JP2011139683A - 昆虫の分化および成長の制御法ならびにそのための組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】ローヤルゼリーと同様の活性を有し、昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分を決定し、その成分を用いることによる昆虫の分化および成長の制御法およびそのための組成物を確立することを、本発明の課題とする。
【解決手段】上記課題は、ローヤルゼリーにおいて昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分がロイヤラクチンであることを同定し、ロイヤラクチンを用いる昆虫の分化および成長の制御法およびそのための組成物を提供することによって、解決された。
【選択図】なし
【解決手段】上記課題は、ローヤルゼリーにおいて昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分がロイヤラクチンであることを同定し、ロイヤラクチンを用いる昆虫の分化および成長の制御法およびそのための組成物を提供することによって、解決された。
【選択図】なし
Description
本発明は、昆虫、特に内翅群昆虫の分化および成長の制御の分野に関する。
雌性のミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）は、女王蜂および働き蜂という２つにカースト分化する。このカースト分化は、遺伝的差異によるものではなく、働き蜂によって分泌されるローヤルゼリー（ＲＪ）を発生の初期段階で摂取するか否かに依存する（非特許文献１〜３）。
しかしながら、ローヤルゼリーに含有されるどの成分が、カースト分化を担うかについては解明されていない。昆虫の分化および成長の制御においてローヤルゼリーの使用は非常に有用ではあるが、ローヤルゼリーを大量に調製することは困難である。
そこで、ローヤルゼリーと同様に昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分を決定し、その成分を用いることによる昆虫の分化および成長の制御法、ならびに、そのための組成物の確立が必要である。
ＰａｇｅおよびＰｅｎｇ、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３６，６９５-７１１（２００１）
Ｗｈｅｅｌｅｒ、Ａｍ．Ｎａｔ．１２８，１３−３４（１９８６）
Ｗｅａｖｅｒ、Ａｎｎａｌｓ Ｅｎｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．５０，２８３−２９４（１９５７）
ローヤルゼリーと同様の活性を有し、昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分を決定し、その成分を用いることによる昆虫の分化および成長の制御法およびそのための組成物を確立することを、本発明の課題とする。
上記課題は、ＲＪに含有されるカースト分化を担うタンパク質がロイヤラクチン（登録商標）であると同定し、ロイヤラクチンを用いる昆虫の分化および成長の制御法、ならびに、ロイヤラクチンを含む組成物を提供することによって解決された。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１） 雌性の内翅群昆虫の分化および成長を促進する方法であって、該方法は、（ｉ）該雌性昆虫の幼虫にロイヤラクチンまたはその改変体を投与する工程、を包含し、ここで、該ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、ここで、前記ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、方法。
（項目３） 前記ロイヤラクチンまたはその改変体が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記ＥＧＦＲが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５） 前記昆虫が双翅目昆虫または膜翅目昆虫である、項目１に記載の方法。
（項目６） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の昆虫またはＡｐｉｓ属の昆虫である、項目５に記載の方法。
（項目７） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａである、項目６に記載の方法。
（項目８） 前記雌性の内翅群昆虫の分化および成長の促進が、羽化までの発生に要する時間の減少、羽化時の成体の重量の増加、卵巣サイズの増大、卵巣あたりの卵巣小管数の増加、幼若ホルモンの分泌の増加、女王蜂への分化、体長の伸長、体重の増加、翅の面積の増大、蛹サイズの増大、および、産卵数の増加、からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９） 雌性の内翅群昆虫の分化および成長を促進するための組成物であって、該組成物はロイヤラクチンまたはその改変体を含有し、ここで、該ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、組成物。
（項目１０） 項目９に記載の組成物であって、ここで、前記ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、組成物。
（項目１１） 前記ロイヤラクチンまたはその改変体が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、項目９に記載の組成物。
（項目１２） 前記ＥＧＦＲが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなる群から選択される、項目９に記載の組成物。
（項目１３） 前記昆虫が双翅目昆虫または膜翅目昆虫である、項目９に記載の組成物。
（項目１４） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の昆虫またはＡｐｉｓ属の昆虫である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａである、項目１４に記載の組成物。
（項目１６） 前記雌性の内翅群昆虫の分化および成長の促進が、羽化までの発生に要する時間の減少、羽化時の成体の重量の増加、卵巣サイズの増大、卵巣あたりの卵巣小管数の増加、幼若ホルモンの分泌の増加、ビテロゲニン発現の増加、女王蜂への分化、体長の伸長、体重の増加、翅の面積の増大、蛹サイズの増大、および、産卵数の増加、からなる群から選択される、項目９に記載の組成物。
（項目１） 雌性の内翅群昆虫の分化および成長を促進する方法であって、該方法は、（ｉ）該雌性昆虫の幼虫にロイヤラクチンまたはその改変体を投与する工程、を包含し、ここで、該ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、方法。
（項目２） 項目１に記載の方法であって、ここで、前記ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、方法。
（項目３） 前記ロイヤラクチンまたはその改変体が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記ＥＧＦＲが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目５） 前記昆虫が双翅目昆虫または膜翅目昆虫である、項目１に記載の方法。
（項目６） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の昆虫またはＡｐｉｓ属の昆虫である、項目５に記載の方法。
（項目７） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａである、項目６に記載の方法。
（項目８） 前記雌性の内翅群昆虫の分化および成長の促進が、羽化までの発生に要する時間の減少、羽化時の成体の重量の増加、卵巣サイズの増大、卵巣あたりの卵巣小管数の増加、幼若ホルモンの分泌の増加、女王蜂への分化、体長の伸長、体重の増加、翅の面積の増大、蛹サイズの増大、および、産卵数の増加、からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９） 雌性の内翅群昆虫の分化および成長を促進するための組成物であって、該組成物はロイヤラクチンまたはその改変体を含有し、ここで、該ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、組成物。
（項目１０） 項目９に記載の組成物であって、ここで、前記ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、組成物。
（項目１１） 前記ロイヤラクチンまたはその改変体が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、項目９に記載の組成物。
（項目１２） 前記ＥＧＦＲが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなる群から選択される、項目９に記載の組成物。
（項目１３） 前記昆虫が双翅目昆虫または膜翅目昆虫である、項目９に記載の組成物。
（項目１４） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の昆虫またはＡｐｉｓ属の昆虫である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５） 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａである、項目１４に記載の組成物。
（項目１６） 前記雌性の内翅群昆虫の分化および成長の促進が、羽化までの発生に要する時間の減少、羽化時の成体の重量の増加、卵巣サイズの増大、卵巣あたりの卵巣小管数の増加、幼若ホルモンの分泌の増加、ビテロゲニン発現の増加、女王蜂への分化、体長の伸長、体重の増加、翅の面積の増大、蛹サイズの増大、および、産卵数の増加、からなる群から選択される、項目９に記載の組成物。
ローヤルゼリーにおいて昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分がロイヤラクチンであることを同定することによって、ロイヤラクチンまたはその改変体を用いる昆虫の分化および成長の制御法およびそのための組成物が提供される。
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本発明において使用する場合、「ロイヤラクチン」とは、配列番号１の核酸配列にコードされる遺伝子、または、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは、これらの改変体を意味する。ロイヤラクチンの改変体（変異体）としては、ロイヤラクチンと同様の生化学的機能および／または生理学的機能を有するポリペプチドが包含される。ロイヤラクチンの生化学的機能としては、ＥＧＦＲとの結合が挙げられるが、これに限定されない。ロイヤラクチンを細胞と接触させた場合の生化学的機能としては、細胞におけるＥＧＦＲの活性化（ＥＧＦＲのインターナリゼーションおよび／またはリン酸化）、細胞におけるＴＯＲ発現の増加、細胞におけるｖｇ発現の増加、細胞におけるＭＡＰキナーゼの活性化（リン酸化）、細胞におけるＳ６キナーゼの活性化（リン酸化）、細胞（脂肪体）におけるｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル下流に存在する遺伝子（ｗｎｔ１、ｗｎｔ２、ｅｎ、ｈｈ）の発現誘導、エクダイソンレセプターシグナル下流に存在する遺伝子（ＤＨＲ３８、Ｅ７８Ｃ）の発現誘導、ＪＨ関連因子（ＪＨＡＭＥＴ（ＪＨ合成酵素）、ｍｅｔ（ＪＨ受容体））の発現誘導、ならびに、卵黄形成遺伝子（ｙｐ−１、ｙｐ−２、ｙｐ−３）の発現誘導が挙げられるが、これに限定されない。ロイヤラクチンの生理学的機能としては、卵巣サイズ（卵巣小管数）の増加、成体昆虫の重量の増加、および、成体への発生に必要な時間の短縮が挙げられるが、これに限定されない。
ロイヤラクチンの改変体は、例えば、配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる遺伝子であって、上記ロイヤラクチンの生化学的機能および生理学的機能の少なくとも１つの機能を有するポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。また、ロイヤラクチンの改変体は、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、置換、および／または、付加を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、上記ロイヤラクチンの生化学的機能および生理学的機能の少なくとも１つの機能を有するポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。また、ロイヤラクチンの改変体には、上記改変体と、ロイヤラクチンの活性に悪影響を与えないペプチド（例えば、タグ、Ｆｃ領域などが挙げられるが、これらに限定されない）との融合体も含まれる。
本発明の対象となる昆虫は、好ましくは内翅群昆虫であり、より好ましくは双翅目昆虫および膜翅目昆虫である。好ましい双翅目昆虫は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の昆虫であり、より好ましくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒである。好ましい膜翅目昆虫は、Ａｐｉｓ属の昆虫であり、より好ましくはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａである。本発明の対象となる昆虫は、好ましくは雌性である。
本発明において使用する場合、「ＥＧＦＲ」とは、配列番号３の核酸配列にコードされるショウジョウバエＥＧＦＲ−Ａ遺伝子、もしくは、配列番号４のアミノ酸配列からなるショウジョウバエＥＧＦＲ−Ａポリペプチド、または、配列番号５の核酸配列にコードされるショウジョウバエＥＧＦＲ−Ｂ遺伝子、もしくは、配列番号６のアミノ酸配列からなるショウジョウバエＥＧＦＲ−Ｂポリペプチド、または、配列番号７の核酸配列にコードされるミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＥＧＦＲ遺伝子、もしくは、配列番号８のアミノ酸配列からなるミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＥＧＦＲポリペプチド、あるいは、これらの改変体を意味する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン「ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１に示される核酸、ならびにその相補鎖、改変体およびフラグメントを包含する。
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な塩基配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２に示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５
Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列またはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
（１） ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２） ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３） ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４） ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５） ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
（２） ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３） ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４） ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５） ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリー配列または核酸のクエリー配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ ＥＳ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本発明の遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウン（抑制）することが可能である。所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、当該分野で公知のｓｉＲＮＡ提供業者（例えば、株式会社 ニッポンイージーティー、富山、日本）により、アニーリングしている２本鎖の合成ｓｉＲＮＡを入手することができる。その合成ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの溶液に溶解し、最終濃度が２０μＭになるように調整し、その後細胞へ導入する。ｓｉＲＮＡを調製する場合には、例えば、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現生成物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現生成物自体はまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され得る媒体（例えば、プラスミド）を包含する。
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中で野使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ １９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
本発明の配列番号２に記載のポリペプチドをコードする核酸の発現は、原核生物または真核生物細胞において従来の方法によって実行され得る。本発明はまた、本発明の配列番号２に記載のポリペプチドおよび配列番号１に記載のポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む、融合物を包含する。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。そのようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、当該分野で周知である。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
（実施例１：ミツバチ幼虫の分化および成長に関連する因子の同定）
（実施例１−１：インビトロでの幼虫の飼育）
第１齢の幼虫を、ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の巣房から取り出した。幼虫は、室温、９６％湿度でプレート上に１時間放置し、良好に摂食する幼虫を選択した。食餌は、以下のとおりである（単位は、幼虫の重量あたりの重量％）：ローヤルゼリー（５０．０％）、水（３７．０％）、Ｄ−グルコース（６．０％）、Ｄ−フルクトース（６．０％）および酵母エキス（１．０％）。使用したローヤルゼリーは、４０℃で ７日間保存したローヤルゼリー（４０−７ｄ ＲＪ）、４０℃で１４日間保存したローヤルゼリー（４０−１４ｄ ＲＪ）、４０℃で２１日間保存したローヤルゼリー（４０−２１ｄ ＲＪ）、および、４０℃で３０日間保存したローヤルゼリー（４０−３０ｄ ＲＪ）である。精製したロイヤラクチン、Ｅ．ｃｏｌｉにて組換え発現した後に精製したロイヤラクチン、または、ローヤルゼリー由来の精製４５０ｋＤａタンパク質を、４０−３０ｄ ＲＪを含む食餌に、０．５％（ｗ/ｗ）、１．０％（ｗ/ｗ）、または、２．０％（ｗ/ｗ）で添加した。幼虫を、食餌を含む６０ｍｍのプレートに配置し、３４℃±１℃、９６％湿度で飼育した。飼育開始の４日目に、幼虫を、２４ウェルのマイクロタイタープレートに移した。幼虫の間に、２４時間毎に、幼虫を新鮮な食餌を含むプレートに移した。幼虫が排便を開始した後、付着する食餌をキムワイプで取り除き、幼虫を、６ウェルのマイクロタイタープレート（底部にフィルターペーパーを敷いている）に移した。蛹の期間は、３４℃±１℃、７６％湿度で飼育した。羽化するまで、蛹を、同一条件で飼育した。
（実施例１−１：インビトロでの幼虫の飼育）
第１齢の幼虫を、ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の巣房から取り出した。幼虫は、室温、９６％湿度でプレート上に１時間放置し、良好に摂食する幼虫を選択した。食餌は、以下のとおりである（単位は、幼虫の重量あたりの重量％）：ローヤルゼリー（５０．０％）、水（３７．０％）、Ｄ−グルコース（６．０％）、Ｄ−フルクトース（６．０％）および酵母エキス（１．０％）。使用したローヤルゼリーは、４０℃で ７日間保存したローヤルゼリー（４０−７ｄ ＲＪ）、４０℃で１４日間保存したローヤルゼリー（４０−１４ｄ ＲＪ）、４０℃で２１日間保存したローヤルゼリー（４０−２１ｄ ＲＪ）、および、４０℃で３０日間保存したローヤルゼリー（４０−３０ｄ ＲＪ）である。精製したロイヤラクチン、Ｅ．ｃｏｌｉにて組換え発現した後に精製したロイヤラクチン、または、ローヤルゼリー由来の精製４５０ｋＤａタンパク質を、４０−３０ｄ ＲＪを含む食餌に、０．５％（ｗ/ｗ）、１．０％（ｗ/ｗ）、または、２．０％（ｗ/ｗ）で添加した。幼虫を、食餌を含む６０ｍｍのプレートに配置し、３４℃±１℃、９６％湿度で飼育した。飼育開始の４日目に、幼虫を、２４ウェルのマイクロタイタープレートに移した。幼虫の間に、２４時間毎に、幼虫を新鮮な食餌を含むプレートに移した。幼虫が排便を開始した後、付着する食餌をキムワイプで取り除き、幼虫を、６ウェルのマイクロタイタープレート（底部にフィルターペーパーを敷いている）に移した。蛹の期間は、３４℃±１℃、７６％湿度で飼育した。羽化するまで、蛹を、同一条件で飼育した。
（実施例１−２：女王蜂および働き蜂の測定）
女王蜂および働き蜂の以下の特徴を測定した。女王蜂の特徴：働き蜂よりも早く羽化する（発生のための時間が短い）、突出した腹部を有する大きな身体（重い重量）、分散した体毛を伴う大きな後脚附節隣接部、ノッチのある下顎、および、卵巣あたり１２０〜１８０の卵巣小管。働き蜂の特徴：女王蜂よりも遅く羽化する（発生のための時間が長い）、小さな身体（軽い重量）、分散した体毛を伴わない小さな後脚附節隣接部、ノッチのない下顎、および、卵巣あたり２〜６の未発達の卵巣小管。本実施例に記載の実験では、形態学的特徴と、卵巣のサイズが非常に良好に相関していた。そのため、本実施例においては、卵巣のサイズの結果のみを記載し、形態学的特徴については、記載しなかった。
（実施例１−３：ビタミン、脂肪、および、糖の定量）
ローヤルゼリー中のビタミンＢ１、Ｂ２及びＣは、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ（４．６×１５０ｍｍ），Ｃｏｓｍｏｓｉｌ Ｃ１８ Ｅｃｏｎｏｐａｋ ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１５０ｍｍ）またはＳｉｌｉｃａ ２１５０−Ｎ ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１００ｍｍ）をそれぞれ備えたＨＰＬＣを用いて定量的に分析した。ローヤルゼリー中のビタミンＢ６、Ｂ１２及び葉酸は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＴＣＣ９０８０，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＡＴＣＣ７８３０ 及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ＡＴＣＣ７４６９をそれぞれ用いた微生物定量によって分析した。パントテン酸、ニコチン酸及びビオチンは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＡＴＣＣ８０１４を用いた微生物定量によって分析した。１０ハイドロキシデセン酸は、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ）を備えたＨＰＬＣを用いて定量的に分析した。ローヤルゼリー中のグルコースおよびフルクトースを、Ｗａｋｏｓｉｌ ５ＮＨ２（４．６×２５０ｍｍ）を備えたＨＰＬＣを用いて定量的に分析した。ローヤルゼリー中の脂肪酸を、ＤＢ−２３（０．２５×３００ｍｍ）を備えたガスクロマログラフィーを用いて、定量的に分析した。脂肪酸の検出限界は、１００ｇのローヤルゼリーあたり１０ｍｇであった。
（実施例１−４：ローヤルゼリータンパク質の定量）
ローヤルゼリー中のタンパク質の定量分析を、５〜２０％のグラジエントポリアクリルアミドゲルでのネイティブＰＡＧＥによって行った。０．１５ｇのローヤルゼリーのサンプルを、２０％のグリセリンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液５ｍｌ中に懸濁し、５０００×ｇ １０分間遠心した。懸濁液をネイティブＰＡＧＥに供した。４０℃の種々の条件下で保存したローヤルゼリー中の、４５０ｋＤａタンパク質、１７０ｋＤａタンパク質、および、ロイヤラクチンをブロットし、デンシトメトリーでのスキャンによって定量した。ＨＰＬＣでのローヤルゼリータンパク質の定量の結果、４５０ｋＤａタンパク質、１７０ｋＤａタンパク質、および、ロイヤラクチンの濃度は、１００ｇローヤルゼリーあたり、それぞれ、４．５ｇ、０．７７ｇ、および、２．１ｇであった。これらの値に基いて、種々の条件下で保存されたローヤルゼリー内の各タンパク質の残存割合を計算した。ブロットのバンドを、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｖｅｒ．１．６２（ＮＩＨ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて定量した。
（実施例１−５：ローヤルゼリー中のタンパク質の精製）
ロイヤラクチンをＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ ｃｏｌｕｍｎとＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／１０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｃｏｌｕｍｎを用いて精製し、精製ロイヤラクチンを、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。４５０ｋＤａタンパク質の精製では、ローヤルゼリーを、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）で平衡化したＨｉＬｏａｄ １６／１０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラムに供した。次に、カラムを、同一緩衝液を用い、１．０ｍｌ／分の速度で溶出し、４５０ｋＤａタンパク質を含む画分を回収し、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。
