JP2011112631A - Method for pretreating sample for detection of hepatitis c virus core protein and reagent kit for pretreatment - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのコア蛋白（ＨＣＶコア蛋白）検出のための試料の前処理方法及び前処理用試薬キットに関する。 The present invention relates to a sample pretreatment method and a pretreatment reagent kit for detecting a hepatitis C virus core protein (HCV core protein).
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされる伝染性の疾病である。ＨＣＶは、直径約６０ｎｍのＲＮＡウイルスで、エンベロープをもつ。ＨＣＶ ＲＮＡは一本鎖プラス鎖で、約９５００塩基配列よりなっている。遺伝子構造はフラビウィルスに類似しており、５’末端と３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）があり、この間に約３０００アミノ酸をコードする翻訳領域が存在する。翻訳領域は、５’側より、構造タンパクをコードするコア領域、エンベロープ領域１、エンベロープ領域２があり、これに続いて非構造領域が存在する。 Hepatitis C is an infectious disease caused by hepatitis C virus (HCV). HCV is an RNA virus with a diameter of about 60 nm and has an envelope. HCV RNA is a single-stranded plus strand consisting of approximately 9500 base sequences. The gene structure is similar to that of flavivirus, with an untranslated region (UTR) at the 5 'end and 3' end, and a translation region encoding about 3000 amino acids between them. The translation region has, from the 5 'side, a core region encoding a structural protein, an envelope region 1 and an envelope region 2, followed by a non-structural region.
ＨＣＶを検出するための方法として、コア領域がコードするＨＣＶコア蛋白を抗原とし、免疫学的手法を用いて検出する方法が知られている。ここで、ＨＣＶコア蛋白は、エンベロープを持つHCVの内部に存在する。従って、ＨＣＶコア蛋白を抗原として検出するには、ＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる必要がある。ＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる前処理方法としては、ＨＣＶをアルカリ性溶液で処理した後、酸性溶液で中和する前処理方法が知られている。例えば、特許文献１には、Ｃ型肝炎ウイルスを含む疑いのある試料を、非イオン性界面活性剤、蛋白変性剤及びアルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程、及び第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程により、ＨＣＶコア蛋白を遊離させる前処理方法が開示されている。 As a method for detecting HCV, a method is known in which an HCV core protein encoded by a core region is used as an antigen and is detected using an immunological technique. Here, the HCV core protein exists inside the enveloped HCV. Therefore, in order to detect HCV core protein as an antigen, it is necessary to release HCV core protein from HCV. As a pretreatment method for releasing HCV core protein from HCV, a pretreatment method is known in which HCV is treated with an alkaline solution and then neutralized with an acidic solution. For example, Patent Document 1 discloses a first treatment step in which a sample suspected of containing hepatitis C virus is treated with a reagent containing a nonionic surfactant, a protein denaturant, and an alkaline substance, and a first treatment step. A pretreatment method is disclosed in which the HCV core protein is released by a second treatment step in which the sample obtained in (2) is treated with a reagent containing an acidic substance.
特許文献１のような、ＨＣＶをアルカリ性溶液で処理した後、酸性溶液で中和する方法を用いれば、簡便に短時間でＨＣＶコア蛋白を検出するための試料を調製することができる。しかしながら、当該方法で調整した試料を使用し、粒子を用いた免疫測定法でＨＣＶコア蛋白を検出する場合、Ｂ／Ｆ分離を行った後、粒子を液相に分散させると粒子の凝集が生じることがある。 If a method of treating HCV with an alkaline solution and then neutralizing with an acidic solution as in Patent Document 1, a sample for detecting HCV core protein can be easily prepared in a short time. However, when HCV core protein is detected by immunoassay using particles using a sample prepared by this method, particle aggregation occurs when particles are dispersed in the liquid phase after B / F separation. Sometimes.
従って、本発明は、上述の粒子の凝集を抑制することが可能な、ＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理方法、及びＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理用試薬キットを提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention provides a sample pretreatment method for detecting HCV core protein, and a sample pretreatment reagent kit for detecting HCV core protein, which can suppress the aggregation of the particles described above. For the purpose.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させるのに用いられるアルカリ性物質を含有する試薬、並びに酸性物質を含有する試薬の少なくとも一方に還元剤を添付することにより、粒子の凝集を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have determined that at least one of a reagent containing an alkaline substance and a reagent containing an acidic substance used to release HCV core protein from HCV. The inventors have found that the aggregation of particles can be suppressed by attaching a reducing agent to the present invention, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は
（１）粒子を用いた免疫測定法によるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白の検出のための試料の前処理方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、を含み、
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する、ＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理方法；
（２）還元剤が、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも１つである（１）に記載の方法；
（３）第１処理工程で用いられる試薬が、さらに非イオン性界面活性剤を含有する、（１）または（２）に記載の方法；
（４）非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤から選択される（３）に記載の方法；
（５）第１処理工程で用いられる試薬が、さらにカオトロピック剤を含有する、（１）〜（４）いずれかに記載の方法；
（６）カオトロピック剤が、尿素、グアニジン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム、アセトアミド及びホルムアミドから選択される少なくとも１つである（５）に記載の方法；
（７）アルカリ性物質が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化マグネシウムから選択される少なくとも１つである（１）〜（６）いずれかに記載の方法；
（８）酸性物質が、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸及び硫酸から選択される少なくとも１つである（１）〜（７）いずれかに記載の方法；
（９）粒子が、磁性粒子である（１）〜（８）いずれかに記載の方法；
（１０）第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、（１）〜（９）いずれかに記載の方法；
（１１）無機塩類が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも１つである（１０）に記載の方法；
（１２）免疫測定法が、液相中で形成されたHCVコア蛋白、抗ＨＣＶコア蛋白抗体および磁性粒子からなる複合体を、磁気分離によって液相から分離してHCVコア蛋白を検出する免疫測定法である（９）記載の試料の方法；
（１３）粒子を用いた免疫測定法によるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）コア蛋白の検出のための試料の前処理用試薬キットであって、アルカリ性物質を含む第１試薬と、酸性物質を含む第２試薬と、
を含み、第１試薬及び第２試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスの有無を判定するための試薬キット；
（１４）第１試薬及び第２試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、（１３）に記載の試薬キット；
（１５）第１試薬が、さらに非イオン性界面活性剤を含有する、（１３）または（１４）に記載の試薬キット；
（１６）第１試薬が、さらにカオトロピック剤を含有する、請求項１３〜１５いずれかに記載の試薬キット；
を提供する。
That is, the present invention is (1) a sample pretreatment method for detecting hepatitis C virus (HCV) core protein by immunoassay using particles, wherein a sample suspected of containing hepatitis C virus is obtained. A first treatment step for treating with a reagent containing an alkaline substance, and a second treatment step for treating the sample obtained in the first treatment step with a reagent containing an acidic substance,
A sample pretreatment method for detecting HCV core protein, wherein at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step contains a reducing agent;
(2) The method according to (1), wherein the reducing agent is at least one selected from mercaptoethylamine, mercaptoethanol, dithiothreitol, cysteine, dithioerythritol, sodium borohydride and phosphine;
(3) The method according to (1) or (2), wherein the reagent used in the first treatment step further contains a nonionic surfactant;
(4) The method according to (3), wherein the nonionic surfactant is selected from polyoxyethylene-based nonionic surfactants;
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the reagent used in the first treatment step further contains a chaotropic agent;
(6) The method according to (5), wherein the chaotropic agent is at least one selected from urea, guanidine hydrochloride, sodium salicylate, acetamide, and formamide;
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein the alkaline substance is at least one selected from sodium hydroxide, potassium hydroxide, and magnesium hydroxide;
(8) The acidic substance is at least one selected from acetic acid, lactic acid, citric acid, malic acid, succinic acid, phosphoric acid, formic acid, fumaric acid, tartaric acid, hydrochloric acid and sulfuric acid (1) to (7) A method according to crab;
(9) The method according to any one of (1) to (8), wherein the particles are magnetic particles;
(10) The method according to any one of (1) to (9), wherein at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step contains an inorganic salt;
(11) The method according to (10), wherein the inorganic salt is at least one selected from sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride and sodium sulfate;
(12) An immunoassay in which the immunoassay detects a HCV core protein by separating a complex of HCV core protein, anti-HCV core protein antibody and magnetic particles formed in the liquid phase from the liquid phase by magnetic separation. (9) the sample method according to the method;
(13) A sample pretreatment reagent kit for detecting hepatitis C virus (HCV) core protein by immunoassay using particles, comprising a first reagent containing an alkaline substance and a first reagent containing an acidic substance Two reagents,
A reagent kit for determining the presence or absence of hepatitis C virus, wherein at least one of the first reagent and the second reagent contains a reducing agent;
(14) The reagent kit according to (13), wherein at least one of the first reagent and the second reagent contains an inorganic salt;
(15) The reagent kit according to (13) or (14), wherein the first reagent further contains a nonionic surfactant;
(16) The reagent kit according to any one of claims 13 to 15, wherein the first reagent further contains a chaotropic agent;
I will provide a.
