JP2011158341A - Method for screening peptide - Google Patents
Method for screening peptide Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011158341A JP2011158341A JP2010019731A JP2010019731A JP2011158341A JP 2011158341 A JP2011158341 A JP 2011158341A JP 2010019731 A JP2010019731 A JP 2010019731A JP 2010019731 A JP2010019731 A JP 2010019731A JP 2011158341 A JP2011158341 A JP 2011158341A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- target protein
- amino acid
- screening
- library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 59
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 21
- 108010091769 Shiga Toxin 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 13
- 102100029932 Syntaxin-1A Human genes 0.000 claims description 12
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 10
- 108010090763 Shiga Toxin 2 Proteins 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102100035936 Syntaxin-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010076365 Adiponectin Proteins 0.000 claims description 4
- 102000011690 Adiponectin Human genes 0.000 claims description 4
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 4
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 claims description 4
- 101710090322 Truncated surface protein Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims description 4
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 4
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 102220057402 rs730881760 Human genes 0.000 description 13
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- -1 Met Chemical class 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 4
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- LINBWYYLPWJQHE-UHFFFAOYSA-N 3-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LINBWYYLPWJQHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WCFJUSRQHZPVKY-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCC(O)=O WCFJUSRQHZPVKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032759 Hemolytic-Uremic Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical group CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- XAKBSHICSHRJCL-UHFFFAOYSA-N [CH2]C(=O)C1=CC=CC=C1 Chemical group [CH2]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAKBSHICSHRJCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000003670 adamantan-2-yl group Chemical group [H]C1([H])C(C2([H])[H])([H])C([H])([H])C3([H])C([*])([H])C1([H])C([H])([H])C2([H])C3([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005076 adamantyloxycarbonyl group Chemical group C12(CC3CC(CC(C1)C3)C2)OC(=O)* 0.000 description 1
- 108010017893 alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- RXUBZLMIGSAPEJ-UHFFFAOYSA-N benzyl n-aminocarbamate Chemical compound NNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 RXUBZLMIGSAPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical group C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 125000000612 phthaloyl group Chemical group C(C=1C(C(=O)*)=CC=CC1)(=O)* 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N propionitrile Chemical compound CCC#N FVSKHRXBFJPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
Abstract
Description
本発明は、標的タンパク質との結合性を有するペプチドのスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for screening a peptide having a binding property with a target protein.
Shiga toxin (Ｓｔｘ)は、腸管出血性大腸菌が産生する主要な病原因子であり、消化管障害のみならず、その後の一連の微小血管障害である重症合併症〔たとえば、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）〕などを引き起こすことが知られている。 Shiga toxin (Stx) is a major virulence factor produced by enterohemorrhagic E. coli and is not only a gastrointestinal disorder but also a series of microvascular disorders, such as severe complications such as hemolytic uremic syndrome (HUS) )] Is known to cause.
そして、この出願の発明者は、これまでに、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２のＢサブユニットとグロボ３糖の結合にはクラスター効果が存在するとの知見から、多価型ペプチドライブラリーを利用したスクリーニング方法を確立している（特許文献１）。 The inventor of this application has established a screening method using a multivalent peptide library based on the knowledge that a cluster effect exists in the binding between the B subunit of Stx1 and Stx2 and globotrisaccharide. (Patent Document 1).
ここで、「クラスター効果」とは、ある機能分子とそのリガンドとの相互作用において、１対１の場合に比べて多価対多価の相互作用によって、著しくその結合親和性が亢進する現象をいう。特許文献１では、ペプチドライブラリーを多価にすることによって、Ｓｔｘ２のＢサブユニットとの間にクラスター効果を発揮させ、Ｓｔｘ２との高結合親和性を有するＳｔｘ２阻害ペプチドを特定している。 Here, the “cluster effect” is a phenomenon in which the binding affinity is remarkably increased by the interaction between multivalent and multivalent in the interaction between a certain functional molecule and its ligand as compared with the case of 1: 1. Say. In Patent Document 1, by making the peptide library multivalent, a cluster effect is exhibited with the B subunit of Stx2, and a Stx2 inhibitory peptide having a high binding affinity with Stx2 is specified.
しかしながら、特許文献１のスクリーニング方法では、例えば、野生型ＳＴＸと、このミュータントに対してランダム多価ライブラリーを接触させて、各々のpositionで得られたアミノ酸について、どのアミノ酸がどの程度の強さで選択されるかを示す数値化された結果を得ている。 However, in the screening method of Patent Document 1, for example, a wild-type STX and a random multivalent library are brought into contact with this mutant, and for each amino acid obtained at each position, which amino acid is to what strength. A numerical result indicating whether or not is selected is obtained.
このため、標的タンパク質の種類、あるいは、標的部位によっては、各々のpositionで選択されるアミノ酸の選択性が低い場合がある。また、標的部位に荷電アミノ酸がない、あるいは少ない場合には、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＩＩe、Ｐｈｅ、Ｔｒｐなどの疎水的アミノ酸が選択されやすいため、各positionの選択性に影響を与える。このため、結果として選択された結合モチーフが、必ずしも十分な結合性を有していない場合があった。 For this reason, the selectivity of the amino acid selected by each position may be low depending on the kind of target protein or the target site. In addition, when there are no or few charged amino acids in the target site, hydrophobic amino acids such as Met, Val, IIe, Phe, and Trp are easily selected, which affects the selectivity of each position. For this reason, the binding motif selected as a result may not necessarily have sufficient binding property.
また、特許文献１のスクリーニング方法は、各positionのアミノ酸の選択性に基づいて結合モチーフを決定しているため、選択性の強いアミノ酸を組合せた結合モチーフが、結果として必ずしも十分な結合性を有していない場合があった。 Furthermore, since the screening method of Patent Document 1 determines the binding motif based on the amino acid selectivity at each position, a binding motif that combines highly selective amino acids does not necessarily have sufficient binding properties as a result. There was a case that did not.
このように、この出願の発明者は、特許文献１のスクリーニング方法では、結合モチーフの同定に一定の成果が得られるもの、確実に結合性の高い結合モチーフを抽出することが難しいという点において、改善すべき課題があるとの認識に至った。また、例えば、選択性の判断が難しいpositionにおいて、特定のアミノ酸を組み込んで結合性を評価することは、コストの面から現実的ではなかった。 Thus, the inventor of this application, in the screening method of Patent Document 1, it is difficult to extract a binding motif having a high binding property, because it is possible to obtain a certain result in the identification of the binding motif, I came to realize that there are issues to be improved. Further, for example, in a position where it is difficult to judge selectivity, it is not realistic from the viewpoint of cost to incorporate a specific amino acid and evaluate the binding.
また、特許文献１のスクリーニング方法は、一度に得られる結合モチーフの数が数個に限られており、スクリーニングの効率性においても改善すべき点があると考えられた。 In addition, the screening method of Patent Document 1 is limited to several binding motifs obtained at a time, and it was considered that there is a point to be improved in screening efficiency.
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、従来のスクリーニング方法に加え、クラスター効果を有する標的タンパク質に結合するペプチドを、より厳密かつ効率的に特定することができるスクリーニング方法を提供することを課題としている。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and in addition to the conventional screening method, a screening method capable of more strictly and efficiently identifying a peptide that binds to a target protein having a cluster effect. It is an issue to provide.
