JP2011149859A - Esophagus cancer marker - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＳＬＣ３８Ａ４（別名、ＳＮＡＴ４）タンパク質の発現を指標に食道癌を検査する方法、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を含んだ食道癌の検出用組成物、その製造方法、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を含んだ食道癌の検出用キット、および、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を利用した食道癌の治療薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a method for examining esophageal cancer using SLC38A4 (also known as SNAT4) protein expression as an index, a composition for detecting esophageal cancer containing an anti-SLC38A4 protein antibody, a method for producing the same, and an esophagus containing an anti-SLC38A4 protein antibody. The present invention relates to a cancer detection kit and a screening method for a therapeutic agent for esophageal cancer using SLC38A4 protein.
食道癌は、食道に発生する上皮性由来の腫瘍である。組織学的には、主に、食道粘膜上皮が癌化する扁平上皮癌と食道腺が癌化する腺癌に分類される。日本では全体の９０％以上を扁平上皮癌が占め、残りの５％が腺癌である。このことから日本人における食道癌のほとんどは扁平上皮癌である。６０歳代の男性に好発し、男女比は３〜５：１である。食道の形態学的特徴として外膜（漿膜）を有しないことから、増殖した癌細胞は周囲に浸潤し易く、リンパ節にも容易に転移するために進行が早い。また自覚症状に乏しいため、早期の発見が遅れやすい。食道癌の予後は胃癌、大腸癌を含む消化器系癌の中では極めて悪く、食道癌全体の５年生存率は１４％程度である。発癌因子は不明であるが、禁煙により、食道扁平上皮癌の罹患率が下がることから、喫煙と食道扁平上皮癌との関連が示唆されている。 Esophageal cancer is a tumor of epithelial origin that occurs in the esophagus. Histologically, it is mainly classified into squamous cell carcinoma in which the esophageal mucosal epithelium becomes cancerous and adenocarcinoma in which the esophageal gland becomes cancerous. In Japan, squamous cell carcinoma accounts for over 90% of the total, and the remaining 5% is adenocarcinoma. Therefore, most esophageal cancer in Japanese is squamous cell carcinoma. It is common among men in their 60s, and the gender ratio is 3-5: 1. Since it does not have an outer membrane (serosa) as a morphological feature of the esophagus, the proliferated cancer cells tend to invade the surroundings and metastasize easily to the lymph nodes, and thus progress rapidly. Moreover, since there are few subjective symptoms, early detection tends to be delayed. The prognosis of esophageal cancer is extremely poor among gastrointestinal cancers including gastric cancer and colorectal cancer, and the overall 5-year survival rate of esophageal cancer is about 14%. Although carcinogenic factors are unknown, smoking cessation reduces the incidence of squamous cell carcinoma of the esophagus, suggesting an association between smoking and squamous cell carcinoma of the esophagus.
食道癌の診断には、身体所見、画像診断、そして腫瘍マーカーが利用されている。身体所見については早期癌ではほとんど存在しない。進行癌では、ときに右もしくは左の鎖骨上部リンパ節腫大を認める。食道癌と診断された人では、その時点で７４％に食道違和感を含む嚥下困難があり、１４％に嚥下痛がある。 Diagnosis of esophageal cancer uses physical findings, diagnostic imaging, and tumor markers. There are few physical findings in early cancer. In advanced cancer, sometimes right or left upper clavicular lymphadenopathy is observed. Among those diagnosed with esophageal cancer, 74% have difficulty swallowing, including esophageal discomfort, and 14% have swallowing pain.
画像診断においては、硫酸バリウムのエックス線撮影によって食道の狭窄や変形を簡便に調査することができる。しかし、この方法では早期癌の検出は難しい。早期癌の発見に最も有用なのは内視鏡検査である。ただし、通常の内視鏡観察では、粘膜面に留まる表在癌の発見が困難なこともしばしばである。そのため、ルゴール液を用いた染色が行われている（色素内視鏡検査）。ルゴール液は、正常な粘膜扁平上皮に豊富に含まれるグリコーゲンを染色する。粘膜の癌化や異型上皮化によってグリコーゲン量が著しく減少すると、病変部位はルゴール液で染色されずに白い不染帯となる。ただし、ルゴール液不染色帯は、癌に特異的ではなく、食道炎や萎縮部位においても陽性となってしまう。トルイジンブルー染色も使用されるが、この場合、正常粘膜が不染帯となり、癌病変が青染される。この染色では、癌病変が表面に露出していることが不可欠であり、皮内癌では陽性とならない。いずれの場合にも、内視鏡検査とあわせて行う生検による病理学的診断が、食道癌の確定診断となる。食道癌が確定されると、その深達度（進行期）を判断するために、超音波内視鏡検査やＣＴ（コンピュータトモグラフィー）が施行される。これによって食道癌の周囲組織への浸潤やリンパ節、遠隔臓器への転移の有無が検出され、食道癌の進行期が診断される。ＰＥＴ検査はＣＴによる判断が困難な転移巣の評価に有用とされる。 In diagnostic imaging, esophageal stricture and deformation can be easily investigated by X-ray photography of barium sulfate. However, early detection of cancer is difficult with this method. Endoscopy is most useful for detecting early cancer. However, it is often difficult to find superficial cancers that remain on the mucosal surface by normal endoscopic observation. For this reason, staining with Lugol's solution is performed (chromoendoscopy). Lugol's solution stains glycogen abundant in normal mucosal squamous epithelium. When the amount of glycogen is significantly reduced due to mucosal canceration or atypical epithelialization, the lesion site is not stained with Lugol's solution and becomes a white unstained zone. However, the Lugol's solution unstained zone is not specific to cancer and becomes positive also at the site of esophagitis and atrophy. Toluidine blue staining is also used, but in this case the normal mucosa becomes unstained and the cancerous lesion is stained blue. In this staining, it is essential that the cancerous lesion is exposed on the surface, and it is not positive in intradermal cancer. In any case, pathological diagnosis by biopsy performed in conjunction with endoscopy is a definitive diagnosis of esophageal cancer. When esophageal cancer is confirmed, ultrasonic endoscopy and CT (computer tomography) are performed in order to determine the depth (advanced stage). This detects the invasion of surrounding tissues of esophageal cancer, the presence or absence of metastasis to lymph nodes and distant organs, and diagnoses the advanced stage of esophageal cancer. The PET examination is useful for the evaluation of metastases that are difficult to judge by CT.
腫瘍マーカーを利用した診断に関しては、上記したように日本における食道癌の９０％以上が扁平上皮癌であることから、子宮頚管部や食道の扁平上皮癌の指標であるＳＣＣ（扁平上皮癌関連抗原）が比較的よく利用されている。ＳＣＣ単独での術前の診断率は３０％前後であるとされている。ＳＣＣ以外の腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１などが用いられている。しかし、これらマーカーを使用した場合、癌の進行度が進むと陽性率は高いが、早期癌の場合は診断率が低下する。自己抗体関連では、ｐ５３抗体が比較的早期の症例での陽性率が高いのが特徴であるが、それでも陽性率は２０−３０％程度である。 Regarding diagnosis using tumor markers, as described above, 90% or more of esophageal cancers in Japan are squamous cell carcinomas. Therefore, SCC (squamous cell carcinoma-related) is an index of squamous cell carcinoma of the cervix and esophagus. Antigens) are relatively popular. The preoperative diagnosis rate with SCC alone is said to be around 30%. CEA, CYFRA 21-1, etc. are used as tumor markers other than SCC. However, when these markers are used, the positive rate increases as the cancer progresses, but the diagnostic rate decreases in the case of early cancer. In relation to autoantibodies, the p53 antibody is characterized by a high positive rate in relatively early cases, but the positive rate is still around 20-30%.
一方、トランスポーターの異常な発現亢進が、癌化の指標の一つになりうることが指摘されている（特許文献１〜３、非特許文献１）。癌化した細胞の特徴として著しい増殖や転移が挙げられるが、これらの達成には多量の栄養源を必要とするため、癌細胞はグルコースやアミノ酸のトランスポーターの発現量を増加させることがある。例えば、Ｌ型アミノ酸トランスポーターのＬＡＴ１はヒトの種々の癌組織（前立腺癌、大腸癌、膀胱癌、バレット食道腺癌、口腔扁平上皮癌、肝臓癌）において高発現することが明らかとなっている（非特許文献２）。しかしながら、ＬＡＴ１を含め、これまで報告されているトランスポーターはいずれも正常細胞にも少なからず発現しており、癌特異的なトランスポーターとはいいがたい（非特許文献３、４）。 On the other hand, it has been pointed out that abnormal increase in transporter expression can be one of indicators of canceration (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Document 1). Cancerous cells are characterized by significant proliferation and metastasis, but since achieving these requires a large amount of nutrients, cancer cells may increase the expression level of glucose and amino acid transporters. For example, L-type amino acid transporter LAT1 has been shown to be highly expressed in various human cancer tissues (prostate cancer, colon cancer, bladder cancer, Barrett's esophageal adenocarcinoma, oral squamous cell carcinoma, liver cancer). (Non-patent document 2). However, all of the transporters reported so far, including LAT1, are expressed in a considerable amount in normal cells, and are not considered to be cancer-specific transporters (Non-patent Documents 3 and 4).