本発明によれば、粒子を用いた免疫測定法によるＨＣＶコア蛋白の検出において、粒子の凝集を抑制することができる。 According to the present invention, particle aggregation can be suppressed in detection of HCV core protein by immunoassay using particles.
本実施形態におけるＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理方法は、粒子を用いた免疫測定法によるＨＣＶコア蛋白の検出に用いられる、試料の前処理方法であって、Ｃ型肝炎ウイルスを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、を含み、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する。 The sample pretreatment method for detecting HCV core protein in this embodiment is a sample pretreatment method used for detection of HCV core protein by immunoassay using particles, and includes hepatitis C virus. A first treatment step of treating a suspicious sample with a reagent containing an alkaline substance; and a second treatment step of treating a sample obtained in the first treatment step with a reagent containing an acidic substance, At least one of the reagents used in the first processing step and the second processing step contains a reducing agent.
本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、還元剤を含む。第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが還元剤を含有することにより、後述する分離工程において、粒子の凝集を抑制することができる。ここで、「還元剤」は、後述する形成工程に影響を及ぼさない還元剤であれば、特に限定されない。本実施形態における還元剤としては、特に、蛋白質のジスルフィド結合を解離させるものが好ましい。より具体的な還元剤としては、例えば、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、システイン、ジチオエリトリオール、水酸化ホウ素ナトリウムまたはホスフィンなどが挙げられる。本実施形態における還元剤としては、特にメルカプトエチルアミン、ジチオトレイトールおよびシステイン塩酸塩が好ましい。 In this embodiment, at least one of the reagents used in the first processing step and the second processing step includes a reducing agent. When at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step contains a reducing agent, particle aggregation can be suppressed in the separation step described later. Here, the “reducing agent” is not particularly limited as long as it is a reducing agent that does not affect the formation process described later. As the reducing agent in the present embodiment, those that dissociate protein disulfide bonds are particularly preferable. More specific reducing agents include, for example, mercaptoethylamine, mercaptoethanol, dithiothreitol, cysteine, dithioerythriol, sodium borohydride or phosphine. As the reducing agent in the present embodiment, mercaptoethylamine, dithiothreitol and cysteine hydrochloride are particularly preferable.
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有される還元剤の濃度は、使用する還元剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、還元剤としてメルカプトエチルアミンを用いる場合、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有されるメルカプトエチルアミンの濃度は、１０〜６０ｍＭが好ましい。 The concentration of the reducing agent contained in at least one of the reagents used in the first processing step and the second processing step may be appropriately adjusted depending on the type of the reducing agent used, and is not limited. For example, when mercaptoethylamine is used as the reducing agent, the concentration of mercaptoethylamine contained in at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step is preferably 10 to 60 mM.
本実施形態において、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つは、さらに無機塩類を含有することが好ましい。第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、さらに無機塩類を含有することにより、後述する分離工程において、粒子の凝集をさらに抑制することができる。ここで、「無機塩類」は、後述する形成工程に影響を及ぼさない塩類であれば、特に限定されない。本実施形態における塩類としては、特に、無機塩が好ましい。より具体的な無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムまたは硫酸ナトリウムなどが挙げられる。本実施形態における塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび硫酸ナトリウムが好ましい。 In this embodiment, it is preferable that at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step further contains an inorganic salt. When at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step further contains an inorganic salt, particle aggregation can be further suppressed in the separation step described later. Here, the “inorganic salts” are not particularly limited as long as they are salts that do not affect the formation process described later. As the salts in this embodiment, inorganic salts are particularly preferable. More specific inorganic salts include, for example, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride or sodium sulfate. As salts in this embodiment, sodium chloride, potassium chloride, and sodium sulfate are preferable.
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有される無機塩類の濃度は、使用する無機塩類の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、無機塩類として塩化ナトリウムを用いる場合、第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つに含有される塩化ナトリウムの濃度は、０．１〜１．０Ｍが好ましい。 The concentration of the inorganic salts contained in at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step may be adjusted as appropriate according to the type of inorganic salts used, and is not limited. For example, when sodium chloride is used as the inorganic salt, the concentration of sodium chloride contained in at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step is preferably 0.1 to 1.0M.
ここで、「ＨＣＶを含む疑いのある試料」は、生体試料又は生体試料から調製された試料が好ましい。生体試料及び生体試料から調製された試料としては、例えば、尿、糞便、全血、血漿、血清、胆汁、胃腸分泌物、リンパ液、精液、骨髄液、唾液、母乳、組織抽出液、組織ホモジネート、細胞抽出液、細胞ホモジネートなどが挙げられる。 Here, the “sample suspected of containing HCV” is preferably a biological sample or a sample prepared from a biological sample. Examples of biological samples and samples prepared from biological samples include urine, feces, whole blood, plasma, serum, bile, gastrointestinal secretions, lymph, semen, bone marrow, saliva, breast milk, tissue extract, tissue homogenate, Examples include cell extracts and cell homogenates.
本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらに非イオン性界面活性剤を含有することが好ましい。ここで、「非イオン性界面活性剤」は、上述のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができる非イオン性界面活性剤であれば、特に限定されない。本実施形態における非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好ましい。具体的なポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（Triton X-100、Triton X-114及びNP-40等）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Tween-20及びTween-80等）、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル（Brij35及びBrij45等）などが挙げられる。本実施形態におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。 In this embodiment, it is preferable that the reagent used in the first treatment step further contains a nonionic surfactant. Here, the “nonionic surfactant” is not particularly limited as long as it is a nonionic surfactant that can be used in the method of releasing the HCV core protein from HCV. As the nonionic surfactant in this embodiment, a polyoxyethylene nonionic surfactant is preferable. Specific examples of the polyoxyethylene-based nonionic surfactant include polyoxyethylene alkylphenyl ether (Triton X-100, Triton X-114, NP-40, etc.), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (Tween- 20 and Tween-80), and polyoxyethylene alkyl ether (Brij35 and Brij45). As the polyoxyethylene nonionic surfactant in the present embodiment, polyoxyethylene alkyl ether is preferable.
第１処理工程における、非イオン性界面活性剤の濃度は、使用する非イオン性界面活性剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、非イオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを用いる場合、第１処理工程における、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの濃度は２〜４％が好ましい。 The concentration of the nonionic surfactant in the first treatment step may be appropriately adjusted depending on the type of nonionic surfactant to be used, and is not limited. For example, when polyoxyethylene alkyl ether is used as the nonionic surfactant, the concentration of polyoxyethylene alkyl ether in the first treatment step is preferably 2 to 4%.