本発明は、以下のことを特徴としている。 The present invention is characterized by the following.
第１に、本発明のスクリーニング方法は、クラスター効果を有する標的タンパク質との結合性を有するペプチドのスクリーニング方法であって、以下のステップ：
（Ａ）ランダム多価ライブラリー法を用いて、１以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定するステップ；
（Ｂ）シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造を形成し、このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる２価または４価ペプチドを伸長させて、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸（Cysを除く）が異なる多価ペプチドライブラリーを作成するステップ；
（Ｃ）多価ペプチドライブラリーの各々の２価ペプチドまたは４価ペプチドに標的タンパク質をブロットするステップ；
（Ｄ）標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定するステップ；
を含む。
First, the screening method of the present invention is a method for screening a peptide having a binding property to a target protein having a cluster effect, which comprises the following steps:
(A) determining a target protein binding motif in which one or more amino acid non-specific sites are present using a random multivalent library method;
(B) A synthetic nucleus structure of a bivalent peptide or a synthetic nucleus structure of a tetravalent peptide is formed directly or via a spacer from an amino group on the sheet, and the amino acid sequence of the target protein binding motif is formed from this peptide synthesis nucleus structure Elongating a divalent or tetravalent peptide comprising a multivalent peptide library in which amino acids at non-specific amino acid sites (excluding Cys) differ for each peptide;
(C) blotting the target protein to each bivalent or tetravalent peptide of the multivalent peptide library;
(D) determining that the peptide to which the target protein is bound is the target peptide;
including.
第２に、前記第１のスクリーニング方法において、ペプチド合成核構造は、リジンを含む。 Second, in the first screening method, the peptide synthesis nucleus structure contains lysine.
第３に、標的タンパク質は、ＳＴＸ１、ＳＴＸ２、ＳＴＸ１c、ＳＴＸ２c、 ＳＴＸ２e、ＳＴＸ２d、ＳＴＸ２ｆ、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、HAタンパク質、gp120、セレクチン、アディポネクチンのうちの１種または２種以上である。 Third, the target protein is one or more of STX1, STX2, STX1c, STX2c, STX2e, STX2d, STX2f, cholera toxin, heat-labile enterotoxin, HA protein, gp120, selectin, adiponectin.
第４に、本発明のスクリーニング用キットは、前記第１のスクリーニング方法に使用されるキットであって、シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造が形成されている。 Fourthly, the screening kit of the present invention is a kit used in the first screening method, wherein the bivalent peptide synthetic core structure or 4 is directly or via a spacer from an amino group on the sheet. A synthetic nucleus structure of a valent peptide is formed.
本発明のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットによれば、クラスター効果を有する標的タンパク質に結合するペプチドを、より厳密かつ効率的に特定することができる。 According to the screening method and screening kit of the present invention, a peptide that binds to a target protein having a cluster effect can be identified more strictly and efficiently.
本発明のペプチドのスクリーニング方法は、クラスター効果を有する標的タンパク質との結合性を有するペプチドのスクリーニング方法である。 The peptide screening method of the present invention is a method for screening a peptide having a binding property to a target protein having a cluster effect.
クラスター効果を有する標的タンパク質としては、例えば、ＳＴＸ１、ＳＴＸ２、ＳＴＸ１、ＳＴＸ２のバリアント（ＳＴＸ１Ｃ、ＳＴＸ２c,２e,２d,２f）、コレラ菌が産生するコレラ毒素、毒素原生大腸菌が産生する易熱性エンテロトキシン、インフルエンザウイルスの侵入に関わるHAタンパク質、HIVの侵入に関わるgp120、がん細胞の転移に関わる各種セレクチン、糖尿病に関係するアディポネクチンなどが挙げられる。 Examples of target proteins having a cluster effect include STX1, STX2, STX1, STX2 variants (STX1C, STX2c, 2e, 2d, 2f), cholera toxin produced by Vibrio cholerae, heat-labile enterotoxin produced by Escherichia coli E. coli, HA protein involved in influenza virus entry, gp120 involved in HIV entry, various selectins involved in cancer cell metastasis, and adiponectin related to diabetes.
そして、本発明のペプチドのスクリーニング方法は、以下のステップ：
（Ａ）ランダム多価ライブラリー法を用いて、１以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定するステップ；
（Ｂ）シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造を形成し、このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる２価または４価ペプチドを伸長させて、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸（Cysを除く）が異なる多価ペプチドライブラリーを作成するステップ；
（Ｃ）多価ペプチドライブラリーの各々の２価ペプチドまたは４価ペプチドに標的タンパク質をブロットするステップ；
（Ｄ）標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定するステップ；
を含む。
The peptide screening method of the present invention comprises the following steps:
(A) determining a target protein binding motif in which one or more amino acid non-specific sites are present using a random multivalent library method;
(B) A synthetic nucleus structure of a bivalent peptide or a synthetic nucleus structure of a tetravalent peptide is formed directly or via a spacer from an amino group on the sheet, and the amino acid sequence of the target protein binding motif is formed from this peptide synthesis nucleus structure Elongating a divalent or tetravalent peptide comprising a multivalent peptide library in which amino acids at non-specific amino acid sites (excluding Cys) differ for each peptide;
(C) blotting the target protein to each bivalent or tetravalent peptide of the multivalent peptide library;
(D) determining that the peptide to which the target protein is bound is the target peptide;
including.
以下、前記の各ステップについて説明する。 Hereinafter, each step will be described.
ステップ（Ａ）では、まず、この出願の発明者によって確立された「ランダム多価ライブラリー法」によって、標的タンパク質結合モチーフの絞り込みを行う。 In step (A), first, the target protein binding motif is narrowed down by the “random multivalent library method” established by the inventors of this application.
詳細はWO2006/00152公報に開示しているが、概略としては、標的タンパク質結合の受容体結合サイトの情報に基づいて、前記受容体結合サイトが機能的に欠損したミュータントを作製し、ペプチドライブラリー法によって、標的タンパク質に結合するペプチドモチーフとミュータントに結合するペプチドモチーフとの対比によるアミノ選択比に基づく結合サイト特異性ペプチドモチーフの特定を含んでいる。 The details are disclosed in WO2006 / 00152, but as a general rule, based on the information of the receptor binding site of the target protein binding, a mutant in which the receptor binding site is functionally deleted is prepared, and a peptide library The method includes the identification of a binding site-specific peptide motif based on the amino selectivity by comparing the peptide motif that binds to the target protein and the peptide motif that binds to the mutant.
ペプチドライブラリーは、クラスター効果を発揮させるためにライブラリー自体が多価である多価ライブラリーである。多価ライブラリーの構造は、その設計や合成の容易性、クラスター効果のための分子サイズの観点から、リジン（Ｌｙｓ）を複数個、例えば、２〜５個結合したものを用いることができる。 The peptide library is a multivalent library in which the library itself is multivalent in order to exert a cluster effect. As the structure of the multivalent library, a structure in which a plurality of, for example, 2 to 5, lysines (Lys) are bound can be used from the viewpoint of design and synthesis ease and molecular size for cluster effect.
