containing an antisense RNA stem loop targeting HCV IRES SL IIIf.
(2) The nucleic acid according to (1), wherein the antisense RNA stem loop has a loop of 4 to 12 bases having a region of 2 to 8 bases complementary to the loop region of SL IIIf RNA of HCV IRES.
(3) The nucleic acid according to (1) or (2), wherein a GA mismatch base pair is inserted at the base of the loop.
(4) The nucleic acid according to any one of (1) to (3), wherein the antisense RNA stem loop has a stem of 2 to 48 base pairs.
(5) The nucleic acid according to any one of (1) to (4), wherein the antisense RNA stem loop is represented by any of the following sequences.
IIIf-a0: 5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
IIIf-a1: 5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
IIIf-a2: 5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 3)
IIIf-a1-s4: 5'-GGUGGCUCGCAACACC-3 '(SEQ ID NO: 4)
IIIf-a1-s5: 5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3 '(SEQ ID NO: 5)
IIIf-a1-s6: 5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3 '(SEQ ID NO: 6)
IIIf-a1-s7: 5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
(6) The nucleic acid according to any one of (1) to (5), which is chemically modified.
(7) An expression vector capable of expressing the nucleic acid according to (1) in a cell.
(8) A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to (1) and / or the expression vector according to (7).
(9) The pharmaceutical composition according to (8), which is used for prevention or treatment of hepatitis C.

本発明のアンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸は、一般的な一本鎖ＲＮＡからなるアンチセンス分子やｓｉＲＮＡでは標的とすることが難しいＩＲＥＳの二次構造を標的とする。ＲＮＡ二次構造を標的とすることにより、ＨＣＶの翻訳において重要な役割を果たす宿主やウイルス因子の働きを直接阻害し、効果的な翻訳の抑制が期待される。また、ＩＲＥＳの二次構造は高い配列保存性を有し、耐性変異が生じ難いことが知られており、各種ジェノタイプに対応したＨＶＣ増殖、複製阻害が可能なアンチセンスＲＮＡステム・ループを提供することができる。 The nucleic acid containing the antisense RNA stem loop of the present invention targets the secondary structure of IRES, which is difficult to target with antisense molecules and siRNAs composed of general single-stranded RNA. By targeting the RNA secondary structure, it is expected to directly inhibit the functions of hosts and viral factors that play an important role in the translation of HCV, and effectively suppress the translation. In addition, the secondary structure of IRES is known to have high sequence conservation and resistance mutations are unlikely to occur, providing an antisense RNA stem loop capable of HVC growth and replication inhibition corresponding to various genotypes can do.

(A) ＨＣＶＩＲＥＳの二次構造、(B)ＨＣＶＩＲＥＳドメインIIIe及びf領域の二次構造(A) Secondary structure of HCV IRES, (B) Secondary structure of HCVIRES domain IIIe and f region デザイン／合成したアンチセンスＲＮＡステム・ループとその変異体Designed / synthesized antisense RNA stem loop and its variants デザイン／合成したアンチセンスＲＮＡステム・ループと標的ＲＮＡとの結合のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による解析Analysis of the binding between the designed / synthesized antisense RNA stem loop and the target RNA by polyacrylamide gel electrophoresis アンチセンスＲＮＡステム・ループによるＨＣＶＲＮＡ産生阻害の評価Evaluation of inhibition of HCV RNA production by antisense RNA stem loop

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

定義
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。 Definitions Unless defined otherwise herein, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings that are commonly understood by those of ordinary skill in the art.

アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸
本発明は、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸を提供する。 Nucleic Acids Comprising Antisense RNA Stem Loops The present invention provides nucleic acids comprising an antisense RNA stem loop targeting SL IIIf of HCV IRES.