また、本実施形態において、第１処理工程で用いられる試薬は、さらにカオトロピック剤を含有することが好ましい。ここで、「カオトロピック剤」は、蛋白質の分子構造を不安定化する性質を持つ物質であり、例えば尿素、グアニジン塩酸塩、サルチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド及びホルムアルデヒドなどが挙げられる。本実施形態におけるカオトロピック剤としては、尿素が好ましい。 Moreover, in this embodiment, it is preferable that the reagent used at a 1st process process contains a chaotropic agent further. Here, the “chaotropic agent” is a substance having the property of destabilizing the molecular structure of the protein, and examples thereof include urea, guanidine hydrochloride, sodium salicylate, sodium thiocyanate, sodium perchlorate, acetamide and formaldehyde. It is done. As the chaotropic agent in this embodiment, urea is preferable.
第１処理工程における、カオトロピック剤の濃度は、使用するカオトロピック剤の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、カオトロピック剤として尿素を用いる場合、第１処理工程における、尿素の濃度は２〜４Ｍが好ましい。 What is necessary is just to adjust suitably the density | concentration of the chaotropic agent in a 1st process process with the kind of chaotropic agent to be used, and it is not limited. For example, when urea is used as the chaotropic agent, the concentration of urea in the first treatment step is preferably 2 to 4M.
「アルカリ性物質」は、上述のＨＣＶコア蛋白をＨＣＶから遊離させる方法で用いることができるアルカリ性物質であれば、特に限定されない。ここで、アルカリ性物質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム及び硫酸ナトリウムなどが挙げられる。本実施形態におけるアルカリ物質としては、水酸化ナトリウムが好ましい。 The “alkaline substance” is not particularly limited as long as it is an alkaline substance that can be used in the method for releasing the HCV core protein from HCV. Here, as an alkaline substance, sodium hydroxide, potassium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium sulfate, etc. are mentioned, for example. As an alkaline substance in this embodiment, sodium hydroxide is preferable.
第１処理工程における、アルカリ性物質の濃度は、使用するアルカリ性物質の種類により適宜調整すれば良く、限定されるものではない。例えば、アルカリ性物質として、水酸化ナトリウムを用いる場合、第１処理工程における水酸化ナトリウムの濃度は、０．１５〜０．５Ｎが好ましい。 The concentration of the alkaline substance in the first treatment step may be appropriately adjusted depending on the type of the alkaline substance to be used, and is not limited. For example, when sodium hydroxide is used as the alkaline substance, the concentration of sodium hydroxide in the first treatment step is preferably 0.15 to 0.5N.
「第１処理工程」は、ＨＣＶを含む疑いのある試料と、アルカリ性物質を含有する試薬を混合する処理であれば、特に限定されない。第１処理工程を行うことにより、ＨＣＶからＨＣＶコア蛋白を遊離することができる。ここで、第１処理工程における、処理時間や処理温度は、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第１処理工程における処理時間や処理温度としては、例えば、第１処理工程において、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の濃度が２〜４％で、尿素の濃度が２〜４Ｍで、水酸化ナトリウムの濃度が０．１〜０．４Ｎの試薬を用いる場合、２０〜３０℃の処理温度で６〜１０分の処理時間で第１処理工程を行うことができる。 The “first treatment step” is not particularly limited as long as it is a treatment for mixing a sample suspected of containing HCV and a reagent containing an alkaline substance. By performing the first treatment step, HCV core protein can be released from HCV. Here, the treatment time and the treatment temperature in the first treatment step may be appropriately set according to the mixing conditions of the sample and the reagent, and are not particularly limited. As specific treatment time and treatment temperature in the first treatment step, for example, in the first treatment step, the concentration of polyoxyethylene nonionic surfactant is 2 to 4% and the concentration of urea is 2 to 4M. In the case where a reagent having a sodium hydroxide concentration of 0.1 to 0.4 N is used, the first treatment step can be performed at a treatment temperature of 20 to 30 ° C. and a treatment time of 6 to 10 minutes.
なお、本実施形態における、アルカリ性物質を含有する試薬は、非イオン性界面活性剤とカオトロピック剤とを含有する試薬、及びそれぞれの成分を二つ以上の試薬に分けて含有する試薬キットが含まれる。ここで、試薬キットとしては、例えば、非イオン性界面活性剤及びカオトロピック剤を含有する第１試薬と、アルカリ性物質を含有する第２試薬とを備えた試薬キットなどが挙げられる。 In this embodiment, the reagent containing an alkaline substance includes a reagent containing a nonionic surfactant and a chaotropic agent, and a reagent kit containing each component divided into two or more reagents. . Here, examples of the reagent kit include a reagent kit including a first reagent containing a nonionic surfactant and a chaotropic agent, and a second reagent containing an alkaline substance.
「第２処理工程」では、第１処理工程で得られた試料と、酸性物質を含有する試薬とを混合し、第１処理工程で得られた試料のアルカリを中和する。第２処理工程で得られる試料のｐＨは、後述する形成工程に影響を及ぼさないｐＨであることが好ましい。より具体的な第２処理工程で得られる試料のｐＨとしては、ｐＨ６．５〜８が好ましい。ここで、具体的な第２処理工程における処理時間や処理温度としては、試料と試薬の混合条件に応じて、適宜設定すればよく、特に制限されるものではない。具体的な第１処理工程における処理時間や処理温度としては、２０〜３０℃の処理温度で３〜１５分である。 In the “second treatment step”, the sample obtained in the first treatment step and a reagent containing an acidic substance are mixed to neutralize the alkali of the sample obtained in the first treatment step. The pH of the sample obtained in the second treatment step is preferably a pH that does not affect the formation step described later. The pH of the sample obtained in the more specific second treatment step is preferably pH 6.5-8. Here, the processing time and processing temperature in the specific second processing step may be appropriately set according to the mixing conditions of the sample and the reagent, and are not particularly limited. The processing time and processing temperature in the specific first processing step are 3 to 15 minutes at a processing temperature of 20 to 30 ° C.
「酸性物質」は、特に限定されないが、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸、硫酸などが挙げられる。本実施形態における酸性物質としてはクエン酸が好ましい。ここで、第２処理工程で用いられる酸性物質を含有する試薬における、酸性物質の濃度は、使用する酸性物質や上述の第１工程で使用されたアルカリ性物質などに応じて、適宜調整すればよく、特に制限されない。酸性物質を含有する試薬における、酸性物質の濃度としては、例えば、酸性物質がクエン酸の場合、試薬中のクエン酸の濃度は、０．１〜０．３Ｍが好ましい。 The “acidic substance” is not particularly limited, and examples thereof include acetic acid, lactic acid, citric acid, malic acid, succinic acid, phosphoric acid, formic acid, fumaric acid, tartaric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid and the like. Citric acid is preferred as the acidic substance in the present embodiment. Here, the concentration of the acidic substance in the reagent containing the acidic substance used in the second treatment step may be appropriately adjusted according to the acidic substance used, the alkaline substance used in the first step described above, or the like. There is no particular restriction. As the concentration of the acidic substance in the reagent containing the acidic substance, for example, when the acidic substance is citric acid, the concentration of citric acid in the reagent is preferably 0.1 to 0.3M.
ＨＣＶを含む疑いのある試料は、上述の第１処理工程及び第２処理工程により希釈される。ここで、第１処理工程及び第２処理工程後における、ＨＣＶを含む疑いのある試料の希釈は、ＨＣＶを含む疑いのある試料の種類に応じて、適宜調整すれば良い。例えば、ＨＣＶを含む疑いのある試料が血清の場合、免疫測定に対する血清成分等の影響を抑制し、且つ、ＨＣＶコア蛋白を検出可能な濃度にする観点から、第１処理工程及び第２処理工程後における、血清の希釈は、３〜５倍が好ましい。 Samples suspected of containing HCV are diluted in the first and second processing steps described above. Here, the dilution of the sample suspected of containing HCV after the first processing step and the second processing step may be appropriately adjusted according to the type of the sample suspected of containing HCV. For example, when the sample suspected of containing HCV is serum, the first treatment step and the second treatment step are carried out from the viewpoint of suppressing the influence of serum components and the like on the immunoassay and making the concentration of HCV core protein detectable. The serum dilution is preferably 3 to 5 times later.