具体的には、リジンが３個結合した分子核構造を有する多価ライブラリーとして、以下のものが例示される。 Specific examples of the multivalent library having a molecular nucleus structure in which three lysines are bonded include the following.
この多価ライブラリーでは、リジンの分子核構造に、スペーサー分子を介して、ペプチドモチーフ（ＸＸＸＸ部）を結合させている。ここで、スペーサー分子として、ＡＨＡ（ａｍｉｎｏ−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を採用しているが、これに限定されることはなく、標的タンパク質に応じて、スペーサー長を設計することができる。また、末端のＭＡ（Ｍｅｔ−Ａｌａ）は、アミノ酸シークエンスを行う際のシークエンスチェックのために、スクリーニング時に導入することができる。ＡＨＡ−の前のＡ（Ａｌａ）も同様の理由による。 In this multivalent library, a peptide motif (XXXX portion) is bound to the molecular nucleus structure of lysine via a spacer molecule. Here, although AHA (amino-hexanoic acid) is employ | adopted as a spacer molecule | numerator, it is not limited to this, A spacer length can be designed according to a target protein. Moreover, terminal MA (Met-Ala) can be introduced at the time of screening for sequence check when performing amino acid sequencing. A (Ala) before AHA- is also for the same reason.
そして、前記多価ライブラリーにおいては、ＸＸＸＸ部には、Ｃｙｓを除く１９種のアミノ酸をランダムに構成することができる。ＸＸＸＸ部の長さは、標的タンパク質に応じて適宜決定される。例えば、ＳＴＸ１、２毒性阻害作用ペプチドを特定する場合には、分子サイズに関する知見から、７個のアミノ酸を想定することができる。 And in the said multivalent library, 19 types of amino acids except Cys can be comprised in the XXXXXX part at random. The length of the XXX portion is appropriately determined according to the target protein. For example, when specifying a peptide having STX1 or 2 toxicity-inhibiting action, 7 amino acids can be assumed from the knowledge regarding molecular size.
そして、例えば、ビーズにつけた標的タンパク質およびこのミュータントの各々を調整し、カラムにつめてａｆｆｉｎｉｔｙカラムを作製する。そこに、前記多価ライブラリーを加えて十分に結合させる。その後、ＰＢＳ等で十分に洗浄し、結合しなかったライブラリーを洗い流す。最後にカラムに止まっている前記多価ライブラリーを３０％酢酸等で溶出する。回収された画分をｄｒｙｕｐし、アミノ酸配列解析を行う。その結果、ＸＸＸＸ部（degenerate position）について、どのアミノ酸がどの程度の強さで選択されてくるか、数値化された結果が得られる。 Then, for example, the target protein attached to the beads and each of the mutants are prepared and packed into a column to produce an affinity column. There, the multivalent library is added and allowed to bind sufficiently. Then, it is washed thoroughly with PBS or the like, and the library that has not been bound is washed away. Finally, the multivalent library remaining on the column is eluted with 30% acetic acid or the like. The collected fraction is dried up and amino acid sequence analysis is performed. As a result, for the XXXXXX part (degenerate position), a numerical result is obtained as to which amino acid is selected with what strength.
すなわち、標的タンパク質を用いたときのdegenerate positionの各アミノ酸の値を、ミュータントを用いたとき対応するdegenerate positionのアミノ酸の値で割り、その結果、そのアミノ酸が標的タンパク質では、ミュータントに比べて何倍選択されるようになったかが数値化された結果を得ることができる。このとき、例えば、１９種のアミノ酸の値をすべてたすと１９になるように標準化することができる。この場合、各アミノ酸の間で、選択性に差がないと値は１となる。 That is, the value of each amino acid at the degenerate position when the target protein is used is divided by the value of the amino acid at the corresponding degenerate position when the mutant is used, and as a result, how many times that amino acid is compared with the mutant in the target protein. It is possible to obtain a numerical result indicating whether or not the selection has been made. At this time, for example, it can be standardized to be 19 when all 19 amino acid values are added. In this case, the value is 1 if there is no difference in selectivity between amino acids.
このようにして得られた結果から、各positionにおいて選択比の高いアミノ酸を特定することができる。 From the results thus obtained, amino acids having a high selectivity at each position can be identified.
ただ、本発明においては、上記の通りのアミノ酸の選択性等の問題から、例えば、比較的選択性の低い（例えば、選択性1.2以下など）positionは、アミノ酸非特定部位として具体的なアミノ酸は特定しない。すなわち、本発明のステップ（Ａ）においては、このようにして１以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定する。 However, in the present invention, due to problems such as amino acid selectivity as described above, for example, a position with relatively low selectivity (for example, selectivity of 1.2 or less) is a specific amino acid as an amino acid non-specific site. Not specified. That is, in step (A) of the present invention, a target protein binding motif in which one or more amino acid non-specific sites are present is determined in this way.
次に、本発明のステップ（Ｂ）では、シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、Lysからなる２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造をスポット合成する。 Next, in step (B) of the present invention, a synthetic nucleus structure of a bivalent peptide or a synthetic nucleus structure of a tetravalent peptide consisting of Lys is spot-synthesized directly or via a spacer from an amino group on the sheet.
シートは特に限定されないが、例えば、セルロースシート、樹脂等を例示することができる。そして、シート上のアミノ基は、公知の方法で付加することができる。また、例えば、セルロースシートに遊離アミノ基が付加された市販品を使用することもできる。 Although a sheet | seat is not specifically limited, For example, a cellulose sheet, resin, etc. can be illustrated. And the amino group on a sheet | seat can be added by a well-known method. Moreover, for example, a commercial product in which a free amino group is added to a cellulose sheet can be used.
ペプチドの合成に関して、縮合や保護基の除去は、従来公知の方法に従って行うことができる。具体的には、例えば、Fmocペプチド合成法などを採用することができ、市販のペプチド合成器によって行うこともできる。 Concerning peptide synthesis, condensation and removal of protecting groups can be performed according to conventionally known methods. Specifically, for example, an Fmoc peptide synthesis method or the like can be employed, and a commercially available peptide synthesizer can also be used.
さらに詳しくは、保護アミノ酸の縮合においては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。保護アミノ酸の縮合は、例えば活性化試薬およびラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を添加するか、あらかじめ保護アミノ酸を対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとして活性化した後に添加することによって行うことができる。 More specifically, in the condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used. Condensation of the protected amino acid may be performed, for example, by adding the protected amino acid together with an activating reagent and a racemization inhibitor (for example, HOBt, HOOBt), or after previously activating the protected amino acid as a symmetric anhydride, HOBt ester or HOBt ester. This can be done by adding.
保護アミノ酸の活性化や縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択される。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類；塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類；トリフルオロエタノールなどのアルコール類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類；ピリジンなどのアミン類；ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類；あるいはこれらの適宜の混合物などを用いることができる。 The solvent used for the activation and condensation of the protected amino acid is appropriately selected from solvents that are known to be usable for protein condensation reactions. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol; dimethyl sulfoxide and the like Sulfoxides; amines such as pyridine; ethers such as dioxane and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof can be used.
反応温度は、蛋白質縮合反応に使用されることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。 The reaction temperature is appropriately selected from the range known to be used in protein condensation reactions, and is usually selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C.
