JP2011115098A - Method for evaluating skin for predicting reduction of skin brightness by aging - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法に関する。 The present invention relates to a skin evaluation method for predicting a decrease in skin lightness due to aging.
加齢により、皮膚明度が低下することが知られている。これは、加齢によってメラニン量が増加する、新陳代謝が低下し皮膚のターンオーバーが遅延する、血流が低下するなどが原因であると考えられる。特に、顔や首などの皮膚明度の低下は、常に他人から見られる部位であるため非常に気になり、大きな精神的ダメージを被る。また、皮膚明度の低下を隠す方法として、例えばメイク用品のファンデーションやコンシーラーなどがあるが、その効果は十分なものではなかった。このように、加齢による皮膚明度の低下は、我々にとって大きな悩みではあるが、年齢を重ねると誰にでも起こり得る現象であるため、対処は難しいとの考え方が一般的であった。 It is known that skin brightness decreases with aging. This is thought to be due to an increase in the amount of melanin with aging, a decrease in metabolism, a delay in skin turnover, and a decrease in blood flow. In particular, a decrease in skin brightness such as the face and neck is a part that is always seen by others, and is very worrisome and suffers great mental damage. In addition, as a method for hiding the decrease in skin lightness, for example, there are makeup product foundations and concealers, but the effect is not sufficient. As described above, the decrease in skin lightness due to aging is a big problem for us, but it is a general idea that it is difficult to deal with because it is a phenomenon that can occur to anyone as they age.
しかしながら、加齢による皮膚明度の低下は誰にでも起こり得るものの、その程度には大きな差があることが経験上知られている。即ち、皮膚明度の変化を同年代で比較した場合、皮膚明度が大きく低下するヒトがいる一方で、それほど低下しないヒトがいる。このように、皮膚明度の低下には極めて個人差があると考えられる。そこで、加齢による皮膚明度の低下をある程度予測することができれば、皮膚明度が低下する前から念入りにアンチエイジング対応の医薬品、医薬部外品および化粧品を使用することで、将来起こり得る皮膚明度の低下を予防・改善することができると考えられる。 However, although it is possible for anyone to cause a decrease in skin lightness due to aging, experience has shown that there is a large difference in the degree. That is, when changes in skin lightness are compared in the same ages, there are humans whose skin lightness is greatly reduced, while there are humans who are not so much lowered. Thus, it is considered that there is a great individual difference in the decrease in skin lightness. Therefore, if the decrease in skin lightness due to aging can be predicted to some extent, the use of anti-aging drugs, quasi-drugs, and cosmetics carefully before the skin lightness decreases can lead to a possible skin lightness in the future. It is thought that the decrease can be prevented and improved.
皮膚における特定の因子を測定することにより、将来起こり得る皮膚性状の変化を予測することは既に行われている。例えば、シミに特異的な遺伝子の発現量を測定することにより、シミ形成の起こり易さを予測する方法（特許文献１、２）が知られている。また、角質細胞の微絨毛様突起を観察することにより、将来的な皮膚バリア機能の程度を予測する方法（特許文献３）が知られている。しかし、加齢による皮膚明度の低下を予測する方法については、これまで知られていない。 Predicting possible changes in skin properties has already been done by measuring specific factors in the skin. For example, there is known a method (Patent Documents 1 and 2) that predicts the likelihood of spot formation by measuring the expression level of a gene specific to the spot. In addition, a method (Patent Document 3) for predicting the future degree of skin barrier function by observing microvilliform processes of keratinocytes is known. However, a method for predicting a decrease in skin lightness due to aging has not been known so far.