このように、これまで、食道癌に特異性の高いマーカーや早期の食道癌に高い陽性率を示すマーカーが見出されていない。食道癌は自覚症状に乏しいだけでなく、発症後は転移し易く、予後が悪いことを特徴とする。このため、食道癌に特異性が高く、かつ、食道癌の早期発見を可能とする腫瘍マーカーの同定が望まれている。 Thus, until now, a marker having high specificity for esophageal cancer and a marker showing a high positive rate for early esophageal cancer have not been found. Esophageal cancer is characterized by not only poor subjective symptoms but also metastasis after onset and poor prognosis. For this reason, identification of a tumor marker that is highly specific for esophageal cancer and enables early detection of esophageal cancer is desired.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、食道癌に特異性が高く、かつ、食道癌の早期発見を可能とする腫瘍マーカーを提供することにある。さらなる本発明の目的は、当該腫瘍マーカーを標的とした食道癌（特に好ましくは早期の食道癌）の検査方法、当該腫瘍マーカーを検出するための分子を含む食道癌検出用組成物、当該組成物の製造方法、当該組成物を含む食道癌の検出用キット、および、当該腫瘍マーカーを利用した食道癌の治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a tumor marker that is highly specific to esophageal cancer and enables early detection of esophageal cancer. Further objects of the present invention are a method for examining esophageal cancer (particularly preferably early esophageal cancer) targeting the tumor marker, a composition for detecting esophageal cancer comprising a molecule for detecting the tumor marker, and the composition And a screening method for a therapeutic agent for esophageal cancer using the tumor marker.
ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質（別名、ＳＮＡＴ４）は、ナトリウムイオン共役型のアミノ酸トランスポータータンパクに属し（非特許文献４）、その遺伝子は、まず２０００年にラットの筋肉から、ヒトでは２００１年に肝臓由来の培養細胞からクローニングされた（非特許文献５〜７）。ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質は、構造上はグルタミントランスポーターファミリーに分類されるが、実際にはグルタミンに対する親和性は低く、その輸送能は他のグルタミントランスポーターに比べて遥かに低い。その一方でＬアラニンやアスパラギンを好んで輸送する（非特許文献４）。 SLC38A4 protein (also known as SNAT4) belongs to the sodium ion-coupled amino acid transporter protein (Non-patent Document 4), and its gene is first derived from rat muscle in 2000, and from human liver in 2001. (Non-Patent Documents 5 to 7). The SLC38A4 protein is structurally classified into the glutamine transporter family, but actually has a low affinity for glutamine, and its transport ability is much lower than other glutamine transporters. On the other hand, L alanine and asparagine are favored and transported (nonpatent literature 4).
ＳＬＣ３８Ａ４の成体内の局在に関しては、ｍＲＮＡレベルにおいてはノーザンブロッティング法によってラットの筋肉と肝臓で検出され、ヒト組織では肝臓が最も高い（非特許文献６〜８）。ＲＴ―ＰＣＲ法では肝臓以外に骨格筋、脳、肺、心臓、小腸、腎臓、膵臓、胎盤、子宮から遺伝子が増幅されている（非特許文献９と１０）。ＳＬＣ３８Ａ４のタンパク質レベルの局在情報に関しては、ウエスタンブロッティング法によって肝臓と胎盤、免疫組織染色では胎盤にて検出されている（非特許文献９と１１）。癌との関連については、肝細胞癌の細胞株ＪＨＨ４でｍＲＮＡの発現が確認されているが、正常肝臓組織と同じレベルで、発現亢進は実験的に確認されていない（非特許文献２）。また、マウスにおいては、高転移性の株化肝細胞癌Ｈｃａ−Ｆと低転移性肝細胞癌Ｈｃａ−Ｐに対する、遺伝子チップを用いた遺伝子発現解析の結果、ｓｌｃ３８ａ４遺伝子がＨｃａ−Ｆにて比較的高く発現していることが報告されているが、肝臓癌の転移との因果関係については不明である（非特許文献１２）。このように、ＳＬＣ３８Ａ４の発現と食道あるいは食道癌との関係については、これまで知られていなかった。 Regarding the localization of SLC38A4 in adults, the mRNA level is detected in rat muscle and liver by Northern blotting, and the liver is the highest in human tissues (Non-Patent Documents 6 to 8). In the RT-PCR method, genes are amplified from skeletal muscle, brain, lung, heart, small intestine, kidney, pancreas, placenta, and uterus in addition to the liver (Non-patent Documents 9 and 10). The protein level localization information of SLC38A4 is detected in the liver and placenta by Western blotting, and in the placenta by immunohistochemical staining (Non-patent Documents 9 and 11). Regarding the relationship with cancer, expression of mRNA has been confirmed in the cell line JHH4 of hepatocellular carcinoma, but expression enhancement has not been experimentally confirmed at the same level as normal liver tissue (Non-patent Document 2). In addition, in mice, as a result of gene expression analysis using a gene chip for highly metastatic HCC-F and low metastatic HCC-P, the slc38a4 gene was compared with Hca-F. However, the causal relationship with liver cancer metastasis is unclear (Non-patent Document 12). Thus, the relationship between the expression of SLC38A4 and esophagus or esophageal cancer has not been known so far.
本発明者らは、上記の背景に鑑み、癌特異的マーカーを探索する目的において、様々なマーカー候補についてヒト癌病理切片ならびに正常組織切片に対する免疫組織染色を行った結果、自ら開発した８０種類のトランスポーター対する抗原特異的抗体のうち、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に対する抗体が、食道癌組織（特に、早期の食道癌組織）に、特異的かつ強く反応することを見出した。そして、本発明者らは、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質が、食道癌に高発現し、正常組織においては、ほとんど検出されないという知見に基づき、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を指標に食道癌を検査することが可能であり、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を用いた免疫学的手法が食道癌の検査に有用であることを見出した。さらに、本発明者らは、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を利用して、食道癌の治療薬のスクリーニングを行うことが可能であることを見出した。 In view of the above background, the present inventors conducted an immunohistochemical staining on human cancer pathological sections and normal tissue sections for various marker candidates for the purpose of searching for cancer-specific markers. Of the antigen-specific antibodies to the transporter, it was found that antibodies against the SLC38A4 protein react specifically and strongly with esophageal cancer tissues (especially early esophageal cancer tissues). Then, the present inventors can examine esophageal cancer using the expression of SLC38A4 protein as an index based on the knowledge that SLC38A4 protein is highly expressed in esophageal cancer and hardly detected in normal tissues. It was found that an immunological technique using an anti-SLC38A4 protein antibody is useful for examination of esophageal cancer. Furthermore, the present inventors have found that screening for therapeutic agents for esophageal cancer can be performed using SLC38A4 protein.
すなわち、本発明は、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を指標に、食道癌（特に好ましくは早期の食道癌）を検査する方法、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を含んだ食道癌の検出用組成物、その製造方法、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を含んだ食道癌の検出用キット、および、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を利用した食道癌の治療薬のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
（１） 被検体から分離された細胞または組織における、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出する工程を含む、食道癌の検査方法、
（２） ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を抗体を用いて検出する、（１）に記載の方法、
（３） 抗体が、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質中の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体である、（２）に記載の方法、
（４） 食道癌が早期の食道癌である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（５） 抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を含む、食道癌検出用組成物、
（６） 抗体が、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質中の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる領域を認識する抗体である、（５）に記載の組成物、
（７） 食道癌が早期の食道癌である、（５）または（６）に記載の組成物、
（８） （ａ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその免疫原性のある一部を免疫する工程、および
（ｂ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合する抗体を分離・精製する工程、を含む、（５）に記載の組成物の製造方法、
（９） （ａ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質中の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫する工程、および（ｂ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質中の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる領域に結合する抗体を分離・精製する工程、を含む、（６）に記載の組成物の製造方法、
（１０） 組成物が、早期の食道癌の検出用である、（９）または（１０）に記載の製造方法、
（１１） （５）から（７）に記載の組成物を含む、食道癌の検出用キット、
（１２） （ａ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部を提供する工程、（ｂ）候補化合物をＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部に接触させる工程、および（ｃ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部に結合する化合物を選択する工程、を含む、食道癌の治療薬のスクリーニング方法、
（１３） （ａ）食道癌モデル動物(ヒトを除く)に、候補化合物または対照を投与する工程、（ｂ）当該モデル動物の食道部の組織を採取する工程、および（ｃ）採取された組織中の、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出し、対照と比較して、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を低下させる化合物を選択する工程、を含む、食道癌の治療薬のスクリーニング方法、および
（１４） 治療薬が、早期の食道癌の治療薬である、（１２）または（１３）に記載のスクリーニング方法、を提供するものである。
That is, the present invention relates to a method for examining esophageal cancer (particularly preferably early esophageal cancer) using the expression of SLC38A4 protein as an index, a composition for detecting esophageal cancer containing an anti-SLC38A4 protein antibody, a method for producing the same, More specifically, the present invention relates to a kit for detecting esophageal cancer containing an SLC38A4 protein antibody and a screening method for a therapeutic agent for esophageal cancer using the SLC38A4 protein.
(1) A method for examining esophageal cancer, comprising a step of detecting the expression of SLC38A4 protein in a cell or tissue separated from a subject,
(2) The method according to (1), wherein the expression of SLC38A4 protein is detected using an antibody,
(3) The method according to (2), wherein the antibody recognizes a region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the SLC38A4 protein,
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the esophageal cancer is early esophageal cancer,
(5) an esophageal cancer detection composition comprising an anti-SLC38A4 protein antibody,
(6) The composition according to (5), wherein the antibody recognizes a region consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the SLC38A4 protein,
(7) The composition according to (5) or (6), wherein the esophageal cancer is early esophageal cancer,
(8) The composition according to (5), comprising: (a) immunizing SLC38A4 protein or an immunogenic part thereof; and (b) separating and purifying an antibody that binds to SLC38A4 protein. Manufacturing method,
(9) (a) immunizing a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in SLC38A4 protein, and (b) binding to a region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in SLC38A4 protein A method for producing the composition according to (6), comprising a step of separating and purifying the antibody,
(10) The production method according to (9) or (10), wherein the composition is for detection of early esophageal cancer,
(11) A kit for detecting esophageal cancer comprising the composition according to (5) to (7),
(12) (a) providing SLC38A4 protein or a part thereof, (b) contacting a candidate compound with SLC38A4 protein or a part thereof, and (c) selecting a compound that binds to SLC38A4 protein or a part thereof A method for screening a therapeutic agent for esophageal cancer, comprising the step of:
(13) (a) administering a candidate compound or a control to an esophageal cancer model animal (excluding humans), (b) collecting a tissue of the esophagus part of the model animal, and (c) the collected tissue Detecting the expression of SLC38A4 protein and selecting a compound that reduces the expression of SLC38A4 protein compared to control, and (14) a therapeutic agent comprising: The screening method according to (12) or (13), which is a therapeutic agent for early esophageal cancer.