また、原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。 Examples of the protective group for the amino group of the raw material amino acid include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, Examples include trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, and Fmoc.
原料アミノ酸のカルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。 The carboxyl group of the raw material amino acid is, for example, alkyl esterified (for example, straight chain such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, branched or Cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, It can be protected by t-butoxycarbonyl hydrazation, trityl hydrazation or the like.
スペーサーは、具体的に限定されないが、例えば、Ahx（amino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]）を採用することができる。このとき、標的タンパク質に応じて、最適なスペーサー長を設計することができる。 The spacer is not specifically limited, but, for example, Ahx (amino hexanoic acid [NH 2 — (CH 2 ) 5 —COOH]) can be employed. At this time, an optimal spacer length can be designed according to the target protein.
そして、例えば図１に例示するように、シート上のアミノ基から、２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造を形成する。具体的には、例えば、Fmoc-Lys、Fmoc-Hisを使用して２価、４価の合成核構造を形成することができる。他のアミノ酸との相互作用等を考慮すると、Fmoc-Lysが好ましい。また、４価の合成核構造を形成する場合、Fmoc-Lysを２回連続してペプチド合成することが考慮される。合成核構造は、２価または４価ペプチドを伸長させることができる構造であればよく、具体的に限定されない。 For example, as illustrated in FIG. 1, a synthetic nucleus structure of a bivalent peptide or a synthetic nucleus structure of a tetravalent peptide is formed from an amino group on the sheet. Specifically, for example, a divalent or tetravalent synthetic nucleus structure can be formed using Fmoc-Lys or Fmoc-His. Fmoc-Lys is preferable in consideration of interaction with other amino acids. In addition, when a tetravalent synthetic nucleus structure is formed, it is considered to synthesize peptides with Fmoc-Lys twice in succession. The synthetic core structure is not particularly limited as long as it is a structure capable of extending a divalent or tetravalent peptide.
このように、シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造が形成されているものをスクリーニング用のキットとすることができる。 As described above, a screening kit can be obtained by forming a divalent peptide synthetic nucleus structure or a tetravalent peptide synthetic nucleus structure directly or via a spacer from an amino group on a sheet.
このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる２価または４価ペプチドを伸長させて、シート上のペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸（Cysを除く）が異なる多価ペプチドライブラリーを作成する。 From this peptide synthesis core structure, a bivalent or tetravalent peptide consisting of the amino acid sequence of the target protein binding motif is extended, and the amino acid (except for Cys) of the amino acid non-specific site is different for each peptide on the sheet. Create a rally.
すなわち、前記ステップ（Ａ）で絞り込んだアミノ酸非特定部位を有する結合モチーフをペプチド合成核構造から伸長させるが、このとき、アミノ酸非特定部位をCysを除く１９種のアミノ酸で網羅的に置換したペプチドを合成することで配列既知の多価ライブラリーを作成することができる。 That is, the binding motif having the amino acid non-specific site narrowed down in the step (A) is extended from the peptide synthesis nucleus structure, and at this time, the peptide in which the amino acid non-specific site is comprehensively substituted with 19 amino acids excluding Cys Can be synthesized to create a multivalent library with a known sequence.
具体的には、アミノ酸非特定部位が、３つ存在する場合には、19×19×19＝6859種のペプチドをスポット合成することができる。このとき、アミノ酸非特定部位の予測や、シートの種類、数やペプチド合成器の性能に基づいて、ペプチドの種類（スポットの数）を制限することもできる。 Specifically, when there are three non-amino acid specific sites, 19 × 19 × 19 = 6859 kinds of peptides can be spot-synthesized. At this time, the type of peptide (the number of spots) can be limited based on the prediction of non-amino acid specific sites, the type and number of sheets, and the performance of the peptide synthesizer.
なお、シート上のアミノ基から伸長するペプチドの集積密度も標的タンパク質に応じて、適宜設計することができる。 The accumulation density of peptides extending from amino groups on the sheet can also be appropriately designed according to the target protein.
次に、本発明のステップ（Ｃ）として、多価ペプチドライブラリーの各々の２価ペプチドまたは４価ペプチドに標的タンパク質をブロットする。そして、本発明のステップ（Ｄ）として、標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定する。 Next, as step (C) of the present invention, the target protein is blotted onto each bivalent peptide or tetravalent peptide of the multivalent peptide library. Then, as step (D) of the present invention, the peptide to which the target protein is bound is determined to be the target peptide.
ステップ（Ｂ）で作製した多価ペプチドライブラリーは、シート上の各々のペプチドが２価または４価であるため、標識標的タンパク質をブロットすることで、標的タンパク質との間にクラスター効果を生じさせることができる。このため、ペプチドと標的タンパク質との間の高結合を確保することができる。そして、標的タンパク質の標識は、公知の方法を適宜採用することができる。例えば、蛍光標識する場合の蛍光物質としては、フルオレセイン、テトラメチルローダミンなどを例示することができる。 In the multivalent peptide library prepared in step (B), since each peptide on the sheet is bivalent or tetravalent, a labeled target protein is blotted to produce a cluster effect with the target protein. be able to. For this reason, the high coupling | bonding between a peptide and a target protein is securable. A known method can be appropriately employed for labeling the target protein. For example, fluorescein, tetramethylrhodamine and the like can be exemplified as the fluorescent substance in the case of fluorescent labeling.
結合しなかった標的タンパク質を洗い流すために適宜シートの洗浄等を行い、公知の各種分析方法によって、標的タンパク質とシート上のペプチドの結合性を評価することができる。例えば、標的タンパク質を蛍光標識し、その感光強度を定量的に評価することができる。 In order to wash away the unbound target protein, the sheet is appropriately washed, and the binding properties of the target protein and the peptide on the sheet can be evaluated by various known analysis methods. For example, the target protein can be fluorescently labeled and its photointensity can be quantitatively evaluated.
本発明のスクリーニング方法では、シート上に配列既知の２価、４価ペプチドがスポット合成されているため、標的タンパク質との高結合性が確認されたスポットを抽出すれば、ステップ（Ａ）で設定したアミノ酸非特定部位のアミノ酸の候補を確実かつ容易に特定することができる。 In the screening method of the present invention, since a divalent or tetravalent peptide having a known sequence is spot-synthesized on a sheet, if a spot that has been confirmed to be highly binding to the target protein is extracted, it is set in step (A). It is possible to reliably and easily identify amino acid candidates at non-specific amino acid sites.
また、例えば、標的タンパク質における特定の結合サイトに特異的に結合するモチーフを特定するためには、別途、前記結合サイトが機能的に欠損したミュータントを作製し、このミュータントを多価ペプチドライブラリーの各々のペプチドにブロットして、前記標的タンパク質（野生型）の結合性評価の結果と比較することができる。 In addition, for example, in order to identify a motif that specifically binds to a specific binding site in the target protein, separately, a mutant in which the binding site is functionally deleted is prepared, and this mutant is stored in a multivalent peptide library. Each peptide can be blotted and compared with the result of the binding evaluation of the target protein (wild type).
