JP2011079795A - Mixed gel of collagen types i and iv - Google Patents
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Abstract
Description
ＩＶ型コラーゲンによる基底膜の生理機能を再現でき、かつゲル強度に優れるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル、および前記混成ゲルの調製方法、ならびに前記混成ゲルをコーティングしてなる細胞培養プレートなどに関する。 The present invention relates to a type I-IV type collagen hybrid gel capable of reproducing the physiological function of the basement membrane by type IV collagen and excellent in gel strength, a method for preparing the hybrid gel, a cell culture plate coated with the hybrid gel, and the like.
動物の身体は、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織と呼ばれる４種類の組織型を組み合わせて構成され、上皮組織や筋組織が主に細胞で構成されるのに対し、結合組織の主体はコラーゲン線維を主成分とする間質と呼ばれる細胞外マトリックスである。また、前記上皮組織と結合組織との間には基底膜と呼ばれるシート状の細胞外マトリックスが存在し、前記筋組織を構成する細胞も基底膜で周囲を覆われ、血管もその内皮細胞は基底膜で裏打ちされている。更に、神経細胞も、例えば末梢神経の軸索を包むシュワン細胞も基底膜を足場とするなど、多細胞生物を構成する細胞の多くは、基底膜をその足場としている。細胞外マトリックスは、細胞の増殖や生存に必要であり、例えば、動物細胞は培養皿に接着し、足場を形成できないと増殖できないばかりかアポトーシスを起こして自滅する。この現象は、細胞増殖の足場依存性（anchorage dependence of cell growth）と呼ばれ、悪性のがん細胞や血球細胞などを除き、多細胞動物を構成する殆ど全ての細胞で観察される現象である。 The body of an animal is composed of four types of tissue types called epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, and nerve tissue. The epithelial tissue and muscle tissue are mainly composed of cells. Is an extracellular matrix called interstitium composed mainly of collagen fibers. In addition, a sheet-like extracellular matrix called basement membrane exists between the epithelial tissue and connective tissue, and the cells constituting the muscle tissue are covered with the basement membrane, and the blood vessels and the endothelial cells are basal. Backed with a membrane. Furthermore, many cells constituting multicellular organisms use the basement membrane as a scaffold, such as nerve cells, for example, Schwann cells that wrap around peripheral nerve axons. The extracellular matrix is necessary for cell growth and survival. For example, animal cells adhere to a culture dish, and if they cannot form a scaffold, they not only proliferate but also undergo apoptosis and self-destruct. This phenomenon is called “anchorage dependence of cell growth” and is observed in almost all cells constituting multicellular animals except malignant cancer cells and blood cells. .
このような細胞培養の際に足場となる基底膜は、厚さ１００ｎｍほどの極めて薄いシート状の細胞外マトリックスであり、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ニドゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどからなり、これらが複合的に結合して３次元構造を構成している。例えば、前記ＩＶ型コラーゲンは、基底膜の形態維持を担う主要な構成成分であり、Ｎ末端領域でジスルフィド結合により架橋された四量体を形成する一方で、Ｃ末端の球状領域でend-to-end型に会合し、このＮ末端領域とＣ末端領域の会合を通じて２次元網目構造を構築している。また、ラミニンは、α、β、γと呼ばれる三つのサブユニット鎖が会合したヘテロ三量体分子であり、十字形の形をした基底膜成分である。α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３の全部で１１種類のサブユニットが存在する。これらサブユニットの組み合わせにより現時点では１５種類のラミニンが知られており、その名称はサブユニット鎖の構成で呼ばれている。３本のサブユニット鎖は共通のコイルドコイルドメインを持ち、この領域で会合してヘテロ三量体を形成する。一方、各サブユニットのＮ末端領域は互いに親和性を有し、この領域で会合することで基底膜に自己組織化される。なお、基底面で自己会合したラミニンは、ニドゲンを介してＩＶ型コラーゲンと結合し、ＩＶ型コラーゲンが独立に自己会合して作る網目構造で裏打ちされることで物理的な強度を獲得している。更に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンが加わり、基底膜分子間の相互作用とジスルフィド結合や非ジスルフィド結合による分子間架橋により、その構造が安定化される。 The basement membrane that serves as a scaffold in such cell culture is an extremely thin sheet-like extracellular matrix having a thickness of about 100 nm, which is composed of type IV collagen, laminin, nidogen, heparan sulfate proteoglycan, and the like. To form a three-dimensional structure. For example, the type IV collagen is a main component responsible for maintaining the morphology of the basement membrane, and forms a tetramer crosslinked by a disulfide bond in the N-terminal region, while end-to-end in the C-terminal globular region. A two-dimensional network structure is constructed through association of the N-terminal region and the C-terminal region. Laminin is a heterotrimeric molecule in which three subunit chains called α, β, and γ are associated, and is a cruciform basement membrane component. The α chain has α1-5, the β chain has β1-3, and the γchain has 11 types of subunits, γ1-3. At present, 15 types of laminin are known by the combination of these subunits, and their names are called by the structure of the subunit chain. The three subunit chains have a common coiled-coil domain and associate in this region to form a heterotrimer. On the other hand, the N-terminal region of each subunit has an affinity for each other, and self-organizes in the basement membrane by associating in this region. In addition, laminin that self-associates on the basal plane binds to type IV collagen via nidogen, and has acquired physical strength by being lined with a network structure formed by type IV collagen self-associating independently. . Furthermore, heparan sulfate proteoglycan is added, and the structure is stabilized by interaction between basement membrane molecules and intermolecular crosslinking by disulfide bonds and non-disulfide bonds.
従来から、細胞外マトリックスに関する研究は、コラーゲンを中心に進められている。ほ乳類では約３０種類の遺伝的に異なるコラーゲンが発見されており、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型などと発見順に命名されている。それぞれ構造、機能、分布が相違するが、α鎖と呼ばれるポリペプチド鎖が３本、互いに巻きついた右巻きの螺旋構造をとり、前記ポリペプチド鎖は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、Ｘ及びＹは任意のアミノ酸を示す）の繰り返しからなる基本構造を有する点で共通する。なお、Ｉ型コラーゲンでは、３本螺旋領域の両端に、非螺旋領域であるテロペプチドが存在する。 Conventionally, research related to extracellular matrix has been centered on collagen. In mammals, about 30 types of genetically different collagens have been discovered and are named in order of discovery as type I, type II, type III, and the like. Each has a different structure, function, and distribution, but has a right-handed helical structure in which three polypeptide chains called α-chains are wound around each other, and the polypeptide chain is Gly-XY (where X And Y is an arbitrary amino acid, and is common in that it has a basic structure consisting of repetitions of In type I collagen, telopeptides that are non-helical regions exist at both ends of the three-helical region.
前記した基底膜を構成する主要なコラーゲンは、ＩＶ型コラーゲンである。Ｉ型コラーゲンと同様に３本鎖の螺旋構造を形成するが、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ構造が中断する部分を有する点でＩ型コラーゲンと相違する。また、ＩＶ型コラーゲンは、Ｎ末端にシステイン残基を多く含む７Ｓ領域と、分子Ｃ末端に非コラーゲン螺旋領域（ＮＣ１領域）とを有し、これら、７Ｓ領域およびＮＣ１領域を介してＩＶ型コラーゲンの二次元網目構造が形成される点で重要な領域である。 The main collagen constituting the basement membrane is type IV collagen. A three-stranded helical structure is formed as in type I collagen, but differs from type I collagen in that it has a portion where the Gly-XY structure is interrupted. In addition, type IV collagen has a 7S region containing many cysteine residues at the N-terminus and a non-collagen helical region (NC1 region) at the molecule C-terminus, and these type IV collagens pass through these 7S and NC1 regions. This is an important region in that a two-dimensional network structure is formed.
一般に、動物の結合組織のコラーゲンは熱処理によって容易に抽出されるが、この場合にはコラーゲンが熱変性によってその特有の３本螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。コラーゲンはその立体構造を保ったままでは一般に難溶性であり、コラーゲンを溶液として得るには特別な方法が必要となる。ＩＶ型コラーゲンの抽出方法は、胎盤を材料に用いて、ペプシン処理によって胎盤に含まれるＩ，ＩＩＩ，Ｖ，ＩＶ型コラーゲンを抽出した後に、塩分別、カラム等によってＩＶ型コラーゲンを精製する方法（非特許文献１）や、ほぼＩＶ型のみから構成されている動物眼球のレンズカプセルから酸性溶液中でＩＶ型コラーゲンを非酵素的に抽出する方法などが知られている（非特許文献２）。 In general, collagen in animal connective tissue is easily extracted by heat treatment. In this case, collagen has a gelatinous state in which its unique triple helical structure is broken by heat denaturation. Collagen is generally poorly soluble while maintaining its three-dimensional structure, and a special method is required to obtain collagen as a solution. The method for extracting type IV collagen is a method of extracting type I, III, V, and IV collagen contained in the placenta by pepsin treatment using placenta as a material, and then purifying type IV collagen by salt fractionation, column, etc. ( Non-patent document 1) and a method of non-enzymatically extracting type IV collagen in an acidic solution from a lens capsule of an animal eyeball that is substantially composed only of type IV are known (non-patent document 2).
一方、種々のコラーゲンの中で、例えば、Ｉ型コラーゲンは、動物の皮膚・腱・骨などの結合組織の主要構成成分であり、３本のポリペプチド鎖が互いに巻きついた約３００ｎｍの螺旋構造を有する。この３本螺旋体が互いに１／４．４ずつづれながら会合して細い線維を作り、これが更に平行に並んで束を形成し、強い張力に耐えるコラーゲン線維が形成される。Ｉ型コラーゲンの抽出法としては、動物の骨、皮などの材料として、酸性溶液や酵素処理で抽出する方法や(特許文献１)、アルカリ処理による可溶化法等が知られている(非特許文献３)。
前記したＩ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンは、細胞外マトリックスの構成成分であり、細胞接着因子として働く。細胞培養の際に細胞培養プレートのコラーゲンコートが行われるのはこのためである。一方、Ｉ型コラーゲンやＩＶ型コラーゲンは、その抽出方法によって線維形成能やゲル形成能その他が相違し、コラーゲンコートの方法によって前記コート層におけるコラーゲンの形状が相違する。ペプシン処理したＩ型コラーゲンの塩酸溶液を細胞培養プレートの表面にのせ、２５℃の無菌の空気流で乾燥させてなる細胞培養プレート（コラーゲンコートデッシュ）と、前記コラーゲンの塩酸溶液に炭酸水素ナトリウム３倍濃度のＤＭＥＭと、ペニシリン、ストレプトマイシン、ＦＢＳ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを撹拌してコラーゲン培地液を調製し、これを細胞培養プレートに載せ、３７℃で６時間、ＣＯ2条件下でインキュベートしてなる細胞培養プレート（３次元コラーゲン線維ゲル）と、前記コラーゲン培地液と細胞けん濁液とを混合して細胞培養プレートに固定した細胞培養プレート（細胞含有３次元コラーゲンゲル）との３種類で線維芽細胞を培養したところ、コラーゲンコートデッシュと３次元コラーゲン線維ゲルとでは同じ細胞倍増時間であったが、細胞含有３次元コラーゲンゲルでは１．５倍に延長され、有意な増殖抑制が観察されたとの報告がある（非特許文献４）。
On the other hand, among various collagens, for example, type I collagen is a main component of connective tissues such as animal skin, tendons, bones, etc., and has a helical structure of about 300 nm in which three polypeptide chains are wound around each other. Have The three spirals are gathered together by 1 / 4.4 to form thin fibers, which are further arranged in parallel to form a bundle, and collagen fibers that can withstand strong tension are formed. As methods for extracting type I collagen, there are known methods such as animal bones and skins that are extracted by acidic solution or enzyme treatment (Patent Document 1), solubilization method by alkali treatment, etc. Reference 3).
The aforementioned type I collagen and type IV collagen are constituents of the extracellular matrix and function as cell adhesion factors. This is why collagen coating of the cell culture plate is performed during cell culture. On the other hand, type I collagen and type IV collagen differ in fiber forming ability, gel forming ability and the like depending on their extraction methods, and the shape of collagen in the coat layer differs depending on the method of collagen coating. A cell culture plate (collagen coat dish) obtained by placing a hydrochloric acid solution of type I collagen treated with pepsin on the surface of a cell culture plate and drying with a sterile air flow at 25 ° C. A collagen medium solution is prepared by stirring DMEM with double concentration and DMEM containing penicillin, streptomycin, FBS, and 10% FBS, and this is placed on a cell culture plate and incubated at 37 ° C. for 6 hours under CO 2 conditions. A three-dimensional fiber culture plate (three-dimensional collagen fiber gel) and a cell culture plate (cell-containing three-dimensional collagen gel) in which the collagen medium solution and the cell suspension are mixed and fixed to the cell culture plate. When blast cells are cultured, collagen coat dish and 3D collagen fiber gel The same cell doubling was the time is extended to 1.5-fold in the cell-containing three-dimensional collagen gels, it has been reported that significant growth inhibition was observed (Non-Patent Document 4).
また、Ｉ型コラーゲンのカルシウム、マグネシウム不含有リン酸緩衝液を細胞培養プレートにコートし、２時間室温に載置してなる非線維化コラーゲンと、Ｉ型コラーゲンのＰＢＳ（−）溶液を細胞培養プレートに載せ、３７℃、２時間インキュベートして線維状に会合させた線維状コラーゲンとでケラチノサイトを培養したところ、線維状コラーゲンではアポトーシスが引き起こされ（非特許文献５）、分化が引き起こされることが知られている（非特許文献６）。 In addition, the cell culture plate is coated with a type I collagen-free calcium / magnesium-containing phosphate buffer, and the non-fibrotic collagen obtained by placing it at room temperature for 2 hours and the PBS (−) solution of type I collagen are cultured in the cell. When keratinocytes were cultured with fibrillar collagen that had been placed on a plate and incubated at 37 ° C. for 2 hours to associate with fibrils, apoptosis was caused in fibrillar collagen (Non-patent Document 5), and differentiation could be caused. It is known (Non-Patent Document 6).