（実施例１−６：組換えロイヤラクチンの発現および精製）
配列番号１の核酸配列を有する、シグナルペプチドを欠く成熟全長ロイヤラクチンをコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。このサブクローニングによって生成したプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、Ａ６００ｎｍが約０．８になるまで、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、３７℃で３時間増殖させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．５ｍＭ）を添加して、ロイヤラクチン発現を誘導し、３７℃で１７時間、培養を続けた。次に、細胞を遠心分離によって回収し、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、Ｔｏｍｙ超音波発生機を用いて、２０ｋＨｚ ８０Ｗで８０秒間破壊した。超音波処理した溶液を、２０，０００×ｇ ３０分間 ４℃で遠心し、上清を、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄレジン親和性カラムに供し、イミダゾールを用いて溶出した。組換えロイヤラクチン（Ｅ−ロイヤラクチン）を収集し、ＨｉＰｒｅｐ（登録商標）１６／６０Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムに供した。次にカラムを緩衝液Ａで、１０ｍｌ／分の流速で溶出し、１．０ｍｌの画分を収集した。Ｅ−ロイヤラクチンを含む画分をプールし、蒸留水に対して透析して、凍結乾燥した。
（実施例１−７：幼若ホルモンの定量）
ミツバチの３齢幼虫を回収し、血リンパ液を採取した。血リンパ液中に含まれる幼弱ホルモンをヘキサンで２回抽出し、真空乾燥の後、メタノールに溶解させた。幼若ホルモンはＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＭＳ １５０−４．６ （４．６×１５０ｍｍ）を備えた高分解能を有すＬＣ−ＭＳ、ｍｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて定量した。
（実施例１−８：リアルタイムＰＣＲ）
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、３齢の幼虫から調製した。逆転写酵素反応を、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。使用したプライマーは、以下のとおりである：
アクチンフォワードプライマー：５’−ＴＧＣＣＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号９）、
アクチンリバースプライマー：５’−ＡＧＡＡＴＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号１０）、
ビテロゲニン（ｖｇ）フォワードプライマー：５’−ＣＣＣＡＣＧＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＡ−３’（配列番号１１）、および、
ビテロゲニン（ｖｇ）リバースプライマー：５’−ＣＣＧＣＴＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＡ−３’（配列番号１２）。
全てのＰＣＲアッセイを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）、プライマーおよびｃＤＮＡを含む２０μＬ反応混合液中で行った。１：１０のｍＲＮＡの段階希釈によって作成した４〜５ｌｏｇ範囲の標準曲線を用いて、半定量分析を行った。ＰＣＲ条件は次のとおりである：９５℃１０秒の後、９５℃５秒および６０℃３５秒のサイクルを４０サイクル行なった。４０−３０ｄ ＲＪを用いて飼育した幼虫での発現レベルに対する相対値として、各サンプルのアクチン濃度に対して規準化した後に、平均発現レベルを決定した。
（実施例１−９：統計学的処理）
実験結果を、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示した。ダネット多重比較試験を用いるＡＮＯＶＡによって、データを分析した。ｐ＜０．０５を統計学的有意か否かの規準として用いた。
（結果）
ローヤルゼリーに含まれる単一の成分がローヤルゼリーと同様に昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担うか否かは不明であったが、ローヤルゼリーと同様に昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分を決定するために、本発明者は、ローヤルゼリーの生理学的活性に対する、保存の影響を決定した。
ローヤルゼリー（ＲＪ）を摂取した幼虫は、完全に女王蜂に分化した。これに対して、４０℃で３０日間保存したローヤルゼリー（４０−３０ｄ ＲＪ）を与えた幼虫は、働き蜂となった。１０−ヒドロキシ−２−デセン酸、数種類のビタミン、糖、および、脂肪酸は、３０日間の保存の前後で変化しなかった。しかしながら、ロイヤラクチン（５７ｋＤａタンパク質）の量は、４０℃での保存時間に比例して分解していた。保存後に残存する５７ｋＤａタンパク質の量は、ミツバチの女王蜂への分化誘導活性と相関した（幼虫を女王蜂に分化させる残存活性の指標として、羽化までの発生に要する時間、羽化時の成体の重量、および、卵巣のサイズを用いた、図１ａ〜ｃ）。
ローヤルゼリーを４０℃で３０日間の保存後（４０−３０ｄ ＲＪ）に、精製ロイヤラクチン（図２；「Ｒｏｌ」）を添加することによって、幼虫を女王蜂に分化させる活性が回復した。この結果は、ロイヤラクチンが幼虫を女王蜂に分化生させる活性を有することを実証している。組換え発現したロイヤラクチン（図２；「Ｅ−Ｒｏｌ」）を添加することによっても、幼虫を女王蜂に分化させる活性が回復した。この結果は、ロイヤラクチンのみによって、幼虫の女王蜂への分化が誘導されることを実証している。
その一方で、ローヤルゼリーに含まれる４５０ｋＤａタンパク質は、ロイヤラクチンのような機能を示さなかった（図２；４５０ｋＤａ）。この結果は、ロイヤラクチンがミツバチの女王蜂への分化および成長を担うタンパク質であることを実証している。
さらに、ロイヤラクチンは、カースト決定における重要なホルモンである幼弱ホルモンの分泌（図２ｄ）、および、卵母細胞発生に必須の因子であるビテロゲニンの遺伝子発現（図２ｅ）を誘導した。
これらの結果は、ロイヤラクチンが雌性ミツバチ幼虫の女王蜂への分化の誘導因子であることを示す。
（実施例２：ショウジョウバエモデルを利用した実験結果）
（実施例２−１：ローヤルゼリー含有培地の調製）
ローヤルゼリー含有培地、ならびに、その比較対照としての、カゼイン含有培地、および、コントロール培地を以下の組成で調製した。なお、培地の調製においては、寒天をそのままペースト状で使用することで足場を確保し、培地として機能することを可能にした。また、ローヤルゼリーはｐＨが約４.０であることから、Ｔｒｉｓを用いてｐＨを７．０に調整した。
（１）２０％ローヤルゼリー含有培地：蒸留水 １００ｍｌ、酵母エキス ８ｇ、グルコース １０ｇ、および、ローヤルゼリー ２０ｇをよく混和し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いてｐＨを７．０に調製し、バイアル当たり１０ｍＬの培地を添加し、さらに、粉末の寒天を添加して、よく攪拌した。これらの操作を無菌下で行った。
（２）カゼイン含有培地（ローヤルゼリー含有培地と摂取カロリーが同程度になるように、カゼインを中心として種々の成分を用いて調製した培地）：蒸留水 １００ｍｌ、酵母エキス ８ｇ、グルコース １１．３ｇ、カゼイン ２．８ｇ、フルクトース １．３ｇ、コーンスターチ ０．４ｇ、および、大豆油 ０．７６ｇをよく混和し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いてｐＨを７．０に調製し、バイアル当たり１０ｍＬの培地を添加し、さらに、粉末の寒天を添加して、よく攪拌した。これらの操作を無菌下で行った。
（３）コントロール培地：蒸留水 １００ｍｌ、酵母エキス ８ｇ、および、グルコース １０ｇをよく混和し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いてｐＨを７．０に調製し、バイアル当たり１０ｍＬの培地を添加し、さらに、粉末の寒天を添加して、よく攪拌した。これらの操作を無菌下で行った。
（実施例２−２：野生型ショウジョウバエにおける体長、体重、細胞サイズ、および、細胞数の変化）
上記の結果は、以下の表１〜５のとおりである。
さらに、ローヤルゼリーの添加によって、産卵速度の促進が観察された。この産卵速度の増加が、産卵数増加の原因である。