このように、本発明のスクリーニング方法では、従来のランダム多価ライブラリー法に加え、前記の各ステップを経ることで、クラスター効果を有する標的タンパク質に結合するペプチドを、より厳密かつ効率的に特定することができる。このため、クラスター効果を有することが知られているＳＴＸ１またはＳＴＸ２、ＳＴＸ１c、ＳＴＸ２c、 ＳＴＸ２e、ＳＴＸ２d、ＳＴＸ２f、コレラ毒素、易熱性エンテロトキシン、HAタンパク質、gp120、セレクチン、アディポネクチンなどと特異的に結合するペプチドをスクリーニングすることができ、これらのペプチドの作用を確認することで、前記標的タンパク質に起因する疾患など、例えば、腸管出血性大腸菌感染症、赤痢、コレラ、毒素原生大腸菌感染症、インフルエンザ、HIV、がん細胞の転移、糖尿病の治療、予防薬とすることができる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、このような創薬スクリーニングとして極めて有用である。 As described above, in the screening method of the present invention, in addition to the conventional random multivalent library method, the peptides that bind to the target protein having the cluster effect can be more strictly and efficiently identified through the above steps. can do. Therefore, peptides that specifically bind to STX1 or STX2, STX1c, STX2c, STX2e, STX2d, STX2f, cholera toxin, heat-labile enterotoxin, HA protein, gp120, selectin, adiponectin and the like that are known to have a cluster effect By confirming the action of these peptides, diseases caused by the target protein such as enterohemorrhagic E. coli infection, dysentery, cholera, protozoan E. coli infection, influenza, HIV, It can be used as a cancer cell metastasis, diabetes treatment, or a prophylactic agent. The screening method of the present invention is extremely useful as such drug discovery screening, for example.
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited to these Examples at all.
＜１＞多価型ペプチドライブラリーのシート合成技術の確立
（１）２価ペプチドの合成
特許文献１の多価型ランダムペプチドライブラリーの欠点を改善するため、図１の概要図に示すように、配列既知の２価、４価ペプチドをセルロースシート上にスポット合成することを検討した。図１の合成核構造は、Fmocが除去されたリジンを示している。
<1> Establishment of Sheet Synthesis Technology for Multivalent Peptide Library (1) Synthesis of Divalent Peptide As shown in the schematic diagram of FIG. 1 in order to improve the disadvantages of the multivalent random peptide library of Patent Document 1. Then, it was studied to spot-synthesize divalent and tetravalent peptides of known sequence on a cellulose sheet. The synthetic core structure in FIG. 1 shows lysine from which Fmoc has been removed.
スポット合成には、intavis AG社のスポットペプチドシンセサイザーを使用した。この機器は、セルロースシート上に一度に384種のペプチドをスポット合成することが可能である。 For spot synthesis, a spot peptide synthesizer from intavis AG was used. This instrument is capable of spot synthesizing 384 peptides at a time on a cellulose sheet.
ここでは、シート上で２価ペプチドを合成する。このために、シート上のアミノ基から伸長するペプチドに、［化２］のFmoc Lysを導入して分岐点を設け、分岐点からのアミノ酸合成が２価となるように設計した。 Here, a bivalent peptide is synthesized on a sheet. For this purpose, Fmoc Lys of [Chemical Formula 2] was introduced into the peptide extending from the amino group on the sheet to provide a branch point, and the amino acid synthesis from the branch point was designed to be divalent.
（２）ペプチド集積密度の最適化
Stx1 B-subunit(1BH)を標的タンパク質とした場合の、シート上ペプチドの集積密度を最適化するため、３種の密度で２価ペプチドを合成した。これは、ペプチド合成を２価で行った場合の立体障害の影響を評価するためである。このとき、標的タンパク質の結合モチーフとして、配列番号１：Met-Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg（ＭＭＡＲＲＲＲ）を採用した。
(2) Optimization of peptide accumulation density
In order to optimize the accumulation density of peptides on the sheet when Stx1 B-subunit (1BH) was used as a target protein, divalent peptides were synthesized at three densities. This is in order to evaluate the influence of steric hindrance when the peptide synthesis is performed in bivalent. At this time, SEQ ID NO: 1: Met-Met-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg (MMARRRR) was employed as a binding motif for the target protein.
まず、図２に示すように、第１番目のアミノ酸合成時にFmoc-βAlaとBoc-βAlaを各比率（100％、30％、10％）で使用する。Fmocだけを除去するために、ピペリジン処理をすることとし、Boc-βAlaが入るとその後のアミノ酸の伸長が起こらないようにした。このため、使用するBoc-βAlaの比率が増加するに従って伸長されてくるアミノ酸密度が減少することになる。 First, as shown in FIG. 2, Fmoc-βAla and Boc-βAla are used in each ratio (100%, 30%, 10%) during the synthesis of the first amino acid. In order to remove only Fmoc, piperidine treatment was performed, and when Boc-βAla entered, subsequent amino acid elongation was prevented. For this reason, the density of the extended amino acid decreases as the ratio of Boc-βAla used increases.
合成された各密度の２価ペプチドをＳＴＸ１Ｂ-subunit(1BH)でブロットし、最適密度を検討した。ここでは、Fuji-filmのBAS-2500を使用し、イメージングプレートに感光させて解析した。100％ Fmoc-βAla使用の条件（最も密度が高くなる合成条件）で、最も１BHの結合が高いことが示された（図３）。このことは、結合効率をあげるために100％ Fmoc-βAlaで２価のペプチドを伸長した場合でも、立体障害とはならないことを示している。
（３）スペーサー長の最適化
シート上に合成されるペプチドのシートからの距離（自由度）を最適化するため、３種のスペーサー長を持つ２価ペプチドを合成した。図４に示すようにβAlaと分岐点となるLys(Fmoc)との間に存在するスペーサーとしてのAhx（amino hexanoic acid [NH2-(CH2)5-COOH]）の数を１、２、３で合成し、1BHでブロットした際の結合の強さを比較した。
The synthesized bivalent peptides of each density were blotted with STX1B-subunit (1BH) to examine the optimum density. Here, Fuji-film BAS-2500 was used and exposed to an imaging plate for analysis. It was shown that the binding of 1BH was the highest under the conditions using 100% Fmoc-βAla (synthetic conditions with the highest density) (FIG. 3). This indicates that even when a divalent peptide is extended with 100% Fmoc-βAla in order to increase the binding efficiency, it does not cause steric hindrance.
(3) Optimization of spacer length In order to optimize the distance (degree of freedom) of the peptide synthesized on the sheet from the sheet, a bivalent peptide having three types of spacer lengths was synthesized. As shown in FIG. 4, the number of Ahx (amino hexanoic acid [NH 2- (CH 2 ) 5 -COOH]) as a spacer existing between βAla and Lys (Fmoc) as a branch point is 1, 2, The binding strength when synthesized with 3 and blotted with 1BH was compared.
その結果、スペーサー（Ahx）が１個の条件で、最も１BHの結合が高いことが示された（図５）。
（４）前記（２）（３）の結果を踏まえて、シート上の２価ペプチドは、図６に示すように、密度100％とし、スペーサー（Ahx）の数は１個とした。
As a result, it was shown that the binding of 1BH was the highest under the condition of one spacer (Ahx) (FIG. 5).
