JP2011092184A - 標本の活性計測用器材セット及び活性計測装置・方法 - Google Patents

Abstract

【課題】計測対象の標本（培養細胞など）および周囲の培養環境に大きな影響を与えずに、個々の標本の活性を高い感度で計測できる活性計測方法に用いて好適な器材セットと、それを用いた標本活性計測装置・方法を提供する。
【解決手段】標本の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着性を低下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた標本培養部材と、
前記標本培養部材が培養容器に収納された状態において、前記第一領域を覆
う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上の第二マイク
ロチャンバと、を設けたマイクロチャンバアレイと、
を有して構成される標本の活性計測用器材セット。
【選択図】 図１

Description

本発明は、培養液中の標本（培養細胞など）の活性を計測するための器材セットと、それを用いた標本活性計測装置・方法に関する。

培養細胞の生物学的活性を計測する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングをはじめとする幅広い分野における基盤技術となっている。一例として、再生医療分野では、インビトロで細胞を増殖、分化させるプロセスが存在する。そして、上記のプロセスでは、細胞の分化の成否、細胞の癌化や感染の有無を管理するために、培養細胞の生物学的活性を計測することが不可欠となる。

一方、従来から公知の細胞の活性計測方法のうち、個々の細胞を解析した上で分離する手法の一例としてフローセルソーターによる計測が挙げられる。フローセルソーターでは、電荷を持たせた液滴中に蛍光染色処理後の細胞を単離して滴下する。そして、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小に基づいて液滴の落下方向を電界の印加で制御し、複数の容器に細胞を分画して回収することができる（例えば、非特許文献１参照）。

また、細胞の集団を対象とした活性評価を行うための手法として、液体中の物質の高感度分析を行う酵素免疫測定法（ＥＩＡ）や蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、あるいは両者を組み合わせたＥＬＩＳＡ法なども知られている。
Kamarck,M.E. Methods Enzymol. 第１５１巻第１５０頁から第１６５頁（１９８７年）

しかし、フローセルソーターをはじめとする従来の計測手法では、計測対象の細胞および周囲の培養環境に大きな影響を与えずに、個々の細胞の活性を高い感度で計測することが非常に困難であった。そのため、上記のニーズを満たす細胞の活性計測方法がなお探求されている。

そこで、本発明の目的は、培養液中の標本（培養細胞など）の活性を計測するための器材セットであり、上記ニーズを満たす標本（培養細胞など）の活性計測方法に用いて好適な器材セットと、それを用いた標本活性計測装置・方法を提供することにある。

本発明の標本活性計測用の器材セットは、標本の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着性を低下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた標本培養部材と、前記標本培養部材が培養容器に収納された状態において、前記第一領域を覆う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上の第二マイクロチャンバと、を設けたマイクロチャンバアレイとを有して構成されることを特徴とする。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測装置は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成するための操作部と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測部と、前記操作部及び前記計測部を制御する制御部と、を有することを特徴とする。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測方法は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成する区画手順と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測手順と、を有することを特徴とする。

本発明によれば、計測対象の標本（培養細胞など）および周囲の培養環境に大きな影響を与えずに、個々の標本の活性を高い感度で計測できる。

一の実施形態に係る活性計測方法の概要図 一の実施形態に係るマイクロチャンバの構成例を模式的に示す断 面図 マイクロチャンバの他の構成例を模式的に示す断面図 マイクロチャンバの他の構成例を模式的に示す断面図 他の実施形態に係る培養細胞の活性計測方法の概要を示す図 他の実施形態に係るマイクロチャンバシートを模式的に示す部分 断面図 他の実施形態で用いる培養容器の培養面と、マイクロチャンバシ ートとの対応関係を示す図 活性計測装置の構成例を示すブロック図 活性計測装置の動作例を示す流れ図 一の実施形態に係る培養中における標本の活性計測用器材セットの部分的構 成例を模式的に示す断面図 一の実施形態に係る培養細胞の活性計測中における標本の活性計測用器材セ ットの部分的構成例を模式的に示す断面図 活性計測装置の別構成例を示すブロック図

＜一の実施形態の活性計測方法の説明＞
図１は、一の実施形態に係る培養細胞の活性計測方法の概要を示す図である。一の実施形態では、液体培地１１とともに培養細胞１２を収容したディッシュなどの培養容器１３に対して、計測対象の細胞１２を取り囲むマイクロチャンバ１４を配置し、マイクロチャンバ１４内の空間に含まれる環境因子を測定する。

ここで、本明細書の環境因子とは、細胞の代謝で産生または消費される物質を意味する。一例として、環境因子には、グルコース、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、水素イオン、酸素、活性酸素種、過酸化水素、二酸化炭素、細胞が産出するタンパクやヘプタイドなど（例えばサイトカイン、ホルモンなど）が含まれる。

図２は、一の実施形態に係るマイクロチャンバ１４の構成例を模式的に示す断面図である。一の実施形態のマイクロチャンバ１４の全体形状は、培養容器１３の培養面と接触する底面側が開放されるとともに、上面側が閉塞された有底円筒形のカップ状に構成されている。そのため、マイクロチャンバ１４の内側には計測対象の細胞１２を収容可能となっている。そして、一の実施形態では、培養容器１３の培養面上にマイクロチャンバ１４を配置することで、培養容器１３の容積に対して十分に微小な被計測空間がマイクロチャンバ１４の内側に構築される。なお、マイクロチャンバ１４の大きさは、計測対象の細胞１２の種類や数、計測する環境因子の種類、計測の所要時間などに応じて適宜選択されるが、一例として、その直径が５０μｍから１００μｍ程度に設定される。

また、一の実施形態のマイクロチャンバ１４の内側には、環境因子センサ１５および生体分子検出プローブ１６がそれぞれ固定されている。環境因子センサ１５は、培養液に含まれる環境因子の量を電気化学的手段によって電気信号に変換するセンサである。一例として、環境因子センサ１５は、酸素センサや各種のバイオセンサ（グルコースセンサなど）で構成される。

生体分子検出プローブ１６は、環境因子のうちから選択された標的分子を特異的に補足する分子で構成され、例えば、抗体、酵素等のタンパク質、ペプチド、糖類等を用いることができる。一の実施形態では、異なる種類の生体分子検出プローブ１６をパターニング等でマイクロチャンバ１４の特定の位置（マイクロチャンバ１４内の上面など）にアレイ化して固定してもよい。この場合には、同時に多項目の網羅的な解析が可能になる。また、標的分子を蛍光標識等しておけば、生体分子検出プローブ１６と標的分子との結合を容易に判断することができる。なお、上記の場合には蛍光強度によって標的分子の量を測ることもできる。

ここで、一の実施形態でのマイクロチャンバ１４は、以下の（１）から（５）の構成（あるいはこれらの組み合わせ）を有していてもよい。
（１）光学的計測（蛍光測定、色変化の測定、吸光度測定）によって環境因子を計測する場合には、マイクロチャンバ１４内で生じる光学的な変化に対応した波長の光を透過する透光性材料でマイクロチャンバ１４を形成することが好ましい。このとき、光学的計測を容易に行う観点から、マイクロチャンバ１４の屈折率は液体培地１１の屈折率と同じ値に設定することが好ましい。一例として、可視光に対する透光性を有するとともに屈折率が液体培地１１とほぼ同等な材質として、非晶質フッ素樹脂（例えば、サイトップ（登録商標））などが挙げられる。

また、光学的計測を行う場合には、計測時の光学像のひずみを避けるために、マイクロチャンバ１４の上面を平坦にしてもよい。あるいは、光学的計測でのＮＡを向上させるために、マイクロチャンバ１４の上面にマイクロレンズを形成してもよい（この場合の図示は省略する）。
（２）マイクロチャンバ１４は、柔軟性の高い弾性材料で形成してもよい。かかる構成によれば、例えば、外部の細胞と接合した軸索などにダメージを与えずに計測対象の細胞１２にマイクロチャンバ１４を被せることができる。また、培養容器１３の培養面に対してマイクロチャンバ１４に傾きが生じている場合にも、マイクロチャンバ１４の変形によってアライメントの誤差を吸収することが可能となる。なお、マイクロチャンバ１４に用いられる弾性材料としては、例えば、シリコンゴム（ポリジメチルシロキサン）が挙げられる。
（３）マイクロチャンバ１４は、酸素透過性を有する材質で形成してもよい。かかる構成によれば、比較的長時間の計測を行う場合にも、マイクロチャンバ１４内に細胞の培養環境を維持できる。勿論、この場合には酸素濃度が計測項目に含まれないことが前提となる。なお、マイクロチャンバ１４に用いられる酸素透過性材料としては、例えば、シリコンゴム（ポリジメチルシロキサン）が挙げられる。
（４）被計測空間内を液体培地１１で満たすことを容易とするために、マイクロチャンバ１４の内面には、親水性被膜の形成などによって親水性を付与してもよい。この場合には、マイクロチャンバ１４を上下に反転させて空気が入らないように予め液体培地１１を容器内に充填し、その後にマイクロチャンバ１４を本来の状態（底面側に開口がある状態）に戻しても表面張力によって容器内の液体は保持される。したがって、この場合には、予め液体培地１１で満たされている状態のマイクロチャンバ１４を、細胞１２の上に被せることが可能となる。
（５）マイクロチャンバ１４の表面には、蛋白質の吸着を阻害する物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２−メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）など）で被膜を形成してもよい。この場合には、計測が培養環境に及ぼす影響をより低減させることができる。

次に、一の実施形態における培養細胞の活性計測方法の各手順を具体的に説明する。

第１の手順では、培養容器１３内の上側から、計測対象の細胞１２を取り囲むようにマイクロチャンバ１４を配置する。これにより、計測対象の細胞１２が収容されるとともに培養容器１３の容積に対して微少な被計測空間がマイクロチャンバ１４の内側に形成される。

また、熱の移動による培養環境への悪影響を抑制するために、マイクロチャンバ１４は予め培地１１と同じ温度に保温しておくことが好ましい。なお、被計測空間に収容する細胞１２の数は複数であってもよいが、一の実施形態ではマイクロチャンバ１４内に１つの細胞を収容するものとする。

第２の手順では、被計測空間に含まれる環境因子を計測する。これにより、計測された環境因子の量に基づいて、計測対象の細胞の活性、細胞のアポトーシスや分化の度合い、細胞の性質などを評価することができる。

培養容器１３の環境因子を測定する場合には、培地全体に代謝物などが拡散されるため、個々の細胞に着目して環境因子を測定することは不可能である。一方、一の実施形態では、培養容器１３内にマイクロチャンバ１４を配置して、計測対象の細胞１２を含む微小な被計測空間を構成して環境因子を計測している。この被計測空間に含まれる環境因子は計測対象の細胞１２と密接に関連するので、培養環境下において計測対象の細胞１２に注目した局所的な環境因子の計測が可能となる。

また、マイクロチャンバ１４内の被計測空間は培養容器１３の容積に対して微小であるので、マイクロチャンバ１４の外側の環境と比べて被計測空間内では代謝物などの濃度変化がより大きくなる。そのため、非常に高い感度で環境因子を検出できる。また、被計測空間内では環境因子の濃度変化が高くなるため、比較的短時間で計測を行うことが可能となる。

さらに、一の実施形態では、細胞１２の周囲の空間に含まれる環境因子を計測対象として細胞の活性を評価する。そのため、細胞自体を計測対象とする場合と比べて計測による細胞への影響を少なくできる。また、一の実施形態では計測対象の細胞１２を培養容器１３内でそのまま計測できるので、計測によって細胞１２や周囲の培養環境に与える影響を極めて少なくできる。

ここで、第２の手順での計測方法をより詳細に説明する。具体的には、第２の手順では、マイクロチャンバ１４内に配置された環境因子センサ１５で被計測空間の環境因子を計測する。あるいは、第２の手順では、マイクロチャンバ１４内に配置した生体分子検出プローブ１６や、試薬（ｐＨ指示薬など）による被計測空間の光学的な変化を顕微鏡で観察し、環境因子の光学的計測（蛍光測定、色変化の測定、吸光度測定など）を行ってもよい。なお、上記の光学的計測で用いる生体分子検出プローブは、マイクロチャンバ１４の内面に固定するものでもよく、マイクロチャンバ１４に固定せずに培養容器１３内の培地１１に直接投入するものであってもよい。

また、第２の手順では、マイクロチャンバ１４内の被計測空間で代謝物を十分蓄積させるために、被計測空間を形成した後に所定の待機時間をあけて環境因子を計測してもよい。さらに、第２の手順では、各々の計測時期を変化させて環境因子を複数回計測してもよい。この場合には、環境因子の量の変化と計測のインターバルとに基づいて、環境因子の量が変化する速度を求めることが可能となる。

第３の手順では、上記の環境因子の計測が終了した後に、培養容器１３からマイクロチャンバ１４を除去する。これにより、細胞の培養環境を計測前とほぼ同様の状態に復元できる。したがって、一の実施形態では、上記の第１の手順から第３の手順を繰り返すことで、培養環境下で培養される細胞１２の活性をほぼ非侵襲で周期的に判断することが可能となる。

なお、一の実施形態において、１つの培養容器１３内に複数のマイクロチャンバ１４を配置して、異なる細胞１２の活性測定を並行して行うようにしてもよい。

＜一の実施形態の変形例＞
図３、図４は、一の実施形態のマイクロチャンバ１４の他の構成例をそれぞれ模式的に示す断面図である。これらの構成によっても、計測対象の細胞１２の周囲に微小な被計測空間を構築することができ、図２に示すマイクロチャンバ１４の場合とほぼ同様の効果を得ることができる。なお、図３、図４において図２と共通する構成については、同一符号を付して重複説明は省略する。

図３に示すマイクロチャンバ１４は、培養容器１３と接触する底面と、上面とがそれぞれ開口した筒状の部材で構成されている。図３の構成によれば、マイクロチャンバ１４を細胞１２に被せるときに上面側の開口から空気を逃がすことができる。なお、図３の構成では、マイクロチャンバ１４の上面側から培地１１が流入することを防ぐように、マイクロチャンバ１４の高さを設定する必要がある。

図４に示すマイクロチャンバ１４は、培養容器１３と接触する底面と、上面とがそれぞれ開口した筒状の部材で構成されている。そして、図４のマイクロチャンバ１４では、培地１１の流出入を阻害するとともに空気の流出入を許容する疎水性の半透過膜１７で上面側の開口部が覆われている。図４の構成によれば、マイクロチャンバ１４を細胞１２に被せるときに上面側の開口から空気を一方的に逃がすことができ、かつ、被計測空間内を形成したときにマイクロチャンバ１４の内外で培地１１が混ざることを防止できる。

＜他の実施形態の活性計測方法の説明＞
図５は、他の実施形態に係る培養細胞の活性計測方法の概要を示す図である。他の実施形態は、図１に示す一の実施形態の変形例であって、マイクロチャンバ１４を配列したマイクロチャンバシート２１を用いて各々の被計測空間毎に環境因子の計測を行う。なお、他の実施形態では培養容器１３側の培養面を修飾することで、培養細胞１２の付着位置がマイクロチャンバシート２１に合わせて制御されている。

図６は、他の実施形態に係るマイクロチャンバシート２１を模式的に示す部分断面図である。また、図７は、他の実施形態で用いる培養容器１３の培養面と、マイクロチャンバシート２１との対応関係を示す図である。他の実施形態に係るマイクロチャンバシート２１の全体形状は、培養容器１３の内径よりも外径が小さい円板状の部材であって、一方の面（底面側）には複数のマイクロチャンバ１４が形成されている。マイクロチャンバ１４は有底円筒形の凹部で構成されており、例えばリソグラフィなどの公知の微細加工手段で形成される。

そして、マイクロチャンバシート２１の各々のマイクロチャンバ１４は一定間隔をおいて２次元的に配列されている。なお、図５、図７では、一例として、マイクロチャンバ１４が４×４の配列をなすマイクロチャンバシート２１を図示する。

一方、培養容器１３の培養面上には、各々で細胞の付着性が異なる第１領域２２と第２領域２３とが形成されている。上記の第１領域２２は、培養面上で相対的に細胞の付着性が高い領域である。この第１領域２２は培養面上に複数形成されており、その数はマイクロチャンバシート２１のマイクロチャンバ１４の数と対応する。培養面上の第１領域２２は、マイクロチャンバ１４の間隔に合わせて４×４の配列をなしている。なお、個々の第１領域２２のサイズは、マイクロチャンバ１４のサイズよりも若干小さくなるように設定されている。

また、第２領域２３は、培養面上で相対的に細胞の付着性が低い領域であって、第１領域２２を取り囲むように形成されている。そのため、培養容器１３内では、マイクロチャンバ１４の位置に対応する第１領域２２に細胞が付着しやすくなっている。

ここで、第１領域２２および第２領域２３の形成手段としては、以下の（１）から（４）の例が考えられる。なお、これらの構成は適宜組み合わせてもかまわない。
（１）第１領域２２に対して親水性を付与することで蛋白質の吸着を高め、第１領域２２での細胞の付着性を相対的に高くする。一例として、培養容器１３の培養面にプラズマや紫外線を照射してパターニングを行うことで、親水性が付与された第１領域２２を形成することができる。
（２）電荷を持った高分子被膜（例えばポリリジンのコーティングなど）を第１領域２２に形成することで蛋白質の吸着を高め、第１領域２２での細胞の付着性を相対的に高くする。
（３）第２領域２３に対して蛋白質の吸着を阻害する皮膜を形成することで、第２領域２３での細胞の付着性を相対的に低くする。上記の被膜の材料としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、２−メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）などが挙げられる。
（４）第２領域２３に表面加工で微小な突起を形成し、細胞の接着面積を低くすることで第２領域２３での細胞の付着性を相対的に低くしてもよい。

なお、他の実施形態における活性計測方法の手順は、マイクロチャンバシート２１を培養容器１３に配置する点と、個々のマイクロチャンバ１４ごとに環境因子を計測する点を除いて、一の実施形態とほぼ共通するので説明を省略する。なお、マイクロチャンバシート２１や培養容器１３にアライメントマークを予め設けておけば、マイクロチャンバシート２１を培養容器１３に配置するときの位置決めが容易となる。

他の実施形態の構成によれば、上記の一の実施形態の効果に加えて、細胞の活性の計測をアレイ化して一度に行うことができるので、複数の細胞の活性を評価するときのスループットを大幅に向上させることができる。また、他の実施形態では、アレイ化により個々のマイクロチャンバ１４をそれぞれ独立してアライメントする必要がないので、計測作業の煩雑さが低減して作業効率が一層向上する。

＜一の実施形態の標本の活性計測用器材セットと計測法の説明＞
図10は、一の実施形態に係る標本の活性計測用器材セットの部分的構成例を模式的に示す断面図であり、図11は、一の実施形態に係る標本の活性計測用
器材セットの構成例を模式的に示す断面図である。

本実施形態に係る標本の活性計測用器材セットは、標本（培養対象の細胞）
の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着性を低
下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた標本培養部材と、
前記標本培養部材と標本及び培養液とを収納する培養容器と、前記培養容器の
蓋部材と、前記標本培養部材が前記培養容器に収納された状態において、前記
第一領域を覆う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上
の第二マイクロチャンバと、を設けたマイクロチャンバアレイと、を有して構
成されている。

また、前記器材が用いられる本実施形態の標本活性計測方法は、培養液、標本培養部材および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成する区画手順と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測手順と、を有する。

培養容器の蓋部材は培養中に培養容器を覆うために装着され（図10）、標本の活性計測時には取り外される（図11）。

標本培養部材の表面（培養面）上には、各々で細胞の付着性が異なる第１領
域と第２領域２３とが形成されている。第１領域は、培養面上で相対的に細胞
の付着性が高い領域であり、第２領域は、培養面上で相対的に細胞の付着性が
低い領域である。

そのため、培養容器内では、第１マイクロチャンバの位置に対応する第１領
域２２に細胞が付着しやすくなっている。

標本試験において、前記第一マイクロチャンバは標本及び培養液を取り囲ん
で第一微小空間を形成し、また前記第二マイクロチャンバは培養液を取り囲ん
で第二微小空間を形成する。

前記第一微小空間は、取り囲まれた培養液中の標本の活性を計測するための
空間である。つまり、第一マイクロチャンバの内側（第一微小空間）には計測
対象の標本（細胞）と、培養液を収容可能となっている。標本培養部材の第一
領域に第一マイクロチャンバを配置することで、培養容器の容積に対して十分
に微小な被計測空間が第一マイクロチャンバの内側（第一微小空間）に構築さ
れる。

また前記第二微小空間は、前記活性計測のバックグランドとなる培養液から
のデータを計測する空間である。つまり、第二マイクロチャンバの内側（第二微小空間）に活性計測のバックグランドとなる培養液を収容可能となっている。

なお、各マイクロチャンバの大きさは、計測対象の細胞１２の種類や数、計測する環境因子の種類、計測の所要時間などに応じて適宜選択されるが、一例として、その直径が５０μｍから１００μｍ程度に設定される。

マイクロチャンバアレイを構成する各マイクロチャンバは、標本培養部材の
表面と接触する底面側が開放されるとともに、上面側が閉塞された有底円筒形
のカップ状に構成されており、例えばリソグラフィなどの公知の微細加工手段
で形成される。また、各マイクロチャンバは一定間隔をおいて２次元的に配列
されている。

また、本実施形態の各マイクロチャンバの内側には、環境因子センサおよび生体分子検出プローブがそれぞれ固定されている。環境因子センサは、培養液に含まれる環境因子の量を電気化学的手段によって電気信号に変換するセンサである。一例として、環境因子センサは、酸素センサや各種のバイオセンサ（グルコースセンサなど）で構成される。

生体分子検出プローブは、環境因子のうちから選択された標的分子を特異的に補足する分子で構成され、例えば、抗体、酵素等のタンパク質、ペプチド、糖類等を用いることができる。

本実施形態では、異なる種類の生体分子検出プローブをパターニング等で各マイクロチャンバの特定の位置（各マイクロチャンバ内の上面など）にアレイ化して固定してもよい。この場合には、同時に多項目の網羅的な解析が可能になる。また、標的分子を蛍光標識等しておけば、生体分子検出プローブと標的分子との結合を容易に判断することができる。なお、上記の場合には蛍光強度によって標的分子の量を測ることもできる。

ここで、本実施形態での各マイクロチャンバは、以下の（１）から（５）の構成（あるいはこれらの組み合わせ）を有していてもよい。
（１）光学的計測（蛍光測定、色変化の測定、吸光度測定）によって環境因子を計測する場合には、各マイクロチャンバ内で生じる光学的な変化に対応した波長の光を透過する透光性材料で各マイクロチャンバを形成することが好ましい。

このとき、光学的計測を容易に行う観点から、各マイクロチャンバの屈折率は培養液（液体培地）の屈折率と同じ値に設定することが好ましい。一例として、可視光に対する透光性を有するとともに屈折率が液体培地とほぼ同等な材質として、非晶質フッ素樹脂（例えば、サイトップ（登録商標））などが挙げられる。

また、光学的計測を行う場合には、計測時の光学像のひずみを避けるために、各マイクロチャンバの上面を平坦にしてもよい。あるいは、光学的計測でのＮＡを向上させるために、各マイクロチャンバの上面にマイクロレンズを形成してもよい（この場合の図示は省略する）。
（２）各マイクロチャンバは、柔軟性の高い弾性材料で形成してもよい。かかる構成によれば、例えば、外部の細胞と接合した軸索などにダメージを与えずに計測対象の細胞に第一マイクロチャンバを被せることができる。また、標本培養部材の第一領域（培養面）に対して第一マイクロチャンバに傾きが生じている場合にも、第一マイクロチャンバの変形によってアライメントの誤差を吸収することが可能となる。なお、各マイクロチャンバに用いられる弾性材料としては、例えば、シリコンゴム（ポリジメチルシロキサン）が挙げられる。
（３）各マイクロチャンバは、酸素透過性を有する材質で形成してもよい。かかる構成によれば、比較的長時間の計測を行う場合にも、マイクロチャンバ１４内に細胞の培養環境を維持できる。勿論、この場合には酸素濃度が計測項目に含まれないことが前提となる。なお、各マイクロチャンバに用いられる酸素透過性材料としては、例えば、シリコンゴム（ポリジメチルシロキサン）が挙げられる。
（４）被計測空間内を液体培地で満たすことを容易とするために、各マイクロチャンバの内面には、親水性被膜の形成などによって親水性を付与してもよい。この場合には、各マイクロチャンバを上下に反転させて空気が入らないように予め液体培地を容器内に充填し、その後に各マイクロチャンバを本来の状態（底面側に開口がある状態）に戻しても表面張力によって容器内の液体は保持される。したがって、この場合には、予め液体培地で満たされている状態の第一マイクロチャンバを、細胞の上に被せることが可能となる。
（５）各マイクロチャンバの表面には、蛋白質の吸着を阻害する物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２−メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）など）で被膜を形成してもよい。この場合には、計測が培養環境に及ぼす影響をより低減させることができる。

マイクロチャンバアレイの材料としては前記材料以外に例えば、透明性及び弾性のある材料（アリル樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン、ケイ素樹脂、ポリエーテルスルホン、エポキシ樹脂、非晶質フッ素樹脂など）も使用することができる。

培養容器の材料としては例えば、透明性のある材料（ガラス、アリル樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン、ケイ素樹脂、ポリエーテルスルホン、エポキシ樹脂、非晶質フッ素樹脂など）を使用すればよい。

標本培養部材は例えば平板形状を有し、また材料としては例えば、培養液よりも比重が大きく、透明性のある材料（ガラス、アリル樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリスチレン、ケイ素樹脂、ポリエーテルスルホン、エポキシ樹脂、非晶質フッ素樹脂など）を使用すればよい。

標本培養部材の表面（培養面）上に、培養面上で相対的に細胞の付着性が高
い第１領域と、培養面上で相対的に細胞の付着性が低い第２領域を形成する手段としては、以下の（１）から（４）の例が考えられる。なお、これらの構成は適宜組み合わせてもかまわない。
（１）第１領域に対して親水性を付与することで蛋白質の吸着を高め、第１領域での細胞の付着性を相対的に高くする。一例として、標本培養部材の表面（培養面）にプラズマや紫外線を照射してパターニングを行うことで、親水性が付与された第１領域を形成することができる。
（２）電荷を持った高分子被膜（例えばポリリジンのコーティングなど）を第１領域に形成することで蛋白質の吸着を高め、第１領域での細胞の付着性を相対的に高くする。
（３）第２領域に対して蛋白質の吸着を阻害する皮膜を形成することで、第２領域での細胞の付着性を相対的に低くする。上記の被膜の材料としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や、２−メタクリロイオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）などが挙げられる。
（４）第２領域に表面加工で微小な突起を形成し、細胞の接着面積を低くすることで第２領域での細胞の付着性を相対的に低くしてもよい。

なお、本実施形態の標本活性計測用器材セットを用いた活性計測方法の手順は、標本培養部材及びマイクロチャンバアレイを培養容器に配置する点と、個々のマイクロチャンバごとに環境因子を計測する点を除いて、一の実施形態とほぼ共通するので説明を省略する。

また、本実施形態の構成によれば、上記の一の実施形態の効果に加えて、細胞の活性の計測をアレイ化して一度に行うことができるので、複数の細胞の活性を評価するときのスループットを大幅に向上させることができる。

また、本実施形態では、アレイ化により個々のマイクロチャンバをそれぞれ独立してアライメントする必要がないので、計測作業の煩雑さが低減して作業効率が一層向上する。

本実施形態の構成によれば、標本の活性計測時に必要となる相互の位置決めのための構造またはアライメントマークを設けたマイクロチャンバアレイ及び標本培養部材をセットで作製できる。

このように、マイクロチャンバアレイ及び標本培養部材に位置決め構造またはアライメントマークを予め設けておけば、マイクロチャンバアレイを培養容器中の標本培養部材に配置するときの位置決めが容易となる。

＜活性計測装置の構成例＞
図８は、上述の一の実施形態または他の実施形態の活性計測方法を実行するための活性計測装置の構成例を示すブロック図である。

本実施形態の標本活性計測装置は、標本培養部材、培養液および標本を収容
した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記
培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形
成するための操作部と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計
測対象の標本の活性を求める計測部と、前記培養容器内に前記マイクロチャン
バを位置決め配置するときの位置情報の取得や、或いは前記マイクロチャンバ
内部の被計測空間で生じる光学的変化を示す画像情報の取得に用いる光学観察
部と、前記操作部、前記計測部及び前記光学観察部を制御する制御部と、を有
する。

具体的に説明すると、本実施形態の標本活性計測装置は、恒温室３１と、ロ
ボットアーム（操作部）３２と、光学観察ユニット（光学観察部）３３と、モニタ３４と、記憶部３５と、制御部（計測部を含む）３６と、ユーザーから各種の入力を受け付ける入力部３７とを有している。ここで、ロボットアーム３２、光学観察ユニット３３、モニタ３４、記憶部３５および入力部３７は、それぞれ制御部３６に接続されている。

恒温室３１には、計測対象の細胞１２を培養する培養容器１３が収納される。この恒温室３１の内部は、細胞の培養に適した環境（例えば温度３７℃、湿度９０％の雰囲気）に維持されるとともに、コンタミネーションを防止するために高い清浄度に保たれている。

ロボットアーム３２は、マイクロチャンバ１４、マイクロチャンバシート２１またはマイクロチャンバアレイが先端に保持されており、マイクロチャンバ１４等を三次元的に移動させる。そして、ロボットアーム３２は、制御部３６の指示に応じて、培養容器１３の所定位置の細胞１２にマイクロチャンバ１４等を被せるとともに、計測終了後にマイクロチャンバ１４等を除去する動作を行う。

光学観察ユニット３３は、培養細胞を照明する照明装置と、培養細胞を観察するための顕微光学系と、顕微光学系を介した培養容器１３内の像を撮像する撮像装置とを有している。この光学観察ユニット３３は、ロボットアーム３２が培養容器１３内にマイクロチャンバ１４等を位置決めするときの位置情報の取得や、マイクロチャンバ１４等の内部の被計測空間で生じる光学的な変化を示す画像情報の取得に用いられる。なお、光学観察ユニット３３で撮像された画像は、制御部３６の制御によってモニタ３４に表示することができる。

記憶部３５は、ハードディスクやフラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体で構成される。この記憶部３５には、環境因子の計測情報や、環境因子の計測時に光学観察ユニット３３が生成した画像情報がそれぞれ記憶される。上記の画像情報や環境因子の計測情報は、計測対象の細胞の識別情報および計測日時の情報とそれぞれ対応付けされた状態で記憶部３５に記憶される。なお、記憶部３５には、制御部３６によって実行されるプログラムも記憶される。

制御部３６は、活性計測装置の各部の動作を統括的に制御するプロセッサである。例えば、制御部３６は、ロボットアーム３２を制御してマイクロチャンバ１４等を移動させる。また、制御部３６は、光学観察ユニット３３の撮像装置やマイクロチャンバ１４等の内部の環境因子センサ１５によって、マイクロチャンバ１４等の内部の環境因子の計測を行う。

以下、図９の流れ図を参照しつつ、活性計測装置の動作例を説明する。

ステップＳ１０１：制御部３６は、光学観察ユニット３３を駆動させて培養容器１３内の状態を撮像した観察画像を取得する。これにより、制御部３６は、マイクロチャンバ１４等を位置決めするときの位置情報を取得する。一例として、制御部３６は、画像の基準点（例えば画面の中心）と培養容器１３での位置とを予め対応付けておく。そして、制御部３６は、光学観察ユニット３３での撮影倍率やレンズ位置などを考慮して、画像内における細胞と基準点との位置関係から、培養容器１３での実際の細胞の座標を幾何学的に求めることができる。 その後、制御部３６は、上記の観察画像をモニタ３４に表示する。これにより、ユーザーは観察画像に基づいて、計測対象となる細胞１２を操作部３７から指定することができる。

ステップＳ１０２：ユーザーから計測対象となる細胞１２の指定を受け付けると、制御部３６は、上記の位置情報（Ｓ１０１）に基づいてロボットアーム３２を駆動させて計測対象の細胞１２の上からマイクロチャンバ１４等を配置する。これにより、計測対象の細胞１２の周囲にマイクロチャンバ１４等で被計測空間が形成される。

ステップＳ１０３：制御部３６は、光学観察ユニット３３による画像の撮像や、環境因子センサ１５の出力によって、被計測空間内の環境因子の計測を実行する。そして、制御部３６は、必要に応じて環境因子の計測結果を統計解析した後に、記憶部３５への計測結果の記録や、モニタ３４での計測結果の表示を行う。

ステップＳ１０４：制御部３６は、計測終了後に、ロボットアーム３２を駆動させて培養容器１３からマイクロチャンバ１４等を除去し、培養容器１３内の培養環境を復元する。

以上で、図９の流れ図の説明を終了する。上記の活性計測装置によれば、上述の実施形態の活性計測方法を効率的に実行することが可能となる。

＜実施形態の補足事項＞
（１）上記の実施形態において、マイクロチャンバ１４に光硬化性樹脂を用いた場合には、マイクロチャンバ１４にレーザーを照射することで任意の細胞をマイクロチャンバ１４内に封止することができる。上記の構成によれば、被計測空間における環境因子の計測結果に基づいて、所望の細胞を選択的に分離抽出することが可能となる。
（２）上記の図４の例において、マイクロチャンバ１４の側面に疎水性の半透過膜１７で覆われた開口部を形成してもよい。
（３）上記の実施形態において、マイクロチャンバ１４内の蛍光を観察する場合には、マイクロチャンバ１４の側壁の内面側に、蛍光の波長を反射する反射膜を形成してもよい。この場合には、マイクロチャンバ１４内の蛍光シグナルをより高感度に検出できるようになる。
（４）なお、上記実施形態のマイクロチャンバ１４、マイクロチャンバシート２１、マイクロチャンバアレイ、培養容器１３などの器具は、使い捨て物品として設計することが好ましい。
（５）本実施形態の標本活性計測装置は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器を搬送する機構であり、培養中の培養容器を保管するストッカに前記培養容器を出し入れする搬送装置との間で、前記培養容器の受け渡しを行う受け渡し部をさらに有してもよい（図１２）。
（６）本実施形態の標本活性計測装置は、マイクロチャンバを保管する保管部
をさらに有し、前記操作部は使用前のマイクロチャンバを前記保管部から取り
出して前記培養容器内に配置し、また計測終了後のマイクロチャンバを前記培
養容器から取り外して前記保管部に戻すように構成してもよい（図１２）。

以上の詳細な説明により、実施形態の特徴点および利点は明らかになるであろう。これは、特許請求の範囲が、その精神および権利範囲を逸脱しない範囲で前述のような実施形態の特徴点および利点にまで及ぶことを意図する。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、あらゆる改良および変更に容易に想到できるはずであり、発明性を有する実施形態の範囲を前述したものに限定する意図はなく、実施形態に開示された範囲に含まれる適当な改良物および均等物によることも可能である。

また、本発明は以下の特徴を設けて構成してもよい。

本発明の標本活性計測用の器材セットは、標本の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着性を低下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた標本培養部材と、前記標本培養部材が培養容器に収納された状態において、前記第一領域を覆う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上の第二マイクロチャンバと、を設けたマイクロチャンバアレイとを有して構成され、前記標本の活性計測時の位置決めを行うための構造またはアライメントマークが前記標本培養部材及び前記マイクロチャンバアレイに設けられている。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測装置は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成するための操作部と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測部と、前記操作部及び前記計測部を制御する制御部と、を有することを特徴とする。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測方法は、前記標本
培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成する区画手順と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測手順と、を有することを特徴とする。

本発明の標本活性計測用の器材セットは、標本の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着性を低下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた部材であり、培養容器に対する設置及び取り外しを行うための構造を設けた標本培養部材と、前記標本培養部材が培養容器に収納された状態において、前記第一領域を覆う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上の第二マイクロチャンバと、を設けたマイクロチャンバアレイと、を有して構成されることを特徴とする。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測装置は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成するための操作部と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測部と、前記操作部及び前記計測部を制御する制御部と、を有することを特徴とする。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測方法は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成する区画手順と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測手順と、を有することを特徴とする。

本発明の標本活性計測用の器材セットは、標本の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着性を低下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた標本培養部材と、
前記標本培養部材が培養容器に収納された状態において、前記第一領域を覆
う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上の第二マイク
ロチャンバと、前記標本培養部材に対する設置及び取り外しを行うための構造
を設けたマイクロチャンバアレイと、を有して構成されることを特徴とする。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測装置は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成するための操作部と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測部と、前記操作部及び前記計測部を制御する制御部と、を有することを特徴とする。

また、前記器材セットが用いられる本発明の標本活性計測方法は、前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成する区画手順と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測手順と、を有することを特徴とする。

１１…培地、１２…細胞、１３…培養容器、１４…マイクロチャンバ、１５…環境因子センサ、１６…生体分子検出プローブ、１７…半透過膜、２１…マイクロチャンバシート、２２…第１領域、２３…第２領域、３１…恒温室、３２…ロボットアーム、３３…光学観察ユニット、３４…モニタ、３５…記憶部、３６…制御部、３７…入力部

Claims (9)

1. 標本の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着
   性を低下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた標本培養
   部材と、
   前記標本培養部材が培養容器に収納された状態において、前記第一領域を覆
   う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上の第二マイク
   ロチャンバと、を設けたマイクロチャンバアレイと、
   を有して構成される標本の活性計測用器材セット。
2. 標本の付着性を向上させる処理が施された一以上の第一領域と、標本の付着
   性を低下させる処理が施された一以上の第二領域と、を表面に設けた標本培養
   部材と、
   前記標本培養部材と標本及び培養液とを収納する培養容器と、
   前記培養容器の蓋部材と、
   前記標本培養部材が前記培養容器に収納された状態において、前記第一領域
   を覆う一以上の第一マイクロチャンバと、前記第二領域を覆う一以上の第二マ
   イクロチャンバと、を設けたマイクロチャンバアレイと、
   を有して構成される標本の活性計測用器材セット。
3. 標本試験において、前記第一マイクロチャンバは標本及び培養液を取り囲ん
   で第一微小空間を形成し、また前記第二マイクロチャンバは培養液を取り囲ん
   で第二微小空間を形成することを特徴とする請求項１または２に記載の標本の活性計測用 器材セット。
4. 前記第一微小空間は、取り囲まれた培養液中の標本の活性を計測するための
   空間であり、また前記第二微小空間は、前記活性計測のバックグランドとなる
   取り囲まれた培養液からのデータを計測する空間であることを特徴とする請求
   項３記載の標本の活性計測用器材セット。
5. 請求項１〜４のいずれか１項記載の標本の活性計測用器材セットが用いられ
   る標本活性計測装置であって、
   前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器内に計測対象の標本を取り囲むマイクロチャンバを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記マイクロチャンバの内側に形成するための操作部と、前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を求める計測部と、前記操作部及び前記計測部を制御する制御部と、を有することを特徴とする標本活性計測装置。
6. 前記標本培養部材、培養液および標本を収容した培養容器を搬送する機構で
   あり、培養中の培養容器を保管するストッカに前記培養容器を出し入れする搬
   送装置との間で、前記培養容器の受け渡しを行う受け渡し部をさらに有するこ
   とを特徴とする請求項５記載の標本活性計測装置。
7. 前記培養容器内に前記マイクロチャンバを位置決め配置するときの位置情報
   の取得や、或いは前記マイクロチャンバ内部の被計測空間で生じる光学的変化
   を示す画像情報の取得に用いる光学観察部をさらに有し、前記制御部は前記光
   学観察部を制御することを特徴とする請求項５または６記載の標本活性計測装
   置。
8. マイクロチャンバを保管する保管部をさらに有し、前記操作部は使用前のマ
   イクロチャンバを前記保管部から取り出して前記培養容器内に配置し、また計
   測終了後のマイクロチャンバを前記培養容器から取り外して前記保管部に戻す
   ことを特徴とする請求項５から７のいずれか１項記載の標本活性計測装置。
9. 請求項１〜４のいずれか１項記載の標本の活性計測用器材セットを使用して
   実施する標本活性計測方法であって、
   標本培養部材と培養液、標本培養部材および標本とを収容した培養容器内に
   計測対象の標本及び培養液を取り囲む第一マイクロチャンバと、培養液を取り囲む第二チャンバとを配置し、前記培養容器の容積に対して微少な被計測空間を前記各マイクロチャンバの内側に形成する区画手順と、
   前記被計測空間に含まれる環境因子を計測し、前記計測対象の標本の活性を
   求める計測手順と、
   を有することを特徴とする標本の活性計測方法。