アンチセンスRNAステム・ループは、HCV IRESのSL IIIf RNAのループ領域と相補的な２〜８塩基の領域を持つ４〜１２塩基のループを持つとよい。また、ループの根元にGAミスマッチ塩基対が挿入されてもよい。さらに、ループには、HIV DISの5'AANNNNNNA3'のようにアデニン３個が挿入されてもよい。これにより、結合の親和性が向上する。アンチセンスRNAステム・ループは、４〜１２塩基のループを持つとよく、好ましくは、５〜１０塩基のループを持ち、より好ましくは、６〜１０塩基のループを持つ。 The antisense RNA stem loop may have a 4 to 12 base loop having a 2 to 8 base region complementary to the loop region of SL IIIf RNA of HCV IRES. A GA mismatch base pair may be inserted at the base of the loop. Furthermore, three adenines may be inserted into the loop, such as 5'AANNNNNNA3 'of HIV DIS. This improves the binding affinity. The antisense RNA stem loop may have a 4-12 base loop, preferably a 5-10 base loop, and more preferably a 6-10 base loop.

アンチセンスRNAステム・ループは、２〜４８塩基対のステムを持つとよく、好ましくは、２〜２０塩基対のステムを持ち、より好ましくは、２〜１０塩基対のステムを持つ。 The antisense RNA stem loop may have a stem of 2 to 48 base pairs, preferably has a stem of 2 to 20 base pairs, and more preferably has a stem of 2 to 10 base pairs.

アンチセンスRNAステム・ループは、下記のいずれかの配列で表されるとよい。IIIf-a0:5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3'（配列番号１）
IIIf-a1:5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3'（配列番号２）
IIIf-a2:5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3'（配列番号３）
IIIf-a1-s4:5'-GGUGGCUCGCAACACC-3'（配列番号４）
IIIf-a1-s5:5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3'（配列番号５）
IIIf-a1-s6:5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3'（配列番号６）
IIIf-a1-s7:5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3'（配列番号７） The antisense RNA stem loop may be represented by any of the following sequences. IIIf-a0: 5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
IIIf-a1: 5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
IIIf-a2: 5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 3)
IIIf-a1-s4: 5'-GGUGGCUCGCAACACC-3 '(SEQ ID NO: 4)
IIIf-a1-s5: 5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3 '(SEQ ID NO: 5)
IIIf-a1-s6: 5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3 '(SEQ ID NO: 6)
IIIf-a1-s7: 5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3 '(SEQ ID NO: 7)

本発明の核酸は、バルジ塩基、internalループ、apicalループなどを含んでもよい。本発明の核酸は、８〜１２０塩基の長さであるとよく、好ましくは、９〜６０塩基の長さであり、より好ましくは、１０〜４０塩基の長さである。 The nucleic acid of the present invention may contain a bulge base, an internal loop, an apical loop and the like. The nucleic acid of the present invention may be 8 to 120 bases in length, preferably 9 to 60 bases in length, and more preferably 10 to 40 bases in length.

本発明の核酸は、鋳型DNAからin vitro転写法により、作製することができる。また、本発明の核酸は、公知のオリゴヌクレオチド合成法で作製することができる。 The nucleic acid of the present invention can be prepared from template DNA by an in vitro transcription method. The nucleic acid of the present invention can be prepared by a known oligonucleotide synthesis method.

本発明の核酸は、当業者に公知の手法で化学修飾することにより安定化することができる。具体的には、アンチセンスＲＮＡステム・ループあるいはその他の構成要素の一部或いは全部が、ホスホロチオエート体、ボラノフォスフェート体であってもよく、ＤＮＡ、Ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ（ＬＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ（ＢＮＡ）或いはモルフォリノ体、ｐｒｏｔｅｉｎｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ（ＰＮＡ）体で置換されていてもよい。また、２’−修飾体であってもよく、具体的には、２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ、２’−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ、２’−ｆｌｕｏｒｏ修飾体であってもよい。 The nucleic acid of the present invention can be stabilized by chemical modification by methods known to those skilled in the art. Specifically, a part or all of the antisense RNA stem loop or other components may be a phosphorothioate body or a boranophosphate body, and can be DNA, Locked Nucleic Acid (LNA), Bridged Nucleic Acid ( BNA), morpholino form, or protein nucleic acid (PNA) form. Further, it may be a 2'-modified product, specifically, a 2'-O-methyl, 2'-methoxyethyl, or 2'-fluor modified product.

アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸を発現するベクター
また、本発明は、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸を発現することができる発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸をコードするDNA又はRNAがベクターに組み込まれたものである。当該ベクターは非ウイルスベクターであってもよいし、ウイルスベクターであってもよい。 A vector expressing a nucleic acid containing an antisense RNA stem loop The present invention also provides an expression vector capable of expressing a nucleic acid containing an antisense RNA stem loop targeting HCV IRES SL IIIf. The expression vector of the present invention is a vector in which a DNA or RNA encoding a nucleic acid containing an antisense RNA stem loop that targets SL IIIf of HCV IRES is incorporated into the vector. The vector may be a non-viral vector or a viral vector.

非ウイルスベクターとしては、pUC19（宝酒造、京都）、pGREENLANTERN（ライフテックオリエンタル（株）、東京）、pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY 6:905-915 (July 1995))など、当業者が周知のプラスミドベクターを用いることができる。 Non-viral vectors include pUC19 (Takara Shuzo, Kyoto), pGREENLANTERN (Lifetech Oriental Co., Tokyo), pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY 6: 905-915 (July 1995)), etc. Can be used.

ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、又はワクシニアウイルスであってもよい。 The viral vector may be an adenovirus, an adeno-associated virus, a retrovirus, a herpes virus, a herpes simplex virus, a lentivirus, a Sendai virus, a pox virus, a poliovirus, a simbis virus, or a vaccinia virus.

上記発現ベクターは、当該アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸をコードするＤＮＡを作製し、これを転写因子結合部位（プロモーター領域）を含むベクターに組み込むことによって調製できる。当該アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸をコードするＤＮＡは、当業者に周知の核酸の化学的合成法により、ＤＮＡ合成機を用いて製造することができる。また、合成されたＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、あるいは当該ＤＮＡを含むベクターによって形質転換された培養宿主細胞中で増幅することができる。 The expression vector can be prepared by preparing a DNA encoding a nucleic acid containing the antisense RNA stem loop and incorporating it into a vector containing a transcription factor binding site (promoter region). A DNA encoding a nucleic acid containing the antisense RNA stem loop can be produced using a DNA synthesizer by a chemical synthesis method of nucleic acid well known to those skilled in the art. Alternatively, the amplified DNA can be amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the synthesized DNA as a template or in a cultured host cell transformed with a vector containing the DNA.

医薬品組成物
さらに、本発明は、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステムループを含む核酸及び/又は当該核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、C型肝炎の予防又は治療のために用いることができる。 Pharmaceutical composition Furthermore, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid comprising an antisense RNA stem loop targeting SL IIIf of HCV IRES and / or an expression vector capable of expressing the nucleic acid in a cell. To do. The pharmaceutical composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of hepatitis C.

ＨＣＶに感染した被験者の組織または細胞（例えば、肝臓）に、本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを導入することによって、細胞中のＨＣＶタンパク質の合成を抑制および／またはＨＣＶの複製を抑制することができる。本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターの導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（”Ｌｉｐｉｄｉｃｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ”（１９９７）
Ｒ．Ｊ．ＬｅｅａｎｄＬ．ＨｕａｎｇＣｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ１４，１７３−２０６；中西守ら、蛋白質核酸
酵素Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１１，１５９０−１５９６（１９９９））、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接あるいは静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内投与などの投与経路で本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを導入することもできる。本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。例えば、通常、成人一人当たり１〜１００mg、好ましくは、１〜１０mgの投与量で、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。ベクターがウイルスの場合には、例えば、成人一人当たり１０^９〜１０^１２pfu、好ましくは１０^１１〜１０^１２pfuの投与量で少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。 By introducing the nucleic acid of the present invention or an expression vector capable of expressing the nucleic acid of the present invention into a cell or tissue (eg, liver) of a subject infected with HCV, synthesis of HCV protein in the cell is performed. Suppression and / or HCV replication can be suppressed. The introduction of the nucleic acid of the present invention or an expression vector capable of expressing the nucleic acid of the present invention in cells is, for example, a method of encapsulating them in liposomes and incorporating them into cells ("Lipid vector systems for gene transfer" (1997)
R. J. et al. Lee and L.L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys 14, 173-206; Mamoru Nakanishi et al., Protein Nucleic Acid Enzyme Vol. 44, no. 11, 1590-1596 (1999)), calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, microinjection method, gene gun method and the like. When introducing into the cell the nucleic acid of the present invention or the expression vector capable of expressing the nucleic acid of the present invention in the cell, for example, a part of the cell at the disease site is taken out,
After the gene transfer in vitro, the cells can be returned to the tissue again, or the present invention can be applied directly to the diseased tissue or via administration routes such as intravenous, muscle, abdominal, subcutaneous, and intradermal administration. It is also possible to introduce an expression vector capable of expressing the nucleic acid of the present invention or the nucleic acid of the present invention in cells. Administration of the nucleic acid of the present invention or an expression vector capable of expressing the nucleic acid of the present invention in a cell depends on the severity of the disease state or the responsiveness of the living body, but until the effectiveness of treatment is confirmed or the disease An appropriate dose, administration method, and frequency may be used over a period until the reduction of the condition is achieved. For example, the dose is usually 1 to 100 mg, preferably 1 to 10 mg per adult, and is preferably administered at least once with a frequency that the desired effect is sustained. When the vector is a virus, for example, it may be administered at a dose of 10 ⁹ to 10 ¹² pfu per adult, preferably 10 ¹¹ to 10 ¹² pfu at a frequency at which the desired effect is sustained.