(4) Based on the results of (2) and (3) above, the bivalent peptide on the sheet had a density of 100% and the number of spacers (Ahx) was 1, as shown in FIG.
＜２＞ランダム多価ペプチドライブラリー法を用いたＳＴＸ１のサイト２特異的結合モチーフの同定
先願（ＷＯ2006/001542公報）の手順に従い、ランダム多価ペプチドライブラリー法を用いてＳＴＸ１のサイト２を標的とした結合モチーフの同定を行った。スクリーニングには、多価ペプチドライブラリーとして、以下の化学式、
<2> Identification of STX1 Site 2 Specific Binding Motif Using Random Multivalent Peptide Library Method According to the procedure of the prior application (WO2006 / 001542), STX1 site 2 was determined using the random multivalent peptide library method. The target binding motif was identified. For screening, as a multivalent peptide library, the following chemical formula,
からなる４価ペプチドを使用した。 A tetravalent peptide consisting of
このとき、サイト２変異体としてG62Aをサブトラクションに使用した。G62Aは、Stx1 B-subunitの６２番目のGlyをAlaに置換した変異体である。このアミノ酸はサイト２を構成する重要な位置に存在しているアミノ酸であり、この変異導入によって受容体（Gb3）との結合活性、標的細胞への結合、毒性、いずれも大きく低下する。また、サイト２は他のサイトに比べて構造が平坦であり、かつ、サイト２を構成する前記６２番目のGlyの周辺には静電的、あるいは疎水的な相互作用を達成するに十分なアミノ酸を持たないことも見出されている。 At this time, G62A was used for subtraction as a site 2 mutant. G62A is a mutant in which the 62nd Gly of Stx1 B-subunit is replaced with Ala. This amino acid is an amino acid present at an important position constituting the site 2, and by this mutation introduction, binding activity to the receptor (Gb3), binding to the target cell, and toxicity are greatly reduced. Site 2 has a flat structure compared to other sites, and there are sufficient amino acids around the 62nd Gly constituting site 2 to achieve electrostatic or hydrophobic interaction. It has also been found not to have.
そして、この変異によって受容体であるGb3結合能は顕減するが、この変異はわずかに-Hが-CH3に変化するにすぎない。すなわち、野生型と変異体の違いがわずかであるため、アミノ酸の選択性に違いが出にくいことが考えられ、スクリーニングによる結合モチーフの取得は難しいと予想されたが、最終的にサイト２特異性を発揮するモチーフとして、図７に示すように、ＫＲＲＲＲＲＲ（Lys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg：配列番号２）の１種類のモチーフを同定することができた。 And this mutation reduces the ability to bind to the receptor Gb3, but this mutation only slightly changes -H to -CH3. In other words, since the difference between the wild type and the mutant is slight, it is considered that the difference in amino acid selectivity is difficult to obtain, and it was expected that the binding motif by the screening would be difficult to obtain. As shown in FIG. 7, one motif of KRRRRRR (Lys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg: SEQ ID NO: 2) could be identified.
得られた結合モチーフを、上記［化３］の４箇所のＸＸＸＸ部にそれぞれ組み入れ、４
価のペプチド性化合物（以下、KRR-tetと記す）を合成した。
The obtained binding motif was incorporated into each of the four XXXX parts of [Chemical Formula 3] above.
Valent peptide compound (hereinafter referred to as KRR-tet) was synthesized.
ELISA法を用いた検討から、KRR-tetはG62Aに比べ野生型1BHに対し約２倍の結合活性を示すこと、すなわち、Stx1のサイト２に対する結合特異性を示すことが明らかとなった。 From the examination using the ELISA method, it was revealed that KRR-tet has about twice the binding activity to wild-type 1BH compared to G62A, that is, shows the binding specificity of Stx1 to site 2.
なお、KRR-tetのベロ細胞に対する毒性を検討したところ、本ペプチドは塩基性が非常に強いために細胞に対して強い毒性を示すことが明らかとなった。このためKRR-tetの阻害薬としての利用は難しいと判断した。 In addition, when the toxicity of KRR-tet to Vero cells was examined, it was revealed that this peptide exhibits a strong toxicity to cells since it is very basic. Therefore, it was judged that it was difficult to use KRR-tet as an inhibitor.
＜３＞２価ペプチドライブラリーのシート合成技術を用いたＳＴＸ１のサイト２特異的結合阻害薬の同定
上記＜２＞のスクリーニング結果から、ＳＴＸ１のサイト２に結合するためには、図７に示すように、position 4-7にArg（R）が選択されてくるという点に着目した。
<3> Identification of STX1 Site 2 Specific Binding Inhibitor Using Sheet Synthesis Technique of Bivalent Peptide Library From the above screening results of <2>, in order to bind to site 2 of STX1, it is shown in FIG. Thus, we focused on the point that Arg (R) is selected for positions 4-7.
そこで、Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Arg-Arg（配列番号３）を標的タンパク質結合モチーフとして、＜１＞で確立した、２価ペプチドライブラリーのシート合成技術の適用を試みた。Xaaは、アミノ酸非特定部位を示している。 Therefore, an attempt was made to apply the sheet synthesis technique of the bivalent peptide library established in <1> using Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO: 3) as a target protein binding motif. Xaa represents an amino acid non-specific site.
具体的には、Xaa-Xaa-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg（配列番号４）において、２つのXaaを各々、Cys 以外の19種のアミノ酸うちのいずれかとした361（19×19）種の２価ペプチド、および、Ala-Ala-Xaa-Arg-Arg-Arg-Arg（配列番号５）において、XaaをCys 以外の19種のアミノ酸うちのいずれかとした19種の２価ペプチドを、＜１＞で検討した単一シート上の２価ペプチドの合成核構造から伸長させ、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸（Cysを除く）が異なるペプチド（380種）をスポット合成することで、配列既知の多価ペプチドライブラリーを作成した。 Specifically, in Xaa-Xaa-Ala-Arg-Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO: 4), 361 (19 × 19) species in which two Xaas are each one of 19 amino acids other than Cys 19 divalent peptides in which Xaa is any one of 19 amino acids other than Cys in Ala-Ala-Xaa-Arg-Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO: 5) < By extending the synthetic core structure of the bivalent peptide on the single sheet studied in 1> and spot-synthesizing peptides (380 species) with different amino acids (except for Cys) at non-specific amino acid sites for each peptide, A known multivalent peptide library was created.
ここで、Alaは、荷電をもたず、大きな疎水性もなく、ボリュームも小さいこと、また、他のほとんどのアミノ酸（Glyを除く）はAlaの構造をその中にもっていること、を考慮している。なお、多価ペプチドライブラリーは、上記＜１＞で決定した最適条件（スペーサー長、最適密度）に従っている。 Here, Ala has no charge, no large hydrophobicity, small volume, and most other amino acids (except Gly) have Ala structure in it. ing. The multivalent peptide library follows the optimum conditions (spacer length, optimum density) determined in <1> above.
