JP2011116724A

JP2011116724A - Amyloid fibril elongated peptide

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Publication number: JP2011116724A
Application number: JP2009277681A
Authority: JP
Inventors: Koji Kawada; 康志河田; Tomohiro Mizohata; 知宏溝端; Kunihiro Hongo; 邦広本郷; Hideki Takeuchi; 英樹武内
Original assignee: Tottori University NUC
Current assignee: Tottori University NUC
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-06-16

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a diagnostic for estimating the amount of an amyloid fibril nucleus becoming dangerousness capable of forming amyloid fiber or becoming its "seed" or the amount of protein molecular species being the origin of the nucleus; to early evaluate the infection or the possibility of infection with amyloidosis; and to develop a prophylactic or a remedy of amyloidosis. <P>SOLUTION: The following are novel peptides, each being an amyloid fibril core site peptide of human α-synuclein protein: peptides equivalent to from the 76th amino acid to 94th to 96th amino acids; and peptides obtained by substituting the 94th phenylalanine with another amino acid in the peptides. The novel peptides are used for checking, prevention or therapy of amyloidosis. <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&INPIT

Description

本発明は、アミロイド線維伸長ペプチド、アミロイド病の検査におけるその使用、ならびにアミロイド病の予防または治療におけるその使用に関する。 The present invention relates to amyloid fibril elongation peptides, their use in the examination of amyloid disease, and their use in the prevention or treatment of amyloid disease.

近年、医学の進歩によって人の寿命が延び、世界的に高齢化社会に向かっている。ここで、新たな病気として、人の尊厳や生活の質に深く関わっている認知症をはじめとする脳神経変性病が生じ、社会的な問題となっている。アルツハイマー病やパーキンソン病、プリオン病（狂牛病）をはじめとする脳神経変性病は、特殊なタンパク質（それぞれ、Ａβ１−４２、αシヌクレイン、プリオン）の構造が変化して、β構造に富んだアミロイド線維という不溶性の物質を細胞内外で長い年月をかけて蓄積することによって発症するとされている。 In recent years, the advance of medicine has extended the lifespan of human beings and is moving toward an aging society worldwide. Here, as a new disease, cranial nerve degenerative diseases such as dementia, which are deeply related to human dignity and quality of life, have arisen and become a social problem. Cranial neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and prion disease (mad cow disease) change the structure of special proteins (Aβ1-42, α-synuclein and prion, respectively), and amyloid rich in β structure It is said that it develops by accumulating insoluble substances called fibers over and over the cell.

また、脳神経変性病に限らず、体の様々な臓器や血液中においても、ある種のタンパク質が高濃度で長期間存在するとアミロイド線維を形成し、臓器や組織に沈着することで病気が発症する。これらの病気はアミロイド病（アミロイドーシス）と呼ばれており、２０種類以上の病気が知られている（非特許文献１）。例えば、β２ミクログロブリンが血中に高濃度で存在すると関節などにアミロイド線維が蓄積して痛みを生じる。β２ミクログロブリンは人工透析を行っている患者の血液中に高濃度に蓄積されることが知られており、日本でも数十万人がそのアミロイド病の発症予備軍となりうる。さらに、膵臓や肝臓などに蓄積して全身性アミロイドーシスを引き起こすインスリンやアミリン、リゾチームなどもアミロイド線維を形成することが知られている。 Not only cranial neurodegenerative diseases, but also in various organs and blood of the body, when a certain protein is present at a high concentration for a long period of time, amyloid fibrils are formed and deposited in the organs and tissues cause disease. . These diseases are called amyloid diseases (amyloidosis), and more than 20 types of diseases are known (Non-patent Document 1). For example, when β2 microglobulin is present in a high concentration in blood, amyloid fibrils accumulate in joints and cause pain. β2 microglobulin is known to accumulate at high concentrations in the blood of patients undergoing artificial dialysis, and hundreds of thousands of people in Japan can serve as a reserve for the onset of amyloid disease. Furthermore, insulin, amylin, lysozyme and the like that accumulate in the pancreas and liver and cause systemic amyloidosis are also known to form amyloid fibrils.

アミロイド線維の形成は、タンパク質の安定性とも大きく関係しており、コンフォーメーション変化が起こり、アミロイド線維の種（シード）に相当するものが先ず形成され、その後、その「種」に次々と構造変化したタンパク質が結合して伸長してアミロイド線維が形成される、いわゆる「核形成−核依存的伸長」の機構で起こることが分かっている。 The formation of amyloid fibrils is also greatly related to the stability of the protein. A conformational change occurs, and the seed corresponding to the seed of amyloid fibril is first formed, and then the structure changes to the "species" one after another. It has been found that this occurs by a so-called “nucleation-nucleus-dependent elongation” mechanism in which the proteins bound and elongated to form amyloid fibrils.

高齢化社会の中で多くの人が質の高い生活を享受するためには、神経変性病をはじめとするアミロイド病の克服が大きなポイントとなる。このためには、アミロイド病を早期に診断する技術を開発する必要がある。さらに、アミロイド病の予防薬や治療薬の開発も必要となる。 In order for many people to enjoy a quality life in an aging society, overcoming amyloid diseases such as neurodegenerative diseases is a major point. For this purpose, it is necessary to develop a technique for early diagnosis of amyloid disease. Furthermore, it is necessary to develop preventive and therapeutic agents for amyloid disease.

G.T.Westermark and P.Westermark, Amyloid, Vol.7, 19 (2000)G.T.Westermark and P.Westermark, Amyloid, Vol. 7, 19 (2000)

アミロイド線維を形成しうる危険性やその「種」となるアミロイド線維核、あるいはその元になるタンパク質分子種の量を見積もる診断薬を開発し、早期にアミロイド病に罹病していること、あるいは罹病する可能性があることを判断することが必要である。そして、アミロイド病の予防薬や治療薬の開発も必要である。 Developed a diagnostic agent to estimate the risk of amyloid fibril formation and the amount of the amyloid fibril nucleus that is the “species” or the protein molecular species from which it develops. It is necessary to judge that there is a possibility of doing. There is also a need to develop preventive and therapeutic drugs for amyloid disease.

本発明者らは、上記課題を解決せんと鋭意研究を重ね、αシヌクレインの特定の部分ペプチドが、αシヌクレイン以外の様々なアミロイド性タンパク質の「種」に対して伸長する能力を有することを見出した。さらに本発明者らは、これらのペプチドの特定の変異体が、自らはアミロイド核形成を起こさないが、アミロイド核が存在する場合にはアミロイド線維伸長反応を起こすことを見出した。本発明者らは、これらの知見から本発明を完成するに至った。 The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems and found that specific partial peptides of α-synuclein have the ability to elongate to “species” of various amyloid proteins other than α-synuclein. It was. Furthermore, the present inventors have found that specific mutants of these peptides do not cause amyloid nucleation by themselves, but cause amyloid fibril elongation reaction when amyloid nuclei are present. The present inventors have completed the present invention from these findings.