なお、粒子を用いた免疫測定法によるＣ型肝炎ウイルスの検出は、ＨＣＶコア蛋白を、公知の粒子を用いた免疫測定法を用いて検出するものであれば良い。また、粒子も、免疫測定法で用いられる公知の粒子であればよく、例えば、磁性粒子、ラテックス粒子、赤血球、ゼラチン粒子などが挙げられるが、磁性粒子が好ましい。ここで、磁性粒子としては、磁性を有する材料を基材として含み、通常の免疫測定に用いられる粒子であればよい。例えば、基材としてＦｅ２Ｏ３および／またはＦｅ３Ｏ４、コバルト、ニッケル、フィライト、マグネタイトなどを用いた磁性粒子が知られている。 In addition, the detection of hepatitis C virus by immunoassay using particles may be performed as long as HCV core protein is detected using an immunoassay using known particles. The particles may be known particles used in immunoassay methods, and examples include magnetic particles, latex particles, erythrocytes, gelatin particles, and the like, and magnetic particles are preferable. Here, the magnetic particles may be any particles that contain a magnetic material as a base material and are used for normal immunoassay. For example, magnetic particles using Fe 2 O 3 and / or Fe 3 O 4 , cobalt, nickel, phylite, magnetite or the like as a base material are known.
磁性粒子を用いた免疫測定法を用いてＣ型肝炎ウイルスの検出する場合、液相中で形成されたＨＣＶコア蛋白、抗ＨＣＶコア蛋白抗体および磁性粒子からなる複合体を、磁気分離によって液相から分離してＨＣＶコア蛋白を検出することができる。より具体的には、液相中で、ＨＣＶコア蛋白、標識抗ＨＣＶコア蛋白抗体（以下、単に標識抗体という場合がある）および磁性粒子からなる複合体を形成する。次に、液相中の複合体を磁気分離によって液相から分離する。次に、分離された複合体を液相に分散し、複合体の標識を測定する。そして、測定の結果に基づいて、試料中のＣ型肝炎ウイルスの有無を判定することができる。 When hepatitis C virus is detected using an immunoassay method using magnetic particles, a complex consisting of HCV core protein, anti-HCV core protein antibody and magnetic particles formed in the liquid phase is separated by liquid separation by magnetic separation. HCV core protein can be detected by separating from HCV. More specifically, a complex composed of HCV core protein, labeled anti-HCV core protein antibody (hereinafter sometimes simply referred to as labeled antibody) and magnetic particles is formed in the liquid phase. Next, the complex in the liquid phase is separated from the liquid phase by magnetic separation. Next, the separated complex is dispersed in the liquid phase, and the label of the complex is measured. And based on the result of a measurement, the presence or absence of the hepatitis C virus in a sample can be determined.
本実施形態における、第２処理工程で得られた試料を用いて、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体および磁性粒子からなる複合体を形成する場合、第２処理工程後、標識抗体及び第２処理工程で得られた試料に含まれるHCVコア蛋白を含む複合体を、粒子上に形成させればよい。 In the present embodiment, when a complex composed of HCV core protein, labeled antibody, and magnetic particles is formed using the sample obtained in the second processing step, the labeled antibody and the second processing step are used after the second processing step. A complex containing the HCV core protein contained in the obtained sample may be formed on the particles.
ここで、「標識抗体」は、免疫測定法で一般的に用いられる公知の標識物質により標識された抗体であれば、特に限定されない。また、標識抗体は、ＨＣＶコア蛋白と抗原抗体反応により結合する。ここで、標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェリンなどが挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐなどが挙げられる。なお、標識物質としては、酵素が好ましい。 Here, the “labeled antibody” is not particularly limited as long as it is an antibody labeled with a known labeling substance generally used in immunoassays. The labeled antibody binds to the HCV core protein by an antigen-antibody reaction. Here, examples of the labeling substance include enzymes, fluorescent substances, and radioisotopes. Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, tyrosinase, and acid phosphatase. Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC), green fluorescent protein (GFP), and luciferin. Examples of the radioisotope include 125 I, 14 C, and 32 P. The labeling substance is preferably an enzyme.
標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質は、標識物質として用いる酵素に応じて、適宜公知の基質を選択すればよい。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合の基質としてはＣＤＰ−Ｓｔａｒ（商標登録）、（４−クロロ−３−（メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（商標登録）（３−（４−メトキシスピロ{１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン}−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質；ｐ−ニトロフェニルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＢＴ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）などの発光基質；４−メチルウムベリフェニル・ホスフェート（４ＭＵＰ）などの蛍光基質；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリンなどの発色基質が挙げられる。 When the labeling substance is an enzyme, the substrate for the enzyme may be appropriately selected from known substrates depending on the enzyme used as the labeling substance. For example, as a substrate when alkaline phosphatase is used as an enzyme, CDP-Star (registered trademark), (4-chloro-3- (methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro) trixiro) [3.3.1.1 3,7 ] decan} -4-yl) phenyl phosphate disodium), CSPD (registered trademark) (3- (4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2- Chemiluminescent substrates such as (5′-chloro) tricyclo [3.3.1.1 3,7 ] decan} -4-yl) phenyl phosphate disodium); p-nitrophenyl phosphate, 5-bromo-4- Luminescent substrates such as chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), 4-nitroblue tetrazolium chloride (NBT), iodonitrotetrazolium (INT); 4-methylumberif Fluorescent substrates such as nyl phosphate (4MUP); 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), disodium 5-bromo-6-chloro-indolyl phosphate, p-nitrophenyl phosphorus, etc. The chromogenic substrate is mentioned.
なお、標識抗体は、当該分野において公知の方法で作成することができる。例えば、抗体のチオール（−ＳＨ）を用いて上記の標識物質を抗体と結合させる方法が知られている。より具体的には、チオール基と反応できる官能基、例えばマレイミド基を導入した上記の標識物質を、抗体と反応させることにより、抗体を標識物質で標識できる。 The labeled antibody can be prepared by a method known in the art. For example, a method of binding the above-mentioned labeling substance to an antibody using an antibody thiol (-SH) is known. More specifically, the antibody can be labeled with a labeling substance by reacting the above-described labeling substance into which a functional group capable of reacting with a thiol group, such as a maleimide group, is reacted with the antibody.
標識抗体及び第２処理工程で得られた試料に含まれるHCVコア蛋白を含む複合体を、粒子上に形成するには、標識抗体と、磁性粒子と、第２処理工程で得られた試料に含まれるHCVコア蛋白とを液相中で接触させればよい。これにより、HCVコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体が、形成される。ここで、標識抗体とHCVコア蛋白は、抗原抗体反応により結合し、標識抗体−HCVコア蛋白複合体を形成する。さらに、標識抗体−HCVコア蛋白複合体は、HCVコア蛋白複合体と磁性粒子に結合可能な物質を介して、磁性粒子に結合させることができる。ここで、HCVコア蛋白複合体と磁性粒子に結合可能な物質としては、例えば、ＨＣＶコア蛋白と磁性粒子に結合する粒子結合抗体が挙げられる。ＨＣＶコア蛋白と磁性粒子に結合する粒子結合抗体を用いた場合、磁性粒子上には標識抗体−HCVコア蛋白−粒子結合抗体複合体が形成される。 In order to form a complex containing the labeled antibody and the HCV core protein contained in the sample obtained in the second treatment step on the particles, the labeled antibody, the magnetic particles, and the sample obtained in the second treatment step What is necessary is just to contact the HCV core protein contained in a liquid phase. Thereby, a complex composed of the HCV core protein, the labeled antibody and the magnetic particles is formed. Here, the labeled antibody and the HCV core protein are combined by an antigen-antibody reaction to form a labeled antibody-HCV core protein complex. Furthermore, the labeled antibody-HCV core protein complex can be bound to the magnetic particles via a substance that can bind to the HCV core protein complex and the magnetic particles. Here, examples of the substance that can bind to the HCV core protein complex and the magnetic particles include a particle-bound antibody that binds to the HCV core protein and the magnetic particles. When a particle-bound antibody that binds to HCV core protein and magnetic particles is used, a labeled antibody-HCV core protein-particle-bound antibody complex is formed on the magnetic particles.
