JP2011120536A - Method for detecting microorganism - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微生物検出方法に関する。 The present invention relates to a microorganism detection method.
ＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）とは、蛍光標識したプローブを、標的微生物のみに反応させることで、標的微生物のみを蛍光染色する手法であり、自然界の微生物研究の多くに活用されている。しかし、ＦＩＳＨ法において標的微生物の捕集に用いられるメンブレンフィルタ、特にポリカーボネートフィルタは、非常に薄く、波打ちやすい。そのため、メンブレンフィルタは、標本の調整中に平坦性が失われてしまうことがある。そして、ステージの移動が自動化された顕微鏡では、メンブレンフィルタの平坦性が失われると、視野の移動ごとにメンブレンフィルタの起伏に応じてフォーカスを合わせなければならないので、観察に余分な時間がかかる。
そのため、このような課題を解消する発明として、下記特許文献１には、平坦な標本を作製することができる微生物検出方法が開示されている。この微生物検出方法は、平坦な基材上に粘着層が積層された捕集シートで微生物を捕集し、当該捕集シート上の微生物を観察する。
The FISH method (fluorescence in situ hybridization) is a technique for fluorescently staining only a target microorganism by reacting a fluorescently labeled probe only with the target microorganism, and is used in many microorganism researches in the natural world. However, a membrane filter used for collecting a target microorganism in the FISH method, particularly a polycarbonate filter, is very thin and easily corrugated. Therefore, the flatness of the membrane filter may be lost during sample preparation. In the microscope in which the movement of the stage is automated, if the flatness of the membrane filter is lost, the focus must be adjusted according to the undulation of the membrane filter every time the field of view moves, so that extra time is required for observation.
Therefore, as an invention for solving such a problem, the following Patent Document 1 discloses a microorganism detection method capable of producing a flat specimen. In this microorganism detection method, microorganisms are collected by a collection sheet in which an adhesive layer is laminated on a flat substrate, and the microorganisms on the collection sheet are observed.
ところで、上記特許文献１では、平坦な基材上に粘着層が積層された捕集シートで標的微生物を捕集し、顕微鏡で捕集シート上の微生物を観察する。しかしながら、上記特許文献１では、試料中の微生物をもれなく採取するには、試料中の全ての微生物を粘着層に付着させなければならないが、全ての微生物を粘着層に付着させることは極めて困難である。そして、上記特許文献１では、微生物をもれなく捕集することが困難であるので、試料中に含まれる微生物を定量することがむずかしい。 By the way, in the said patent document 1, target microorganisms are collected with the collection sheet | seat on which the adhesion layer was laminated | stacked on the flat base material, and the microorganisms on a collection sheet | seat are observed with a microscope. However, in Patent Document 1, in order to collect all the microorganisms in the sample, all the microorganisms in the sample must be attached to the adhesive layer, but it is extremely difficult to attach all the microorganisms to the adhesive layer. is there. And in the said patent document 1, since it is difficult to collect all microorganisms, it is difficult to quantify the microorganisms contained in a sample.
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、微生物をもれなく採取するとともに微生物の含まれる標本を平坦化することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and an object thereof is to collect all microorganisms and to flatten a specimen containing microorganisms.
上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、ろ過によりフィルタで試料中の微生物を捕集し、当該フィルタから微生物を検出する微生物検出方法であって、微生物の捕集面を上にした状態でフィルタを広げて平面板に載せ、親水性かつ揮発性の溶媒を水性マウント剤に混合したマウント液を前記フィルタに塗布し、その後に前記溶媒を揮発させる平坦化工程を具備するという手段を採用する。 In order to achieve the above object, in the present invention, as a first solving means related to a microorganism detection method, a microorganism detection method for collecting microorganisms in a sample with a filter by filtration and detecting the microorganisms from the filter is provided. The filter is spread with the surface of the microorganisms facing up and placed on a flat plate, and a mounting solution in which a hydrophilic and volatile solvent is mixed with an aqueous mounting agent is applied to the filter, and then the solvent is volatilized. A means of providing a flattening step is adopted.
本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記溶媒は、アルコールであるという手段を採用する。 In the present invention, as the second solving means relating to the microorganism detection method, in the first solving means, means that the solvent is alcohol is adopted.
本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記溶媒は、エタノールまたはイソプロパノールであるという手段を採用する。 In the present invention, as the third solving means relating to the microorganism detection method, in the second solving means, a means is adopted in which the solvent is ethanol or isopropanol.
本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第１〜第３のいずれかの解決手段において、前記マウント剤に対して１０倍の容量の溶媒を混合するという手段を採用する。 In the present invention, as a fourth solving means relating to the microorganism detection method, a means of mixing 10 times the volume of the solvent with respect to the mounting agent in any one of the first to third solving means is adopted. .
本発明では、微生物検出方法に係る第５の解決手段として、上記第１〜第４のいずれかの解決手段において、前記溶媒が揮発した後の前記フィルタに、イマージョンオイルを親油性の第２の溶媒で希釈したイマージョンオイル希釈液を塗布する液浸工程を具備するという手段を採用する。 In the present invention, as a fifth solving means related to the microorganism detection method, in any one of the first to fourth solving means, immersion oil is added to the filter after the solvent has volatilized. A means is provided that includes a liquid immersion step of applying an immersion oil diluted solution diluted with a solvent.
本発明では、微生物検出方法に係る第６の解決手段として、上記第５の解決手段において、前記第２の溶媒は、キシレンであるという手段を採用する。 In the present invention, as a sixth solving means relating to the microorganism detecting method, in the fifth solving means, a means is adopted in which the second solvent is xylene.
本発明では、微生物検出方法に係る第７の解決手段として、上記第５または第６の解決手段において、前記イマージョンオイルを第２の溶媒で１０倍に希釈するという手段を採用する。 In the present invention, as the seventh solving means relating to the microorganism detection method, means for diluting the immersion oil 10 times with the second solvent in the fifth or sixth solving means is adopted.
本発明によれば、エタノールの混合されたマウント液は液状になるので、マウント液が塗布されたフィルタは、平面板に均一に広がった状態で貼り付く。その後にエタノールが揮発すると、フィルタは、平面板に完全に密着する。そして、フィルタは、平面板に完全に密着することで、平坦化される。このように、本発明は、ろ過により微生物を捕集したフィルタを平坦化することで、微生物をもれなく採取するとともに微生物の含まれる標本を平坦化することができる。これにより、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がないので、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。 According to the present invention, since the mounting liquid mixed with ethanol is in a liquid state, the filter to which the mounting liquid is applied sticks to the flat plate in a state of being spread uniformly. If ethanol volatilizes after that, a filter will stick to a plane board completely. And a filter is planarized by sticking to a plane board completely. As described above, the present invention can flatten a filter that collects microorganisms by filtration, thereby collecting all the microorganisms and flattening a specimen containing the microorganisms. Thereby, since it is not necessary to adjust the focus every time the field of view of the fluorescence microscope is moved, it is possible to reduce the extra time generated during observation.
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
本実施形態に係るレジオネラ菌検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて試料からレジオネラ菌を検出する方法であり、以下に説明するように第１〜第１２の工程を有するものである。また、これら第１〜第１２の工程のうち、第９の工程は、本実施形態における平坦化工程である。また、第１０の工程は、本実施形態における液浸工程である。
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
The Legionella detection method according to the present embodiment is a method for detecting Legionella from a sample using the FISH method, and includes first to twelfth steps as described below. Of these first to twelfth steps, the ninth step is a planarization step in the present embodiment. The tenth step is a liquid immersion step in the present embodiment.
レジオネラ菌検出方法について、図１を参照して、説明する。
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、レジオネラ菌を含む液体試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することでレジオネラ菌の固定標本を作製する（ステップＳ１）。
〔第２の工程〕
上記第１の工程が終了すると、次に第２の工程において、上記液体試料をろ過装置によってろ過することで、レジオネラ菌の固定標本をメンブレンフィルタ上に捕集する（ステップＳ２）。なお、上記メンブレンフィルタは、直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。そして、このメンブレンフィルタの中心部の直径１６ｍｍの円形領域が、ろ過に使用される。
〔第３の工程〕
上記第２の工程が終了すると、次に第３の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ３）。
The Legionella detection method will be described with reference to FIG.
[First step]
First, in a first step, a paraformaldehyde solution is added to a liquid sample containing Legionella bacteria so that the final concentration is 4%, and the liquid sample is stored overnight at a temperature of 4 ° C. A fixed specimen of the bacterium is prepared (step S1).
[Second step]
When the first step is finished, in the second step, the liquid sample is filtered by a filtration device, thereby collecting a fixed sample of Legionella on a membrane filter (step S2). The membrane filter is a polycarbonate filter having a circular shape with a diameter of 25 mm and a pore diameter of 0.22 μm. And the circular area | region with a diameter of 16 mm of the center part of this membrane filter is used for filtration.
[Third step]
When the second step is completed, in the third step, the membrane filter is dehydrated by placing it in 99.5% ethanol for 1 minute, and then dried in air at room temperature (step S3).
〔第４の工程〕
上記第３の工程が終了すると、次に第４の工程において、上記メンブレンフィルタを約４０℃の０．１％の寒天溶液に浸し、その後に当該メンブレンフィルタを気泡の入らないようにスライドガラス上に貼り付け、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ４）。このようにすることで、レジオネラ菌の固定標本がメンブレンフィルからはがれないようにすることができる。
〔第５の工程〕
上記第４の工程が終了すると、次に第５の工程において、上記メンブレンフィルタをスライドガラスからはがし、その後に当該メンブレンフィルタの全面にハイブリダイゼーションバッファを塗布する（ステップＳ５）。なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。
[Fourth step]
When the third step is completed, in the fourth step, the membrane filter is immersed in a 0.1% agar solution at about 40 ° C., and then the membrane filter is placed on a slide glass so that bubbles do not enter. And then dried in air at room temperature (step S4). By doing so, it is possible to prevent the fixed specimen of Legionella from peeling off the membrane fill.
[Fifth step]
When the fourth step is completed, in the fifth step, the membrane filter is peeled off from the slide glass, and then a hybridization buffer is applied to the entire surface of the membrane filter (step S5). The hybridization buffer is composed of 0.9% NaCl, 20 mM Tris-Cl, 35% formamide, 2% Blocking reagent, and 0.02% SDS (Sodium Dodecyl sulphate: surfactant). is there.
〔第６の工程〕
上記第５の工程が終了すると、次に第６の工程において、上記メンブレンフィルタ上のレジオネラ菌にプローブを結合させる（ステップＳ６）。第６の工程を具体的に説明すると、まずレジオネラ菌用プローブ溶液の入ったマイクロチューブに上記メンブレンフィルタを入れる。そして、振とう機を使ってマイクロチューブを４６℃の温度下で、約２時間振とうさせる。これにより、レジオネラ菌に対するプローブの結合が促進され、時間の経過とともにレジオネラ菌とプローブとが結合する。なお、プローブとは、標的微生物であるレジオネラ菌の核酸（多くの場合においてリボソームＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid））に対して相補的なポリヌクレオチドに蛍光色素を共有結合したものである。
[Sixth step]
When the fifth step is finished, in the sixth step, a probe is bound to Legionella on the membrane filter (step S6). The sixth step will be specifically described. First, the membrane filter is put in a microtube containing a probe solution for Legionella bacteria. Then, the microtube is shaken at a temperature of 46 ° C. for about 2 hours using a shaker. Thereby, the coupling | bonding of the probe with Legionella is accelerated | stimulated, and Legionella and a probe couple | bond together with progress of time. The probe is a probe in which a fluorescent dye is covalently bonded to a polynucleotide complementary to the nucleic acid of Legionella, which is a target microorganism (in many cases, ribosome RNA (ribosome RNA)).
〔第７の工程〕
上記第６の工程が終了すると、次に第７の工程において、上記メンブレンフィルタをウォッシングバッファに浸し、メンブレンフィルタ上の未反応のプローブを洗浄する。（ステップＳ７）。
〔第８の工程〕
上記第７の工程が終了すると、次に第８の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることでメンブレンフィルタを脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ８）。
[Seventh step]
When the sixth step is completed, in the seventh step, the membrane filter is immersed in a washing buffer, and unreacted probes on the membrane filter are washed. (Step S7).
[Eighth step]
When the seventh step is completed, in the eighth step, the membrane filter is dehydrated by placing the membrane filter in 99.5% ethanol for 1 minute, and then dried in air at room temperature (step) S8).
〔第９の工程（平坦化工程）〕
上記第８の工程が終了すると、次に第９の工程において、微生物の捕集面を上にした状態でメンブレンフィルタを広げて平行平面基板（平面板）に載せ、水性マウント剤に対して１０倍の容量のエタノールを混合したマウント液をマイクロピペットで滴下することで上記メンブレンフィルタに塗布し、その後に常温の空気中で乾燥させることでエタノールを揮発させる（ステップＳ９）。例えば、上記水性マウント剤として、ＣｉｔｉＦｌｕｏｒ、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ、グリセロール液などがある。また、マウント液の溶媒としてエタノールを使用したのは、親水性、揮発性、観察の邪魔になる影響をメンブレンフィルタ及びレジオネア菌に与えないという特徴を持っているからである。
[Ninth step (flattening step)]
When the eighth step is completed, in the ninth step, the membrane filter is spread and placed on a parallel flat substrate (planar plate) with the microorganism collection surface facing upward, and 10 A mounting solution mixed with double the volume of ethanol is dropped onto the membrane filter by a micropipette, and then ethanol is volatilized by drying in air at room temperature (step S9). For example, examples of the aqueous mounting agent include CitiFluor, VectaShield, and glycerol solution. Further, the reason why ethanol is used as a solvent for the mounting solution is that it has hydrophilicity, volatility, and a characteristic that it does not interfere with observation on the membrane filter and Legionaire.
そして、このようなマウント剤及びエタノールからなるマウント液は、純粋なマウント剤よりも粘度が緩和され、液状である。すなわち、マウント液は、純粋なマウント剤よりもメンブレンフィルタへの浸透性が高い。そして、このような液状のマウント液が塗布されたメンブレンフィルタは、平行平面基板に均一に広がった状態で貼り付く。その後にエタノールが揮発すると、図２の（ａ）に示すように、メンブレンフィルタＦｌは、その表面が均一にマウント剤Ｍｎに覆われるとともに平行平面基板Ｆｂに完全に密着する。そして、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着することで、平坦化される。また、エタノールにはメンブレンフィルタを緩める働きがあるので、メンブレンフィルタは、エタノールが揮発した際に縮まって平行平面基板Ｆｂへの密着性が高まる。 And the mounting liquid which consists of such a mounting agent and ethanol has a viscosity eased rather than a pure mounting agent, and is a liquid state. That is, the mount liquid has higher permeability to the membrane filter than a pure mount agent. Then, the membrane filter coated with such a liquid mount solution is stuck on the parallel flat substrate in a state of spreading uniformly. Thereafter, when ethanol is volatilized, as shown in FIG. 2A, the surface of the membrane filter Fl is uniformly covered with the mount agent Mn and completely adhered to the parallel flat substrate Fb. The membrane filter is flattened by being completely adhered to the parallel flat substrate. Further, since ethanol has a function of loosening the membrane filter, the membrane filter is contracted when ethanol is volatilized, and adhesion to the parallel flat substrate Fb is increased.
しかし、従来のように純粋なマウント剤をメンブレンフィルタに塗布すると、粘度の高いマウント剤がメンブレンフィルタに十分に浸透しない。このため、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着することができないので、平坦性が失われる。例えば、図２の（ｂ）に示すように、マウント剤Ｍｎが塗布されたメンブレンフィルタＦｌは、平行平面基板Ｆｂ上で波打った状態になる。 However, when a pure mounting agent is applied to the membrane filter as in the past, the mounting agent having a high viscosity does not sufficiently penetrate the membrane filter. For this reason, since the membrane filter cannot completely adhere to the parallel flat substrate, the flatness is lost. For example, as shown in FIG. 2B, the membrane filter Fl to which the mount agent Mn is applied is in a undulated state on the parallel flat substrate Fb.