本発明は、以下のものに関する。
（１）下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド
［（ａ）〜（ｃ）においてＸａａはＰｈｅ以外のいずれかのアミノ酸を意味し、（ｄ）に記載のペプチドにおいてＸａａは保持されている］
からなる群より選択されるペプチド。
（２）ＸａａがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕまたはＡｒｇである、（１）記載のペプチド。
（３）ＸａａがＧｌｙである（２）記載のペプチド。
（４）下記（ｅ）〜（ｇ）：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：６）
からなる群より選択される（３）記載のペプチド。
（５）標識されている（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物。
（７）（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを構成成分として含む、アミロイド病の検査用キット。
（８）対象から得た試料に（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法であって、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する方法。
（９）下記（ｈ）〜（ｍ）：
（ｈ）（１）請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物。 The present invention relates to the following.
(1) The following (a) to (d):
(A) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa (SEQ ID NO: 1),
(B) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa-Val (SEQ ID NO: 2),
(C) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa-Val-Lys (SEQ ID NO: 3) And (d) a peptide in which one to several amino acids are added, deleted or substituted in the peptides of (a) to (c) [in (a) to (c), Xaa is any one other than Phe Means an amino acid, and Xaa is retained in the peptide described in (d)]
A peptide selected from the group consisting of:
(2) The peptide according to (1), wherein Xaa is Gly, Ala, Ser, Met, His, Leu, or Arg.
(3) The peptide according to (2), wherein Xaa is Gly.
(4) The following (e) to (g):
(E) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4),
(F) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Val (SEQ ID NO: 5), and (G) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Val-Lys (SEQ ID NO: 6)
The peptide according to (3), selected from the group consisting of:
(5) The peptide according to any one of (1) to (4), which is labeled.
(6) A composition for testing amyloid disease, comprising the peptide according to any one of (1) to (5).
(7) A test kit for amyloid disease comprising the peptide according to any one of (1) to (5) as a constituent component.
(8) A method for testing amyloid disease, comprising contacting a sample obtained from a subject with the peptide according to any one of (1) to (5), and then examining the presence or absence of amyloid fibril formation. Then, when amyloid fibrils are generated, the method determines that the subject has or is likely to suffer from amyloid disease.
(9) The following (h) to (m):
(H) (1) the peptide according to any one of claims 1 to 4,
(I) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 7),
(J) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val (SEQ ID NO: 8),
(K) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SEQ ID NO: 9) ,
(L) Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SEQ ID NO: 10), and (m) (i)-( A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of amyloid disease, comprising a peptide selected from the group consisting of peptides to which one to several amino acids are added, deleted or substituted in the peptide of k).

本発明によれば、広範囲のアミロイド病の早期診断が可能な検査方法、予防および治療が可能となる。該検査方法は大がかりな設備を必要とせず、しかも比較的短時間で済むという利点がある。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the test | inspection method in which the early diagnosis of a wide range amyloid disease, prevention, and treatment are attained. The inspection method has the advantage that it does not require large-scale equipment and can be completed in a relatively short time.

図１はαシヌクレインの全アミノ酸配列を示す。アミロイド線維核領域（コアー）領域を黒くしている。FIG. 1 shows the entire amino acid sequence of α-synuclein. The amyloid fibril nucleus region (core) region is blackened. 図２は合成核部位ペプチドによるアミロイド線維形成を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。０．５ｍＭペプチド、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ中、３７℃でインキュベートした。黒丸はＳＰ６１−８９、白丸はＳＰ７６−８９、黒四角はＳＰ８１−９６、白四角はＳＰ７６−９６を用いた場合である。（ｂ）はＳＰ８１−９６のアミロイド線維形成後のＴＥＭによるイメージ、（ｃ）はＳＰ７６−９６のアミロイド線維形成後のＴＥＭによるイメージである。FIG. 2 shows amyloid fibril formation by a synthetic nuclear site peptide. (A) shows the time-dependent change of amyloid fibril formation by ThioT binding measurement. Incubation was performed at 37 ° C. in 0.5 mM peptide, 25 mM Tris-HCl pH 7.5 buffer, 150 mM NaCl. The black circle is SP61-89, the white circle is SP76-89, the black square is SP81-96, and the white square is SP76-96. (B) is an image by TEM after amyloid fibril formation of SP81-96, and (c) is an image by TEM after amyloid fibril formation of SP76-96. 核部位ペプチドのアミロイド線維形成能における９４番目のフェニルアラニン残基の役割を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。黒丸はＳＰ７６−９４、黒四角はＳＰ７６−９３、白丸はＳＰ７６−９１、白四角はＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇを用いた場合である。（ｂ）はＳＰ７６−９４の線維形成後のＡＦＭによる観測イメージである。スケールバーは２００ｎｍである。（ｃ）はＳＰ７６−９４の線維形成実験前後のＣＤスペクトル測定結果である。白丸は０時間、黒丸は３５０時間後である。The role of the 94th phenylalanine residue in the amyloid fibril formation ability of a nuclear site peptide is shown. (A) shows the time-dependent change of amyloid fibril formation by ThioT binding measurement. The black circle is SP76-94, the black square is SP76-93, the white circle is SP76-91, and the white square is SP76-94F94G. (B) is an observation image by AFM after fiber formation of SP76-94. The scale bar is 200 nm. (C) is a CD spectrum measurement result before and after the fiber formation experiment of SP76-94. The white circle is 0 hours later, and the black circle is 350 hours later. 図４はＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇの線維伸長反応を示す。（ａ）はＴｈｉｏＴ結合測定によるアミロイド線維形成の経時変化を示す。ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇのみの場合をグレーの棒で、１０％（ｖ／ｖ）のＳＰ７６−９４アミロイド線維をシードとして添加した場合を黒の棒で示す。（ｂ）はシードを添加したサンプルの３３６時間後のＴＥＭ観測イメージである。スケールバーは２００ｎｍである。FIG. 4 shows the fiber elongation reaction of SP76-94F94G. (A) shows the time-dependent change of amyloid fibril formation by ThioT binding measurement. The case of SP76-94F94G alone is shown by a gray bar, and the case of adding 10% (v / v) SP76-94 amyloid fibrils as a seed is shown by a black bar. (B) is a TEM observation image after 336 hours of the sample to which the seed was added. The scale bar is 200 nm. 図５はＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの各種アミロイド線維核（シード）に対する伸長反応の様子をＴｈｊｏＴ結合測定による経時変化にて示す。１ｍｇ／ｍｌＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ、１％（ｖ／ｖ）シード添加、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｈｉｏＴ、１２０ｍｉｎ^−１振盪、３７℃。FIG. 5 shows the state of elongation reaction of SP76-96F94G on various amyloid fibril nuclei (seed) as a change with time by ThjoT binding measurement. 1 mg / ml SP76-96F94G, 1% (v / v) seed addition, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 300 mM NaCl, 20 mM ThioT, 120 min ⁻¹ shaking, 37 ° C. 図６は蛍光顕微鏡を用いたＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの線維伸長反応の直接観察結果を示す。（ａ）はαシヌクレイン線維シードのみを添加したコントロール、（ｂ）はαシヌクレイン線維シードを用いて４８時間後、（ｃ）はＧｒｏＥＳシードを用いて４８時間後、（ｄ）はインシュリン線維シードを用いての２０時間後（ｅ）はリゾチーム線維シードを用いての２０時間後のＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ線維伸長の様子である。図中の白いバーはいずれも１０μｍを示す。FIG. 6 shows the results of direct observation of the fiber elongation reaction of SP76-96F94G using a fluorescence microscope. (A) is a control to which only α-synuclein fiber seed is added, (b) is 48 hours after using α-synuclein fiber seed, (c) is 48 hours after using GroES seed, and (d) is insulin fiber seed. 20 hours after use (e) shows SP76-96F94G fiber elongation after 20 hours using lysozyme fiber seed. The white bars in the figure all indicate 10 μm.

