JP2011080775A - Pregnancy hypertension syndrome marker and diagnosis using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、妊娠高血圧症候群の新規診断マーカー、並びにそれを利用した妊娠高血圧症候群の診断方法等に関する。 The present invention relates to a novel diagnostic marker for gestational hypertension syndrome, a method for diagnosing gestational hypertension syndrome using the same, and the like.
妊娠高血圧症候群（PIH；いわゆる「妊娠中毒症」、2005年に日本産科婦人科学会により「妊娠高血圧症候群」と名称変更がなされている）の発症頻度は全妊婦の7〜10％を占め、産科領域における代表的疾患の一つである。本症は、高血圧やそれに伴うタンパク尿を主症状とする疾患であるが、病因についてはなお不明な点が多い。重症化により、肝機能障害、凝固線溶系異常、呼吸・循環障害、中枢神経系異常など、致死的な多臓器障害が惹起される場合もあるため、早期発見を心がけることが重要である。 The incidence of pregnancy-induced hypertension syndrome (PIH; so-called “pregnancy hypertension”, renamed as “pregnancy-hypertension syndrome” in 2005 by the Japan Obstetrics and Gynecology Society) accounted for 7-10% of all pregnant women, It is one of the typical diseases in the field. This disease is a disease whose main symptom is hypertension and associated proteinuria, but the etiology is still unclear. It is important to make early detection because severe cases may cause fatal multi-organ disorders such as liver dysfunction, coagulation / fibrinolysis abnormality, respiratory / circulation disorder, and central nervous system abnormality.
現在、妊娠高血圧症候群の診断は、血圧測定や尿検査を通じて、即ち病態の完成を指標にして行われているために治療戦略は後手に回ることが多く、より簡便かつ精度の高い新規な診断（特に予知診断）手法の開発が望まれている。 At present, the diagnosis of gestational hypertension syndrome is carried out through blood pressure measurement and urinalysis, that is, with the completion of the pathological condition as an indicator, so the treatment strategy often goes to the rear, and a new diagnosis with simpler and higher accuracy ( In particular, the development of a predictive diagnosis method is desired.
生体内のタンパク質発現を網羅的に解析するプロテオミクス研究の進展に伴い、プロテオミクスを利用した新規バイオマーカーの探索が精力的に行われている。例えば、いくつかの癌患者の血清中のタンパク質分解産物パターンが調べられ、フィブリノーゲンα鎖、Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4)、Complement C4-A (C4a)、Kininogen-1のフラグメントが、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌で変動することが報告されている（非特許文献１）。
しかし、これらのタンパク質フラグメントと妊娠高血圧症候群との関連は何ら報告されていない。
With the progress of proteomics research that comprehensively analyzes protein expression in vivo, search for new biomarkers using proteomics has been energetically performed. For example, proteolytic product patterns in the sera of several cancer patients were examined and fibrinogen alpha chain, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4), Complement C4-A (C4a), and Kininogen-1 fragments It has been reported that it varies in prostate cancer, bladder cancer, and colon cancer (Non-patent Document 1).
However, no association between these protein fragments and gestational hypertension syndrome has been reported.
本発明の目的は、妊娠高血圧症候群の新規診断マーカー、並びにそれを利用した妊娠高血圧症候群の有効な診断方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a novel diagnostic marker for gestational hypertension syndrome and an effective diagnostic method for gestational hypertension syndrome using the same.
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、妊娠高血圧症候群患者から採取した血清を質量分析により調べた結果、正常妊婦と比較して顕著にレベルが変動している7種のペプチドを見出した。アミノ酸配列を分析した結果、これらのペプチドのうち３つはKininogen-1の部分アミノ酸配列からなるペプチド、２つはフィブリノーゲンα鎖の部分アミノ酸配列からなるペプチド、１つはC4aの部分アミノ酸配列からなるペプチドであり、残りの１つはITIH4の部分アミノ酸配列からなるペプチドであることが判明した。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、これらのペプチドを妊娠高血圧症候群の診断マーカーとして新たに同定し、本発明を完成するに至った。
In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have examined 7 sera collected from patients with gestational hypertension syndrome by mass spectrometry, and as a result, found 7 kinds of peptides whose levels are remarkably different from those of normal pregnant women. It was. As a result of analyzing the amino acid sequence, three of these peptides are peptides composed of a partial amino acid sequence of Kininogen-1, 2 are peptides composed of a partial amino acid sequence of fibrinogen α chain, and one is composed of a partial amino acid sequence of C4a. It was found that the remaining one was a peptide consisting of a partial amino acid sequence of ITIH4.
Based on these findings, the present inventors have newly identified these peptides as diagnostic markers for pregnancy-induced hypertension syndrome, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は、
［１］被験者より採取した生体試料中の、Kininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aおよびITIH4の分解産物からなる群より選ばれる１以上のペプチドの量を測定することを特徴とする、該被験者における妊娠高血圧症候群の診断のための検査方法；
［２］Kininogen-1の分解産物が、配列番号１〜３に示される各アミノ酸配列からなるペプチド群であり、フィブリノーゲンＡα鎖の分解産物が、配列番号４および５に示される各アミノ酸配列からなるペプチド群であり、C4aの分解産物が、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、ITIH4の分解産物が、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記［１］記載の方法；
［３］生体試料が体液である、上記［１］または［２］記載の方法；
［４］体液が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される、上記［３］記載の方法；
［５］生体試料を質量分析にかけることを含む、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法；
［６］測定するペプチドを特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法；
［７］妊娠高血圧症候群患者から時系列で生体試料を採取し、該試料における、Kininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aおよびITIH4の分解産物からなる群より選ばれる１以上のペプチドの量の経時変化を調べることを特徴とする、該患者に該疾患の経過観察のための検査方法；
［８］妊娠高血圧症候群患者における治療効果の評価方法であって、治療が施される前後に該患者から採取した生体試料における、Kininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aおよびITIH4の分解産物からなる群より選ばれる１以上のペプチドの量の変化を調べることを特徴とする方法；
［９］配列番号１、２、５および６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド
などを提供する。
That is, the present invention
[1] In the subject, the amount of one or more peptides selected from the group consisting of degradation products of Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a and ITIH4 in a biological sample collected from the subject is measured. Test method for diagnosis of pregnancy hypertension syndrome;
[2] The degradation product of Kininogen-1 is a peptide group consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 3, and the degradation product of fibrinogen Aα chain consists of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4 and 5. [1] above, which is a peptide group, wherein the degradation product of C4a is a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and the degradation product of ITIH4 is a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7. the method of;
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the biological sample is a body fluid;
[4] The body fluid is selected from the group consisting of blood, plasma, serum, saliva, urine, spinal fluid, bone marrow fluid, pleural effusion, ascites, joint fluid, tear fluid, aqueous humor, vitreous humor and lymph fluid [3] ] The method according to
[5] The method according to any one of the above [1] to [4], comprising subjecting the biological sample to mass spectrometry;
[6] The method according to any one of [1] to [4] above, wherein an antibody that specifically recognizes the peptide to be measured is used;
[7] A biological sample is collected in time series from a patient with gestational hypertension syndrome, and the amount of one or more peptides selected from the group consisting of degradation products of Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a and ITIH4 in the sample is changed over time. A test method for observing the disease in the patient;
[8] A method for evaluating the therapeutic effect in patients with gestational hypertension syndrome, comprising a degradation sample of Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a and ITIH4 in a biological sample collected from the patient before and after treatment A method characterized by examining a change in the amount of one or more peptides selected from;
[9] Provided is a peptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 5, and 6.
本発明によれば、妊娠高血圧症候群を迅速・的確に判定できるので、該疾患の早期発見、早期治療が可能となる。 According to the present invention, since the pregnancy-induced hypertension syndrome can be determined quickly and accurately, early detection and early treatment of the disease are possible.
本発明は、妊娠高血圧症候群のマーカーペプチド（以下、「本発明の妊娠高血圧症候群マーカー」という場合がある）を提供する。本発明における「妊娠高血圧症候群」とは、日本産科婦人科学会により「妊娠高血圧症候群」と定義される疾患を意味する。すなわち、妊娠20週以降、分娩後12週までに高血圧がみられる場合、または高血圧にタンパク尿を伴う場合のいずれかで、かつこれらの症状が単なる妊娠の偶発合併症によるものでないものをいう。 The present invention provides a marker peptide for pregnancy-induced hypertension syndrome (hereinafter sometimes referred to as “the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention”). The “pregnant hypertension syndrome” in the present invention means a disease defined by the Japanese Obstetrics and Gynecology Association as “pregnancy hypertension syndrome”. That is, when hypertension is observed after the 20th week of pregnancy and by 12 weeks after delivery, or when hypertension is accompanied by proteinuria, and these symptoms are not simply caused by contingent complications of pregnancy.