図８に、これらのシートを標識１BH、G62Aでブロットした結果を示す。標識１BH、G62Aは、放射標識NaIと１BH 、G62Aを、酸化剤としてIODO-Gen(ピアス社)をコートしたガラスチューブ上でインキュベーションし、未反応体をゲル濾過で除去して調整した。 FIG. 8 shows the results of blotting these sheets with the labels 1BH and G62A. Labels 1BH and G62A were prepared by incubating radiolabeled NaI, 1BH and G62A on a glass tube coated with IODO-Gen (Pierce) as an oxidizing agent, and removing unreacted substances by gel filtration.
そして、各スポットの濃さを定量し、感光度を数値化し、1BHとG62Aでの放射活性の差を補正した。1BHでブロットしたシートと、G62Aでブロットしたシートにおける対応スポットについて、その比、1BH/G62Aの値を算出した。1BH/G62Aの値が大きければ、1BHサイト２に対する特異性が高いと判断することができる。 Then, the density of each spot was quantified, the sensitivity was quantified, and the difference in radioactivity between 1BH and G62A was corrected. The ratio, the value of 1BH / G62A, was calculated for the corresponding spots in the sheet blotted with 1BH and the sheet blotted with G62A. If the value of 1BH / G62A is large, it can be determined that the specificity for 1BH site 2 is high.
1BHで強くブロットされること、かつ1BH/G62の比が高いこと、の２点を指標に、最終的に６４種のペプチドモチーフを抽出した。図８では、代表的なスポット８種を示している。 The 64 peptide motifs were finally extracted using two points, ie, strong blotting with 1BH and high ratio of 1BH / G62. FIG. 8 shows eight typical spots.
さらに、図９に、抽出した６４種のアミノ酸配列情報を示す。そして、これら６４種について、改めて２価ペプチドとしてのシート合成を行い、濃度の異なった標識１BH、G62Aでブロット後、同様の解析を行い、各ペプチドの１BH、G62Aそれぞれに対する結合活性の濃度依存性を検討した。 Furthermore, FIG. 9 shows the extracted 64 types of amino acid sequence information. These 64 species were re-synthesized as divalent peptides and blotted with different concentrations of labeled 1BH and G62A, followed by the same analysis, and the concentration dependence of the binding activity of each peptide to 1BH and G62A, respectively. It was investigated.
代表例を２例、図１０に示す。その結果、1BHと濃度依存的に強く結合する結合モチーフ、1BH/G62の比が高い結合モチーフを選出基準とし、改めてペプチド１１種を同定した。同定された結合モチーフを配列番号６〜１６として図１１に示す。 Two representative examples are shown in FIG. As a result, 11 types of peptides were identified anew with selection criteria based on binding motifs that strongly bind to 1BH in a concentration-dependent manner and binding motifs with a high ratio of 1BH / G62. The identified binding motif is shown in FIG. 11 as SEQ ID NOs: 6-16.
さらに、これらの結合モチーフを、上記［化３］の４箇所のＸＸＸＸ部にそれぞれ組み
入れ、４価のペプチド化合物１１種を、最終的なＳＴＸ１サイト２特異的阻害薬候補として合成した。
Furthermore, these binding motifs were respectively incorporated into the four XXX parts of the above [Chemical Formula 3], and 11 types of tetravalent peptide compounds were synthesized as final STX1 site 2-specific inhibitor candidates.
合成した１１種の４価ペプチド化合物について、ベロ細胞に対するＳＴＸ１の細胞障害活性の阻害効果を検討した。 The 11 tetravalent peptide compounds synthesized were examined for the inhibitory effect of the cytotoxic activity of STX1 on Vero cells.
結果を図１２に示す。なかでも、IIA-RRRR（配列番号７）、 KGA-RRRR（配列番号８）、KMA-RRRR（配列番号９）、FRA-RRRR（配列番号１１）、 PQA-RRRR（配列番号１２）、 YTA-RRRR（配列番号１３）モチーフを４価で有する化合物は、非常に強い毒性阻害活性を有することが明らかとなった。 The results are shown in FIG. Among them, IIA-RRRR (SEQ ID NO: 7), KGA-RRRR (SEQ ID NO: 8), KMA-RRRR (SEQ ID NO: 9), FRA-RRRR (SEQ ID NO: 11), PQA-RRRR (SEQ ID NO: 12), YTA- It has been clarified that a compound having the RRRR (SEQ ID NO: 13) motif in tetravalent has a very strong toxicity inhibitory activity.
なお、本発明者が別途同定したMMA-RRRR（配列番号１）モチーフ、AAA-RRRR（Ala-Ala-Ala Arg-Arg-Arg-Arg）（配列番号１７）モチーフを有する化合物(MMA-tet、AAA-tet)も比較のために提示している。AAA-tetは、はじめの３個のアミノ酸が全てAlaであることから、今回のシート合成スクリーニングで同定された化合物の基本となる化合物として同時に検討に含めている。今回同定した１１種のうち、半数以上がAAA-tetよりも優れた活性を示すことが明らかとなった。 In addition, a compound (MMA-tet, MMA-RRRR (SEQ ID NO: 1) motif, AAA-RRRR (Ala-Ala-Ala Arg-Arg-Arg-Arg) (SEQ ID NO: 17) motif separately identified by the present inventor AAA-tet) is also presented for comparison. AAA-tet is included in the study at the same time as the basic compound of the compounds identified in this sheet synthesis screening because the first three amino acids are all Ala. Of the 11 species identified this time, it was revealed that more than half showed activity superior to AAA-tet.
上記のとおり、先願（ＷＯ2006/001542公報）のランダム多価ライブラリー法では、ＫＲＲＲＲＲＲ（配列番号２）を同定することができたが、例えば、1BHと濃度依存的に強く結合する上記１１種の結合モチーフは抽出できていない。すなわち、先願（ＷＯ2006/001542公報）の方法では、例えば、アミノ酸の選択比が低いもの（例えば、選択比が1.2以下のアミノ酸）については選択性の判断が難しく、場合によっては抽出から漏れることがあるが、本発明では、上記＜２＞の多価ペプチドライブラリーを利用することで、このような抽出漏れをカバーすることができる。したがって、クラスター効果を有する標的タンパク質に結合するペプチドを、より厳密かつ効率的に特定することができる。 As described above, the random multivalent library method of the prior application (WO2006 / 001542) was able to identify KRRRRRR (SEQ ID NO: 2). For example, the above 11 types that strongly bind to 1BH in a concentration-dependent manner. The binding motif has not been extracted. That is, in the method of the prior application (WO2006 / 001542), for example, it is difficult to judge the selectivity for those having a low amino acid selection ratio (for example, amino acids having a selection ratio of 1.2 or less), and in some cases, they are not extracted. However, in the present invention, such extraction omission can be covered by using the multivalent peptide library of <2> above. Therefore, a peptide that binds to a target protein having a cluster effect can be identified more strictly and efficiently.