本発明者らは、パーキンソン病の原因タンパク質の１つであるαシヌクレインのアミロイド線維のアミロイド核部分を同定した。さらに本発明者らは、同定したアミロイド核部分の部分ペプチドおよび変異ペプチドについても検討を重ねた結果、自身ではアミロイド線維形成は起こさないが、アミロイド核が「種」として存在する場合に限り、それを足がかりにして伸長してアミロイド線維を形成するという、従来になかったユニークな性質を有するペプチドを見出した（実施例参照）。すでに本発明者らは、αシヌクレイン全長のタンパク質が異種タンパク質のアミロイド線維核に対しても伸長することを見出しているが（H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005）、上記のようなユニークな性質を持ったペプチドが見出されたのは今回が初めてである。 The present inventors have identified the amyloid nucleus portion of amyloid fibrils of α-synuclein, which is one of the causative proteins of Parkinson's disease. Furthermore, as a result of repeated investigations on the partial peptides and mutant peptides of the identified amyloid nucleus, the present inventors did not cause amyloid fibril formation by themselves, but only when the amyloid nucleus exists as a “species”. A peptide having a unique property that was not found in the past was found (see Examples). Already, the present inventors have found that a full-length α-synuclein protein extends to a heterologous protein amyloid fibril nucleus (H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005), this is the first time that a peptide having such unique properties has been found.

上記のユニークな性質を有する本発明の新規ペプチドの具体例は下記のものである：
（ａ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：１）、
（ｂ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９５番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：２）、
（ｃ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９６番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンを他のアミノ酸に置換したペプチド、配列番号：３）、および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド。 Specific examples of novel peptides of the present invention having the above unique properties are as follows:
(A) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa (from the 76th amino acid of α-synuclein to 94 A peptide in which the 94th phenylalanine is substituted with another amino acid in the peptide corresponding to the first amino acid, SEQ ID NO: 1),
(B) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa-Val (the 76th amino acid of α-synuclein) To the 95th amino acid, a peptide in which the 94th phenylalanine is substituted with another amino acid, SEQ ID NO: 2),
(C) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa-Val-Lys (76th of α-synuclein) A peptide in which the 94th phenylalanine is substituted with another amino acid in the peptide corresponding to the amino acid from the amino acid to the 96th amino acid, SEQ ID NO: 3), and (d) one to several in the peptides (a) to (c) A peptide in which a single amino acid is added, deleted or substituted.

上記（ｄ）のような変異ペプチドも本発明に包含される。ただし、いずれのペプチドにおいても、上記性質を有するためには９４番目のフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸（Ｘａａ）により置換されていることが必要である。ペプチドが上記性質を有するために好ましいＸａａとしてはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、ＬｅｕあるいはＡｒｇなどが挙げられ、より好ましいＸａａとしてはグリシンが挙げられる。 Mutant peptides such as (d) above are also encompassed by the present invention. However, in any peptide, in order to have the above properties, it is necessary that the 94th phenylalanine is substituted with an amino acid (Xaa) other than phenylalanine. Preferred Xaa because the peptide has the above properties includes Gly, Ala, Ser, Met, His, Leu, Arg and the like, and more preferred Xaa includes glycine.

したがって、上記のユニークな性質が特に顕著なペプチドとしては：
（ｅ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇ、配列番号：４）、
（ｆ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９５番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９５Ｆ９４Ｇ、配列番号：５）、および
（ｇ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（αシヌクレインの７６番目のアミノ酸から９６番目のアミノ酸までに相当するペプチドにおいて９４番目のフェニルアラニンをグリシンに置換したペプチド、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ、配列番号：６）
が挙げられる。 Thus, peptides that are particularly prominent in the above unique properties include:
(E) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly (from the 76th amino acid of α-synuclein to 94 A peptide in which the 94th phenylalanine is substituted with glycine in the peptide corresponding to the first amino acid, SP76-94F94G, SEQ ID NO: 4),
(F) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Val (the 76th amino acid of α-synuclein) , A peptide in which the 94th phenylalanine is substituted with glycine in the peptide corresponding to amino acids from to 95, SP76-95F94G, SEQ ID NO: 5), and (g) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val- Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Val-Lys (94th phenylalanine in the peptide corresponding to the 76th to 96th amino acids of α-synuclein) Substituted with glycine , SP76-96F94G, SEQ ID NO: 6)
Is mentioned.

上で説明したペプチドは修飾されていてもかまわない。修飾の例としては、ペプチドの側鎖官能基を誘導体化すること等が挙げられる。かかる誘導体化は当業者によく知られている。例えば、アラニンの水酸基を修飾してもよく、グルタミン酸のγ−カルボキシル基を修飾してもよい。また、上記ペプチドにおいて１またはそれ以上のアミノ酸残基を非天然または人工アミノ酸に変更してもよい。ペプチド中の変異、修飾あるいは誘導体化の部位は、上記性質を損なわないかぎり、ペプチドのいずれの部位にあってもよい。例えば、ペプチドの内部残基が変異（例えば、他のアミノ酸で置換、欠失、付加等）、修飾あるいは誘導体化されていてもよく、ペプチドのＣ末端またはＮ末端において変異、修飾あるいは誘導体化されていてもよい。ただし、９４番目のフェニルアラニンがフェニルアラニン以外のアミノ酸により置換されていることが必要である。 The peptides described above may be modified. Examples of the modification include derivatization of the side chain functional group of the peptide. Such derivatization is well known to those skilled in the art. For example, the hydroxyl group of alanine may be modified, or the γ-carboxyl group of glutamic acid may be modified. In the above peptide, one or more amino acid residues may be changed to a non-natural or artificial amino acid. The site of mutation, modification or derivatization in the peptide may be at any site of the peptide as long as the above properties are not impaired. For example, an internal residue of the peptide may be mutated (for example, substituted, deleted, added, etc. with other amino acids), modified or derivatized, and mutated, modified or derivatized at the C-terminal or N-terminal of the peptide. It may be. However, it is necessary that the 94th phenylalanine is substituted with an amino acid other than phenylalanine.

ここで、本明細書におけるペプチドの標記方法について説明する。本発明のペプチドのアミノ酸残基番号は図１に示αシヌクレインのアミン酸配列の番号と一致する。本明細書において、アミノ酸はカナ標記のほか、当業者によく知られた３文字表記または１文字表記で示される。本明細書において、αシヌクレインのＸ番目のアミノ酸からＹ番目のアミノ酸からなる部分ペプチドを、「ＳＰＸ−Ｙ」と標記することがある。例えば、図１のαシヌクレインのアミノ酸７６からアミノ酸９６までからなる本発明のペプチドをＳＰ７６−９６と標記することがある。本明細書において、本発明のペプチド中のアミノ酸残基を特定するに際し、αシヌクレインのＺ番目のアミノ酸に相当するものである場合には、「Ｚ番目のアミノ酸」あるいは「アミノ酸Ｚ」と標記することがある。例えば、「９４番目のＰｈｅ」あるいは「Ｐｈｅ９４」という場合には、図１の９４番目のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基をいう。さらに、本発明のペプチドがαシヌクレインのアミノ酸とは異なるアミノ酸を含む場合には、その位置を示す数字の前に本来のアミノ酸、後に異なるアミノ酸を表示する。例えば、本発明のペプチドＳＰ７６−９６の９４番目のＰｈｅがＧｌｙに置き換わっているペプチドを、「ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ」と標記することがある。 Here, the peptide marking method in this specification will be described. The amino acid residue number of the peptide of the present invention matches the amino acid sequence number of α-synuclein shown in FIG. In the present specification, amino acids are represented by three-letter code or one-letter code well known to those skilled in the art, in addition to kana. In the present specification, a partial peptide consisting of the X-th amino acid to the Y-th amino acid of α-synuclein may be referred to as “SPX-Y”. For example, the peptide of the present invention consisting of amino acids 76 to 96 of α-synuclein in FIG. 1 may be designated as SP76-96. In the present specification, when the amino acid residue in the peptide of the present invention is specified, if it corresponds to the Z-th amino acid of α-synuclein, it is denoted as “Z-th amino acid” or “amino acid Z”. Sometimes. For example, “94th Phe” or “Phe94” means an amino acid residue corresponding to the 94th amino acid residue in FIG. Further, when the peptide of the present invention contains an amino acid different from the amino acid of α-synuclein, the original amino acid is displayed before the number indicating the position, and the different amino acid is displayed after. For example, a peptide in which 94th Phe of the peptide SP76-96 of the present invention is replaced with Gly may be referred to as “SP76-96F94G”.

上で説明した本発明のペプチドは、自身ではアミロイド線維形成は起こさないが、アミロイド核が「種」として存在する場合に限り、それを足がかりにして伸長してアミロイド線維を形成するという極めてユニークな性質を有する。これらのペプチドは、同種タンパク質であるαシヌクレインだけでなく、他のアミロイド性タンパク質の「種」に対しても伸長する能力を有する。したがって、これらのペプチドを用いて、アミロイド病の発症前のアミロイド線維核や前駆体分子種の存在を確認することができる。すなわち、すなわち、上で説明したペプチドは、検体中にアミロイド線維形成の「種」があるかどうかを判断する試薬として利用価値がある。そして、これらのペプチドを用いることによって、検体中の「種」の存在を調べ、アミロイド病の発症を早期に診断することができる。アミロイド病（アミロイドーシス）は、アミロイド線維が臓器や組織に沈着することで発症する病気であり、パーキンソン病やアルツハイマー病などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書において、「アミロイド核」、「アミロイド線維核」、「種」、「シード」は同義である。また、特に断らないかぎり、本明細書で用いられる他の用語の意味は当該分野で一般的に認識されている意味に解される。 The peptide of the present invention described above does not cause amyloid fibril formation by itself, but only when the amyloid nucleus exists as a “species”, it is used as a foothold to extend to form amyloid fibrils. Has properties. These peptides have the ability to extend not only to the homologous protein α-synuclein, but also to “species” of other amyloidic proteins. Therefore, the presence of amyloid fiber nuclei and precursor molecular species before the onset of amyloid disease can be confirmed using these peptides. That is, the peptide described above is useful as a reagent for determining whether or not there is a “seed” of amyloid fibril formation in a specimen. By using these peptides, the presence of “species” in the specimen can be examined, and the onset of amyloid disease can be diagnosed early. Amyloid disease (amyloidosis) is a disease that develops when amyloid fibers are deposited in an organ or tissue, and includes, but is not limited to, Parkinson's disease and Alzheimer's disease. In the present specification, “amyloid nucleus”, “amyloid fiber nucleus”, “seed”, and “seed” are synonymous. In addition, unless otherwise specified, the meanings of other terms used in this specification are understood to be those generally recognized in the art.

したがって、本発明は、上で説明したペプチドを含む、アミロイド病の検査用組成物および検査用キットを提供する。さらに本発明は、対象から得た試料に上で説明したペプチドを接触させ、次いで、アミロイド線維の生成の有無を調べることを特徴とする、アミロイド病の検査方法を提供する。該方法において、アミロイド線維が生成した場合に、対象がアミロイド病に罹患しているか、罹患するおそれがあると判定する。上記検査方法、検査キットおよび検査方法においてアミロイド線維の生成を確認する手段・方法としては、以下のようなものが挙げられるが、限定するものではない。 Accordingly, the present invention provides a composition for testing for amyloid disease and a kit for testing, which comprise the peptide described above. Furthermore, the present invention provides a test method for amyloid disease, which comprises contacting the peptide described above with a sample obtained from a subject, and then examining the presence or absence of amyloid fibril formation. In the method, when amyloid fibrils are generated, it is determined that the subject has or is likely to suffer from amyloid disease. Examples of means / method for confirming the production of amyloid fibrils in the above-described testing method, testing kit and testing method include, but are not limited to, the following.

先ず、対象から試料を得る。試料採取は、アミロイド線維が存在あるいは生成する可能性のある身体部位から得ることができる。対象から得た試料に上で説明したペプチドを接触させた後、一定時間後（例えば、数時間〜数百時間後）に、アミロイド線維に特異的に結合する色素（例えば、チオフラビンＴなど）と混合し、色素の結合を調べることによりアミロイド線維の生成を確認する。色素は、試料とペプチドとの接触時に添加しておいてもよく、色素添加のタイミングは特に限定されない。アミロイド線維の生成は、蛍光を測定すること、光学顕微鏡にて観察すること、あるいは透過型電子顕微鏡または原子間力顕微鏡などを用いること、円偏光二色性を調べることなどにより行うことができるが、このような手段・方法に限定されず、当業者は、他の手段・方法を適用してアミロイド線維の生成を確認することができる。 First, a sample is obtained from a subject. Sampling can be obtained from a body part where amyloid fibrils may be present or generated. After contacting the peptide described above with a sample obtained from a subject, after a certain time (for example, several hours to several hundred hours), a dye (for example, thioflavin T) that specifically binds to amyloid fibrils; Mix and confirm the formation of amyloid fibrils by examining dye binding. The dye may be added at the time of contact between the sample and the peptide, and the timing of adding the dye is not particularly limited. Amyloid fibrils can be generated by measuring fluorescence, observing with an optical microscope, using a transmission electron microscope or an atomic force microscope, and examining circular dichroism. Without being limited to such means and methods, those skilled in the art can confirm the production of amyloid fibrils by applying other means and methods.

具体的には、上記ペプチド約０．１ｍＭ以上，例えば約０．５ｍＭ（約１ｍｇ／ｍｌ）、好ましくは約１．５ｍＭ（約３ｍｇ／ｍｌ）、より好ましくは約３ｍＭ（約６ｍｇ／ｍｌ）を、アミロイド線維伸長反応を調べたい試料に添加することが望ましい。伸長反応時間は約２５〜３７℃で約２４時間、好ましくは４８時間、より好ましくは２００時間またはそれ以上行うことが望ましい。好ましくは、伸長反応は中性付近の緩衝液中で振盪しながら行う。反応系にＮａＣｌなどの塩類を適当濃度、例えば数十ｍＭ〜約１Ｍ程度添加してアミロイド線維伸長反応を行ってもよい。色素が光感受性である場合など、必要に応じてアミロイド線維伸長反応中は適宜遮光してもよい。 Specifically, the peptide is about 0.1 mM or more, for example, about 0.5 mM (about 1 mg / ml), preferably about 1.5 mM (about 3 mg / ml), more preferably about 3 mM (about 6 mg / ml). It is desirable to add to a sample to be examined for amyloid fibril elongation reaction. The extension reaction time is desirably about 24 hours, preferably 48 hours, more preferably 200 hours or more at about 25 to 37 ° C. Preferably, the extension reaction is performed with shaking in a near neutral buffer. An amyloid fiber elongation reaction may be performed by adding a salt such as NaCl to the reaction system at an appropriate concentration, for example, about several tens mM to about 1M. In the case where the dye is photosensitive, the light may be appropriately shielded during the amyloid fiber elongation reaction as necessary.

上記検査方法、検査キットおよび検査方法において、上で説明したペプチドが検出可能な標識にて標識されていてもよい。標識は、発色基、蛍光基、吸光基、例えば、Ｃｙ５、ダンシル基、フルオレセイン基、ナフタレンスルホン酸基、ナフチル基、ピレン基など、あるいは放射性基などであってもよいが、これらに限定されない。 In the test method, test kit, and test method described above, the peptide described above may be labeled with a detectable label. The label may be a chromogenic group, a fluorescent group, a light absorbing group such as Cy5, dansyl group, fluorescein group, naphthalene sulfonic acid group, naphthyl group, pyrene group, or a radioactive group, but is not limited thereto.

アミロイド病はアミロイド線維そのものに毒性があるのではなく、アミロイド線維形成を起こす過程の凝集体やアミロイド核、オリゴマー分子種などが毒性の原因であるとも考えられている（Ｉ.Ｃ. Ｍａｒｔｉｎｓ, Ｉ. Ｋｕｐｅｒｓｔｅｉｎ, Ｈ. Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ, Ｅ. Ｍａｅｓ, Ｍ. Ｖａｎｂｒａｂａｎｔ, Ｗ. Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ, Ｐ.Ｖ. Ｇｅｌｄｅｒ, Ｄ. Ｈａｒｔｍａｎｎ, Ｒ. Ｄ'Ｈｏｏｇｅ, Ｂ. ＤｅＳｔｒｏｏｐｅｒ, Ｊ. Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ, Ｆ. Ｒｏｕｓｓｅａｕ, ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ, ２７, ２２４-２３３, ２００８）。したがって、むしろ、できるだけ素早いアミロイド線維を形成させて無毒化してしまうことがアミロイド病の予防や治療につながると考えられる。したがって、「種」が存在しさえすればそれを足場としてアミロイド線維を形成するペプチドを、アミロイド病の予防または治療に用いることができる。 In amyloid disease, amyloid fibrils themselves are not toxic, but aggregates, amyloid nuclei, oligomeric molecular species and the like that cause amyloid fibril formation are also thought to be the cause of toxicity (IC Martins, I Kuperstein, H. Wilkinson, E. Maes, M. Vanbrabant, W. Jonckheere, P.V. Gelder, D. Hartmann, R. D'Hoge, B. Deetros. 27, 224-233, 2008). Therefore, rather, it is considered that the quickest possible amyloid fibril formation and detoxification leads to the prevention and treatment of amyloid disease. Therefore, a peptide that forms amyloid fibrils using a “species” as a scaffold as long as it exists can be used for the prevention or treatment of amyloid disease.

したがって、本発明は、下記のペプチドからなる群より選択されるペプチドを含む、アミロイド病の予防または治療用医薬組成物を提供する：
上記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のペプチド、
（ｉ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ＳＰ７６−９４、配列番号：７）、
（ｊ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（ＳＰ７６−９５、配列番号：８）、
（ｋ）Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ７６−９６、配列番号：９）、
（ｌ）Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ８１−９６、配列番号：１０）、および
（ｍ）（ｉ）〜（ｋ）のペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が付加、欠失または置換されているペプチド（ただし、９４番目のＰｈｅは保持されている）。 Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating amyloid disease, comprising a peptide selected from the group consisting of the following peptides:
The peptide according to any one of (a) to (h) above,
(I) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe (SP76-94, SEQ ID NO: 7) ,
(J) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val (SP76-95, SEQ ID NO: 8),
(K) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SP76-96, sequence) Number: 9),
(L) Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SP81-96, SEQ ID NO: 10), and (m) ( A peptide in which one to several amino acids are added, deleted or substituted in the peptides i) to (k) (however, the 94th Phe is retained).

（ｉ）〜（ｍ）のペプチドは修飾されていてもかまわない。修飾の例としては、ペプチドの側鎖官能基を誘導体化することが挙げられる。かかる誘導体化は当業者によく知られている。例えば、アラニンの水酸基を修飾してもよく、グルタミン酸のγ−カルボキシル基を修飾してもよい。また、上記ペプチドにおいて１またはそれ以上のアミノ酸残基を非天然または人工アミノ酸としてもよい。ペプチド中の変異、修飾あるいは誘導体化の部位は、上記性質を損なわないかぎり、ペプチドのいずれの部位にあってもよい。例えば、ペプチドの内部残基が変異（例えば、他のアミノ酸で置換、欠失、付加等）、修飾あるいは誘導体化されていてもよく、ペプチドのＣ末端またはＮ末端において変異、修飾あるいは誘導体化されていてもよい。 The peptides (i) to (m) may be modified. An example of modification includes derivatizing the side chain functional group of the peptide. Such derivatization is well known to those skilled in the art. For example, the hydroxyl group of alanine may be modified, or the γ-carboxyl group of glutamic acid may be modified. In the above peptide, one or more amino acid residues may be non-natural or artificial amino acids. The site of mutation, modification or derivatization in the peptide may be at any site of the peptide as long as the above properties are not impaired. For example, an internal residue of the peptide may be mutated (for example, substituted, deleted, added, etc. with other amino acids), modified or derivatized, and mutated, modified or derivatized at the C-terminal or N-terminal of the peptide. It may be.

本発明のアミロイド病の予防または治療用医薬組成物は、公知の方法にて製造されうる。また、本発明のアミロイド病の予防または治療用医薬組成物の剤形は特に限定されず、例えば、溶液状、乾燥固体状などであってもよく、好ましい剤形は溶液状である。これらの有効成分たるペプチドの投与量は、１〜１０ｍｇ/ｋｇなどであってもよく、好ましい投与量は１０ｍｇ/ｋｇである。これらの条件は例示であり、医師により適宜選択、変更されうる。 The pharmaceutical composition for preventing or treating amyloid disease of the present invention can be produced by a known method. Moreover, the dosage form of the pharmaceutical composition for prevention or treatment of amyloid disease of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a solution, a dry solid, etc., and a preferred dosage form is a solution. The dose of the peptide as the active ingredient may be 1 to 10 mg / kg, and the preferred dose is 10 mg / kg. These conditions are examples, and can be appropriately selected and changed by a doctor.

本発明のペプチドおよびそれらの変異ペプチドは一般的な固相法（Ｆｍｏｃ法やＢｏｃ法など）によって化学合成することができ、遺伝子組み換え法によっても得ることができ、あるいはそれらを組み合わせた方法によっても得ることができる。これらの方法は当業者によく知られている。 The peptides of the present invention and their mutant peptides can be chemically synthesized by a general solid phase method (Fmoc method, Boc method, etc.), can be obtained by a gene recombination method, or a method combining them. Obtainable. These methods are well known to those skilled in the art.

以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例はあくまでも例示説明であり、本発明を限定するものと解釈してはならない。 The present invention will be described in more detail and specifically with reference to the following examples. However, the examples are merely illustrative and should not be construed as limiting the present invention.

実施例１：本発明のペプチドの同定
（１）αシヌクレインアミロイド線維核部位の同定
H. Yagi, A. Sato, A. Yoshida, Y. Hattori, M. Hara, J. Shimamura, I. Sakane, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 377, 1593-1606, 2008に記載の方法に準じて行った。すなわち、H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005に示す方法でαシヌクレインのアミロイド線維を作成し、その後、Ｌｙｓを特異的に認識してペプチド鎖を切断するAchromobactr Lyticus protease I （ＡＰＩと略称）と、疎水性アミノ酸を認識してペプチド鎖を切断するproteinase K （ＰＫと略称）で別々に消化した。残存する不溶性部分を７．５Ｍグアニジンに可溶化させた後、逆相ＨＰＬＣで単離生成し、アミノ酸シークエンサーと質量分析計にて分析した。参考のため、αシヌクレインの全アミノ酸配列を図１に示した。得られた消化ペプチドは、それぞれ、
ＡＲＩ消化ペプチド：Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ８１−９６、配列番号：１０）、および
ＰＫ消化ペプチド：Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（ＳＰ７６−８９、配列番号：１１）
であった。 Example 1: Identification of Peptide of the Present Invention (1) Identification of α-synuclein amyloid fibril nucleus site
H. Yagi, A. Sato, A. Yoshida, Y. Hattori, M. Hara, J. Shimamura, I. Sakane, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 377, 1593- 1606, 2008 The method described in 2008 was performed. That is, α-synuclein amyloid fibrils were prepared by the method shown in H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005, Digestion was separately performed with Achromobactr Lyticus protease I (abbreviated as API) that specifically recognizes Lys and cleaves the peptide chain, and proteinase K (abbreviated as PK) that recognizes hydrophobic amino acids and cleaves the peptide chain. The remaining insoluble part was solubilized in 7.5M guanidine, isolated and produced by reverse phase HPLC, and analyzed with an amino acid sequencer and a mass spectrometer. For reference, the entire amino acid sequence of α-synuclein is shown in FIG. The obtained digested peptides were respectively
ARI digested peptides: Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SP81-96, SEQ ID NO: 10), and PK digested peptides : Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala (SP76-89, SEQ ID NO: 11)
Met.

（２）同定した核部位ペプチドの性質検討
上で同定した２つの核部位ペプチドのほか、これら２つのペプチドの重なり部分であるＴｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（ＳＰ８１−８９、配列番号：１２）や、これら２つの同定ペプチドの領域すべてに渡ったペプチドＡｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（ＳＰ７６−９６、配列番号：９）など、様々な種類のペプチドを化学合成し、それらのアミロイド線維形成の特徴を調べた（表１）。アミロイド線維形成は、それぞれ終濃度０．５ｍＭのペプチドを１５０ｍＭＮａＣｌを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、３７℃で毎分１７０回転（１７０ｍｉｎ^−１）の振盪速度で振盪することで行った。適宜サンプルを取り出し、ＰＢＳ−ｓａｌｉｎｅ緩衝液中２５μＭチオフラビンＴ（ＴｈｉｏＴ）と混合し、励起波長４４０ｎｍ、蛍光観測波長４８０ｎｍで測定した。さらに、アミロイド線維は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）または原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、円偏光二色性（ＣＤ）によっても確認した。その結果、Ｃ末端領域を含むＳＰ８１−９６とＳＰ７６−９６が自発的にアミロイド線維を形成することが分かった（図２）。 (2) Examination of properties of identified nuclear site peptides In addition to the two nuclear site peptides identified above, Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala (the overlapping portion of these two peptides) SP81-89, SEQ ID NO: 12) and the peptide Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala over the entire region of these two identified peptides Various types of peptides such as -Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SP76-96, SEQ ID NO: 9) were chemically synthesized and their amyloid fibril formation characteristics were examined (Table 1) . In amyloid fibril formation, peptides each having a final concentration of 0.5 mM were dissolved in 25 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 150 mM NaCl, and shaken at 37 ° C. with a shaking speed of 170 revolutions per minute (170 min ⁻¹ ). It was done by doing. A sample was taken out as appropriate, mixed with 25 μM Thioflavin T (ThioT) in PBS-saline buffer, and measured at an excitation wavelength of 440 nm and a fluorescence observation wavelength of 480 nm. Furthermore, amyloid fibrils were also confirmed by transmission electron microscope (TEM), atomic force microscope (AFM), and circular dichroism (CD). As a result, it was found that SP81-96 and SP76-96 including the C-terminal region spontaneously form amyloid fibrils (FIG. 2).

次に、これらのペプチドのＣ末端領域のそのアミノ酸がアミロイド線維形成に重要であるかを調べるために、Ｃ末端を少しずつ削ったペプチドを作成してアミロイド線維形成を調べた。その結果、９４番目のＰｈｅ（Ｐｈｅ９４）を持っているＳＰ７６−９４はアミロイド線維を形成するが、Ｐｈｅ９４がないＳＰ７６−９３やＳＰ７６−９１はアミロイド線維を成形しないことが分かった。これらの結果から、Ｐｈｅ９４がアミロイド線維形成に重要な役割を果たしていることが示された（図３、表１）。 Next, in order to examine whether the amino acid in the C-terminal region of these peptides is important for amyloid fibril formation, peptides with the C-terminal being gradually removed were prepared to examine amyloid fibril formation. As a result, it was found that SP76-94 having 94th Phe (Phe94) forms amyloid fibrils, but SP76-93 and SP76-91 without Phe94 do not form amyloid fibrils. From these results, it was shown that Phe94 plays an important role in amyloid fibril formation (FIG. 3, Table 1).

そこで、ＳＰ７６−９４あるいはＳＰ７６−９６のＰｈｅ９４をＧｌｙに置換したＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇを合成して、これらのペプチドのアミロイド線維形成について調べた。これらのペプチドはアミロイド核が「種」として存在しなければ、アミロイド線維を形成することはできないが、「種」が存在するとそれを足がかりにして伸長し、結果的にアミロイド線維を形成することが判明した（図４、表１）。すなわち、これらのペプチドは、それ自身はアミロイド核を形成する脳力はないが、アミロイド核が存在していればアミロイド線維伸長を起こすことができるという、極めてユニークな性質を有している。 Therefore, SP76-94F94G and SP76-96F94G in which Phe94 of SP76-94 or SP76-96 was substituted with Gly were synthesized, and amyloid fibril formation of these peptides was examined. These peptides cannot form amyloid fibrils if the amyloid nucleus does not exist as a “species”, but if a “species” exists, they can be used as a foothold to grow and eventually form amyloid fibrils. It became clear (FIG. 4, Table 1). That is, these peptides do not have the brain power to form amyloid nuclei themselves, but have the very unique property that amyloid fibril elongation can occur if amyloid nuclei are present.

これらのペプチドのユニークな性質を利用すれば、検体中にアミロイド線維形成の「種」があるかどうかを判断することができる。すなわち、アミロイド線維を作る「種」があれば、最終的に時間が経てばアミロイドが形成され、様々なアミロイド病が発症する可能性があるので、この「種」の存在を調べることで、アミロイド病の発症を予期することができる。したがって、かかるユニークな性質を有するペプチドは、アミロイド病の早期診断のための検査に非常に有用である。 By utilizing the unique properties of these peptides, it can be determined whether or not there are “species” of amyloid fibril formation in the specimen. In other words, if there is a “seed” that makes amyloid fibrils, amyloid will eventually form over time, and various amyloid diseases may develop. By examining the presence of this “seed”, amyloid The onset of disease can be expected. Therefore, a peptide having such a unique property is very useful for testing for early diagnosis of amyloid disease.

表１の核（種）なし、有りは実施例２の（２）で述べる方法で作成したαシヌクレインのアミロイド線維核（種）のなし、有りを示す。＋は線維が形成されたこと、−は線維が形成されなかったことを示す。ｎ．ｄ．は未測定であることを示す。

The absence or presence of nuclei (species) in Table 1 indicates the presence or absence of amyloid fibril nuclei (species) of α-synuclein prepared by the method described in Example 2 (2). + Indicates that fibers were formed, and-indicates that fibers were not formed. n. d. Indicates unmeasured.

実施例２：本発明のペプチドのアミロイド線維伸長
（１）アミロイド線維伸長およびその条件
アミロイド伸長ペプチドとして、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇをペプチド研究所（大阪）に依頼して化学合成したものを使用した。０．５ｍＭに相当するペプチドを秤量し、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌの緩衝液に溶解し、シリコナイズドした試験管中に調製した。調製したサンプルは、３７℃、１７０ｍｉｎ^−１で振盪し、アミロイド線維形成を行った。 Example 2: Amyloid fibril elongation of peptide of the present invention (1) Amyloid fibril elongation and its conditions As amyloid elongation peptides, SP76-94F94G and SP76-96F94G were chemically synthesized upon request from Peptide Institute (Osaka). did. Peptides corresponding to 0.5 mM were weighed and dissolved in a buffer of 25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl and prepared in a siliconized test tube. The prepared sample was shaken at 37 ° C. and 170 min ⁻¹ to form amyloid fibrils.

（２）αシヌクレインおよび異種タンパク質ＧｒｏＥＳ、インシュリン、リゾチームのアミロイド線維核（種、あるいはシード）の調製
これらのアミロイド線維は以下のようにして形成させた。αシヌクレインおよびＧｒｏＥＳは、それぞれH. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005およびT. Higurashi, Y. Hiragi, K. Ichimura, Y. Seki, K. Soda, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 333, 605-620, 2003に従って精製した。ウシのインシュリンとニワトリのリゾチームはシグマとナカライテスクからそれぞれ購入した。αシヌクレイン、インシュリン、リゾチームのアミロイド線維核の形成方法は上記H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J.Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005に記載された方法で行った。ＧｒｏＥＳは７量体のコシャペロニンであり、病気とは関係のないオリゴマータンパク質であるが、変性状態で長時間放置すると典型的なアミロイド線維を形成することがすでに確かめられており（T. Higurashi, H. Yagi, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 351, 1057-1069, 2005）、その方法に従ってアミロイド線維核を調製した。 (2) Preparation of α-synuclein and amyloid fiber nuclei (seed or seed) of heteroproteins GroES, insulin, and lysozyme These amyloid fibrils were formed as follows. α-synuclein and GroES were obtained from H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005 and T. Higurashi, Y. Hiragi, K, respectively. Purified according to Ichimura, Y. Seki, K. Soda, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 333, 605-620, 2003. Bovine insulin and chicken lysozyme were purchased from Sigma and Nacalai Tesque, respectively. The method for forming amyloid nuclei of α-synuclein, insulin, and lysozyme is described in the above-mentioned H. Yagi, E. Kusaka, K. Hongo, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Biol. Chem. 280, 38609-38616, 2005 Was done by the method. GroES is a 7-mer co-chaperonin and is an oligomeric protein that is not related to disease, but it has already been confirmed that it forms typical amyloid fibrils when left in a denatured state for a long time (T. Higurashi, H. Yagi, T. Mizobata, Y. Kawata, J. Mol. Biol. 351, 1057-1069, 2005), and amyloid fibril nuclei were prepared according to the method.

上記の方法で調製したアミロイド線維核の溶液を超遠心分離（１１０，０００ｘｇ，４℃,１時間）にかけ、沈殿画分を回収し、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５に再懸濁し、溶液中の沈殿が均等になるように超音波破砕（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ２０，ＰＵＬＳＥＲ１，３０秒）を行った後、ＴｈｉｏＴによる蛍光が一定になるように希釈してシード（種）サンプル（タンパク質量は３０μｇ程度）を調製した。 The solution of amyloid fibril nuclei prepared by the above method is subjected to ultracentrifugation (110,000 × g, 4 ° C., 1 hour), the precipitate fraction is collected, resuspended in 25 mM Tris-HCl pH 7.5, After ultrasonic disruption (Amplitude 20, PULSER 1, 30 seconds) so that the precipitate is uniform, dilute so that the fluorescence by ThioT becomes constant, and seed (seed) sample (protein amount is about 30 μg) Prepared.

（３）各種シード存在下でのＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇを用いた線維伸長
本発明のペプチドの由来と同種であるαシヌクレインアミロイド線維シードや異種タンパク質で病気とは無関係のＧｒｏＥＳタンパク質のアミロイド線維シード、異種タンパク質であるが病気に関連しているインシュリンとリゾチームのアミロイド線維シードをそれぞれ存在させて、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧとＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇによるアミロイド線維伸長実験を行った。 (3) Fiber elongation using SP76-94F94G and SP76-96F94G in the presence of various seeds α-synuclein amyloid fiber seeds that are the same species as the origin of the peptide of the present invention and amyloid fibers of the GroES protein that are heterogeneous and unrelated to disease The seeds, amyloid fiber seeds of insulin and lysozyme, which are heterogeneous proteins but related to illness, were present, respectively, and amyloid fiber elongation experiments with SP76-94F94G and SP76-96F94G were performed.

１ＭＮａＣｌを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５緩衝液に終濃度５μＭのＴｈｉｏＴ、１〜６ｍｇ／ｍｌのアミロイド線維を伸長させるべきペプチドを、様々なシード存在下でよく混合した後、１５０μｌずつ、９６穴のプラスチックマルチプレートのウェルに分注し、ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌＲＴでシールし、アルミホイルで遮光しながらＴＡＩＴＥＣＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲＢＲ−５１を用いて、１２０ｍｉｎ^−１で振盪させながら、３７℃でインキュベートした。適当な時間に、アミロイド線維形成の指標となるＴｈｉｏＴの蛍光測定をＴＥＣＡＮＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００プレートリーダーを用いて行った。ＳＰ７６−９４Ｆ９４Ｇを用いた結果を図５に示した。同種のαシヌクレインのシードからは４８時間後にはアミロイド線維伸長がすでに起こっていた。一方、異種タンパク質のインシュリンのシードでも９６時間後には、ＧｒｏＥＳのシードとリゾチームのシードは１９２時間後にアミロイド線維伸長が起こっていることが明らかになった。 A peptide to elongate a final concentration of 5 μM ThioT and 1-6 mg / ml amyloid fibrils in 25 mM Tris-HCl pH 7.5 buffer containing 1 M NaCl was mixed well in the presence of various seeds. The solution was dispensed into wells of a plastic multi-plate with holes, sealed with Thermal Seal RT, and incubated at 37 ° C. while shaking at 120 min ⁻¹ using TAITEC BIO-SHAKER BR-51 while light-shielding with aluminum foil. At an appropriate time, fluorescence measurement of ThioT, which is an index of amyloid fibril formation, was performed using a TECAN Infinite M200 plate reader. The results using SP76-94F94G are shown in FIG. Amyloid fibril elongation had already occurred 48 hours after the seed of the same α-synuclein. On the other hand, it was clarified that the amyloid fibril elongation occurred after 192 hours in the seed of GroES and the seed of lysozyme in the seed of insulin of the heterologous protein.