なお、ＩＶ型コラーゲンをコートした細胞培養プレートとして、コスモ・バイオ株式会社製の登録商標マトリゲルがある。マトリゲルは、マウスのＥＨＳ（Engelbreth-Holm-Swarm）肉腫という基底膜分子を過剰生産する肉腫の抽出物からなり、さらに、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されたものである。 As a cell culture plate coated with type IV collagen, there is a registered trademark Matrigel manufactured by Cosmo Bio. Matrigel consists of an extract of sarcoma that overproduces basement membrane molecules called mouse EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) sarcoma, and further contains laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin and the like.
コラーゲンコートした細胞培養プレートを使用して細胞培養を行うと、培養細胞は表面にあるコラーゲン受容体であるインテグリンを介してコラーゲン分子に接着し、細胞培養プレート上で増殖する。上皮細胞の幹細胞の維持や分化、増殖には基底膜の存在が必須であり、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンをコートした細胞培養プレートが使用されることが望ましい。 When cell culture is performed using a collagen-coated cell culture plate, the cultured cells adhere to collagen molecules via integrin, which is a collagen receptor on the surface, and grow on the cell culture plate. The presence of a basement membrane is essential for the maintenance, differentiation and proliferation of stem cells of epithelial cells, and it is desirable to use a cell culture plate coated with type IV collagen, which is the main component of the basement membrane.
また、コラーゲンは調製方法によって３次元構造を形成し、細胞培養プレートにコートした場合も３次元構造をとりうるか否かによって培養細胞の増殖や分化に相違が生じる。基底膜は、その主成分であるＩＶ型コラーゲンが網目状に広がって構成されるが、細胞培養プレートの表面にＩＶ型コラーゲンの網目構造を再現できれば、より生体の基底膜に近似した細胞増殖環境を形成することができる。 Collagen forms a three-dimensional structure by the preparation method, and even when coated on a cell culture plate, the growth and differentiation of cultured cells vary depending on whether or not the three-dimensional structure can be formed. The basement membrane is composed of type IV collagen, the main component of which spreads in a network, but if the type IV collagen network structure can be reproduced on the surface of the cell culture plate, the cell growth environment more closely resembles the basement membrane of a living body. Can be formed.
しかしながら、ＩＶ型コラーゲンは、動物の胎盤や眼球のレンズカプセルを抽出原料とするため、大量に製造することが困難である。例えば、市販の登録商標マトリゲルは、マウスのＥＨＳ肉腫からの抽出物であるが、正常細胞の培養には、正常個体から抽出したＩＶ型コラーゲンの使用が好ましく、原料の入手が容易でない。また、ＩＶ型コラーゲンは、抽出方法によっては、分子相互作用が弱いためゲル化による網目構造を形成することができず、ゲル化する場合でも温度４℃で５日以上静置しなければ網目構造を形成しない。このため、３次元構造の形成に長時間を要し、ＩＶ型コラーゲンによる実質的な３次元構造の形成は容易でない。市販のマトリゲルでは、電子顕微鏡写真によるＩＶ型コラーゲンによる網目状構造を観察することはできない。したがって、ＩＶ型コラーゲンの使用量を低減し、かつ基底膜の構成成分としてのＩＶ型コラーゲンの特性し、簡便に３次元構造を形成することができ、基底膜の構成成分としてのＩＶ型コラーゲンの特性をするＩＶ型コラーゲン含有ゲルの開発が望まれる。
一方、Ｉ型コラーゲンはゲル強度が高く、比較的容易に抽出や精製が行えるため、コラーゲン３次元培養基質として広く使用することができる。
However, type IV collagen is difficult to produce in large quantities because it uses animal placenta and eye lens capsules as extraction raw materials. For example, the commercially available trademark Matrigel is an extract from mouse EHS sarcoma, but it is preferable to use type IV collagen extracted from normal individuals for culturing normal cells, and it is not easy to obtain raw materials. Further, type IV collagen cannot form a network structure due to gelation due to weak molecular interaction depending on the extraction method, and even when gelled, it must be allowed to stand at a temperature of 4 ° C. for 5 days or more. Does not form. For this reason, it takes a long time to form a three-dimensional structure, and it is not easy to form a substantial three-dimensional structure with type IV collagen. In a commercially available Matrigel, a network structure of type IV collagen cannot be observed by an electron micrograph. Therefore, the amount of type IV collagen can be reduced and the characteristics of type IV collagen as a constituent of basement membrane can be easily formed, and a three-dimensional structure can be easily formed. Development of a type IV collagen-containing gel having properties is desired.
On the other hand, type I collagen has a high gel strength and can be extracted and purified relatively easily. Therefore, it can be widely used as a collagen three-dimensional culture substrate.
しかしながら、Ｉ型コラーゲンは基底膜としての機能を有しておらず、ＥＳ細胞やそこから分化誘導した細胞の培養維持、更には様々な臓器から分離した組織幹細胞の培養や増殖には、基底膜の生理活性を保持し、かつ安定な３次元ゲルを構成する必要がある。 However, type I collagen does not have a function as a basement membrane. For the culture maintenance of ES cells and cells induced to differentiate from them, and for the culture and proliferation of tissue stem cells isolated from various organs, the basement membrane is used. Therefore, it is necessary to construct a stable three-dimensional gel that retains the physiological activity.
また、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合してそのゲル強度を高めようとしても、Ｉ型コラーゲンは３７℃で会合体を形成してゲル化し、これより温度を下げると分子分散した溶液となり会合体を形成することができず、一方、ＩＶ型コラーゲンの会合温度は３７℃より低温の４℃である。実際、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる混成ゲルは知られておらず、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとによって３次元ゲルを形成する方法も存在しない。 In addition, even when trying to increase the gel strength by mixing type I collagen and type IV collagen, type I collagen forms an aggregate at 37 ° C. and gels, and when the temperature is lowered, it becomes a molecularly dispersed solution. Aggregates cannot be formed, while the association temperature of type IV collagen is 4 ° C., which is lower than 37 ° C. Actually, a hybrid gel composed of type I collagen and type IV collagen is not known, and there is no method for forming a three-dimensional gel with type I collagen and type IV collagen.
従って、異なる会合温度のＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合して、均一な３次元構造を形成することができ、かつＩＶ型コラーゲンの機能が発揮される、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルの開発が望まれる。
また、基底膜は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの様々な器官の細胞の足場となり、その増殖や分化を調節している。細胞培養プレートとして生体の基底膜に近似した環境を形成することができれば、より生体環境に近い培養を行うことができる。このような基底膜には、ＩＶ型コラーゲンのほかにラミニンが必須の成分として含有されるため、使用するＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルにもラミニンが含有されることが好ましい。
Therefore, type I collagen and type IV collagen can be formed by mixing type I collagen and type IV collagen having different association temperatures to form a uniform three-dimensional structure and exhibit the function of type IV collagen. Development of hybrid gel is desired.
The basement membrane serves as a scaffold for cells of various organs such as ES cells and iPS cells, and regulates their proliferation and differentiation. If an environment similar to the basement membrane of a living body can be formed as a cell culture plate, culture closer to the living environment can be performed. Since such a basement membrane contains laminin as an essential component in addition to type IV collagen, it is preferable that laminin is also contained in a hybrid gel of type I collagen and type IV collagen to be used.
しかしながら、Ｉ型コラーゲンは、会合によって線維化するがこのような線維状コラーゲンに対するラミニンの結合力は弱い。したがって、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合してなる混成ゲルからなり、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲル、並びにこのような混成ゲルを使用してなる細胞培養プレートの開発が望まれる。
上記現状に鑑みて、本発明は、ＩＶ型コラーゲンの基底膜の構成成分としての特性を保持し、ゲル強度に優れ、３次元構造を形成しうるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供することを目的とする。
However, type I collagen fibrillates by association, but laminin has a weak binding force to such fibrillar collagen. Accordingly, a hybrid gel comprising a mixture of type I collagen and type IV collagen, laminin-bound type I collagen and type IV collagen, and a cell culture plate using such a hybrid gel Development is desired.
In view of the above situation, the present invention provides a type I-IV type collagen hybrid gel that retains the properties of a type IV collagen as a constituent of the basement membrane, has excellent gel strength, and can form a three-dimensional structure. With the goal.
また、本発明は、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合し、３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a method for preparing a type I-IV type collagen hybrid gel, characterized in that type I collagen and type IV collagen are mixed to form a three-dimensional gel.
更に、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを細胞培養プレートの表面にコートしてなる細胞培養プレートを提供することを目的とする。
更に、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜を提供することを目的とする。
It is another object of the present invention to provide a cell culture plate obtained by coating the surface of a cell culture plate with a type I-IV type collagen hybrid gel.
Furthermore, it aims at providing the artificial basement membrane which consists of a type I-IV type collagen hybrid gel.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特定のＩ型コラーゲンと特定のＩＶ型コラーゲンとを特定条件下で混合したところ、短時間に、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物にＩＶ型コラーゲンによる膜状構造物が結合した３次元ゲルを形成することができること、このような混成３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの使用量が低減されたにもかかわらず、基底膜に含まれるＩＶ型コラーゲンと近似する特性を有すること、この混成３次元ゲルは、Ｉ型コラーゲンと相違して、ＩＶ型コラーゲンの配合量に対応するラミニンを結合することができ、より基底膜に近似する細胞培養環境を形成しうること、このような混成ゲルを細胞培養プレートにコートしてなる細胞培養プレートは、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルが形成されるため、極めて基底膜に近似した細胞培養プレートとなりうることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have mixed specific type I collagen and specific type IV collagen under specific conditions. The ability to form a three-dimensional gel in which membranous structures of type IV collagen are combined, and such a hybrid three-dimensional gel is included in the basement membrane despite the reduced amount of type IV collagen used. Different from type I collagen, this hybrid three-dimensional gel has properties that approximate type IV collagen, and can bind laminin corresponding to the amount of type IV collagen, and more closely approximates the basement membrane A cell culture plate that can form a culture environment and is coated with such a hybrid gel on a cell culture plate comprises type I collagen and type IV collagen. Because dimension gel is formed, it found that can be a approximated very basement membrane cell culture plates, thereby completing the present invention.
That is, the present invention provides a type I-IV type collagen hybrid gel in which 100 parts by mass of type IV collagen having gelling ability and 100 to 500 parts by mass of type I collagen having fibrogenic ability are mixed. Is.
また本発明は、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合していることを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。 The present invention also provides the type I-IV type collagen hybrid gel, characterized in that a fibrous structure made of type I collagen is bound to a membrane made of type IV collagen.
本発明は、更に、ラミニンを含有することを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを提供するものである。
本発明は、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが細胞培養用の支持体にコーティングされたことを特徴とする、細胞培養プレートを提供するものである。
The present invention further provides the above type I-IV type collagen hybrid gel characterized by containing laminin.
The present invention provides a cell culture plate, wherein the type I-IV collagen hybrid gel is coated on a support for cell culture.
本発明は、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルからなる、人工基底膜を提供するものである。
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、ついで、温度３０〜４０℃、５％ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供するものである。
The present invention provides an artificial basement membrane comprising the above type I-IV type collagen hybrid gel.
The present invention is based on 100 parts by mass of a type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, and a type I collagen solution having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml. A mass part is mixed at a temperature of 0 to 4 ° C. to prepare a mixed collagen solution, and a neutral buffer solution containing sodium chloride is added to the mixed collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C. The sodium chloride concentration is 0.9% by mass, neutral, and then incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. and 5% CO 2 for 10 minutes to 2 hours to form a three-dimensional gel. A method for preparing a type I-IV type collagen hybrid gel is provided.
本発明は、更に、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法を提供するものである。 The present invention is characterized in that laminin is further added to the three-dimensional gel at a concentration of 10 to 200 μg / ml and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. for 1 to 24 hours. A method for preparing a type IV collagen hybrid gel is provided.
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、これを細胞培養用の支持体に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、細胞培養プレートの製造方法を提供するものである。 The present invention is based on 100 parts by mass of a type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, and a type I collagen solution having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml. A mass part is mixed at a temperature of 0 to 4 ° C. to prepare a mixed collagen solution, and a neutral buffer solution containing sodium chloride is added to the mixed collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C. A sodium chloride concentration of 0.9% by mass and neutrality is placed on a cell culture support and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. under CO 2 conditions for 10 minutes to 2 hours to form a three-dimensional gel. The present invention provides a method for producing a cell culture plate.
本発明は、前記３次元ゲルの形成についで、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記細胞培養プレートの製造方法を提供するものである。 The present invention is characterized in that, after the formation of the three-dimensional gel, laminin is added to the three-dimensional gel so as to have a concentration of 10 to 200 μg / ml and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. for 1 to 24 hours. A method for producing the cell culture plate is provided.
本発明は、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、得られた溶液を厚さ０．０１〜３ｍｍとなるように平板にコートし、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成し、ついで、前記平板から前記３次元ゲルを回収することを特徴とする、人工基底膜の製造方法を提供するものである。 The present invention is based on 100 parts by mass of a type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, and a type I collagen solution having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml. A mass part is mixed at a temperature of 0 to 4 ° C. to prepare a mixed collagen solution, and a neutral buffer solution containing sodium chloride is added to the mixed collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C. The sodium chloride concentration is 0.9% by mass and neutral, and the resulting solution is coated on a flat plate so as to have a thickness of 0.01 to 3 mm, and the temperature is 30 to 40 ° C. under CO 2 conditions for 10 minutes to 2 The present invention provides a method for producing an artificial basement membrane, which comprises incubating for a time to form a three-dimensional gel, and then recovering the three-dimensional gel from the flat plate.
本発明は、前記３次元ゲルの形成についで、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、上記人工基底膜の製造方法を提供するものである。
The present invention is characterized in that, after the formation of the three-dimensional gel, laminin is added to the three-dimensional gel so as to have a concentration of 10 to 200 μg / ml and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. for 1 to 24 hours. A method for producing the artificial basement membrane is provided.