ここで、「ＨＣＶコア蛋白と粒子に結合する粒子結合抗体」は、上述の標識抗体とは異なるＨＣＶコア蛋白のエピトープと抗原抗体反応により結合し、且つ粒子に結合可能な抗体であれば特に制限されない。なお、粒子に結合可能な抗体は、当該技術において公知の方法を用いて作成することができる。例えば、抗体に粒子結合部位を結合させ、粒子に粒子結合部位に結合可能な結合物質を固定化することで、粒子に結合可能な抗体を作成することができる。すなわち、粒子結合部位と結合物質との結合能を利用して、抗体を粒子に結合可能にすることができる。 Here, “particle-bound antibody that binds to HCV core protein and particles” is not particularly limited as long as it is an antibody that binds to an epitope of HCV core protein different from the above-mentioned labeled antibody by antigen-antibody reaction and can bind to particles. Not. In addition, the antibody which can be couple | bonded with particle | grains can be produced using a well-known method in the said technique. For example, an antibody capable of binding to a particle can be prepared by binding a particle binding site to an antibody and immobilizing a binding substance capable of binding to the particle binding site on the particle. That is, the antibody can be bound to the particle by utilizing the binding ability between the particle binding site and the binding substance.
上記の粒子結合部位と結合物質は、形成工程において、特異的に結合できる物質の組み合わせであれば特に限定されない。これらの組み合わせとして、例えばビオチンとアビジン類、ハプテンと抗ハプテン抗体、ニッケルとヒスタチジンタグ、グルタチオンとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどが挙げられる。粒子結合部位と結合物質の組み合わせとしては、ビオチンとアビジン類との組み合わせが好ましい。粒子結合部位と結合物質との組み合わせに用いられる各々の物質は、どちらを粒子結合部位または結合物質を使用してもよい。より好ましい組み合わせとしては、粒子結合部位がビオチンを含み、結合物質がアビジン類を含む組み合わせが挙げられる。なお、「アビジン類」とは、アビジン及びスプレプトアビジンを含むことを意味する。 The particle binding site and the binding substance are not particularly limited as long as they are a combination of substances that can specifically bind in the formation step. Examples of these combinations include biotin and avidin, hapten and anti-hapten antibody, nickel and histidine tag, glutathione and glutathione-S-transferase, and the like. As a combination of the particle binding site and the binding substance, a combination of biotin and avidin is preferable. Each of the substances used for the combination of the particle binding site and the binding substance may use either the particle binding site or the binding substance. A more preferable combination includes a combination in which the particle binding site contains biotin and the binding substance contains avidins. “Avidins” means containing avidin and streptavidin.
なお、粒子結合部位を抗体に結合させる方法は、当該技術において公知である。例えば、粒子結合部位がビオチンを含む場合、抗体中のアミノ基やチオール基などと反応性を有する基を介してビオチンを抗体に結合させることができる。アミノ基と反応性を有する基としてはＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基が挙げられ、チオール基と反応性を有する基としてはマレイミド基などが挙げられる。 The method for binding the particle binding site to the antibody is known in the art. For example, when the particle binding site contains biotin, biotin can be bound to the antibody via a group reactive with an amino group or thiol group in the antibody. Examples of the group reactive with an amino group include an N-hydroxysuccinimide (NHS) group, and examples of the group reactive with a thiol group include a maleimide group.
また、結合物質を粒子に固定化する方法も、当該技術において公知である。該固定化は、例えば物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、これらの組み合わせなどにより行うことができる。例えば、結合物質がアビジン類である場合、物理的吸着によりアビジンを粒子に直接固定化することができる。また、アビジン類と結合可能な物質、例えばビオチンが結合した粒子にアビジン類を結合させることで、アビジン類を粒子に固定化することもできる。また、特開2006−226689号公報に記載の方法により、アビジン類を粒子に固定化することも可能である。なお、市販のアビジン類を結合させた粒子を用いることもできる。 例えば、ＪＳＲ株式会社やダイナルバイオテック社などから、アビジン類を結合させた粒子を購入することもできる。 Methods for immobilizing binding substances on particles are also known in the art. The immobilization can be performed by, for example, a physical adsorption method, a covalent bond method, an ionic bond method, or a combination thereof. For example, when the binding substance is an avidin, the avidin can be directly immobilized on the particle by physical adsorption. Alternatively, the avidin can be immobilized on the particle by binding the avidin to a substance capable of binding to the avidin, for example, a particle bound with biotin. Further, avidins can be immobilized on the particles by the method described in JP-A-2006-226689. It is also possible to use particles to which commercially available avidins are bound. For example, particles to which avidins are bound can be purchased from JSR Corporation or Dynal Biotech.
次に、液相中のＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体を磁気分離によって液相から分離する。より具体的には、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体を含む液が入った容器の壁面に磁石を近づける。これにより、磁石を用いて複合体を容器の壁面に固定する。そして、複合体を容器の壁面に固定した状態で液相を吸引除去することで、分離工程を行うことができる。この分離を行うことにより、液相中に存在する、非イオン性界面活性剤、カオトロピック剤、及び複合体の形成に使用されなかった標識抗体など、後述する複合体の標識の測定において不要又は悪影響を及ぼす成分を除去することができる。 Next, the complex composed of the HCV core protein, the labeled antibody and the magnetic particles in the liquid phase is separated from the liquid phase by magnetic separation. More specifically, a magnet is brought close to the wall surface of a container containing a liquid containing a complex composed of an HCV core protein, a labeled antibody, and magnetic particles. Thereby, a composite_body | complex is fixed to the wall surface of a container using a magnet. And a separation process can be performed by suction-removing a liquid phase in the state where the composite was fixed to the wall surface of the container. By performing this separation, it is unnecessary or adversely affected in the measurement of the label of the complex described later, such as a nonionic surfactant, a chaotropic agent, and a labeled antibody that has not been used to form the complex. Can be removed.
なお、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体を磁気分離によって液相から分離する際に、複合体を洗浄することもできる。例えば、上述の分離された複合体に、洗浄液を添加して複合体を懸濁し、さらに複合体を洗浄液から磁気分離することで、複合体を洗浄することができる。この洗浄工程を行うことで、複合体の標識の測定において不要又は悪影響を及ぼす成分を、さらに除去することができる。この洗浄も、磁性粒子を用いた免疫測定法において公知である。ここで、洗浄液としては、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体に影響を及ぼさない緩衝液が好ましい。また、洗浄液は、界面活性剤を含有する緩衝液が特に好ましい。より具体的な洗浄液としては、たとえば、ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）及びＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）などが挙げられる。なお、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）などの、市販の洗浄液を用いることもできる。 The complex can also be washed when separating the complex composed of the HCV core protein, the labeled antibody, and the magnetic particles from the liquid phase by magnetic separation. For example, the complex can be washed by adding a washing liquid to the separated complex and suspending the complex, and further magnetically separating the complex from the washing liquid. By performing this washing step, components that are unnecessary or have an adverse effect in the measurement of the label of the complex can be further removed. This washing is also known in immunoassay methods using magnetic particles. Here, the washing solution is preferably a buffer solution that does not affect the complex composed of the HCV core protein, the labeled antibody, and the magnetic particles. The washing solution is particularly preferably a buffer solution containing a surfactant. More specific examples of the cleaning liquid include TBS-T (0.05% Tween 20) and PBS-T (0.05% Tween 20). A commercially available cleaning solution such as a HISCL cleaning solution (manufactured by Sysmex Corporation) can also be used.
次に、分離された複合体を液相に分散し、複合体の標識を測定する。分離された複合体の液相への分散は、分離された複合体を、基質液や緩衝液等の液相に分散させればよい。 ここで、標識の測定は、上述の標識抗体に用いた標識物質の種類に応じて、適宜適切な測定方法で行えばよく、特に限定されない。例えば、該標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることにより発生する光、色などを適切な装置を用いて測定することにより行うことができる。該装置としては、分光光度計、ルミノメータなどが挙げられる。また、標識物質が放射性同位体である場合、シンチレーションカウンターなどの従来公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。 Next, the separated complex is dispersed in the liquid phase, and the label of the complex is measured. The separated complex may be dispersed in the liquid phase by dispersing the separated complex in a liquid phase such as a substrate solution or a buffer solution. Here, the measurement of the label may be appropriately performed by an appropriate measurement method according to the type of the labeling substance used for the above-described labeled antibody, and is not particularly limited. For example, when the labeling substance is an enzyme, it can be carried out by measuring light, color, etc. generated by reacting a substrate for the enzyme with an appropriate apparatus. Examples of the apparatus include a spectrophotometer and a luminometer. When the labeling substance is a radioisotope, it can be measured by using a conventionally known apparatus such as a scintillation counter.
そして、測定の結果に基づいて、試料中のＣ型肝炎ウイルスの有無を判定する。このＣ型肝炎ウイルスの有無を判定は、前記測定の結果に基づいて行う。具体的には、上述の測定において、ＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体に由来する標識が測定された場合、試料中にＨＣＶが有ると判定する。逆に、上述の測定においてＨＣＶコア蛋白、標識抗体及び磁性粒子とからなる複合体に由来する標識が測定されなかった場合、試料中にＨＣＶが無いと判定する。例えば、測定で得られた測定値と予め設定した閾値を比較する。そして、測定値が閾値以上の場合に、試料中にＨＣＶが有ると判定することができる。また逆に、測定値が閾値未満の場合に、試料中にＨＣＶが無いと判定することができる。ここで閾値は、公知の方法で適宜設定すれば良い。閾値の設定の方法としては、例えば、複数の予めＨＣＶが含まれていることが分かっている試料と、複数の予めＨＣＶが含まれていないことが分かっている試料とについて、それぞれの測定値を取得する。そして、ＨＣＶが含まれている試料の集団と、ＨＣＶが含まれていない試料の集団とを、二等分できる中央値を閾値として設定することができる。 And based on the result of a measurement, the presence or absence of the hepatitis C virus in a sample is determined. The presence or absence of this hepatitis C virus is determined based on the result of the measurement. Specifically, in the above-described measurement, when a label derived from a complex composed of an HCV core protein, a labeled antibody, and magnetic particles is measured, it is determined that HCV is present in the sample. On the contrary, when the label derived from the complex composed of the HCV core protein, the labeled antibody, and the magnetic particles is not measured in the above measurement, it is determined that there is no HCV in the sample. For example, a measurement value obtained by measurement is compared with a preset threshold value. And when a measured value is more than a threshold value, it can determine with having HCV in a sample. Conversely, when the measured value is less than the threshold value, it can be determined that there is no HCV in the sample. Here, the threshold value may be appropriately set by a known method. As a method for setting the threshold value, for example, a plurality of samples that are known to contain HCV in advance and a plurality of samples that are known to contain no HCV in advance are measured. get. Then, a median value that can bisect a group of samples containing HCV and a group of samples not containing HCV can be set as a threshold value.
なお、粒子を用いた免疫測定法によるＣ型肝炎ウイルスの検出として、磁性粒子を用いた免疫測定法を説明したが、ＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理方法の適用は、これに限られない。磁性粒子以外の粒子としては、ラテックス粒子、赤血球、及びゼラチン粒子等が挙げられる。磁性粒子以外の粒子を用いた場合、磁気分離の代わりに、遠心分離を行うことで、複合体を液相から分離することができる。 Although the immunoassay method using magnetic particles has been described as the detection of hepatitis C virus by the immunoassay method using particles, the application of the sample pretreatment method for detecting HCV core protein is not limited to this. I can't. Examples of particles other than magnetic particles include latex particles, red blood cells, and gelatin particles. When particles other than magnetic particles are used, the composite can be separated from the liquid phase by centrifuging instead of magnetic separation.
＜還元剤による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
本例で使用する試薬は以下に示す。
<Confirmation of aggregation suppression of magnetic particles by reducing agent>
The reagents used in this example are shown below.
第１処理試薬：
カオトロピック剤として尿素を６Ｍ、界面活性剤としてＢｒｉｊ３５（シグマ社製）を４％、及びアルカリ性物質として水酸化ナトリウムを０．４５Ｎ含む水溶液を、第１処理試薬とした。
First treatment reagent:
An aqueous solution containing 6M urea as a chaotropic agent, 4% Brij35 (manufactured by Sigma) as a surfactant, and 0.45N sodium hydroxide as an alkaline substance was used as the first treatment reagent.
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２処理試薬Ａ〜Ｃの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ａ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
（第２処理試薬Ｂ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
（第２処理試薬Ｃ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ３０ｍＭ
ＮａＣｌ ０．６ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｂには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｃには、還元剤としてメルカプトエチルアミン、及び無機塩類としてＮａＣｌが含まれている。
Second treatment reagent:
The following aqueous solutions of the second treatment reagents A to C containing 0.15M citric acid as an acidic substance were prepared.
(Second treatment reagent A)
Citric acid 0.15M
(Second treatment reagent B)
Citric acid 0.15M
Mercaptoethylamine 30 mM
(Second treatment reagent C)
Citric acid 0.15M
Mercaptoethylamine 30 mM
NaCl 0.6 mM
Here, the second treatment reagent B contains mercaptoethylamine as a reducing agent. In addition, the second processing reagent C contains mercaptoethylamine as a reducing agent and NaCl as an inorganic salt.
標識抗体試薬：
標識抗体として、ＡＬＰで標識された抗ＨＣＶ抗体（ＡＬＰ標識ＨＣＦ３−８０７）を用いた。ここで、ＨＣＦ３−８０７としては、ＮＩＴＥ ＡＰ−８４２で受領されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４２で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。具体的な標識抗体試薬の作製は、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したALPを混合して、反応させることで標識抗体を調製する。この方法で調製したALP標識抗体20μｌを、980μｌの希釈液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．５) ２５ｍＭ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＢＳＡ ０．２５％、ＮａＮ３ ０．０２％、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＺｎＣｌ２ ０．１ｍＭ）で50倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
Labeled antibody reagent:
As a labeled antibody, an anti-HCV antibody (ALP-labeled HCF3-807) labeled with ALP was used. Here, as HCF3-807, a monoclonal antibody produced from a hybridoma received by NITE AP-842 was used. The hybridoma is a cell having a receipt number NITE AP-842, which was received on November 25, 2009 by the Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation. A specific labeled antibody reagent was prepared by maleimidation using pepsin digestion and reduction to Fab ′ converted to Fab ′ and EMCS [N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimido] (Dojin Chemical) as a crosslinking agent. The labeled antibody is prepared by mixing and reacting the ALP. 20 μl of ALP-labeled antibody prepared by this method was added to 980 μl of diluted solution (Tris-HCl (pH 7.5) 25 mM, NaCl 0.15 M, BSA 0.25%, NaN 3 0.02%, MgCl 2 1 mM, ZnCl 2 0.1 mM). ) To obtain a labeled antibody reagent.
第１抗体試薬：
第１抗体として、ビオチン及びＤＮＰで修飾された抗体（Ｂｉｏｔｉｎ／ＤＮＰ標識ＨＣＦ４−１０４）を用いた。ここで、ＨＣＦ４−１０４としては、ＮＩＴＥ ＡＰ−８４１で受領されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４１で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。具体的な第１抗体試薬の作製は、ビオチン化試薬（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents:ピアス社）をBSAに添加して、次いでDNP標識試薬（DNP-X acid SE:ABD Bioquest社）を添加することでBiotin/DNP標識したBSAを調製する。次に、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕（同仁化学）を用いてマレイミド化したBiotin/DNP標識したBSAを混合して、反応させることで第１抗体を調製する。この方法で調製した5 μｌの第１抗体を、495 μｌの希釈液で１００倍に希釈し、第１抗体試薬とした。
First antibody reagent:
As the first antibody, an antibody modified with biotin and DNP (Biotin / DNP-labeled HCF4-104) was used. Here, as HCF4-104, a monoclonal antibody produced from a hybridoma received by NITE AP-841 was used. The hybridoma is a cell having a receipt number of NITE AP-841 and received on November 25, 2009 from the National Institute of Technology and Evaluation, Japan Patent Microorganism Depositary. Specifically, the first antibody reagent was prepared by adding a biotinylation reagent (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents: Pierce) to BSA, and then DNP labeling reagent (DNP-X acid SE: ABD Bioquest To prepare Biotin / DNP-labeled BSA. Next, the antibody converted to Fab ′ by digestion with pepsin and reduction, and biotin / DNP-labeled BSA that was maleimidized using EMCS [N- (6-Maleimidocaproyloxy) succinimido] (Dojindo) as a cross-linking agent Are mixed and reacted to prepare the first antibody. 5 μl of the first antibody prepared by this method was diluted 100 times with 495 μl of diluent to obtain a first antibody reagent.
磁性粒子試薬：
第２抗体として抗ＤＮＰ抗体（ＤＮＰ−１７５３）を固定化した磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０；インビトロジェン社製）を用いた。ここで、ＤＮＰ−１７５３としては、ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で受領されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−８４５で、２００９年１１月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受領された細胞である。100μｌの該磁性粒子を、900μｌの希釈液で10倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
Magnetic particle reagent:
Magnetic particles (Dynabeads M-270; manufactured by Invitrogen) on which an anti-DNP antibody (DNP-1753) was immobilized were used as the second antibody. Here, as DNP-1753, a monoclonal antibody produced from a hybridoma received by NITE AP-845 was used. The hybridoma is a cell having a receipt number NITE AP-845, which was received on November 25, 2009 by the National Institute of Technology and Evaluation, Japan Patent Microorganism Depositary. 100 μl of the magnetic particles were diluted 10-fold with 900 μl of diluent to obtain a magnetic particle reagent.
還元剤による、磁性粒子の凝集の抑制効果を、以下の通り確認した。
＜第１処理工程＞
４０μｌのＨＣＶ陰性血清と、６０μｌの第１処理試薬とを混合し、室温にて８分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。
＜第２処理工程＞
第１処理工程で得られた試料に、６０μｌの第２処理試薬Ａ〜Ｃをそれぞれ添加し、室温にて５分間インキュベーションすることで、第１処理工程を実施した。なお、第２処理工程後の試料はｐＨ７〜７．５であることをｐＨ試験紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製）により確認した。
＜形成工程＞
第２処理工程で得られた１６０μｌの試料と、７５μｌの標識抗体試薬とを、反応キュベット（ＨＩＳＣＬ用反応キュベット；シスメックス社製）で混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、５０μｌの第１抗体試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、８０μｌの磁性粒子試薬を添加し、室温で１０分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
＜分離工程＞
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置（ＭＩＮＩＴＵＢＥ ＭＡＧ ＳＥＰＡＲＡＴＯＲ：ＳＰＨＥＲＯ ＴＥＣＨ社製）を用いて磁気分離を行った。
The effect of suppressing the aggregation of magnetic particles by the reducing agent was confirmed as follows.
<First treatment process>
The first treatment step was performed by mixing 40 μl of HCV negative serum and 60 μl of the first treatment reagent and incubating at room temperature for 8 minutes.
<Second treatment process>
The first treatment step was performed by adding 60 μl of the second treatment reagents A to C to the sample obtained in the first treatment step and incubating at room temperature for 5 minutes. In addition, it confirmed that the sample after a 2nd process process was pH 7-7.5 with the pH test paper (made by Whatman).
<Formation process>
160 μl of the sample obtained in the second treatment step and 75 μl of the labeled antibody reagent were mixed in a reaction cuvette (HISCL reaction cuvette; manufactured by Sysmex Corporation) and incubated at room temperature for 10 minutes. Next, 50 μl of the first antibody reagent was added to the reaction cuvette and incubated at room temperature for 10 minutes. Next, 80 μl of magnetic particle reagent was added to the reaction cuvette and incubated at room temperature for 10 minutes to carry out the forming step.
<Separation process>
The reaction cuvette containing the sample obtained in the forming step was subjected to magnetic separation using a magnetic collector (manufactured by MINITUBE MAG SEPARATOR: manufactured by SPHERO TECH).
分離工程において磁気分離した磁性粒子に、ＨＩＳＣＬ洗浄液（シスメックス社製）を３００μｌ添加し、ボルテックスミキサーを用いて分散させ、反応キュベットを静置した後、粒子の凝集を評価した。 To the magnetic particles magnetically separated in the separation step, 300 μl of HISCL cleaning solution (manufactured by Sysmex Corporation) was added and dispersed using a vortex mixer, and the reaction cuvette was allowed to stand, and then aggregation of the particles was evaluated.
ここで、粒子の凝集の評価は、目視により観察し、凝集の程度を次の３段階に分けて評価した。
＋＋：凝集が認められる。
＋：やや凝集が認められる。
−：凝集が認められない。
第２処理工程において、第２処理試薬Ａ〜Ｃを用いた試料における、反応キュベット内の凝集の評価を表１に示す。
Here, the particle aggregation was evaluated by visual observation, and the degree of aggregation was divided into the following three stages.
++: Aggregation is observed.
+: Slight aggregation is observed.
-: Aggregation is not recognized.
Table 1 shows the evaluation of aggregation in the reaction cuvette in the sample using the second processing reagents A to C in the second processing step.
表１から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む、第２処理試薬Ｂ又は第２処理試薬Ｃを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が確認が認められなかった。このことから、第２処理試薬に還元剤を添加することで、分離工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。 As is clear from Table 1, in the second treatment step, the sample treated with the second treatment reagent A that does not contain mercaptoethylamine showed aggregation of magnetic particles. On the other hand, in the sample treated with the second treatment reagent B or the second treatment reagent C containing mercaptoethylamine, no confirmation of the aggregation of the magnetic particles was observed. From this, it was shown that aggregation of the magnetic particles after the separation step can be suppressed by adding a reducing agent to the second treatment reagent.
＜還元剤の種類及びＨＣＶの存在による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、還元剤の種類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｄ〜Ｆを調製した。また、試料として使用する血清中のＨＣＶの存在の有無が凝集に影響するかを調べるため、本例では、ＨＣＶ陰性血清に代えて、ＨＣＶ陽性血清を用いた。
<Confirmation of aggregation of magnetic particles due to the type of reducing agent and presence of HCV>
In order to examine whether the aggregation suppression by the second treatment reagent containing the reducing agent depends on the type of the reducing agent, the following second treatment reagents D to F were prepared. Moreover, in order to investigate whether the presence or absence of HCV in the serum used as a sample affects aggregation, in this example, HCV positive serum was used instead of HCV negative serum.
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｄ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
メルカプトエチルアミン ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｅ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
ジチオトレイトール ４５ｍＭ
（第２処理試薬Ｆ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
システイン塩酸塩 ９０ｍＭ
ここで、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第２処理試薬Ｅには、還元剤としてジチオトレイトールが含まれている。また、第２処理試薬Ｄには、還元剤としてシステイン塩酸塩が含まれている。
Second treatment reagent:
The following aqueous solutions of second reagents D to F containing 0.15 M citric acid as an acidic substance were prepared.
(Second treatment reagent D)
Citric acid 0.15M
Mercaptoethylamine 45 mM
(Second treatment reagent E)
Citric acid 0.15M
Dithiothreitol 45 mM
(Second treatment reagent F)
Citric acid 0.15M
Cysteine hydrochloride 90 mM
Here, the second treatment reagent D contains mercaptoethylamine as a reducing agent. Further, the second treatment reagent E contains dithiothreitol as a reducing agent. Further, the second treatment reagent D contains cysteine hydrochloride as a reducing agent.
上述した第２処理試薬Ｄ〜Ｆ、及びＨＣＶ陽性血清を用いること以外は、実施例１と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表２に示す。 The inhibitory effect on the aggregation of the magnetic particles was confirmed in the same manner as in Example 1 except that the above-described second treatment reagents D to F and HCV positive serum were used. As a control, the effect of suppressing the aggregation of magnetic particles by the second treatment liquid A was also confirmed. Table 2 shows the evaluation results of the aggregation.
表２から明らかなように、第２処理工程において、メルカプトエチルアミンを含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、磁性粒子の凝集が認められた。一方、メルカプトエチルアミンを含む第２処理試薬Ｄでは、ＨＣＶ陽性血清を用いた場合でも、実施例１と同様に磁性粒子の凝集が認められなかった。また、ジチオトレイトールを含む第２処理試薬Ｅ、およびシステイン塩酸塩を含む第２処理試薬Ｆを用いて処理した試料でも、第２処理試薬Ｄと同様に、磁性粒子の凝集が認められなかった。このことから、還元剤の種類を問わず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、分離工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。また、血清中のＨＣＶの存在の有無にかかわらず、第２処理試薬に還元剤を添加することで、分離工程後の磁性粒子の凝集を抑制できることが示された。 As is clear from Table 2, in the second treatment step, in the sample treated with the second treatment reagent A that does not contain mercaptoethylamine, aggregation of magnetic particles was observed even when HCV positive serum was used. . On the other hand, in the second treatment reagent D containing mercaptoethylamine, even when HCV positive serum was used, the aggregation of magnetic particles was not recognized as in Example 1. In addition, in the sample treated with the second treatment reagent E containing dithiothreitol and the second treatment reagent F containing cysteine hydrochloride, no aggregation of magnetic particles was observed as in the second treatment reagent D. . From this, it was shown that the aggregation of the magnetic particles after the separation step can be suppressed by adding the reducing agent to the second treatment reagent regardless of the type of the reducing agent. Moreover, it was shown that aggregation of the magnetic particles after the separation step can be suppressed by adding a reducing agent to the second treatment reagent regardless of the presence or absence of HCV in the serum.
＜無機塩類による磁性粒子の凝集抑制の確認＞
還元剤及び無機塩類を含有する第２処理試薬による凝集抑制が、無機塩類に依存するものであるかを調べるため、以下の第２処理試薬Ｇ〜Ｉを調製した。
<Confirmation of aggregation suppression of magnetic particles by inorganic salts>
In order to examine whether the aggregation suppression by the second treatment reagent containing a reducing agent and inorganic salts depends on the inorganic salts, the following second treatment reagents G to I were prepared.
第２処理試薬：
酸性物質としてクエン酸を０．１５Ｍ含む、以下の第２試薬Ｄ〜Ｆの水溶液を調製した。
（第２処理試薬Ｇ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化ナトリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｈ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
塩化カリウム ０．６Ｍ
（第２処理試薬Ｉ）
クエン酸 ０．１５Ｍ
硫酸ナトリウム ０．６Ｍ
ここで、第２処理試薬Ｇには、無機塩類として塩化ナトリウムが含まれている。また、第２処理試薬Ｈには、無機塩類として塩化カリウムが含まれている。さらにまた、第２処理試薬Ｉには、無機塩類として硫酸ナトリウムが含まれている。
Second treatment reagent:
The following aqueous solutions of second reagents D to F containing 0.15 M citric acid as an acidic substance were prepared.
(Second treatment reagent G)
Citric acid 0.15M
Sodium chloride 0.6M
(Second treatment reagent H)
Citric acid 0.15M
Potassium chloride 0.6M
(Second treatment reagent I)
Citric acid 0.15M
Sodium sulfate 0.6M
Here, the second treatment reagent G contains sodium chloride as an inorganic salt. In addition, the second treatment reagent H contains potassium chloride as an inorganic salt. Furthermore, the second treatment reagent I contains sodium sulfate as an inorganic salt.
上述した第２処理試薬Ｇ〜Ｉを用いること以外は、実施例２と同様に、磁性粒子の凝集の抑制効果を確認した。なお、コントロールとして、第２処理液Ａによる、磁性粒子の凝集の抑制効果も確認した。凝集の評価結果を表３に示す。 The effect of suppressing aggregation of magnetic particles was confirmed in the same manner as in Example 2 except that the second treatment reagents G to I described above were used. As a control, the effect of suppressing the aggregation of magnetic particles by the second treatment liquid A was also confirmed. Table 3 shows the evaluation results of the aggregation.
表３から明らかなように、第２処理工程において、無機塩類を含まない、第２処理試薬Ａを用いて処理した試料では、磁性粒子の凝集が認められた。一方、塩化ナトリウムを含む第２処理試薬Ｇ、塩化カリウムを含む第２処理試薬Ｈ、及び硫酸ナトリウムを含む第２処理試薬Ｉでは、磁性粒子の凝集がやや認められたものの、第２処理試薬Ａに比べ、磁性粒子の凝集の抑制効果が認められた。このことから、還元剤の磁性粒子の凝集の抑制効果より低いが、無機塩類にも磁性粒子の凝集の抑制効果があることが示された。従って、還元剤及び無機塩類の添加により、より効果的に磁性粒子の凝集が抑制できることが示唆された。 As is clear from Table 3, in the second treatment step, the sample treated with the second treatment reagent A that does not contain inorganic salts showed aggregation of magnetic particles. On the other hand, in the second treatment reagent G containing sodium chloride, the second treatment reagent H containing potassium chloride, and the second treatment reagent I containing sodium sulfate, although aggregation of the magnetic particles was slightly observed, the second treatment reagent A As compared with the above, an effect of suppressing aggregation of magnetic particles was observed. From this, it was shown that the inorganic salt has an effect of suppressing the aggregation of the magnetic particles, although it is lower than the effect of suppressing the aggregation of the magnetic particles of the reducing agent. Therefore, it was suggested that the addition of a reducing agent and inorganic salts can more effectively suppress aggregation of magnetic particles.
Claims (16)
Ｃ型肝炎ウイルスを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第１処理工程と、
第１処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第２処理工程と、を含み、
第１処理工程及び第２処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する、ＨＣＶコア蛋白検出のための試料の前処理方法。 A sample pretreatment method for detection of hepatitis C virus (HCV) core protein by immunoassay using particles, comprising:
A first treatment step of treating a sample suspected of containing hepatitis C virus with a reagent containing an alkaline substance;
A second treatment step of treating the sample obtained in the first treatment step with a reagent containing an acidic substance,
A sample pretreatment method for detecting HCV core protein, wherein at least one of the reagents used in the first treatment step and the second treatment step contains a reducing agent.
アルカリ性物質を含む第１試薬と、
酸性物質を含む第２試薬と、
を含み、
第１試薬及び第２試薬の少なくとも一つが、還元剤を含有する、Ｃ型肝炎ウイルスの有無を判定するための試薬キット。 A reagent kit for pretreatment of a sample for detection of hepatitis C virus (HCV) core protein by immunoassay using particles,
A first reagent containing an alkaline substance;
A second reagent containing an acidic substance;
Including
A reagent kit for determining the presence or absence of hepatitis C virus, wherein at least one of the first reagent and the second reagent contains a reducing agent.
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