さらに、この反応が線維核由来であることを裏付けるとともに、線維の詳細な形態観察を、さらに感度の良い蛍光顕微鏡を用いて行った。１ＭＮａＣｌを含む２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５緩衝液に終濃度５〜２０μＭのＴｈｉｏＴ、１〜６ｍｇ／ｍｌのアミロイド線維を伸長させるべきペプチドをそれぞれ、シード存在下でよく混合した後、１０μｌをスライドガラス上に載せ、気泡が入らないように丁寧にカバーガラスで覆った後、余分な溶液をクリーンワイプで吸い取り、周囲をマニキュアで固め、アルミホイルで遮光した状態で３７℃、２０〜４８時間インキュベートした。使用ペプチドはＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇであった。核シードの量は３０μｇ、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇの量はαシヌクレインとＧｒｏＥＳシードの場合３ｍｇ／ｍｌ、インシュリンシードおよびリゾチームシードの場合６ｍｇ／ｍｌであった。アミロイド線維伸長は、ＺＥＩＳＳＡｘｉｏｖｅｒｔ２００蛍光顕微鏡を用い、ＴｈｉｏＴの蛍光によって調べた。結果を図６に示す。同種であるαシヌクレインのシードだけでは見られなかったアミロイド線維（図６ａ）がＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇ添加後４８時間（図６ｂ）で、さらに異種シードであるＧｒｏＥＳシード添加後４８時間（図６ｃ）、インシュリンシード（図６ｄ）、リゾチームシード（図６ｅ）の２０時間後に伸長したアミロイド線維の蛍光顕微鏡写真を示した。このように、ＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇは、異種シードであるインシュリンシードおよびリゾチームシードからもアミロイド線維を伸長できることが確認された。 Furthermore, while confirming that this reaction was derived from the fiber nucleus, detailed morphological observation of the fiber was performed using a more sensitive fluorescence microscope. A 25 mM Tris-HCl pH 7.5 buffer containing 1 M NaCl is mixed with a peptide to elongate a final concentration of 5-20 μM ThioT and 1-6 mg / ml amyloid fibrils in the presence of seeds, and then 10 μl is slid. Place on glass and cover carefully with a cover glass to prevent air bubbles from entering. Absorb excess solution with clean wipe, harden around with nail polish, and incubate at 37 ° C for 20 to 48 hours with light shielded with aluminum foil. did. The peptide used was SP76-96F94G. The amount of nuclear seed was 30 μg, and the amount of SP76-96F94G was 3 mg / ml for α-synuclein and GroES seeds and 6 mg / ml for insulin seeds and lysozyme seeds. Amyloid fibril elongation was examined by ThioT fluorescence using a ZEISS Axiovert 200 fluorescence microscope. The results are shown in FIG. Amyloid fibrils (FIG. 6a), which were not found only with the same α-synuclein seed, were 48 hours after addition of SP76-96F94G (FIG. 6b), and 48 hours after addition of the heterogeneous seed, GroES seed (FIG. 6c). Fluorescence micrographs of amyloid fibrils stretched 20 hours after the seed (FIG. 6d) and lysozyme seed (FIG. 6e) are shown. Thus, it was confirmed that SP76-96F94G can extend amyloid fibrils also from heterogeneous seeds of insulin seed and lysozyme seed.

これらの結果から、ＳＰ７６−９４Ｆ９４ＧやＳＰ７６−９６Ｆ９４Ｇには、同種のαシヌクレインのシードからは最も早く、そして、異種タンパク質由来の線維核からでも線維を伸長させる能力を有することが判明した。このように、このペプチドは脳神経変性病に関わるαシヌクレインのアミロイド線維形成をはじめ、他のアミロイド病（インシュリンやリゾチームが関与）、更には、病気とは関係していないＧｒｏＥＳタンパク質のアミロイド線維でさえ、それらの「種」が存在していればそれを基に伸長する性質を有することが証明された。このユニークな性質は、これらの本発明のペプチドを広範なアミロイド病の早期診断や検査に使用可能ならしめるものである。 From these results, it was found that SP76-94F94G and SP76-96F94G are the earliest from the seeds of the same kind of α-synuclein and have the ability to extend the fiber even from the fiber nucleus derived from the heterologous protein. Thus, this peptide includes α-synuclein amyloid fibril formation related to cranial neurodegenerative diseases, other amyloid diseases (including insulin and lysozyme), and even amyloid fibrils of GroES protein that are not related to the disease. It has been proved that these “species” have the property of extending based on them if they exist. This unique property makes these peptides of the present invention usable for early diagnosis and testing of a wide range of amyloid diseases.

本発明は、アミロイド病の診断薬および予防・治療薬の分野において利用可能である。 The present invention can be used in the fields of diagnostic agents and preventive / therapeutic agents for amyloid diseases.

SEQ ID NO:1 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.

SEQ ID NO:2 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.

SEQ ID NO:3 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.

SEQ ID NO:4 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-94F94G).

SEQ ID NO:5 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-95F94G).

SEQ ID NO:6 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-96F94G).

SEQ ID NO:7 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein (SP76-94).

SEQ ID NO:8 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein (SP76-95).

SEQ ID NO:9 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein (SP76-96).

SEQ ID NO:10 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-96 of alpha-synuclein (SP81-96).

SEQ ID NO:11 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-89 of alpha-synuclein (SP76-89).

SEQ ID NO:12 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-89 of alpha-synuclein (SP81-89).

SEQ ID NO:13 is an amino acid sequence of the amyloid fiber core region of human alpha-synuclein. SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.

SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.

SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with other amino acid (Xaa) than phenylalanine.

SEQ ID NO: 4 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-94F94G).

SEQ ID NO: 5 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-95F94G).

SEQ ID NO: 6 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein in which amino acid 94 is substituted with glycine (SP76-96F94G).

SEQ ID NO: 7 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-94 of alpha-synuclein (SP76-94).

SEQ ID NO: 8 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-95 of alpha-synuclein (SP76-95).

SEQ ID NO: 9 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-96 of alpha-synuclein (SP76-96).

SEQ ID NO: 10 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-96 of alpha-synuclein (SP81-96).

SEQ ID NO: 11 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 76-89 of alpha-synuclein (SP76-89).

SEQ ID NO: 12 is an amino acid sequence corresponding to amino acids 81-89 of alpha-synuclein (SP81-89).

SEQ ID NO: 13 is an amino acid sequence of the amyloid fiber core region of human alpha-synuclein.

Claims

The following (a) to (d):
(A) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa (SEQ ID NO: 1),
(B) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa-Val (SEQ ID NO: 2),
(C) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Xaa-Val-Lys (SEQ ID NO: 3) And (d) a peptide in which one to several amino acids are added, deleted or substituted in the peptides of (a) to (c) [in (a) to (c), Xaa is any one other than Phe Means an amino acid, and Xaa is retained in the peptide described in (d)]
A peptide selected from the group consisting of:

The peptide according to claim 1, wherein Xaa is Gly, Ala, Ser, Met, His, Leu or Arg.

The peptide according to claim 2, wherein Xaa is Gly.

The following (e) to (g):
(E) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4),
(F) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Val (SEQ ID NO: 5), and (G) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Gly-Val-Lys (SEQ ID NO: 6)
The peptide according to claim 3, which is selected from the group consisting of:

The peptide according to any one of claims 1 to 4, which is labeled.

The composition for a test | inspection of amyloid disease containing the peptide of any one of Claims 1-5.

A test kit for amyloid disease comprising the peptide according to any one of claims 1 to 5 as a constituent component.

A method for testing amyloid disease, comprising contacting a peptide according to any one of claims 1 to 5 with a sample obtained from a subject, and then examining the presence or absence of amyloid fibril formation, Is generated, the method determines that the subject has or is likely to suffer from amyloid disease.

The following (h) to (m):
(H) the peptide according to any one of claims 1 to 4,
(I) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe (SEQ ID NO: 7),
(J) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val (SEQ ID NO: 8),
(K) Ala-Val-Ala-Gln-Lys-Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SEQ ID NO: 9) ,
(L) Thr-Val-Glu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ile-Ala-Ala-Ala-Thr-Gly-Phe-Val-Lys (SEQ ID NO: 10), and (m) (i)-( k) Peptide in which one to several amino acids are added, deleted or substituted in the peptide of k) (however, the 94th Phe is retained)
A pharmaceutical composition for preventing or treating amyloid disease, comprising a peptide selected from the group consisting of: