JP2011063518A - Oatp-r gene expression-enhancing composition containing arb and/or glitazone-based hypoglycemic substance - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物や、ＴＣＡサイクル代謝物濃度上昇抑制剤に関する。 The present invention relates to an OATP-R gene expression enhancing composition and a TCA cycle metabolite concentration increase inhibitor.
腎不全患者等の腎機能障害を有する患者、特に腎透析を受ける患者の数は年々増加の一途を辿っており、現在２０万人の患者が維持透析治療を行っており、さらに毎年３万人以上が新たに透析導入に至っている。透析療法には、一人あたり年間約５００万円の費用がかかるため、２０万人に対して約１兆円の医療費が恒常的に必要となっている。また、近年、慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease：ＣＫＤ）という疾患概念が提唱され、その予防・治療の重要性に対する認識が高まりを見せている。ＣＫＤはCommon Diseaseであり、患者数は膨大（約２０００万人）であることから、ＣＫＤ対策が急務の課題となっている。以上のような状況下において、腎不全やＣＫＤ等の腎機能障害の症状の予防法や、そのような症状を緩和し、透析導入を遅らせる治療法が開発されれば、患者のＱＯＬ（クオリティオブライフ）に資するだけでなく、医療費の大幅な削減が可能となり社会に大きく貢献することが出来る。 The number of patients with renal dysfunction, such as patients with renal insufficiency, especially those undergoing renal dialysis, has been increasing year by year. Currently, 200,000 patients are undergoing maintenance dialysis, and an additional 30,000 patients every year. The above has led to the introduction of dialysis. Since dialysis therapy costs about 5 million yen per person per year, medical expenses of about 1 trillion yen are constantly required for 200,000 people. In recent years, the concept of chronic kidney disease (CKD) has been proposed, and recognition of the importance of its prevention and treatment is increasing. Since CKD is a common disease and the number of patients is enormous (approximately 20 million people), countermeasures against CKD are an urgent issue. Under these circumstances, if a method for preventing symptoms of renal dysfunction such as renal failure or CKD, or a treatment that alleviates such symptoms and delays the introduction of dialysis, the patient's QOL (quality of quality) Not only contributes to life), but can also greatly reduce medical costs and contribute greatly to society.
腎臓には多種多様なトランスポーターが存在し、多様な物質輸送に関与している。なかでも有機アニオントランスポーター（ＯＡＴＰ：organic anion transporting polypeptide）ファミリーは、生体内から不要となった有機アニオン等を体外に出すための排出・解毒ポンプとして機能するトランスポーターのファミリーであり、該トランスポーターはその幅広い基質認識性と多岐にわたる臓器分布から、内因性物質や薬物の体内動態において重要な役割を行うトランスポーターと考えられている。本発明者は、世界に先駆けて１５個以上の有機アニオントランスポーターを単離し、胆汁酸、甲状腺ホルモン、ステロイドホルモン、プロスタグランジン類等が単に拡散でなく有機アニオントランスポーターにより細胞膜輸送されるという知見を世界に先駆けて報告してきた。更に、本発明者は、腎臓にのみ発現している有機アニオントランスポーターであるＯＡＴＰ−Ｒ（ＯＡＴＰ４Ｃ１やＯＡＴＰ−Ｍ１とも呼ばれる）を世界で初めて発見し（非特許文献１）、その内容に関する特許出願が日本において特許登録された（特許文献１参照）。 There are a wide variety of transporters in the kidney, and they are involved in various transport of substances. In particular, the organic anion transporting polypeptide (OATP) family is a family of transporters that function as an evacuation / detoxification pump for removing organic anions, etc. that are no longer necessary from the living body. Is considered to be a transporter that plays an important role in the pharmacokinetics of endogenous substances and drugs due to its wide substrate recognition and diverse organ distribution. The present inventor isolated 15 or more organic anion transporters for the first time in the world, and bile acids, thyroid hormones, steroid hormones, prostaglandins and the like are not simply diffused but transported through the cell membrane by organic anion transporters. We have reported our knowledge for the first time in the world. Furthermore, the present inventor discovered OATP-R (also referred to as OATP4C1 or OATP-M1), an organic anion transporter expressed only in the kidney for the first time in the world (Non-Patent Document 1), and applied for a patent on the contents thereof. Was registered in Japan (see Patent Document 1).
さらに、本発明者らは、そのＯＡＴＰ−Ｒの発現調節を明らかにするために、５’上流転写領域を詳細に解析したところ、ダイオキシンの核内受容体であるアリルハイドロカーボン受容体（ＡＨＲ）が結合する繰り返し配列として知られるxenobiotic response element（ＸＲＥ）類似配列が、ヒトやラットのＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の５’上流転写領域に存在することを見い出した（特許文献２参照）。さらに、本発明者らは、ヒトＯＡＴＰ−Ｒの５’上流転写領域の下流にレポーター遺伝子を配置したプラスミドを、ＡＨＲを発現するＡＣＨＮ細胞にトランスフェクトした細胞を作製し、該細胞を用いたレポーターアッセイを行なった。その結果、ＡＨＲに結合する３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）によって、レポーター遺伝子の転写活性が上昇すること、及び、前述の５’上流転写領域中に、転写開始点より上流−１００塩基付近のＸＲＥ類似領域が存在する場合において、転写活性の上昇傾向が特に顕著であることが分かった（前述の特許文献２参照）。また、５’上流転写領域中のＸＲＥ類似領域の配列を除去又は改変することにより、レポーター遺伝子の転写活性が顕著に低下することから、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の転写制御には、ＸＲＥ類似領域が関連している可能性が示唆された（前述の特許文献２参照）。以上のように３−ＭＣは、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強活性を有しているが、３−ＭＣはダイオキシン類似物質であるため、毒性等の観点から、ヒトに投与することはできなかった。 Furthermore, the present inventors analyzed the 5 ′ upstream transcription region in detail in order to clarify the regulation of OATP-R expression. As a result, allyl hydrocarbon receptor (AHR), which is a nuclear receptor for dioxins, was analyzed. It was found that a xenobiotic response element (XRE) -like sequence known as a repetitive sequence to which is bound exists in the 5 ′ upstream transcription region of the OATP-R gene of human or rat (see Patent Document 2). Furthermore, the present inventors prepared a cell in which a reporter gene is placed downstream of the 5 ′ upstream transcription region of human OATP-R and transfected into ACHN cells expressing AHR, and the reporter using the cell is used. The assay was performed. As a result, the transcription activity of the reporter gene is increased by 3-methylcholanthrene (3-MC) binding to AHR, and in the 5 ′ upstream transcription region described above, around −100 bases upstream from the transcription start point. In the case where the XRE-like region is present, it was found that the increase in transcriptional activity was particularly remarkable (see Patent Document 2 described above). Moreover, since the transcription activity of the reporter gene is significantly reduced by removing or modifying the sequence of the XRE-like region in the 5 ′ upstream transcription region, the transcriptional control of the human OATP-R gene involves the XRE-like region. The possibility of being related was suggested (refer to the above-mentioned patent document 2). As described above, 3-MC has OATP-R gene expression enhancing activity, but 3-MC is a dioxin-like substance, and thus could not be administered to humans from the viewpoint of toxicity and the like.
腎不全等の腎疾患の治療剤としては様々なものが知られている。例えば、アンジオテンシンII受容体阻害物質（ＡＲＢ）は降圧剤として既に実用化されているが、このアンジオテンシンII受容体の中のサブタイプの１つであるＡＴ１受容体のアンタゴニストを腎不全等の治療剤として使用することが知られている（特許文献３参照）。また、グリタゾン系物質は血糖降下剤として既に実用化されているが、このグリタゾン系物質を腎不全等の治療剤として用い得ることが知られている（特許文献４参照）。しかし、アンジオテンシンII受容体阻害物質やグリタゾン系血糖降下物質が、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強作用や、腎不全時に上昇している血中のＴＣＡサイクル代謝物濃度の上昇抑制作用を有していることは知られていなかった。 Various therapeutic agents for renal diseases such as renal failure are known. For example, an angiotensin II receptor inhibitor (ARB) has already been put to practical use as an antihypertensive agent, but an antagonist of AT 1 receptor, which is one of the subtypes in this angiotensin II receptor, is used for the treatment of renal failure and the like. It is known to be used as an agent (see Patent Document 3). Moreover, although the glitazone substance has already been put into practical use as a hypoglycemic agent, it is known that this glitazone substance can be used as a therapeutic agent for renal failure or the like (see Patent Document 4). However, the angiotensin II receptor inhibitor and the glitazone hypoglycemic substance have an OATP-R gene expression enhancing effect and an inhibitory effect on the increase in the TCA cycle metabolite concentration in blood that is elevated during renal failure. Was not known.
本発明者らは、これまでに、前述の特許文献２のアッセイ系を利用して、様々な薬物の中からヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強作用を有する薬物を行なったところ、高脂血症剤としてすでに実用化され広く用いられているスタチンがヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強する作用を有していることを見い出している（特願２００８−２６４６７５号）。しかし、スタチンは、シトクロームＰ−４５０（ｃｙｐ１ａ）遺伝子を誘導するため、投与量が多過ぎると薬物耐性や肝肥大や黄紋筋融解症を惹起する可能性もあった。本発明の課題は、安全性がより高く、かつ、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強作用を有するＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物を提供することにある。 The present inventors have so far conducted a drug having an action of enhancing human OATP-R gene expression from various drugs using the assay system of Patent Document 2 described above. It has been found that statins that have already been put into practical use and widely used have the effect of enhancing the expression of the human OATP-R gene (Japanese Patent Application No. 2008-264675). However, since statins induce the cytochrome P-450 (cyp1a) gene, there is a possibility that drug tolerance, liver hypertrophy, and rhabdomyolysis may be caused when the dose is too large. An object of the present invention is to provide an OATP-R gene expression enhancing composition having higher safety and having an OATP-R gene expression enhancing action.
本発明者らは、上記課題を解決するために、前述の特許文献２のアッセイ系を利用して、様々な薬物の中からヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強作用を有する薬物のスクリーニングを行なったところ、降圧剤として知られるアンジオテンシンII受容体阻害物質や、又はグリタゾン系血糖降下物質が、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強することを見い出した。また、意外なことに、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強作用を有する上記物質が、腎不全時に上昇している血中のＴＣＡサイクル代謝物濃度の上昇抑制作用を有していることも見い出した。本発明者らは、以上の知見に基づいて本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors screened a drug having a human OATP-R gene expression enhancing action from various drugs using the assay system of Patent Document 2 described above. It has been found that an angiotensin II receptor inhibitor known as an antihypertensive agent or a glitazone hypoglycemic substance enhances the expression of the human OATP-R gene. Surprisingly, it has also been found that the above-mentioned substance having an OATP-R gene expression enhancing action has an inhibitory action on an increase in the TCA cycle metabolite concentration in blood that is elevated during renal failure. Based on the above findings, the present inventors have completed the present invention.
すなわち、本発明は、（１）アンジオテンシンII受容体阻害物質（ＡＲＢ）及び／又はグリタゾン系血糖降下物質を含有するＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物や、（２）ＡＲＢが、ロサルタン、カンデサルタン、カンデサルタン・シレキセチル、オルメサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、テルミサルタン、ＥＸＰ３１７４、及びＲＮＨ６２７０から選択されることを特徴とする上記（１）に記載のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物や、（３）グリタゾン系血糖降下物質が、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、及びマレイン酸ロシグリタゾンから選択されることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物や、（４）ＡＲＢが、ＲＮＨ６２７０であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物に関する。 That is, the present invention relates to (1) an OATP-R gene expression enhancing composition containing an angiotensin II receptor inhibitor (ARB) and / or a glitazone-based hypoglycemic substance, and (2) ARB is losartan, candesartan, candesartan -The OATP-R gene expression enhancing composition according to (1) above, which is selected from cilexetil, olmesartan, valsartan, irbesartan, eprosartan, telmisartan, EXP3174, and RNH6270, and (3) a glitazone blood glucose The composition for enhancing OATP-R gene expression according to (1) or (2) above, wherein the lowering substance is selected from pioglitazone, troglitazone, rosiglitazone, and rosiglitazone maleate, (4) ARB Is RNH6270 It relates to the (1) OATP-R gene expression enhancing composition according to any one of the - (3).
また、本発明は、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物を含有するＴＣＡサイクル代謝物濃度上昇抑制剤に関する。 The present invention also relates to a TCA cycle metabolite concentration increase inhibitor containing the OATP-R gene expression enhancing composition according to any one of (1) to (4) above.
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物は、腎臓に特異的に発現するＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強することができる。また、スタチンは、シトクロームＰ−４５０（ｃｙｐ）遺伝子を誘導するため、投与量が多過ぎると薬物耐性や肝肥大や黄紋筋融解症を惹起する可能性もあったが、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物はｃｙｐ遺伝子を誘導しないため、安全性がより高い。また、本発明のＴＣＡサイクル代謝物濃度上昇抑制剤は、腎疾患時に異常に上昇しているＴＣＡサイクル代謝物の濃度を低下させることによって、ＴＣＡサイクル代謝物の濃度を正常化させることができる。 The OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention can enhance the expression of the OATP-R gene that is specifically expressed in the kidney. In addition, since statins induce the cytochrome P-450 (cyp) gene, too much dose may cause drug resistance, hepatic hypertrophy, or rhabdomyolysis, but the OATP- of the present invention. Since the R gene expression enhancing composition does not induce the cyp gene, it is safer. Moreover, the TCA cycle metabolite concentration increase inhibitor of the present invention can normalize the concentration of the TCA cycle metabolite by reducing the concentration of the TCA cycle metabolite that is abnormally elevated during renal disease.
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物としては、アンジオテンシンII受容体阻害物質（以下、「ＡＲＢ」とも表示する。）及び／又はグリタゾン系血糖降下物質を含有している限り特に制限されない。ここで、本明細書における「ＡＲＢ」には、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現を増強する活性を有している限り、ＡＲＢの誘導体をも含む。かかるＡＲＢとしては、例えばロサルタン、カンデサルタン、カンデサルタン・シレキセチル（カンデサルタンのプロドラッグ）、オルメサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、テルミサルタン、ＥＸＰ３１７４（ロサルタンの代謝物）、及びＲＮＨ６２７０（オルメサルタン活性体）、又は、薬学上許容され得るこれらの塩若しくは誘導体を好適に例示することができ、中でも、カンデサルタン、オルメサルタン、バルサルタン、エプロサルタン、テルミサルタン、ＥＸＰ３１７４、及びＲＮＨ６２７０（オルメサルタン活性体）をより好適に例示することができ、中でも、ＲＮＨ６２７０を特に好適に例示することができる。前述のグリタゾン系血糖降下物質としては、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現を増強する活性を有するグリタゾン系血糖降下物質である限り特に制限されないが、例えばピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、及びマレイン酸ロシグリタゾン、又は、薬学上許容され得るこれらの塩若しくは誘導体を好適に例示することができ、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、及びマレイン酸ロシグリタゾンをより好適に例示することができる。これらのＡＲＢやグリタゾン系血糖降下物質は、それぞれ２種類以上併用することもできるし、また、ＡＲＢとグリタゾン系血糖降下物質を併用することもできる。なお、上に例示したＡＲＢは降圧剤として既に市販されており、グリタゾン系血糖降下物質は血糖降下物質として既に市販されているため、容易に入手することができる。 The OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains an angiotensin II receptor inhibitor (hereinafter also referred to as “ARB”) and / or a glitazone hypoglycemic substance. Here, “ARB” in the present specification includes ARB derivatives as long as they have an activity of enhancing OATP-R gene expression. Examples of such ARBs include losartan, candesartan, candesartan cilexetil (prodesed of candesartan), olmesartan, valsartan, irbesartan, eprosartan, telmisartan, EXP3174 (metabolite of losartan), and RNH6270 (olmesartan active), or pharmaceutical These salts or derivatives that can be tolerated can be preferably exemplified, among which candesartan, olmesartan, valsartan, eprosartan, telmisartan, EXP3174, and RNH6270 (olmesartan activator) can be more preferably exemplified. Among these, RNH6270 can be particularly preferably exemplified. The aforementioned glitazone hypoglycemic substance is not particularly limited as long as it is a glitazone hypoglycemic substance having an activity to enhance OATP-R gene expression, for example, pioglitazone, troglitazone, rosiglitazone, and rosiglitazone maleate, or These pharmaceutically acceptable salts or derivatives can be preferably exemplified, and pioglitazone, troglitazone, rosiglitazone, and rosiglitazone maleate can be more suitably exemplified. These ARBs and glitazone-based hypoglycemic substances can be used in combination of two or more, respectively, and ARB and glitazone-based hypoglycemic substances can be used in combination. In addition, since ARB illustrated above is already marketed as an antihypertensive agent and the glitazone series hypoglycemic substance is already marketed as a hypoglycemic substance, it can be obtained easily.
「薬学上許容され得る塩」には、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが包含される。この他、上記塩には、ＡＲＢ又はグリタゾン系血糖降下物質と適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。かかる塩は、当業界で周知の方法により調製することができる。これらの塩の中のうち、無毒性アルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩を好適に例示することができ、ナトリウム塩やカルシウム塩を特に好適に例示することができる。 “Pharmaceutically acceptable salts” include non-toxic alkali metal salts, alkaline earth metal salts, ammonium salts and the like such as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, barium and ammonium. In addition, the above-mentioned salts include non-toxic acid addition salts obtained by reacting ARB or glitazone hypoglycemic substances with appropriate organic or inorganic acids. Representative non-toxic acid addition salts include, for example, hydrochloride, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, bisulfate, acetate, oxalate, valerate, oleate, laurate, Borate, benzoate, lactate, phosphate, p-toluenesulfonate (tosylate), citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, sulfonate, glycolate , Ascorbate, benzenesulfonate, napsilate and the like. Such salts can be prepared by methods well known in the art. Among these salts, nontoxic alkali metal salts and alkaline earth metal salts can be preferably exemplified, and sodium salts and calcium salts can be particularly suitably exemplified.
上記の「ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現を増強する活性を有する物質」とは、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を発現し得るヒト又はラット腎細胞株と共培養したり、ヒト又はラットに投与した場合に、不存在又は非投与の場合と比較して、腎細胞等のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を発現し得る細胞内におけるＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を発現し得る細胞内におけるＯＡＴＰ−Ｒの発現が、ｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベルで上昇する物質をいう。ヒトの場合についてより具体的には、後述の実施例１におけるルシフェラーゼアッセイや、後述の実施例４におけるヒト腎癌細胞株を用いたヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現アッセイにおいて、コントロール（ＡＲＢやグリタゾン系血糖降下物質非投与）の場合より、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現や転写活性が上昇する物質を含み、ラットの場合についてより具体的には、後述の実施例５のラットを用いたインビボにおけるＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現アッセイにおいて、コントロール（水）を投与した場合より、ラットＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現が上昇する物質を含む。 The above-mentioned “substance having activity to enhance OATP-R gene expression” is absent when co-cultured with human or rat kidney cell line capable of expressing OATP-R gene or administered to human or rat. Or compared with the case of non-administration, the expression of OATP-R in a cell capable of expressing an OATP-R gene such as a kidney cell is expressed at the mRNA level and / or protein level. The substance that rises at. More specifically, in the case of humans, in the luciferase assay in Example 1 described later and the human OATP-R gene expression assay using the human renal cancer cell line in Example 4 described later, control (ARB or glitazone blood glucose level) In the case of the rat, more specifically, in vivo OATP using the rat of Example 5 described later, including a substance that increases mRNA expression and transcriptional activity of the human OATP-R gene. -In the R gene expression assay, it contains a substance that increases the mRNA expression of rat OATP-R gene compared to when control (water) is administered.
上記のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現の上昇の程度としては、特に制限されないが、コントロールと比較して、割合として、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上である場合を好適に例示することができる。なお、上記のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子としては、ＯＡＴＰ−Ｒのコード領域の上流にＸＲＥ類似配列を備えているＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子である限り特に制限されず、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子、ラットＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を特に好適に例示することができる。 The degree of increase in the mRNA expression of the OATP-R gene is not particularly limited, but is preferably 5% or more, more preferably 10% or more, and even more preferably 15% or more as a percentage compared to the control. A certain case can be preferably exemplified. The OATP-R gene is not particularly limited as long as it is an OATP-R gene having an XRE-like sequence upstream of the OATP-R coding region, and the human OATP-R gene, rat OATP-R gene Can be particularly preferably exemplified.
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物としては、上記のＡＲＢ及び／又はグリタゾン系血糖降下物質を含有している限り特に制限されないが、任意成分として、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を増強する他の成分や、薬学上許容される担体をさらに含有していてもよい。薬学上許容される担体としては、例えば賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤などの任意成分を配合することができる。 The OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above ARB and / or glitazone hypoglycemic substance, but as an optional component, other components that enhance the OATP-R gene In addition, it may further contain a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, excipients, binders, solvents, solubilizers, suspending agents, emulsifiers, isotonic agents, buffers, stabilizers, soothing agents, antiseptics, antiseptics, and the like. Optional components such as an oxidizing agent and a coloring agent can be blended.
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物の剤型としては、特に制限はなく、上記のＡＲＢやグリタゾン系血糖降下物質そのものであってもよいし、散剤、顆粒剤、錠剤等の固形製剤であってもよいし、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤であってもよい。また、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物の投与方法としては、経口投与や静脈投与等を例示することができるが、投与が簡便であることから、経口投与を好ましく例示することができる。 The dosage form of the OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention is not particularly limited, and may be the above-mentioned ARB or glitazone hypoglycemic substance itself, or a solid preparation such as a powder, granule or tablet. It may be a liquid agent such as a solution, an emulsion, or a suspension. In addition, examples of the method for administering the OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention include oral administration and intravenous administration. However, since administration is simple, oral administration can be preferably exemplified. .
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物の投与量としては、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現を増強する活性が得られる限り特に制限されず、投与対象に応じて適宜投与量を調整することができる。投与対象としては、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現を増強する活性が得られる限り特に制限されないが、哺乳動物を例示することができ、中でもヒト、ラットを好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。 The dose of the OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention is not particularly limited as long as the activity of enhancing OATP-R gene expression is obtained, and the dose can be appropriately adjusted according to the administration subject. The administration target is not particularly limited as long as the activity of enhancing OATP-R gene expression is obtained, but mammals can be exemplified, among which humans and rats can be preferably exemplified, and humans are particularly preferred. It can be illustrated.
本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物は、腎機能予防・治療剤としても使用することができる。ＯＡＴＰ−Ｒは、胆汁酸、ジゴキシン、ウアバイン、ｃＡＭＰ等の腎不全物質を対外に排出する活性を有することが知られており、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現を増強することによって、腎機能を改善して腎不全物質の体外への排出機能が促進されて、腎機能障害の予防効果や治療効果が得られると考えられるからである。 The OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention can also be used as an agent for preventing or treating renal function. OATP-R is known to have an activity to excrete renal failure substances such as bile acids, digoxin, ouabain, cAMP and the like, and improves renal function by enhancing the expression of OATP-R gene. This is because it is considered that the function of discharging renal failure substances to the outside of the body is promoted, and the preventive effect and therapeutic effect of renal dysfunction are obtained.
上記の腎機能障害としては、腎臓における尿形成や排泄に関連する機能の障害である限り特に制限されず、例えば、急性腎不全、慢性腎不全、急性腎炎、慢性腎炎、急性尿細管壊死、尿細管間質障害、慢性腎臓病、ネフローゼ症候群、多発性のう胞腎、糖尿病性腎症、及び腎硬化症を好適に例示することができる。 The renal dysfunction is not particularly limited as long as it is a functional disorder related to urine formation or excretion in the kidney. For example, acute renal failure, chronic renal failure, acute nephritis, chronic nephritis, acute tubular necrosis, urine Suitable examples include tubulointerstitial disorder, chronic kidney disease, nephrotic syndrome, polycystic kidney disease, diabetic nephropathy, and nephrosclerosis.
上記の腎機能予防・治療剤には、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物の他に、任意成分として、他の腎機能の予防・治療剤をさらに含有していてもよい。 In addition to the OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention, the above-mentioned agent for preventing or treating renal function may further contain another agent for preventing or treating renal function as an optional component.
また、本発明のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物、好ましくはＡＲＢを含有するＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物、より好ましくは、ＲＮＨ６２７０を含有するＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物は、ＴＣＡサイクル代謝物濃度が異常に上昇した状態を正常化するＴＣＡサイクル代謝物濃度上昇抑制剤としても使用することができる。 The OATP-R gene expression enhancing composition of the present invention, preferably an OATP-R gene expression enhancing composition containing ARB, more preferably an OATP-R gene expression enhancing composition containing RNH6270 is used for TCA cycle metabolism. It can also be used as a TCA cycle metabolite concentration increase inhibitor that normalizes a state in which the product concentration has abnormally increased.
さらに、本発明には、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強組成物の製造におけるＡＲＢ及び／又はグリタゾン系血糖降下物質の使用方法や、腎機能障害の予防・治療剤の製造におけるＡＲＢ及び／又はグリタゾン系血糖降下物質の使用方法や、ＡＲＢ及び／又はグリタゾン系血糖降下物質の腎機能障害の予防・治療における使用や、ＡＲＢ及び／又はグリタゾン系血糖降下物質を哺乳動物（特にヒト又はラット）に投与することを特徴とするＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の増強方法や、ＡＲＢ及び／又はグリタゾン系血糖降下物質を哺乳動物（特にヒト又はラット）に投与することを特徴とする腎機能障害の予防・治療方法も含まれる。これらの使用や方法における文言の内容やその好ましい態様は、前述したとおりである。 Furthermore, the present invention provides a method for using ARB and / or a glitazone hypoglycemic substance in the production of an OATP-R gene expression enhancing composition, and an ARB and / or a glitazone blood sugar in the production of a prophylactic / therapeutic agent for renal dysfunction. Use of hypotensive substances, use of ARB and / or glitazone hypoglycemic substances in the prevention and treatment of renal dysfunction, and administration of ARB and / or glitazone hypoglycemic substances to mammals (especially humans or rats) And a method for preventing and treating renal dysfunction characterized by administering an ARB and / or glitazone hypoglycemic substance to a mammal (particularly a human or a rat). . The contents of the words in these uses and methods and the preferred embodiments thereof are as described above.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
［ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞を用いた、ヒトＯＡＴＰ−Ｒのルシフェラーゼアッセイ１］
ＡＲＢがヒトＯＡＴＰ−Ｒ（ｈＯＡＴＰ−Ｒ）遺伝子のｍＲＮＡ発現を増強するか否かを確認するために、ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞を用いて、ヒトＯＡＴＰ−Ｒのルシフェラーゼアッセイを行なった。具体的には以下のような方法で行なった。
[Using ACHN cells, a human renal cancer cell line, luciferase assay 1 human OATP-R]
In order to confirm whether ARB enhances mRNA expression of human OATP-R (hOATP-R) gene, luciferase assay of human OATP-R was performed using ACHN cells which are human renal cancer cell lines. . Specifically, the following method was used.
ｐＧＬ３プラスミドに、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子（ＳＬＣＯ４Ｃ１）の転写活性領域を組み込み、該転写活性領域の下流にヒトルシフェラーゼ遺伝子を組み込んでレポータープラスミドを作製した。このレポータープラスミドを、ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞株にトランスフェクションして、ヒトＯＡＴＰ−Ｒのルシフェラーゼ用のレポーター細胞を作製した。なお、ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞株は、東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより供与された。 A reporter plasmid was prepared by incorporating the transcription active region of the human OATP-R gene (SLCO4C1) into the pGL3 plasmid and incorporating the human luciferase gene downstream of the transcription active region. This reporter plasmid was transfected into an ACHN cell line, which is a human renal cancer cell line, to produce a reporter cell for luciferase of human OATP-R. The ACHN cell line, which is a human renal cancer cell line, was provided by the Medical Cell Resource Center, Institute of Aging Medicine, Tohoku University.
このレポーター細胞を２４ウェルプレートに、１ウェル当たり２．４×１０５ｃｅｌｌずつ分注し、特定の培地（ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを、それぞれ最終濃度がＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。レポーター細胞が７０−８０％のコンフルエントになったのを確認してから、培地を無血清培地であるＯＰＴＩ−ＭＥＭＩに交換し、４時間培養した後、２４ウェル内の無血清培地と等量の特定の培地を、それぞれのウェル内に添加した。この特定の培地としては、２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に、サンプルとしてＡＲＢを最終濃度１０μＭ又は３０μＭで添加したサンプル培地を用いた。また、サンプル培地に代えて、サンプル無添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）の２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（ネガティブコントロール培地）を用いた。サンプルに用いたＡＲＢは、ロサルタン、ＥＸＰ３１７４（ロサルタンの代謝物）、カンデサルタン、カンデサルタン・シレキセチル（カンデサルタンのプロドラッグ）、オルメサルタン、ＲＮＨ６２７０、バルサルタン、イルベサルタン、エプロサルタン、テルミサルタンの１０種類である。 This reporter cell was dispensed into a 24-well plate at 2.4 × 10 5 cells per well, and a specific medium (RPMI1640 medium containing FBS, penicillin, streptomycin, final concentrations of FBS 10% and penicillin 100 U / ml, respectively). In a medium added to 100 μg / ml of streptomycin), the cells were cultured for 48 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . After confirming that the reporter cells were 70-80% confluent, the medium was changed to OPTI-MEMI, which is a serum-free medium, and cultured for 4 hours, and then the same amount as the serum-free medium in 24 wells. Specific media was added into each well. As this specific medium, a sample medium obtained by adding ARB as a sample to 20% FBS / RPMI1640 medium at a final concentration of 10 μM or 30 μM was used. Further, instead of the sample medium, 20% FBS / RPMI 1640 medium (negative control medium) with no sample added (control) was used. There are 10 types of ARB used for the samples: losartan, EXP3174 (metabolite of losartan), candesartan, candesartan cilexetil (prodrug of candesartan), olmesartan, RNH6270, valsartan, irbesartan, eprosartan, and telmisartan.
これらの特定の培地を添加してから２４時間培養した後、各レポーター細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。それぞれのサンプルについて、コントロールの場合のルシフェラーゼ活性を１．０としたときの相対ルシフェラーゼ活性を算出し、それらをグラフ化した。各種ＡＲＢの結果を図１に示す。図１の結果から分かるように、１０種類のいずれのＡＲＢを添加した場合であっても、コントロールと比較して、ルシフェラーゼ活性が上昇した。すなわち、１０種類すべてのＡＲＢが、腎臓細胞におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現を上昇させることが示された。なお、各種ＡＲＢについてのより詳細な結果は以下のとおりである。括弧内の数値はそのＡＲＢの上記の相対ルシフェラーゼ活性の値である。１０μＭのロサルタン（１．１９）、３０μＭのロサルタン（１．３５）、１０μＭのＥＸＰ３１７４（１．２５）、３０μＭのＥＸＰ３１７４（１．２１）、１０μＭのカンデサルタン（１．３３）、３０μＭのカンデサルタン（１．６５）、１０μＭのカンデサルタン・シレキセチル（１．０３）、３０μＭのカンデサルタン・シレキセチル（１．３２）、１０μＭのオルメサルタン（１．６２）、３０μＭのオルメサルタン（１．５７）、１０μＭのＲＮＨ６２７０（１．３３）、３０μＭのＲＮＨ６２７０（１．５０）、１０μＭのバルサルタン（１．２８）、３０μＭのバルサルタン（１．４７）、１０μＭのイルベサルタン（１．３８）、３０μＭのイルベサルタン（１．２６）、１０μＭのエプロサルタン（１．５７）、３０μＭのエプロサルタン（１．５３）、１０μＭのテルミサルタン（２．００）、３０μＭのテルミサルタン（２．５４）。 After adding these specific media and culturing for 24 hours, the luciferase activity of each reporter cell was measured. For each sample, the relative luciferase activity when the luciferase activity in the case of the control was 1.0 was calculated and graphed. The results of various ARBs are shown in FIG. As can be seen from the results in FIG. 1, luciferase activity increased as compared to the control even when any 10 types of ARBs were added. That is, all 10 types of ARBs were shown to increase mRNA expression of human OATP-R gene in kidney cells. The detailed results for various ARBs are as follows. The numerical value in parentheses is the value of the above relative luciferase activity of the ARB. 10 μM losartan (1.19), 30 μM losartan (1.35), 10 μM EXP3174 (1.25), 30 μM EXP3174 (1.21), 10 μM candesartan (1.33), 30 μM candesartan (1 .65) 10 μM candesartan cilexetil (1.03), 30 μM candesartan cilexetil (1.32), 10 μM olmesartan (1.62), 30 μM olmesartan (1.57), 10 μM RNH6270 (1. 33), 30 μM RNH6270 (1.50), 10 μM valsartan (1.28), 30 μM valsartan (1.47), 10 μM irbesartan (1.38), 30 μM irbesartan (1.26), 10 μM Eprosartan (1.57), 30 μM epro Le Temps (1.53), 10μM of telmisartan (2.00), 30μM of telmisartan (2.54).
［ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞を用いた、ヒトＯＡＴＰ−Ｒのルシフェラーゼアッセイ２］
次に、グリタゾン系血糖降下物質がヒトＯＡＴＰ−Ｒ（ｈＯＡＴＰ−Ｒ）遺伝子のｍＲＮＡ発現を増強するか否かを確認するために、上記実施例１と同様の方法にて、ヒトＯＡＴＰ−Ｒのルシフェラーゼアッセイを行なった。用いた４種類のグリタゾン系血糖降下物質（ピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン、マレイン酸ロシグリタゾン）の相対ルシフェラーゼ活性の結果を図２に示す。図２の結果から分かるように、４種類のいずれのグリタゾン系血糖降下物質を添加した場合であっても、コントロールと比較して、ルシフェラーゼ活性が上昇した。すなわち、４種類すべてのグリタゾン系血糖降下物質が、腎細胞におけるヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現を上昇させることが示された。
[Human OATP-R Luciferase Assay 2 Using ACHN Cells, a Human Renal Cancer Cell Line]
Next, in order to confirm whether or not the glitazone-based hypoglycemic substance enhances mRNA expression of the human OATP-R (hOATP-R) gene, the same method as in Example 1 above was used. A luciferase assay was performed. The results of the relative luciferase activity of the four types of glitazone-based hypoglycemic substances used (pioglitazone, troglitazone, rosiglitazone, rosiglitazone maleate) are shown in FIG. As can be seen from the results in FIG. 2, luciferase activity increased as compared to the control even when any of the four types of glitazone-based hypoglycemic substances was added. That is, it was shown that all four types of glitazone hypoglycemic substances increase the mRNA expression of human OATP-R gene in kidney cells.
［ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞を用いた、ｃｙｐ１ａ１のルシフェラーゼアッセイ］
ダイオキシン類をはじめとするＡｈＲリガンドは、生体内で薬物代謝酵素の誘導、発癌、内分泌撹乱、奇形の誘導、免疫不全、体重減少などの副作用を起こす可能性が指摘されている。そこで代表的ＡｈＲリガンドであるダイオキシン類によって誘導のかかるＸＲＥ配列をその５’上流に持つ解毒酵素ｃｙｐ１ａ１の転写領域を単離し、該転写領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を組み込んで、レポータープラスミドを作製した。このレポータープラスミドを、ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞株にトランスフェクションして、ｃｙｐ１ａ１のルシフェラーゼアッセイ用のレポーター細胞を作製した。このレポーター細胞について、実施例１と同様のアッセイを行なったところ、１０種類のいずれのＡＲＢも、腎臓細胞におけるｃｙｐ１ａ１遺伝子のｍＲＮＡ発現を上昇させないことが示された。このことは、ＡＲＢが安全であることや、発癌などの副作用をもたらさないことを強く示唆した。
[Cyp1a1 luciferase assay using ACHN cells, a human renal cancer cell line]
It has been pointed out that AhR ligands including dioxins may cause side effects such as induction of drug metabolizing enzymes, carcinogenesis, endocrine disruption, induction of malformation, immunodeficiency, and weight loss in vivo. Therefore, a transcription region of the detoxification enzyme cyp1a1 having such an XRE sequence induced by dioxins that are typical AhR ligands 5 ′ upstream was isolated, and a luciferase gene was incorporated downstream of the transcription region to prepare a reporter plasmid. This reporter plasmid was transfected into the ACHN cell line, which is a human renal cancer cell line, to prepare reporter cells for cyp1a1 luciferase assay. When this reporter cell was assayed in the same manner as in Example 1, it was shown that none of the 10 ARBs increased the mRNA expression of the cyp1a1 gene in kidney cells. This strongly suggested that ARB is safe and does not cause side effects such as carcinogenesis.
［ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞を用いたヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現アッセイ］
ＡＲＢがヒトＯＡＴＰ−Ｒ（ｈＯＡＴＰ−Ｒ）遺伝子のｍＲＮＡ発現を実際に増強するか否かを確認するために、ヒト腎癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞を用いて、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子についての定量ＲＴ−ＰＣＲを行なった。具体的には以下のような方法で行なった。
[Human OATP-R gene expression assay using ACHN cells, a human renal cancer cell line]
In order to confirm whether ARB actually enhances mRNA expression of human OATP-R (hOATP-R) gene, quantification of human OATP-R gene using ACHN cells, which are human renal cancer cell lines RT-PCR was performed. Specifically, the following method was used.
ＡＣＨＮ細胞はＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子を発現し得る細胞である。このＡＣＨＮ細胞を２４ウェルプレートに、１ウェル当たり２．４×１０５ｃｅｌｌずつ分注し、特定の培地（ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを、それぞれ最終濃度がＦＢＳ１０％、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。ＡＣＨＮ細胞が７０−８０％のコンフルエントになったのを確認してから、培地を無血清培地であるＯＰＴＩ−ＭＥＭＩに交換し、４時間培養した後、２４ウェル内の無血清培地と等量の特定の培地を、それぞれのウェル内に添加した。この特定の培地としては、２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に、サンプルとしてＲＮＨ６２７０（オルメサルタン活性体）を最終濃度１０μＭ又は３０μＭで添加したサンプル培地を用いた。また、サンプル培地に代えて、サンプル無添加（ｃｏｎｔｒｏｌ）の２０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地（ネガティブコントロール培地；Ｃ）を用いた。 ACHN cells are cells that can express the OATP-R gene. The ACHN cells were dispensed into a 24-well plate at 2.4 × 10 5 cells per well, and a specific medium (RPMI1640 medium containing FBS, penicillin, and streptomycin, final concentrations of FBS 10%, penicillin 100 U / ml, respectively) In a medium added to 100 μg / ml of streptomycin), the cells were cultured for 48 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . After confirming that the ACHN cells were 70-80% confluent, the medium was replaced with serum-free medium OPTI-MEMI, and cultured for 4 hours, and then the same amount as the serum-free medium in 24 wells. Specific media was added into each well. As this specific medium, a sample medium in which RNH6270 (olmesartan active substance) was added as a sample at a final concentration of 10 μM or 30 μM to 20% FBS / RPMI1640 medium was used. Further, instead of the sample medium, 20% FBS / RPMI1640 medium (negative control medium; C) with no sample added (control) was used.
これらの特定の培地を添加してから２４時間培養した後、培養細胞を１０ｍｌのＴＲＩＺＯＬ液（インビトロジェン社製）に加え、ポリトロン破砕機の最大速度（１００，０００ｒｐｍ）で１分間ホモジエナイズした。ホモジナイズした溶液に２倍量のクロロフォルム液を加えて攪拌後、遠心分離し、水相部分を別のチューブに移した。この水相に２倍量のイソプロピルアルコールを添加し、１５０００ｒｐｍで冷却遠心を行ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをテンプレートとし、SuperScriptIII RTS ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。TaqMan Probe（アプライドバイオシステム社製）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、培養細胞中のヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。 After adding these specific media and culturing for 24 hours, the cultured cells were added to 10 ml of TRIZOL solution (manufactured by Invitrogen) and homogenized for 1 minute at the maximum speed (100,000 rpm) of a polytron crusher. Two times the amount of chloroform solution was added to the homogenized solution, stirred, and then centrifuged, and the aqueous phase portion was transferred to another tube. Two times the amount of isopropyl alcohol was added to this aqueous phase, followed by cooling and centrifugation at 15000 rpm to extract RNA. Using the extracted RNA as a template, cDNA synthesis was performed using a SuperScriptIII RTS first strand cDNA synthesis kit (Invitrogen). Quantitative RT-PCR was performed using TaqMan Probe (Applied Biosystems) to quantify the mRNA expression level of the human OATP-R gene in the cultured cells.
各サンプルについてＮ＝５にて定量し、各サンプルごとにｍＲＮＡ発現量の平均値を算出した。水の場合のｍＲＮＡ発現量の平均値を１として、各サンプルのｍＲＮＡ発現量の平均値を補正し、相対ｍＲＮＡ量を算出した。以上の定量ＲＴ−ＰＣＲの結果を図３に示す。図３の結果から分かるように、ＲＮＨ６２７０（ＡＲＢ）の添加によって、ヒトＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現が有意に上昇することが示された。 Each sample was quantified at N = 5, and the average value of mRNA expression level was calculated for each sample. The average mRNA expression level in the case of water was taken as 1, and the average mRNA expression level of each sample was corrected to calculate the relative mRNA amount. The results of the above quantitative RT-PCR are shown in FIG. As can be seen from the results in FIG. 3, it was shown that the addition of RNH6270 (ARB) significantly increased the mRNA expression of the human OATP-R gene.
［インビボにおけるＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現アッセイ］
ＡＲＢのＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強作用が、インビボにおいても得られるか否かを確認するために、ラットを用いて、インビボにおけるＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現アッセイを行なった。具体的には以下のような方法で行なった。
[In vivo OATP-R gene expression assay]
In order to confirm whether the OATP-R gene expression enhancing action of ARB can be obtained in vivo, an in vivo OATP-R gene expression assay was performed using rats. Specifically, the following method was used.
１０匹のＷｉｓｔｅｒラットを水（コントロール）投与群（control）（５匹）、ＲＮＨ６２７０投与群（ＲＮＨ）（５匹）に分けた。ＲＮＨ６２７０投与群には、０．５％ＮａＨＣＯ３水溶液を溶媒としてＲＮＨ６２７０を低容量（０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）で７日間、飲水投与した。コントロール群には、ＲＮＨ６２７０投与群に投与したのと同量の０．５％ＮａＨＣＯ３水溶液を投与した。なお、Ｗｉｓｔｅｒラットについて、コントロール又はＲＮＨ６２７０投与前１週間から、投与後３週間経過まで、その血圧、体重、血清クレアチニン、クレアチニンクリアランスを計測し（図４）、それらをあまり大きくは変化させないＲＮＨ６２７０の投与量として、０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとした。 Ten Wister rats were divided into a water (control) administration group (5 animals) and an RNH6270 administration group (RNH) (5 animals). In the RNH6270 administration group, 0.5% NaHCO 3 aqueous solution was used as a solvent, and RNH6270 was administered by drinking at a low volume (0.3 mg / kg / day) for 7 days. The control group was administered 0.5% NaHCO 3 solution the same amount as that administered to RNH6270 administration group. For Wister rats, blood pressure, body weight, serum creatinine, and creatinine clearance were measured from 1 week before control or RNH6270 administration to 3 weeks after administration (FIG. 4), and administration of RNH6270 that did not change them significantly. The amount was 0.3 mg / kg / day.
前述のコントロール投与群及びＲＮＨ６２７０投与群について、７日間の投与終了後、各Ｗｉｓｔｅｒラットを解剖して、腎臓を摘出した。摘出した腎臓１ｇを１０ｍｌのＴＲＩＺＯＬ液（インビトロジェン社製）に加え、ポリトロン破砕機の最大速度（１００，０００ｒｐｍ）で１分間ホモジエナイズした。ホモジナイズした溶液に２倍量のクロロフォルム液を加えて攪拌後、遠心分離し、水相部分を別のチューブに移した。この水相に２倍量のイソプロピルアルコールを添加し、１５０００ｒｐｍで冷却遠心を行ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをテンプレートとし、SuperScriptIII RTS ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。TaqMan Probe（アプライドバイオシステム社製）を用いて実施例４記載の方法と同様の方法で定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、ラット腎臓細胞中のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量（ＧＡＰＤＨに対する相対発現量）を、各サンプル群についてＮ＝５にて定量し、各サンプルごとにｍＲＮＡ発現量の平均値を算出した。コントロールである０．５％ＮａＨＣＯ３水溶液を用いた場合のラットＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を１として、各サンプルのｍＲＮＡ発現量の平均値を補正し、相対ｍＲＮＡ量を算出した。これらの結果を図５に示す。図５から分かるように、ＲＮＨ６２７０のＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現増強活性は、インビボにおいても得られることが示された。 For the control administration group and the RNH6270 administration group, after completion of the administration for 7 days, each Wister rat was dissected and the kidney was removed. 1 g of the extracted kidney was added to 10 ml of TRIZOL solution (manufactured by Invitrogen) and homogenized for 1 minute at the maximum speed (100,000 rpm) of a polytron crusher. Two times the amount of chloroform solution was added to the homogenized solution, stirred, and then centrifuged, and the aqueous phase portion was transferred to another tube. Two times the amount of isopropyl alcohol was added to this aqueous phase, followed by cooling and centrifugation at 15000 rpm to extract RNA. Using the extracted RNA as a template, cDNA synthesis was performed using a SuperScriptIII RTS first strand cDNA synthesis kit (Invitrogen). Quantitative RT-PCR was performed using TaqMan Probe (Applied Biosystems) in the same manner as described in Example 4, and mRNA expression level of OATP-R gene in rat kidney cells (relative expression level to GAPDH) Was quantified for each sample group at N = 5, and the average value of mRNA expression level was calculated for each sample. The mRNA expression level of rat OATP-R gene in the case of using 0.5% NaHCO 3 aqueous solution as a control was set to 1, and the average value of mRNA expression level of each sample was corrected to calculate the relative mRNA level. These results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 5, it was shown that the OATP-R gene expression enhancing activity of RNH6270 can be obtained in vivo.
［ＲＮＨ６２７０投与群のラットの血液の解析］
上記実施例５の結果から分かるように、ＡＲＢの１種であるＲＮＨ６２７０の投与によって、インビボにおいても、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子の発現が増強されることが示された。そこで、上記実施例５におけるＲＮＨ６２７０投与群及びコントロール群のラット（ＲＮＨ６２７０又はコントロールの投与開始から７日間経過したラット）の血液を採取し、キャピラリー電気泳動質量分析装置（ＣＥ−ＭＳ）を用いてその血液を解析した。本発明者らの先願である特願２００８−２６４６７５号にも示したように、ＯＡＴＰ−Ｒはアニオンだけでなく、カチオンも輸送することを既に確認しているので、上記血液中のアニオン類とカチオン類の解析を行なった。カチオン類の解析結果を図６に、アニオン類の解析結果を図７に示す。なお、本明細書中における「カチオン類」には、塩基性条件下でカチオンとなる物質も含まれ、例えば、塩基性条件下でカチオンとなるアミノ酸類も含まれる。
[Analysis of blood of rats in RNH6270 administration group]
As can be seen from the results of Example 5 above, it was shown that the administration of RNH6270, which is a kind of ARB, enhanced the expression of the OATP-R gene even in vivo. Therefore, blood of the rats of the RNH6270 administration group and the control group in Example 5 (rats after 7 days from the start of administration of RNH6270 or control) was collected, and the blood was collected using a capillary electrophoresis mass spectrometer (CE-MS). Blood was analyzed. As shown in Japanese Patent Application No. 2008-264675 which is a prior application of the present inventors, it has already been confirmed that OATP-R transports not only anions but also cations. And cations were analyzed. The analysis result of cations is shown in FIG. 6, and the analysis result of anions is shown in FIG. In addition, the “cations” in this specification includes substances that become cations under basic conditions, for example, amino acids that become cations under basic conditions.
図６の結果から分かるように、ＲＮＨ６２７０投与群の血液では、コントロール投与群の血液と比較して、メチオニン（methionine）、チロシン（tyrosine）、グルタチオン（酸化型）２価（glutathione (ox) divalent）、システイン−グルタチオン ジスルフィド（cysteine-glutathione disulphide）、及び、β−アラニン（bea-alanine）の濃度が低下していた。また、図７の結果から分かるように、ＲＮＨ６２７０投与群の血液では、コントロール投与群の血液と比較して、フマル酸塩（fumarate）、コハク酸塩（succinate）、２−ヒドロキシペンタノエート（2-hydroxypentanoate）、２−オキソグルタレート（2-oxoglutarate）、シス−アコニット酸塩（cis-aconitate）、Ｎ−アセチルノイラミネート（N-acetylneuraminate）、グリコール酸塩（glycolate）、マレイン酸塩（malate）、グリセロリン酸塩（glycerophosphate）、安息香酸塩（benzoate）、トランス−アコニット酸塩（trans-aconitate）、３−ホスホグリセリン酸塩（3-phosphoglycerate）、糖酸塩（saccharate）、グリコール酸塩（glycocholate）の濃度が低下していた。 As can be seen from the results in FIG. 6, methionine, tyrosine, glutathione (ox) divalent in the blood of the RNH6270-administered group compared to the blood of the control-administered group. The concentrations of cysteine-glutathione disulphide and β-alanine were decreased. Further, as can be seen from the results of FIG. 7, in the blood of the RNH6270 administration group, compared with the blood of the control administration group, fumarate, succinate, 2-hydroxypentanoate (2 -hydroxypentanoate), 2-oxoglutarate, cis-aconitate, N-acetylneuraminate, glycolate, maleate , Glycerophosphate, benzoate, trans-aconitate, 3-phosphoglycerate, saccharate, glycolate ) Concentration decreased.
図６及び図７の結果によると、ＲＮＨ６２７０投与群においては、ＯＡＴＰ−Ｒの各種基質の濃度が低下していた。すなわち、ＲＮＨ６２７０投与によってＯＡＴＰ−Ｒタンパク質の発現がインビボで増強されており、その結果、その個体のＯＡＴＰ−Ｒの活性が上昇していることが示された。特に、腎不全物質であるトランス−アコニット酸塩は、ＴＣＡサイクル中における重要な酵素であるアコニターゼを抑制して、ＴＣＡサイクルを止め、クエン酸などのＴＣＡサイクル代謝物の濃度を上昇させる。また、本願発明者らのこれまでの研究において、トランス−アコニターゼは血圧を上昇させ、腎尿細管での酸化ストレスを産生することが解明されている。腎不全ラットにＡＲＢを投与してトランス−アコニット酸塩の血中濃度が低下したことは、腎不全時の腎を含めた臓器の障害の軽減と、降圧（レニン−アンギオテンシン系に関しない降圧）をもたらすと考えられる。 According to the results of FIGS. 6 and 7, the concentrations of various substrates of OATP-R were decreased in the RNH6270 administration group. That is, it was shown that the expression of OATP-R protein was enhanced in vivo by administration of RNH6270, and as a result, the activity of OATP-R in the individual increased. In particular, trans-aconitate, a renal failure substance, suppresses aconitase, an important enzyme in the TCA cycle, stops the TCA cycle, and increases the concentration of TCA cycle metabolites such as citric acid. In addition, it has been elucidated in previous studies by the present inventors that trans-aconitase increases blood pressure and produces oxidative stress in renal tubules. Decreasing blood levels of trans-aconitate in rats with renal failure caused a reduction in damage to organs, including the kidney during renal failure, and decreased blood pressure (hypertensive pressure not related to the renin-angiotensin system). It is thought to bring.
また、本発明者らは、ＲＮＨ６２７０投与群の血液で濃度が低下していた前述の図７記載の物質の中に、トランス−アコニット酸塩にもＴＣＡサイクルを構成する代謝物が多いことを見い出した。図８に、ＴＣＡサイクルを構成する代謝物と、その代謝物の図７における結果を示す。図８の結果から分かるように、ＲＮＨ６２７０投与群では、ＴＣＡサイクルを構成する代謝物の濃度が、コントロール群と比較して低下している。このことから、ＲＮＨ６２７０等のＡＲＢは、腎不全時に異常に上昇しているＴＣＡサイクルの代謝物の濃度を低下させることによって、ＴＣＡサイクル代謝物の濃度を正常化する作用を有していることが示された。 In addition, the present inventors have found that trans-aconite has many metabolites constituting the TCA cycle among the substances shown in FIG. 7 whose concentration has been reduced in the blood of the RNH6270 administration group. It was. FIG. 8 shows the metabolites constituting the TCA cycle and the results of the metabolites in FIG. As can be seen from the results in FIG. 8, the concentration of metabolites constituting the TCA cycle is lower in the RNH6270 administration group than in the control group. Thus, ARBs such as RNH6270 have the effect of normalizing the concentration of TCA cycle metabolites by lowering the concentration of TCA cycle metabolites that are abnormally elevated during renal failure. Indicated.
本発明は、ＯＡＴＰ−Ｒ遺伝子発現の増強や、ＴＣＡサイクル代謝物濃度の上昇抑制に関連する分野で好適に用いることができる。 The present invention can be suitably used in fields related to enhancement of OATP-R gene expression and suppression of increase in TCA cycle metabolite concentration.
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Citations (4)
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| JPH11513395A (en) * | 1995-10-06 | 1999-11-16 | ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト | AT1-receptor antagonist for prevention and treatment of post-ischemic renal failure and protection of ischemic kidney |
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- 2009-09-15 JP JP2009212962A patent/JP2011063518A/en active Pending
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|---|
| JPN6013058348; Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １９９８， Ｖｏｌ．１１， ｐｐ．１４４７-１４５２ * |
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