一方、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＮＡＤＨ脱水素酵素）は、ミトコンドリア電子伝達系の呼吸鎖複合体Ｉにおいて、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子供与体として、酸化型電子受容体を還元型に変換する反応を触媒する酵素である。ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの量または活性が低下することによって引き起こされる疾患群として、例えばミトコンドリア異常症が知られており、症例部位においては、ミトコンドリアの呼吸鎖複合体Ｉの活性が低下していることが知られている（非特許文献１）。また、アルツハイマー病患者の脳組織においては、健常者の脳組織と比べてＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの量が減少していることが知られている（特許文献４）。 On the other hand, NADH dehydrogenase (NADH dehydrogenase) converts oxidized electron acceptor into reduced form using NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) as an electron donor in respiratory chain complex I of mitochondrial electron transport system. It is an enzyme that catalyzes the reaction that occurs. As a disease group caused by a decrease in the amount or activity of NADH dehydrogenase, for example, mitochondrial abnormalities are known, and it is known that the activity of mitochondrial respiratory chain complex I is reduced in the case site. (Non-Patent Document 1). Further, it is known that the amount of NADH dehydrogenase is reduced in the brain tissue of Alzheimer's disease patients as compared with the brain tissue of healthy subjects (Patent Document 4).
本発明者は、加齢による皮膚明度の低下が起こるか否かを予測できる手法について鋭意検討した。 This inventor earnestly examined about the technique which can predict whether the fall of the skin lightness by aging will occur.
本発明は、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量と皮膚明度に相関があることを見出したものである。従って、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を調べることにより、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することが可能であることが明らかとなった。以下に列挙する皮膚評価方法を提供する。
［１］皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を指標とする、加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法。
［２］前記ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅが、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２である、［１］に記載の皮膚評価方法。
［３］角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより決定される、［１］および［２］に記載の皮膚評価方法。
［４］加齢による皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進させる能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とするスクリーニング方法。
The present invention has been found that there is a correlation between the expression level of NADH dehydrogenase in the skin and the skin brightness. Therefore, it became clear by examining the expression level of NADH dehydrogenase in the skin that it is possible to determine that the skin is susceptible to a decrease in skin brightness due to aging. The skin evaluation methods listed below are provided.
[1] A skin evaluation method for predicting a decrease in skin lightness due to aging, using the expression level of NADH dehydrogenase in the skin as an index.
[2] The skin evaluation method according to [1], wherein the NADH dehydrogenase is NDUFA1, NDUFB7, and NDUFS2.
[3] The skin evaluation method according to [1] and [2], which is determined by measuring the expression level of NADH dehydrogenase in keratinocytes.
[4] A method for screening an inhibitor of a decrease in skin lightness due to aging, wherein the ability of a candidate compound to promote the expression and / or activity of NADH dehydrogenase is evaluated, and the NADH dehydrogenase promoting factor having the promoting ability is used as a skin A screening method characterized by being selected as a factor for suppressing the decrease in brightness.
本発明により、被験対象部位の皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することによって、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする皮膚評価方法を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a skin evaluation method characterized by determining that the skin lightness is likely to decrease due to aging by measuring the expression level of NADH dehydrogenase in the skin of the test target site. It becomes possible.
本発明の第一の局面は、加齢による皮膚明度の低下を予測するための検査方法を提供する。この方法は、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量が基準発現量よりも低値を示す場合、加齢による皮膚明度の低下が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする。 1st aspect of this invention provides the test | inspection method for estimating the fall of the skin lightness by aging. This method is characterized in that when the expression level of NADH dehydrogenase in the skin is lower than the reference expression level, it is determined that the skin is susceptible to a decrease in skin lightness due to aging.
本発明の加齢による皮膚明度の低下を予測するための皮膚評価方法は、好ましくは以下の一連のステップ（１）〜（３）によって実施される。
（１）被験対象部位の皮膚試料を用意するステップ
（２）前記皮膚試料中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定するステップ
（３）前記発現量から皮膚明度の低下の起こり易さを評価するステップ
The skin evaluation method for predicting a decrease in skin lightness due to aging according to the present invention is preferably performed by the following series of steps (1) to (3).
(1) A step of preparing a skin sample of a site to be tested (2) A step of measuring an NADH dehydrogenase expression level in the skin sample (3) A step of evaluating the likelihood of a decrease in skin lightness from the expression level
本発明の「加齢による皮膚明度の低下を予測する」とは、将来的に生じると考えられる皮膚明度の低下を、現在の皮膚状態から科学的根拠に基づいて推測することである。 “Predicting a decrease in skin lightness due to aging” in the present invention is to estimate a decrease in skin lightness that is expected to occur in the future from the current skin condition based on scientific grounds.
「ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ」は、ミトコンドリア電子伝達系の呼吸鎖複合体Ｉにおいて、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を電子供与体として、酸化型電子受容体を還元型に変換する反応を触媒する酵素であり、いくつかのサブユニットが存在する。本発明における皮膚評価方法としては、皮膚試料中のＮＤＵＦＡ１〜ＮＤＵＦＡ１３、ＮＤＵＦＢ１〜ＮＤＵＦＢ１１、ＮＤＵＦＣ１〜ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＳ１〜ＮＤＵＦＳ８、およびＮＤＵＦＶ１〜ＮＤＵＦＶ３を測定することによって、加齢による皮膚明度の低下を予測することが可能となる。好ましくは、ＮＤＵＦＡ１〜ＮＤＵＦＡ１３、ＮＤＵＦＢ１〜ＮＤＵＦＢ１１およびＮＤＵＦＳ１〜ＮＤＵＦＳ８を測定することによって、皮膚明度の低下を予測することが可能となる。より好ましくは、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２を測定することによって、皮膚明度の低下を予測することが可能となる。 “NADH dehydrogenase” is an enzyme that catalyzes a reaction in the respiratory chain complex I of the mitochondrial electron transport system using NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) as an electron donor and converting an oxidized electron acceptor to a reduced form. There are several subunits. As a skin evaluation method in the present invention, predicting a decrease in skin lightness due to aging by measuring NDUFA1 to NDUFA13, NDUFB1 to NDUFB11, NDUFC1 to NDUFC2, NDUFS1 to NDUFS8, and NDUVV1 to NDUVV3 in skin samples Is possible. Preferably, a decrease in skin lightness can be predicted by measuring NDUFA1 to NDUFA13, NDUFB1 to NDUFB11, and NDUFS1 to NDUFS8. More preferably, by measuring NDUFA1, NDUFB7, and NDUFS2, it is possible to predict a decrease in skin lightness.
検査すべき皮膚は、例えば顔、首、腕、肢など、加齢による皮膚明度の低下が気になるあらゆる部位の皮膚であってよい。また、これらの試料（組織もしくは細胞）の培養物であってもよい。 The skin to be examined may be the skin of any part where the reduction in skin lightness due to aging is a concern, such as the face, neck, arms, and limbs. Moreover, cultures of these samples (tissues or cells) may be used.
本発明中の「角質細胞」とは、皮膚の中で最外層に存在する角質層における細胞を示す。本発明における、皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量の測定は、皮膚中のどの細胞を用いても行うことができる。好ましくは、容易に採取でき、かつ非侵襲的な方法による採取が可能な、角質細胞中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定するのがよい。 The “keratinocytes” in the present invention refer to cells in the stratum corneum existing in the outermost layer in the skin. In the present invention, measurement of NADH dehydrogenase expression level in the skin can be performed using any cell in the skin. Preferably, the NADH dehydrogenase expression level in corneocytes that can be easily collected and collected by a non-invasive method is measured.
皮膚からの試料の採取方法は特に限定されない。例えば、外科的手段などの侵襲的な方法により採取されたものでよい。好ましくは非侵襲的な採取方法を採用することが望ましい。非侵襲的な方法としては、当該技術分野で使用されているテープストリッピングや擦過法などを挙げることができる。 The method for collecting the sample from the skin is not particularly limited. For example, it may be collected by an invasive method such as a surgical means. It is preferable to adopt a non-invasive sampling method. Non-invasive methods include tape stripping and rubbing methods used in the art.
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量の測定方法は特に限定されない。例えば、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードするｍＲＮＡ発現量を測定する方法が挙げられる。 The measuring method of the NADH dehydrogenase expression level in skin is not specifically limited. For example, a method for measuring the expression level of mRNA encoding NADH dehydrogenase can be mentioned.
皮膚中のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量は、皮膚試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行った後にＰＣＲ法を行うことにより決定することができる。ＲＮＡの抽出方法、ＰＣＲ法は当業者にとって周知であり、常法のプロトコール、または常法のプロトコールを適宜修正・変更したプロトコールによって適切な測定系を構築し、そして実施することができる。 The expression level of NADH dehydrogenase mRNA in the skin can be determined by extracting RNA from a skin sample and performing a reverse transcription reaction followed by a PCR method. RNA extraction methods and PCR methods are well known to those skilled in the art, and an appropriate measurement system can be constructed and implemented by a conventional protocol, or a protocol obtained by appropriately modifying or changing a conventional protocol.
皮膚明度の低下の起こり易さの評価は、例えば、算出した発現量を、予め設定した基準発現量と比較して、その比率を計算する。そして、その比率が、複数の区分の中のいずれに該当するのかを調べる。区分の設定に関する具体例を以下に示す。
（例１）皮膚明度の低下の起こり易さ（低い）：比率＜ａ、（中程度）：ａ≦比率＜ｂ、（高い）：ｂ≦比率
For example, the evaluation of the ease of occurrence of a decrease in skin lightness is performed by comparing the calculated expression level with a preset reference expression level and calculating the ratio. Then, it is examined which of the plurality of categories the ratio corresponds to. Specific examples regarding the setting of categories are shown below.
(Example 1) Ease of decrease in skin lightness (low): ratio <a, (medium): a ≦ ratio <b, (high): b ≦ ratio
（例１）では区分数を３としているが、区分数は特に限定されるものではない。例えば、区分数を２〜１０のいずれかにすることができる。区分数、および各区分に関連付けられる基準発現量の値の範囲は、予備実験の結果を基に任意に設定可能である。 In (Example 1), the number of divisions is 3, but the number of divisions is not particularly limited. For example, the number of sections can be any of 2-10. The number of sections and the range of the value of the reference expression level associated with each section can be arbitrarily set based on the results of preliminary experiments.
本発明の第二の局面は、皮膚明度の低下抑制因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、候補化合物をＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅの発現および／または活性を促進する能力について評価し、当該促進能力を有するＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ促進因子を皮膚明度の低下抑制因子として選定することを特徴とする。 The second aspect of the present invention provides a method of screening for a skin lightness decrease inhibitor. This method is characterized in that the candidate compound is evaluated for the ability to promote the expression and / or activity of NADH dehydrogenase, and the NADH dehydrogenase promoting factor having the promoting ability is selected as an inhibitor of decrease in skin lightness.
例えば、被験対象部位の皮膚に候補化合物、または候補化合物を含む製剤を適用し、適用前後のＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより、当該促進能力の評価をすることができる。被験対象部位への候補化合物の適用方法は、塗布や接種など、皮膚への直接的な適用に限定されることはなく、例えば、経口や経鼻などの間接的な適用であってもよい。また、被験対象部位の皮膚試料（組織もしくは細胞）の培養物に候補化合物を適用し、適用の有無によるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ発現量を測定することにより、当該促進能力の評価を行うこともできる。 For example, the promotion ability can be evaluated by applying a candidate compound or a preparation containing the candidate compound to the skin of the test target site, and measuring the NADH dehydrogenase expression level before and after application. The method for applying the candidate compound to the site to be tested is not limited to direct application to the skin, such as application or inoculation, and may be indirect application such as oral or nasal, for example. Further, the promotion ability can also be evaluated by applying a candidate compound to a culture of a skin sample (tissue or cell) at a site to be tested and measuring the expression level of NADH dehydrogenase depending on whether or not it is applied.
以下、本発明を効果的に説明するために、実験例を挙げる。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。 In order to effectively explain the present invention, experimental examples are given below. In addition, this invention is not limited by this.
実験例１ 老化によるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量の減少
正常ヒトケラチノサイト（ＫＫ−４００９、クラボウ）を解凍後、直径６０ｍｍ ｄｉｓｈ（ＦＡＬＣＯＮ）でコンフルエントになるまで培養した。この細胞を継代回数０（Ｐ０）とし、ＲＮＡ抽出キット（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて総ＲＮＡを抽出した。また、繰り返し継代培養を行うことにより、細胞の老化モデルを作製した。継代培養を１回行った細胞をＰ１、２回行った細胞をＰ２、３回行った細胞をＰ３とし、それぞれコンフルエントになった後、ＲＮＡ抽出キットにて総ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた定量ＰＣＲ反応に供し、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのサブユニットのうち、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２遺伝子の発現量を定量した。これらの遺伝子発現量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量で規格化（ノーマライズ）した。なお、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７、ＮＤＵＦＳ２およびＧＡＰＤＨ遺伝子発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
Experimental Example 1 Reduction of NADH dehydrogenase mRNA expression level due to aging Normal human keratinocytes (KK-4409, Kurabo Industries) were thawed and cultured until they became confluent with a 60 mm diameter dish (FALCON). This cell was passaged 0 (P0), and total RNA was extracted with an RNA extraction kit (TRIzol Reagent, Invitrogen). In addition, a cell aging model was prepared by repeated subculture. Cells that had been subcultured once were P1, cells that had been subcultured twice, P2 were cells that had been subcultured 3 times, and P3 were confluent, and then total RNA was extracted with an RNA extraction kit. The obtained RNA was subjected to a quantitative PCR reaction using an RT-PCR kit (SuperScript III Platinum SYBR Green Two-step qRT-PCR kit, Invitrogen). The expression level was quantified. These gene expression levels were normalized (normalized) with the expression level of the GAPDH gene. In addition, the primers used for the measurement of NDUFA1, NDUFB7, NDUFS2 and GAPDH gene expression levels are as follows.
ＮＤＵＦＡ１用のプライマーセット
ＴＧＧＧＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＴＧＡＴ（配列番号１）
ＣＣＧＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＴＡＣ（配列番号２）
ＮＤＵＦＢ７用のプライマーセット
ＡＧＣＡＣＣＧＣＧＡＣＴＡＴＧＴＧＡＴＧ（配列番号３）
ＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴ（配列番号４）
ＮＤＵＦＳ２用のプライマーセット
ＴＴＧＡＴＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣ（配列番号５）
ＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＡ（配列番号６）
ＧＡＰＤＨ用のプライマーセット
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号７）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号８）
Primer set TGGGCGTGTGCTTGTTGAT for NDUFA1 (SEQ ID NO: 1)
CCGTTAGGAACCTGTGGATGTAC (SEQ ID NO: 2)
Primer set AGCACCGCCGACTATGTGATG for NDUFB7 (SEQ ID NO: 3)
CAACTCTGCCCCCTCTCTTCT (SEQ ID NO: 4)
Primer set TTGATCCCCCCTGCCCTATC for NDUFS2 (SEQ ID NO: 5)
ACAGAGGCCAATTTCCAGTGA (SEQ ID NO: 6)
GAPDH primer set TGCACCACCAACTGCCTTAGC (SEQ ID NO: 7)
TCTTCTGGGTGGCAGTGATG (SEQ ID NO: 8)
上記の遺伝子発現量の定量化はΔΔＣｔ法にて行い、Ｐ０におけるＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２ ｍＲＮＡ発現量に対するＰ１、Ｐ２およびＰ３における発現量を算出した。その結果を表１に示す。正常ヒトケラチノサイトの継代数が増加するに伴い、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＢ７およびＮＤＵＦＳ２ ｍＲＮＡ発現量が減少することが明らかとなった。以上より、加齢によって、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量が減少することが示された。 The gene expression level was quantified by the ΔΔCt method, and the expression levels at P1, P2, and P3 relative to the NDUFA1, NDUFB7, and NDUFS2 mRNA expression levels at P0 were calculated. The results are shown in Table 1. It was revealed that the expression levels of NDUFA1, NDUFB7 and NDUFS2 mRNA decreased as the passage number of normal human keratinocytes increased. From the above, it was shown that NADH dehydrogenase mRNA expression level decreased with aging.