本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターは、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）とともに製剤化した医薬組成物として、投与されるとよい。 The nucleic acid of the present invention or the expression vector capable of expressing the nucleic acid of the present invention in a cell is a pharmaceutical formulated with a pharmaceutically acceptable carrier (for example, a diluent such as physiological saline or a buffer) as necessary. It may be administered as a composition.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本発明の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
試薬・溶媒・使用機器など EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but these are not intended to limit the technical scope of the present invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description of the present invention, and these are included in the technical scope of the present invention.
Reagents, solvents, equipment used, etc.

塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）、尿素、アクリルアミド、エタノール、ＥＤＴＡ、エチジウム・ブロマイド、リン酸ナトリウム、グアノシン5’三リン酸（ＧＴＰ）、シトシン5’三リン酸（ＣＴＰ）は、和光純薬より購入した。ＨＥＰＥＳは、シグマより購入した。ウリジン5’三リン酸（ＵＴＰ）は、ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ社より購入した。アデノシン5’三リン酸（ＡＴＰ）はロッシュより購入した。トリス（Ｔｒｉｓ）、ＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔは、インビトロジェンより購入した。ホウ酸は、アマシャム・バイオサイエンスより購入した。Ｔ７
ＲＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅは、大腸菌で発現し、ＴｒｉｓａｃｒｙｌＳＰ樹脂（シグマ）を用いて精製した。ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔは、ＭｉｒｕｓＢｉｏ社より購入した。ＵＶトランスイルミネーターはフナコシ、スラブゲル電気泳動層はバイオクラフト、ＴａｑＭａｎｒｅａｌ−ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ
はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のものを用いた。 Sodium chloride (NaCl), magnesium chloride (MgCl ₂ ), polyethylene glycol (PEG 6000), urea, acrylamide, ethanol, EDTA, ethidium bromide, sodium phosphate, guanosine 5 ′ triphosphate (GTP), cytosine 5 ′ triphosphate Acid (CTP) was purchased from Wako Pure Chemical. HEPES was purchased from Sigma. Uridine 5 ′ triphosphate (UTP) was purchased from MP Biomedical. Adenosine 5 ′ triphosphate (ATP) was purchased from Roche. Tris and TRIZOL Reagent were purchased from Invitrogen. Boric acid was purchased from Amersham Bioscience. T7
RNA Polymerase was expressed in E. coli and purified using Trisacryl SP resin (Sigma). TransIT-mRNA Transfection Kit was purchased from MirasBio. UV transilluminator is Funakoshi, Slab gel electrophoresis layer is Biocraft, TaqMan real-time RT-PCR
Was from Applied Biosystems.