本発明の妊娠高血圧症候群マーカーは、Kininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aおよびITIH4の分解産物である。Kininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aおよびITIH4のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８、９、１０および１１に示す。 The gestational hypertension syndrome marker of the present invention is a degradation product of Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a and ITIH4. The amino acid sequences of Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a and ITIH4 are shown in SEQ ID NOs: 8, 9, 10 and 11, respectively.
Kininogen-1の分解産物としては、配列番号８に示されるアミノ酸配列の任意の部分アミノ酸配列からなるペプチドであれば特に制限されないが、好ましくは、配列番号１〜３に示される各アミノ酸配列からなるペプチド（それぞれ「ペプチドK1」、「ペプチドK2」、「ペプチドK3」ともいう）が挙げられる。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Kininogen-1のＮ末端から439番目のHis残基から、456番目のGln残基までのフラグメントに相当する。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、Kininogen-1のＮ末端から458番目のGly残基から、477番目のPhe残基までのフラグメントに相当する。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、Kininogen-1のＮ末端から438番目のLys残基から、456番目のGln残基までのフラグメントに相当する。 The degradation product of Kininogen-1 is not particularly limited as long as it is a peptide consisting of an arbitrary partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, but preferably consists of each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 3 Peptides (also referred to as “peptide K1”, “peptide K2”, and “peptide K3”, respectively). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to a fragment from the 439th His residue to the 456th Gln residue from the N-terminus of Kininogen-1. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 corresponds to a fragment from the 458th Gly residue to the 477th Phe residue from the N-terminus of Kininogen-1. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 corresponds to a fragment from the 438th Lys residue to the 456th Gln residue from the N-terminus of Kininogen-1.
フィブリノーゲンα鎖の分解産物としては、配列番号９に示されるアミノ酸配列の任意の部分アミノ酸配列からなるペプチドであれば特に制限されないが、好ましくは、配列番号４および５に示される各アミノ酸配列からなるペプチド（それぞれ「ペプチドα1」、「ペプチドα2」ともいう）が挙げられる。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、フィブリノーゲンα鎖のＮ末端から605番目のAsp残基から、624番目のAla残基までのフラグメントに相当する。配列番号５に示されるアミノ酸配列は、フィブリノーゲンα鎖のＮ末端から603番目のMet残基から、629番目のVal残基までのフラグメントに相当する。 The degradation product of fibrinogen α chain is not particularly limited as long as it is a peptide consisting of an arbitrary partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, but preferably consists of each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 And peptides (also referred to as “peptide α1” and “peptide α2”, respectively). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 corresponds to a fragment from the 605th Asp residue to the 624th Ala residue from the N-terminus of the fibrinogen α chain. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 corresponds to a fragment from the 603rd Met residue to the 629th Val residue from the N-terminus of the fibrinogen α chain.
C4aの分解産物としては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列の任意の部分アミノ酸配列からなるペプチドであれば特に制限されないが、好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ペプチド4a」）が挙げられる。配列番号６に示されるアミノ酸配列は、C4aのＮ末端から1429番目のAsp残基から、1449番目のAsn残基までのフラグメントに相当する。 The degradation product of C4a is not particularly limited as long as it is a peptide consisting of an arbitrary partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. Preferably, a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (hereinafter, “ Peptide 4a "). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 corresponds to a fragment from the 1429th Asp residue to the 1449th Asn residue from the N-terminus of C4a.
ITIH4の分解産物としては、配列番号１１に示されるアミノ酸配列の任意の部分アミノ酸配列からなるペプチドであれば特に制限されないが、好ましくは、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、「ペプチドH4」）が挙げられる。配列番号７に示されるアミノ酸配列は、ITIH4のＮ末端から617番目のAsn残基から、644番目のArg残基までのフラグメントに相当する。 The degradation product of ITIH4 is not particularly limited as long as it is a peptide consisting of an arbitrary partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, but preferably a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 (hereinafter, “ Peptide H4 "). The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 corresponds to a fragment from the 617th Asn residue to the 644th Arg residue from the N-terminus of ITIH4.
上述の通り、ペプチドK1〜K3はKininogen-1のフラグメント（分解産物）であり、ペプチドα1およびα2はフィブリノーゲンα鎖のフラグメントであり、ペプチド4aはC4aのフラグメントであり、ペプチドH4はITIH4のフラグメントである。したがって、被験対象となる患者が、Kininogen-1、フィブリノーゲンα、C4aまたITIH4のこれらのペプチドに対応する部分アミノ酸配列内に１もしくは２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加またはそれらの組合せを含む多型もしくはアレル変異を有する場合、検出すべきペプチドのアミノ酸配列は、「配列番号１〜７に示される各アミノ酸配列において、当該多型もしくはアレル変異を有するアミノ酸配列」と解すべきであることは、当業者にとって自明であろう。 As described above, peptides K1 to K3 are Kininogen-1 fragments (degradation products), peptides α1 and α2 are fibrinogen α chain fragments, peptide 4a is a C4a fragment, and peptide H4 is a fragment of ITIH4. is there. Therefore, the patient to be tested is one or more amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the partial amino acid sequence corresponding to these peptides of Kininogen-1, fibrinogen α, C4a or ITIH4, or combinations thereof The amino acid sequence of the peptide to be detected should be construed as “the amino acid sequence having the polymorphism or allelic variation in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 7”. This will be obvious to those skilled in the art.
本発明の妊娠高血圧症候群マーカーは、生体内においてＮ末端、Ｃ末端もしくは側鎖が修飾されたものを包含する。例えば、該マーカーがＮ末端にGln残基を有する場合には、ピログルタミン酸化したものを包含する。 The gestational hypertension syndrome marker of the present invention includes those in which the N-terminus, C-terminus or side chain is modified in vivo. For example, when the marker has a Gln residue at the N-terminus, it includes a pyroglutamine-oxidized one.
本発明はまた、妊娠高血圧症候群に罹患していると疑われる患者由来の生体試料中の、１種以上の本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量を測定することによる、該患者における妊娠高血圧症候群の診断のための検査方法を提供する。ここで「診断のための検査」とは、該マーカーペプチド量の測定および必要に応じて対照サンプルにおける測定値との比較を意味する。「妊娠高血圧症候群に罹患していると疑われる患者」は、患者本人が主観的に疑いを抱くものであっても、何らかの客観的な根拠に基づくものであってもよいが、好ましくは、従来公知の臨床検査および／または診察の結果、当該疾患への合理的な罹患可能性があると医師が判断した患者、あるいはそれと同等の病態を有する妊婦である。 The present invention also relates to gestational hypertension syndrome in a patient by measuring the amount of one or more gestational hypertension syndrome markers of the present invention in a biological sample from a patient suspected of suffering from gestational hypertension syndrome. Provide an inspection method for diagnosis. Here, “test for diagnosis” means measurement of the amount of the marker peptide and, if necessary, comparison with the measured value in a control sample. The “patient suspected of suffering from pregnancy-induced hypertension syndrome” may be subjectively suspected by the patient or based on some objective basis. A patient who has been judged by a doctor to have a reasonable possibility of having the disease as a result of a known clinical examination and / or examination, or a pregnant woman having an equivalent condition.
被験試料となる患者由来の生体試料は特に限定されないが、患者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液など生体から容易に採取できるものや、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液など比較的容易に採取されるものが挙げられる。
血清や血漿を用いる場合、常法に従って患者から採血し、液性成分を分離することにより調製することができる。測定対象である本発明の妊娠高血圧症候群マーカーが比較的低分子量（例えば10000以下、5000以下など）のペプチドの場合には、必要に応じ、スピンカラムなどを用いて濃縮し、予め高分子量のタンパク質画分などを分離除去しておくこともできる。
The patient-derived biological sample to be the test sample is not particularly limited, but is preferably one that is less invasive to the patient, for example, blood, plasma, serum, saliva, urine, tears that can be easily collected from the living body And those collected relatively easily such as cerebrospinal fluid, bone marrow fluid, pleural effusion, ascites, joint fluid, aqueous humor, and vitreous humor.
When serum or plasma is used, it can be prepared by collecting blood from a patient according to a conventional method and separating the liquid component. When the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention to be measured is a peptide having a relatively low molecular weight (for example, 10000 or less, 5000 or less, etc.), it is concentrated using a spin column, etc. It is also possible to separate and remove fractions and the like.
生体試料中の、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの検出は、例えば、生体試料を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法等に供し、該マーカーペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、あるいはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。本発明の妊娠高血圧症候群マーカーはアミノ酸配列が既知であるので、該アミノ酸配列を認識する抗体を作製して、ウェスタンブロッティングや各種イムノアッセイにより該ペプチドを検出する方法が、より好ましく用いられ得る。さらに上記方法のハイブリッド型検出法も有効である。 The detection of the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention in a biological sample can be carried out, for example, by using various molecular weight measuring methods such as gel electrophoresis or various separation and purification methods (eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography). Chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, etc.), ionization methods (eg, electron impact ionization, field desorption, secondary ionization, fast atom bombardment, matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI), Electrospray ionization, etc.), mass spectrometers (eg, double-focusing mass spectrometer, quadrupole analyzer, time-of-flight mass spectrometer, Fourier transform mass spectrometer, ion cyclotron mass spectrometer, etc.) A band or spot that matches the molecular weight of the marker peptide, There could be done by detecting a peak, but not limited to. Since the gestational hypertension syndrome marker of the present invention has a known amino acid sequence, a method of preparing an antibody that recognizes the amino acid sequence and detecting the peptide by Western blotting or various immunoassays can be used more preferably. Furthermore, the hybrid detection method of the above method is also effective.
本発明のペプチドK1〜K3、α1、α2、4aおよびH4は、それぞれ2079.96、2126.01、2208.05、2090.90、2860.33、2377.20および3155.62の分子量（計算値）を有するが、用いられる測定方法・測定機器に応じて、実測値は若干変動し得ることはいうまでもない。例えば、質量分析計を用いる方法による場合は、計算値±0.5%（好ましくは±0.3%、より好ましくは±0.1%）の位置に出現するピーク強度を測定することが好ましい。 Peptides K1 to K3, α1, α2, 4a and H4 of the present invention have molecular weights (calculated values) of 2079.96, 2126.01, 2208.05, 2090.90, 2806.20 and 3155.62 respectively, depending on the measurement method / measurement equipment used. Needless to say, the actual measurement values may vary slightly. For example, in the case of a method using a mass spectrometer, it is preferable to measure the peak intensity appearing at the position of the calculated value ± 0.5% (preferably ± 0.3%, more preferably ± 0.1%).
本発明の検査方法における特に好ましい測定法の１つは、飛行時間型質量分析に使用するプレートの表面に被験試料を接触させ、該プレート表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法が挙げられる。
飛行時間型質量分析計に適合可能なプレートは、検出対象である本発明のペプチドを効率よく吸着し得る表面構造を有している限り、いかなるものであってもよい。そのような表面構造としては、例えば、官能基付加ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改質シリコン、広範囲のゲル又はポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフロリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はこれらの組合せなど）によるコーティングが挙げられる。複数のモノマー又はポリマー配列を有する表面構造としては、例えば、核酸の直鎖状及び環状ポリマー、ポリサッカライド、脂質、α-、β-又はω-アミノ酸を有するペプチド、クロマトグラフィーで使用されるゲル表面の担体（陰イオン性／陽イオン性化合物、炭素鎖1〜18からなる疎水性化合物、親水性化合物（例えば、シリカ、ニトロセルロース、セルロースアセテート、アガロース等）と架橋した担体など）、人工ホモポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート等）、上記化合物のいずれかに既知の薬物又は天然化合物が結合（共有及び非共有結合）したヘテロポリマー等によるコーティングが挙げられる。
One of the particularly preferable measurement methods in the inspection method of the present invention is that a test sample is brought into contact with the surface of a plate used for time-of-flight mass spectrometry, and the mass of a component captured on the plate surface is measured using a time-of-flight mass spectrometer. The method of measuring by is mentioned.
The plate that can be adapted to the time-of-flight mass spectrometer may be any plate as long as it has a surface structure that can efficiently adsorb the peptide of the present invention to be detected. Such surface structures include, for example, functionalized glass, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO 2 , SiN 4 , modified silicon, a wide range of gels or polymers (eg (poly) tetrafluoroethylene, (poly And vinylidene difluoride, polystyrene, polycarbonate, or combinations thereof). Examples of surface structures having a plurality of monomer or polymer sequences include linear and cyclic polymers of nucleic acids, polysaccharides, lipids, peptides having α-, β- or ω-amino acids, gel surfaces used in chromatography Carriers (anionic / cationic compounds, hydrophobic compounds comprising carbon chains 1-18, hydrophilic compounds (eg, carriers cross-linked with silica, nitrocellulose, cellulose acetate, agarose, etc.), artificial homopolymers) (For example, polyurethane, polyester, polycarbonate, polyurea, polyamide, polyethyleneimine, polyarylene sulfide, polysiloxane, polyimide, polyacetate, etc.) Any known drug or natural compound is bound to any of the above compounds (covalent and non-covalent bonds). ) Coated with heteropolymer etc. Packaging and the like.
好ましい実施態様においては、質量分析用プレートとして用いられる支持体は、ポリビニリデンジフロリド（PVDF）、ニトロセルロースまたはシリカゲル、特に好ましくはPVDFで薄層コーティングされた基材［通常、質量分析用プレートにおいて使用されているものであれば、特に限定されず、例えば、絶縁体（ガラス、セラミクス、プラスチック・樹脂等）、金属（アルミニウム、ステンレス・スチール等）、導電性ポリマー、それらの複合体などが挙げられるが、好ましくはアルミニウムプレートが用いられる］である（WO 2004/031759を参照）。支持体の形状は、使用する質量分析装置の、特に試料導入口に適合するような形状に適宜考案され得るが、それらに限定されない。かかるPVDFで薄層コーティングされた質量分析用プレートとして、好ましくはプロトセラ社のブロットチップ（登録商標）などが挙げられる。 In a preferred embodiment, the support used as a plate for mass spectrometry is a substrate coated with a thin layer of polyvinylidene difluoride (PVDF), nitrocellulose or silica gel, particularly preferably PVDF [usually a plate for mass spectrometry For example, insulators (glass, ceramics, plastics, resins, etc.), metals (aluminum, stainless steel, etc.), conductive polymers, composites thereof, etc. Although an aluminum plate is preferably used, see WO 2004/031759). The shape of the support can be appropriately devised into a shape suitable for the sample analyzer, in particular, the sample introduction port, but is not limited thereto. As such a plate for mass spectrometry coated with a thin layer with PVDF, a blot chip (registered trademark) manufactured by Protocera is preferably used.
好ましくは、コーティングは、メンブレンのように予め成型された構造体を支持体上に重層するのではなく、コーティング分子が分散した状態で支持体上に堆積されて形成される薄層をいう。コーティング分子が堆積される態様は特に制限されないが、後述の質量分析用プレートの調製方法において例示される手段が好ましく用いられる。
薄層の厚さは、組織もしくは細胞に含まれる分子の転写効率および質量分析の測定感度等に好ましくない影響を与えない範囲で適宜選択することができるが、例えば、約0.001〜約100 μm、好ましくは約0.01〜約30 μmである。
Preferably, the coating refers to a thin layer formed by depositing on a support in a state where coating molecules are dispersed, instead of overlaying a pre-formed structure like a membrane on the support. The manner in which the coating molecules are deposited is not particularly limited, but means exemplified in a method for preparing a plate for mass spectrometry described later is preferably used.
The thickness of the thin layer can be appropriately selected within a range that does not adversely affect the transfer efficiency of the molecules contained in the tissue or cells and the measurement sensitivity of mass spectrometry, etc., for example, about 0.001 to about 100 μm, Preferably, it is about 0.01 to about 30 μm.
質量分析用プレート（支持体）は自体公知の方法により調製することができるが、例えば、上記の好ましい質量分析用プレートは、PVDF等のコーティング分子で支持体表面を薄層コーティングすることにより調製される。コーティングの手段としては、塗布、噴霧、蒸着、浸漬、印刷（プリント）、スパッタリングなどが好ましく例示される。
「塗布」する場合、コーティング分子を、適当な溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（dimethyl formamide；DMF）などの有機溶媒に適当な濃度（例えば、約1〜約100 mg/mL程度）で溶解したもの（コーティング分子含有溶液）を、刷毛などの適当な道具を用いて基材に塗布することができる。
「噴霧」する場合、上記と同様にして調製したコーティング分子含有溶液を噴霧器に入れ、基材上に均一にPVDFが堆積されるように噴霧すればよい。
「蒸着」する場合、通常の有機薄膜作製用真空蒸着装置を用い、基材を入れた真空槽中でコーティング分子（固体でも溶液でもよい）を加熱・気化させることにより、基材表面上に該分子の薄層を形成させることができる。
「浸漬」させる場合、上記と同様にして調製したコーティング分子含有溶液中に基材を浸漬させればよい。
「印刷（プリント）」する場合は、基材の材質に応じて通常使用され得る各種印刷技術を適宜選択して利用することができ、例えば、スクリーン印刷などが好ましく用いられる。
「スパッタリング」する場合は、例えば、真空中に不活性ガス（例、Arガス等）を導入しながら基材とコーティング分子間に直流高電圧を印加し、イオン化したガスを該分子に衝突させて、はじき飛ばされたコーティング分子を基材上に堆積させて薄層を形成させることができる。
コーティングは基材全面に施してもよいし、質量分析に供される面（画分）のみに施してもよい。
Although the plate for mass spectrometry (support) can be prepared by a method known per se, for example, the above preferred mass spectrometry plate is prepared by thinly coating the surface of the support with a coating molecule such as PVDF. The Preferred examples of the coating means include application, spraying, vapor deposition, dipping, printing (printing), and sputtering.
In the case of “application”, the coating molecule is dissolved in an appropriate solvent, for example, an organic solvent such as dimethyl formamide (DMF) at an appropriate concentration (for example, about 1 to about 100 mg / mL) ( The coating molecule-containing solution) can be applied to the substrate using a suitable tool such as a brush.
In the case of “spraying”, the coating molecule-containing solution prepared in the same manner as described above may be put in a sprayer and sprayed so that PVDF is uniformly deposited on the substrate.
In the case of “evaporation”, the coating molecule (which may be solid or solution) is heated and vaporized in a vacuum tank containing the substrate using a normal vacuum deposition apparatus for producing an organic thin film. A thin layer of molecules can be formed.
In the case of “immersing”, the substrate may be immersed in a coating molecule-containing solution prepared in the same manner as described above.
In the case of “printing”, various printing techniques that can be normally used depending on the material of the substrate can be appropriately selected and used. For example, screen printing or the like is preferably used.
In the case of “sputtering”, for example, a DC high voltage is applied between the substrate and the coating molecule while introducing an inert gas (eg, Ar gas) in a vacuum, and the ionized gas collides with the molecule. The repelled coating molecules can be deposited on the substrate to form a thin layer.
The coating may be applied to the entire surface of the substrate, or may be applied only to the surface (fraction) subjected to mass spectrometry.
コーティング分子は、コーティング手段に応じて適宜好ましい形態で使用することができ、例えば、コーティング分子含有溶液、コーティング分子含有蒸気、固体コーティング分子などの形態で基材にアプライされ得るが、コーティング分子含有溶液の形態でアプライすることが好ましい。「アプライする」とは、接触後にコーティング分子が支持体上に残留・堆積されるように支持体に接触させることをいう。アプライ量は特に制限はないが、コーティング分子量として、例えば、約10〜約100,000 μg/cm2、好ましくは約50〜約5,000 μg/cm2挙げられる。アプライ後に溶媒は自然乾燥、真空乾燥などにより除去する。 The coating molecule can be used in a suitable form depending on the coating means. For example, the coating molecule can be applied to the substrate in the form of a coating molecule-containing solution, a coating molecule-containing vapor, a solid coating molecule, etc. It is preferable to apply in the form. “Apply” refers to bringing a coating molecule into contact with the support so that the coating molecules remain and deposit on the support after contact. The amount of application is not particularly limited, and examples of the coating molecular weight include about 10 to about 100,000 μg / cm 2 , preferably about 50 to about 5,000 μg / cm 2 . After the application, the solvent is removed by natural drying, vacuum drying or the like.
質量分析用プレートにおける基材は、コーティング分子でコーティングする前に予め適当な物理的、化学的手法により、その表面を修飾（加工）しておいてもよい。具体的には、プレート表面を磨く、傷を付ける、酸処理、アルカリ処理、ガラス処理（テトラメトキシシランなど）等の手法が例示される。 The substrate of the mass spectrometric plate may be modified (processed) in advance by an appropriate physical or chemical technique before coating with the coating molecule. Specifically, techniques such as polishing the plate surface, scratching, acid treatment, alkali treatment, glass treatment (tetramethoxysilane, etc.) are exemplified.
被験試料の質量分析用プレート（支持体）への移行は、被験試料となる患者由来の生体試料を未処理のままで、あるいは抗体カラムその他の方法で高分子タンパク質を除去、濃縮した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくは等電点電気泳動に付し、泳動後ゲルをプレートと接触させて転写（ブロッティング）することにより行われる。転写装置としては公知のものを用いることができる。転写の方法自体は公知である。好ましくは電気転写が用いられる。泳動後ゲルに展開された試料は、種々の方法（拡散、電気力その他）によって質量分析用プレートに移行される。電気転写時に使用する緩衝液としては、pH 7〜9、低塩濃度のものを用いることが好ましい。具体的には、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液などが例示される。トリス緩衝液としては、トリス／グリシン／メタノール緩衝液、SDS-トリス−トリシン緩衝液など、リン酸緩衝液としては、ACN／NaCl／等張リン酸緩衝液、リン酸ナトリウム／ACNなど、ホウ酸緩衝液としては、ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液、トリス−ホウ酸塩／EDTA、ホウ酸塩／ACNなど、酢酸緩衝液としては、トリス−酢酸塩／EDTAなどが挙げられる。好ましくは、トリス／グリシン／メタノール緩衝液、ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液である。トリス／グリシン／メタノール緩衝液の組成としては、トリス10〜15 mM、グリシン70〜120 mM、メタノール7〜13%程度が例示される。ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液の組成としては、ホウ酸ナトリウム5〜20 mM程度が例示される。 Transfer of the test sample to the mass spectrometric plate (support) can be performed by leaving the patient-derived biological sample as the test sample untreated, or after removing and concentrating the high molecular weight protein using an antibody column or other method. -It is performed by subjecting to polyacrylamide gel electrophoresis or isoelectric focusing, and transferring (blotting) the gel after bringing it into contact with the plate. A known transfer device can be used. The transfer method itself is known. Preferably electrotransfer is used. The sample developed on the gel after electrophoresis is transferred to the plate for mass spectrometry by various methods (diffusion, electric force, etc.). As a buffer used for electrotransfer, it is preferable to use a buffer having a pH of 7 to 9 and a low salt concentration. Specific examples include Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, and acetate buffer. Tris / Glycine / Methanol buffer, SDS-Tris-Tricine buffer, etc. as Tris buffer, ACN / NaCl / Isotonic phosphate buffer, Sodium phosphate / ACN, Boric acid, etc. as phosphate buffer Examples of the buffer solution include sodium borate-hydrochloric acid buffer solution, tris-borate / EDTA, borate / ACN, and the like. Examples of the acetate buffer solution include tris-acetate / EDTA. Preferred are tris / glycine / methanol buffer and sodium borate-hydrochloric acid buffer. Examples of the composition of the tris / glycine / methanol buffer include Tris 10-15 mM, glycine 70-120 mM, and methanol 7-13%. Examples of the composition of the sodium borate-hydrochloric acid buffer include about 5-20 mM sodium borate.
これにより、標的分子を含めて、被験試料中に存在する分子は支持体表面上に効率よく捕捉される。プレートを乾燥させた後、後の質量分析（MALDI法による場合）に有利なように、レーザー光を吸収し、エネルギー移動を通じて分析対象物分子のイオン化を促進するためにマトリックスと呼ばれる試薬を添加することもできる。当該マトリックスとしては、質量分析において公知のものを用いることができる。例えば、シナピン酸（sinapinic acid；SPA (=3,5-dimethoxy-4-hydoroxycinammic acid)）、インドールアクリル酸（Indoleacrylic acid；IAA）、2,5-ジヒドロキシ安息香酸（2,5-dihydroxybenzoic acid；DHB）、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（α-cyano-4-hydroxycinammic acid；CHCA）等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、DHBまたはCHCAである。 Thereby, the molecules present in the test sample including the target molecules are efficiently captured on the support surface. After the plate is dried, a reagent called matrix is added to absorb the laser light and promote ionization of analyte molecules through energy transfer, which is advantageous for later mass spectrometry (when using MALDI method) You can also. As the matrix, those known in mass spectrometry can be used. For example, sinapinic acid (SPA (= 3,5-dimethoxy-4-hydoroxycinammic acid)), indoleacrylic acid (IAA), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) ), Α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), and the like, but is not limited thereto. Preferably, it is DHB or CHCA.
上記の方法により支持体表面上に捕捉された被験試料中の分子を質量分析することにより、分子量に関する情報から、標的分子である本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの存在および量を同定することができる。
質量分析装置は、ガス状の試料をイオン化した後、その分子や分子断片を電磁場に投入し、その移動状況から質量数／電荷数によって分離、物質のスペクトルを求めることにより、物質の分子量を測定・検出する装置である。試料とレーザー光を吸収するマトリックスを混合、乾燥させて結晶化し、マトリックスからのエネルギー移動によるイオン化とレーザー照射による瞬間加熱により、イオン化した分析対象物を真空中に導くマトリックス支援レーザー脱イオン化（MALDI）と、初期加速による試料分子イオンの飛行時間差で質量数を分析する飛行時間型質量分析（TOFMS）とをあわせて用いるMALDI-TOFMS法、１分析対象物を１液滴にのせて液体から直接電気的にイオン化する方法、試料溶液を電気的に大気中にスプレーして、個々の分析対象物多価イオンをunfoldの状態で気相に導くナノエレクトロスプレー質量分析（nano-ESMS）法等の原理に基づく質量分析装置を使用することができる。
質量分析用プレート上の分子を質量分析する方法自体は公知である。例えば、WO 2004/031759に記載の方法を、必要に応じて適宜改変して使用することができる。
The presence and amount of the target hypertension syndrome marker of the present invention, which is the target molecule, can be identified from the molecular weight information by mass spectrometry of the molecules in the test sample captured on the support surface by the above method. .
The mass spectrometer measures the molecular weight of a substance by ionizing a gaseous sample and then putting the molecule or molecular fragment into an electromagnetic field, separating it by mass number / charge number from its movement, and obtaining the spectrum of the substance. -It is a device to detect. Matrix-assisted laser deionization (MALDI), in which a sample and a matrix that absorbs laser light are mixed, dried and crystallized, and ionized analytes are brought into vacuum by ionization by energy transfer from the matrix and instantaneous heating by laser irradiation. And MALDI-TOFMS method, which uses time-of-flight mass spectrometry (TOFMS), which analyzes the mass number based on the time-of-flight difference of sample molecular ions by initial acceleration. Principles of ionization, nanoelectrospray mass spectrometry (nano-ESMS), etc., in which sample solutions are electrically sprayed into the atmosphere and individual analyte multivalent ions are unfolded into the gas phase A mass spectrometer based on can be used.
A method for mass spectrometry of molecules on a plate for mass spectrometry is known per se. For example, the method described in WO 2004/031759 can be appropriately modified and used as necessary.
質量分析の結果から、標的分子の分子量情報に基づいて、被験試料中の標的分子の有無およびその量が同定され得る。この工程において、質量分析装置からの情報を、任意のプログラムを用いて、健常者由来の生体試料における質量分析データと比較して、示差的な（differential）情報として出力させることも可能である。そのようなプログラムは周知であり、また、当業者は、公知の情報処理技術を用いて、容易にそのようなプログラムを構築もしくは改変することができることが理解されよう。 From the result of mass spectrometry, the presence or absence and the amount of the target molecule in the test sample can be identified based on the molecular weight information of the target molecule. In this step, it is also possible to output information from the mass spectrometer as differential information by comparing it with mass spectrometry data in a biological sample derived from a healthy person using an arbitrary program. It will be appreciated that such programs are well known and those skilled in the art can easily construct or modify such programs using known information processing techniques.
特に好ましい態様においては、質量分析用プレートとしてプロトセラ社のブロットチップを用いて、上記の各工程を実施し、MALDI型質量分析装置で本発明の妊娠高血圧症候群マーカーを定量比較(ディファレンシャル解析)する。さらに、必要に応じて、同一チップに残存する該マーカーペプチドを同定することもできる。あるいは、被験試料の定量比較(ディファレンシャル解析)までをプロトセラ社のブロットチップシステムを用いて実施し、該マーカーペプチドの同定を、高速液体クロマトグラフィーとイオンスプレイ型質量分析装置の組み合わせ装置（LC-MS/MS）で実施することも可能である。 In a particularly preferred embodiment, each of the above steps is performed using a blot chip manufactured by Protocera as a plate for mass spectrometry, and the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention is quantitatively compared (differential analysis) using a MALDI mass spectrometer. Further, if necessary, the marker peptide remaining on the same chip can be identified. Alternatively, up to quantitative comparison (differential analysis) of the test sample is performed using a blot chip system manufactured by Protocera, and the marker peptide is identified by a combination device (LC-MS) of high performance liquid chromatography and an ion spray type mass spectrometer. / MS).
本発明の検査方法における本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの測定は、それに対する抗体を用いて行うこともできる。かかる方法は、最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、上記質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に該ペプチドを検出することができる点で、特に有用である。 The measurement of the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention in the test method of the present invention can also be performed using an antibody against it. In such a method, if an optimized immunoassay system is constructed and a kit is made, the peptide can be detected with high sensitivity and high accuracy without using a special device such as the mass spectrometer. It is particularly useful in that it can.
本発明の妊娠高血圧症候群マーカーに対する抗体は、例えば、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーを、これを発現する患者由来の生体試料から単離・精製し、該マーカーペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、得られるペプチド量が少量である場合等は、該マーカーペプチドをペプチダーゼ等によって部分消化し、得られる断片のアミノ酸配列をエドマン法などにより決定し、その配列を基に該ペプチドをコードする核酸とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを合成、これをプローブとして該患者由来のcDNAラリブラリーを鋳型にハイブリダイゼーション法により該ペプチドを含むタンパク質をコードするcDNAを得るか、あるいは該オリゴヌクレオチドをプライマーとして該患者由来のRNAを鋳型にしてRT-PCRを行うことにより、該ペプチドをコードするcDNA断片を得て、該cDNA断片を適当な発現ベクターに組み込んで適当な宿主細胞に導入し、得られる形質転換体を培養して組換えペプチドを採取することによって、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーを大量に調製することができる。あるいは上記のようにして得られるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて本発明の妊娠高血圧症候群マーカーを取得することもできる。さらに有機合成法により大量に調製することも可能である。 The antibody against the gestational hypertension syndrome marker of the present invention is obtained, for example, by isolating and purifying the gestational hypertension syndrome marker of the present invention from a biological sample derived from a patient expressing the marker, and immunizing an animal using the marker peptide as an antigen. Can be prepared. Alternatively, when the amount of the peptide obtained is small, the marker peptide is partially digested with a peptidase or the like, the amino acid sequence of the obtained fragment is determined by the Edman method or the like, and a nucleic acid encoding the peptide based on the sequence A cDNA encoding a protein containing the peptide is obtained by a hybridization method using a cDNA library derived from the patient as a template using this as a probe, or derived from the patient using the oligonucleotide as a primer. RT-PCR is performed using the RNA of the above as a template to obtain a cDNA fragment encoding the peptide, the cDNA fragment is incorporated into an appropriate expression vector, introduced into an appropriate host cell, and the resulting transformant is obtained. By culturing the recombinant peptide, the pregnancy-induced hypertension symptoms of the present invention Group markers can be prepared in large quantities. Alternatively, the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention can be obtained using the cell-free transcription / translation system using the cDNA obtained as described above as a template. Furthermore, it can be prepared in large quantities by organic synthesis methods.
上述のように、本発明のペプチドK1〜K3、α1、α2、4aおよびH4は、それぞれ配列番号１〜７に示される各アミノ酸配列からなるペプチドである。従って、本発明のペプチドK1〜K3、α1、α2、4aもしくはH4に対する抗体は、例えば、該アミノ酸配列の全部もしくは一部を、上記アミノ酸配列情報に基づき、公知のペプチド合成法を用いて合成するか、あるいは常法により単離したKininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aまたはITIH4タンパク質を適当なペプチダーゼ等で切断して、本発明のペプチドK1〜K3、α1、α2、4aもしくはH4の配列の全部もしくは一部を含むペプチド断片を取得し、これを免疫原として調製することが望ましい。 As described above, the peptides K1 to K3, α1, α2, 4a, and H4 of the present invention are peptides consisting of amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 7, respectively. Therefore, the antibody against peptides K1 to K3, α1, α2, 4a or H4 of the present invention is synthesized, for example, by using a known peptide synthesis method based on the above amino acid sequence information, for example, all or part of the amino acid sequence. Alternatively, the Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a or ITIH4 protein isolated by a conventional method is cleaved with an appropriate peptidase or the like, and the entire sequence of the peptides K1 to K3, α1, α2, 4a or H4 of the present invention Alternatively, it is desirable to obtain a peptide fragment containing a part and prepare it as an immunogen.
本発明の妊娠高血圧症候群マーカーに対する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する場合がある）は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、minibody等が挙げられる。 The antibody against the gestational hypertension syndrome marker of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “the antibody of the present invention”) may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a known immunological technique. it can. The antibody includes not only a complete antibody molecule but also a fragment thereof, and examples thereof include Fab, F (ab ′) 2, ScFv, and minibody.
例えば、ポリクローナル抗体は、上記のいずれかの方法または他の方法によって調製された本発明の妊娠高血圧症候群マーカーもしくはその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアータンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバントとともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約3〜約10日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。 For example, the polyclonal antibody may be a carrier such as bovine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin, if necessary) prepared by any of the above methods or other methods. (It can also be a protein-crosslinked complex) and is administered together with a commercially available adjuvant, either subcutaneously or intraperitoneally in animals, 2 to 4 times every 2 to 3 weeks. It is measured by a known antigen-antibody reaction and its rise is confirmed), and can be obtained by collecting whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum. Examples of animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作成することができる。例えば、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーもしくはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、リンパ球を採取する。このリンパ球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該マーカーペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はPEG法［J. Immunol. Methods, 81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。 Monoclonal antibodies can be obtained by cell fusion methods (for example, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal Antibodies and Cancer: Basic and Clinical”, 2-14). Page, Science Forum Publishing, 1985). For example, the gestational hypertension syndrome marker of the present invention or a partial peptide thereof is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and the spleen or lymph node is collected about 3 days after the final administration, and lymphocytes are collected. Collect. The lymphocytes and myeloma cells (for example, NS-1, P3X63Ag8, etc.) are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the marker peptide. Cell fusion may be PEG method [J. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (1985)] or voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)]. A hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a known EIA or RIA method or the like. The culture of the hybridoma producing the monoclonal antibody can be performed in vitro or in vivo such as mouse or rat, or preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively. .
Kininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aおよびITIH4のフラグメントとしては、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーであるペプチド以外のものも、被験試料中に存在する可能性がある。これらのペプチド群は妊娠高血圧症候群で有意な変動は認められないが、他の疾患においてこれらのいずれかが顕著に高値または低値を示す可能性がある。例えば、本発明のペプチドK1に対する抗体が、１以上のKininogen-1の他のフラグメントと交差反応性を有する場合、他の疾患を妊娠高血圧症候群と誤診する（偽陽性）可能性が高くなる。従って、本発明の検査方法に用いられる、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーに対する抗体は、該マーカーペプチド以外のKininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4aまたはITIH4のフラグメントとは交差反応しない、特異性の高い抗体であることが望ましい。そのような抗体は、上記のようにして得られた複数のモノクローナル抗体を当該他のフラグメントと反応させ、それらと交差反応しない抗体を選択することにより得ることができる。 As a fragment of Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a and ITIH4, there may be a peptide other than the peptide which is a gestational hypertension syndrome marker of the present invention. These peptide groups do not show significant variation in gestational hypertension syndrome, but any of these may be significantly higher or lower in other diseases. For example, if the antibody against peptide K1 of the present invention has cross-reactivity with one or more other fragments of Kininogen-1, the possibility of misdiagnosing other diseases as pregnancy hypertension syndrome (false positive) is increased. Therefore, the antibody against the pregnancy hypertension syndrome marker of the present invention used in the test method of the present invention does not cross-react with Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a or ITIH4 fragments other than the marker peptide, and has high specificity. Desirably an antibody. Such an antibody can be obtained by reacting a plurality of monoclonal antibodies obtained as described above with the other fragments and selecting an antibody that does not cross-react with them.
本発明の抗体を用いる本発明の検査方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。 The test method of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in the test sample is determined by chemical or physical means. Any measurement method may be used as long as it is a measurement method that is detected and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used.
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。 As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. The enzyme is preferably stable and has a large specific activity. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for binding of an antibody or antigen and a labeling agent.
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。 For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被験試料を反応させ（1次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（2次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、被験試料中の本発明の妊娠高血圧症候群マーカー量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 In the sandwich method, a test sample is reacted with an insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), and another labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), followed by a labeling agent on an insolubilized carrier. By measuring the amount (activity), the amount of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention in the test sample can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, or may be performed simultaneously or at different times.
本発明の妊娠高血圧症候群マーカーに対するモノクローナル抗体を、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることもできる。
競合法では、被験試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原（B）とを分離し（B/F分離）、B，Fいずれかの標識量を測定し、被験試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被験試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被験試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被験試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被験試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
The monoclonal antibody against the gestational hypertension syndrome marker of the present invention can also be used in measurement systems other than the sandwich method, for example, competitive method, immunometric method, nephrometry, and the like.
In the competition method, the antigen in the test sample and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated ( B / F separation), measure the amount of labeled B or F, and quantify the amount of antigen in the test sample. In this reaction method, a soluble antibody is used as an antibody, a B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid-phased antibody is used as the first antibody, or The first antibody is soluble, and the second antibody is a solid phase method using a solid phase antibody.
In the immunometric method, the antigen of the test sample and the immobilized antigen are competitively reacted with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen and excess in the test sample are separated. Then, the solid phase antigen is added, and then the solid phase antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase. Next, the amount of label in any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test sample.
In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test sample is small and only a small amount of precipitate is obtained.
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
In applying these individual immunological measurement methods to the quantification method of the present invention, special conditions, operations and the like are not required to be set. What is necessary is just to construct | assemble the measurement system of the pregnancy high blood pressure syndrome marker of this invention, adding the usual technical consideration of those skilled in the art to the usual conditions and operation method in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like.
For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Continue Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Medical School, published in 1982), "Enzyme Immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (3rd edition) (Medical School, Showa) 62), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibid. Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibid. Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibid. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) )) (Above, published by Academic Press) It is possible to irradiation.
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の検査方法として、該抗体を上記したような質量分析計に適合し得るプローブの表面上に固定化し、該プローブ上の該抗体に被検試料を接触させ、該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、該抗体が認識するマーカーペプチドの分子量に相当するピークを検出する方法が挙げられる。 Alternatively, as another test method of the present invention using the antibody of the present invention, the antibody is immobilized on the surface of a probe that can be adapted to a mass spectrometer as described above, and a test sample is applied to the antibody on the probe. Examples include a method of detecting a peak corresponding to the molecular weight of a marker peptide recognized by the antibody by subjecting the biological sample component captured by the antibody to mass spectrometry.
上記のいずれかの方法により測定された被験者由来の試料中の本発明の妊娠高血圧症候群マーカーのレベルが、正常妊婦由来の対照試料中の該マーカーペプチドレベルに比べて有意に変動している場合、該被験者は妊娠高血圧症候群に罹患している可能性が高いと診断することができる。 When the level of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention in the sample derived from the subject measured by any of the above methods is significantly varied compared to the marker peptide level in the control sample derived from a normal pregnant woman, The subject can be diagnosed as having a high probability of suffering from gestational hypertension syndrome.
より具体的には、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーがKininogen-1もしくはITIH4の分解産物である場合、試料中の該マーカーのレベルが、正常妊婦由来の対照試料中の該マーカーレベルに比べて有意に減少している場合、該被験者は妊娠高血圧症候群に罹患している可能性が高いと診断することができる。 More specifically, when the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention is a degradation product of Kininogen-1 or ITIH4, the level of the marker in the sample is significant compared to the marker level in a control sample derived from a normal pregnant woman. If it is decreased, the subject can be diagnosed as having a high possibility of suffering from pregnancy-induced hypertension syndrome.
本発明の妊娠高血圧症候群マーカーがフィブリノーゲンα鎖もしくはC4aの分解産物の場合、試料中の該マーカーのレベルが、正常妊婦由来の対照試料中の該マーカーレベルに比べて有意に上昇している場合、該被験者は妊娠高血圧症候群に罹患している可能性が高いと診断することができる。 When the pregnancy hypertension syndrome marker of the present invention is a fibrinogen α chain or a degradation product of C4a, the level of the marker in the sample is significantly increased compared to the marker level in a control sample derived from a normal pregnant woman, The subject can be diagnosed as having a high probability of suffering from gestational hypertension syndrome.
本発明の検査方法は、患者から時系列で生体試料を採取し、各試料における本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの発現の経時変化を調べることにより行うことが好ましい。生体試料の採取間隔は特に限定されないが、患者のQOLを損なわない範囲でできるだけ頻繁にサンプリングすることが望ましく、例えば、血漿もしくは血清を試料として用いる場合、約１分〜約12時間の間隔で採血を行うことが好ましい。本発明の妊娠高血圧症候群マーカーのうち、Kininogen-1およびITIH4の分解産物（例、ペプチドK1〜K3、ペプチドH4）は、妊娠高血圧症候群の病態が進行するに従って血清・血漿レベルが減少する傾向にある。従って、これらのマーカーのレベルが経時的に増加した場合には、該患者における妊娠高血圧症候群の病態が改善されている可能性が高いと判定することができる。一方、フィブリノーゲンα鎖およびC4aの分解産物（例、ペプチドα1、α2、ペプチド4a）は、妊娠高血圧症候群の病態が進行するに従って血清・血漿レベルが上昇する傾向にある。従って、これらのマーカーのレベルが経時的に減少した場合には、該患者における妊娠高血圧症候群の病態が改善されている可能性が高いと判定することができる。 The test method of the present invention is preferably carried out by collecting biological samples from patients in time series and examining the change over time in the expression of the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention in each sample. The collection interval of the biological sample is not particularly limited, but it is desirable to sample as frequently as possible within a range that does not impair the patient's QOL. For example, when plasma or serum is used as a sample, blood is collected at intervals of about 1 minute to about 12 hours. It is preferable to carry out. Among the gestational hypertension syndrome markers of the present invention, degradation products of Kininogen-1 and ITIH4 (eg, peptides K1 to K3, peptide H4) tend to decrease in serum and plasma levels as the pathology of gestational hypertension syndrome progresses . Therefore, when the level of these markers increases with time, it can be determined that there is a high possibility that the pathology of pregnancy-induced hypertension syndrome in the patient is improved. On the other hand, fibrinogen α chain and degradation products of C4a (eg, peptides α1, α2, peptide 4a) tend to increase in serum and plasma levels as the state of pregnancy hypertension syndrome progresses. Therefore, when the level of these markers decreases with time, it can be determined that there is a high possibility that the pathology of pregnancy-induced hypertension syndrome in the patient is improved.
さらに、上記時系列的なサンプリングによる妊娠高血圧症候群の検査方法は、前回サンプリングと当回サンプリングとの間に、被験者である患者に対して該疾患の治療措置が講じられた場合に、当該措置による治療効果を評価するのに用いることができる。即ち、治療の前後にサンプリングした試料について、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められると判定された場合に、当該治療の効果があったと評価することができる。一方、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められない、あるいはさらに悪化していると判定された場合には、当該治療の効果がなかったと評価することができる。 Furthermore, the method of testing for gestational hypertension syndrome by the above-mentioned time-series sampling is based on the above measures when the patient is treated for the disease between the previous sampling and the current sampling. It can be used to evaluate the therapeutic effect. That is, for a sample sampled before and after treatment, when it is determined that the condition after treatment is improved compared to the condition before treatment, it can be evaluated that the treatment is effective. On the other hand, when it is determined that the condition after treatment is not improved or further deteriorated as compared with the condition before treatment, it can be evaluated that the treatment has no effect.
さらに本発明の妊娠高血圧症候群マーカーは、診断以外に積極的な妊娠高血圧症候群の創薬ターゲットを提供することもできる。即ち、該マーカーペプチドそれ自体が該疾患の治療（寛解）方向に生理機能を持つ（「治療ペプチド」という）場合、該ペプチドの量もしくは活性を増大させる物質を患者に投与することにより、また、該マーカーペプチドそれ自体が該疾患の増悪方向に生理機能を持つ場合（「増悪ペプチド」という）、該ペプチドの量もしくは活性を低減させる物質を投与することにより、それぞれ該疾患を治療することができる。 Furthermore, the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention can also provide an active drug discovery target for pregnancy-induced hypertension syndrome in addition to diagnosis. That is, when the marker peptide itself has a physiological function in the direction of treatment (remission) of the disease (referred to as “therapeutic peptide”), by administering to the patient a substance that increases the amount or activity of the peptide, When the marker peptide itself has a physiological function in the direction of exacerbation of the disease (referred to as “exacerbation peptide”), the disease can be treated by administering a substance that reduces the amount or activity of the peptide, respectively. .
本発明はまた、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーが治療ペプチドとして作用する場合に、該ペプチドの量もしくは活性を増大させる、および／または、本発明の妊娠高血圧症候群マーカーが増悪ペプチドとして作用する場合に、該ペプチドの量もしくは活性を低減させることによる、妊娠高血圧症候群の治療方法を提供する。該治療方法は、具体的には、治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を増大させる物質および／または増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を低減させる物質の有効量を、妊娠高血圧症候群患者に投与することを含む。従って、本発明はまた、治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を増大させる物質および／または増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を低減させる物質を含有してなる、妊娠高血圧症候群治療剤を提供する。
具体的には、治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの活性を増大させる物質としては、該ペプチド自体あるいはそれと同様のアゴニスト作用を有する分子が挙げられる。あるいは、治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの活性を増大させる物質として、該ペプチドの非中和抗体、好ましくはアゴニスト抗体なども挙げることができる。一方、増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの活性を低減させる物質としては、該ペプチドのアンタゴニスト作用を有する分子、あるいは該ペプチドに対する中和抗体などが挙げられる。
また、治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの産生を増大させる物質としては、生体内に存在する親タンパク質（Kininogen-1、フィブリノーゲンα鎖、C4a、ITIH4）から該ペプチドを遊離する分解酵素、該ペプチドのＮ末側および／またはＣ末側に該分解酵素により認識・切断されるアミノ酸配列をさらに含む、該分解酵素の基質もしくは基質アナログ分子、該分解酵素の産生を促進する分子(類似化合物を含む)、該分解酵素の活性を促進する分子、該分解酵素のインヒビターの産生を抑制する分子などが挙げられる。該ペプチドのＮ末側および／またはＣ末側のアミノ酸配列から、該ペプチドを遊離させる分解酵素の存在が示唆され、該ペプチドのＮ末側および／またはＣ末側のアミノ酸配列をプローブにした分解酵素探索と同定が可能となる。こうして同定された分解酵素の基質もしくは基質アナログ分子、即ち、該ペプチドのＮ末側および／またはＣ末側に該分解酵素により認識・切断されるアミノ酸配列をさらに含むペプチド分子は、妊娠高血圧症候群患者の体内で該分解酵素により切断されて治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーもしくはそのアナログ分子を遊離するので、同様の治療効果を奏することができる。一方、同定された分解酵素の産生および／または活性を促進する物質も、間接的に治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの産生を増大させることができる。これらの物質は、標的の分解酵素が同定されれば、自体公知の手法によりスクリーニングし、あるいは分子設計することができる。
一方、増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの産生を低減させる物質としては、生体内に存在するタンパク質から該ペプチドを遊離する分解酵素の産生を抑制する分子、該分解酵素のインヒビター、該インヒビターの産生を促進する分子などが挙げられる。増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーを遊離する分解酵素は、上記治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーと同様の手法により探索・同定することができる。こうして同定された分解酵素を用いて、自体公知の手法により、該分解酵素の産生もしくは活性を直接または間接的に抑制（阻害）する物質をスクリーニングし、あるいは分子設計することができる。
The present invention also increases the amount or activity of the peptide when the gestational hypertension syndrome marker of the present invention acts as a therapeutic peptide and / or when the gestational hypertension syndrome marker of the present invention acts as an exacerbation peptide. The present invention provides a method for treating gestational hypertension syndrome by reducing the amount or activity of the peptide. The therapeutic method specifically reduces the amount or activity of a substance that increases the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as a therapeutic peptide and / or the marker of gestational hypertension syndrome of the present invention as an exacerbation peptide. Including administering an effective amount of the substance to a patient with gestational hypertension syndrome. Accordingly, the present invention also includes a substance that increases the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as a therapeutic peptide and / or a substance that decreases the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as an exacerbation peptide. And a therapeutic agent for pregnancy-induced hypertension syndrome.
Specifically, examples of the substance that increases the activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as a therapeutic peptide include the peptide itself or a molecule having the same agonistic action. Alternatively, as a substance that increases the activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as a therapeutic peptide, a non-neutralizing antibody, preferably an agonistic antibody, etc. of the peptide can also be mentioned. On the other hand, examples of the substance that decreases the activity of the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention as an exacerbation peptide include molecules having an antagonistic action of the peptide, neutralizing antibodies against the peptide, and the like.
In addition, as a substance that increases the production of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as a therapeutic peptide, a degrading enzyme that releases the peptide from a parent protein (Kininogen-1, fibrinogen α chain, C4a, ITIH4) existing in the living body A substrate or substrate analog molecule of the decomposing enzyme, a molecule that promotes production of the decomposing enzyme (similar) Compounds), molecules that promote the activity of the degrading enzyme, molecules that suppress the production of inhibitors of the degrading enzyme, and the like. The presence of a degrading enzyme that liberates the peptide is suggested from the amino acid sequence at the N-terminal side and / or C-terminal side of the peptide, and degradation using the amino acid sequence at the N-terminal side and / or C-terminal side of the peptide as a probe Enzyme search and identification becomes possible. A substrate or substrate analog molecule of a decomposing enzyme thus identified, that is, a peptide molecule further comprising an amino acid sequence recognized and cleaved by the decomposing enzyme on the N-terminal side and / or C-terminal side of the peptide Is released by the degrading enzyme in the body to release the gestational hypertension syndrome marker of the present invention or its analog molecule as a therapeutic peptide, so that the same therapeutic effect can be obtained. On the other hand, substances that promote the production and / or activity of the identified degrading enzymes can also indirectly increase the production of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as a therapeutic peptide. If the target degrading enzyme is identified, these substances can be screened or molecularly designed by a method known per se.
On the other hand, as a substance that reduces the production of the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention as an exacerbation peptide, a molecule that suppresses the production of a degrading enzyme that liberates the peptide from a protein present in vivo, an inhibitor of the decomposing enzyme, Examples include molecules that promote the production of inhibitors. The degrading enzyme that releases the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention as an exacerbation peptide can be searched and identified by the same method as the pregnancy-induced hypertension syndrome marker of the present invention as the therapeutic peptide. By using a degrading enzyme thus identified, a substance that suppresses (inhibits) the production or activity of the degrading enzyme directly or indirectly can be screened or molecularly designed by a method known per se.
治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を増大させる物質および増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を低減させる物質は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
Substances that increase the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as therapeutic peptides and substances that decrease the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as exacerbation peptides can be formulated according to conventional means. .
For example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like. Such a composition is produced by a method known per se, and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
As a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, intraarticular injections. Includes dosage forms such as agents. Such an injection is prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above compound or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule. A suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-mentioned compound or a salt thereof with an ordinary suppository base.
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を増大させる物質または増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を低減させる物質との配合により、好ましくない相互作用を生じない限り、他の活性成分を含有してもよい。
The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of dosage forms of such dosage units include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for injections, for each dosage unit dosage form. Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above compound.
Each of the compositions described above is a substance that increases the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as the therapeutic peptide or a substance that decreases the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as an exacerbation peptide. Other active ingredients may be included as long as undesirable interactions are not caused by the blending.
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトに対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
治療ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を増大させる物質および増悪ペプチドとしての本発明の妊娠高血圧症候群マーカーの量もしくは活性を低減させる物質の投与量は、その作用、投与ルート、患者の重篤度、年齢、体重、薬物受容性などにより差異はあるが、例えば、成人１日あたり活性成分量として約０．０００８〜約２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００８〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを1回もしくは数回に分けて投与することができる。
Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered, for example, orally or parenterally to humans.
The substance that increases the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as a therapeutic peptide and the dose of the substance that decreases the amount or activity of the gestational hypertension syndrome marker of the present invention as an exacerbation peptide are the action, administration route, There are differences depending on the severity, age, weight, drug acceptability, etc. of the patient. For example, the amount of active ingredient per day for an adult is about 0.0008 to about 25 mg / kg, preferably about 0.008 to about 2 mg / kg. It is in the range of kg and can be administered once or divided into several times.
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.
（１）検体
順天堂大学環境医学研究所でサンプリングした妊娠高血圧症候群患者の血清11例および正常妊婦の血清13例（表１）1.5μLを電気泳動用サンプル処理液（NuPAGE（登録商標）LDS Sample Buffer 4x ;Invitrogen）4.5μLと混合し、70℃で10分間、加熱処理した後、4-12％グラジェントポリアクリルアミドゲル（Invitorigen）にアプライし電気泳動を行った。
(1) Sample 11 samples of gestational hypertension syndrome patients and 13 samples of normal pregnant women sampled at Juntendo University Institute of Environmental Medicine (Table 1) 1.5 μL of sample treatment solution for electrophoresis (NuPAGE (registered trademark) LDS Sample Buffer) 4x; Invitrogen) 4.5 μL, heat-treated at 70 ° C. for 10 minutes, applied to a 4-12% gradient polyacrylamide gel (Invitorigen) and electrophoresed.
（２）BLOTCHIP（登録商標）による質量分析およびディファレンシャルプロファイリング解析
電気泳動終了後、ゲルを切り出しBLOTCHIP（登録商標）（Protosera, Inc.）に積層し、電気転写用バッファー（BLOTBufferTM;Protosera, Inc.）中で90mA、120分間転写した。転写終了後、チップの表面を超純水でリンスし、チップ全体にマトリックス（α-Cyano-4-hydroxy cinamic acid）を塗布後、matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometer (Bruker Daltnics社製UltraFlexII)で質量分析を行った。測定パラメータは、Detector voltage 1685V, Supression1000, Laser Intensity は28〜35のFuzzyモードで、１チップあたり415点、１点あたり500回のレーザー照射で、総計207,500回レーザー照射を行った。得られたスペクトル中の各ピーク強度をM/z毎に積算し、１個の積算スペクトルに変換した。積算スペクトルをClinProTools (Bruker Daltonik GmbH) を用いて、妊娠高血圧症候群患者血清と正常妊婦血清の間でディファレンシャルプロファイリング解析を行った。解析手法は以下の通りである。
（ａ）CrinPro Tools 2.2(Bruker)による解析
解析ソフトClinPro Tools 2.2を使用し、2群間で比較を行い、有意差のあったピークを抽出した。解析については複数の条件で実施し、ClinPro Tools 2.2の平均積算スペクトルは、群内の積算スペクトルをノーマライゼーション（標準化）した。
（ｂ）Peak-Analysis（Protosera）による解析
解析ソフトPeak-Analysisを使用し、2群間で比較を行い、有意差のあったピークを抽出した。Peak-Analysisの平均積算スペクトルは群内の積算スペクトルそのものの平均値を表示した。
（ｃ）Data mining Tool（Protosera）による解析
解析ソフトData mining Toolを使用し、感度・特異度検定を行い閾値(70）以上の感度または特異度を有するピークを抽出した。Data mining Toolの平均積算スペクトルは、群内の積算スペクトルをノーマライゼーションした。
以上のディファレンシャルプロファイリング解析の結果、有意差を有したピークをピックアップし、バイオマーカー候補（ターゲットペプチド）群とした。結果を図１〜７に示す。
(2) Mass spectrometry and differential profiling analysis by BLOTCHIP (registered trademark) After electrophoresis, the gel was cut out and laminated on BLOTCHIP (registered trademark) (Protosera, Inc.), and the buffer for electrotransfer (BLOTBuffer ™ ; Protosera, Inc.) ) Was transferred at 90 mA for 120 minutes. After transfer, rinse the surface of the chip with ultrapure water, apply matrix (α-Cyano-4-hydroxy cinamic acid) to the entire chip, and then apply matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) Mass spectrometry was performed with a mass spectrometer (UltraFlexII manufactured by Bruker Daltnics). The measurement parameters were Detector voltage 1685V,
(A) Analysis by CrinPro Tools 2.2 (Bruker) Using analysis software ClinPro Tools 2.2, comparison was made between the two groups, and peaks with significant differences were extracted. The analysis was performed under multiple conditions, and the average integrated spectrum of ClinPro Tools 2.2 was normalized (standardized) within the group.
(B) Analysis by Peak-Analysis (Protosera) Using the analysis software Peak-Analysis, comparison was made between the two groups, and peaks with significant differences were extracted. The average integrated spectrum of Peak-Analysis displayed the average value of the integrated spectrum within the group.
(C) Analysis by Data mining Tool (Protosera) Using analysis software Data mining Tool, a sensitivity / specificity test was performed, and a peak having sensitivity or specificity equal to or higher than the threshold (70) was extracted. The average integrated spectrum of the Data mining Tool was normalized to the integrated spectrum within the group.
As a result of the differential profiling analysis described above, peaks having significant differences were picked up and used as biomarker candidate (target peptide) groups. The results are shown in FIGS.
（３）逆相クロマトグラフィー分画
検体血清200μLに最終濃度が10%になるようにトリフルオロ酢酸を加え、氷上で30分インキュベーションし、遠心してタンパク質を沈殿させた。上清を回収し、Sep-Pak Plus C18 Cartrigeで固相抽出を行い、脱脂、脱塩した。このサンプルを逆相クロマトグラフィーでグラジエントをかけて73フラクションに分画し、遠心濃縮機で10μL以下になるまで濃縮した。
(3) Reversed-phase chromatography fraction Trifluoroacetic acid was added to 200 μL of the sample serum to a final concentration of 10%, incubated on ice for 30 minutes, and centrifuged to precipitate the protein. The supernatant was collected and subjected to solid phase extraction with Sep-Pak Plus C18 Cartrige to degrease and desalinate. This sample was subjected to a gradient using reverse phase chromatography and fractionated into 73 fractions, and concentrated to 10 μL or less with a centrifugal concentrator.
（４）MS/MS測定と同定
上記（３）で得た各フラクションをマトリックスと混合してground steelターゲットプレートにスポットし、MALDI-TOF型質量分析計UltraflexIIのLinearモードで測定して、ターゲットペプチドの有無とm/zを確認した。ターゲットペプチドのあったフラクションのスポットに対し、MALDI-TOF型質量分析計UltraflexIIのReflectorモードでモノアイソトピック質量[M+H]+を測定した。得られたモノアイソトピック質量[M+H]+をParent Massに指定して、Liftモード(PSD)でMS/MS測定を行った。測定結果をMASCOT Serverで検索し、ペプチドを同定した。結果を表２に示す。
(4) MS / MS measurement and identification Each fraction obtained in (3) above is mixed with a matrix, spotted on a ground steel target plate, measured in the Linear mode of the MALDI-TOF mass spectrometer Ultraflex II, and the target peptide The presence / absence and m / z were confirmed. Monoisotopic mass [M + H] + was measured in the Reflector mode of the MALDI-TOF mass spectrometer Ultraflex II with respect to the fraction spot where the target peptide was present. The obtained monoisotopic mass [M + H] + was designated as Parent Mass, and MS / MS measurement was performed in Lift mode (PSD). The measurement results were searched with MASCOT Server to identify peptides. The results are shown in Table 2.
Kininogen-1の３つのフラグメントおよびITIH4の１つのフラグメントが、妊娠高血圧症候群で減少するペプチドとして、また、フィブリノーゲンα鎖の２つのフラグメントおよびC4aの１つのフラグメントが、妊娠高血圧症候群で増加するペプチドとして同定された。 Three fragments of Kininogen-1 and one fragment of ITIH4 identified as peptides that decrease in pregnancy hypertension syndrome, and two fragments of fibrinogen alpha chain and one fragment of C4a identified as peptides that increase in pregnancy hypertension syndrome It was done.
本発明の新規な妊娠高血圧症候群診断マーカーを利用した臨床検査方法は、妊娠高血圧症候群を迅速且つ的確に判断できるので、該疾患の早期発見、早期治療が可能となる点で有用である。 The clinical test method using the novel diagnostic marker for gestational hypertension syndrome of the present invention is useful in that the gestational hypertension syndrome can be determined quickly and accurately, so that early detection and early treatment of the disease are possible.
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