実験例２ 皮膚中ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量と皮膚明度の相関
同年代の被験者６名（平均年齢４４歳）の顔面頬部にそれぞれ半径１ｃｍの円状のテープ（Ｂｌｅｎｄｅｒｍ、３Ｍ）を一枚貼り付け、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。得られた角質に含まれるＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ−４ＰＣＲ Ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープをテープごと３５０μＬのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに入れ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、５６℃で１時間インキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて分散させた後、３５０μＬの６４％エタノールを加えて攪拌し、テープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のＦｉｌｔｅｒ ＣａｒｔｒｉｇｅにＲＮＡを吸着させた後に、１００μＬの抽出液でＲＮＡを溶出した。得られた溶出液にＤＮａｓｅＩを加え、残存しているＤＮＡを完全に除去した後、エタノールを用いてＲＮＡを沈殿させてＲＮＡを濃縮した。得られたＲＮＡのペレットを必要量の水に溶解して、角質に含まれる残存ＲＮＡを得た。得られたＲＮＡは、実験例１と同様の方法にて定量ＰＣＲ反応に供し、ＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅのサブユニットの一つであるＮＤＵＦＡ１遺伝子発現量を定量した。ＮＤＵＦＡ１遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子の発現量で規格化した。なお、β−アクチン遺伝子発現量の測定に使用したプライマーを以下に示した。
また、皮膚明度は、上記同一被験者６名の顔面頬部を、分光測色計（ＣＭ−２６００ｄ、コニカミノルタ）にて同一箇所を５回測定し、その平均から皮膚明度（Ｌ値）を算出した。
Experimental Example 2 Correlation between NADH dehydrogenase mRNA expression level in skin and skin lightness A single circular tape (Blenderm, 3M) with a radius of 1 cm was applied to the facial cheeks of 6 subjects of the same age (average age 44 years), After confirming that it was sufficiently adhered, the tape was peeled off to obtain a tape containing keratin. RNA contained in the resulting keratin was extracted using an RNA extraction kit (RNAqueous-4PCR Kit, Ambion). That is, the keratin-attached tape was put into 350 μL of Lysis / Binding Solution together with proteinase K (Invitrogen), and incubated at 56 ° C. for 1 hour. Then, after making it disperse | distribute using an ultrasonic crusher, 350 microliters 64% ethanol was added and stirred, the tape was removed, and the keratin extract was obtained. After adsorbing RNA to the attached Filter Cartridge, the RNA was eluted with 100 μL of the extract. DNase I was added to the obtained eluate to completely remove the remaining DNA, and then RNA was precipitated using ethanol to concentrate the RNA. The obtained RNA pellet was dissolved in a necessary amount of water to obtain residual RNA contained in the stratum corneum. The obtained RNA was subjected to a quantitative PCR reaction in the same manner as in Experimental Example 1, and the expression level of NDUFA1 gene, which is one of the subunits of NADH dehydrogenase, was quantified. The expression level of the NDUFA1 gene was normalized by the expression level of the β-actin gene. In addition, the primer used for the measurement of (beta) -actin gene expression level was shown below.
In addition, the skin brightness was measured five times on the face cheeks of the same six subjects using a spectrocolorimeter (CM-2600d, Konica Minolta), and the skin brightness (L value) was calculated from the average. did.
β−アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号９）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号１０）
Primer set CACTCTCCCAGCCTCTCTCCC for β-actin (SEQ ID NO: 9)
GTGTTGCGCGTACAGGTCTTTG (SEQ ID NO: 10)
上記の遺伝子発現量の定量化はΔΔＣｔ法で行い、ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡの発現量は、標準品の発現量に対する顔面頬部の発現量の比率として算出した。標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量は、ＢｉｏＣｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＴｏｔａｌ ＲＮＡ（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｒ１２３４２１８−Ｐ）を用いて算出した。遺伝子発現比率が１以上となった場合は、顔面頬部角質中のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が、標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量よりも高いことを示している。
ΔΔＣｔ＝（顔面頬部のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡのＣｔ値―顔面頬部のβ−アクチンｍＲＮＡのＣｔ値）―（標準品のＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡのＣｔ値―標準品のβ−アクチンｍＲＮＡのＣｔ値）
遺伝子発現比率＝２−ΔΔＣｔ
The gene expression level was quantified by the ΔΔCt method, and the expression level of NDUFA1 mRNA was calculated as the ratio of the expression level of the facial cheek to the expression level of the standard product. The NDUFA1 mRNA expression level of a standard product was calculated using Total RNA (Catalog No. R1234218-P) purchased from BioChain Institute. When the gene expression ratio is 1 or more, it indicates that the NDUFA1 mRNA expression level in the facial cheek corneum is higher than the standard NDUFA1 mRNA expression level.
ΔΔCt = (Ct value of NDUFA1 mRNA in the face cheek region—Ct value of β-actin mRNA in the face cheek region) — (Ct value of NDUFA1 mRNA in the standard product—Ct value of β-actin mRNA in the standard product)
Gene expression ratio = 2− ΔΔCt
その結果を表２に示す。皮膚中ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が高値を示す被験者（被験者１〜３）においては、高いＬ値を示し、ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量が低値を示す被験者（被験者４〜６）においては、低いＬ値を示すことが明らかとなった。従って、皮膚中ＮＤＵＦＡ１ ｍＲＮＡ発現量と皮膚明度に相関があることが示された。以上より、皮膚におけるＮＡＤＨ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｍＲＮＡ発現量を測定することにより、従来技術では評価することができなかった、加齢による皮膚明度の低下について予測することが可能となった。 The results are shown in Table 2. Subjects with high NDUFA1 mRNA expression levels in skin (subjects 1-3) show high L values, and subjects with low NDUFA1 mRNA expression levels (subjects 4-6) show low L values. It became clear. Therefore, it was shown that there is a correlation between the NDUFA1 mRNA expression level in the skin and the skin brightness. From the above, by measuring the NADH dehydrogenase mRNA expression level in the skin, it was possible to predict a decrease in skin lightness due to aging, which could not be evaluated by the prior art.
本発明の加齢による皮膚明度の低下を予測する皮膚評価方法によれば、加齢による皮膚明度の低下が起こり易いか否かを判断することができる。また、皮膚明度の低下が起こる前から皮膚明度の低下に対する手入れを行うことで、今まで以上の効果が期待できる。さらに、皮膚明度の低下抑制因子を適切に選定することができる。 According to the skin evaluation method for predicting a decrease in skin brightness due to aging according to the present invention, it can be determined whether or not a decrease in skin brightness due to aging is likely to occur. Further, by taking care of the decrease in skin brightness before the decrease in skin brightness occurs, it is possible to expect more effects than ever. Furthermore, it is possible to appropriately select a factor that suppresses the decrease in skin brightness.
Claims (4)
A method for screening an inhibitor of a decrease in skin lightness due to aging, wherein the ability of a candidate compound to promote the expression and / or activity of NADH dehydrogenase is evaluated, and the NADH dehydrogenase promoter having the promotion ability is decreased A screening method comprising selecting as a suppressor.
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