実施例１：アンチセンスＲＮＡステム・ループのデザイン
図２に示したアンチセンスＲＮＡステム・ループをデザインした。すなわち、アンチセンスＲＮＡステム・ループ分子IIIｆ−ａ０は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ IIIfのループに相補的な6塩基をループにもつようにデザインした。IIIf-a1はIIIf-a0のループ根元にＧＡミスマッチ塩基対を挿入した。IIIf-a2はIIIf-a1より２塩基多い８塩基の相補的な塩基をループに持つようにデザインした。IIIf-a1mは、IIIf-a1のループ先端の塩基ＣＧをＧＣに置換した変異体で、IIIf-a1の陰性コントロールとして作成した。同様にIIIf-a2mは、IIIf-a2のループ先端の塩基ＣＧをＧＣに置換した変異体で、IIIf-a2の陰性コントロールを目的として作成した。このようにデザインした当該アンチセンスＲＮＡステム・ループ分子は、ＲＮＡ二次構造予測プログラム（ＭｕｌＦｏｌｄ）によってステム・ループ構造をとるか確認した。 Example 1 Design of Antisense RNA Stem Loop The antisense RNA stem loop shown in FIG. 2 was designed. That is, the antisense RNA stem loop molecule IIIf-a0 was designed to have 6 bases complementary to the loop of HCV genomic RNA IIIf in the loop. IIIf-a1 inserted a GA mismatch base pair at the base of the loop of IIIf-a0. IIIf-a2 was designed to have an 8 base complementary base in the loop, which is 2 bases more than IIIf-a1. IIIf-a1m was a mutant in which the base CG at the loop tip of IIIf-a1 was replaced with GC, and was prepared as a negative control for IIIf-a1. Similarly, IIIf-a2m is a mutant in which the base CG at the end of the loop of IIIf-a2 is replaced with GC, and was prepared for the purpose of negative control of IIIf-a2. The antisense RNA stem-loop molecule thus designed was confirmed to have a stem-loop structure by an RNA secondary structure prediction program (MulFold).

実施例２：アンチセンスＲＮＡステム・ループの合成
アンチセンスＲＮＡステム・ループ分子は、Ｔ７ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたｉｎｖｉｔｒｏ転写法によって合成した。当該アンチセンスＲＮＡ
ステム・ループ分子と相補的なＤＮＡ配列にＴ７プロモーターの相補鎖の配列を連結した鋳型ＤＮＡを作製した。転写反応に用いた鋳型ＤＮＡ配列を表１に示した。当該一本鎖鋳型ＤＮＡ(５μＭ)は、Ｔ７プロモーターＤＮＡ(７．５μＭ)、ＮａＣｌ(１００ｎＭ),Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (１０ｎＭ)を含む溶液を９５℃で５分間熱変性させ室温まで戻すことでＴ７プロモーターＤＮＡをアニーリングさせた。これを鋳型としてＴ７ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより転写し、当該アンチセンスＲＮＡ
ステム・ループ分子を含む転写反応溶液を得た。転写反応溶液[ＨＥＰＥＳ(1×), ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００, ８０ｍｇ／ｍｌ）, ＧＴＰ (８ｍＭ), ＵＴＰ(８ｍＭ), ＡＴＰ(４ｍＭ), ＣＴＰ(４ｍＭ) 、ＭｇＣｌ_２(４２ｍＭ), ｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡ
(３００ｍＭ)]を調製し、Ｔ７ポリメラーゼを加えて３７℃で２時間インキュベーションした。転写反応溶液はＥＤＴＡを加え反応を停止させ、エタノール沈殿をして８Ｍ尿素／１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。
表１に使用したＲＮＡの鋳型オリゴＤＮＡ配列を示した。 Example 2: Synthesis of antisense RNA stem loop Antisense RNA stem loop molecules were synthesized by in vitro transcription method using T7 polymerase. The antisense RNA
A template DNA was prepared by linking the sequence of the complementary strand of the T7 promoter to a DNA sequence complementary to the stem-loop molecule. Table 1 shows the template DNA sequence used for the transcription reaction. The single-stranded template DNA (5 μM) is obtained by heat denaturing a solution containing T7 promoter DNA (7.5 μM), NaCl (100 nM), Tris-HCl (10 nM) at 95 ° C. for 5 minutes and returning to room temperature. DNA was annealed. This antisense RNA is transcribed using T7 polymerase as a template.
A transcription reaction solution containing stem-loop molecules was obtained. Transcription reaction solution [HEPES (1 ×), polyethylene glycol (PEG6000, 80 mg / ml), GTP (8 mM), UTP (8 mM), ATP (4 mM), CTP (4 mM), MgCl ₂ (42 mM), template DNA
(300 mM)] was prepared, T7 polymerase was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours. The transcription reaction solution was added with EDTA to stop the reaction, precipitated with ethanol, and purified by 8M urea / 15% polyacrylamide gel electrophoresis.
Table 1 shows the template oligo DNA sequence of the RNA used.

IIIf、IIIf-a0、IIIf-a1、IIIf-a2、IIIf-a1m及びIIIf-a2mのDNA配列を、それぞれ、配列番号８、９、１０、１１、１２及び１３に示す。 The DNA sequences of IIIf, IIIf-a0, IIIf-a1, IIIf-a2, IIIf-a1m and IIIf-a2m are shown in SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12 and 13, respectively.

実施例３：アンチセンスＲＮＡステム・ループと標的ＲＮＡとの相互作用の解析
各ＲＮＡ基質が６μＭになるように標的ＲＮＡ：アンチセンスＲＮＡステム・ループ＝１：１のモル比になるようＲＮＡ基質溶液を調製した。９５℃で５分間熱変性させ氷上で５分間急冷した。反応溶液に４×ＰＮバッファー[リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０(４０ｍＭ)、塩化ナトリウム(２００ｍＭ)]を1×になるように加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。グリセロールを終濃度の１０％となるように添加し、ゲルＴＢＥ（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ）、ＴＢＭ（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、０．１ｍＭ塩化マグネシウム）の各ゲルに等分してアプライした。電気泳動は、一定温度（特記以外４℃）、２００Ｖで行った。電気泳動後のゲルはエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶトランスイルミネーターでバンドを可視化した。
ＴＢＥゲルはマグネシウムイオンを含まないためループ・ループ相互作用はみられず、２本のバンドとして検出される。ＴＢＭゲルでは、マグネシウムイオンの存在により、ループ・ループ相互作用可能な条件になっている。 Example 3 Analysis of Interaction between Antisense RNA Stem Loop and Target RNA RNA substrate solution so that each RNA substrate is 6 μM in a target RNA: antisense RNA stem loop = 1: 1 molar ratio Was prepared. It was heat denatured at 95 ° C. for 5 minutes and rapidly cooled on ice for 5 minutes. To the reaction solution, 4 × PN buffer [sodium phosphate, pH 7.0 (40 mM), sodium chloride (200 mM)] was added to 1 × and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Glycerol is added to a final concentration of 10%, and equally divided into gels TBE (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA) and TBM (89 mM Tris, 89 mM boric acid, 0.1 mM magnesium chloride). Applied. Electrophoresis was performed at a constant temperature (4 ° C. unless otherwise specified) and 200V. The gel after electrophoresis was stained with ethidium bromide, and the band was visualized with a UV transilluminator.
Since the TBE gel does not contain magnesium ions, no loop-loop interaction is observed, and it is detected as two bands. In the TBM gel, the presence of magnesium ions is a condition that allows loop-loop interaction.

標的ＲＮＡIIIfとアンチセンスＲＮＡを組み合わせてゲルシフトを行った。IIIf-a0, IIIf-a1, IIIf-a2すべてにおいてバンドのシフトがみられたことから、デザインしたアンチセンスＲＮＡステム・ループは標的に結合した。また、IIIf-a1, IIIf-a2については、バンドのシフトの度合いが大きいことから、ＧＡミスマッチ塩基対の効果が得られ、IIIf-a0よりも強く結合した。特に、IIIf-a1はIIIf-a2より大きなシフトが確認された。シフトの度合いが大きかったこれら２つのアンチセンスＲＮＡステム・ループIIIf-a1, IIIf-a2に関して、ループ先端の２配列を変えた変異体IIIf-a1m,
IIIf-a2mを作製し、同法によるバンドのシフトを調べた。その結果、変異体では、標的ＲＮＡとの結合がみられなかったことから、IIIf-a1, IIIf-a2は標的に対し特異的に結合することが示された。 Gel shift was performed by combining target RNA IIIf and antisense RNA. The designed antisense RNA stem loop bound to the target because of band shifts in all of IIIf-a0, IIIf-a1, and IIIf-a2. In addition, since IIIf-a1 and IIIf-a2 had a large band shift, the effect of GA mismatch base pairing was obtained, and binding was stronger than IIIf-a0. In particular, IIIf-a1 was confirmed to have a larger shift than IIIf-a2. With respect to these two antisense RNA stem loops IIIf-a1 and IIIf-a2 with a large degree of shift, mutants IIIf-a1m, in which two sequences at the loop tip were changed,
IIIf-a2m was fabricated and the band shift by this method was investigated. As a result, it was shown that IIIf-a1 and IIIf-a2 bind specifically to the target because the mutant did not bind to the target RNA.

実施例４：アンチセンスＲＮＡステム・ループ分子によるＨＣＶ複製阻害効果の確認
ＨＣＶ感染ヒト肝癌細胞Ｈｕｈ−７を２４-ｗｅｌｌ培養プレートに１ｘ１０^５cells/well播種し、１日後、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔ (ＭｉｒｕｓＢｉｏ社)を利用してアンチセンスＲＮＡを細胞へ導入した。アンチセンスＲＮＡ
１または５μｇを、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡＲｅａｇｅｎｔ／ｍＲＮＡＢｏｏｓｔＲｅａｇｅｎｔ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混和し、４分間静億後、細胞へ添加した。３日間培養後、細胞の全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬｒｅａｇｅｎｔにより調製した。全ＲＮＡ量を測定し、ＴａｑＭａｎｒｅａｌ−ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶ
ＲＮＡを定量測定した。その結果、IIIf-a1の場合、ＨＣＶＲＮＡ量の７０％程度の低下が、IIIf-a2の場合は３０％程度の低下が見られ、試験管内アッセイでの標的ＲＮＡとの結合活性に対応する結果が見られた。また、IIIf-a1およびIIIf-a2のループ変異を導入したIIIf-a1mおよびIIIf-a2mの場合は、予想される通り阻害活性は見られなかった。 Example 4: Confirmation of HCV replication inhibitory effect by antisense RNA stem-loop molecule HCV-infected human hepatoma cells Huh-7 were seeded in 24-well culture plates at 1 × 10 ⁵ cells / well, and one day later, TransIT-mRNA Transfection Kit ( Antisense RNA was introduced into the cells using MirasBio. Antisense RNA
1 or 5 μg was mixed with TransIT-mRNA Reagent / mRNA Boost Reagent / Opti-MEM, and the mixture was allowed to stand for 4 minutes and then added to the cells. After culturing for 3 days, total cellular RNA was prepared by TRIZOL reagent. The total RNA amount was measured and HCV was measured by TaqMan real-time RT-PCR.
RNA was quantitatively measured. As a result, in the case of IIIf-a1, a decrease of about 70% in the amount of HCV RNA was observed, and in the case of IIIf-a2, a decrease of about 30% was observed, which corresponds to the binding activity with the target RNA in the in vitro assay. It was observed. In addition, IIIf-a1m and IIIf-a2m into which IIIf-a1 and IIIf-a2 loop mutations were introduced showed no inhibitory activity as expected.

本発明の核酸は、ＨＶＣ増殖、複製阻害が可能であり、C型肝炎の予防又は治療のための医薬品として利用可能である。 The nucleic acid of the present invention can inhibit HVC proliferation and replication, and can be used as a pharmaceutical product for the prevention or treatment of hepatitis C.

＜配列番号１＞
配列番号１は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a0のRNA配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1のRNA配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a2のRNA配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s4のRNA配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s5のRNA配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s6のRNA配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s7のRNA配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIfのDNA配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a0のDNA配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a1のDNA配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a2のDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a1mのDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a2mのDNA配列を示す。 <SEQ ID NO: 1>
SEQ ID NO: 1 shows the RNA sequence of the antisense RNA stem loop IIIf-a0.
<SEQ ID NO: 2>
SEQ ID NO: 2 shows the RNA sequence of the antisense RNA stem loop IIIf-a1.
<SEQ ID NO: 3>
SEQ ID NO: 3 shows the RNA sequence of antisense RNA stem loop IIIf-a2.
<SEQ ID NO: 4>
SEQ ID NO: 4 shows the RNA sequence of the antisense RNA stem loop IIIf-a1-s4.
<SEQ ID NO: 5>
SEQ ID NO: 5 shows the RNA sequence of antisense RNA stem loop IIIf-a1-s5.
<SEQ ID NO: 6>
SEQ ID NO: 6 shows the RNA sequence of antisense RNA stem loop IIIf-a1-s6.
<SEQ ID NO: 7>
SEQ ID NO: 7 shows the RNA sequence of antisense RNA stem loop IIIf-a1-s7.
<SEQ ID NO: 8>
SEQ ID NO: 8 shows the DNA sequence of RNA template oligo DNA sequence IIIf.
<SEQ ID NO: 9>
SEQ ID NO: 9 shows the DNA sequence of RNA template oligo DNA sequence IIIf-a0.
<SEQ ID NO: 10>
SEQ ID NO: 10 shows the DNA sequence of template oligo DNA sequence IIIf-a1 of RNA.
<SEQ ID NO: 11>
SEQ ID NO: 11 shows the DNA sequence of RNA template oligo DNA sequence IIIf-a2.
<SEQ ID NO: 12>
SEQ ID NO: 12 shows the DNA sequence of template oligo DNA sequence IIIf-a1m of RNA.
<SEQ ID NO: 12>
SEQ ID NO: 12 shows the DNA sequence of template oligo DNA sequence IIIf-a2m of RNA.

特開２００２−１６５５９４JP 2002-165594 A

Rijnbrand RC et al., Curr Top MicrobiolImmunol.242:85-116, 2000Rijnbrand RC et al., Curr Top MicrobiolImmunol. 242: 85-116, 2000 Kieft et al., ＲＮＡ, Feb;7(2):194-206, 2001Kieft et al., RNA, Feb; 7 (2): 194-206, 2001 Ray & Das, Nucleic Acids Res.,32:1678-1687, 2004Ray & Das, Nucleic Acids Res., 32: 1678-1687, 2004 Tallet-Lopez et al., Nucleic Acids Res.,31:734-742, 2003Tallet-Lopez et al., Nucleic Acids Res., 31: 734-742, 2003 Kanda et al., J. Virol., 81:669-676, 2007Kanda et al., J. Virol., 81: 669-676, 2007 Aldaz-Carrol et al., Biochem., 41:5883-5893, 2002Aldaz-Carrol et al., Biochem., 41: 5883-5893, 2002 Da Rocha Gomes et al., BBRC, 322:820-826, 2004Da Rocha Gomes et al., BBRC, 322: 820-826, 2004 Romero-Lopez et al., Cell Mol. Life Sci., 64:2994-3006, 2007Romero-Lopez et al., Cell Mol. Life Sci., 64: 2994-3006, 2007 Wang et al., ＲＮＡ, Jul;1(5):526-37.:526-537, 1995Wang et al., RNA, Jul; 1 (5): 526-37.: 526-537, 1995

Claims

Nucleic acid containing an antisense RNA stem loop targeting HCV IRES SL IIIf.

Antisense RNA stem loop is HCV
The nucleic acid according to claim 1, which has a 4 to 12 base loop having a 2 to 8 base region complementary to the loop region of SL IIIf RNA of IRES.

The nucleic acid according to claim 1 or 2, wherein a GA mismatch base pair is inserted at the base of the loop.

The nucleic acid according to any one of claims 1 to 3, wherein the antisense RNA stem loop has a stem of 2 to 48 base pairs.

The nucleic acid according to any one of claims 1 to 4, wherein the antisense RNA stem loop is represented by any of the following sequences.
IIIf-a0: 5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 1)
IIIf-a1: 5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
IIIf-a2: 5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3 '(SEQ ID NO: 3)
IIIf-a1-s4: 5'-GGUGGCUCGCAACACC-3 '(SEQ ID NO: 4)
IIIf-a1-s5: 5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3 '(SEQ ID NO: 5)
IIIf-a1-s6: 5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3 '(SEQ ID NO: 6)
IIIf-a1-s7: 5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3 '(SEQ ID NO: 7)

The nucleic acid according to any one of claims 1 to 5, which is chemically modified.

An expression vector capable of expressing the nucleic acid according to claim 1 in a cell.

A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid according to claim 1 and / or the expression vector according to claim 7.

The pharmaceutical composition according to claim 8, which is used for prevention or treatment of hepatitis C.