JP2011144125A

JP2011144125A - Use of 5-aminolevulinic acid as target-directional ligand

Info

Publication number: JP2011144125A
Application number: JP2010005160A
Authority: JP
Inventors: Yukio Nagasaki; 幸夫長崎; Yutaka Ikeda; 豊池田; Shintaro Kugimiya; 慎太郎釘宮; Yasushi Matsui; 裕史松井
Original assignee: University of Tsukuba NUC
Current assignee: University of Tsukuba NUC
Priority date: 2010-01-13
Filing date: 2010-01-13
Publication date: 2011-07-28

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a labeling or antitumor agent that uses a small molecule compound as a ligand having a low production cost, a simple processing step and being easily engineered. <P>SOLUTION: A preparation or conjugate for providing a labeling or antitumor agent comprising 5-aminolevulinic acid as an active ingredient or carriers thereof with target-directionality to tumor cells is provided. The label is a labeled compound known to be used for tumor diagnosis and a compound that forms a covalent bond through a carboxy group of 5-aminolevulinic acid and forms a conjugate while maintaining the labeling ability is used. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、５−アミノレブリン酸（以下、「５ＡＬＡ」と略称する場合あり）の腫瘍細胞に対する標的指向性リガンドとしての使用、または５−アミノレブリン酸と標識または抗腫瘍剤のコンジュゲートの製造方法に関する。 The present invention relates to the use of 5-aminolevulinic acid (hereinafter sometimes abbreviated as “5ALA”) as a targeting ligand for tumor cells, or to a method for producing a conjugate of 5-aminolevulinic acid and a label or an antitumor agent. .

悪性腫瘍（がん）は、現在、日本の死亡率の第一位となっており、死因全体の約３０％を占めている。がん治療には、外科療法、放射線療法、化学療法が三大療法として上げられる。その中の一つである化学療法は抗がん剤を投与することによる全身的な悪性腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、転移癌等の治療法であり、抗がん剤を静脈注射、もしくは経口投与により血液を通り全身に運び、がん細胞を攻撃する。しかし同時に、正常細胞にも作用し、嘔気、嘔吐、脱毛、疲労感や心臓、膀胱、肺、神経系の細胞にも障害を与えるといった重篤な有害事象がもたらされる結果、治療が中断される事になる。 Malignant tumors (cancers) are currently the top mortality rate in Japan, accounting for about 30% of all causes of death. There are three major treatments for cancer treatment: surgery, radiation therapy, and chemotherapy. Chemotherapy, one of them, is a treatment for systemic malignant tumors, leukemia, malignant lymphoma, metastatic cancer, etc. by administering anticancer drugs, and anticancer drugs are injected intravenously or orally. Carries the blood through the body and attacks cancer cells. At the same time, it also affects normal cells, causing nausea, vomiting, hair loss, fatigue, and serious adverse events such as damage to cells in the heart, bladder, lungs, and nervous system, resulting in interruption of treatment. It will be a thing.

有害事象を軽減させる一方法として、ドラッグデリバリーシステムによる腫瘍選択的な薬剤の送達が提案されてきた。具体的には抗体医薬やアプタマー・ペプチドといったバイオ製剤及び糖や葉酸といった小分子化合物を腫瘍指向性リガンドとして用いたドラッグデリバリーシステムの開発が行われている。 As a way to reduce adverse events, tumor selective drug delivery by drug delivery systems has been proposed. Specifically, drug delivery systems using biopharmaceuticals such as antibody drugs and aptamers / peptides and small molecule compounds such as sugars and folic acid as tumor-directing ligands have been developed.

このような抗体・アプタマー及びペプチドといったバイオ製剤を用いる場合、製造コストが高いことや構造が複雑及び不安定であるため上記のシステム開発に応用する際の加工過程における活性の失活、及び加工工程が煩雑であるといった問題点も多い。これらのバイオ製剤に対し、小分子化合物をリガンドとして用いた場合、製造コストも安く、加工工程も簡便でありエンジニアリングが行いやすいという利点がある。しかしながらこれら小分子化合物のリガンドとしてこれまで報告されているのはガラクトースやグルコースといった糖及び葉酸等であり、数少ない。標的指向性または選択性の高いドラッグデリバリーシステムの開発に応用できるリガンドに求められる条件に効率と選択性がある。効率（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は標的に対し多くの量の薬剤を導入する能力であり、選択性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は標的に対し選択的に薬剤を導入する能力である。例えば、正常細胞と比較した場合、標的としている癌細胞に優先的に導入する能力がこれにあたる。 When using such biopharmaceuticals such as antibodies, aptamers and peptides, the manufacturing cost is high, the structure is complicated and unstable, the activity is deactivated in the processing process when applied to the above system development, and the processing process There are also many problems such as being complicated. In contrast to these biopharmaceuticals, when a small molecule compound is used as a ligand, there are advantages that production costs are low, processing steps are simple, and engineering is easy to perform. However, sugars such as galactose and glucose, folic acid, and the like have been reported so far as ligands for these small molecule compounds. Efficiency and selectivity are the conditions required for ligands that can be applied to the development of drug delivery systems with high target-directivity or selectivity. Efficiency is the ability to introduce a large amount of drug to the target, and specificity is the ability to selectively introduce the drug to the target. For example, when compared with normal cells, this is the ability to introduce preferentially into targeted cancer cells.

したがって、上記の糖または葉酸等と同等な腫瘍指向性及び腫瘍細胞への取り込み効率を示す小分子化合物リガンドに対するニーズは依然として存在する。 Accordingly, there remains a need for small molecule ligands that exhibit tumor directivity and uptake efficiency into tumor cells comparable to the sugars or folic acids described above.

５ＡＬＡから合成されたプロトポルフィリン（ＰｐＩＸ）は種々の腫瘍細胞内で蓄積することが分かっており、ＰｐＩＸはその蛍光発光を利用した癌の切除手術に用いられている。このＰｐＩＸの集積は癌特有の代謝障害により起こっていると報告されているが、本発明者等は腫瘍細胞内でＰｐＩＸの高度な蓄積が代謝障害だけでなく５ＡＬＡの癌細胞への優先的な取り込みが生じているのではないかと考えた。こうして、本発明者等は腫瘍を優先的に認識する分子としてヘモグロビンの前駆体である５ＡＬＡに着目し、癌細胞における５ＡＬＡの取り込み促進の可能性について検討を行った。その結果、５ＡＬＡが腫瘍細胞に対し高い指向性または選択性を有し、かつ、効率よく導入されることが確認できた。 Protoporphyrin (PpIX) synthesized from 5ALA has been found to accumulate in various tumor cells, and PpIX has been used for excision of cancer using its fluorescence. It has been reported that the accumulation of PpIX is caused by a metabolic disorder peculiar to cancer. However, the present inventors have preferentially accumulated not only a metabolic disorder but also 5ALA in cancer cells. I thought that there was an uptake. Thus, the present inventors focused on 5ALA, which is a precursor of hemoglobin, as a molecule that preferentially recognizes tumors, and examined the possibility of promoting 5ALA uptake in cancer cells. As a result, it was confirmed that 5ALA had high directivity or selectivity for tumor cells and was efficiently introduced.

したがって、本発明はこうした知見に基づいて完成されたものであって、５−アミノレブリン酸を有効性成分とする標識もしくは抗腫瘍剤またはこれらのキャリアーに腫瘍細胞
に対する標的指向性を付与するための調製物またはコンジュゲートが提供される。 Therefore, the present invention has been completed based on such findings, and is a label or antitumor agent comprising 5-aminolevulinic acid as an active ingredient, or a preparation for imparting targeting properties to tumor cells to these carriers. Articles or conjugates are provided.

または別の態様の本発明として、５−アミノレブリン酸と標識もしくは抗腫瘍剤またはこれらのキャリアーとを共有結合せしめることを特徴する腫瘍細胞に対する標的指向性のコンジュゲートの製造方法が提供される。 Alternatively, as another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a targeting conjugate for tumor cells, which comprises covalently binding 5-aminolevulinic acid and a labeled or antitumor agent or a carrier thereof.