ローヤルゼリーの添加によって、雌性の寿命は有意に伸長したが、雄性の寿命に有意な変化は見られなかった。また、上記に示した雌性ショウジョウバエの形質変化は、次世代へは遺伝しなかった。
ローヤルゼリーの添加によって、雌性の寿命は有意に伸長したが、雄性の寿命に有意な変化は見られなかった。また、上記に示した雌性ショウジョウバエの形質変化は、次世代へは遺伝しなかった。
このように、ローヤルゼリー含有培地で飼育したハエの表現型は、女王蜂の表現型と極めて類似していたことから、このハエの飼育系がミツバチのカースト分化解明の評価系（例えば、変異型ロイヤラクチンの評価系）として活用できることが明らかとなった。
（実施例２−３：ショウジョウバエでのロイヤラクチン強制発現による表現型の変化）
ショウジョウバエでのロイヤラクチン形質転換体を作成し、Ｇａｌ４／ＵＡＳ系を用いて組織特異的にロイヤラクチンを強制発現させたときの表現型の変化について測定した。
（実施例２−４：ショウジョウバエの変異体における、ローヤルゼリーの影響）
次に、各種変異型ショウジョウバエにおける、ローヤルゼリーの影響について検討した。結果を次の表７に示す。表中、ローヤルゼリーによる体長伸長および体重増加が有意な結果の数値を斜体として下線を付した。
Ｇａｌ４／ＵＡＳ系統で組織特異的に変異を入れたところ、ｐｐｌ（脂肪体（肝臓）で誘導）でのＥＧＦＲ変異でのみローヤルゼリーによる作用を阻害した（Ｐ０２０６は前胸線とアラタ体で誘導され、Ａｕｇ２１はアラタ体で誘導される）。これら結果は、各組織の中で、脂肪体のＥＧＦＲが最も重要であることを示す。また、ローヤルゼリーによる体サイズの増加は、細胞サイズの増加に起因していた。Ｓ６キナーゼは、細胞サイズの増加に関与し、また、ＥＧＦＲの下流に存在する。そのため、Ｓ６キナーゼもまた、ローヤルゼリーによるシグナル伝達に関与していることが判明した。ＴＯＲの下流でのＳ６キナーゼの活性化には富栄養状態によるものが考えられるが、富栄養状態よるS6キナーゼの活性化にはＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＰＤＫ１からのシグナルが関わっていないにも関わらず、ローヤルゼリーによる効果にはこれらのシグナルが関与していたことからから、ローヤルゼリーが栄養素としてではなく、シグナル因子として機能していることが確認された。
（実施例２−５：ロイヤラクチンによるシグナルの伝達：タンパク質のリン酸化）
次にロイヤラクチンがＥＧＦＲに作用するとき、直接作用しているかどうかを確認するため、ショウジョウバエ由来Ｓ２細胞に、ショウジョウバエ由来のＥＧＦＲであるＥＧＦＲ−Ａ（配列番号３および４）、または、ＥＧＦＲ−Ｂ（配列番号５および６）、または、ミツバチのＥＧＦＲ（配列番号７または８）を発現させ、細胞内のシグナル活性化を確認した。
具体的には、ショウジョウバエ由来Ｓ２細胞を形質転換して、ショウジョウバエ由来のＥＧＦＲであるＥＧＦＲ−Ａ（配列番号３および４）、または、ＥＧＦＲ−Ｂ（配列番号５および６）、または、ミツバチのＥＧＦＲ（配列番号７または８）を発現させ、その細胞に対してロイヤラクチンを作用させた。その細胞を溶解し、各種抗体を用いてウェスタンブロットを行った。リン酸化ＥＧＦＲの検出には抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（ＧＥヘルスケア）を用い、ＥＧＦＲ検出のコントロール実験においては抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いた。リン酸化Ｓ６キナーゼの検出には抗ｐＳ６Ｋウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、Ｓ６キナーゼ検出のコントロール実験においては抗Ｓ６Ｋウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いた。リン酸化ＭＡＰキナーゼの検出には抗ｐＥＲＫウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用い、ＭＡＰキナーゼ検出のコントロール実験においては抗ＥＲＫウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。
その結果、ロイヤラクチンは、ショウジョウバエ由来ＥＧＦＲおよびミツバチ由来ＥＧＦＲの両方に作用し、ＥＧＦＲのリン酸化、ＭＡＰキナーゼのリン酸化、および、Ｓ６キナーゼのリン酸化をもたらすことが判明した。
（実施例２−６：ローヤルゼリーが野生型ショウジョウバエの幼若ホルモン分泌及びエクダイソン分泌に及ぼす影響）
ミツバチを含む社会性昆虫は、幼若ホルモンにより女王個体へと分化する。そこで、ショウジョウバエの幼若ホルモンやエクダイソンがローヤルゼリーによりどのような影響を受けているかどうかについて検討した。孵化後２−５日後の野生型ショウジョウバエの幼虫を回収し、ヘキサンで２回抽出の後、真空乾燥させ、メタノールに溶解さた。サンプル中の幼若ホルモンは、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＭＳ １５０−４．６（４．６×１５０ｍｍ）を備えた高分解能を有すＬＣ−ＭＳ、ｍｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて定量した。一方、エクダイソン定量は、抗ウサギＩｇＧ抗体をコートしてある９６穴プレート（コスモバイオ）にサンプル或いは標準液５０μｌ、ＨＲＰ標識エクダイソン（コスモバイオ）５０μｌ、抗エクダイソン抗体（コスモバイオ）５０μｌを添加し、室温で３時間静置する。その後、ＰＢＳで３回洗浄の後、ｏ−フェニレンジアミン溶液で発色させ、４９２ｎｍの吸光度を測定することでエクダイソンを定量した。その結果、ローヤルゼリーの摂取により、ショウジョウバエの孵化後４日目に著しく幼弱ホルモンが増加し、孵化後３日目にエクダイソンが増加していた。また、ロイヤラクチン形質転換体においても分析したところ、ｐｐｌ＞ＲがＵＡＳ−Ｒに比べ、孵化後４日目に幼弱ホルモンが、孵化後３日目にエクダイソンが同様に増加していた。更に、各種変異体を対象に同様の試験を行った結果、幼若ホルモン、及びエクダイソンの分泌には、脂肪体のＥＧＦＲが関与していることが明らかとなった。
（実施例２−７：ロイヤラクチンシグナルの伝達：遺伝子発現の誘導）
これまでに報告のある発生に関与する遺伝子３８個（Ｗｎｔシグナル関連遺伝子として、ｗｎｔ−１、ｗｎｔ−２、ｗｎｔ−４、ｗｎｔ−５、ｗｎｔ−１０、ｗｎ、ｈｈ、ｄｐｐ、ｓａｌ、Ｕｂｘ、ｖｇ／ｓｄ、および、ｅｘｄ；ＪＨ関連遺伝子として、ＪＨＡＭＥＴ、および、Ｍｅｔ；卵黄形成関連遺伝子として、ｙｐ−１、ｙｐ−２、および、ｙｐ−３；エクダイソンシグナル関連遺伝子として、ＥｃＲ、ＵＳＰ、ＤＨＲ３、ＤＨＲ４、ＢＲ−Ｃ、Ｅ７４Ａ、Ｅ７４Ｂ、Ｅ７５Ａ、Ｅ７５Ｂ、ＦＴＺ−Ｆ１、ＤＨＲ３８、Ｅ７８Ｃ、ｄｉｂ、および、ｐｈｍ；ＥＧＦＲシグナル関連遺伝子として、ＥＧＦＲ、Ｓｐｉｔｚ、および、Ｇｒｕｋｅｎ；ならびに、インスリンシグナル関連遺伝子として、ＩｎＲ、Ｉｌ−１、Ｉｌ−２、および、Ｉｌ−３）について、幼虫期の発現変動をリアルタイムＰＣＲを用いて解析した。その結果、孵化後４日目にｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル（ｗｎｔ１，ｗｎｔ２，ｅｎ，ｈｈ）、エクダイソンレセプターシグナル（ＤＨＲ３８，Ｅ７８Ｃ）、幼弱ホルモン（ＪＨ）関連因子（ＪＨＡＭＥＴ（ＪＨ合成酵素），ｍｅｔ（ＪＨ受容体））、卵黄形成（ｙｐ−１，ｙｐ−２，ｙｐ−３）の遺伝子発現がローヤルゼリーにより上昇した。さらに、孵化後３日目にエクダイソン合成に関与するｄｉｂ，ｐｈｍの遺伝子発現がローヤルゼリーにより上昇した。これらの結果はホルモンの動態とよく一致していた。次に、発現変動が見られた因子の変異体を対象とした、ローヤルゼリー含有培地による飼育試験の結果から、ローヤルゼリーによる体サイズの増加には、ｗｎｔ１とｍｅｔが関与していることが新たに明らかとなった。さらに、ＥＧＦＲ、ｗｎｔ１、ｍｅｔとの関係を調べた結果、ロイヤラクチンが脂肪体のＥＧＦＲに作用した後、その下流でＪＨが分泌され、ｍｅｔ（ＪＨ受容体）に作用し、その下流で脂肪体のｗｎｔ１の発現が増加され、体サイズの増加や産卵数の増加に関与していることが明らかとなった。
（実施例２−８：ローヤルゼリーによるショウジョウバエの羽化までの発生に要する時間の変化）
ミツバチのカースト分化において女王蜂は働き蜂より早く羽化する特徴をもつ。この変化は、ショウジョウバエをローヤルゼリー含有培地で飼育した場合にも見られる。実施例２−７においてローヤルゼリーによる発現変動が見られる因子のうち、この表現型の変化に関与する因子を調べた。その結果、唾腺でのＤＨＲ３８の発現増加がローヤルゼリーによるショウジョウバエの体サイズの増加には関与せず、羽化までの発生に要する時間の短縮に関与していることが分かった。さらに、脂肪体でのＥＧＦＲの変異体では、この唾腺でのＤＨＲ３８の発現誘導と孵化後３日目にエクダイソンの分泌が抑制されていた。同様の結果が、ロイヤラクチンを脂肪体で強制発現させた系統であるｐｐｌ＞Ｒでも観察された。これらの結果から、ロイヤラクチンが脂肪体のＥＧＦＲに作用した後、エクダイソンの分泌を促進させ、エクダイソンにより発現が誘導されるＤＨＲ３８の唾腺での発現を誘導し、羽化までの発生に要する時間を短縮させたものと判断された。
（実施例２−９：ミツバチのＲＮＡｉ試験）