本発明において、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現が、食道癌に特異的に検出され、特に、早期の高分化段階にある食道癌において高い陽性率で検出されることが判明した。従って、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を指標とした本発明の食道癌の検査方法によれば、高い精度で早期に食道癌を検出することが可能である。これにより、食道癌の進行の早い段階で食道癌の治療を行うことが可能となり、患者の治療や患者の予後の改善に大きく貢献することができる。また、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を利用した本発明の食道癌の治療薬のスクリーニング方法によれば、効率的に治療薬候補化合物を同定することが可能である。抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を含む、本発明の食道癌の検出用組成物や食道癌の検出キットは、上記本発明における食道癌の検査や食道癌の治療薬のスクリーニングに極めて有用である。 In the present invention, it has been found that the expression of SLC38A4 protein is specifically detected in esophageal cancer, and in particular, is detected at a high positive rate in esophageal cancer in an early highly differentiated stage. Therefore, according to the esophageal cancer test method of the present invention using the expression of SLC38A4 protein as an index, it is possible to detect esophageal cancer early with high accuracy. This makes it possible to treat esophageal cancer at an early stage of progression of esophageal cancer, and can greatly contribute to the treatment of patients and the improvement of the prognosis of patients. Moreover, according to the screening method for therapeutic agents for esophageal cancer of the present invention using SLC38A4 protein, it is possible to efficiently identify therapeutic agent candidate compounds. The composition for detecting esophageal cancer or the kit for detecting esophageal cancer of the present invention comprising an anti-SLC38A4 protein antibody is extremely useful for the examination of esophageal cancer or the screening of therapeutic agents for esophageal cancer in the present invention.
＜食道癌の検査方法＞
本発明は被検体から分離された細胞または組織における、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出する工程を含む、食道癌の検査方法を提供する。
<Examination methods for esophageal cancer>
The present invention provides a method for examining esophageal cancer, comprising the step of detecting the expression of SLC38A4 protein in cells or tissues isolated from a subject.
本発明において「細胞または組織」とは、本発明の検査方法において、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出する際の試料（対象）となる細胞または組織である。生体より分離された状態の細胞または組織に対して本発明が適用される。「被検体から分離された」とは、生体から細胞または組織を摘出することによって、当該細胞または組織が、その由来の生体と完全に隔離されている状態をいう。細胞または組織を摘出する「被検体」としては、癌患者に限らず、健常者（癌のおそれがある者を含む）を対象とすることもできる。バイオプシー（生検）において採取した、被検体の臓器や組織の一部を本発明の検査方法に供することができる。 In the present invention, the “cell or tissue” refers to a cell or tissue that serves as a sample (target) when detecting the expression of SLC38A4 protein in the test method of the present invention. The present invention is applied to cells or tissues separated from a living body. “Separated from the subject” refers to a state in which the cells or tissues are completely isolated from the living body from which the cells or tissues are extracted by removing the cells or tissues from the living body. The “subject” from which cells or tissues are removed is not limited to cancer patients, but can also be healthy subjects (including those who may have cancer). A part of an organ or tissue of a subject collected in a biopsy (biopsy) can be used for the examination method of the present invention.
病理組織は、通常、生体で存在していた状態、すなわち、周囲の細胞と結合した状態で（組織片として）調製され、本発明の方法において使用されるが、病理組織を周囲の細胞から分離した後に本発明の方法に使用してもよい。 The pathological tissue is usually prepared in a state existing in the living body, that is, in a state of being bound to surrounding cells (as a tissue piece) and used in the method of the present invention, but the pathological tissue is separated from the surrounding cells. Then, it may be used in the method of the present invention.
ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現の検出結果を食道癌の診断に利用する目的の場合、病理組織としては、他の診断法によって癌であると判断される組織、癌である蓋然性が高いと判断される組織、または癌である可能性を有する組織が好適に使用される。使用される組織は、好ましくは、他の診断法によって癌であると判断される組織、または癌である蓋然性が高いと判断される組織である。ここで、他の診断法としては、例えば、Ｘ線造影検査、内視鏡検査、超音波検査、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査、ＰＥＴ検査、腫瘍マーカーを用いた診断法などが挙げられる。通常は、これらの一つ以上によって癌が疑われる組織が用いられる。 In the case of using the detection result of the expression of SLC38A4 protein for diagnosis of esophageal cancer, as a pathological tissue, a tissue judged to be cancer by other diagnostic methods, a tissue judged to have a high probability of being cancer, Or the tissue which has a possibility of being cancer is used suitably. The tissue used is preferably a tissue that is determined to be cancerous by other diagnostic methods, or a tissue that is highly likely to be cancerous. Here, examples of other diagnostic methods include X-ray contrast examination, endoscopy, ultrasonic examination, CT examination, MRI examination, PET examination, and a diagnostic method using a tumor marker. Usually, a tissue suspected of having cancer due to one or more of these is used.
本発明において、発現を検出する「ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質」は、典型的には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。しかしながら、タンパク質のアミノ酸配列は、そのコードする遺伝子の変異などにより、自然界において（すなわち、非人工的に）変異しうる。従って、本発明においては、このようなＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の天然の変異体も、検出対象となりうる。 In the present invention, the “SLC38A4 protein” for detecting expression is typically a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. However, the amino acid sequence of a protein can be mutated in nature (ie, non-artificially) due to mutations in the gene that it encodes. Therefore, in the present invention, such a natural mutant of the SLC38A4 protein can also be a detection target.
本発明において「ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出する」とは、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現の有無の検出、および発現の程度の検出の双方を含む意である。ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現量は、絶対量としてまたは相対量として把握することができる。相対量を把握する場合には、例えば、用意した標準試料のＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現量と比較して判断することができる。「標準試料」は、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を発現しているか否かが事前に特定されている試料である。例えば、既に食道癌の存在している部位が特定されている病理組織を、本発明の標準試料とすることができる。また、癌に罹患していない組織（正常組織）も、本発明の標準試料とすることができる。 In the present invention, “detecting the expression of SLC38A4 protein” means both detection of the presence / absence of expression of SLC38A4 protein and detection of the degree of expression. The expression level of SLC38A4 protein can be grasped as an absolute amount or a relative amount. In the case of grasping the relative amount, for example, it can be determined by comparing with the expression level of the SLC38A4 protein of the prepared standard sample. The “standard sample” is a sample in which whether or not the SLC38A4 protein is expressed is specified in advance. For example, a pathological tissue in which a site where esophageal cancer already exists can be used as the standard sample of the present invention. Moreover, the tissue (normal tissue) which does not suffer from cancer can also be used as the standard sample of the present invention.
本発明におけるＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現の検出は、免疫学的手法によることが好ましい。免疫学的手法としては、例えば、免疫組織化学的染色法、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、ＦＣＭ、免疫沈降法、イムノブロッティング等が挙げられる。免疫学的手法では、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体が使用され、当該抗体をＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に接触させ、当該抗体のＳＬＣ３８Ａ４タンパク質への結合性（結合量）を指標として、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質が検出される。ここで「接触」とは、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体がＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を認識できうる生理条件下に、当該抗体とＳＬＣ３８Ａ４タンパク質をおくことを意味する。例えば、当該抗体を用いて、細胞表面上のＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の染色を行う場合には、抗体を含有した溶液に、被検体から分離した細胞または組織を浸す、あるいは、当該細胞または組織に、抗体を含有した溶液を十分に滴下もしくは噴霧し、当該抗体が細胞または組織に存在するＳＬＣ３８Ａ４を認識できうる生理条件下におくことを意味する。免疫学的検出法によれば、迅速で感度のよい検出が可能となり、操作も簡便である。本発明の検査方法は、患者身体への負担が少ない点でも有利である。 Detection of the expression of SLC38A4 protein in the present invention is preferably performed by an immunological technique. Examples of the immunological technique include immunohistochemical staining method, ELISA method, radioimmunoassay, FCM, immunoprecipitation method, immunoblotting and the like. In the immunological technique, an anti-SLC38A4 protein antibody is used, the antibody is brought into contact with the SLC38A4 protein, and the SLC38A4 protein is detected using the binding property (binding amount) of the antibody to the SLC38A4 protein as an index. Here, “contacting” means placing the antibody and the SLC38A4 protein under physiological conditions where the anti-SLC38A4 protein antibody can recognize the SLC38A4 protein. For example, when staining the SLC38A4 protein on the cell surface using the antibody, the cell or tissue separated from the subject is immersed in a solution containing the antibody, or the antibody is applied to the cell or tissue. It means that the contained solution is sufficiently dripped or sprayed and the physiological condition is set such that the antibody can recognize SLC38A4 present in cells or tissues. According to the immunological detection method, rapid and sensitive detection is possible, and the operation is simple. The inspection method of the present invention is also advantageous in that the burden on the patient's body is small.
本発明の検査方法に用いる、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体としては、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に対する特異的な結合性を有する限り、その種類や由来に、特に制限はない。ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質（配列番号：１）の２９位〜４７位のアミノ酸配列「ＧＩＧＮＳＥＫＡＡＭＳＳＱＦＡＮＥＤＴ」（配列番号：２）を認識する抗体であることが好ましい。 The anti-SLC38A4 protein antibody used in the test method of the present invention is not particularly limited in its type and origin as long as it has a specific binding property to the SLC38A4 protein. An antibody that recognizes the amino acid sequence “GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (SEQ ID NO: 2) at positions 29 to 47 of the SLC38A4 protein (SEQ ID NO: 1) is preferable.
抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体として、標識物質を結合させた抗体を使用すれば、当該標識を検出することにより、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合した抗体量を直接測定することが可能であり、簡易である。その反面、この方法では、標識物質を結合させた抗体を用意する煩雑さがあり、また、検出感度が一般に低くなるという問題もある。そこで、本発明においては、標識物質を結合させた二次抗体を利用する方法や二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用する方法などの間接的検出方法を利用することが好ましい。ここで「二次抗体」とは、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体に特異的な結合性を示す抗体である。例えば、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体をウサギ抗体として調製した場合には、二次抗体として抗ウサギＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択し、本発明において使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。 When an antibody to which a labeling substance is bound is used as the anti-SLC38A4 protein antibody, the amount of the antibody bound to the SLC38A4 protein can be directly measured by detecting the label, which is simple. On the other hand, this method has a problem of preparing an antibody to which a labeling substance is bound, and has a problem that detection sensitivity is generally lowered. Therefore, in the present invention, it is preferable to use an indirect detection method such as a method using a secondary antibody to which a labeling substance is bound or a method using a polymer to which a secondary antibody and a labeling substance are bound. Here, the “secondary antibody” is an antibody exhibiting specific binding to the anti-SLC38A4 protein antibody. For example, when an anti-SLC38A4 protein antibody is prepared as a rabbit antibody, an anti-rabbit IgG antibody can be used as the secondary antibody. Labeled secondary antibodies that can be used are commercially available for antibodies derived from various biological species such as rabbits, goats, and mice, and appropriate secondary antibodies are available depending on the biological species from which the anti-SLC38A4 protein antibody is derived. Can be selected and used in the present invention. Instead of the secondary antibody, protein G or protein A to which a labeling substance is bound can be used.
標識物質としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、および放射性物質などが挙げられる。本発明において、ビオチンを標識物質として用い、これにアビジンペルオキシダーゼを反応させることによれば、高感度で、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合した抗体を検出することが可能である。 Examples of the labeling substance include peroxidase, β-D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substance. In the present invention, by using biotin as a labeling substance and reacting this with avidin peroxidase, it is possible to detect an antibody bound to the SLC38A4 protein with high sensitivity.
生体組織の免疫組織化学的染色は、一般に、以下の手順（１）〜（１０）で実施される。なお、生体組織の免疫組織化学的染色法については様々な文献および成書を参照することができる（例えば、「酵素抗体法、改訂第３版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画）。
（１）固定・パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド、無水エチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ（例えば、３〜５μm厚）に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。なお、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。
（２）脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、および精製水で順に処理する。
（３）前処理（抗原賦活）
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理および／または加圧処理等を行う。
（４）内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
（５）非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液（例えば、１％溶液）で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。なお、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
（６）抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
（７）標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。上記抗体反応において、ペルオキシダーゼを結合させた抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を用いることもできるが、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を標識しない場合には、ペルオキシダーゼを結合させた２次抗体、ペルオキシダーゼを結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることもできる。例えば、２次抗体を用いる場合には、ペルオキシダーゼを結合させた２次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後、数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
（８）発色反応
トリス緩衝液にＤＡＢ（3,3'-diaminobenzidine）を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間（例えば、５分間）切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、ＤＡＢを除去する。
（９）核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする（通常、数分間）。
（１０）脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
In general, immunohistochemical staining of a living tissue is performed by the following procedures (1) to (10). Various documents and books can be referred to for immunohistochemical staining of living tissues (for example, “Enzyme Antibody Method, Revised 3rd Edition”, edited by Keiichi Watanabe, Kazuho Nakane, interdisciplinary planning).
(1) Fixation / embedding in paraffin Fix tissue surgically collected from a living body with formalin, paraformaldehyde, anhydrous ethyl alcohol, or the like. Then embedded in paraffin. Generally dehydrated with alcohol, treated with xylene, and finally embedded in paraffin. A specimen embedded in paraffin is sliced into a desired thickness (for example, 3 to 5 μm thick) and spread on a glass slide. In place of the paraffin-embedded specimen, an alcohol-fixed specimen, a dry-sealed specimen, a frozen specimen, or the like may be used.
(2) Deparaffinization Generally, treatment is performed sequentially with xylene, alcohol, and purified water.
(3) Pretreatment (antigen activation)
If necessary, enzyme treatment, heat treatment and / or pressure treatment are performed for antigen activation.
(4) Removal of endogenous peroxidase When peroxidase is used as a labeling substance at the time of staining, it is treated with hydrogen peroxide to remove endogenous peroxidase activity.
(5) Nonspecific reaction inhibition The section is treated with a bovine serum albumin solution (for example, 1% solution) for several minutes to several tens of minutes to inhibit nonspecific reaction. Note that this step may be omitted by carrying out the next primary antibody reaction using an antibody solution containing bovine serum albumin.
(6) Antibody reaction An antibody diluted to an appropriate concentration is dropped onto a section on a slide glass, and then allowed to react for several tens of minutes to several hours. After completion of the reaction, wash with an appropriate buffer such as phosphate buffer.
(7) Addition of labeling reagent Peroxidase is frequently used as a labeling substance. In the above antibody reaction, an anti-SLC38A4 protein antibody to which peroxidase is bound can be used. However, when the anti-SLC38A4 protein antibody is not labeled, a secondary antibody to which peroxidase is bound, or a protein G or protein to which peroxidase is bound. A or the like can also be used. For example, when a secondary antibody is used, a secondary antibody to which peroxidase is bound is dropped onto a section on a slide glass and then reacted for several tens of minutes to several hours. After completion of the reaction, wash with an appropriate buffer such as phosphate buffer.
(8) Color reaction DAB (3,3'-diaminobenzidine) is dissolved in Tris buffer. Subsequently, hydrogen peroxide is added. The coloring solution thus prepared is allowed to permeate the section for several minutes (for example, 5 minutes) to develop a color. After color development, the section is thoroughly washed with tap water to remove DAB.
(9) Nuclear staining Nuclear staining is performed by reacting Meyer's hematoxylin for several seconds to several tens of seconds. Wash with running water and color (usually for a few minutes).
(10) Dehydration, clearing, sealing After dehydrating with alcohol, clearing with xylene, and finally sealing with synthetic resin, glycerin, rubber syrup or the like.
細胞または組織が癌である蓋然性や組織におけるがん化している部位は、免疫染色による染色強度や免疫染色により染色される細胞の割合と強い相関性がある。このため、本発明の方法において、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出することにより、被検体から分離した細胞または組織が癌である蓋然性の評価や、組織における癌化している部位の特定を行うことができる。これにより、食道癌の存在している部位や状況（転移部位や転移の状況、新たな組織に浸潤していくがん細胞の存在様式などを含む）を視覚的にとらえることができる。特に、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現は、早期の高分化段階にある食道癌において高い陽性率で検出されることから、本発明の方法によれば、病理組織のステージ(高分化段階)を判定することができる。高分化段階の癌細胞は、正常な扁平上皮細胞と細胞形態的に類似点が多く、グレードが進んだ進行癌に比べて癌と正常の区別が付きにくいが、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を利用した本発明の組織染色は、目視では正常と区別しにくい早期癌の検出に極めて有用である。 The probability that a cell or tissue is cancer or a cancerous site in the tissue has a strong correlation with the staining intensity by immunostaining and the proportion of cells stained by immunostaining. For this reason, in the method of the present invention, by detecting the expression of the SLC38A4 protein, it is possible to evaluate the probability that cells or tissues separated from the subject are cancerous and to identify cancerous sites in the tissues. . Thereby, the site | part and condition (including the metastatic site | part, the condition of a metastasis, the presence pattern of the cancer cell which infiltrate a new tissue, etc.) in which esophageal cancer exists can be caught visually. In particular, since the expression of SLC38A4 protein is detected at a high positive rate in esophageal cancer in an early highly differentiated stage, according to the method of the present invention, the stage of the pathological tissue (highly differentiated stage) can be determined. it can. Well differentiated cancer cells have many similarities to normal squamous epithelial cells, and it is difficult to distinguish between cancer and normal compared to advanced cancers that have advanced grades. However, this book uses anti-SLC38A4 protein antibody. The tissue staining of the invention is extremely useful for detection of early cancer that is difficult to distinguish from normal by visual observation.
癌患者を対象として、上記方法を実施して得られた情報は、当該患者の病態の評価ないし把握、治療効果の評価などに利用できる。例えば、癌の治療と並行して本発明の方法を実施すれば、結果として得られる情報を基に治療効果を評価することができる。具体的には、薬剤投与後に本発明の方法を実施することで病理組織における染色性の変化を調べ、染色部位の増減の推移から治療効果を判定することができる。このように本発明の方法を治療効果のモニターに利用してもよい。一方、患者以外の者、すなわち、癌が認定されていない者を対象として得られた情報は、食道癌の罹患の有無の判定評価等に利用できる。本発明の方法に基づけば、染色性という客観性に優れた指標を基に癌の診断を行うことができる。 Information obtained by implementing the above method for cancer patients can be used for evaluation or grasping of the patient's disease state, evaluation of therapeutic effects, and the like. For example, if the method of the present invention is performed in parallel with cancer treatment, the therapeutic effect can be evaluated based on the resulting information. Specifically, by carrying out the method of the present invention after drug administration, changes in the staining properties in the pathological tissue can be examined, and the therapeutic effect can be determined from the change in increase or decrease in the stained site. Thus, you may utilize the method of this invention for the monitoring of a therapeutic effect. On the other hand, information obtained for persons other than patients, that is, persons who have not been certified for cancer, can be used for determination and evaluation of the presence or absence of esophageal cancer. Based on the method of the present invention, cancer can be diagnosed based on an index that is excellent in objectivity such as dyeability.