Detailed Description of the Invention

本発明にいう、標識としては、腫瘍の診断に用いられることが知られている標識化合物であって、５ＡＬＡのカルボキシル基を介して共有結合を形成して当該標識能を維持したままコンジュゲートを形成できる有機または有機金属化合物を挙げることができる。かような化合物の具体的なものとしては、限定されるものでないが、例えば、非環式リガンドに由来するもの、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコール−０，０’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジ酢酸（ＨＢＥＤ）およびトリエチレンテトラアミンヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ）、置換ＤＴＰＡに由来するもの、例えば、ｐ−イソチオシアネート−ベンジル−ＤＴＰＡに由来するもの、巨大環式リガンドに由来するもの、例えば、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ'”−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）および１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ'”−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、または１，４，７，１０−テトラアザシクロトリデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ'”−テトラ−酢酸（ＴＩＴＲＡ）に由来するものを挙げることができる。 The label referred to in the present invention is a labeled compound that is known to be used for tumor diagnosis, and a conjugate is formed while maintaining the labeling ability by forming a covalent bond via the carboxyl group of 5ALA. Mention may be made of organic or organometallic compounds which can be formed. Specific examples of such compounds include, but are not limited to, those derived from acyclic ligands such as diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylene glycol-0,0′-bis (2 -Aminoethyl) -N, N, N ', N'-tetraacetic acid (EGTA), N, N'-bis (hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N'-diacetic acid (HBED) and triethylenetetraaminehexaacetic acid (TTHA), derived from substituted DTPA, such as derived from p-isothiocyanate-benzyl-DTPA, derived from macrocyclic ligand, such as 1,4,7,10-tetra-azacyclododecane -N, N ', N ", N'"-tetraacetic acid (DOTA) and 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane- N, N ′, N ″, N ′ ″-tetraacetic acid (TETA) or 1,4,7,10-tetraazacyclotridecane-N, N ′, N ″, N ′ ″-tetra-acetic acid (TITRA) ).

また、抗腫瘍剤としては、アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アザシチジン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アロプリノール、アントラサイクリン、アンドロゲン、アンドロゲンビカルタミド、アンドロゲン抗アンドロゲン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、インターロイキン−２、ウベニメクス、エストロゲン、エトポシド、エノシタビン、エピルビシン、オキサリプラチン、カペシタビン、カルボコン、カルボプラチン、カルムスチン、クラドリビン、クラリスロマイシン、クロラムブシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、サリドマイド、シクロホスファミド、シスプラチン、シタラビン、シプロヘプタジン、ジノスタチンスチマラマー、ストレプトゾシン、ダウノルビシン、ダカルバジン、チオグアニン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、テニポシド、デキサメタゾン、トポテカン、トリプトレリン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ニムスチン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、バルルビシン、パクリタキセル、ビカルタミド、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ピラルビシン、フルオロウラシル、フルタミド、フルダラビン、フルベストラント、フロクスウリジン、ブレオマイシン、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、プロゲスチン、ペプロマイシン、ペメトレキセド、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、マイトマイシン、ミトキサントロン、メスナ、メチセルジド、メトトレキサート、メラシン、メルカプトプリン、メルファラン、ラニムスチン、リュープロライド、レンチナン、ロイコボリン、ロムスチンを挙げることができる。 Antitumor agents include actinomycin D, aclarubicin, azacitidine, aminoglutethimide, amsacrine, allopurinol, anthracycline, androgen, androgen bicalutamide, androgen antiandrogen, idarubicin, ifosfamide, imatinib, irinotecan, interferon, interferon alpha, Interleukin-2, ubenimex, estrogen, etoposide, enocitabine, epirubicin, oxaliplatin, capecitabine, carbocon, carboplatin, carmustine, cladribine, clarithromycin, chlorambucil, gefitinib, gemcitabine, goserelin, thalidomide, pralidomide, cyclophosphamide , Cyproheptadine, Dinostatin Stimala -, Streptozocin, daunorubicin, dacarbazine, thioguanine, tegafur, tegafur uracil, tegafur gimeracil oteracil potassium, teniposide, dexamethasone, topotecan, triptorelin, doxyfluridine, doxorubicin, nimustine, neocalcinostatin, nedaplatin, nedaplatin Bicalutamide, vincristine, vindesine, vinblastine, pirarubicin, fluorouracil, flutamide, fludarabine, fulvestrant, floxuridine, bleomycin, pricamycin, prednisone, procarbazine, progestin, pepromycin, pemetrexed, pentostatin, porfimer sodium, mitomycin, mitoxan TRON, mesna, methysergide , Methotrexate, melacin, mercaptopurine, melphalan, ranimustine, leuprolide, lentinan, leucovorin, lomustine.