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによれば、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンと、線維形成能を有するＩ型コラーゲンとを混合することで、収量の少ないＩＶ型コラーゲンの使用量を減らし、ゲル強度に優れ、かつＩＶ型コラーゲンの特性を有する混成ゲルを提供することができる。 According to the type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention, the amount of type IV collagen having a low yield can be reduced by mixing type IV collagen having gelling ability and type I collagen having fibrogenic ability. It is possible to provide a hybrid gel that is reduced, has excellent gel strength, and has the characteristics of type IV collagen.
本発明によれば、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを所定の方法でインキュベートすることで、短時間に、線維状のＩ型コラーゲンに膜状のＩＶ型コラーゲンが結合した３次元構造を形成することができる。 According to the present invention, a three-dimensional structure in which membrane type IV collagen is bound to fibrous type I collagen is formed in a short time by incubating type I-IV type collagen hybrid gel by a predetermined method. be able to.
本発明によれば、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを所定の方法でインキュベートすることで、線維状のＩ型コラーゲンに膜状のＩＶ型コラーゲンが結合した３次元構造を形成することができ、この混成ゲルを細胞培養プレートにコートすることで、より生体の基底膜に近似する細胞培養プレートを製造することができる。
According to the present invention, a three-dimensional structure in which membrane type IV collagen is bound to fibrous type I collagen can be formed by incubating type I-IV type collagen hybrid gel by a predetermined method. By coating this hybrid gel on the cell culture plate, a cell culture plate that more closely resembles the basement membrane of a living body can be produced.
本発明の第１は、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルである。 The first of the present invention is a type I-IV type collagen hybrid gel comprising 100 parts by mass of type IV collagen having gelling ability and 100-500 parts by mass of type I collagen having fibrogenic ability. is there.
基底膜による細胞培養環境を提供するには、基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンを使用することが好ましいが、ＩＶ型コラーゲンは供給量が少なくかつゲル化能も弱い。本発明によれば、少量のＩＶ型コラーゲンにＩ型コラーゲンを混合することで、ＩＶ型コラーゲンの特性を維持したままゲル強度に優れる混成コラーゲンを提供することができる。なお、後記する実施例に示すように、ＩＶ型コラーゲンの特性を発揮するには、ＩＶ型コラーゲンが、上記混成ゲルの中で網目構造を形成する必要がある。従来から、ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンとの混合や、得られた混成ゲルから３次元ゲルを形成する方法、更には、このような混成ゲルが基底膜の主成分であるＩＶ型コラーゲンの特性を維持しうることは、全く知られていなかった。本発明では、ＩＶ型コラーゲンとしてゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを使用し、Ｉ型コラーゲンとして線維形成能を有するＩ型コラーゲンを使用し、かつ前記ＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、前記Ｉ型コラーゲンを１００〜５００質量部、より好ましくは１００〜３００質量部、混合してなる混成ゲルを提供する。この混成ゲルは、所定条件下で簡便に３次元ゲルを形成することができ、かつこのようにして得られた３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの生理機能を維持したままＩ型コラーゲンのゲル強度を有することが判明した。以下、本発明を詳細に説明する。
（１）線維形成能を有するＩ型コラーゲン
本願明細書において、「コラーゲン」とは、タンパク質の一種で、３本のポリペプチド鎖が３重螺旋を巻いたものの総称であり、コラーゲン分子は１種類のα鎖からなっていてもよく、別々の遺伝子にコードされた複数種のα鎖からなっていてもよい。α鎖は、通常、α１，α２，α３のようにαの後に数字をつけてよび，さらにコラーゲンの型をつけて，α１（Ｉ）などと称する。本発明では、線維形成能を有するものであれば、例えば、［α１（Ｉ）2α２（Ｉ）］のような天然に存在するＩ型コラーゲンのほか、天然に存在しないような組み合わせの三量体であってもよい。
In order to provide a cell culture environment using a basement membrane, it is preferable to use type IV collagen, which is the main component of the basement membrane, but type IV collagen has a small supply amount and a low gelling ability. According to the present invention, by mixing type I collagen with a small amount of type IV collagen, hybrid collagen excellent in gel strength can be provided while maintaining the characteristics of type IV collagen. In addition, as shown in the Example mentioned later, in order to exhibit the characteristic of IV type | mold collagen, it is necessary for IV type | mold collagen to form a network structure in the said hybrid gel. Conventionally, a mixture of type IV collagen and type I collagen, a method of forming a three-dimensional gel from the obtained hybrid gel, and the characteristics of type IV collagen in which such a hybrid gel is the main component of the basement membrane It has not been known at all that it can be maintained. In the present invention, type IV collagen having gelling ability is used as type IV collagen, type I collagen having fiber forming ability is used as type I collagen, and the type I collagen is used with respect to 100 parts by mass of type IV collagen. A hybrid gel obtained by mixing 100 to 500 parts by mass, more preferably 100 to 300 parts by mass of collagen is provided. This hybrid gel can easily form a three-dimensional gel under predetermined conditions, and the three-dimensional gel thus obtained maintains the physiological function of type IV collagen while maintaining the gel strength of type I collagen. It was found to have Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(1) Type I collagen having fibril forming ability In the present specification, "collagen" is a kind of protein and is a general term for three polypeptide chains wound in a triple helix, and one type of collagen molecule. The α chain may be composed of a plurality of types of α chains encoded by different genes. The α chain is usually referred to as α1 (I) or the like by adding a number after α, such as α1, α2, α3, and a collagen type. In the present invention, any one having a fibrogenic ability, for example, naturally occurring type I collagen such as [α1 (I) 2 α2 (I)], or a combination of three that does not exist in nature. It may be a body.
本発明で使用するＩ型コラーゲンは、線維形成能を有することを特徴とする。線維状のＩ型コラーゲンにＩＶ型コラーゲンを膜状に結合することで、ＩＶ型コラーゲンの基底膜成分の特性が発揮されることが判明したからである。なお、使用するＩ型コラーゲンが線維形成能を有するか否かは、濃度０．１％のＩ型コラーゲン溶液を生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有中性緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で３７℃に加温した場合に、会合構造により肉眼で白く濁ったゲル状の再生線維を形成する場合に線維形成能ありとして確認することができる。
一般に、Ｉ型コラーゲンは、動物の結合組織に多く含まれるが、熱処理によって抽出するとコラーゲンが熱変性して特有の３本螺旋構造が壊され、ゼラチン状態となる。本発明では、３本螺旋構造を有し、かつ線維形成能を有するＩ型コラーゲンを使用する点に特徴がある。このようなＩ型コラーゲンの抽出法として、動物の骨、皮などを材料として、（１）酸性溶液を用いる方法、（２）酵素処理する方法、（３）アルカリ処理による可溶化法等がある。
The type I collagen used in the present invention is characterized by having a fiber forming ability. This is because it has been found that the characteristics of the base membrane component of type IV collagen are exhibited by binding type IV collagen to fibrous type I collagen in the form of a membrane. Whether or not the type I collagen used has a fiber-forming ability is determined by using a type I collagen solution having a concentration of 0.1% as a physiological salt concentration buffer (neutral buffer containing 0.9% NaCl), pH 7.6. When heated to 37 ° C. under the above conditions, it can be confirmed that there is a fiber-forming ability when gel-like regenerated fibers that are white and cloudy with the naked eye are formed by the association structure.
In general, type I collagen is abundant in connective tissues of animals. However, when extracted by heat treatment, the collagen is thermally denatured and the specific triple helical structure is destroyed, resulting in a gelatin state. The present invention is characterized in that type I collagen having a three-helical structure and having a fiber forming ability is used. Such extraction methods for type I collagen include (1) a method using an acidic solution, (2) a method for enzyme treatment, (3) a solubilization method by alkali treatment, etc., using animal bones, skins and the like as materials. .
（ｉ）酸性溶液処理法
Ｉ型コラーゲンの抽出原料として、ウシ、ブタ、ニワトリ、ダチョウ、ウマ、魚類等の真皮や腱を例示することができる。胎児由来などの若い動物の組織を使用すると収率が向上するため好ましいが、線維形成能を有するＩ型コラーゲンが抽出できれば、上記に限定されるものではない。
(I) Acidic solution treatment method Examples of the extraction material for type I collagen include dermis and tendons of cows, pigs, chickens, ostriches, horses, fishes, and the like. Although it is preferable to use a tissue of a young animal such as a fetus because the yield is improved, it is not limited to the above as long as type I collagen having fibrogenic ability can be extracted.
例えばウシの真皮を使用する場合には、蛋白質分解酵素阻害剤を加えた食塩を含まない、リン酸緩衝液、もしくはトリス緩衝液（ｐＨ７．６）をもちいてよく洗浄する。または石灰漬によって脱毛処理を行ったのち塩酸で中和水洗した牛皮を使用することができる。 For example, when bovine dermis is used, it is thoroughly washed using a phosphate buffer solution or a Tris buffer solution (pH 7.6) that does not contain salt added with a protease inhibitor. Alternatively, it is possible to use cowhide that has been depilated by lime pickling and then washed with neutralized water with hydrochloric acid.
前記した下処理を行った牛皮を１ｃｍ角程度に細切し、組織質重量に対して１０倍の０．５Ｍ酢酸を加え４０℃以下、より好ましくは４〜２５℃で２４時間〜１２０時間ゆっくり撹拌する。抽出後、遠心分離によって溶け残りの組織を除く。遠心分離によって得た溶液には最終濃度２Ｍとなるように食塩を加えることで、Ｉ型コラーゲンを沈殿させる。さらに上記Ｉ型コラーゲンの沈殿を０．０５Ｍの酢酸に再溶解し、最終濃度１Ｍとなるように食塩を加え、遠心分離によって粗Ｉ型コラーゲンの沈殿を得る。その後、必要に応じてトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）に沈殿を溶解し、中性塩分別を行うとＩ型コラーゲンをさらに精製することができる。 The above-prepared beef skin is chopped into about 1 cm square, 10 times the 0.5 M acetic acid is added to the tissue weight, and slowly added at 40 ° C. or lower, more preferably 4-25 ° C. for 24 hours to 120 hours. Stir. After extraction, the remaining tissue is removed by centrifugation. Type I collagen is precipitated by adding sodium chloride to the solution obtained by centrifugation at a final concentration of 2M. Further, the above type I collagen precipitate is redissolved in 0.05 M acetic acid, sodium chloride is added to a final concentration of 1 M, and a crude type I collagen precipitate is obtained by centrifugation. Thereafter, the type I collagen can be further purified by dissolving the precipitate in Tris-HCl buffer (pH 7.6) and performing neutral salt fractionation as necessary.
上記酸性溶液を使用する方法では、３本螺旋領域の両端の非螺旋領域であるテロペプチドを含む、生体内に存在するコラーゲン分子と同じ状態のコラーゲンを得ることができる。 In the method using the acidic solution, collagen in the same state as collagen molecules existing in the living body, including telopeptides that are non-helical regions at both ends of the three-helical region, can be obtained.
（ｉｉ）酵素処理法
前記（ｉ）で得た下処理を行った牛皮を、ｐＨ２〜３の塩酸酸性ペプシン溶液に浸し、随時撹拌しながらＩ型コラーゲンの収縮温度である４０℃以下、より好ましくは４〜２５℃で２４時間〜１２０時間ゆっくり撹拌する。ペプシンにより不溶性コラーゲンが酵素で処理され、不溶性コラーゲンが溶解する。
(Ii) Enzyme treatment method The cowhide that has been subjected to the pretreatment obtained in (i) above is immersed in an acidic pepsin solution having a pH of 2 to 3, and is preferably 40 ° C. or less, which is the contraction temperature of type I collagen while stirring as needed. Stir slowly at 4-25 ° C. for 24 hours to 120 hours. Pepsin treats insoluble collagen with enzymes and dissolves insoluble collagen.
ついで、０．００５Ｎの塩酸溶液を追加してＩ型コラーゲンの変性温度である３７℃以下、より好ましくは２０〜２５℃で１２〜６０時間撹拌すると、Ｉ型コラーゲンが溶解する。酸溶液としては、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、クエン酸、他の有機酸を好適に使用することができる。 Subsequently, when a 0.005N hydrochloric acid solution is added and stirred at 37 ° C. or lower, more preferably 20 to 25 ° C., which is the denaturation temperature of type I collagen, type I collagen is dissolved. As the acid solution, acetic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, citric acid, and other organic acids can be suitably used.
この溶液をろ過し、ろ液を水酸化ナトリウムなどのアルカリでｐＨ６〜８に中和してペプシンを不活化する。その後、再び溶液を酸性に戻し、２モルの食塩を加えてコラーゲンを沈殿させる。その後の操作は上記（ｉ）の酸性溶液処理法と同様にして、粗Ｉ型コラーゲンや精製Ｉ型コラーゲンを得ることができる。 This solution is filtered, and the filtrate is neutralized to pH 6-8 with an alkali such as sodium hydroxide to inactivate pepsin. Thereafter, the solution is returned to acidity and 2 mol of sodium chloride is added to precipitate collagen. Subsequent operations can be carried out in the same manner as in the acidic solution treatment method (i) above to obtain crude type I collagen or purified type I collagen.
（ｉｉｉ）アルカリ溶液処理
前記（ｉ）で得た下処理を行った牛皮を、１５％（ｗ／ｖ）硫酸ナトリウム含有５％水酸化ナトリウムなどの、硫酸ナトリウム含有アルカリ溶液で処理する。３本螺旋構造を維持したコラーゲンを抽出することができる。アルカリ処理の方法は、抽出効率が高い点で優れる。
Ｉ型コラーゲンは、コラーゲンへリックス領域の両端に、螺旋構造をとらない数十残基のアミノ酸からなるテロペプチドが結合し、テロペプチド部分が除去されたコラーゲンをアテロコラーゲンと称する。上記した（ｉｉ）の酵素処理法によるとアテロコラーゲンとしてＩ型コラーゲンを得ることができる。本発明で使用するＩ型コラーゲンとしては、３本螺旋構造を維持でき、かつ線維形成能を有すれば、テロペプチドが除去されたアテロコラーゲンであってもよい。
(Iii) Alkaline solution treatment The treated cowhide obtained in (i) is treated with a sodium sulfate-containing alkaline solution such as 15% (w / v) sodium sulfate-containing 5% sodium hydroxide. Collagen maintaining a three-helical structure can be extracted. The alkali treatment method is excellent in that the extraction efficiency is high.