ミツバチ由来ａｍＩｎＲ(インスリン受容体)、ａｍＥＧＦＲ、ａｍｗｎｔ１、ａｍＳ６Ｋ、ａｍＨＲ３８とＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のｃDNAを鋳型としてＬＡ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いてPCRを行い、末端にＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒのついた断片を増幅させた。使用したプライマーは、以下のとおりである：
ａｍＩｎＲ-Ｔ７フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＣＧ−３’（配列番号１３）、
ａｍＩｎＲ−Ｔ７リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＡＧＡＴＴＣＧＴＴＧ−３’（配列番号１４）、
ａｍＥＧＦＲ−Ｔ７フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＡＣＡＧＴＧＣＧＡＡＧＡＣＧＡＡ−３’（配列番号１５）、
ａｍＥＧＦＲ−Ｔ７リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＴＡ−３’（配列番号１６）、
ａｍｗｎｔ１−Ｔ７フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＧＡＴＴＧＣＡＴＴＣＧＡＴＣＧＴＣＡ−３’（配列番号１７）、
ａｍｗｎｔ１−Ｔ７リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＡＣＣＧＴＡＧＣＣＧＡＴＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１８）、
ａｍＳ６Ｋ−Ｔ７フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＡＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１９）、
ａｍＳ６Ｋ−Ｔ７リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＧＣＡＴＡＴＴＧＣＣＴＣ−３’（配列番号２０）、
ａｍＨＲ３８−Ｔ７フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＴＧＡＧＧＡＣＧＧＡＴＴＣＣＴＴＧＡＡ−３’（配列番号２１）、
ａｍＨＲ３８−Ｔ７リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＣＴＡＣＧＣＴＧＡＣＡＣＴＧＴＴＣＣＡ−３’（配列番号２２）、
ＧＦＰ−Ｔ７フォワードプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＧＴＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣ−３’（配列番号２３）、
ＧＦＰ−Ｔ７リバースプライマー：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＣＧ−３’（配列番号２４）。
次にこの断片を鋳型として、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ＲＮＡｉ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてｄｓＲＮＡを合成させる。幼虫飼育の培地に１５０μｇ／ｍｌの濃度でｄｓＲＮＡを添加し、孵化後２日目、３日目の幼虫に投与した（ａｍＨＲ３８は孵化後２−４日目の間投与した）。尚、ＧＦＰは核酸添加のための影響がないかを確認するためのネガティブコントロールとして用いた。ミツバチにおけるＲＮＡｉ飼育試験においては、核酸の影響は見られなったので、ＧＦＰ培地は、女王蜂に分化する培地となる。ＲＮＡｉの確認はリアルタイムＰＣＲにより行った。使用したプライマーは、以下のとおりである：
アクチンフォワードプライマー：５’−ＴＧＣＣＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号９）、
アクチンリバースプライマー：５’−ＡＧＡＡＴＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＡＴＣＣＡ−３’（配列番号１０）、
ａｍＩｎＲ−フォワードプライマー：５’−ＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＴＧＣＣＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号２５）、
ａｍＩｎＲ−リバースプライマー：５’−ＴＡＧＴＣＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＣＴＴ−３’（配列番号２６）、
ａｍＥＧＦＲ−フォワードプライマー：５’−ＣＡＡＣＧＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号２７）、
ａｍＥＧＦＲ−リバースプライマー：５’−ＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＡ−３’（配列番号２８）、
ａｍｗｎｔ１−フォワードプライマー：５’−ＧＣＧＡＡＣＧＴＧＧＴＣＧＡＡＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号２９）、
ａｍｗｎｔ１−リバースプライマー：５’−ＣＧＧＡＣＡＴＧＣＣＧＴＧＡＣＡＣＴＴ−３’（配列番号３０）、
ａｍＳ６Ｋ−フォワードプライマー：５’−ＧＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＴＣＧＴＡＧＡＣＣＴＴＡＴＧ−３’（配列番号３１）、
ａｍＳ６Ｋ−リバースプライマー：５’−ＣＧＡＴＡＧＡＴＡＧＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号３２）、
ａｍＨＲ３８−フォワードプライマー：５’−ＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴ−３’（配列番号３３）、
ａｍＨＲ３８−リバースプライマー：５’−ＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴ−３’（配列番号３４）。
まず、ａｍＩｎＲ、ａｍＥＧＦＲ、ａｍｗｎｔ１、ａｍＳ６Ｋ、ａｍＨＲ３８のそれぞれのＲＮＡｉ個体において各遺伝子の発現抑制を確認した。次に、ＲＮＡｉがミツバチの羽化までの発生に要する期間、羽化時の成体の重量、卵巣のサイズに及ぼす影響を調べた。その結果、ネガティブコントロールとして使用したＧＦＰに比べ、ａｍＩｎＲとのＲＮＡｉでは、羽化までの発生に要する期間、羽化時の成体の重量、卵巣のサイズに変化が見られなった（図３ａ−ｃ）。一方、ａｍＥＧＦＲ、ａｍｗｎｔ１及びａｍＳ６ＫのＲＮＡｉにおいては、ＧＦＰに比べ、羽化時の成体の重量、卵巣のサイズの減少が見られた（図３ｂ、ｃ）。ａｍＨＲ３８のＲＮＡｉでは、ＧＦＰに比べ、羽化時の成体の重量、卵巣のサイズに差が見られなかった（図３ｂ、ｃ）。また、ａｍＥＧＦＲ及びａｍＨＲ３８のＲＮＡｉにおいては、ＧＦＰに比べ羽化までの発生に要する期間に差が見られず、ａｍｗｎｔ１及びａｍＳ６ＫのＲＮＡｉにおいては、ＧＦＰに比べ羽化までの発生に要する期間が増加していた（図３ａ）。さらに、ａｍＥＧＦＲのＲＮＡｉによりａｍｗｎｔ１及びａｍＨＲ３８の発現抑制が見られ、ロイヤラクチンで飼育したミツバチ個体（女王蜂）のＥＧＦＲシグナルの活性化（ＥＧＦＲのリン酸化、ＭＡＰキナーゼの活性化、Ｓ６キナーゼの活性化）も確認された。これらの結果から、女王蜂分化において、体サイズの増加や産卵機能の発達に関しては、ロイヤラクチンがａｍＥＧＦＲに作用し、その下流でａｍｗｎｔ１、ａｍＳ６Ｋが関与する。一方、羽化までの発生に要する期間の短縮には、ロイヤラクチンがａｍＥＧＦＲに作用し、その下流でａｍＨＲ３８が関与していることが明らかとなった。以上の結果は、ショウジョウバエのローヤルゼリー含有培地で飼育したときの結果と一致していた。従って、ショウジョウバエにおいてもミツバチにおいても、ローヤルゼリー或いはロイヤラクチンによる体サイズの増加、産卵数の増加などの表現型の変化は、ＩｎＲシグナルではなく、ＥＧＦＲシグナルが中心的な役割を果たしていることが明らかとなった。
（実施例２−１０：変異ロイヤラクチンの評価）
ロイヤラクチンに種々の変異を導入し、野生型ロイヤラクチンと同等の活性を有する変異体を得ることが可能である。変異ロイヤラクチンの活性は、例えば、以下の方法によって評価することができる。
（１：ＭＡＰキナーゼ、または、Ｓ６キナーゼのリン酸化を指標とする評価）
実施例２−５において実証したように、ロイヤラクチンは、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲをリン酸化する。ＥＧＦＲリン酸化の後、ＥＧＦＲの下流にあるＭＡＰキナーゼおよびＳ６キナーゼもまたリン酸化される。そのため、実施例２−５に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲ、ＭＡＰキナーゼ、または、Ｓ６キナーゼのいずれかのリン酸化を指標として、変異ロイヤラクチンが野生型ロイヤラクチンと同様の活性を保持するか否かを決定することができる。
ミツバチの幼虫または組織分解物、ショウジョウバエの幼虫または組織分解物、Ｓ２細胞などをリン酸化アッセイ用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ βグリセロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、および、３μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡ）に溶解させ、氷中３０分放置する。さらに１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心してその上清をキナーゼアッセイに用いる。組織または細胞の懸濁液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて供した後、タンパク質をセルロースメンブランにトランスファーさせる。メンブランは一次抗体として抗ｐＳ６Ｋウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｓ６Ｋウサギ抗体（Ａｂｃａｍ）、抗ｐＥＲＫウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥＲＫウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と１時間反応させ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄ののち、二次抗体アルカリフォスファターゼＩｇＧでと１時間反応させる。ＰＢＳＴで３回洗浄の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色させる。
（２：ＥＧＦＲのリン酸化を指標とする評価）
実施例２−５において実証したように、ロイヤラクチンは、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲをリン酸化する。そのため、以下に記載の方法を用いて、ＥＧＦＲのリン酸化を指標として、変異ロイヤラクチンが野生型ロイヤラクチンと同様の活性を保持するか否かを決定することができる。
ミツバチの幼虫または組織分解物、ショウジョウバエの幼虫または組織分解物、Ｓ２細胞などをリン酸化アッセイ用緩衝液に溶解させ、氷中３０分放置する。さらに１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心してその上清をＥＧＦＲリン酸化アッセイに用いる。組織または細胞を懸濁した溶液２００μｌに抗ＥＧＦＲウサギ抗体（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）１０μｌを入れ、４℃で３時間ローテーターで攪拌する。プロテインＡアガロースビーズ（５０％）懸濁液６０μｌを入れ、さらに４℃で一晩攪拌する。次に、リン酸化アッセイ用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＮａＦ、５ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭ βグリセロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、および、３μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡ）で３回洗浄の後、２ｘＳＤＳ緩衝液（１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ ＳＤＳ ２０％グリセロール、０．０１％ＢＰＢ）を３０μｌ添加し、９５℃で５分反応させ、遠心（５０００ｒｐｍ、２分）し、上清をウエスタンブロットで分析する。一次抗体として抗ＥＧＦＲウサギ抗体（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）と抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（ＧＥヘルスケア）を用いることでＥＧＦＲのリン酸化を測定する。
（３：ＥＧＦＲのインターナリゼーションを指標とする評価）
実施例２−４において実証したように、ロイヤラクチンは、ＥＧＦＲに結合し、ＥＧＦＲをリン酸化する。リン酸化されたＥＧＦＲはインターナリゼーションされることから、ＥＧＦＲのインターナリゼーションを指標として、変異ロイヤラクチンが野生型ロイヤラクチンと同様の活性を保持するか否かを決定することができる。
ミツバチの幼虫または組織分解物、ショウジョウバエの幼虫または組織分解物、Ｓ２細胞などをリン酸化アッセイ用緩衝液に溶解させ、氷中３０分放置する。さらに１５０００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心してその上清をＥＧＦＲインターナリゼーションアッセイに用いる。組織または細胞を懸濁した溶液を一次抗体として抗ＥＧＦＲウサギ抗体（ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）用いたウエスタンブロットで分析する。ＥＧＦＲのバンド強度の測定によりＥＧＦＲの相対量を比較することでＥＧＦＲのインターナリゼーションを測定する。また、Ｓ２細胞などの細胞を用いたときは、ＥＧＦＲ−ＧＦＰ、ＥＧＦＲ−ＹＦＰ或いはＥＧＦＲ−ＣＦＰなどを細胞に発現させ、ＧＦＰ、ＹＦＰ或いはＣＦＰの蛍光強度を共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０）などで顕微鏡観察し、それら蛍光強度すなわちＥＧＦＲの発現量の相対量を比較することでＥＧＦＲのインターナリゼーションを測定する。
（４：ＬＳＭでの解析を指標とする評価）
上記（１）〜（３）ではウェスタンブロットを用いたが、ウェスタンブロットに替えて、共焦点レーザー顕微鏡を用いることも可能である。孵化後２〜６日後のショウジョウバエまたはミツバチの幼虫を回収し、目的の組織を摘出の後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、一次抗体で１時間処理後、０．０２％ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄し、二次抗体で１時間反応させる。さらに、ＰＢＳＴで洗浄した後、スライドガラスにマウントして共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０）で観察する。一次抗体は、ウエスタンの項で述べたものと同一のものを用いる。二次抗体としては、例えばＴｅｘａｓＲｅｄ−ＩｇＧなどを用いる。また、染色の際、ＦＩＴＣ−ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎなどにより細胞骨格（アクチン）を染色しておくと細胞の発現分布についても解析できる。
ローヤルゼリーと同様の活性を有し、昆虫の分化誘導能および成長刺激能を担う成分であるロイヤラクチンまたはその改変体を用いることによる昆虫の分化および成長の制御法およびそのための組成物が提供される。
配列番号１：ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のロイヤラクチンの核酸配列
配列番号２：ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のロイヤラクチンのアミノ酸配列
配列番号３：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ａの核酸配列
配列番号４：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ａのアミノ酸配列
配列番号５：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ｂの核酸配列
配列番号６：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ｂのアミノ酸配列
配列番号７：ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＥＧＦＲの核酸配列
配列番号８：ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＥＧＦＲのアミノ酸配列
配列番号９：アクチンフォワードプライマー
配列番号１０：アクチンリバースプライマー
配列番号１１：ビテロゲニンフォワードプライマー
配列番号１２：ビテロゲニンリバースプライマー
配列番号１３：ａｍＩｎＲ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号１４：ａｍＩｎＲ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号１５：ａｍＥＧＦＲ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号１６：ａｍＥＧＦＲ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号１７：ａｍｗｎｔ１-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号１８：ａｍｗｎｔ１-Ｔ７リバースプライマー