さらに、キャリアーとしては、上記標識化合物または抗腫瘍剤を腫瘍細胞に対してデリバリーする際に使用することができるそれ自体公知のキャリア−分子、例えば、ミセル、リポソーム、デキストラン、ＣＭＣなどの多糖、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子、ナノゲル、金コロイドを挙げることができる。 Further, as the carrier, a carrier molecule known per se that can be used for delivering the labeled compound or the antitumor agent to tumor cells, for example, a polysaccharide such as micelle, liposome, dextran, CMC, polyvinyl Examples thereof include water-soluble polymers such as alcohol, polyethylene glycol, and polyvinyl pyrrolidone, nanogels, and gold colloids.

本願発明にしたがう、標的指向性を付与するための調製物には、５ＡＬＡそれ自体が有効成分として含まれていてもよいが、５ＡＬＡのアミノ基がペプチド合成の際に常用され
ているようなアミノ保護基、例えば、Ｃ_１−４低級アルカノイル基、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル基等により保護され、及び／またはカルボキシル基が酸無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル等の活性型に転化されている化合物として含まれていてもよい。また、腫瘍細胞に対する標的指向性を付与するためのコンジュゲートは、これらの標識化合物もしくは抗腫瘍剤またはそのキャリアーと５ＡＬＡとが、５ＡＬＡのカルボキシル基を介して、前者に当該カルボキシル基と共有結合を形成し得る官能基、例えばアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基等が存在する場合には、そのような官能基をそのまま、また必要により、そのような官能基またはそのような官能基を担持するスペーサー（例えば、グリシン、２−アミノエタノール、メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、２−アミノエタンチオール）を導入した誘導体の当該官能基との共有結合を形成するのとにより形成することができる。 According to the present invention, the preparation for imparting target directivity may contain 5ALA itself as an active ingredient, but the amino group in which the amino group of 5ALA is commonly used during peptide synthesis. Protected by a protective group such as C _1-4 lower alkanoyl group, benzyloxycarbonyl, t-butoxycarbonyl group, etc., and / or converted into an active form such as an acid anhydride, N-hydroxysuccinimidyl ester, etc. It may be contained as a compound. In addition, conjugates for imparting targeting properties to tumor cells include those labeled compounds or antitumor agents or their carriers and 5ALA covalently bonded to the carboxyl group via the carboxyl group of 5ALA. When there is a functional group that can be formed, such as an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, etc., such a functional group is left as it is, and if necessary, such a functional group or a spacer carrying such a functional group It can be formed by forming a covalent bond with the functional group of a derivative into which (for example, glycine, 2-aminoethanol, mercaptoethanol, 3-mercaptopropionic acid, 2-aminoethanethiol) is introduced.

したがって、本発明によれば、５ＡＬＡと、標識もしくは抗腫瘍剤またはこれらのキャリアーとの共有結合の形成は、５ＡＬＡのカルボキシル基またはその活性化された化合物と標識もしくは抗腫瘍剤またはこれらのキャリアーの、例えばアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基等、また別に、当該標識等に例えばアミノ基、ヒドロキシル基、等またはかような官能基を担持するスペーサーを導入した官能基とをそれ自体公知の縮合または付加反応により実施できる。このような共有結合は、例えば，必要により、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸等の縮合剤を用いて、反応に不活性な溶媒、例えば、塩化メチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で、必要により加熱下に当該共有結合が形成される時間反応させることにより形成することができる。 Therefore, according to the present invention, the formation of a covalent bond between 5ALA and a labeled or antitumor agent or their carrier is the same as that of the carboxyl group of 5ALA or its activated compound and the labeled or antitumor agent or their carrier. For example, an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, etc., or a functional group having an amino group, a hydroxyl group, etc. It can be carried out by addition reaction. Such a covalent bond is, for example, a solvent inert to the reaction using a condensing agent such as N, N′-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, if necessary, For example, it can be formed by reacting in methylene chloride and N, N-dimethylformamide for a period of time during which the covalent bond is formed, if necessary under heating.

実施例による、５ＡＬＡと蛍光試薬とのコンジュゲート（ＡＬＡ−ＦＬ）と、５−アミノ吉草酸（以下、「５ＡＶＡ」と略記する場合あり）と蛍光試薬とのコンジュゲート（ＡＶＡ−ＦＬ）の癌細胞（ＲＧＫ−１）に対する取り込み効率を比較するグラフ表示である。Cancer of conjugate of 5ALA and fluorescent reagent (ALA-FL), conjugate of 5-aminovaleric acid (hereinafter sometimes abbreviated as “5AVA”) and fluorescent reagent (AVA-FL) according to Examples It is a graph display which compares the uptake | capture efficiency with respect to a cell (RGK-1). 実施例による、ＡＬＡ−ＦＬ及びＡＶＡ−ＦＬの正常細胞に対する癌細胞への取り込み選択性を示すグラフ表示である。It is a graph display which shows the uptake | capture selectivity to the cancer cell with respect to the normal cell of ALA-FL and AVA-FL by an Example.

以下、本発明を、具体例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明を当該説明に限定することを意図するものでない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to specific examples. However, the present invention is not intended to be limited to the description.

（１）５ＡＬＡの腫瘍細胞に対する導入効率と選択性を評価するため、ＡＬＡに蛍光試薬を縮合反応し標識した。また比較実験を行うため、類似物質である５−アミノ吉草酸（ＡＶＡ）にも蛍光試薬の標識を行った。 (1) In order to evaluate the introduction efficiency and selectivity of 5ALA to tumor cells, a fluorescent reagent was condensed on ALA and labeled. In order to perform a comparative experiment, a fluorescent reagent was also labeled on a similar substance, 5-aminovaleric acid (AVA).

標識する際に用いた、５ＡＬＡ、５ＡＶＡ及び蛍光試薬は、それぞれ順に下記の式で表される。 The 5ALA, 5AVA, and fluorescent reagent used for labeling are sequentially represented by the following formulas.

また、標識は、下記の合成スキームに従って行った。 The labeling was performed according to the following synthesis scheme.

５アミノレブリン酸（化合物１）（コスモ石油株式会社）を１．０ｇ（７．６２ｍｍｏｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（Ｗａｋｏ）を３０ｍｌ、１，４−Ｄｉｏｘａｎｅ（Ｗａｋｏ）を５０ｍｌ、Ｄｉ−ｔｅｒ−ｂｕｔｙｌＰｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（東京化成株式会社）を１．９５ｇ（１１．４ｍｍｏｌ）入れ、６０℃で８時間攪拌する。１，４−Ｄｉｏｘａｎｅ（Ｗａｋｏ）を２−プロパノール（関東化学株式会社）を加え共沸させ、エバポレーターにより揮発させる。その後アセトンを加え、塩をろ紙によりろ過し、エバポレーターにより濃縮を行う。その後シリカカラム（Ｗａｋｏ）により展開溶媒であるクロロホルム（Ｗａｋｏ）、メタノール（Ｗａｋｏ）を加え（クロロホルム：メタノール＝１００：２）、化合物２を精製した。次に、化合物２を５００ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（関東化学株式会社）を５０ｍｌ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸（東京化成株式会社）を４１４ｍｇ（２．１６ｍｍｏｌ）、４−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（東京化成株式会社）を５００ｍｇ（１．４４ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（Ｗａｋｏ）を１７ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）加え、４０℃、４８時間攪拌する。攪拌後、クロロホルムを塩化ア
ンモニウム（Ｗａｋｏ）、炭酸水素ナトリウム（Ｗａｋｏ）、塩化ナトリウム水溶液（Ｗａｋｏ）の順に分液を行い、クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルムに硫酸ナトリウム（関東化学株式会社）を加え、水を除去した後、エバポレーターにより濃縮を行った。分液後、シリカカラム（Ｗａｋｏ）により展開溶媒（クロロホルム−メタノール＝１００：２）を用いて精製を行い化合物３が得られた。化合物３を３００ｍｇにＨｙｄｒｏｇｅｎＣｈｌｏｒｉｄｅ（東京化成工業株式会社）を１０ｍｌ加え３時間攪拌し、脱保護を行い、化合物４を得た。 1.0 g (7.62 mmol) of 5-aminolevulinic acid (Compound 1) (Cosmo Oil Co., Ltd.), 30 ml of 1N aqueous sodium hydroxide (Wako), 50 ml of 1,4-Dioxane (Wako), Di-ter-butyl 1.95 g (11.4 mmol) of Pyrocarbonate (Tokyo Kasei Co., Ltd.) is added and stirred at 60 ° C. for 8 hours. 1,4-Dioxane (Wako) is azeotropically added with 2-propanol (Kanto Chemical Co., Inc.) and volatilized by an evaporator. Acetone is then added, the salt is filtered through filter paper, and concentrated with an evaporator. Thereafter, chloroform (Wako) and methanol (Wako) as developing solvents were added through a silica column (Wako) (chloroform: methanol = 100: 2) to purify compound 2. Next, 500 mg (2.16 mmol) of Compound 2, 50 ml of N, N-dimethylformamide (Kanto Chemical Co., Ltd.), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 414 mg (2.16 mmol), 4-Aminofluorescein (Tokyo Kasei Co., Ltd.) 500 mg (1.44 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (Wako) 17 mg (0.14 mmol) are added and stirred at 40 ° C. for 48 hours. After stirring, chloroform was separated in the order of ammonium chloride (Wako), sodium hydrogen carbonate (Wako) and sodium chloride aqueous solution (Wako), and the chloroform layer was recovered. Sodium sulfate (Kanto Chemical Co., Inc.) was added to the recovered chloroform, water was removed, and the mixture was concentrated by an evaporator. After separation, purification was performed using a developing solvent (chloroform-methanol = 100: 2) with a silica column (Wako) to obtain Compound 3. Compound 3 was added to 300 mg of Hydrogen Chloride (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and stirred for 3 hours to perform deprotection to obtain Compound 4.

（２）５ＡＬＡの腫瘍細胞に対する取り込み効率の評価
上記の５ＡＬＡおよび５ＡＶＡの蛍光標識ラベル体を用いて、ＡＬＡの腫瘍細胞に対する導入効率と選択性を評価した。 (2) Evaluation of 5ALA uptake efficiency for tumor cells Using the above-mentioned 5ALA and 5AVA fluorescently labeled labels, the introduction efficiency and selectivity of ALA for tumor cells were evaluated.

細胞としては正常細胞としてＲＧＭ−１（ラット正常胃粘膜上皮細胞、理研セルバンクＲＣＢ０８７６）を用い、癌細胞としてはＲＧＫ−１（ＲＧＭ−１癌化細胞：この細胞は、筑波大学大学院人間総合科学研究科臨床医学系疾患制御医学専攻消化器病態医学分野講師の松井裕史博士より、試験研究に使用することを目的とすることを条件として入手できる）を用いた。 As cells, RGM-1 (rat normal gastric mucosa epithelial cells, RIKEN Cell Bank RCB0876) is used as normal cells, and as cancer cells, RGK-1 (RGM-1 cancerous cells: this cell is the University of Tsukuba Graduate School of Human Sciences) Was obtained from Dr. Hiroshi Matsui, a lecturer in the field of gastrointestinal pathology, Department of Disease Control Medicine, Department of Clinical Medicine.

まず、５ＡＬＡが癌細胞に対してどの程度効率よく取り込まれるか評価を行った。癌細胞であるＲＧＫ−１に対し、５ＡＬＡの蛍光ラベル体（ＡＬＡ−ＦＬと略す）およびコントロール化合物である５ＡＶＡの蛍光ラベル体（ＡＶＡ−ＦＬと略す）を添加し、取り込み効率をフローサイトメーターにより評価した（ＡＬＡ−ＦＬ、ＡＶＡ−ＦＬをそれぞれ、ＰＢＳに溶かし、６２．１μＭの溶液を作製する。ＲＧＫ−１細胞を２４ｗｅｌｌ細胞培養用マルチウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ）に１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で細胞を播く。培地は４５０μｌ入れる。それぞれのサンプルを５０μｌ滴下し、１分ごとに測定を行う。測定にはフローサイトメーター（ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｏｍｉｎｉ）を使用した。Ｃｏｕｎｔ数を５０００カウントとし、全体の蛍光強度の算術平均値を基に細胞に導入された各サンプルの量を解析した。）。結果を図１に示す。 First, it was evaluated how efficiently 5ALA is taken up by cancer cells. A 5ALA fluorescent label (abbreviated as ALA-FL) and a control compound of 5AVA (abbreviated as AVA-FL) were added to RGK-1 which is a cancer cell, and the uptake efficiency was measured by a flow cytometer. (ALA-FL and AVA-FL were each dissolved in PBS to prepare a 62.1 μM solution. RGK-1 cells were placed in a 24-well cell culture multiwell plate (FALCON) at 1 × 10 ⁵ cells / well. Cells are seeded at a concentration of 450 μl of medium, 50 μl of each sample is added dropwise, and measurement is performed every minute using a flow cytometer (Guava EasyCyto mini), the count number is 5000 counts, Each sample introduced into the cell based on the arithmetic average of the overall fluorescence intensity The amount of pull was analyzed.) The results are shown in FIG.