〔第１０の工程（液浸工程）〕
上記第９の工程が終了すると、次に第１０の工程において、イマージョンオイルをキシレンで１０倍に希釈したイマージョンオイル希釈液をマイクロピペットで上記メンブレンフィルタ上に滴下し、平行平面板を傾けて広げることでメンブレンフィルタ上にイマージョンオイル希釈液を塗布し、その後に常温の空気中で乾燥させる。（ステップＳ１０）。なお、イマージョンオイル希釈液は、キシレンで希釈されているので、イマージョンオイルよりも粘度が緩和され、液状である。そのため、イマージョンオイル希釈液は、メンブレンフィルタ上に均一に広がる。
〔第１１の工程〕
上記第１０の工程が終了すると、次に第１１の工程において、メンブレンフィルタ上にカバーガラスを載せ、カバーガラスのメンブレンフィルタの反対側、すなわち顕微鏡の対物レンズに接する側の面にイマージョンオイルを付着させる（ステップＳ１１）。
[Tenth step (immersion step)]
When the ninth step is completed, in the tenth step, an immersion oil diluted solution obtained by diluting immersion oil 10 times with xylene is dropped on the membrane filter with a micropipette, and the parallel flat plate is inclined and spread. Apply the immersion oil dilution on the membrane filter, and then dry in air at room temperature. (Step S10). In addition, since the immersion oil diluted solution is diluted with xylene, its viscosity is relaxed compared with the immersion oil and is in a liquid state. Therefore, the immersion oil diluted solution spreads uniformly on the membrane filter.
[Eleventh step]
When the above tenth step is completed, in the next eleventh step, a cover glass is placed on the membrane filter, and immersion oil is attached to the surface of the cover glass opposite to the membrane filter, that is, the surface in contact with the objective lens of the microscope. (Step S11).
〔第１２の工程〕
上記第１１の工程が終了すると、次に第１２の工程において、蛍光顕微鏡でメンブレンフィルタ上のレジオネラ菌を検出する（ステップＳ１２）。つまり、蛍光顕微鏡に平行平面基板を取り付け、対物レンズをカバーガラスのイマージョンオイルに接するように配置する。そして、蛍光顕微鏡が波長４９５ｎｍの青色の励起光をメンブレンフィルタに照射すると、レジオネラ菌に結合したプローブが波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発するので、その蛍光を基にレジオネラ菌を検出する。この際、図３に示すように、平行平面基板Fｂ上には、下からメンブレンフィルタFｌ、マウント液Ｍｎ、イマージョンオイル希釈液Ｉｏ１、カバーガラスＣｇ、イマージョンオイルＩｏ２という順番で積み重なっている。そして、顕微鏡の対物レンズＯｌが、図３に示すように、イマージョンオイルＩｏ２に接している。
[Twelfth step]
When the eleventh step is completed, legionella on the membrane filter is detected with a fluorescence microscope in a twelfth step (step S12). That is, a parallel plane substrate is attached to the fluorescence microscope, and the objective lens is disposed so as to be in contact with the immersion oil of the cover glass. When the fluorescent microscope irradiates the membrane filter with blue excitation light having a wavelength of 495 nm, the probe coupled to Legionella emits green fluorescence having a wavelength of 520 nm, and Legionella is detected based on the fluorescence. At this time, as shown in FIG. 3, the membrane filter Fl, the mount liquid Mn, the immersion oil dilution liquid Io1, the cover glass Cg, and the immersion oil Io2 are stacked in this order on the parallel flat substrate Fb. The objective lens Ol of the microscope is in contact with the immersion oil Io2 as shown in FIG.
そして、メンブレンフィルタが平坦であるので、蛍光顕微鏡の視野が移動しても、オートフォーカスによる焦点の再調整がほとんど行われることがない。そして、蛍光顕微鏡によって画像を撮影したところ、通常の方法では画像全体にフォーカスの合う写真は１０枚に１枚程度であったが、本実施形態に係る微生物検出方法を使うことで多数の画像において良好なフォーカスの画像が得られた。 Since the membrane filter is flat, even if the field of view of the fluorescence microscope moves, the focus is hardly readjusted by autofocus. Then, when images were taken with a fluorescence microscope, in the normal method, the number of photographs focused on the entire image was about 1 in 10, but in the case of many images using the microorganism detection method according to this embodiment. An image with good focus was obtained.
以上のように、本実施形態では、液状のマウント液が塗布されたメンブレンフィルタは、平行平面基板に均一に広がった状態で貼り付く。そして、その後にエタノールが揮発すると、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着する。そして、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着することで、平坦化される。このように、本実施形態は、ろ過によりレジオネラ菌を捕集したメンブレンフィルタを平坦化することで、レジオネア菌をもれなく採取するとともにレジオネア菌の含まれる標本を平坦化することができる。これにより、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がないので、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。 As described above, in the present embodiment, the membrane filter to which the liquid mount solution is applied is attached to the parallel flat substrate in a state where it is spread uniformly. Then, when ethanol is volatilized thereafter, the membrane filter is completely adhered to the parallel flat substrate. The membrane filter is flattened by being completely adhered to the parallel flat substrate. Thus, this embodiment can flatten the membrane filter which collected Legionella bacteria by filtration, can collect | collect all Legionella bacteria, and can planarize the sample which contains Legionella bacteria. Thereby, since it is not necessary to adjust the focus every time the field of view of the fluorescence microscope is moved, it is possible to reduce the extra time generated during observation.
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法を用いてレジオネラ菌を検出する際の標本を平坦化したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法などのＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法、また蛍光染色法以外の微生物検出方法であっても、ろ過によりポリカーボネート製のメンブレンフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、当該メンブレンフィルタから微生物を検出する方法であれば、本発明を適用することができる。
As mentioned above, although embodiment of this invention was described, this invention is not limited to the said embodiment, For example, the following modifications can be considered.
(1) In the said embodiment, although the sample at the time of detecting Legionella bacteria was flattened using FISH method, this invention is not limited to this.
For example, even filtration methods other than the FISH method such as the DAPI (4 ′, 6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) staining method and the acridine orange staining method and microorganism detection methods other than the fluorescence staining method can be obtained by filtration. The present invention can be applied to any method that collects microorganisms in a sample on a polycarbonate membrane filter and detects the microorganisms from the membrane filter.
（２）上記実施形態では、平面板として平行平面基板を用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、平行平面基板の代わりに、スライドガラスを用いてもよい。しかし、より平面度を増すためには平行平面基板など平面度の高い物を用いた方がよい。また、ＦＩＳＨ法などの蛍光染色法では、標本を載せる平面板が透明である必要がないので、シリコンウェハーを用いてもよい。
(2) In the above embodiment, a parallel plane substrate is used as the plane plate, but the present invention is not limited to this.
For example, a slide glass may be used instead of the parallel plane substrate. However, in order to increase the flatness, it is better to use an object with high flatness such as a parallel flat substrate. In addition, in a fluorescent staining method such as the FISH method, a flat plate on which a specimen is placed does not need to be transparent, and a silicon wafer may be used.
（３）上記実施形態では、マウント剤にエタノールを混合したが、本発明はこれに限定されない。マウント剤に混合する溶媒は、親水性、揮発性及び観察の邪魔になる影響をメンブレンフィルタ及びレジオネア菌に与えないという条件を備える必要がある。このようなものとして、アルコール（エタノールを含む）がある。そして、エタノール以外のアルコールとして、イソプロパノールがある。 (3) In the above embodiment, ethanol is mixed with the mounting agent, but the present invention is not limited to this. The solvent to be mixed with the mounting agent needs to have a condition that the membrane filter and Legionaire are not affected by hydrophilicity, volatility, and observation. As such, there is alcohol (including ethanol). And there exists isopropanol as alcohol other than ethanol.
（４）上記実施形態では、第１０の工程においてイマージョンオイル希釈液をメンブレンフィルタに塗布し、第１１の工程においてそのメンブレンフィルタにカバーガラスを載せたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、第９の工程の後に、第１０の工程を行わずに、第１１の工程においてマウント剤の載ったメンブレンフィルタ上に直接カバーガラスを載せるようにしてもよい。
(4) In the above embodiment, the immersion oil diluent is applied to the membrane filter in the tenth step, and the cover glass is placed on the membrane filter in the eleventh step. However, the present invention is not limited to this.
For example, the cover glass may be directly placed on the membrane filter on which the mount agent is placed in the eleventh step without performing the tenth step after the ninth step.
Claims (7)
微生物の捕集面を上にした状態でフィルタを広げて平面板に載せ、親水性かつ揮発性の溶媒を水性マウント剤に混合したマウント液を前記フィルタに塗布し、その後に前記溶媒を揮発させる平坦化工程を具備することを特徴とする微生物検出方法。 A microorganism detection method for collecting microorganisms in a sample on a filter by filtration and detecting microorganisms from the filter,
Spread the filter with the microbial collection surface facing up and place it on a flat plate, apply a mount solution in which a hydrophilic and volatile solvent is mixed with an aqueous mount agent, and then volatilize the solvent. A microorganism detection method comprising a planarization step.
The microorganism detection method according to claim 5 or 6, wherein the immersion oil is diluted 10-fold with a second solvent.
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Family Applications (1)
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2009
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