Claims (4)
（Ａ）ランダム多価ライブラリー法を用いて、１以上のアミノ酸非特定部位が存在する標的タンパク質結合モチーフを決定するステップ；
（Ｂ）シート上のアミノ基から、直接またはスペーサーを介して、２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造を形成し、このペプチド合成核構造から、標的タンパク質結合モチーフのアミノ酸配列からなる２価または４価ペプチドを伸長させて、ペプチド毎にアミノ酸非特定部位のアミノ酸（Cysを除く）が異なる多価ペプチドライブラリーを作成するステップ；
（Ｃ）多価ペプチドライブラリーの各々の２価ペプチドまたは４価ペプチドに標的タンパク質をブロットするステップ；
（Ｄ）標的タンパク質が結合したペプチドが、目的ペプチドであると決定するステップ；
を含むことを特徴とするペプチドのスクリーニング方法。 A method for screening a peptide having a binding property with a target protein having a cluster effect, comprising the following steps:
(A) determining a target protein binding motif in which one or more amino acid non-specific sites are present using a random multivalent library method;
(B) A synthetic nucleus structure of a bivalent peptide or a synthetic nucleus structure of a tetravalent peptide is formed directly or via a spacer from an amino group on the sheet, and the amino acid sequence of the target protein binding motif is formed from this peptide synthesis nucleus structure Elongating a divalent or tetravalent peptide comprising a multivalent peptide library in which amino acids at non-specific amino acid sites (excluding Cys) differ for each peptide;
(C) blotting the target protein to each bivalent or tetravalent peptide of the multivalent peptide library;
(D) determining that the peptide to which the target protein is bound is the target peptide;
A method for screening a peptide comprising the steps of:
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010019731A JP5718574B2 (en) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Peptide screening method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010019731A JP5718574B2 (en) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Peptide screening method |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015055399A Division JP5897178B2 (en) | 2015-03-18 | 2015-03-18 | Stx1 toxicity-inhibiting tetravalent peptide and disease therapeutic agent containing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011158341A true JP2011158341A (en) | 2011-08-18 |
| JP5718574B2 JP5718574B2 (en) | 2015-05-13 |
Family
ID=44590412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010019731A Expired - Fee Related JP5718574B2 (en) | 2010-01-29 | 2010-01-29 | Peptide screening method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5718574B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014159414A (en) * | 2013-01-28 | 2014-09-04 | Doshisha | Stx2-inhibiting tetravalent peptides and therapeutic agents comprising stx2-inhibiting tetravalent peptides |
| JP2015143246A (en) * | 2015-03-18 | 2015-08-06 | 学校法人同志社 | Stx1 toxicity inhibition tetravalent peptide, and disease therapeutic agent comprising the same |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018038168A1 (en) * | 2016-08-25 | 2018-03-01 | 学校法人同志社 | Hemagglutinin-binding peptide and prophylactic/therapeutic agent for influenza virus infection which contains same |
| EP4159745A1 (en) | 2020-06-02 | 2023-04-05 | Tokyo Women's Medical University | S100a8-inhibiting peptide and therapeutic drug for disease which containing same |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002311029A (en) * | 2001-04-18 | 2002-10-23 | Japan Science & Technology Corp | Bacterial endotoxin absorbent, and screening method for the same |
| JP2003161732A (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-06 | Itoham Foods Inc | Method for quantitatively determining the amount of nerve peptide |
| WO2006001542A1 (en) * | 2004-06-28 | 2006-01-05 | Japan Science And Technology Agency | Method of screening toxin-neutralizing peptide, stx2 inhibitory peptide and vero toxin-neutralizing agent |
-
2010
- 2010-01-29 JP JP2010019731A patent/JP5718574B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002311029A (en) * | 2001-04-18 | 2002-10-23 | Japan Science & Technology Corp | Bacterial endotoxin absorbent, and screening method for the same |
| JP2003161732A (en) * | 2001-11-28 | 2003-06-06 | Itoham Foods Inc | Method for quantitatively determining the amount of nerve peptide |
| WO2006001542A1 (en) * | 2004-06-28 | 2006-01-05 | Japan Science And Technology Agency | Method of screening toxin-neutralizing peptide, stx2 inhibitory peptide and vero toxin-neutralizing agent |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6013049758; 西川喜代孝: 'Ｏ１５７感染症に対する次世代治療薬の開発' 小児感染免疫 Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１, 2007, Ｐ．７５-８３ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014159414A (en) * | 2013-01-28 | 2014-09-04 | Doshisha | Stx2-inhibiting tetravalent peptides and therapeutic agents comprising stx2-inhibiting tetravalent peptides |
| JP2015143246A (en) * | 2015-03-18 | 2015-08-06 | 学校法人同志社 | Stx1 toxicity inhibition tetravalent peptide, and disease therapeutic agent comprising the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5718574B2 (en) | 2015-05-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2373110T3 (en) | SELECTION OF PROTEINS USING ARN-PROTEIN FUSIONS. | |
| EP2310855B1 (en) | Multi-ligand capture agents and related compositions, methods and systems | |
| Thakkar et al. | High-throughput sequencing of peptoids and peptide− peptoid hybrids by partial Edman degradation and mass spectrometry | |
| JP5718574B2 (en) | Peptide screening method | |
| Kaupbayeva et al. | Molecular sieving on the surface of a nano-armored protein | |
| WO2012150314A1 (en) | Method for generating proteins | |
| WO2002046395A1 (en) | C-terminal modified protein and process for producing the same, modifying agent and translation template to be used in produfing c-terminal modified protein, and method of detecting protein interaction with the use of c-termial modified protein | |
| Caporale et al. | The LQSP tetrapeptide is a new highly efficient substrate of microbial transglutaminase for the site‐specific derivatization of peptides and proteins | |
| Schirwitz et al. | Sensing immune responses with customized peptide microarrays | |
| CN111393519A (en) | As KRASG12CNovel stapled peptides of/SOS 1 inhibitor and uses thereof | |
| AU2016251857B2 (en) | Method and composition for peptide cyclization and protease treatment | |
| US20170152543A1 (en) | System and method for identification of protease substrates | |
| Moyer et al. | Leveraging orthogonal mass spectrometry based strategies for comprehensive sequencing and characterization of ribosomal antimicrobial peptide natural products | |
| JP5897178B2 (en) | Stx1 toxicity-inhibiting tetravalent peptide and disease therapeutic agent containing the same | |
| US20050003360A1 (en) | Array systems and methods | |
| Wang et al. | Activity-based proteomic profiling: The application of photoaffinity probes in the target identification of bioactive molecules | |
| Hoang et al. | An oxime-based glycocluster microarray | |
| Kye et al. | Synthesis and purification of self‐assembling peptide‐oligonucleotide conjugates by solid‐phase peptide fragment condensation | |
| Kunys et al. | Specificity Profiling of Protein‐Binding Domains Using One‐Bead‐One‐Compound Peptide Libraries | |
| KR102243870B1 (en) | Cyclic peptides, affinity chromatography carriers, labeled antibodies, antibody drug complexes, and pharmaceutical preparations | |
| Hüttl et al. | Development of Peptidyl Lysine Dendrons: 1, 3‐Dipolar Cycloaddition for Peptide Coupling and Antibody Recognition | |
| JP2021054848A (en) | Specific peptide binders to proteins identified via systemic search, maturation and extension process | |
| JP2008094822A (en) | Cellulose-binding peptide and method for producing the same | |
| JP5297734B2 (en) | Peptide having binding ability to cedar pollen allergen | |
| WO2018130170A1 (en) | High-affinity peptide for tumor necrosis factor alpha and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121217 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20130927 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131008 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140722 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140916 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150217 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150319 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5718574 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |