JP2011072970A - Tablet containing sugar chain trapping material and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、所定の糖鎖捕捉物質を含み、かつ、水に溶解させて一定濃度の糖鎖捕捉物質の溶液とするためのタブレット、およびこのタブレットの用途に関する。 The present invention relates to a tablet that contains a predetermined sugar chain-trapping substance and is dissolved in water to obtain a solution of a sugar chain-trapping substance at a constant concentration, and an application of this tablet.
血清、細胞破砕液、組織などの混合物から、糖鎖などの特定の生体高分子を精製抽出する手段として、これらの分子と特異的に作用する固相担体を用いる方法がある。例えば、特許文献１には、ヒドラジド基含有ポリマービーズなどの糖鎖捕捉用の固相担体（糖鎖捕捉物質）を用いて、糖鎖を精製抽出することができる旨記載されている。また、非特許文献１には、実際に表面に捕捉物質を固定化した固相ビーズを用いて、タンパク質を精製する技術が記載されている。 As a means for purifying and extracting specific biopolymers such as sugar chains from a mixture of serum, cell lysate, tissue, etc., there is a method using a solid phase carrier that specifically acts on these molecules. For example, Patent Document 1 describes that a sugar chain can be purified and extracted using a solid-phase carrier (sugar chain-capturing substance) for capturing a sugar chain, such as a hydrazide group-containing polymer bead. Non-Patent Document 1 describes a technique for purifying a protein using solid phase beads in which a capture substance is actually immobilized on the surface.
ところで、近年において、同時に複数のアッセイを行うためのマルチウェルタイプ、特に９６穴、３８４穴などのハイスループットタイプのマイクロタイタープレートなどが開発され、アッセイ技術の向上が図られている。また、糖鎖の精製抽出も、迅速化ならびに少量サンプルでの実施の要請から、このようなマイクロタイタープレートを用いて行うことが要望されるようになってきている。 By the way, in recent years, multi-well types for performing a plurality of assays simultaneously, in particular, high-throughput type microtiter plates such as 96 holes and 384 holes have been developed, and the assay technology has been improved. In addition, purification and extraction of sugar chains have been demanded to be performed using such a microtiter plate because of demand for speeding up and implementation with a small amount of sample.
そこで、特許文献１に記載されているような糖鎖捕捉物質を用いて、マイクロタイタープレートにて糖鎖の精製抽出を行う場合には、マイクロタイタープレートの各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とする必要がある。このような用途では、糖鎖捕捉物質は通常微粒子の形態のものが使用され、一般的に微粒子は乾燥粉末の状態で提供されることが多い。 Therefore, when a sugar chain capture substance as described in Patent Document 1 is used to purify and extract sugar chains in a microtiter plate, a certain amount of sugar chain capture substance is contained in each well of the microtiter plate. It is necessary to. In such applications, the sugar chain-trapping substance is usually used in the form of fine particles, and the fine particles are generally provided in a dry powder state in many cases.
このような場合、各ウェルにおいて糖鎖捕捉物質を一定量とするために、使用するウェルの数だけ糖鎖捕捉物質の乾燥粉末を秤量して、ウェルごとに分散液を作製する方法がある。この場合、ミリグラムまたはマイクログラムのオーダーで秤量する必要があることから秤量誤差が無視できないという点、およびその秤量誤差が各ウェルについて発生する点、ならびにウェルの数が非常に多いハイスループットアッセイには秤量回数が非常に多くなるという点などから現実的なアプローチとは言えない。 In such a case, there is a method of preparing a dispersion for each well by weighing the dry powder of the sugar chain-trapping substance as many as the number of wells to be used in order to make the sugar chain-trapping substance constant in each well. In this case, the weighing error is not negligible because it must be weighed on the order of milligrams or micrograms, the weighing error occurs for each well, and high throughput assays with a very large number of wells. It cannot be said that it is a realistic approach because the number of times of weighing becomes very large.
一方で、秤量誤差をおよび秤量回数の低減の観点から、一度に大容量の分散液を作製し、その分散液をマイクロタイタープレートの各ウェルに分注するという操作を行う方法が考えられる。しかしながら、ハイスループットアッセイにおいては、分注の回数が非常に多くなり、操作も煩雑になる。また、分注の操作中に分散液中で微粒子が沈殿し、分散液中で糖鎖捕捉物質の分布ができてしまうため、各ウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を導入することが困難であり、これが分注操作時の誤差となる。このような分注操作持の誤差は、各ウェルでのアッセイの評価を困難にし、特にスクリーニング用途でのマイクロタイタープレートでのアッセイでは望ましくない。 On the other hand, from the viewpoint of reducing weighing errors and the number of times of weighing, a method of performing an operation of preparing a large-capacity dispersion at a time and dispensing the dispersion into each well of a microtiter plate can be considered. However, in the high-throughput assay, the number of times of dispensing becomes very large and the operation becomes complicated. In addition, it is difficult to introduce a certain amount of sugar chain-trapping substance into each well because fine particles are precipitated in the dispersion liquid during the dispensing operation, and the sugar chain-trapping substance is distributed in the dispersion liquid. There is an error in dispensing operation. Such errors in the dispensing operation make it difficult to evaluate the assay in each well, and are undesirable in assays on microtiter plates, especially for screening applications.
分散液の入った容器を振とう、あるいは、分散液をスターラー等で撹拌させながら、各ウェルへの分注操作を行うことにより、分注操作時の誤差を低減することは可能である。しかしながら、分注操作の回数を低減させることは困難であり、このような煩雑な操作は、分注操作を含めた全操作の自動化を実現することを困難にしている。 It is possible to reduce the error during the dispensing operation by shaking the container containing the dispersion or stirring the dispersion with a stirrer or the like. However, it is difficult to reduce the number of dispensing operations, and such a complicated operation makes it difficult to automate all operations including the dispensing operation.
このため、マイクロタイタープレートを用いて同時に多くのアッセイを行うことが可能であったとしても、分注操作を含めた全操作の自動化が困難であることから、ハイスループットアッセイを行うことの利点が活かし切れていなかった。 For this reason, even if many assays can be performed simultaneously using a microtiter plate, it is difficult to automate all operations including dispensing operations. It was not fully utilized.
そこで、本発明は、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないような、タブレットおよびその用途を提供するものである。 Therefore, the present invention makes it easy to introduce a predetermined amount of a sugar chain-capturing substance by a simple operation, and does not require a complicated operation when introducing a sugar chain-trapping substance even in a high-throughput assay. And its use.
本発明は、
（１）下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレット。
The present invention
(1) A tablet comprising a sugar chain-trapping substance represented by the following (formula 1) and a salt.
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
（２）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有する（１）記載のタブレット。
(The carrier is a polymer matrix, and R represents a hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms which may be interrupted by -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-).
(2) The tablet according to (1), wherein the sugar chain-trapping substance has a crosslinked polymer structure represented by the following (formula 2).
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（３）前記糖鎖捕捉物質が下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有する（２）記載のタブレット。
(R 1 and R 2 are hydrocarbon chains having 1 to 20 carbon atoms which may be interrupted by —O—, —S—, —NH—, —CO—, —CONH—, R 3 , R 4 , R 5. Represents H, CH 3 , or a hydrocarbon chain having 2 to 5 carbon atoms, and m and n represent the number of monomer units.)
(3) The tablet according to (2), wherein the sugar chain-trapping substance has a crosslinked polymer structure represented by the following (formula 3).
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。）
（４）前記糖鎖捕捉物質が平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である（１）〜（３）のいずれかに記載のタブレット。
（５）前記糖鎖捕捉物質が乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である（１）〜（４）のいずれかに記載のタブレット。
（６）前記糖鎖捕捉物質がｐＨ３〜８で安定である（１）〜（５）のいずれかに記載のタブレット。
（７）前記糖鎖捕捉物質が少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定である（１）〜（５）のいずれかに記載のタブレット。
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
（９）マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、
前記各ウェルに、（１）〜（７）のいずれかに記載のタブレットを投入し、
当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。
（１０）（８）または（９）記載の試料調製方法において、
前記複合体を酸性条件で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させる、試料調製方法。
（１１）（１０）記載の試料調製方法において、
前記遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化する、試料調製方法。
（１２）（１１）記載の試料調製方法において、
前記ラベル化が２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化である、試料調製方法。
を提供する。
(M and n indicate the number of monomer units.)
(4) The tablet according to any one of (1) to (3), wherein the sugar chain-trapping substance is polymer particles having an average particle size of 0.1 μm to 500 μm.
(5) The tablet according to any one of (1) to (4), wherein the sugar chain-trapping substance is polymer particles having a hydrazide group of 100 nmol or more per 1 mg of dry weight.
(6) The tablet according to any one of (1) to (5), wherein the sugar chain-trapping substance is stable at pH 3 to 8.
(7) The tablet according to any one of (1) to (5), wherein the sugar chain-trapping substance is stable under a pressure of at least 1 MPa or less.
(8) The tablet according to any one of (1) to (7) is dissolved in water to obtain a dispersion of a sugar chain-trapping substance,
A sample preparation method, wherein a sample containing a sugar chain and / or a sugar derivative is introduced into the dispersion, and a complex is formed between the sugar chain-capturing substance and the sugar chain and / or sugar derivative.
(9) A sample preparation method for preparing a sample in a multiwell type microtiter plate,
Into each well, the tablet according to any one of (1) to (7) is charged,
Water is introduced into each well and the tablet is dissolved to form a sugar chain-trapping substance dispersion.
A sample preparation method, wherein a sample containing a sugar chain and / or a sugar derivative is introduced into each well, and a complex is formed between the sugar chain-capturing substance and the sugar chain and / or sugar derivative.
(10) In the sample preparation method according to (8) or (9),
A sample preparation method, wherein the complex is treated under acidic conditions to release sugar chains and / or sugar derivatives.
(11) In the sample preparation method described in (10),
A sample preparation method, wherein the released sugar chain and / or sugar derivative is further labeled.
(12) In the sample preparation method described in (11),
A sample preparation method, wherein the labeling is fluorescent labeling with 2-aminobenzamide or 2-aminopyridine.
I will provide a.
本発明によれば、簡便な操作にて所定量の糖鎖捕捉物質を導入することを容易にし、たとえハイスループットアッセイにおいても糖鎖捕捉物質の導入に際して煩雑な操作を必要としないタブレットが提供することができる。 According to the present invention, there is provided a tablet that facilitates the introduction of a predetermined amount of a sugar chain-capturing substance by a simple operation and does not require a complicated operation when introducing the sugar chain-trapping substance even in a high-throughput assay. be able to.
以下、本発明の実施形態について説明する。
一つの観点から、本発明は、下記（式１）で表される糖鎖捕捉物質と、塩とを含むタブレットを提供する。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
From one viewpoint, the present invention provides a tablet containing a sugar chain-trapping substance represented by the following (Formula 1) and a salt.
（担体はポリマーマトリックス、Ｒは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。）
ここで、「糖鎖捕捉物質」とは、以下の糖鎖捕捉反応に関与する物質をいう。
(The carrier is a polymer matrix, and R represents a hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms which may be interrupted by -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-).
Here, the “sugar chain-trapping substance” refers to a substance involved in the following sugar chain-trapping reaction.
式１において、担体は、無機物質または有機高分子物質からなる粒子状のポリマーマトリックスである。 In Formula 1, the carrier is a particulate polymer matrix made of an inorganic substance or an organic polymer substance.
ここで、担体として用いることができる無機物質としては、粒子状のものであればよく、例えばシリカ粒子、アルミナ粒子、ガラス粒子、金属粒子などが挙げられる。 Here, the inorganic substance that can be used as the carrier may be in the form of particles, and examples thereof include silica particles, alumina particles, glass particles, and metal particles.
また、有機高分子物質としては、アガロース、セファロースに代表される多糖類ゲル、ビニル化合物の重合体であるポリマーを粒子状にしたものが挙げられる。 Examples of the organic polymer substance include polysaccharide gels typified by agarose and sepharose, and particles obtained by polymerizing a polymer that is a polymer of a vinyl compound.
また、粒子の形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子である。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離，フィルタなどによる回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。粒径が上記の範囲よりも大幅に大きい場合、表面積が小さくなるために糖鎖との反応効率が低くなることがある。また、粒径が上記の範囲よりも大幅に小さい場合、特にフィルタによる粒子の回収が難しくなることがある。さらに、粒子をカラムに充填して用いる場合、粒径が過小であると通液の際の圧力損失が大きくなってしまうことがある。 Moreover, it is preferable that the shape of a particle is a sphere, and it is a polymer particle with an average particle diameter of 0.1 μm to 500 μm. It is considered that the carrier particles having a particle size in such a range can be easily collected by centrifugation, a filter, etc., and have a sufficient surface area, so that the reaction efficiency with sugar chains is high. When the particle size is significantly larger than the above range, the reaction efficiency with the sugar chain may be lowered due to the small surface area. In addition, when the particle diameter is significantly smaller than the above range, it may be difficult to collect the particles, particularly with a filter. Furthermore, when the particles are packed in a column and used, if the particle size is too small, the pressure loss at the time of liquid passage may increase.
Ｒは、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ａ、ｂ、ｄは１から５の整数を表し、ｃは１から１０の整数を表す。 R represents a hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms that may be interrupted by —O—, —S—, —NH—, —CO—, or —CONH—, and examples thereof include the following. In the following formula, a, b, and d represent an integer of 1 to 5, and c represents an integer of 1 to 10.
また、上記（式１）で表される糖鎖捕捉物質は、特許文献１に記載されているように、重合性基を含むカルボン酸エステルモノマーを含む原料を架橋剤存在下で重合させてカルボン酸エステル含有ポリマー粒子を得た後、当該カルボン酸エステル含有ポリマー粒子を１０体積パーセント以上の濃度のヒドラジン溶液で処理することにより得ることができる。 Further, as described in Patent Document 1, the sugar chain-trapping substance represented by the above (formula 1) is obtained by polymerizing a raw material containing a carboxylic acid ester monomer containing a polymerizable group in the presence of a crosslinking agent. After obtaining the acid ester-containing polymer particles, the carboxylic acid ester-containing polymer particles can be obtained by treating with a hydrazine solution having a concentration of 10 volume percent or more.
ここで、カルボン酸エステルモノマーとしては、カルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボン酸メチルエステルが挙げられる。 Here, examples of the carboxylic acid ester monomer include N-hydroxysuccinimide ester of carboxylic acid and carboxylic acid methyl ester.
また、架橋剤としては、多官能の化合物であって、カルボン酸エステルモノマーと共重合を行う化合物を好適に用いることができ、例えば（１）ポリオールのジまたはトリ（メタ）アクリル酸エステル類、例えばポリオールがエチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチロールプロパン、グリセリン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシプロピレングリコール、ポリグリセリン等であるもの、（２）上記（１）において、不飽和酸が（メタ）アクリル酸以外のもの、例えばマレイン酸、フマル酸などであるもの、（３）ビスアクリルアミド類、例えばＮ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミドなど、（４）ポリエポキシドと（メタ）アクリル酸を反応させて得られるジまたはトリ（メタ）アクリル酸エステル類、（５）ポリイソシアネートと（メタ）アクリル酸ヒドロキシエステルを反応させて得られるジ（メタ）アクリル酸カルバミルエステル類、例えばポリイソシアネートがトリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネートなどであるもの、（６）多価アリル化合物、例えばアリル化デンプン、アリル化セルロース、ジアリルフタレート、テトラアリロキシエタン、ペンタエリストールトリアリルエーテル、トリメチロールプロパントリアリルエーテル、ジエチレングリコールジアリルエーテル、トリアリルトリメリテート等が挙げられる。これらの中でも本発明では、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ'−メチレンビス（メタ）アクリルアミド等が好ましい。 Moreover, as a crosslinking agent, it is a polyfunctional compound, Comprising: The compound which copolymerizes with a carboxylic acid ester monomer can be used suitably, For example, (1) Di or tri (meth) acrylic acid ester of polyol, For example, the polyol is ethylene glycol, propylene glycol, trimethylolpropane, glycerin, polyoxyethylene glycol, polyoxypropylene glycol, polyglycerin, etc. (2) In (1) above, the unsaturated acid is (meth) acrylic acid (3) Bisacrylamides such as N, N′-methylenebisacrylamide, etc. (4) Diepoxide obtained by reacting polyepoxide with (meth) acrylic acid Or tri (meth) acrylic esters, (5) polyi Di (meth) acrylic acid carbamyl esters obtained by reacting socyanate and (meth) acrylic acid hydroxy ester, for example, polyisocyanate is tolylene diisocyanate, hexamethylene diisocyanate, etc., (6) polyvalent allyl compound, Examples include allylated starch, allylated cellulose, diallyl phthalate, tetraallyloxyethane, pentaerythritol triallyl ether, trimethylolpropane triallyl ether, diethylene glycol diallyl ether, triallyl trimellitate and the like. Among these, ethylene glycol di (meth) acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, N, N′-methylenebis (meth) acrylamide and the like are preferable in the present invention.
すなわち、（式１）で表される糖鎖捕捉物質は、下記のような構造をとるものを用いることができる。
−(ヒドラジド基含有化合物成分)m−(架橋剤成分)n−
このような構造を有する糖鎖捕捉物質としては、下記の（式２）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。
That is, as the sugar chain-trapping substance represented by (Formula 1), a substance having the following structure can be used.
-(Hydrazide group-containing compound component) m-(crosslinking agent component) n-
Examples of the sugar chain-trapping substance having such a structure include those having a crosslinked polymer structure represented by the following (formula 2).
（Ｒ1，Ｒ2は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5はＨ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示す。ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。） (R 1 and R 2 are hydrocarbon chains having 1 to 20 carbon atoms which may be interrupted by —O—, —S—, —NH—, —CO—, —CONH—, R 3 , R 4 , R 5. Represents H, CH 3 , or a hydrocarbon chain having 2 to 5 carbon atoms, and m and n represent the number of monomer units.)
Ｒ1は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば前記Ｒと同様のものを挙げることができる。 R 1 represents a hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms that may be interrupted by —O—, —S—, —NH—, —CO—, or —CONH—, and examples thereof are the same as those described above for R. be able to.
Ｒ2は、−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｅ、ｆは１から５の整数を表し、ｇは１から１０の整数を表す。 R 2 represents a hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms which may be interrupted by —O—, —S—, —NH—, —CO— or —CONH—, and examples thereof include the following. . In the following formulae, e and f represent an integer of 1 to 5, and g represents an integer of 1 to 10.
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｈ，ＣＨ3，または炭素数２〜５の炭化水素鎖を示し、例えば下記のものを挙げることができる。下記式中、ｈは１から４の整数を表す。 R 3 , R 4 , and R 5 may be the same or different and each represents H, CH 3 , or a hydrocarbon chain having 2 to 5 carbon atoms, and examples thereof include the following. In the following formula, h represents an integer of 1 to 4.
また、このような（式２）のうち、特に好適な物質Ａとしては、下記の（式３）で表される架橋型ポリマー構造を有するものが挙げられる。 Moreover, among such (Formula 2), as the particularly preferable substance A, those having a crosslinked polymer structure represented by the following (Formula 3) may be mentioned.
（ｍ，ｎはモノマーユニット数を示す。） (M and n indicate the number of monomer units.)
本発明で用いられる糖鎖捕捉物質は、乾燥重量１ｍｇ当り１００ｎｍｏｌ以上、好ましくは０．５μｍｏｌ以上のヒドラジド基を有するポリマー粒子である。また、ｐＨ３〜８で安定であり、少なくとも１ＭＰａ以下の圧力下で安定であることが、粒子の形状を保ち、かつ、活性なヒドラジド基の含有量が実質的に変化しないという観点から好ましい。また、架橋剤と共重合した粒子なので、溶媒への溶解性が低くなり、さらに物理的強度が十分得られる。さらには、ｐＨ３〜８で切断される部位がない。 The sugar chain-trapping substance used in the present invention is a polymer particle having a hydrazide group of 100 nmol or more, preferably 0.5 μmol or more, per 1 mg of dry weight. Moreover, it is preferable from a viewpoint that it is stable at pH 3-8, and it is stable under the pressure of at least 1 MPa or less from the viewpoint that the shape of the particles is maintained and the content of the active hydrazide group does not substantially change. Further, since the particles are copolymerized with a crosslinking agent, the solubility in a solvent is lowered, and a sufficient physical strength can be obtained. Furthermore, there is no site cleaved at pH 3-8.
このような糖鎖捕捉物質を用いた糖鎖捕捉反応、すなわち糖鎖捕捉物質と、糖鎖および／または糖の誘導体との反応は、糖鎖および／または糖の誘導体を含む試料に、糖鎖捕捉物質を導入して、ｐＨが４〜８の条件にて、また反応温度が４〜９０℃、好ましくは２５〜９０℃、より好ましくは４０〜９０℃の条件における反応系で、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜２時間行われる。 A sugar chain capture reaction using such a sugar chain-trapping substance, that is, a reaction between a sugar chain-trapping substance and a sugar chain and / or a sugar derivative is performed on a sample containing a sugar chain and / or a sugar derivative. Introducing a capture substance, the reaction system under the condition of pH 4-8, and the reaction temperature of 4-90 ° C, preferably 25-90 ° C, more preferably 40-90 ° C, for 10 minutes to It is carried out for 24 hours, preferably 10 minutes to 8 hours, more preferably 10 minutes to 2 hours.
本発明のタブレットに用いられる塩としては、結晶化しやすい塩であればよく、例えばリン酸塩、臭化カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの無機塩、デンプンなどの糖類、ゼラチンなどの水溶性の賦形剤、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどの水溶性の合成ポリマーなどが挙げられる。特に、リン酸塩は乾燥すると固化しやすいため、好ましい。 The salt used in the tablet of the present invention may be any salt that is easily crystallized. For example, inorganic salts such as phosphate, potassium bromide, sodium chloride, potassium chloride, sodium bicarbonate, calcium carbonate, and sugars such as starch. And water-soluble excipients such as gelatin, and water-soluble synthetic polymers such as polyvinyl alcohol and polyethylene glycol. In particular, phosphate is preferable because it is easily solidified when dried.
本発明のタブレットは、例えば以下のようにして作製することができる。
糖鎖捕捉物質をサンプルチューブにて秤量し、そこに所定濃度の緩衝剤を所定量だけ導入して分散液を作製する。作製した分散液を、例えばマイクロタイタープレートのウェルに分注し、その後プレートごと加熱乾燥させて、糖鎖捕捉物質と一緒に塩を固めてタブレットを得ることができる。また、加熱乾燥に換えて、自然乾燥（風乾）や凍結真空乾燥によりタブレットを形成することも可能である。
The tablet of the present invention can be produced, for example, as follows.
A sugar chain-trapping substance is weighed in a sample tube, and a predetermined amount of a buffering agent is introduced into the sample to prepare a dispersion. The prepared dispersion can be dispensed, for example, into wells of a microtiter plate, and then heated and dried together with the plate to solidify the salt together with the sugar chain-trapping substance to obtain a tablet. In addition, instead of heat drying, tablets can be formed by natural drying (air drying) or freeze vacuum drying.
また、このとき、糖鎖捕捉物質の量、緩衝剤の濃度および導入量、緩衝剤の種類は、想定される実験系を考慮して適宜設定することができる。すなわち、タブレットに含有される糖鎖捕捉物質および塩の量は、水を添加して所定の容積の溶液としたとき、所定の濃度となるように調整される。 At this time, the amount of the sugar chain-trapping substance, the concentration and amount of the buffering agent, and the type of the buffering agent can be appropriately set in consideration of the assumed experimental system. That is, the amounts of the sugar chain-trapping substance and the salt contained in the tablet are adjusted so as to have a predetermined concentration when water is added to form a predetermined volume of solution.
また、別の観点から、本発明は前述のタブレットの用途として、試料調製方法を提供する。
すなわち、当該試料調製方法の一態様は、前述のタブレットを水に溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させるものである。
From another viewpoint, the present invention provides a sample preparation method as an application of the aforementioned tablet.
That is, in one embodiment of the sample preparation method, the above-described tablet is dissolved in water to obtain a dispersion of a sugar chain-trapping substance, a sample containing a sugar chain and / or a sugar derivative is introduced into the dispersion, A complex is formed between the sugar chain-trapping substance and the sugar chain and / or sugar derivative.
この試料調製方法によれば、前述のタブレットが、水に溶解させたときに所定濃度の糖鎖捕捉物質および塩になるように調整されているため、所定量の糖鎖捕捉物質を導入することが容易となり、従来の粉末形態で提供されていたときに生じ得た、秤量誤差などの影響を受けない。 According to this sample preparation method, since the aforementioned tablet is adjusted to become a sugar chain-capturing substance and a salt at a predetermined concentration when dissolved in water, a predetermined amount of sugar-chain-capturing substance is introduced. And is not affected by weighing errors or the like that may have occurred when provided in conventional powder form.
また、試料調製方法の他の態様は、マルチウェルタイプのマイクロタイタープレートにて試料調製を行う試料調製方法であって、前記各ウェルに、前述のタブレットを投入し、当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させるものである。 Another embodiment of the sample preparation method is a sample preparation method in which a sample is prepared using a multi-well type microtiter plate. The tablet is introduced into each well, and water is introduced into each well. Then, the tablet is dissolved to obtain a dispersion of the sugar chain-trapping substance, a sample containing a sugar chain and / or a sugar derivative is introduced into each well, and the sugar chain-trapping substance and the sugar chain and / or sugar are mixed. A complex is formed with the derivative.
この試料調製方法によれば、前述したように、所定量の固相担体を導入することが容易になる上に、特にマイクロタイタープレートのような一度に多くのウェルに一定量の糖鎖捕捉物質を含む分散液を導入する際に、分注操作などの煩雑な操作を行うことなく、タブレットを各ウェルに投入し、一定量の水を導入するといった簡便な操作だけでよく、従来行ってきた分注操作による誤差を低減することを可能にすることができる。 According to this sample preparation method, as described above, it is easy to introduce a predetermined amount of a solid phase carrier, and in addition, a certain amount of a sugar chain-capturing substance in many wells at one time such as a microtiter plate. Introducing a dispersion liquid containing liquid, a simple operation such as introducing a tablet into each well and introducing a certain amount of water without performing complicated operations such as dispensing operations has been performed in the past. It is possible to reduce errors due to the dispensing operation.
さらに、本発明の試料調製方法において、糖鎖捕捉物質と糖鎖および／または糖の誘導体との間で形成された複合体を酸性条件下で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させてもよい。 Furthermore, in the sample preparation method of the present invention, the complex formed between the sugar chain-capturing substance and the sugar chain and / or sugar derivative is treated under acidic conditions to give the sugar chain and / or sugar derivative. It may be liberated.
このときの酸性条件での処理は、０．０１〜１０体積パーセントの酢酸溶液による処理であり、好ましくは０．０１〜１体積パーセントの酢酸溶液にて、２５〜８０℃で５〜６０分間行われる。 The treatment under acidic conditions at this time is treatment with 0.01 to 10 volume percent acetic acid solution, and preferably 0.01 to 1 volume percent acetic acid solution at 25 to 80 ° C. for 5 to 60 minutes. Is called.
このようにして得られる糖鎖サンプルからなる分析試料は、標識化されていないものであり、標識しなくてもよい用途に有用である。 The analytical sample comprising the sugar chain sample thus obtained is not labeled and is useful for applications that do not need to be labeled.
このようにして、糖鎖および／または糖の誘導体を含む生体試料より分析試料のための糖鎖および／または糖の誘導体を、簡単な操作で分離精製することが可能になる。さらなる観点から、本発明は、この分析試料方法により得られる分析試料を提供する。 In this way, it is possible to separate and purify sugar chains and / or sugar derivatives for analysis samples from biological samples containing sugar chains and / or sugar derivatives by a simple operation. From a further aspect, the present invention provides an analytical sample obtained by this analytical sample method.
また、この試料調製方法において、遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化してもよく、このようなラベル化としては、２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化が挙げられる。 In this sample preparation method, the released sugar chain and / or sugar derivative may be further labeled. As such labeling, fluorescent labeling with 2-aminobenzamide or 2-aminopyridine is used. Can be mentioned.
さらに、本発明の試料調製方法において、糖鎖捕捉物質と糖鎖および／または糖の誘導体との間で形成された複合体における、糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質を含む第二の試料を接触させて、当該糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質を捕集することもできる。 Furthermore, in the sample preparation method of the present invention, in the complex formed between the sugar chain-trapping substance and the sugar chain and / or sugar derivative, the binding property or affinity for the sugar chain and / or sugar derivative A substance having binding or affinity for the sugar chain and / or the sugar derivative can also be collected by contacting a second sample containing the substance having the above.
本実施形態においては、まず、糖鎖捕捉物質と、糖鎖および／または糖の誘導体とを反応させて複合体とした後、この複合体に対して、診断または検査を行うための検体から採取した試料（以下、「検体試料」という）を作用させて、この検体試料に含まれる糖鎖および／または糖の誘導体に対して結合性または親和性を有する物質、例えばレクチンなどの糖結合性タンパク質を捕集させる。 In the present embodiment, first, a sugar chain-capturing substance and a sugar chain and / or a sugar derivative are reacted to form a complex, and then the complex is collected from a specimen for diagnosis or testing. A substance having a binding property or affinity for a sugar chain and / or a sugar derivative contained in the specimen sample, for example, a saccharide-binding protein such as a lectin. To collect.
また、捕集された物質を、検出、定量化することにより、糖鎖と検体細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係について、より高度な解析を行うことができる。 In addition, by detecting and quantifying the collected substances, it is possible to perform a more advanced analysis of the relationship between sugar chains and specimen cell differentiation and proliferation, cell adhesion, immunity, and cell canceration. .
以下の実験例にて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実験例に限定されることはない。 The present invention will be specifically described in the following experimental examples, but the present invention is not limited to these experimental examples.
（製造例）
特許文献１に記載されているように、以下の１〜４の手順にしたがって、ヒドラジド基含有ポリマービーズを作製し、実施例、比較例において糖鎖捕捉ビーズとして用いた。
１．メチルエステル含有モノマーの合成
以下のスキーム１に示すルートでメチルエステル含有モノマーを合成した。
(Production example)
As described in Patent Document 1, hydrazide group-containing polymer beads were prepared according to the following procedures 1 to 4 and used as sugar chain-capturing beads in Examples and Comparative Examples.
1. Synthesis of methyl ester-containing monomer A methyl ester-containing monomer was synthesized by the route shown in Scheme 1 below.
（１）化合物（ｃ）の合成
無水メタクリル酸（ＭＡＨ：５ｇ，０．０３ｍｏｌ）（ｂ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液を、２５ｇの（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＢＥＡ：２５ｇ，０．１７ｍｏｌ）（ａ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に氷浴上で滴下投入した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｃ）を得た。
(1) Synthesis of Compound (c) A solution obtained by dissolving methacrylic anhydride (MAH: 5 g, 0.03 mol) (b) in 100 ml of chloroform was mixed with 25 g of (ethylenedioxy) bis (ethylamine) (EDBEA: 25 g). 0.17 mol) (a) was added dropwise to a solution of 100 ml of chloroform in an ice bath. Nitrogen was sealed therein and stirred overnight. The residue obtained by evaporating the solvent from the obtained reaction solution is applied to a silica gel column (developing solvent: mixed solvent of 90 parts of chloroform / 10 parts of methanol) to fractionate a predetermined fraction, and the solvent is evaporated from this fraction. To give compound (c).
（２）化合物（ｅ）の合成
５ｇの化合物（ｃ）（０．０２３ｍｏｌ）を１００ｍｌのクロロホルムに溶解させた溶液に、１．５当量のコハク酸モノメチル（ｄ）および１．５当量の水溶性カルボジイミド化合物（ＷＳＣ）である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを加えて、密栓した。そこへ窒素を封入し、終夜攪拌させた。得られた反応溶液から溶媒を蒸発させて得た残留物を、シリカゲルカラム（展開溶媒：クロロホルム９０容／メタノール１０容の混合溶媒）にかけて所定のフラクションを分取して、このフラクションから溶媒を蒸発させて化合物（ｅ）を得た。
また、得られた物質は、ＮＭＲ、マトリックス支援レーザイオン化−飛行時間型質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により化合物（ｅ）であることを確認した。
(2) Synthesis of Compound (e) In a solution of 5 g of Compound (c) (0.023 mol) dissolved in 100 ml of chloroform, 1.5 equivalents of monomethyl succinate (d) and 1.5 equivalents of water solubility 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, which is a carbodiimide compound (WSC), was added and sealed. Nitrogen was sealed therein and stirred overnight. The residue obtained by evaporating the solvent from the obtained reaction solution is applied to a silica gel column (developing solvent: mixed solvent of 90 parts of chloroform / 10 parts of methanol) to fractionate a predetermined fraction, and the solvent is evaporated from this fraction. To give compound (e).
Moreover, it confirmed that the obtained substance was a compound (e) by NMR and the matrix assistance laser ionization-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS).
２．メチルエステル含有ポリマーの合成
以下のスキーム２に示すルートでメチルエステル含有ポリマー粒子を合成した。
2. Synthesis of methyl ester-containing polymer Methyl ester-containing polymer particles were synthesized by the route shown in Scheme 2 below.
三口フラスコに２５ｍｌの５％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液を装入し、そこへ窒素をパージした。１ｇの化合物（ｅ）（２．６ｍｍｏｌ）、エチレングリコールジメタクリレート（ｆ）（ＥＧＤＭＡ：（ｅ）に対して５ｍｏｌ％）および１ｍｌのクロロホルムからなる混合物を、前記三口フラスコに導入し、６０℃に保ちながら攪拌して、混合物に含まれるモノマーとしての化合物（ｅ）およびＥＧＤＭＡをＰＶＡ水溶液中に分散させた。続いて、モノマーに対して３重量％の重合開始剤としてのアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を加えて重合を開始させた。６０℃で１６時間反応させた後、生成したポリマー粒子を遠心分離により回収し、メタノールと水とで洗浄した。 A three-necked flask was charged with 25 ml of 5% polyvinyl alcohol (PVA) aqueous solution and purged with nitrogen. A mixture consisting of 1 g of compound (e) (2.6 mmol), ethylene glycol dimethacrylate (f) (EGDMA: 5 mol% with respect to (e)) and 1 ml of chloroform was introduced into the three-necked flask and heated to 60 ° C. While maintaining, the compound (e) and EGDMA as monomers contained in the mixture were dispersed in the aqueous PVA solution. Subsequently, 3% by weight of azobisisobutyronitrile (AIBN) as a polymerization initiator was added to the monomer to initiate polymerization. After reacting at 60 ° C. for 16 hours, the produced polymer particles were recovered by centrifugation and washed with methanol and water.
３．ヒドラジド基の導入
ポリマー粒子４００ｍｇを容器にとり、ヒドラジン１水和物４ｍｌを加えて攪拌し、室温で２時間静置した。反応後、ヒドラジン１水和物を除去し、メタノールで洗浄したのち、１Ｍ塩酸でリンスした。その後さらに純水で洗浄した。
3. Introduction of hydrazide group 400 mg of polymer particles were placed in a container, 4 ml of hydrazine monohydrate was added and stirred, and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After the reaction, hydrazine monohydrate was removed, washed with methanol, and rinsed with 1M hydrochloric acid. Thereafter, it was further washed with pure water.
４．官能基量の定量
ポリマー粒子１ｍｇを容器にとり、Ｎ−アセチル−Ｄ−ラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）１μｍｏｌを添加し、さらに、２％酢酸を含むアセトニトリル１８０μｌを加えた。これを８０℃で４５分間加熱することによりＬａｃＮＡｃとビーズ上のヒドラジド基を反応させた。純水でビーズをリンスして未反応の糖鎖を回収し、それをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定により定量（内部標準法）し、ビーズへのＬａｃＮＡｃ結合量を求めた。ビーズ１ｍｇあたり０．８６μｍｏｌ（８６０ｎｍｏｌ）のＬａｃＮＡｃが結合することが分かった。
4). Quantification of functional group amount 1 mg of polymer particles was placed in a container, 1 μmol of N-acetyl-D-lactosamine (LacNAc) was added, and 180 μl of acetonitrile containing 2% acetic acid was further added. This was heated at 80 ° C. for 45 minutes to react LacNAc with the hydrazide group on the beads. The beads were rinsed with pure water to recover unreacted sugar chains, which were quantified by MALDI-TOF-MS measurement (internal standard method) to determine the amount of LacNAc bound to the beads. It was found that 0.86 μmol (860 nmol) of LacNAc was bound per 1 mg of beads.
（実施例１）
９．６ｇのダルベッコＰＢＳ（−）粉末（日水製薬（株）製）を１リットルの純水に溶解して、ＰＢＳ溶液を得た。製造例で得られた糖鎖捕捉ビーズを５０ｍｇ、サンプルチューブに量り取り、そこに５００μｌのＰＢＳ溶液を加えて、分散液を作製した。この分散液を５０μｌ、ピペットで量り取り、フッ素系樹脂で成形したＵ底マイクロプレート（（株）フロンケミカル製のフッ素系樹脂で成形したカルチャープレート）の１０箇所のウェルにそれぞれ分注した。その後、マイクロプレートを８０℃のオーブン内に１時間静置して、ウェル内の分散液を乾燥させた。乾燥後、各ウェルにタブレット状に固められたビーズを取り出し、合計１０個のタブレットが得られた。
Example 1
9.6 g of Dulbecco's PBS (-) powder (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) was dissolved in 1 liter of pure water to obtain a PBS solution. 50 mg of the sugar chain-capturing beads obtained in the production example were weighed into a sample tube, and 500 μl of PBS solution was added thereto to prepare a dispersion. 50 μl of this dispersion was weighed with a pipette and dispensed into each of 10 wells of a U-bottom microplate molded with a fluororesin (culture plate molded with fluororesin manufactured by Freon Chemical Co., Ltd.). Thereafter, the microplate was left in an oven at 80 ° C. for 1 hour to dry the dispersion in the well. After drying, the beads solidified into tablets in each well were taken out, and a total of 10 tablets were obtained.
得られたタブレットの一つをサンプルチューブに投入し、純水１００μｌを注入したところ、素早く良好な状態で分散した。 When one of the obtained tablets was put into a sample tube and 100 μl of pure water was injected, it was quickly dispersed in a good state.
（実施例２）
実施例１で調製した９個のタブレットを、９本のサンプルチューブにそれぞれ投入した。各サンプルチューブに純水１００μｌを注入し、分散状態にした後、遠心してビーズを沈殿させて上澄みを除去した。この操作を３回繰り返した後、真空乾燥してビーズを乾燥させ、サンプルチューブごとに、残ったビーズの総乾燥重量をそれぞれ測定した。この測定の結果を表１に示した。
(Example 2)
Nine tablets prepared in Example 1 were put into nine sample tubes, respectively. 100 μl of pure water was injected into each sample tube to make it dispersed, and then centrifuged to precipitate beads and remove the supernatant. After repeating this operation three times, the beads were dried by vacuum drying, and the total dry weight of the remaining beads was measured for each sample tube. The results of this measurement are shown in Table 1.
（比較例１）
製造例で得られた糖鎖捕捉ビーズを５０ｍｇ、サンプルチューブに量り取り、そこに５００μｌの純水を加えて、分散液を作製した。この分散液を９本のサンプルチューブに５０μｌずつ分注した。チューブを遠心してビーズを沈殿させ、上澄みを除去した後、真空乾燥してビーズを乾燥させ、サンプルチューブごとに、残ったビーズの総乾燥重量をそれぞれ測定した。この測定の結果を表１に示した。
(Comparative Example 1)
50 mg of the sugar chain-capturing beads obtained in the production example were weighed into a sample tube, and 500 μl of pure water was added thereto to prepare a dispersion. 50 μl of this dispersion was dispensed into nine sample tubes. After centrifuging the tube to precipitate the beads and removing the supernatant, the beads were dried by vacuum drying, and the total dry weight of the remaining beads was measured for each sample tube. The results of this measurement are shown in Table 1.
表１によれば、実施例２のアッセイの方が、比較例１のアッセイよりも、標準偏差／平均値で得られるＣＶ値が理想であるゼロに近い値となった。また、実施例２のアッセイの方が短時間で行うことができた。 According to Table 1, in the assay of Example 2, the CV value obtained by the standard deviation / average value was closer to the ideal value of zero than the assay of Comparative Example 1. In addition, the assay of Example 2 could be performed in a shorter time.
Claims (12)
当該分散液に糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。 Dissolving the tablet according to any one of claims 1 to 7 in water to obtain a dispersion of a sugar chain-trapping substance,
A sample preparation method, wherein a sample containing a sugar chain and / or a sugar derivative is introduced into the dispersion, and a complex is formed between the sugar chain-capturing substance and the sugar chain and / or sugar derivative.
前記各ウェルに、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタブレットを投入し、
当該各ウェルに水を導入してタブレットを溶解させて糖鎖捕捉物質の分散液とし、
前記各ウェルに糖鎖および／または糖の誘導体を含有する試料を導入し、前記糖鎖捕捉物質と前記糖鎖および／または糖の誘導体との間で複合体を形成させる、試料調製方法。 A sample preparation method for preparing a sample in a multiwell type microtiter plate,
Into each well, the tablet according to any one of claims 1 to 7 is charged,
Water is introduced into each well and the tablet is dissolved to form a sugar chain-trapping substance dispersion.
A sample preparation method, wherein a sample containing a sugar chain and / or a sugar derivative is introduced into each well, and a complex is formed between the sugar chain-capturing substance and the sugar chain and / or sugar derivative.
前記複合体を酸性条件で処理して、糖鎖および／または糖の誘導体を遊離させる、試料調製方法。 The sample preparation method according to claim 8 or 9,
A sample preparation method, wherein the complex is treated under acidic conditions to release sugar chains and / or sugar derivatives.
前記遊離させた糖鎖および／または糖の誘導体を、さらにラベル化する、試料調製方法。 The sample preparation method according to claim 10,
A sample preparation method, wherein the released sugar chain and / or sugar derivative is further labeled.
前記ラベル化が２−アミノベンズアミド、または、２−アミノピリジンによる蛍光ラベル化である、試料調製方法。 The sample preparation method according to claim 11,
A sample preparation method, wherein the labeling is fluorescent labeling with 2-aminobenzamide or 2-aminopyridine.
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