被検体における癌の診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。）によって行われるが、本発明の方法によって得られる、病理組織におけＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現量に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。 Diagnosis of cancer in a subject is usually performed by a doctor (including those who have received instructions from the doctor; the same applies hereinafter), but data relating to the expression level of SLC38A4 protein in a pathological tissue obtained by the method of the present invention. Is useful for diagnosis by doctors. Therefore, the method of the present invention can also be expressed as a method of collecting and presenting data useful for diagnosis by a doctor.
＜食道癌検出用組成物およびその製造方法＞
本発明は、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を含む、食道癌検出用組成物を提供する。抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体は、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に対する特異的な結合性を有する限り、その種類や由来に、特に制限はない。本発明の食道癌検出用組成物に用いる抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、本発明の食道癌検出用組成物に用いる抗体は、抗体の機能的断片や機能的断片の多量体の形態（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）であり得る。このような機能的断片やその多量体としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、およびダイアボディーなどが挙げられる。ここで、「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖および重鎖の一部からなる免疫グロブリンの一価の抗原結合断片を意味する。抗体のパパイン消化によって、また、組換え方法によって得ることができる。「Ｆａｂ'」は、抗体のヒンジ領域の１つまたはそれより多いシステインを含めて、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのわずかの残基の付加によって、Ｆａｂとは異なる。「Ｆ（ａｂ’）２」とは、両方の軽鎖と両方の重鎖の部分からなる免疫グロブリンの二価の抗原結合断片を意味する。「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を有する最少の抗体断片である。Ｆｖは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである。「ｓｃＦｖ」は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、これらの領域は、単一のポリペプチド鎖に存在する。「ｓｃ（Ｆｖ）２」は、２つの重鎖可変領域および２つの軽鎖可変領域をリンカー等で結合して一本鎖にしたものである。「ｄｓＦｖ」とは、ジスルフィド安定化されたＦｖである。「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、この断片は、同一ポリペプチド鎖の中に軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含み、各領域は別の鎖の相補的領域とペアを形成している。
<Esophageal cancer detection composition and method for producing the same>
The present invention provides a composition for detecting esophageal cancer comprising an anti-SLC38A4 protein antibody. The anti-SLC38A4 protein antibody is not particularly limited in its type and origin as long as it has specific binding properties for the SLC38A4 protein. The antibody used in the composition for detecting esophageal cancer of the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. In addition, the antibody used in the composition for detecting esophageal cancer of the present invention can be a functional fragment of the antibody or a multimeric form of the functional fragment (eg, dimer, trimer, tetramer, polymer). Examples of such functional fragments and multimers thereof include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv, sc (Fv) 2, dsFv, and diabody. Here, “Fab” means a monovalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin composed of one light chain and part of a heavy chain. It can be obtained by papain digestion of antibodies and by recombinant methods. “Fab ′” differs from Fab by the addition of a few residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cysteines in the hinge region of the antibody. “F (ab ′) 2” means a bivalent antigen-binding fragment of an immunoglobulin that consists of both light chains and parts of both heavy chains. “Fv” is the minimum antibody fragment which has a complete antigen recognition and binding site. Fv is a dimer in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are strongly linked by a noncovalent bond. “ScFv” comprises the heavy and light chain variable regions of an antibody, and these regions are present in a single polypeptide chain. “Sc (Fv) 2” is a chain formed by joining two heavy chain variable regions and two light chain variable regions with a linker or the like. “DsFv” is a disulfide stabilized Fv. A “diabody” is a small antibody fragment having two antigen-binding sites, the fragment comprising a heavy chain variable region bound to a light chain variable region in the same polypeptide chain, each region comprising a separate It forms a pair with the complementary region of the strand.
抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体としては、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質（配列番号：１）の２９位〜４７位のアミノ酸配列「ＧＩＧＮＳＥＫＡＡＭＳＳＱＦＡＮＥＤＴ」（配列番号：２）を認識する抗体であることが好ましい。 The anti-SLC38A4 protein antibody is preferably an antibody that recognizes the amino acid sequence “GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (SEQ ID NO: 2) at positions 29 to 47 of the SLC38A4 protein (SEQ ID NO: 1).
本発明の食道癌検出用組成物の製造方法は、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその免疫原性のある一部を免疫する工程、および、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合する抗体を分離・精製する工程、を含む。さらに、組成物として許容される他の成分を混合する工程を含むことができる。 The method for producing a composition for detecting esophageal cancer of the present invention comprises a step of immunizing SLC38A4 protein or an immunogenic part thereof, and a step of separating and purifying an antibody that binds to SLC38A4 protein. Furthermore, the process of mixing the other component accept | permitted as a composition can be included.
本発明の食道癌検出用組成物に用いられる抗体の調製方法は、当分野で知られており、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)に記載されている。抗体は、通常の免疫学的手法、その他、ファージディスプレイ法など利用して調製することができる。 Methods for preparing antibodies used in the composition for detecting esophageal cancer of the present invention are known in the art. For example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Are listed. The antibody can be prepared by using a usual immunological technique or other phage display methods.
ポリクローナル抗体の調製は、次の手順で行うことができる。抗原（例えば、配列番号：１に記載のＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の全長もしくはその一部）を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。抗原としてのＳＬＣ３８Ａ４タンパク質は、生体試料から分離・精製することにより調製することができる。また、組換えタンパク質として調製したＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を抗原として用いることもできる。組換えタンパク質は、例えば、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質をコードする遺伝子もしくはその一部を、発現可能な状態でベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主に導入し、宿主において発現させたタンパク質を分離・精製することにより、調製される。ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質、好ましくは、２９位〜４７位のアミノ酸配列「ＧＩＧＮＳＥＫＡＡＭＳＳＱＦＡＮＥＤＴ」（配列番号：２）からなるペプチド領域を、ＧＳＴ、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、またはヒスチジン（His）タグ等との融合タンパク質として調製したものを、抗原として用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に分離・精製することができる。 The polyclonal antibody can be prepared by the following procedure. An antigen (for example, the full length of SLC38A4 protein described in SEQ ID NO: 1 or a part thereof) is prepared, and this is used to immunize animals such as rabbits. The SLC38A4 protein as an antigen can be prepared by separating and purifying from a biological sample. In addition, SLC38A4 protein prepared as a recombinant protein can be used as an antigen. Recombinant protein, for example, inserts a gene encoding SLC38A4 protein or a part thereof into a vector in an expressible state, introduces the vector into an appropriate host, and isolates and purifies the protein expressed in the host To be prepared. SLC38A4 protein, preferably a peptide region consisting of the amino acid sequence “GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (SEQ ID NO: 2) at positions 29 to 47 as a fusion protein with GST, β-galactosidase, maltose-binding protein, histidine (His) tag or the like What was prepared can also be used as an antigen. Such a fusion protein can be easily separated and purified by a general-purpose method.
必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で採血し、遠心処理などによって血清を得る。得られた抗血清は、プロテインＧやプロテインＡ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ＩｇＧ画分とすることができる。ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質もしくはその一部を利用したアフィニティー精製により、抗血清やＩｇＧ画分から、さらに、免疫原として用いたＳＬＣ３８Ａ４タンパク質もしくはその一部に結合する抗体を、分離・精製することができる。 Immunization is repeated as necessary, and blood is collected when the antibody titer sufficiently increases, and serum is obtained by centrifugation or the like. The obtained antiserum can be made into an IgG fraction by affinity chromatography using protein G, protein A or the like. By affinity purification using the SLC38A4 protein or a part thereof, an antibody that binds to the SLC38A4 protein or a part thereof used as an immunogen can be further separated and purified from the antiserum or IgG fraction.
本発明の食道癌検出用組成物に用いるポリクローナル抗体は、特に好ましくは、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の２９位〜４７位のアミノ酸配列「ＧＩＧＮＳＥＫＡＡＭＳＳＱＦＡＮＥＤＴ」（配列番号：２）からなるペプチドを免疫し、当該ペプチドに結合する抗体として、分離・精製したものである。 The polyclonal antibody used in the composition for detecting esophageal cancer of the present invention particularly preferably immunizes a peptide comprising the amino acid sequence “GIGNSEKAAMSSQFANEDT” (SEQ ID NO: 2) at positions 29 to 47 of the SLC38A4 protein and binds to the peptide. As an antibody to be isolated, purified and purified.
一方、モノクローナル抗体については次の手順で調製することができる。まず、上記と同様の手順で免疫操作を実施する。必要に応じて免疫を繰り返し、十分に抗体価が上昇した時点で免疫動物から抗体産生細胞を摘出する。次に、得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合してハイブリドーマを得る。続いて、目的タンパク質に対して高い特異性を有する抗体を産生するクローンを選択する。ハイブリドーマをモノクローン化した後、選択されたクローンの培養液を精製することによって、目的の抗体を取得することができる。一方、ハイブリドーマを所望数以上に増殖させた後、これを動物（例えばマウス）の腹腔内に移植して腹水内で増殖させ、その後、腹水を精製することにより目的の抗体を取得することもできる。上記培養液の精製または腹水の精製には、プロテインＧやプロテインＡ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーが好適に用いられる。また、抗原を固相化したアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。さらには、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、硫安分画、および遠心分離等の方法を用いることもできる。これらの方法は単独ないし任意に組み合わされて用いられる。 On the other hand, a monoclonal antibody can be prepared by the following procedure. First, an immunization operation is performed in the same procedure as described above. Immunization is repeated as necessary, and antibody-producing cells are removed from the immunized animal when the antibody titer sufficiently increases. Next, the obtained antibody-producing cells and myeloma cells are fused to obtain a hybridoma. Subsequently, a clone that produces an antibody having high specificity for the target protein is selected. After the hybridoma is monocloned, the target antibody can be obtained by purifying the culture medium of the selected clone. On the other hand, after the hybridoma is proliferated to a desired number or more, it is transplanted into the abdominal cavity of an animal (for example, a mouse) and allowed to proliferate in ascites, and then the target antibody can be obtained by purifying ascites. . For purification of the culture medium or ascites, affinity chromatography using protein G, protein A or the like is preferably used. Alternatively, affinity chromatography in which an antigen is immobilized may be used. Furthermore, methods such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, ammonium sulfate fractionation, and centrifugation can also be used. These methods can be used alone or in any combination.
こうして得られた抗体もしくはその遺伝子を基に、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、およびダイアボディー等の、抗体の機能的断片やその多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）を調製することができる。 Based on the antibody thus obtained or its gene, functional fragments of antibodies, such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv, sc (Fv) 2, dsFv, and diabody, Bodies (eg, dimers, trimers, tetramers, polymers) can be prepared.
上記の通り、直接的にＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合した抗体量を検出する場合、得られた抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体は、直接、酵素、蛍光等により標識して用いられる。一方、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合した抗体量を、二次抗体などを利用して検出する間接的検出方法を実施する場合、得られた抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体（一次抗体）を標識せず、当該抗体を認識する二次抗体を標識してもよい。 As described above, when detecting the amount of antibody directly bound to the SLC38A4 protein, the obtained anti-SLC38A4 protein antibody is directly labeled with an enzyme, fluorescence, or the like. On the other hand, when performing an indirect detection method in which the amount of antibody bound to the SLC38A4 protein is detected using a secondary antibody or the like, the obtained anti-SLC38A4 protein antibody (primary antibody) is not labeled and the antibody is recognized. The secondary antibody may be labeled.
本発明の食道癌検出用組成物としては、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体の他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、標識化合物、二次抗体などが挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。 The composition for detecting esophageal cancer of the present invention may contain other components acceptable as a composition in addition to the anti-SLC38A4 protein antibody. Examples of such other components include carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, labeled compounds, and secondary antibodies. It is done. As the excipient, lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used. As the disintegrant, starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer. As the emulsifier, gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used. As the suspending agent, glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used. As the stabilizer, propylene glycol, diethylin sulfite, ascorbic acid or the like can be used. As preservatives, phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used. As preservatives, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol, and the like can be used.
＜食道癌検出用キット＞
本発明は、また、上記本発明の食道癌検出用組成物を含む、食道癌の検出用キットを提供する。本発明のキットには、食道癌検出用組成物（抗体標品）の他、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせることができる。また、標識されていない抗体を抗体標品とした場合には、本発明のキットには、当該抗体に結合する物質（例えば、二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡなど）を標識化したものを組み合わせることができる。さらに、本発明のキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。本発明のキットは、例えば、食道癌の診断において有用である。
<Esophageal cancer detection kit>
The present invention also provides a kit for detecting esophageal cancer comprising the composition for detecting esophageal cancer of the present invention. In addition to the composition for detecting esophageal cancer (antibody preparation), the kit of the present invention may be combined with a substrate necessary for detection of the label, a positive control or negative control, or a buffer used for dilution or washing of the sample. it can. In addition, when an unlabeled antibody is used as an antibody preparation, the kit of the present invention contains a substance labeled with a substance (for example, secondary antibody, protein G, protein A, etc.) that binds to the antibody. Can be combined. Furthermore, the kit of the present invention can include instructions for using the kit. The kit of the present invention is useful, for example, in the diagnosis of esophageal cancer.
＜食道癌の治療薬のスクリーニング方法＞
本発明は、また、食道癌の治療薬のスクリーニング方法を提供する。その一つの態様は、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を標的としてスクリーニングする方法であり、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部を提供する工程、候補化合物をＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部に接触させる工程、および、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部に結合する化合物を選択する工程、を含む方法である。この方法により、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合する化合物が得られ、食道癌の治療薬のスクリーニングが行うことができる。候補化合物としては、化学合成または天然の低分子化合物、天然または合成のタンパク質、ペプチド、抗体（本発明の抗体を含む）、細胞抽出液、培養上清などを用いることができる。候補化合物として抗体を用いる場合には、ＥＩＡやＥＬＩＳＡ等により候補化合物の結合活性を測定することができる。コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いてタンパク質に結合する人工合成された化合物をスクリーニングすることも当業者に周知の技術である（Verdine GL. Nature（ENGLAND） 1996 Nov 7;384:11-13、Hogan JC Jr．Nature（ENGLAND） 1996 Nov 7;384:17-19）。こうして得た化合物は、食道癌のターゲッティングにも用いることができる。
<Screening method for therapeutic agents for esophageal cancer>
The present invention also provides a screening method for a therapeutic agent for esophageal cancer. One aspect thereof is a method for screening SLC38A4 protein as a target, the step of providing SLC38A4 protein or part thereof, the step of contacting a candidate compound with SLC38A4 protein or part thereof, and SLC38A4 protein or part thereof Selecting a compound that binds to. By this method, a compound that binds to the SLC38A4 protein can be obtained, and a therapeutic drug for esophageal cancer can be screened. Candidate compounds include chemically synthesized or natural low molecular weight compounds, natural or synthetic proteins, peptides, antibodies (including the antibody of the present invention), cell extracts, culture supernatants, and the like. When an antibody is used as a candidate compound, the binding activity of the candidate compound can be measured by EIA, ELISA, or the like. Screening artificially synthesized compounds that bind to proteins using high-throughput combinatorial chemistry techniques is also well known to those skilled in the art (Verdine GL. Nature (ENGLAND) 1996 Nov 7; 384: 11-13, Hogan JC Jr. Nature (ENGLAND) 1996 Nov 7; 384: 17-19). The compound thus obtained can also be used for targeting esophageal cancer.
他の一つの態様は、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を指標にスクリーニングする方法であり、食道癌モデル動物(ヒトを除く)に、候補化合物または対照を投与する工程、当該モデル動物の食道部の組織を分離する工程、および、分離された組織中の、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出し、対照と比較して、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法である。本方法は、上記のＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を標的としてスクリーニングする方法に加え、あるいは、独立して、実施することができる。 Another embodiment is a method for screening using the expression of SLC38A4 protein as an indicator, and administering a candidate compound or a control to an esophageal cancer model animal (excluding humans), and separating the esophageal tissue of the model animal And detecting the expression of SLC38A4 protein in the separated tissue and selecting a compound that reduces the expression of SLC38A4 protein compared to a control. This method can be carried out independently or in addition to the above-described method of screening using the SLC38A4 protein as a target.
本方法においては、まず、食道癌モデル動物を用意する。例えば、ＡＬＤＨ２ノックアウトマウスの皮下等にエタノールまたはアセトアルデヒドを注射し、扁平上皮癌を発癌させ、食道癌のモデルマウスを得ることができる(例えば、特開2005-110601号公報参照)。ヒト食道癌細胞を免疫不全マウスに移植することによっても、食道癌モデル動物を作製することができる。 In this method, first, an esophageal cancer model animal is prepared. For example, ethanol or acetaldehyde can be injected subcutaneously into ALDH2 knockout mice to cause squamous cell carcinoma, and a model mouse for esophageal cancer can be obtained (see, for example, JP-A-2005-110601). An esophageal cancer model animal can also be produced by transplanting human esophageal cancer cells into immunodeficient mice.
次に、そのモデル動物に候補化合物または対照を投与する。候補化合物としては、化学合成または天然の低分子化合物、天然または合成のタンパク質、ペプチド、抗体（本発明の抗体を含む）、細胞抽出液、培養上清などを用いることができる。対照としては、陰性対照や陽性対照を用いることができる。ここで陰性対照としては、通常、生理食塩水等が用いられる。既に治療効果のないことが判明している物質でもよい。陽性対照としては、既に治療効果のあることが判明している物質等が用いられる。投与の方法は、当業者には周知であり、経口、静脈注射、皮内、または皮下などから、適宜選択することができる。 The model animal is then administered a candidate compound or control. Candidate compounds include chemically synthesized or natural low molecular weight compounds, natural or synthetic proteins, peptides, antibodies (including the antibody of the present invention), cell extracts, culture supernatants, and the like. As a control, a negative control or a positive control can be used. Here, physiological saline or the like is usually used as a negative control. It may be a substance that has already been found to have no therapeutic effect. As a positive control, a substance or the like that has already been found to have a therapeutic effect is used. The method of administration is well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected from oral, intravenous injection, intradermal, or subcutaneous.
次に、モデル動物の食道部の組織を分離する。分離された組織は、免疫染色に供する場合には、上記の通り、固定・パラフィン包埋等の処理を行うことができる。 Next, the tissue of the esophagus part of the model animal is separated. When the separated tissue is subjected to immunostaining, it can be subjected to treatment such as fixation and paraffin embedding as described above.