In type I collagen, a telopeptide consisting of several tens of amino acids that do not have a helical structure is bound to both ends of a collagen helix region, and the collagen from which the telopeptide portion has been removed is referred to as atelocollagen. According to the enzyme treatment method (ii) described above, type I collagen can be obtained as atelocollagen. The type I collagen used in the present invention may be atelocollagen from which the telopeptide has been removed as long as it can maintain a three-helical structure and has a fiber-forming ability.
なお、上記抽出法は一例であり、これらの変法や他の方法で抽出したものであってもよい。更に、線維形成能を有するＩ型コラーゲンであれば、市販品を使用することもできる。
（２）ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン
本願明細書において「ＩＶ型コラーゲン」とは、基底膜を構成する主要なコラーゲンであり、その分子は、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインからなっており、Ｎ末端の７Ｓで４分子が重合し、Ｃ末端のＮＣ１で２分子が重合することにより、網目状のネットワークを形成しているコラーゲンまたはその機能的に等価な分子をいう。ＩＶ型コラーゲンの機能的に等価な分子は、例えば、酵素抗体法、ＥＩＡ法という方法により同定することができる。
In addition, the said extraction method is an example and what extracted by these modified methods and other methods may be used. Furthermore, a commercially available product can be used as long as it is type I collagen having fiber-forming ability.
(2) Type IV collagen having gelling ability In this specification, “type IV collagen” is a major collagen constituting the basement membrane, and its molecules are composed of four domains of 7S, NC2, TH2, and NC1. In this case, 4 molecules are polymerized at 7S at the N-terminal, and 2 molecules are polymerized at NC1 at the C-terminal to form a network or a functionally equivalent molecule thereof. A functionally equivalent molecule of type IV collagen can be identified by, for example, an enzyme antibody method or an EIA method.
本発明で使用するＩＶ型コラーゲンは、ゲル化能を有することを特徴とする。ゲル化能によって、Ｉ型コラーゲンの線維状構造物にＩＶ型コラーゲンを膜状に結合させることができる。後記する実施例に示すように、ゲル化能がないＩＶ型コラーゲンを使用すると、Ｉ型コラーゲンの線維状構造物にＩＶ型コラーゲンを膜状に形成することができず、ＩＶ型コラーゲンとしての特性も発揮することができない。 The type IV collagen used in the present invention is characterized by having a gelling ability. Due to the gelation ability, type IV collagen can be bound to the fibrous structure of type I collagen in a membrane form. As shown in the examples described later, when type IV collagen having no gelling ability is used, type IV collagen cannot be formed into a membrane in the fibrous structure of type I collagen, and characteristics as type IV collagen Can not be demonstrated.
なお、使用するＩＶ型コラーゲンがゲル化能を有するか否かは、濃度１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン溶液を生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有、中性緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で４℃、５日放置した後に、溶液がＩＶ型コラーゲンの会合によって流動性を失った場合に、ゲル化能ありとして確認することができる。
このようなゲル化能のあるＩＶ型コラーゲンは、酸性溶液を使用して抽出することができる。
Whether or not the type IV collagen used has a gelling ability is determined by using a type IV collagen solution with a concentration of 1 mg / ml using a physiological salt concentration buffer (containing 0.9% NaCl, neutral buffer), pH 7.6. When the solution loses its fluidity due to association of type IV collagen after standing at 4 ° C. for 5 days under the conditions described above, it can be confirmed as having gelation ability.
Such gelling ability type IV collagen can be extracted using an acidic solution.
まず、ＩＶ型コラーゲンの抽出原料としては、ウシ、ブタ、ウマ等の眼球レンズカプセルや胎盤を例示することができる。特に、眼球レンズカプセルを使用することが好ましい。回収率および純度が高いからである。ただしＩＶ型コラーゲンが抽出できれば、上記に限定されるものではない。 First, examples of the raw material for extracting type IV collagen include bovine, porcine, and equine eyeball lens capsules and placenta. In particular, it is preferable to use an ocular lens capsule. This is because the recovery rate and purity are high. However, it is not limited to the above as long as type IV collagen can be extracted.
抽出処理方法を以下に示す。
例えば、凍結ウシの眼球レンズカプセルを使用する場合には、解凍後に、まず洗浄工程として、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライドからなるプロテアーゼインヒビター混合溶液を含むｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで眼球レンズカプセルを洗浄する。続いて抽出工程にはいる。眼球レンズカプセル１ｇについて５〜１０ｍｌの１ｍＭの塩酸を添加してホモジナイズし２〜３日間、4℃で静置する。遠心分離後、上澄みを４℃で保存する。上澄みを０．５Ｍの酢酸で透析して前記インヒビターを除去し、ついで凍結乾燥してＩＶ型コラーゲンを得ることができる。
The extraction processing method is shown below.
For example, when using a frozen bovine eye lens capsule, after thawing, as a washing step, a protease inhibitor mixed solution consisting of 5 mM EDTA, 1 mM N-ethylmaleimide, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride is first used. Wash the ophthalmic lens capsule with 20 mM sodium phosphate, pH 7.2. Subsequently, the extraction process is started. Add 5-10 ml of 1 mM hydrochloric acid to 1 g of the eyeball capsule and homogenize it, and leave it at 4 ° C. for 2-3 days. After centrifugation, the supernatant is stored at 4 ° C. The supernatant can be dialyzed against 0.5M acetic acid to remove the inhibitor and then lyophilized to obtain type IV collagen.
なお、後記する実施例に示すように、眼球レンズカプセルから抽出したＩＶ型コラーゲンは、α鎖由来のバンドが存在する。１００ｋＤａ以下のコラーゲン由来でない不純物が含まれる場合には、ＤＥＡＥセファロース等のイオン交換樹脂により精製し、純度の高いＩＶ型コラーゲンを得ることができる。
ＩＶ型コラーゲンは、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインを有し、分子Ｎ末端はシステイン残基を多く含む７Ｓ領域を、分子Ｃ末端は非コラーゲン螺旋領域（ＮＣ１領域）を有し、７Ｓ領域およびＮＣ１領域は、コラーゲン分子が相互作用して基底膜構造を形成するのに重要な役割をもっている。本発明では、ゲル化能を有すれば、７Ｓ、ＮＣ２、ＴＨ２、ＮＣ１の４つのドメインの全てを有している必要はない。
In addition, as shown in the Example mentioned later, the type IV collagen extracted from the eyeball lens capsule has a band derived from an α chain. When impurities not derived from collagen of 100 kDa or less are contained, it can be purified by an ion exchange resin such as DEAE Sepharose to obtain highly purified type IV collagen.
Type IV collagen has four domains of 7S, NC2, TH2, and NC1, the molecule N-terminus has a 7S region containing many cysteine residues, the molecule C-terminus has a non-collagen helical region (NC1 region), The 7S region and the NC1 region have an important role in the interaction of collagen molecules to form a basement membrane structure. In the present invention, it is not necessary to have all four domains of 7S, NC2, TH2, and NC1 as long as they have gelling ability.
なお、上記抽出法は一例であり、これらの変法や他の方法で抽出したものであってもよい。更に、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンであれば、市販品を使用することもできる。
（３）ラミニン
ラミニンは、基底膜の構成成分である。ラミニンは、α、β、γと呼ばれる三つのサブユニット鎖が会合したヘテロ三量体分子であり、α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３の全部で１１種類のサブユニットが存在し、その名称はサブユニット鎖の構成で呼ばれている。例えば、サブユニットαがα１であり、サブユニットβがβ１であり、サブユニットγがγ１であるラミニンを、ラミニン１１１と称し、サブユニットαがα２であり、サブユニットβがβ１であり、サブユニットγがγ１であるラミニンをラミニン２１１と称する。理論上は、サブユニットの組み合わせによって、４５種のラミニンが存在しうる。本発明で使用できるラミニンは、現時点で知られている以下に示す１５種類ラミニン１１１，２１１，１２１，２２１，３３２，３１１，３２１，４１１，４２１，５１１，５２１，２１３，４２３，５２３，３３３のほかに、これから見出されうる他のラミニンを含むことができる。更に、臓器、細胞分泌物からの精製品のほか、リコンビナントラミニンであってもよい。
In addition, the said extraction method is an example and what extracted by these modified methods and other methods may be used. Furthermore, a commercial item can also be used if it is type IV collagen which has gelling ability.
(3) Laminin Laminin is a component of the basement membrane. Laminin is a heterotrimeric molecule in which three subunit chains called α, β, and γ are associated. The α chain is α1 to 5, the β chain is β1 to 3, and the γ chain is 11 to 11 in total. There are different types of subunits, and their names are referred to as subunit chain configurations. For example, a laminin in which subunit α is α1, subunit β is β1, and subunit γ is γ1 is referred to as
ＩＶ型コラーゲンは基底膜に普遍的に存在するが、ラミニンの構成サブユニット鎖は、臓器、発生の段階によって相違する。ＩＶ型コラーゲンが基底膜成分として細胞間に共通な基底膜特有の細胞制御を担当し、ラミニンはさらに臓器・発生段階に特徴的な微妙な細胞機能の制御を分担して行っている可能性がある。例えば、ラミニンは、細胞受容体であるインテグリン、ジストログリカン、シンデカンと結合し細胞の分化、増殖を制御していると考えられる。したがって、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに種々のラミニンを結合することで、培養細胞の分化や増殖を制御することができる。
（４）Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン１００質量部に対し、線維形成能を有するＩ型コラーゲン１００〜５００質量部とが混合されてなる。前記したように、上記範囲で配合した混成ゲルは、所定条件下で、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造物に、ＩＶ型コラーゲンによる膜状物が結合する３次元ゲルを形成することができ、かつこのようにして得られた３次元ゲルは、ＩＶ型コラーゲンの生理機能を維持したままＩ型コラーゲンのゲル強度を有する。
Type IV collagen is ubiquitously present in the basement membrane, but the constituent subunit chains of laminin differ depending on the organ and the stage of development. Type IV collagen is responsible for cell-specific cell control common to cells as a component of the basement membrane, and laminin may also share the delicate control of cell functions characteristic of organs and developmental stages. is there. For example, laminin is thought to regulate cell differentiation and proliferation by binding to cell receptors, integrins, dystroglycans and syndecans. Therefore, the differentiation and proliferation of cultured cells can be controlled by binding various laminins to the type I-IV type collagen hybrid gel.
(4) Type I-IV type collagen hybrid gel The type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention is 100 to 500 parts by mass of type I collagen having fiber forming ability with respect to 100 parts by mass of type IV collagen having gelling ability. The part is mixed. As described above, the hybrid gel blended in the above range can form a three-dimensional gel in which a membrane structure of type IV collagen is bonded to a fibrous structure of type I collagen under a predetermined condition, and The three-dimensional gel thus obtained has the gel strength of type I collagen while maintaining the physiological function of type IV collagen.
従来から、３次元細胞培養の基材としてはＩ型コラーゲンが利用されてきたが、Ｉ型コラーゲンは基底膜の特性を有しておらず、再生医療などで必要となるＥＳ細胞の培養には最適とはいえない。従って、ＥＳ細胞やそこから分化誘導した細胞の培養維持、更には様々な臓器から分離した組織幹細胞の培養や増殖には、基底膜の生理活性を保持し、かつ安定な３次元ゲルを構成する必要がある。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ゲル強度に優れＩＶ型コラーゲンの特性を維持でき、生体の基底膜に近似した細胞培養環境を提供することができる。
また、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、ラミニンなどの他の基底膜成分を結合することができる。生体の基底膜では、ＩＶ型コラーゲンの網目構造とラミニンとが複合的に結合して、基底膜の立体構造を形成している。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに更にラミニンを結合することで、より基底膜に近似する細胞培養環境を提供することができる。ラミニンの結合量は、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜１５０μｇ／ｍｌとする。なお、結合させるラミニンの種類には特に制限はなく、その目的に応じて、各種のラミニンから選択して結合させることができる。
なお、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、含水ゲルである。前記Ｉ型コラーゲンと前記ＩＶ型コラーゲンとの配合割合は上記の範囲であるが、混成ゲルに含まれる前記Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの総濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜８ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．１〜６ｍｇ／ｍｌである。この範囲で、基底膜に近似するゲル強度を確保し、ＩＶ型コラーゲンの特性を発揮することができる。
Conventionally, type I collagen has been used as a base material for three-dimensional cell culture, but type I collagen does not have basement membrane characteristics and is used for ES cell culture required for regenerative medicine. Not optimal. Therefore, for maintaining and culturing ES cells and cells induced to differentiate from them, and for culturing and proliferating tissue stem cells isolated from various organs, a stable three-dimensional gel that retains the physiological activity of the basement membrane is constructed. There is a need. The type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention is excellent in gel strength, can maintain the characteristics of type IV collagen, and can provide a cell culture environment similar to a basement membrane of a living body.
Moreover, the type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention can bind other basement membrane components such as laminin. In the basement membrane of a living body, the type IV collagen network structure and laminin are combined to form a basement membrane three-dimensional structure. By further bonding laminin to the type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention, it is possible to provide a cell culture environment that more closely resembles a basement membrane. The amount of laminin bound is 10 to 200 μg / ml, more preferably 20 to 150 μg / ml in the type I-IV collagen hybrid gel. In addition, there is no restriction | limiting in particular in the kind of laminin to couple | bond, According to the objective, it can select and couple | bond together from various laminins.
The type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention is a hydrous gel. The blending ratio of the type I collagen and the type IV collagen is in the above range, but the total concentration of the type I collagen and type IV collagen contained in the hybrid gel is more preferably 0.05 to 10 mg / ml. Is 0.1 to 8 mg / ml, particularly preferably 0.1 to 6 mg / ml. Within this range, the gel strength approximate to that of the basement membrane can be secured and the characteristics of type IV collagen can be exhibited.
一方、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、３次元ゲルを形成した後にこれを乾燥および凍結してもよい。これにより、高度の保存性を確保することができる。なお、ついで培養液など添加することで、再度３次元ゲルを形成することができる。
（５）Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、異なる会合温度のＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを使用するが、簡便な方法で３次元ゲルを形成することができることが判明した。本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルから３次元ゲルを形成する方法には、特に限定はないが、以下の方法を好適に使用することができる。すなわち、
濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、ついで、温度３０〜４０℃、５％ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これにより、３次元ゲルを形成することができる。
(ｉ)ＩＶ型コラーゲン溶液
本発明で使用するＩＶ型コラーゲン溶液の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌである。ＩＶ型コラーゲンは、ｐＨ２〜４、より好ましくはｐＨ３〜４の酸性溶液に溶解して使用することができる。溶解性に優れ、かつ変性が少ないからである。このような酸性溶液としては、２〜８０ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭの酢酸溶液、０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの塩酸溶液を例示することができる。
（ｉｉ）Ｉ型コラーゲン溶液
本発明で使用するＩ型コラーゲン溶液の濃度は、０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍｌである。Ｉ型コラーゲンは、ＩＶ型コラーゲンと同様に、ｐＨ２〜４、より好ましくはｐＨ３〜４の酸性溶液に溶解して使用することができる。溶解性に優れ、かつ変性が少ないからである。このような酸性溶液としては、ＩＶ型コラーゲン溶液と同様に、２〜８０ｍＭ、より好ましくは５〜５０ｍＭの酢酸溶液、０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの塩酸溶液を例示することができる。Ｉ型コラーゲン溶液は、氷冷条件で保存することが好ましい。
（ｉｉｉ）混成コラーゲン溶液の調製
前記濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対し、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃、より好ましくは０〜３℃、より好ましくは氷冷条件で混合して混成コラーゲン溶液を得る。上記温度であれば、ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンとの双方をゲル化させずに混合することができる。なお、得られるＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルにおける各コラーゲンの配合割合は、前記ＩＶ型コラーゲン溶液とＩ型コラーゲン溶液との配合量を上記範囲で選択することで調整することができる。ＩＶ型コラーゲン溶液は、氷冷条件で保存することが好ましい。
（ｉｖ）混成コラーゲン緩衝溶液の調製
本発明では、上記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃、より好ましくは０〜３℃、より好ましくは氷冷条件で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％とし、かつ溶液を中性にする。
On the other hand, the type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention may be dried and frozen after forming a three-dimensional gel. Thereby, a high degree of storage stability can be ensured. A three-dimensional gel can be formed again by adding a culture solution or the like.
(5) Method for preparing three-dimensional gel using type I-IV type collagen hybrid gel The type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention uses type I collagen and type IV collagen having different association temperatures. It has been found that the method can form a three-dimensional gel. The method for forming a three-dimensional gel from the type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention is not particularly limited, but the following method can be suitably used. That is,
For 100 parts by mass of type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, 100 to 500 parts by mass of type I collagen solution having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml, A mixed collagen solution is prepared by mixing at a temperature of 0 to 4 ° C., and a sodium chloride-containing neutral buffer solution is added to the mixed collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C. to adjust the sodium chloride concentration of the mixed collagen solution. 0.9% by weight, neutral, and then incubated at a temperature of 30-40 ° C., 5% CO 2 for 10 minutes to 2 hours. Thereby, a three-dimensional gel can be formed.
(i) Type IV collagen solution The concentration of the type IV collagen solution used in the present invention is 0.05 to 10 mg / ml, more preferably 0.1 to 5 mg / ml. Type IV collagen can be used after being dissolved in an acidic solution of
(Ii) Type I collagen solution The concentration of the type I collagen solution used in the present invention is 0.05 to 10 mg / ml, more preferably 0.1 to 5 mg / ml. Like type IV collagen, type I collagen can be used by dissolving in an acidic solution of
(Iii) Preparation of Hybrid Collagen Solution 100 to 500 parts by mass of a type I collagen solution having a concentration of 0.05 to 10 mg / ml was added at a temperature of 0 to 100 parts by mass of a type IV collagen solution having a concentration of 0.05 to 10 mg / ml. The mixed collagen solution is obtained by mixing at -4 ° C, more preferably 0-3 ° C, more preferably under ice-cooling conditions. If it is the said temperature, both type IV collagen and type I collagen can be mixed, without gelatinizing. In addition, the blending ratio of each collagen in the obtained type I-IV type collagen hybrid gel can be adjusted by selecting the blending amount of the type IV collagen solution and the type I collagen solution in the above range. The type IV collagen solution is preferably stored under ice-cooling conditions.
(Iv) Preparation of Hybrid Collagen Buffer Solution In the present invention, a neutral buffer solution containing sodium chloride is added to the hybrid collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C., more preferably 0 to 3 ° C., more preferably ice-cooled conditions. Then, the sodium chloride concentration of the hybrid collagen solution is set to 0.9% by mass, and the solution is neutralized.
Ｉ型コラーゲンから線維状構造物を形成する方法としては、前記非特許文献４に記載されるように、Ｉ型コラーゲンの塩酸溶液に、炭酸水素ナトリウム３倍濃度のＤＭＥＭなどを添加して３７℃で６時間、５％ＣＯ2条件下でインキュベートする方法が知られているが、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合して３次元ゲルが形成されることは全く知られていない。本発明では、温度０〜４℃で、前記混成コラーゲン溶液に上記塩化ナトリウム濃度の中性緩衝液を添加することで、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンの双方のゲル化を防止しつつ各コラーゲンを均一に混合し、併せて溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％に調整する。
As a method for forming a fibrous structure from type I collagen, as described in
なお、塩化ナトリウム含有中性緩衝液の調製に使用する中性緩衝液としては、ｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液であり、最も好ましくはｐＨ７．６の緩衝液であり、例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液を使用することができる。また、塩化ナトリウムの濃度は、生理食塩水の塩濃度である０．９質量％の５〜２０倍、より好ましくは７〜１５倍の塩濃度とする。例えば、塩化ナトリウム９質量％を含有する塩化ナトリウム含有中性緩衝液を使用する場合には、この１／１０を使用することで、簡便に０．９質量％に調製することができる。
（ｖ）３次元ゲル化
前記混成コラーゲン緩衝溶液を、温度３０〜４０℃、より好ましくは３５〜３７℃に１０分〜２時間、より好ましくは３０〜６０分インキュベートする。この工程により、従来、４℃でなければ会合しなかったＩＶ型コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンが共存することで会合してゲル化することが判明した。すなわち、Ｉ型コラーゲンの線維化温度である３７℃で、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを同時にゲル化させることができる。しかも、従来の方法では、ＩＶ型コラーゲンをゲル化させるために５日間という長時間を要したが、本発明によれば、２時間以内という極めて短時間にゲル化できるのである。しかも、その３次元構造は、Ｉ型コラーゲンによる線維状構造にＩＶ型コラーゲンによる膜状物が形成されたものであり、基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンの網目構造に類似する。この結果、本発明の混成ゲルは、基底膜に存在するＩＶ型コラーゲンの特性をよく保持することができる。
（ｖｉ）ラミニンの添加
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルには、基底膜成分であるラミニンを添加することができ、これにより、より基底膜に近似する混成ゲルを調製することができる。
In addition, as a neutral buffer used for preparation of sodium chloride containing neutral buffer, it is a buffer of pH 6-8, More preferably, it is a buffer of pH 7-8, Most preferably, it is a buffer of pH 7.6, for example, Phosphate buffer or Tris buffer can be used. The sodium chloride concentration is 5 to 20 times, more preferably 7 to 15 times the 0.9% by mass salt concentration of physiological saline. For example, when using a sodium chloride-containing neutral buffer containing 9% by mass of sodium chloride, it can be easily adjusted to 0.9% by mass by using 1/10 of this.
(V) Three-dimensional gelation The hybrid collagen buffer solution is incubated at a temperature of 30 to 40 ° C, more preferably 35 to 37 ° C for 10 minutes to 2 hours, more preferably 30 to 60 minutes. Through this process, it was found that type IV collagen, which had not conventionally associated unless it was 4 ° C., was associated and gelled in the presence of type I collagen. That is, type I collagen and type IV collagen can be simultaneously gelled at 37 ° C., which is the fibrosis temperature of type I collagen. Moreover, in the conventional method, it took a long time of 5 days to gel the type IV collagen, but according to the present invention, it can be gelled in an extremely short time of 2 hours or less. Moreover, the three-dimensional structure is a fibrous structure of type I collagen in which a membrane of type IV collagen is formed, and is similar to the network structure of type IV collagen present in the basement membrane. As a result, the hybrid gel of the present invention can well maintain the characteristics of type IV collagen present in the basement membrane.
(Vi) Addition of laminin Laminin, which is a basement membrane component, can be added to the type I-IV collagen hybrid gel of the present invention, whereby a hybrid gel more closely resembling the basement membrane can be prepared. .
ラミニンを結合する方法にも、特に限定はないが、好ましくは、前記３次元ゲルを形成した後に、３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートする。基底膜では、ラミニンも会合体を形成するが、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルにおいて、ラミニンが結合するか否かは不明であった。本発明では、混成コラーゲン溶液にラミニン溶液を混合するのではなく、一端、３次元ゲルを形成した後にラミニン溶液を添加し、これを上記条件でインキュベートすることで、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルにラミニンを結合しうることを見出した。 The method for binding laminin is not particularly limited, but preferably, after forming the three-dimensional gel, laminin is added to the three-dimensional gel so that the concentration is 10 to 200 μg / ml, and the temperature is 30 to 40. Incubate for 1-24 hours at 0C. In the basement membrane, laminin also forms an aggregate, but it is unclear whether laminin binds in a three-dimensional gel composed of type I collagen and type IV collagen. In the present invention, instead of mixing the laminin solution into the mixed collagen solution, a laminin solution is added after forming a three-dimensional gel at one end, and this is incubated under the above conditions, so that a type I-IV collagen mixed gel is obtained. It was found that laminin can be combined.
なお、ラミニンを添加するＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、３次元ゲルを構成するためラミニンを添加した後にこれを撹拌することはできない。しかしながら、３次元ゲル上にラミニンを重層してインキュベートすると、重層したラミニンがゲルと結合し、保持される。インキュベートしたのち、緩衝液や細胞培養液で３次元ゲルを洗浄すれば、ラミニン結合Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを調製することができる。 In addition, since the type I-IV type collagen hybrid gel to which laminin is added constitutes a three-dimensional gel, it cannot be stirred after laminin is added. However, when laminin is overlaid and incubated on a three-dimensional gel, the overlaid laminin binds to and is retained by the gel. If the three-dimensional gel is washed with a buffer solution or a cell culture solution after incubation, a laminin-binding type I-IV type collagen hybrid gel can be prepared.
ラミニンは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などに溶解したものを使用することが好ましい。
（６）細胞培養プレート
本発明における細胞培養プレートを構成する支持体とは、細胞培養に使用され、かつＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを固定できるものを広く含む。したがって、チップ、アレイ、マイクロタイタープレートやマイクロウェルプレートなどのプレート、シャーレ、スライドグラス、フィルム、ビーズなども含まれる。
It is preferable to use laminin that is dissolved in a phosphate buffer, a tris buffer, or the like.
(6) Cell Culture Plate The support constituting the cell culture plate in the present invention widely includes those used for cell culture and capable of fixing a type I-IV type collagen hybrid gel. Therefore, chips, arrays, plates such as microtiter plates and microwell plates, petri dishes, slide glasses, films, beads and the like are also included.
また、支持体への固定方法は化学的結合のほかに物理的な結合であってもよい。支持体として使用する材料としては、例えば、ガラス、天然および合成ポリマー、金属（合金も含まれる）などを例示することができ、これらは２種以上を組み合わせてなる複合体であってもよい。 Further, the fixing method to the support may be physical bonding in addition to chemical bonding. Examples of the material used as the support include glass, natural and synthetic polymers, metals (including alloys), and the like, and these may be composites formed by combining two or more kinds.
前記ポリマーとしては、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどを例示することができる。 Examples of the polymer include polyethylene, ethylene, polypropylene, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene. Acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile butadiene styrene copolymer, silicone resin, polyphenylene oxide, polysulfone and the like can be exemplified.
また、本発明では、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜も支持体として使用することができる。
本発明の細胞培養プレートは、細胞培養用の支持体に前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルがコーティングされたものである。好ましくは、前記混成ゲルが３次元ゲルを形成するものである。３次元ゲルによってＩＶ型コラーゲンの特性が発揮され、基底膜に近似する培養環境を形成しうるからである。なお、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、前記支持体の全面にコーティングされている必要はなく、少なくとも細胞培養面にコーティングされていればよい。
本発明の細胞培養プレートは、上記したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとから３次元ゲルを調製する方法に準じて、調製することができる。
In the present invention, a membrane used for blotting, such as a nitrocellulose membrane, a nylon membrane, or a PVDF membrane, can also be used as a support.
In the cell culture plate of the present invention, a support for cell culture is coated with the type I-IV collagen hybrid gel. Preferably, the hybrid gel forms a three-dimensional gel. This is because the characteristics of type IV collagen are exhibited by the three-dimensional gel, and a culture environment similar to the basement membrane can be formed. The type I-IV type collagen hybrid gel does not need to be coated on the entire surface of the support, and may be coated at least on the cell culture surface.
The cell culture plate of the present invention can be prepared according to the above-described method for preparing a three-dimensional gel from type I collagen and type IV collagen.
具体的には、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、これを細胞培養プレートに載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これにより３次元ゲルを形成することを特徴とする。
Specifically, with respect to 100 parts by mass of a type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, a type I collagen solution 100 to 100 having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml. 500 parts by mass are mixed at a temperature of 0 to 4 ° C. to prepare a hybrid collagen solution,
A sodium chloride-containing neutral buffer solution is added to the hybrid collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C., so that the sodium chloride concentration of the hybrid collagen solution is 0.9% by mass, and this is added to the cell culture plate. Mount and incubate for 10 minutes to 2 hours at 30-40 ° C. and CO 2 conditions. Thus, a three-dimensional gel is formed.
混成コラーゲン緩衝溶液の調製までは、前記したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法と同様に操作する。相違点は、得られた溶液を、細胞培養プレートに載せて、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする点にある。これにより、細胞培養プレート上に３次元ゲルを形成することができる。 Until the preparation of the hybrid collagen buffer solution, the same operation as the above-described method for preparing a three-dimensional gel using a type I-IV collagen hybrid gel is performed. The difference is that the obtained solution is placed on a cell culture plate and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. under CO 2 conditions for 10 minutes to 2 hours. Thereby, a three-dimensional gel can be formed on the cell culture plate.
なお、同様にして、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートして、細胞培養プレートに、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルを形成することができる。
本発明の細胞培養プレートを使用して、幹細胞を培養することができる。なお、幹細胞とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。幹細胞としては、胚性幹（ＥＳ）細胞や組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）、生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞などがある。自己複製能を有し、多分化能を有すれば、人工的に作製した細胞、たとえば、融合細胞、再プログラム化された細胞、人工多能性幹細胞なども、幹細胞に含まれる。
（７）人工基底膜
本発明では、前記Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを使用して、人工基底膜を調製することができる。なお、人工基底膜とは、生体の基底膜を模したものであり、例えば、前記細胞培養プレートは、人工基底膜を表面に有する細胞培養プレートである。
Similarly, laminin is added to the three-dimensional gel so as to have a concentration of 10 to 200 μg / ml, and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. for 1 to 24 hours to bind laminin to the cell culture plate. A three-dimensional gel made of type I collagen and type IV collagen can be formed.
Stem cells can be cultured using the cell culture plate of the present invention. The stem cell refers to a cell having self-replicating ability and having pluripotency (ie, pluripotency). Stem cells are usually able to regenerate the tissue when the tissue is damaged. Stem cells include embryonic stem (ES) cells, tissue stem cells (also referred to as tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), germ stem cells, and iPS cells. If the cells have self-replicating ability and pluripotency, artificially prepared cells such as fusion cells, reprogrammed cells, and induced pluripotent stem cells are also included in the stem cells.
(7) Artificial Basement Membrane In the present invention, an artificial basement membrane can be prepared using the type I-IV type collagen hybrid gel. The artificial basement membrane imitates a biological basement membrane. For example, the cell culture plate is a cell culture plate having an artificial basement membrane on the surface.
このような人工基底膜は、上記したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとから３次元ゲルを調製する方法に準じて、調製することができる。
具体的には、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌのゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン溶液１００質量部に対して、濃度０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌの線維形成能を有するＩ型コラーゲン溶液１００〜５００質量部を、温度０〜４℃で混合して混成コラーゲン溶液を調製し、
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
これを平板に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートする。これによりして３次元ゲルを形成することを特徴とする。
Such an artificial basement membrane can be prepared according to the above-described method for preparing a three-dimensional gel from type I collagen and type IV collagen.
Specifically, with respect to 100 parts by mass of a type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, a type I collagen solution 100 to 100 having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml. 500 parts by mass are mixed at a temperature of 0 to 4 ° C. to prepare a hybrid collagen solution,
Sodium chloride-containing neutral buffer solution is added to the hybrid collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C., so that the sodium chloride concentration of the hybrid collagen solution is 0.9% by mass,
This is placed on a plate and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. under CO 2 conditions for 10 minutes to 2 hours. Thus, a three-dimensional gel is formed.
混成コラーゲン緩衝溶液の調製までは、前記したＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルによる３次元ゲルの調製方法と同様に操作する。相違点は、得られた溶液を、平板に載せて、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートし、前記平板から前記３次元ゲルを回収する点にある。これにより、３次元ゲルのみからなる人工基底膜を調製することができる。 Until the preparation of the hybrid collagen buffer solution, the same operation as the above-described method for preparing a three-dimensional gel using a type I-IV collagen hybrid gel is performed. The difference is that the obtained solution is placed on a flat plate, incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. under CO 2 conditions for 10 minutes to 2 hours, and the three-dimensional gel is recovered from the flat plate. Thereby, an artificial basement membrane consisting only of a three-dimensional gel can be prepared.
なお、同様にして、前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートして、平板に、ラミニンを結合したＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとからなる３次元ゲルからなる人工基底膜を形成することができる。
In the same manner, laminin was added to the three-dimensional gel to a concentration of 10 to 200 μg / ml, incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. for 1 to 24 hours, and laminin was bound to the plate. An artificial basement membrane composed of a three-dimensional gel composed of type collagen and type IV collagen can be formed.
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。
(製造例１)
牛の真皮を５％の食塩水で洗浄して可溶性タンパクを除去した。この牛皮を、ｐＨ８のトリプシン水溶液に浸し、随時撹拌しながら２５℃で９０時間放置した。ついで、牛皮を流水で水洗して酵素を除去し、ｐＨ２〜３の酢酸酸溶液に浸漬し、２０〜２５℃で２４時間撹拌して粘稠な溶液を得た。抽出したＩ型コラーゲンは、酸性、中性下での塩析を繰り返して精製した。
EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, these Examples do not restrict | limit this invention at all.
(Production Example 1)
The cow dermis was washed with 5% saline to remove soluble proteins. This cowhide was immersed in an aqueous trypsin solution having a pH of 8, and allowed to stand at 25 ° C. for 90 hours while stirring as necessary. Next, the cowhide was washed with running water to remove the enzyme, immersed in an acetic acid solution having a pH of 2 to 3, and stirred at 20 to 25 ° C. for 24 hours to obtain a viscous solution. The extracted type I collagen was purified by repeating salting out under acidic and neutral conditions.
このＩ型コラーゲンを、濃度０．１％に調整し、生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液）、ｐＨ７．６の条件で３７℃に加温した。前記加温により会合して線維状構造物を形成し、肉眼で白く濁ったゲル状の再生線維が形成された。 This type I collagen was adjusted to a concentration of 0.1% and heated to 37 ° C. under the condition of a physiological salt concentration buffer (0.9% NaCl-containing phosphate buffer), pH 7.6. A fibrous structure was formed by associating by the heating, and a gel-like regenerated fiber that was white and cloudy with the naked eye was formed.
なお、得られたＩ型コラーゲンを５％ポリアクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、α１、α２の２種類の異なったα鎖、およびα鎖の２量体であるβ鎖の存在が確認された。結果を図１のＢに示す。
(製造例２)
５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＮ−エチルマレイミド、０．１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオライドからなるプロテアーゼインヒビター混合溶液を含むｐＨ７．２の２０ｍＭのリン酸ナトリウムで牛眼球レンズカプセルを洗浄した。続いて抽出工程として、前記眼球レンズカプセル１ｇについて５〜１０ｍｌの０．５Ｍの酢酸を添加してホモジナイズし３日間、4℃で撹拌した。遠心分離後、上澄みを４℃で保存した。上澄みを１ｍＭの塩酸で透析して前記インヒビターを除去してＩＶ型コラーゲンを得た。なお、ＩＶ型コラーゲンは、凍結乾燥して保存した。
When the obtained type I collagen was subjected to SDS-PAGE of 5% polyacrylamide, the presence of two different α chains, α1 and α2, and a β chain that is a dimer of α chains was confirmed. It was. The results are shown in FIG.
(Production Example 2)
The bovine ocular lens capsule was washed with 20 mM sodium phosphate, pH 7.2, containing a protease inhibitor mixed solution consisting of 5 mM EDTA, 1 mM N-ethylmaleimide, and 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Subsequently, as an extraction step, 5 g of 0.5 M acetic acid was added to 1 g of the above-mentioned eyeball lens capsule, homogenized, and stirred for 3 days at 4 ° C. After centrifugation, the supernatant was stored at 4 ° C. The supernatant was dialyzed against 1 mM hydrochloric acid to remove the inhibitor to obtain type IV collagen. The type IV collagen was lyophilized and stored.
上記ＩＶ型コラーゲンを濃度１ｍｇ／ｍｌ、生理塩濃度緩衝液（０．９％ＮａＣｌ含有リン酸緩衝液）、ｐＨ７．６に調整し、４℃、５日放置したところ会合してゲル化した。
得られたＩＶ型コラーゲンで、還元状態の５％ポリアクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、１６０〜１８０ｋＤａ付近に３本のＩＶ型コラーゲンα鎖由来のバンドが見られた。結果を図１のＣに示す。
（実施例１）
Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと製造例２で得たＩＶ型コラーゲンとからコラーゲン混成ゲルを作成した。
The type IV collagen was adjusted to a concentration of 1 mg / ml, a physiological salt concentration buffer (0.9% NaCl-containing phosphate buffer), pH 7.6, and allowed to stand at 4 ° C. for 5 days to form a gel.
When the obtained type IV collagen was subjected to SDS-PAGE of 5% polyacrylamide in a reduced state, three bands derived from type IV collagen α chain were observed in the vicinity of 160 to 180 kDa. The results are shown in FIG.
Example 1
Preparation of Type I-IV Type Collagen Hybrid Gel (1) A collagen hybrid gel was prepared from type I collagen obtained in Production Example 1 and type IV collagen obtained in Production Example 2 according to the following protocol.
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）５６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、製造例２で得たＩＶ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。 First, in ice-cooled ultrapure water (Millipore, “Milli-Q water”) 56 μl, 10 μl concentration PBS (−) 24 μl containing 9% by mass of sodium chloride, type I collagen obtained in Production Example 1 ( 4.5 mg / ml) 80 μl and type IV collagen (1.5 mg / ml) obtained in Production Example 2 were added in the order of 80 μl on ice to confirm the pH.
（２） この溶液をエッペンドルフチューブに入れ、５％ＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートしてゲル化させた。
その後、ゲル上に静かにジルコニアビーズをのせ、１時間後に観察した。ゲルが形成され、図２のＡのようにビーズがゲルの上面に保持された。なお、ゲル形成が不十分な場合には、図２のＢに示すようにビーズが低面に落下する。なお、図２のＣは、これを模式的に示す図である。
（実施例２）
Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混合物およびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと製造例２で得たＩＶ型コラーゲンとから本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを作成した。
(2) This solution was placed in an Eppendorf tube and incubated at 37 ° C. for 1 hour under 5% CO 2 condition to cause gelation.
Thereafter, the zirconia beads were gently placed on the gel and observed after 1 hour. A gel was formed and the beads were retained on the top surface of the gel as in FIG. In addition, when gel formation is inadequate, a bead falls to a low surface as shown to B of FIG. FIG. 2C schematically shows this.
(Example 2)
Preparation of Type I-IV Type Collagen Mixture and Well Plate (1) According to the following protocol, type I-type IV collagen of the present invention is obtained from type I collagen obtained in Production Example 1 and type IV collagen obtained in Production Example 2. A hybrid gel was made.
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）５６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、製造例２で得たＩＶ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。 First, in ice-cooled ultrapure water (Millipore, “Milli-Q water”) 56 μl, 10 μl concentration PBS (−) 24 μl containing 9% by mass of sodium chloride, type I collagen obtained in Production Example 1 ( 4.5 mg / ml) 80 μl and type IV collagen (1.5 mg / ml) obtained in Production Example 2 were added in the order of 80 μl on ice to confirm the pH.
（２） 前記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートを、ＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（比較例１）
コラーゲンＩ型ゲルおよびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンからＩ型コラーゲンゲルを作成した。
(2) 50 μl / well of the above solution was dispensed into a 96-well plate (trade name “96 well cell culture plate” manufactured by Costar). Subsequently, this well plate was incubated at 37 ° C. for 1 hour under CO 2 condition to gel the solution, and a gel-coated well plate was prepared.
(Comparative Example 1)
Preparation of collagen type I gel and well plate (1) A type I collagen gel was prepared from type I collagen obtained in Production Example 1 according to the following protocol.
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）１３６μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌの順に氷上で添加した。ｐＨを確認したところ、ｐＨ７．６であった。 First, in 136 μl of ice-cooled ultrapure water (Millipore, “MilliQ water”), 24 μl of 10-fold concentration PBS (−) containing 9% by mass of sodium chloride, type I collagen obtained in Production Example 1 ( 4.5 mg / ml) was added in the order of 80 μl on ice. When pH was confirmed, it was pH 7.6.
（２） 上記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートをＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（比較例２）
Ｉ型−ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲン型混成ゲルおよびウェルプレートの調製
（１） 以下のプロトコルに従い、製造例１で得たＩ型コラーゲンと酵素抽出ウシＩＶ型コラーゲンより混成コラーゲンゲルを作成した。酵素抽出ウシＩＶ型コラーゲンは、ゲル化能を有しなかった。
(2) 50 μl / well of the above solution was dispensed into a 96-well plate (trade name “96 well cell culture plate” manufactured by Costar). Subsequently, the well plate was incubated at 37 ° C. for 1 hour under CO 2 condition to gel the solution, thereby preparing a gel-coated well plate.
(Comparative Example 2)
Preparation of type IV collagen type hybrid gel and well plate not having gelation ability (1) In accordance with the following protocol, a hybrid collagen gel is prepared from type I collagen obtained in Production Example 1 and enzyme-extracted bovine type IV collagen did. Enzyme-extracted bovine type IV collagen did not have gelling ability.
まず、氷冷した超純水（ミリポア社製、「ミリＱ水」）１１２μｌに、塩化ナトリウムを９質量％含有する１０倍濃度のＰＢＳ（−）２４μｌ、製造例１で得たＩ型コラーゲン（４．５ｍｇ／ｍｌ）８０μｌ、酵素抽出ＩＶ型コラーゲン（胎盤より、非特許文献１に記載のＳａｇｅらの方法によってペプシン酵素によって抽出した、ゲル化能を有さないＩＶ型コラーゲン：５ｍｇ／ｍｌ）２４μｌの順に氷上で添加し、ｐＨを確認した。ｐＨは７．６であった。 First, 112 μl of ice-cooled ultrapure water (Millipore, “MilliQ Water”), 24 μl of 10-fold PBS (−) containing 9% by mass of sodium chloride, type I collagen obtained in Production Example 1 ( 4.5 mg / ml) 80 μl, enzyme-extracted type IV collagen (type IV collagen without gelling ability extracted from the placenta by the pepsin enzyme by the method of Sage et al. Described in Non-Patent Document 1: 5 mg / ml) 24 μl was added on ice in order to check the pH. The pH was 7.6.
（２） 上記溶液を９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、商品名「９６ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ」）に、５０μｌ／ウエル分注した。ついで、このウェルプレートをＣＯ2条件下に、３７℃で１時間インキュベートし、前記溶液をゲル化させ、ゲルコーティングされたウェルプレートを調製した。
（実施例３）
実施例２、比較例１、比較例２で作成したゲルコーティングウェルプレートを、下記方法で調製した後に走査型電子顕微鏡で観察した。
(2) 50 μl / well of the above solution was dispensed into a 96-well plate (trade name “96 well cell culture plate” manufactured by Costar). Subsequently, the well plate was incubated at 37 ° C. for 1 hour under CO 2 condition to gel the solution, thereby preparing a gel-coated well plate.
(Example 3)
The gel-coated well plates prepared in Example 2, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were prepared by the following method and then observed with a scanning electron microscope.
（１）上記ウェルプレートの各ウェルのゲル上に、２％グルタルアルデヒド５０μｌを添加し、２時間、４℃で静置した。
（２）二次固定として１％四酸化オスミウムを添加し、１時間室温で静置した。
(1) 50 μl of 2% glutaraldehyde was added to the gel of each well of the well plate and left at 4 ° C. for 2 hours.
(2) As secondary fixation, 1% osmium tetroxide was added, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
（３）５０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、７０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、８０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を１回、９０％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回、９５％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回、９９．５％エタノール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回行い、脱水を行った。 (3) 50% ethanol 100 μl / well 10 minutes, 1 time 70% ethanol 100 μl / well 10 minutes, 1 time 80% ethanol 100 μl / well 10 minutes 1 time, 90% ethanol 100 μl / well The wells were left for 10 minutes twice, 95% ethanol 100 μl / well 10 minutes left twice, 99.5% ethanol 100 μl / well 10 minutes left twice, and then dehydrated.
（４）ついで、ｔ−ブチルアルコール１００μｌ／ウエル１０分静置を２回行って置換した。
（５）置換後、終夜凍結乾燥した。
(4) Next, 100 μl of t-butyl alcohol / well for 10 minutes was allowed to stand twice for replacement.
(5) After the replacement, it was freeze-dried overnight.
（６）凍結乾燥サンプルを、２０秒白金コートした後、１５ｋＶ、１００００倍で走査型電子顕微鏡（ＪＣＭ−５７００（ＪＥＯＬ））で観察した。結果を図３に示す。実施例２のゲルを図３Ａに、比較例１のゲルを図３Ｂに、比較例２のゲルを図３Ｃに示す。 (6) The freeze-dried sample was coated with platinum for 20 seconds, and then observed with a scanning electron microscope (JCM-5700 (JEOL)) at 15 kV and 10,000 times. The results are shown in FIG. The gel of Example 2 is shown in FIG. 3A, the gel of Comparative Example 1 is shown in FIG. 3B, and the gel of Comparative Example 2 is shown in FIG. 3C.
(結果)
（１） 図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃに示すように、Ｉ型コラーゲンは線維状であり、実施例２、比較例１、比較例２の各ゲルでは、いずれも線維状物が観察された。各ゲルは、Ｉ型コラーゲンの線維状物によって基本構造が構築されると推察される。
(result)
(1) As shown in FIG. 3A, FIG. 3B, and FIG. 3C, type I collagen is fibrous, and in each of the gels of Example 2, Comparative Example 1, and Comparative Example 2, fibrous substances were observed. . Each gel is presumed to have a basic structure formed by filaments of type I collagen.
（２） 図３Ａに示すように、実施例２の本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルには、Ｉ型コラーゲン線維と共に膜状の構成物が観察された。図３Ｂとの比較により、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンは線維形成能を有するＩ型コラーゲンと混合することで、Ｉ型コラーゲン線維間に膜状物を形成しうることが判明した。 (2) As shown in FIG. 3A, in the type I-IV type collagen hybrid gel of Example 2 of the present invention, a membrane-like composition was observed together with type I collagen fibers. Comparison with FIG. 3B revealed that type IV collagen having gelling ability can form a membrane between type I collagen fibers by mixing with type I collagen having fiber forming ability.
（３） 一方、図３Ｃに示すように、Ｉ型コラーゲン線維とゲル化能を有さない酵素抽出ＩＶ型コラーゲンを加えた比較例２のゲルは、線維状の構造物のみであり、膜状の構造物は存在しなかった。ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンはゲル化能を有するものと会合能が相違し、Ｉ型コラーゲンからなる線維と線維との間にＩＶ型コラーゲンによる膜状物を形成することができなかった。
（実施例４）
（１）製造例１で得たＩ型コラーゲン（１．５ｍｇ／ｍｌ）に、製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを、氷冷しつつ０ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ加えた。
(3) On the other hand, as shown in FIG. 3C, the gel of Comparative Example 2 to which enzyme-extracted type IV collagen that does not have gelling ability and type I collagen fibers is only a fibrous structure and is in the form of a film. There was no structure. Type IV collagen that does not have gelling ability differs from that having gelling ability in associating ability, and it was not possible to form a membrane of type IV collagen between fibers composed of type I collagen. .
Example 4
(1) Type I collagen obtained in Production Example 1 (1.5 mg / ml) and type IV collagen having gelation ability obtained in Production Example 2 were cooled to 0 mg / ml and 0.5 mg / ml while cooling with ice. 1.0 mg / ml was added.
（２）実施例１と同様に操作して、氷冷しながら塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、その後、３７℃で１時間インキュベートを行ってゲル化させた。
（３）得られたゲルをＰＢＳで３回洗浄した後に、５０μｇ／ｍｌとなるようにラミニン１１１またはラミニン５１１溶液を添加した。
(2) By operating in the same manner as in Example 1, the sodium chloride concentration was adjusted to 0.9% by mass and neutralized while cooling with ice, and then incubated at 37 ° C. for 1 hour for gelation.
(3) After the obtained gel was washed 3 times with PBS,
（４）３７℃で２時間インキュベートし、ついでＰＢＳで２０分間、３回洗浄した。その後、ゲルを２倍濃度の還元バッファー（メルカプトエタノール含有）に溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルに結合したラミニンをウェスタンブロットで検出した。結果を図４に示す。 (4) The plate was incubated at 37 ° C. for 2 hours and then washed 3 times with PBS for 20 minutes. Thereafter, the gel was dissolved in a 2-fold concentration reducing buffer (containing mercaptoethanol) and then subjected to SDS-PAGE, and laminin bound to the gel was detected by Western blot. The results are shown in FIG.
（５）ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン０．５ｍｇ／ｍｌ混合した混成ゲルに、ラミニン１１１、ラミニン５１１を添加したものを、実施例４と同様の方法で固定化した後に、実施例４と同様に走査型電子顕微鏡観察を行った。結果を図５に示す。
(比較例３)
製造例２で得たゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンに代えて、ゲル化能を有さない酵素抽出ＩＶ型コラーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）を１．０ｍｇ／ｍｌ加えた以外は、実施例４と同様に操作してゲルを調製し、実施例４と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図４に示す。
(結果)
（１） 図４のＡは、線維形成能を有するＩ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＢは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＣは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルであり、図４のＤは、前記Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有しない酵素抽出ＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルである。
(5) After immobilizing
(Comparative Example 3)
Example 4 is the same as Example 4 except that 1.0 mg / ml of enzyme-extracted type IV collagen having no gelling ability (5 mg / ml) was added instead of the type IV collagen having gelling ability obtained in Production Example 2. A gel was prepared by operating in the same manner, and SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 4. The results are shown in FIG.
(result)
(1) A in FIG. 4 is a gel prepared by mixing 0 mg / ml type IV collagen having gelling ability with type I collagen having fibrogenic ability, and B in FIG. FIG. 4C shows a mixture of type IV collagen having gelling ability and 1.0 mg / ml mixed with type I collagen. FIG. 4D is a gel obtained by mixing 1.0 mg / ml of enzyme-extracted type IV collagen having no gelling ability with respect to the type I collagen.
図４のＡ〜Ｃから、Ｉ型コラーゲンとゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルでは、Ｉ型コラーゲンに対する前記ＩＶ型コラーゲンの混合量に応じて、ラミニンの結合量が増加した。このようなラミニンの結合量の増加は、ラミニン１１１、ラミニン５１１の双方で同様に観察された。
From A to C in FIG. 4, in the hybrid gel of type I collagen and type IV collagen having gelling ability, the amount of laminin binding increased according to the amount of type IV collagen mixed with type I collagen. Such an increase in the amount of laminin binding was similarly observed in both
（２） 図４のＣと図４のＤとの比較から、Ｉ型コラーゲンに対してゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンを１．０ｍｇ／ｍｌ混合したゲルでは、ラミニン１１１、ラミニン５１１の双方でその結合量が少なかった。このことから、抽出方法の異なるＩＶ型コラーゲンは、ラミニンの結合量が相違することが判明し、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを使用することでＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混成ゲルにラミニンを効率的に組込めることが推察された。
(2) From a comparison between FIG. 4C and FIG. 4D, both
（３） 図５Ａは、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンを０．５ｍｇ／ｍｌ混合した混成ゲルにラミニン１１１を添加したものであり、図５Ｂは、ラミニン５１１を添加したものである。図５Ａ、図５Ｂの双方において、ラミニンの添加によって線維間に膜状物の形成が観察された。一方、図５Ａでは均一に線維間に薄い膜構造が形成されるのに対し、図５Ｂでは、図５Ａよりも均一性が低く、添加したラミニンの種類によってＩ型ゲルに付随する膜構造が異なっていた。
（実施例５）
（１） Ｉ型コラーゲンとゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンとの配合割合を３：１に変更した以外は、実施例２と同様の方法でＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを調製し、実施例２と同様にしてゲルコーティングウェルプレートを製造した。
(3) FIG. 5A shows a case where
(Example 5)
(1) A type I-IV type collagen hybrid gel was prepared in the same manner as in Example 2 except that the blending ratio of type I collagen and type IV collagen having gelling ability was changed to 3: 1. A gel coated well plate was prepared as in Example 2.
（２） グラスゴー最小必須培地（ギブコ社製）に、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウムを添加して培地を調製した。 (2) A medium was prepared by adding 10% fetal calf serum, non-essential amino acids, penicillin and streptomycin, and sodium pyruvate to Glasgow minimum essential medium (manufactured by Gibco).
ＥＳ細胞株（ｈｔ７）を、３．８×１０3ｃｅｌｌｓ／９６ウェル分注し、３７℃、５％、ＣＯ2条件下で５日間培養して自発的に分化させた。
１日１回の頻度で培地交換行うと共に、細胞の形態を観察した。
The ES cell line (ht7) was dispensed at 3.8 × 10 3 cells / 96 well, and cultured for 5 days at 37 ° C. under 5% CO 2 to differentiate spontaneously.
The medium was changed once a day, and the morphology of the cells was observed.
ＥＳ細胞コロニーの形態を図６に示す。
また、培養５日目の細胞から全ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって分化マーカー遺伝子の発現を調べた。遺伝子発現レベルを図７に示す。
(比較例４)
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルに代えて、比較例１のコラーゲンＩ型ゲル、比較例２のＩ型−ゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲン型混成ゲルを使用した以外は実施例５と同様に操作してゲルコーティングウェルプレートを製造して、マウスＥＳ細胞株（ｈｔ７）を培養した。また、マトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン製）を終濃度５ｍｇ/ｍｌで５０μｌ／ウェル加え、３７℃１時間ゲル化させたゲルコーティングウェルプレートを製造して、マウスＥＳ細胞株（ｈｔ７）を培養した。
The morphology of the ES cell colony is shown in FIG.
Further, total RNA was extracted from the cells on the fifth day of culture, and the expression of the differentiation marker gene was examined by quantitative RT-PCR. The gene expression level is shown in FIG.
(Comparative Example 4)
Example except that the collagen type I gel of comparative example 1 and the type IV collagen type hybrid gel without type I-gelling ability of comparative example 2 were used instead of the type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention. A gel-coated well plate was produced in the same manner as in Example 5, and a mouse ES cell line (ht7) was cultured. Further, Matrigel ™ (manufactured by Becton Dickinson) was added at 50 μl / well at a final concentration of 5 mg / ml to produce a gel-coated well plate that was gelled at 37 ° C. for 1 hour, and a mouse ES cell line (ht7) was cultured.
また、実施例５と同様にして、各ゲルコートウェルプレートについて、ＥＳ細胞コロニーの形態と遺伝子発現レベルとを観察した。
(結果)
コロニーの形態観察
（１） 図６Ａは、比較例１のＩ型コラーゲンゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｂは、実施例２のＩ型−ゲル化能を有するＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６Ｃは比較例２のＩ型−酵素抽出ＩＶ型混成ゲルでのＥＳ細胞のコロニー、図６ＤはマトリゲルでのＥＳ細胞のコロニーである。
Further, in the same manner as in Example 5, the morphology of the ES cell colony and the gene expression level were observed for each gel-coated well plate.
(result)
Observation of colony morphology (1) FIG. 6A is a colony of ES cells in type I collagen gel of Comparative Example 1, and FIG. 6B is an ES cell in type IV hybrid gel having type I-gelling ability of Example 2. 6C is an ES cell colony in the type I-enzyme extraction type IV hybrid gel of Comparative Example 2, and FIG. 6D is an ES cell colony in Matrigel.
図６Ａに示すように、Ｉ型コラーゲンゲルでは比較的少数の大きいコロニーが形成されていた。一方、図６Ｂに示すように、本発明のＩ型−ＩＶ型混成ゲルでは比較的小型のコロニーが多数個形成されており、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンの配合によって、ＥＳ細胞の応答が異なることが判明した。 As shown in FIG. 6A, a relatively small number of large colonies were formed in the type I collagen gel. On the other hand, as shown in FIG. 6B, a large number of relatively small colonies are formed in the type I-IV hybrid gel of the present invention, and the response of ES cells is improved by the formulation of type IV collagen having gelling ability. It turned out to be different.
（２） 図６Ｃのゲルは、Ｉ型−ゲル化能を有しないＩＶ型混成ゲルである。図６Ｃのコロニーは、比較的大きなコロニーが散在する点で図６Ｂのコロニーと相違する。図６Ｂのコロニーは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルであり、ＩＶ型コラーゲンの抽出方法によって、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲル上でのＥＳ細胞の応答が異なることが判明した。特に、図６Ｃのゲルにはゲル化能を有しないＩＶ型コラーゲンが含まれる点で図６Ａのゲルと相違するが、両者のコロニーは比較的大きなものが散在する点で共通する。このことは、図６Ｃで使用した酵素抽出ＩＶ型コラーゲンとＩ型コラーゲンの混成ゲルでは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルで惹起されるＥＳ細胞の応答がみられないことを示している。 (2) The gel in FIG. 6C is a type IV hybrid gel that does not have type I-gelling ability. The colony in FIG. 6C differs from the colony in FIG. 6B in that relatively large colonies are scattered. The colony in FIG. 6B is the type I-IV collagen hybrid gel of the present invention, and it was found that the response of ES cells on the type I-IV collagen hybrid gel differs depending on the type IV collagen extraction method. In particular, the gel of FIG. 6C is different from the gel of FIG. 6A in that type IV collagen having no gelling ability is included, but both colonies are common in that relatively large ones are scattered. This indicates that the enzyme-extracted type IV collagen and type I collagen hybrid gel used in FIG. 6C does not show the response of ES cells elicited by the type I-IV collagen hybrid gel of the present invention. Yes.
（３） 図６Ｄは、マトリゲルでＥＳ細胞を培養したコロニーであり、前記ゲルには、基底膜の構成成分であり、上皮細胞の接着を支持し、分化形質などを保持する機能を有することが知られているラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されている。図６Ｄのコロニーは、小さなコロニーが散在する点で図６Ｂのコロニーと共通する。このことは、本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルが、それ自体で、基底膜成分が配合されたゲルと類似するＥＳ細胞の応答を惹起できることを示すものである。
マウスＥＳ細胞の分化マーカー遺伝子発現の解析
（１） マウスＥＳ細胞、実施例５で培養したＥＳ細胞、比較例４で培養したＥＳ細胞について、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−３／４、初期エピブラスト（外胚葉）分化マーカーであるＦｇｆ５、および中胚葉分化マーカーであるＦｌｋ１の発現を観察した。図７Ａは、Ｏｃｔ−３／４の発現を、図７Ｂは、Ｆｇｆ５の発現を、図７Ｃは、Ｆｌｋ１の発現を示す図である。
(3) FIG. 6D is a colony obtained by culturing ES cells in Matrigel, and the gel is a component of the basement membrane and has a function of supporting the adhesion of epithelial cells and maintaining a differentiation trait or the like. Known laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin and the like are blended. The colony of FIG. 6D is common to the colony of FIG. 6B in that small colonies are scattered. This indicates that the type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention can elicit an ES cell response similar to that of a gel containing a basement membrane component.
Analysis of mouse ES cell differentiation marker gene expression (1) For mouse ES cells, ES cells cultured in Example 5, and ES cells cultured in Comparative Example 4, Oct-3 / 4, which is a marker for undifferentiated ES cells, Expression of Fgf5, an early epiblast (ectodermal) differentiation marker, and Flk1, a mesoderm differentiation marker, was observed. FIG. 7A shows the expression of Oct-3 / 4, FIG. 7B shows the expression of Fgf5, and FIG. 7C shows the expression of Flk1.
図７Ａに示すように、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−３／４の発現は、いずれのゲルでもＥＳ細胞より低下していた。いずれのゲルを使用した場合でも、ＥＳ細胞の分化が促進されたことが示唆された。 As shown in FIG. 7A, the expression of Oct-3 / 4, which is a marker for undifferentiated ES cells, was lower than that of ES cells in any gel. It was suggested that the differentiation of ES cells was promoted when any gel was used.
（２） 図７Ｂに示すように、初期エピブラスト（外胚葉）分化マーカーであるＦｇｆ５の発現は、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルおよびマトリゲルで強く誘導されていた。マトリゲルには、分化形質などを保持する機能を有することが知られているラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなどが配合されており、ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲンがこれらの成分と同様の外胚葉への分化促進能を有することが示唆された。 (2) As shown in FIG. 7B, the expression of Fgf5, which is an early epiblast (ectoderm) differentiation marker, was strongly induced in type IV collagen hybrid gel and matrigel having type I-gelling ability. Matrigel is formulated with laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin, etc., which are known to have a function of retaining differentiation characteristics, etc., and type IV collagen having gelling ability is the same ectoderm as these components It was suggested that it has the ability to promote differentiation.
一方、Ｉ型コラーゲンゲルおよびＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルでは、Ｆｇｆ５の発現が低いレベルにとどまっていた。このことは、酵素抽出ＩＶ型コラーゲンによる外胚葉への分化促進能は、Ｉ型コラーゲンと同レベルであることを示唆している。 On the other hand, in type I collagen gel and type I-enzyme-extracted type IV collagen hybrid gel, expression of Fgf5 remained at a low level. This suggests that the ability to promote differentiation into ectoderm by enzyme-extracted type IV collagen is at the same level as that of type I collagen.
（３） 図７Ｃに示すように、中胚葉分化マーカーであるＦｌｋ１の発現は、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルとマトリゲルでは抑制され、Ｉ型コラーゲンゲルおよびＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルでは発現が亢進していた。このことから、Ｉ型コラーゲンは、中胚葉への分化促進能を有し、かつ酵素抽出ＩＶ型コラーゲンもＩ型コラーゲンと同様の中胚葉への分化促進能を有することが示唆された。 (3) As shown in FIG. 7C, the expression of Flk1, which is a mesoderm differentiation marker, is suppressed in type IV collagen mixed gel and matrigel having type I-gelling ability, type I collagen gel and type I-enzyme extraction Expression was enhanced in the type IV collagen hybrid gel. From this, it was suggested that type I collagen has the ability to promote differentiation into mesoderm, and enzyme-extracted type IV collagen also has the ability to promote differentiation into mesoderm similar to type I collagen.
（４） 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃを比較すると、Ｉ型コラーゲンとＩ型−酵素抽出ＩＶ型コラーゲン混成ゲルとは、Ｏｃｔ−３／４、Ｆｇｆ５、Ｆｌｋ１の発現量がいずれも類似する傾向にあった。また、Ｉ型−ゲル化能を有するＩＶ型コラーゲン混成ゲルとマトリゲルとは、上記３種の発現量がいずれも類似する傾向にあった。このことは、Ｉ型コラーゲンに配合したＩＶ型コラーゲンは、抽出方法によってＥＳ細胞の分化に対する生理活性が異なることを示すものである。特に、ＩＶ型コラーゲンを非酵素的に抽出することで、基底膜成分を含有するマトリゲルと類似する分化能が発揮される点に特徴があった。
(4) Comparing FIGS. 7A, 7B, and 7C, type I collagen and type I-enzyme-extracted type IV collagen hybrid gel tend to have similar expression levels of Oct-3 / 4, Fgf5, and Flk1. It was in. In addition, the type IV collagen hybrid gel having type I-gelling ability and the matrigel tended to have similar expression levels of the above three types. This indicates that type IV collagen blended with type I collagen has different physiological activities for ES cell differentiation depending on the extraction method. In particular, non-enzymatic extraction of type IV collagen was characterized in that differentiation ability similar to that of matrigel containing a basement membrane component was exhibited.
本発明のＩ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルは、簡便な操作によって３次元ゲルを形成することができ、前記３次元ゲルは、Ｉ型コラーゲンに由来するゲル強度を保持し、かつＩＶ型コラーゲンによる基底膜成分としての特性を保持するものであり、これを用いて細胞培養プレートを調製すれば、生体の基底膜の環境に近似した培養環境を安価に提供することができ、有用である。 The type I-IV type collagen hybrid gel of the present invention can form a three-dimensional gel by a simple operation, and the three-dimensional gel retains the gel strength derived from type I collagen and is based on type IV collagen. It retains the characteristics as a basement membrane component, and if a cell culture plate is prepared using this, a culture environment that approximates the environment of the basement membrane of a living body can be provided at low cost, which is useful.
Claims (11)
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
ついで、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、Ｉ型−ＩＶ型コラーゲン混成ゲルの調製方法。 For 100 parts by mass of type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, 100 to 500 parts by mass of type I collagen solution having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml, Prepare a mixed collagen solution by mixing at a temperature of 0-4 ° C,
Sodium chloride-containing neutral buffer solution is added to the hybrid collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C., so that the sodium chloride concentration of the hybrid collagen solution is 0.9% by mass,
Next, a method for preparing a type I-IV collagen hybrid gel, which comprises incubating at a temperature of 30 to 40 ° C. for 10 minutes to 2 hours under CO 2 conditions to form a three-dimensional gel.
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
これを細胞培養用の支持体に載せ、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成することを特徴とする、細胞培養プレートの製造方法。 For 100 parts by mass of type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, 100 to 500 parts by mass of type I collagen solution having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml, Prepare a mixed collagen solution by mixing at a temperature of 0-4 ° C,
Sodium chloride-containing neutral buffer solution is added to the hybrid collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C., so that the sodium chloride concentration of the hybrid collagen solution is 0.9% by mass,
A method for producing a cell culture plate, which is mounted on a cell culture support and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. under CO 2 conditions for 10 minutes to 2 hours to form a three-dimensional gel.
前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項８記載の細胞培養プレートの製造方法。 Following the formation of the three-dimensional gel,
The production of a cell culture plate according to claim 8, wherein laminin is added to the three-dimensional gel so as to have a concentration of 10 to 200 µg / ml, and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C for 1 to 24 hours. Method.
前記混成コラーゲン溶液に、温度０〜４℃で、塩化ナトリウム含有中性緩衝液を添加して、前記混成コラーゲン溶液の塩化ナトリウム濃度を０．９質量％、中性とし、
得られた溶液を厚さ０．０１〜３ｍｍとなるように平板にコートし、温度３０〜４０℃、ＣＯ2条件下で１０分〜２時間、インキュベートして３次元ゲルを形成し、
ついで、前記平板から前記３次元ゲルを回収することを特徴とする、人工基底膜の製造方法。 For 100 parts by mass of type IV collagen solution having a gelling ability of 0.05 to 10 mg / ml, 100 to 500 parts by mass of type I collagen solution having a fiber forming ability of 0.05 to 10 mg / ml, Prepare a mixed collagen solution by mixing at a temperature of 0-4 ° C,
Sodium chloride-containing neutral buffer solution is added to the hybrid collagen solution at a temperature of 0 to 4 ° C., so that the sodium chloride concentration of the hybrid collagen solution is 0.9% by mass,
The obtained solution was coated on a flat plate to a thickness of 0.01 to 3 mm and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C. under CO 2 conditions for 10 minutes to 2 hours to form a three-dimensional gel.
Next, a method for producing an artificial basement membrane, wherein the three-dimensional gel is recovered from the flat plate.
前記３次元ゲルに、濃度１０〜２００μｇ／ｍｌとなるようにラミニンを添加し、温度３０〜４０℃で１〜２４時間、インキュベートすることを特徴とする、請求項１０記載の人工基底膜の製造方法。 Following the formation of the three-dimensional gel,
The artificial basement membrane according to claim 10, wherein laminin is added to the three-dimensional gel to a concentration of 10 to 200 µg / ml and incubated at a temperature of 30 to 40 ° C for 1 to 24 hours. Method.
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| WO2014199754A1 (en) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | 国立大学法人大阪大学 | Cell culture equipment coated with laminin fragments in dry state |
| CN113215102A (en) * | 2021-04-01 | 2021-08-06 | 南京医科大学 | Culture medium and culture method for organoid |
| JP2021193910A (en) * | 2020-06-11 | 2021-12-27 | 株式会社ナリス化粧品 | Skin model |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005001090A1 (en) * | 2003-06-26 | 2005-01-06 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method and composition for improving efficiency of transferring nucleic acid into cell |
| WO2006001396A1 (en) * | 2004-06-25 | 2006-01-05 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method and composition for transferring nucleic acid fixed to solid phase into cell |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005001090A1 (en) * | 2003-06-26 | 2005-01-06 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method and composition for improving efficiency of transferring nucleic acid into cell |
| WO2006001396A1 (en) * | 2004-06-25 | 2006-01-05 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method and composition for transferring nucleic acid fixed to solid phase into cell |
| JP2007267602A (en) * | 2004-06-25 | 2007-10-18 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Method and composition for transferring nucleic acid into cell on solid phase and differentiating and inducing the same cell |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6014010257; 佐藤（西内）涼子 外９名: 'Ｉ型／ＩＶ型コラーゲン混成ゲルを基盤とした再構成基底膜の作成と幹細胞培養への応用' 第８２回日本生化学会大会プログラム・講演要旨集のＣＤ-ＲＯＭ , 20090925, ２Ｐ-６６４, 社団法人 日本生化学会 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014199754A1 (en) * | 2013-06-12 | 2014-12-18 | 国立大学法人大阪大学 | Cell culture equipment coated with laminin fragments in dry state |
| JPWO2014199754A1 (en) * | 2013-06-12 | 2017-02-23 | 国立大学法人大阪大学 | Cell culture device coated with laminin fragments in a dry state |
| US10287541B2 (en) | 2013-06-12 | 2019-05-14 | Osaka University | Cell culture vessel coated with laminin fragment in dry state |
| JP2021193910A (en) * | 2020-06-11 | 2021-12-27 | 株式会社ナリス化粧品 | Skin model |
| JP7083866B2 (en) | 2020-06-11 | 2022-06-13 | 株式会社ナリス化粧品 | Skin model |
| CN113215102A (en) * | 2021-04-01 | 2021-08-06 | 南京医科大学 | Culture medium and culture method for organoid |
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| Publication number | Publication date |
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