図１に示されるとおり、５ＡＬＡをリガンドとして使用すると、コントロール化合物である５ＡＶＡをリガンドとして使用した場合に比べて、効率よく癌細胞に相当するコンジュゲーテが取り込まれていることがわかった。特筆すべきことは、５ＡＬＡと５ＡＶＡの構造の違いはカルボニル基の有無だけであるが、そのわずかな違いによってこの様な取り込み効率の違いが見えたことである。このことは５ＡＬＡの構造が癌細胞に効率よく蛍光物質を導入している要因であることを示している。 As shown in FIG. 1, it was found that when 5ALA was used as a ligand, a conjugate corresponding to cancer cells was efficiently incorporated as compared with the case where 5AVA as a control compound was used as a ligand. It should be noted that the difference in structure between 5ALA and 5AVA is only the presence or absence of a carbonyl group, but such a difference in uptake efficiency was visible due to the slight difference. This indicates that the structure of 5ALA is a factor that efficiently introduces a fluorescent substance into cancer cells.

（３）５ＡＬＡの腫瘍細胞への取り込み選択性評価
５ＡＬＡの細胞取り込みの選択性を評価した。正常細胞（ＲＧＭ１）及び腫瘍細胞（ＲＧＫ１）にＡＬＡ−ＦＬ及びＡＶＡ−ＦＬを添加し、３分後に各細胞を回収し、各物質のＲＧＭ１及びＲＧＫ１における取り込み量をフローサイトメーターを用いて評価した（ＡＬＡ−ＦＬ、ＡＶＡ−ＦＬをそれぞれ、ＰＢＳに溶かし、６２．１μＭの溶液を作製する。ＲＧＭ−１、ＲＧＫ−１細胞を２４ｗｅｌｌ細胞培養用マルチウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ）にそれぞれ１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で細胞を播く。培地は４５０μｌ入れる。それぞれのサンプルを５０μｌ滴下し、１分ごとに測定を行う。測定にはフローサイトメータ（ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｏｍｉｎｉ）を使用した。Ｃｏｕｎｔ数を５０００カウントとし、全体の蛍光強度の算術平均値を算出した。）。結果を図２に示す。 (3) Evaluation of 5ALA uptake selectivity into tumor cells The selectivity of 5ALA uptake into cells was evaluated. ALA-FL and AVA-FL were added to normal cells (RGM1) and tumor cells (RGK1), and after 3 minutes, each cell was collected, and the amount of each substance incorporated into RGM1 and RGK1 was evaluated using a flow cytometer. (ALA-FL and AVA-FL are each dissolved in PBS to prepare a 62.1 μM solution. RGM-1 and RGK-1 cells are each 1 × 10 ^{5 in a} 24 well cell culture multiwell plate (FALCON). Cells are seeded at a concentration of cell / well, 450 μl of the medium is added, 50 μl of each sample is dropped, and measurement is performed every minute using a flow cytometer (Guava EasyCyto mini). The arithmetic average value of the total fluorescence intensity was calculated as a count.) The results are shown in FIG.

図２より５ＡＶＡを蛍光ラベルした化合物（ＡＶＡ−ＦＬ）は正常細胞と比較した場合、癌細胞に約３倍多く取り込まれていたが、５ＡＬＡを蛍光ラベルした化合物（ＡＬＡ−
ＦＬ）は癌細胞に約１０倍多く取り込まれていた。このことからＡＬＡ−ＦＬは癌細胞への選択性がＡＶＡ−ＦＬと比較して有意に高いことがわかる。 As shown in FIG. 2, the compound labeled with 5AVA (AVA-FL) was about 3 times larger than that of normal cells, but the compound labeled with 5ALA (ALA−)
FL) was taken up about 10 times more in cancer cells. This indicates that ALA-FL has significantly higher selectivity for cancer cells than AVA-FL.

本発明は、例えば、癌細胞への標識化合物や抗腫瘍剤の効率のよいデリバリーの手段を提供できるので、医薬製造業等で利用可能である。 Since the present invention can provide a means for efficient delivery of a labeled compound or an antitumor agent to cancer cells, for example, it can be used in the pharmaceutical manufacturing industry.

Claims

A label or antitumor agent comprising 5-aminolevulinic acid as an active ingredient, or a preparation or conjugate for imparting targeting properties to tumor cells to these carriers.

A method for producing a target-directed conjugate for tumor cells, which comprises covalently binding 5-aminolevulinic acid to a label or an antitumor agent or a carrier thereof.