最後に、分離した組織における、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出し、対照と比較して、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を低下させる化合物を選択する。ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を免疫染色により検出する場合には、陽性対照投与群の染色像と候補化合物投与群の染色像とを比較して、候補化合物投与群の染色をより陰性とする（例えば、染色強度を低くする、あるいは強染色される癌細胞の割合を少なくする）化合物を選択する。対照の染色像としては、陰性対照投与群の染色像の変わりに、陽性対照投与群の染色像（治療効果のある物質の投与群の染色像；標準染色像）を用意し、同等以上に陰性な染色像をもたらす化合物を選択してもよい。 Finally, the expression of SLC38A4 protein in the separated tissue is detected, and a compound that reduces the expression of SLC38A4 protein compared to the control is selected. When detecting the expression of SLC38A4 protein by immunostaining, the stained image of the positive control administration group and the staining image of the candidate compound administration group are compared, and the staining of the candidate compound administration group is made more negative (for example, staining Select a compound that reduces the intensity or reduces the proportion of cancer cells that are strongly stained. As a stained image of the control, instead of the stained image of the negative control administration group, a stained image of the positive control administration group (stained image of the treatment group of the substance having a therapeutic effect; standard staining image) is prepared, and is equal or more negative A compound that produces a stained image may be selected.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
（１）抗体の作製
ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、コンピューターによる二次元構造予測を行い、溶媒との接触率、柔軟性、表面露出、抗原性、親水性、そして極性のすべての要素を統合した結果、２９位〜４７位のアミノ酸配列である「ＧＩＧＮＳＥＫＡＡＭＳＳＱＦＡＮＥＤＴ」（配列番号：２）の位置が最も抗原性が高いと判断された（図１）。この２９位〜４７位のアミノ酸配列からなるペプチドを人工合成してＫＬＨに結合させた後、コンプリートフロイドアジュバンドと混合し、隔週で６回、２羽以上のウサギに免疫した。抗原ペプチドを固相化したアガロースビーズカラムを用いて、免疫後に得られた抗血清から抗原特異的なＩｇＧを精製した。精製ＩｇＧについて、抗原ペプチドを固相化した９６ウェルプレートを用いたＥＬＩＳＡを実施し、抗原濃度が０．４μｇ／ｍｌのとき、その力価（吸光度ＯＤ４５０）が１．０以上であった場合に、以後の実験に用いた。本実施例において取得した抗原特異的ＩｇＧ画分の力価は１．２であった（図２）。
(1) Antibody production Based on amino acid sequence information of SLC38A4 protein, two-dimensional structure prediction is performed by computer, and all factors of solvent contact rate, flexibility, surface exposure, antigenicity, hydrophilicity, and polarity As a result, the position of “GIGNSEKAAMSSQFANED” (SEQ ID NO: 2), which is the amino acid sequence of positions 29 to 47, was determined to be the most antigenic (FIG. 1). The peptide consisting of the amino acid sequence of positions 29 to 47 was artificially synthesized and bound to KLH, and then mixed with complete floyd adjuvant, and immunized to two or more rabbits six times every other week. Antigen-specific IgG was purified from the antiserum obtained after immunization using an agarose bead column on which an antigen peptide was immobilized. For purified IgG, an ELISA using a 96-well plate with an antigen peptide immobilized thereon was performed, and when the antigen concentration was 0.4 μg / ml, the titer (absorbance OD450) was 1.0 or more. This was used for the subsequent experiments. The titer of the antigen-specific IgG fraction obtained in this example was 1.2 (FIG. 2).
（２）抗体の性能確認
得られた抗体は、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の全長を強制発現させた２９３Ｔ培養細胞に対する細胞染色ならびにフローサイトメトリー（ＦＣＭ）において反応性を示すことが望ましい。発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）を用いた。ＳＬＣ３８Ａ４遺伝子の下流に、リボソームのエントリーサイトであるＩＲＥＳ配列とその直下に緑色蛍光タンパク質アザミグリーン（アマルガム社）の遺伝子を搭載させた。この発現ベクターを２９３Ｔ細胞にリポフェクション試薬（インビトロジェン社）によって一過性に導入した際、アザミグリーンの蛍光が光った細胞は、ＳＬＣ３８Ａ４遺伝子が導入された細胞であると判別される。
(2) Confirmation of antibody performance The obtained antibody desirably exhibits reactivity in cell staining and flow cytometry (FCM) on 293T cultured cells in which the full length of the SLC38A4 protein is forcibly expressed. PcDNA3.1 (Invitrogen) was used as an expression vector. Downstream of the SLC38A4 gene, an IRES sequence, which is an entry site for ribosomes, and a gene for green fluorescent protein thistle green (Amalgam) were mounted immediately below. When this expression vector is transiently introduced into a 293T cell using a lipofection reagent (Invitrogen), a cell with the fluorescence of thistle green is identified as a cell into which the SLC38A4 gene has been introduced.
まず、遺伝子導入した２９３Ｔ細胞（１×１０５細胞）の細胞膜に穴を開けるために、４％のパラフォルムアルデヒド／リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で４℃１５分間固定した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで室温１５分間処理した。次に、１μｇ／ｍｌの抗体溶液（１００μｌの１％ＢＳＡと０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳに希釈）と細胞とを室温で１時間反応させた。その後、２次抗体としてＰＥ標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社製、２００倍希釈。希釈溶液は１次抗体希釈液と同一）を反応させた。抗体が抗原発現細胞と反応した場合には、アザミグリーン（緑色）で光る細胞が、同時にＰＥ（赤色）で光ることになる（すなわち、ＦＣＭデータにおいてドットが右上にシフトする）。染色細胞をドットプロットにて展開した結果、陰性対照として用いたウサギＩｇＧを用いた場合には、ドットは右上にシフトせず、一方、陽性対照としてのｍｙｃタグ抗体（ＭＢＬ製：ＰＬ１４）を用いた場合、および、ならびに抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を用いた場合では、ドットが右上にシフトした（図３）。また、対照としてのモック遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞を対照に、および、ＳＬＣ３８Ａ４／ＳＮＡＴ４遺伝子を導入した２９３Ｔ細胞を上記と同様に同じように処理した後、ＵＶ蛍光顕微鏡（オリンパス社ＯＬＹＭＰＵＳ、ＩＸ７１蛍光顕微鏡システムシステム）にて観察を行った。その結果、対照細胞においては、ほとんど蛍光（赤色）が確認されず、ＳＬＣ３８Ａ４／ＳＮＡＴ４遺伝子を導入された２９３Ｔ細胞においては、蛍光（赤色）が確認された（図４）。図２〜４の結果から、調製した抗体が、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を特異的に認識していると判断した。 First, in order to make a hole in the cell membrane of the transfected 293T cells (1 × 10 5 cells), the cells were fixed with 4% paraformaldehyde / phosphate buffer (PBS) at 4 ° C. for 15 minutes, and then 0.1% Of Triton X-100 / PBS for 15 minutes at room temperature. Next, the 1 μg / ml antibody solution (diluted in PBS containing 100 μl of 1% BSA and 0.1% Triton X-100) and the cells were reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, a PE-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by Beckman Coulter, diluted 200-fold. The diluted solution is the same as the primary antibody diluted solution) was reacted as a secondary antibody. When the antibody reacts with antigen-expressing cells, cells that glow with thistle green (green) will glow with PE (red) at the same time (that is, the dots shift to the upper right in the FCM data). As a result of developing the stained cells in a dot plot, when the rabbit IgG used as the negative control was used, the dot did not shift to the upper right, while the myc tag antibody (manufactured by MBL: PL14) was used as the positive control. And when the anti-SLC38A4 protein antibody was used, the dot shifted to the upper right (FIG. 3). In addition, 293T cells introduced with mock genes as controls and 293T cells introduced with SLC38A4 / SNAT4 genes were treated in the same manner as described above, and then treated with a UV fluorescence microscope (OLYMPUS, IX71 fluorescence microscope). Observation was performed in the system system. As a result, almost no fluorescence (red) was confirmed in the control cells, and fluorescence (red) was confirmed in the 293T cells introduced with the SLC38A4 / SNAT4 gene (FIG. 4). From the results of FIGS. 2 to 4, it was determined that the prepared antibody specifically recognizes the SLC38A4 protein.
（３）抗体による組織切片（パラフィン包埋）の染色
検体をアジア人由来に統一するため、すべての組織切片（パラフィン包埋済み）は、上海Ｏｕｔｄｏ社（中国）より購入した。まず、食道正常部（左）と食道扁平上皮癌部（右）を各２例ずつ用いて染色性の確認を行った。患者番号：Ｃｏｍ０１−Ｄ７およびＣｏｍ０１−Ｄ８は、いずれもＷＨＯ病理分類グレードＩの食道扁平上皮癌である。組織切片を脱パラフィン処理するために、キシレンに５分間３回、１００％エタノールに５分間２回、９５％エタノールに５分間１回、９０％エタノールに５分間１回、８０％エタノールに５分間１回、７０％エタノールに５分間１回、そしてＰＢＳに５分間３回の処理を行った（すべて室温）。次に、抗原賦活化を目的に、組織切片を０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ６）に浸し、オートクレーブにて１２５℃で５分間処理を行った。内在性のペルオキシダーゼ活性を消滅させるために、３％の過酸化水素水を含むＰＢＳに室温で１０分間処理を行った後、５％の正常ヤギ血清と０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキング溶液）で室温にて３０分間処理を行った。過剰な溶液を布で拭った後、ブロッキング溶液で１μｇ／ｍｌに希釈した抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を適量添加し（組織切片が十分に浸る程度）、室温で２時間反応させた。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで室温５分間３回洗浄した後、二次抗体としてＨｉｓｔｏｓｔａｒ（Ｍｓ＋Ｒｂ）（ＭＢＬ社）の原液を適量添加し（組織切片が十分に浸る程度）、室温で６０分間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで室温５分間３回洗浄した後、ＤＡＢ基質液（ＭＢＬ社）を１０分間反応させた。反応は組織切片を水で洗浄することで停止させた。ヘマトキシリンによる染色の後、エタノールとキシレンで脱水処理を行い、標本作製液（松浪硝子）で標本を作製した。明視野顕微鏡（オリンパス社、ＩＸ７１）にて検鏡および記録を行ったところ、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体は、正常食道部には反応せず、食道扁平上皮癌と反応することが確認された（図５）。
(3) Staining of tissue sections (embedded in paraffin) with antibodies In order to unify specimens from Asians, all tissue sections (embedded in paraffin) were purchased from Shanghai Outdo (China). First, staining was confirmed using two cases each of the normal part of the esophagus (left) and the squamous cell carcinoma part of the esophagus (right). Patient numbers: Com01-D7 and Com01-D8 are both WHO pathological classification grade I esophageal squamous cell carcinoma. To deparaffinize tissue sections, 3 x 5 minutes in xylene, 2 x 5 minutes in 100% ethanol, 1 x 5 minutes in 95% ethanol, 1 x 5 minutes in 90% ethanol, 5 min in 80% ethanol The treatment was performed once, 70% ethanol once for 5 minutes, and PBS three times for 5 minutes (all at room temperature). Next, for the purpose of antigen activation, the tissue section was immersed in a 10 mM citrate buffer solution (pH 6) containing 0.05% Tween 20 and treated in an autoclave at 125 ° C. for 5 minutes. To extinguish endogenous peroxidase activity, PBS containing 3% hydrogen peroxide was treated for 10 minutes at room temperature, and then PBS containing 5% normal goat serum and 0.5% BSA (blocking) Solution) at room temperature for 30 minutes. After the excess solution was wiped with a cloth, an appropriate amount of an anti-SLC38A4 protein antibody diluted to 1 μg / ml with a blocking solution was added (the tissue section was sufficiently immersed) and allowed to react at room temperature for 2 hours. After washing with PBS containing 0.05% Tween 20 three times at room temperature for 5 minutes, an appropriate amount of a stock solution of Histostar (Ms + Rb) (MBL) was added as a secondary antibody (approx. Reacted for 1 minute. After washing with PBS containing 0.05% Tween 20 three times for 5 minutes at room temperature, DAB substrate solution (MBL) was reacted for 10 minutes. The reaction was stopped by washing the tissue section with water. After staining with hematoxylin, it was dehydrated with ethanol and xylene, and a sample was prepared with a sample preparation solution (Matsunami Glass). When microscopic examination and recording were performed with a bright field microscope (Olympus, IX71), it was confirmed that the anti-SLC38A4 protein antibody did not react with the normal esophagus but reacted with esophageal squamous cell carcinoma (FIG. 5). ).
次に、表１、表２に記した９６例の食道癌患者検体（ＷＨＯによる病理分類で高分化型であるグレードＩは２７例、高分化と中分化の間のグレードＩ−ＩＩは４例、中分化のグレードＩＩは３６例、中分化と低分化の間のグレードＩＩ−ＩＩＩは３例、低分化のグレードＩＩＩは２６例）を用いた組織染色を上記と同様の方法にて実施した。 Next, 96 cases of esophageal cancer patient specimens described in Tables 1 and 2 (27 cases of grade I that are highly differentiated by pathological classification by WHO, and 4 cases of grade I-II between well-differentiated and moderately differentiated cases) Tissue staining using 36 grades of intermediate differentiation, 3 cases of grade II-III between moderate and low differentiation, and 26 cases of grade III of poor differentiation was carried out in the same manner as above. .
なお、染色の程度はその染色強度と分布によって４段階に分けた。すなわち、被検癌組織の全体が非常に強く染まる場合を強陽性（＋＋）、被検組織全体が染まる場合を陽性（＋）、被検組織全体の一部が染まる、あるいは全体が弱く染まる場合を弱陽性（＋−）、そして被検組織が全く染まらない場合を陰性（―）とした。その結果、調べた食道扁平上皮癌患者由来の生検被検組織検体９６例のうち、強陽性は１０例、陽性は２４例、弱陽性は１８例、陰性は４４例であり、強陽性から弱陽性をすべて合わせた陽性例の合計は５２例となり、全体の５４％に相当した。また、ＷＨＯ病理分離グレード別に結果を分類したところ、グレードＩおよびＩ−ＩＩに分類された３１例のうち、２６例が陽性（陽性率８３．９％）（図６ならびに図７）、グレードＩＩおよびＩＩ−ＩＩＩに分類された３９例のうち、２２例が陽性（陽性率５６．４％）（図６ならびに図８）、そしてグレードＩＩＩの２６例のうち、４例が陽性（陽性率１５．４％）（図６ならびに図９）と判断された。この結果から、より早期の高分化段階にある食道癌において抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体による陽性率が高いことが判明した（図６）。さらに、各グレードにおける陽性例を染色強度毎に分類すると、グレードＩでは、強陽性が２５．８％、陽性が３２．３％、弱陽性が２５．８％、グレードＩＩでは、強陽性が５．１％、陽性が３０．８％、弱陽性は２０．５％、そしてグレードＩＩＩでは、強陽性は０％、陽性は７．７％、弱陽性は７．７％であり、グレードが低いほど、組織染色における染色強度が高い傾向が見られた（図１０）。このことから、抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体を利用した食道癌組織染色は、目視では正常と区別しにくい早期癌の検出に極めて有用であると考えられた。 The degree of staining was divided into four stages according to the staining intensity and distribution. That is, when the entire test cancer tissue is stained very strongly (++), when the entire test tissue is stained positive (+), when the entire test tissue is stained, or the entire test tissue is stained weakly Was positive (+-) and negative (-) when the test tissue was not stained at all. As a result, among 96 biopsy specimens derived from esophageal squamous cell carcinoma patients examined, 10 were strongly positive, 24 were positive, 18 were weak positive, 44 were negative, The total number of positive cases including all weak positives was 52 cases, corresponding to 54% of the total. Moreover, when the results were classified according to WHO pathological separation grades, among 31 cases classified into grades I and I-II, 26 cases were positive (positive rate 83.9%) (FIGS. 6 and 7), grade II 22 out of 39 cases classified as II and III (positive rate 56.4%) (FIGS. 6 and 8) and 4 out of 26 grade III cases (positive rate 15) .4%) (FIGS. 6 and 9). From this result, it was found that the positive rate by the anti-SLC38A4 protein antibody is high in esophageal cancer at an early stage of high differentiation (FIG. 6). Furthermore, when positive examples in each grade are classified according to staining intensity, in Grade I, strong positive is 25.8%, positive is 32.3%, weak positive is 25.8%, and in Grade II, strong positive is 5 .1%, positive 30.8%, weak positive 20.5%, and grade III is strong positive 0%, positive 7.7%, weak positive 7.7%, low grade There was a tendency that the staining intensity in tissue staining was high (FIG. 10). From this, it was considered that esophageal cancer tissue staining using an anti-SLC38A4 protein antibody is extremely useful for detection of early cancer that is difficult to distinguish visually from normal.
また、他の消化器系癌における抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体による染色性を評価するために、胃腺癌、大腸腺癌、直腸腺癌、膵臓癌、肝細胞癌、そして腎臓癌に対する組織染色（各癌種４例ずつ）を、上記図５の方法に従って行った。これらの検体はすべて上海ＯｕｔＤｏ社から購入した。その結果、これら６癌種における染色性は確認されなかった（図１１）。抗ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質抗体による染色は、食道扁平上皮癌に特異的な反応であることが示された。 In addition, in order to evaluate staining with anti-SLC38A4 protein antibody in other gastrointestinal cancers, tissue staining for gastric adenocarcinoma, colon adenocarcinoma, rectal adenocarcinoma, pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma, and kidney cancer (each cancer type). 4 cases each) was carried out according to the method of FIG. All these specimens were purchased from Shanghai OutDo. As a result, the staining in these 6 cancer types was not confirmed (FIG. 11). Staining with an anti-SLC38A4 protein antibody was shown to be a reaction specific to esophageal squamous cell carcinoma.
以上説明したように、本発明によれば、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を指標として高い精度で早期に食道癌を検出することが可能である。これにより、食道癌の進行の早い段階で食道癌の治療を行うことが可能となり、患者の治療の成功率を高め、かつ、患者の予後の改善を図ることが可能となる。また、本発明によれば、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質を標的として、また、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を指標に、効率的に、食道癌の治療薬のスクリーニングが可能である。このように、本発明は、食道癌の診断、治療、および治療薬の開発などに、大きく貢献しうるものである。 As described above, according to the present invention, esophageal cancer can be detected early with high accuracy using the expression of SLC38A4 protein as an index. This makes it possible to treat esophageal cancer at an early stage of progression of esophageal cancer, increase the success rate of the patient's treatment, and improve the prognosis of the patient. In addition, according to the present invention, it is possible to efficiently screen for esophageal cancer therapeutics using the SLC38A4 protein as a target and the expression of the SLC38A4 protein as an index. As described above, the present invention can greatly contribute to diagnosis, treatment, and development of therapeutic agents for esophageal cancer.
Claims (14)
（ｂ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質に結合する抗体を分離・精製する工程、
を含む、請求項５に記載の組成物の製造方法。 (A) immunizing SLC38A4 protein or an immunogenic part thereof, and (b) separating and purifying an antibody that binds to SLC38A4 protein,
The manufacturing method of the composition of Claim 5 containing this.
（ｂ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質中の配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる領域に結合する抗体を分離・精製する工程、
を含む、請求項６に記載の組成物の製造方法。 (A) immunizing a peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in SLC38A4 protein; and (b) separating an antibody that binds to a region consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in SLC38A4 protein.・ Purification process,
The manufacturing method of the composition of Claim 6 containing this.
（ｂ）候補化合物をＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部に接触させる工程、および
（ｃ）ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質またはその一部に結合する化合物を選択する工程、
を含む、食道癌の治療薬のスクリーニング方法。 (A) providing an SLC38A4 protein or part thereof;
(B) contacting the candidate compound with the SLC38A4 protein or a part thereof; and (c) selecting a compound that binds to the SLC38A4 protein or a part thereof;
A screening method for a therapeutic agent for esophageal cancer, comprising:
（ｂ）当該モデル動物の食道部の組織を採取する工程、および
（ｃ）採取された組織中の、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を検出し、対照と比較して、ＳＬＣ３８Ａ４タンパク質の発現を低下させる化合物を選択する工程、
を含む、食道癌の治療薬のスクリーニング方法。 (A) administering a candidate compound or a control to an esophageal cancer model animal (excluding humans);
(B) a step of collecting tissue of the esophagus part of the model animal; and (c) a compound that detects the expression of SLC38A4 protein in the collected tissue and reduces the expression of SLC38A4 protein compared to a control. Process to select,
A screening method for a therapeutic agent for esophageal cancer, comprising:
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