配列番号１９：ａｍＳ６Ｋ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号２０：ａｍＳ６Ｋ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号２１：ａｍＨＲ３８-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号２２：ａｍＨＲ３８-Ｔ７リバースプライマー
配列番号２３：ＧＦＰ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号２４：ＧＦＰ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号２５：ａｍＩｎＲ-フォワードプライマー
配列番号２６：ａｍＩｎＲ-リバースプライマー
配列番号２７：ａｍＥＧＦＲ-フォワードプライマー
配列番号２８：ａｍＥＧＦＲ-リバースプライマー
配列番号２９：ａｍｗｎｔ１-フォワードプライマー
配列番号３０：ａｍｗｎｔ１-リバースプライマー
配列番号３１：ａｍＳ６Ｋ-フォワードプライマー
配列番号３２：ａｍＳ６Ｋ-リバースプライマー
配列番号３３：ａｍＨＲ３８-フォワードプライマー
配列番号３４：ａｍＨＲ３８-リバースプライマー
配列番号２：ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のロイヤラクチンのアミノ酸配列
配列番号３：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ａの核酸配列
配列番号４：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ａのアミノ酸配列
配列番号５：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ｂの核酸配列
配列番号６：ショウジョウバエＥＧＦＲ−Ｂのアミノ酸配列
配列番号７：ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＥＧＦＲの核酸配列
配列番号８：ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）ＥＧＦＲのアミノ酸配列
配列番号９：アクチンフォワードプライマー
配列番号１０：アクチンリバースプライマー
配列番号１１：ビテロゲニンフォワードプライマー
配列番号１２：ビテロゲニンリバースプライマー
配列番号１３：ａｍＩｎＲ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号１４：ａｍＩｎＲ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号１５：ａｍＥＧＦＲ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号１６：ａｍＥＧＦＲ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号１７：ａｍｗｎｔ１-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号１８：ａｍｗｎｔ１-Ｔ７リバースプライマー
配列番号１９：ａｍＳ６Ｋ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号２０：ａｍＳ６Ｋ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号２１：ａｍＨＲ３８-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号２２：ａｍＨＲ３８-Ｔ７リバースプライマー
配列番号２３：ＧＦＰ-Ｔ７フォワードプライマー
配列番号２４：ＧＦＰ-Ｔ７リバースプライマー
配列番号２５：ａｍＩｎＲ-フォワードプライマー
配列番号２６：ａｍＩｎＲ-リバースプライマー
配列番号２７：ａｍＥＧＦＲ-フォワードプライマー
配列番号２８：ａｍＥＧＦＲ-リバースプライマー
配列番号２９：ａｍｗｎｔ１-フォワードプライマー
配列番号３０：ａｍｗｎｔ１-リバースプライマー
配列番号３１：ａｍＳ６Ｋ-フォワードプライマー
配列番号３２：ａｍＳ６Ｋ-リバースプライマー
配列番号３３：ａｍＨＲ３８-フォワードプライマー
配列番号３４：ａｍＨＲ３８-リバースプライマー
Claims (16)
- 雌性の内翅群昆虫の分化および成長を促進する方法であって、該方法は、（ｉ）該雌性昆虫の幼虫にロイヤラクチンまたはその改変体を投与する工程、を包含し、ここで、該ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、方法。 - 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、方法。 - 前記ロイヤラクチンまたはその改変体が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
- 前記ＥＧＦＲが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記昆虫が双翅目昆虫または膜翅目昆虫である、請求項１に記載の方法。
- 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の昆虫またはＡｐｉｓ属の昆虫である、請求項５に記載の方法。
- 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａである、請求項６に記載の方法。
- 前記雌性の内翅群昆虫の分化および成長の促進が、羽化までの発生に要する時間の減少、羽化時の成体の重量の増加、卵巣サイズの増大、卵巣あたりの卵巣小管数の増加、幼若ホルモンの分泌の増加、ビテロゲニン発現の増加、女王蜂への分化、体長の伸長、体重の増加、翅の面積の増大、蛹サイズの増大、および、産卵数の増加、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 雌性の内翅群昆虫の分化および成長を促進するための組成物であって、該組成物はロイヤラクチンまたはその改変体を含有し、ここで、該ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲに対する結合活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのインターナリゼーションを促進する活性、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＭＡＰキナーゼのリン酸化を促進する活性、および、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＳ６キナーゼのリン酸化を促進する活性、からなる群から選択される活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、組成物。 - 請求項９に記載の組成物であって、ここで、前記ロイヤラクチンまたはその改変体が、以下：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１または数個の欠失、置換、または付加を含むポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；ならびに、
（ｆ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドであって、ＥＧＦＲを発現する細胞に適用した場合にＥＧＦＲのリン酸化を促進する活性を有するポリペプチド；
からなる群から選択される、組成物。 - 前記ロイヤラクチンまたはその改変体が配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項９に記載の組成物。
- 前記ＥＧＦＲが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
- 前記昆虫が双翅目昆虫または膜翅目昆虫である、請求項９に記載の組成物。
- 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の昆虫またはＡｐｉｓ属の昆虫である、請求項１３に記載の組成物。
- 前記昆虫がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒまたはＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａである、請求項１４に記載の組成物。
- 前記雌性の内翅群昆虫の分化および成長の促進が、羽化までの発生に要する時間の減少、羽化時の成体の重量の増加、卵巣サイズの増大、卵巣あたりの卵巣小管数の増加、幼若ホルモンの分泌の増加、ビテロゲニン発現の増加、女王蜂への分化、体長の伸長、体重の増加、翅の面積の増大、蛹サイズの増大、および、産卵数の増加、からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
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