JP2011059126A5

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Publication number: JP2011059126A5
Application number: JP2010244708A
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Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2011-09-29
Anticipated expiration: 2027-03-26

Description

Pharmaceutical compositions and medicaments containing sulfated polysaccharides or sulfated oligosaccharides

本発明は、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬に関する。 The present invention relates to pharmaceutical compositions and pharmaceuticals comprising the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharides.

硫酸化多糖および硫酸化オリゴ糖の中でも、特にコンドロイチン硫酸(CS)やデルマタン硫酸(DS)等のグリコサミノグリカン(GAG)は、ヘパリンやヘパラン硫酸(HS)とともにその生物活性が注目され、盛んに研究されている。例えば、コンドロイチン硫酸(CS)やデルマタン硫酸(DS)は、コアタンパク質に共有結合した形でプロテオグリカン(PG)として合成され（非特許文献１〜３）、あらゆる組織の細胞表面や細胞外マトリックスに存在していることが報告されている。さらに、こうしたCS/DS-PGsは、哺乳類の脳の構成成分であり、神経細胞の接着、移動、分化、神経突起形成や軸索誘導などの調節を通して、神経の発生に関与していることも報告されている（非特許文献４〜８）。しかしながら、これらグリコサミノグリカンの生物活性等についてはいまだ不明な点が多く、基礎医学、応用医学、創薬等の各分野において、さらなる研究が要求されている。 Among sulfated polysaccharides and sulfated oligosaccharides, glycosaminoglycans (GAG) such as chondroitin sulfate (CS) and dermatan sulfate (DS) are particularly popular because of their biological activity along with heparin and heparan sulfate (HS). Has been studied. For example, chondroitin sulfate (CS) and dermatan sulfate (DS) are synthesized as proteoglycan (PG) in a form covalently bound to the core protein (Non-Patent Documents 1 to 3) and exist on the cell surface and extracellular matrix of all tissues. Has been reported. Furthermore, these CS / DS-PGs are components of the mammalian brain and may be involved in the development of nerves through the regulation of nerve cell adhesion, migration, differentiation, neurite formation and axon guidance. It has been reported (Non-Patent Documents 4 to 8). However, there are still many unclear points regarding the biological activity and the like of these glycosaminoglycans, and further research is required in various fields such as basic medicine, applied medicine, and drug discovery.

例えば、これまでに、ヘパリンが癌転移の阻害活性を示すことが分かっていたが、出血などの副作用があるため臨床応用には至っておらず、さらに良質な腫瘍転移阻害剤等の研究開発が求められている。また、ヘパラン硫酸がヘルペスウイルスやデングウイルスの感染のレセプターとなるという報告はあるが、CSについてはそのような報告はない。 For example, until now it has been known that heparin has an inhibitory activity on cancer metastasis, but it has not been clinically applied due to side effects such as bleeding, and there is a need for research and development of higher-quality tumor metastasis inhibitors, etc. It has been. In addition, there are reports that heparan sulfate is a receptor for herpes virus and dengue virus infection, but there is no such report for CS.

The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J., ed.), pp. 267-371, Plenum Publishing, New York (1980)The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J., ed.), Pp. 267-371, Plenum Publishing, New York (1980) Annu. Rev. Biochem. 47, 385-417 (1991)Annu. Rev. Biochem. 47, 385-417 (1991) Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 321-349 (2000)Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 321-349 (2000) Persp. Dev. Neurol. 3, 319-330 (1996)Persp. Dev. Neurol. 3, 319-330 (1996) Physiol. Rev. 80, 1267-1290 (2000)Physiol. Rev. 80, 1267-1290 (2000) Arch. Biochem. Biophys. 374, 24-34 (2000)Arch. Biochem. Biophys. 374, 24-34 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 13, 612-620 (2003)Curr. Opin. Struct. Biol. 13, 612-620 (2003) Glycoconj. J. 21, 329-341 (2004)Glycoconj. J. 21, 329-341 (2004) Sugahara, K., Tanaka, Y., Yamada, S., Seno, N., and Kitagawa, H. (1996) J. Biol. Chem. 271(43), 26745-26754.Sugahara, K., Tanaka, Y., Yamada, S., Seno, N., and Kitagawa, H. (1996) J. Biol. Chem. 271 (43), 26745-26754.

したがって、本発明は、優れた生物活性を有する硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬を提供することを目的とする。 Accordingly, the present invention aims at providing pharmaceutical compositions and medicaments comprising sulfated polysaccharide or a sulfated oligosaccharide having a superior biological activity.

前記課題を解決するために、本発明の第１の薬学的組成物は、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する用途に使用される。そして、本発明の第２の薬学的組成物は、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、およびCS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含み、デングウィルス感染阻害に関する用途に使用される。さらに、本発明の第３の薬学的組成物は、コンドロイチン硫酸E（CS-E）を活性物質として含み、細胞増殖阻害、細胞死誘導、腫瘍細胞増殖阻害、腫瘍細胞浸潤阻害、腫瘍細胞転移阻害、腫瘍細胞遊走阻害、および腫瘍細胞死誘導からなる群から選択される少なくとも一つに関する用途に使用される。 In order to solve the above problems, the first pharmaceutical composition of the present invention comprises at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K, and oxidized CS-E, Used for applications related to growth factor binding. The second pharmaceutical composition of the present invention comprises CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K. It contains at least one selected from the group and is used for applications related to dengue virus infection inhibition. Furthermore, the third pharmaceutical composition of the present invention contains chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance, cell growth inhibition, cell death induction, tumor cell growth inhibition, tumor cell invasion inhibition, tumor cell metastasis inhibition And at least one selected from the group consisting of tumor cell migration inhibition and tumor cell death induction.

また、本発明の第１の医薬は、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。そして、本発明の第２の医薬は、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、およびCS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含み、デングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。さらに、本発明の第３の医薬は、コンドロイチン硫酸E（CS-E）を活性物質として含み、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。 The first medicament of the present invention contains at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K, and oxidized CS-E, and treats and diagnoses a disease relating to growth factor binding. Used in at least one application selected from the group consisting of symptom relief and prevention. The second medicament of the present invention is selected from the group consisting of CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K. And used for at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, alleviation of symptoms and prevention of diseases relating to dengue virus infection inhibition. Furthermore, the third medicament of the present invention contains at least one chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance, and is selected from the group consisting of treatment, diagnosis, reduction of symptoms and prevention of diseases related to cell proliferation. Used for applications.

本発明の薬学的組成物および医薬は、前記特定の硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を活性物質として含むことにより、その活性物質に対応した優れた生物活性を有する。なお、多糖またはオリゴ糖を酵素消化すると、通常、二糖（ジサッカリド）が生成するが、場合によっては、単糖（モノサッカリド）や三糖（トリサッカリド）が生成するので、本発明はこれらを含む。 The pharmaceutical composition and medicament of the present invention have excellent biological activity corresponding to the active substance by containing the specific sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide as the active substance. In addition, enzymatic digestion of polysaccharides or oligosaccharides usually produces disaccharides (disaccharides), but in some cases, monosaccharides (monosaccharides) and trisaccharides (trisaccharides) are produced. Including.

図１は、コンドロイチナーゼABC消化の、ルイス肺癌H11細胞の転移能に対する効果を示す図である。FIG. 1 is a graph showing the effect of chondroitinase ABC digestion on the metastatic ability of Lewis lung cancer H11 cells. 図２は、種々のCSアイソフォームによるルイス肺癌H11細胞転移阻害を示す図である。FIG. 2 shows the inhibition of Lewis lung cancer H11 cell metastasis by various CS isoforms. 図３は、ルイス肺癌H11細胞の転移に対するCS-Eの阻害活性について、コンドロイチナーゼABC処理の効果を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the effect of chondroitinase ABC treatment on the inhibitory activity of CS-E on Lewis lung cancer H11 cell metastasis. 図４は、ルイス肺癌H11細胞の転移に対するCS-Eの阻害活性の用量依存性を示す図である。FIG. 4 is a graph showing the dose dependency of CS-E inhibitory activity against Lewis lung cancer H11 cell metastasis. 図５は、デングウィルス２型感染の、コンドロイチン硫酸（CS）製剤による阻害を示す図である。FIG. 5 is a diagram showing inhibition of dengue virus type 2 infection by a chondroitin sulfate (CS) preparation. 図６は、デングウィルス２型感染の濃度依存阻害を示す図である。FIG. 6 shows concentration-dependent inhibition of dengue virus type 2 infection. 図７は、化学修飾（酸化処理）したCS-E製剤の、デングウィルス２型感染阻害を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing dengue virus type 2 infection inhibition of a chemically modified (oxidized) CS-E preparation. 図８は、精製CS-Kに対する種々の成長因子および神経栄養性因子の結合を示す図である。FIG. 8 shows the binding of various growth factors and neurotrophic factors to purified CS-K. 図９は、GAGｓ被覆基層上で培養したE16海馬ニューロンの代表的形態および神経突起伸長を示す図であり、図９（Ａ）は、増大した神経長および代表的形態を示し、図９（Ｂ）は、生成した神経突起の定量的分析を示す図である。FIG. 9 shows representative morphology and neurite outgrowth of E16 hippocampal neurons cultured on GAGs-coated substrata, FIG. 9 (A) shows increased nerve length and representative morphology, and FIG. ) Is a diagram showing a quantitative analysis of the generated neurites. 図１０は、化学修飾CS-E製剤により刺激したニューロンの代表的形態、およびそれらの神経突起伸長促進活性の定量分析を示す図であり、図１０（Ａ）は、CS-E, CS-EPまたはCS-EPAでコートした種々の基層で培養したニューロンの、増加した神経突起長および形態学的特徴を示し、図１０（Ｂ）は、生成した神経突起の定量的分析を示す図である。FIG. 10 is a diagram showing a representative form of neurons stimulated by a chemically modified CS-E preparation and quantitative analysis of their neurite outgrowth promoting activity, and FIG. 10 (A) shows CS-E, CS-EP. Or shows increased neurite length and morphological characteristics of neurons cultured in various substrata coated with CS-EPA, and FIG. 10 (B) shows a quantitative analysis of the generated neurites. 図１１は、CS-Kテトラサッカリド(K-K)のCSase ABC消化物におけるESI-MSスペクトル（200〜700m/z amu間）図である。FIG. 11 is an ESI-MS spectrum (between 200 and 700 m / z amu) of a CSase ABC digest of CS-K tetrasaccharide (K-K). 図１２は、９７における硫酸基（sulfite group）についてのプリカーサーイオンモードにより得られたESI-MSスペクトル図である。FIG. 12 is an ESI-MS spectrum diagram obtained by the precursor ion mode for the sulfate group in 97. 図１３は、３００[GalNAc(4S)]についてのプリカーサーイオンモードにより得られたESI-MSスペクトル図である。FIG. 13 is an ESI-MS spectrum diagram obtained by the precursor ion mode for 300 [GalNAc (4S)]. 図１４は、ΔA-KテトラサッカリドCSase ABC消化物のアニオン交換HPLCクロマトグラム図である。FIG. 14 is an anion exchange HPLC chromatogram of ΔA-K tetrasaccharide CSase ABC digest. 図１５は、図１４由来GalNAc(4S)ピークのESI-MSスペクトル図である。FIG. 15 is an ESI-MS spectrum diagram of the GalNAc (4S) peak derived from FIG. 図１６は、CSase ABC消化し2-AB標識したCS-Kポリサッカリド製剤のアニオン交換HPLCクロマトグラム図である。FIG. 16 is an anion exchange HPLC chromatogram of a CS-K polysaccharide preparation that has been digested with CSase ABC and labeled with 2-AB. 図１７は、2-AB-標識不飽和CSジサッカリド標準およびGalNAc(4S)標準の、HPLC条件B下におけるアニオン交換HPLCクロマトグラム図である。FIG. 17 is an anion exchange HPLC chromatogram of the 2-AB-labeled unsaturated CS disaccharide standard and GalNAc (4S) standard under HPLC condition B. 図１８は、2-AB標識後の、CSases ACIおよびACII抵抗性CS-EテトラサッカリドフラクションCSase ABC消化物のアニオン交換HPLCクロマトグラム図である。FIG. 18 is an anion exchange HPLC chromatogram of CSases ACI and ACII resistant CS-E tetrasaccharide fraction CSase ABC digest after 2-AB labeling. 図１９は、2-AB標識後の、CSases ACIおよびACII抵抗性テトラサッカリドフラクションCSase ABC消化物のゲル濾過クロマトグラム図である。FIG. 19 is a gel filtration chromatogram of CSases ACI and ACII resistant tetrasaccharide fraction CSase ABC digest after 2-AB labeling. 図２０は、図１９におけるフラクション４のESI-MSスペクトル図である。FIG. 20 is an ESI-MS spectrum diagram of fraction 4 in FIG. 図２１は、HPLC条件B下での、図１９におけるフラクション４のアニオン交換HPLCクロマトグラム図である。FIG. 21 is an anion exchange HPLC chromatogram of fraction 4 in FIG. 19 under HPLC condition B. 図２２は、HPLC条件B下での、図１９におけるフラクション４の、信頼性のあるΔCSジサッカリド標準および2-AB標識GalNAc(4S)標準混合物との共クロマトグラフの、アニオン交換HPLCクロマトグラム図である。FIG. 22 is an anion exchange HPLC chromatogram of a co-chromatograph of fraction 4 in FIG. 19 with a reliable ΔCS disaccharide standard and a 2-AB labeled GalNAc (4S) standard mixture under HPLC condition B. is there.

次に、本発明の薬学的組成物および医薬について例を挙げて説明する。 Next, the pharmaceutical composition and medicament of the present invention will be described with examples .

本発明の第１の薬学的組成物は、前記の通り、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する用途に使用される。また、本発明の第１の医薬は、前記の通り、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含み、増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。 As described above, the first pharmaceutical composition of the present invention contains at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K, and oxidized CS-E, and relates to growth factor binding. Used for applications. Further, as described above, the first medicament of the present invention contains at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K, and oxidized CS-E, and is a disease relating to growth factor binding. It is used for at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, symptom reduction and prevention.

本発明者らは、コンドロイチン硫酸（CS）の生物活性について鋭意研究の結果、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eが神経突起伸長促進活性および増殖因子結合活性を有し、神経突起伸長促進および増殖因子結合促進の少なくとも一方に関する用途に使用できることを見出し、前記本発明の第１の薬学的組成物および第１の医薬の発明に到達した。前記用途としては、例えば、神経突起伸長促進および増殖因子結合促進の少なくとも一方に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途がある。特に、酸化処理したCS-KおよびCS-Eは、酸化処理による副作用の軽減で、母体のCS-KまたはCS-Eよりも臨床等の用途にさらに有用であることが期待される。前記酸化処理は、例えば、過ハロゲン酸による酸化処理が好ましく、前記過ハロゲン酸は、過ヨウ素酸がより好ましく、また、前記酸化処理したCS-KまたはCS-Eが、例えば、酸化処理後、さらにアルカリ処理したCS-KまたはCS-Eであることがさらに好ましい。 As a result of intensive studies on the biological activity of chondroitin sulfate (CS), the present inventors have found that CS-K, oxidized CS-K and oxidized CS-E have neurite outgrowth promoting activity and growth factor binding activity. Thus, the present inventors have found that it can be used for applications relating to at least one of promoting neurite outgrowth and promoting growth factor binding, and have arrived at the first pharmaceutical composition of the present invention and the first pharmaceutical invention. Examples of the use include at least one use selected from the group consisting of treatment, diagnosis, symptom reduction, and prevention of diseases related to at least one of promoting neurite outgrowth and promoting growth factor binding. In particular, oxidized CS-K and CS-E are expected to be more useful for clinical applications than maternal CS-K or CS-E because of reduction of side effects due to oxidation treatment. The oxidation treatment is preferably, for example, an oxidation treatment with perhalogen acid, and the perhalogen acid is more preferably periodic acid, and the oxidized CS-K or CS-E is, for example, after the oxidation treatment, More preferably, it is CS-K or CS-E that has been alkali-treated.

また、本発明の第２の薬学的組成物は、前記の通り、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、およびCS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含み、デングウィルス感染阻害に関する用途に使用される。そして、本発明の第２の医薬は、前記の通り、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、およびCS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含み、デングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。 In addition, as described above, the second pharmaceutical composition of the present invention includes CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS It contains at least one selected from the group consisting of -K, and is used for applications relating to dengue virus infection inhibition. And, as described above, the second medicament of the present invention comprises CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K. And at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, alleviation and prevention of diseases related to inhibition of dengue virus infection.

従来、コンドロイチン硫酸のデングウィルス感染阻害に関する報告はなかった。しかし、本発明者らは、鋭意研究の結果、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、またはCS-Kがデングウィルス感染阻害活性を有することを見出し、前記本発明の第２の薬学的組成物および前記本発明の第２の医薬の発明に到達した。 Conventionally, there has been no report regarding inhibition of dengue virus infection by chondroitin sulfate. However, as a result of diligent research, the present inventors have found that CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), or CS-K is a dengue virus. It has been found that it has an infection inhibitory activity, and has reached the invention of the second pharmaceutical composition of the present invention and the second pharmaceutical invention of the present invention .

さらに、本発明の第３の薬学的組成物は、前記の通り、コンドロイチン硫酸E（CS-E）を活性物質として含み、細胞増殖阻害、細胞死誘導、腫瘍細胞増殖阻害、腫瘍細胞浸潤阻害、腫瘍細胞転移阻害、腫瘍細胞遊走阻害、および腫瘍細胞死誘導からなる群から選択される少なくとも一つに関する用途に使用される。そして、本発明の第３の医薬は、前記の通り、コンドロイチン硫酸E（CS-E）を活性物質として含み、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される。これらは、本発明者らが鋭意研究の結果発見したコンドロイチン硫酸の細胞増殖阻害活性等に基づく発明である。前記細胞の増殖に関する疾患は、例えば、脳腫瘍、頭頚部癌、神経芽細胞腫、副鼻孔癌、咽頭癌、食道癌、肺癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、胆道癌、膵癌、前立腺癌、膀胱癌、精巣癌、乳癌、子宮癌、子宮筋腫、子宮頚癌、卵巣癌、急性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、赤血球増加症、真正多血症、本態性血小板増多症、骨髄腫、骨肉腫、絨毛癌、ホジキン病、非ホジキン病、膠芽種、星状細胞腫、および軟組織肉腫からなる群から選択される少なくとも一つの疾患であることが好ましい。また、前記本発明の第３の医薬は、例えば、抗腫瘍剤、抗癌剤、制癌剤および抗転移剤からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用されることが好ましい。 Furthermore, as described above, the third pharmaceutical composition of the present invention contains chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance, cell growth inhibition, cell death induction, tumor cell proliferation inhibition, tumor cell invasion inhibition, It is used for applications relating to at least one selected from the group consisting of tumor cell metastasis inhibition, tumor cell migration inhibition, and tumor cell death induction. As described above, the third medicament of the present invention contains chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance, and is selected from the group consisting of treatment, diagnosis, symptom reduction and prevention of cell proliferation diseases. Used in at least one application. These are inventions based on the cell growth inhibitory activity of chondroitin sulfate discovered by the present inventors as a result of intensive studies . Diseases related to the proliferation of pre SL cells, for example, brain tumors, head and neck cancer, neuroblastoma, sub nostrils, pharynx, esophagus cancer, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, prostate Cancer, bladder cancer, testicular cancer, breast cancer, uterine cancer, uterine fibroid, cervical cancer, ovarian cancer, acute leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, malignant lymphoma, erythrocytosis, true polycythemia, essential It is preferably at least one disease selected from the group consisting of thrombocytosis, myeloma, osteosarcoma, choriocarcinoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, glioblastoma, astrocytoma, and soft tissue sarcoma. The third medicament of the present invention is preferably used for at least one application selected from the group consisting of an antitumor agent, an anticancer agent, an anticancer agent and an antimetastatic agent, for example.

従来の研究によれば、細胞表面のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CS-PGs)は、腫瘍細胞の挙動調節に重要な役割を果たしうる（Iida, J., Meijne, A. M., Knutson, J. R., Furcht, L. T., and McCarthy, J. B. (1996) Cell surface chondroitin sulfate proteoglycans in tumor cell adhesion, motility and invasion. Semin. Cancer Biol. 7, 155-162）。コンドロイチナーゼ(CSase)ACまたはBによるメラノーマ細胞の処理は、浸潤および増殖を阻害する（Denholm, E. M., Lin, Y. Q., and Silver, P. J. (2001) Anti-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinase B: inhibition of angiogenesis, proliferation and invasion. Eur. J. Pharmacol. 416, 213-221）。細胞表面のCD44-関連CS-PGは、タイプIコラーゲンにより媒介されるメラノーマ細胞の運動性および浸潤に関し、そして、タイプIコラーゲン基層における細胞の運動性および浸潤挙動に必要であり、トランスフォーミング増殖因子βにより刺激される（Faassen, A. E., Schrager, J. A., Klein, D. J., Oegema, T. R., Couchman, J. R., and McCarthy, J. B. (1992) A cell surface chondroitin sulfate proteoglycan, immunologically related to CD44, is involved in type I collagen-mediated melanoma. J. Cell Biol. 116, 521-531およびFaassen, A. E., Mooradian, D. L., Tranquillo, R. T., Dickinson, R. B., Letourneau, P. C., Oegema, T. R., and McCarthy, J. B. (1993) Cell surface CD44-related chondroitin sulfate proteoglycan is required for transforming growth factor-beta-stimulated mouse melanoma cell motility and invasive behavior on type I collagen. J. Cell Sci. 105, 501-511）。しかし、コンドロイチン硫酸およびその誘導体、特にコンドロイチン硫酸E（CS-E）が非常に強い腫瘍細胞転移阻害活性を有すること、および細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減、予防等の用途に対し有用であることは従来知られておらず、本発明者等が初めて見出した。 According to previous studies, cell surface chondroitin sulfate proteoglycans (CS-PGs) can play an important role in the regulation of tumor cell behavior (Iida, J., Meijne, AM, Knutson, JR, Furcht, LT, and McCarthy, JB (1996) Cell surface chondroitin sulfate proteoglycans in tumor cell adhesion, motility and invasion. Semin. Cancer Biol. 7, 155-162). Treatment of melanoma cells with chondroitinase (CSase) AC or B inhibits invasion and proliferation (Denholm, EM, Lin, YQ, and Silver, PJ (2001) Anti-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinase B: inhibition of angiogenesis, proliferation and invasion. Eur. J. Pharmacol. 416, 213-221). Cell surface CD44-related CS-PG is involved in melanoma cell motility and invasion mediated by type I collagen and is required for cell motility and invasion behavior in type I collagen substrata, a transforming growth factor Stimulated by β (Faassen, AE, Schrager, JA, Klein, DJ, Oegema, TR, Couchman, JR, and McCarthy, JB (1992) A cell surface chondroitin sulfate proteoglycan, immunologically related to CD44, is involved in type I collagen-mediated melanoma. J. Cell Biol. 116, 521-531 and Faassen, AE, Mooradian, DL, Tranquillo, RT, Dickinson, RB, Letourneau, PC, Oegema, TR, and McCarthy, JB (1993) Cell surface CD44 -related chondroitin sulfate proteoglycan is required for transforming growth factor-beta-stimulated mouse melanoma cell motility and invasive behavior on type I collagen. J. Cell Sci. 105, 501-511). However, chondroitin sulfate and its derivatives, especially chondroitin sulfate E (CS-E) has a very strong tumor cell metastasis inhibitory activity, and is used for the treatment, diagnosis, symptom reduction and prevention of diseases related to cell proliferation. However, it has not been known to be useful, and the present inventors have found it for the first time.

これら本発明の薬学的組成物および医薬の製造方法は、特に限定されないが、例えば、以下に説明する分析方法（以下において、「本発明の分析方法」ということがある）によりコンドロイチン硫酸等の構造を解析し、その生物活性等の品質を評価して製造することが好ましい。そのようにすれば、実用に適した医薬や薬学的組成物を製造することができるためである。 These pharmaceutical compositions and pharmaceutical production methods of the present invention are not particularly limited. For example, the structure of chondroitin sulfate or the like by the analysis method described below (hereinafter sometimes referred to as the “analysis method of the present invention”). It is preferable to manufacture the product by analyzing the quality of the biological activity and the like. By doing so, it is because it is possible to produce a practical Suitable pharmaceutical and pharmaceutical compositions.

本発明の分析方法は、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を酵素消化して得られる生成物を質量分析する工程を含む分析方法であって、前記酵素消化生成物は、モノサッカリド、ジサッカリドおよびトリサッカリドからなる群から選択される少なくとも一つのサッカリドを含み、前記質量分析により解析される前記サッカリドの３−Ｏ−硫酸化ヘキスロン酸（ΔHexA(3S)）構造に基づき前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する分析方法である。 The analysis method of the present invention is an analysis method comprising a step of mass spectrometry of a product obtained by enzymatic digestion of a sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide, wherein the enzyme digestion product comprises a monosaccharide, a disaccharide and a trisaccharide. The sulfated polysaccharide or sulfated oligo based on the 3-O-sulfated hexuronic acid (ΔHexA (3S)) structure of the saccharide, which contains at least one saccharide selected from the group consisting of saccharides and is analyzed by mass spectrometry This is an analysis method for analyzing the structure of sugar.

CS等の硫酸化多糖および硫酸化オリゴ糖については、その構造解析についても、さらなる研究が要求されている。例えば、従来の研究としては、CS-EとCS-KをコンドロイチナーゼACIIやACIで消化して硫酸化オリゴ糖とし、NMR測定により、GlcA(3S)構造を確認したことが報告されていた（非特許文献９）。しかし、CS-EまたはCS-KをコンドロイチナーゼABC（CSase ABC）で完全に消化すると、前記GlcA(3S)構造がほとんど消失し、アニオン交換HPLCクロマトグラフィー分析による伝統的なジサッカリド分析では検出できない（非特許文献９）。このため、硫酸化多糖および硫酸化オリゴ糖の構造について、例えば、前記NMR測定よりも感度の良い測定方法が求められている。 For sulfated polysaccharides and sulfated oligosaccharides such as CS, further research is required for structural analysis. For example, as a previous study, it was reported that CS-E and CS-K were digested with chondroitinase ACII and ACI to form sulfated oligosaccharides, and the GlcA (3S) structure was confirmed by NMR measurement. (Non-patent document 9). However, when CS-E or CS-K is completely digested with chondroitinase ABC (CSase ABC), the GlcA (3S) structure is almost lost and cannot be detected by traditional disaccharide analysis by anion exchange HPLC chromatography analysis. (Non-patent document 9). For this reason, for example, there is a demand for a measurement method with higher sensitivity than the NMR measurement regarding the structures of sulfated polysaccharides and sulfated oligosaccharides.

前記本発明の分析方法によれば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を高感度で解析できる。したがって、本発明の分析方法は、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を構造解析して生物活性等の品質を評価することにより、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物または医薬の製造に有用である。 According to the analysis method of the present invention, the structure of sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide can be analyzed with high sensitivity. Therefore, the analysis method of the present invention includes, for example, a pharmaceutical composition containing the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide by analyzing the structure of the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide and evaluating the quality such as biological activity. Or it is useful for manufacture of a medicine.

本発明の分析方法では、前述の通り、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を酵素消化して得られるサッカリドの３−Ｏ−硫酸化ヘキスロン酸（ΔHexA(3S)）構造を質量分析により解析する。前記サッカリドは、モノサッカリド（単糖）、ジサッカリド（二糖）およびトリサッカリド（三糖）からなる群から選択される少なくとも一つを含む。前記質量分析により検出される被検出物質は、前記モノサッカリド（単糖）、前記ジサッカリド（二糖）または前記トリサッカリド（三糖）自体を含んでいても良い。前記被検出物質は、例えば、前記モノサッカリド（単糖）、前記ジサッカリド（二糖）または前記トリサッカリド（三糖）が酵素消化により分解される際の分解中間体を含むことが好ましい。前記分解中間体を質量分析により検出することで、前記モノサッカリド（単糖）、前記ジサッカリド（二糖）または前記トリサッカリド（三糖）の構造を、さらに正確に感度良く解析することができる。本発明の分析方法では、さらに高感度な分析のために、例えば、前記質量分析工程に先立ち、前記酵素消化生成物を分画する工程をさらに含むことが好ましい。前記分画に用いる手段は特に限定されないが、例えばゲル濾過クロマトグラフィーがより好ましい。 In the analysis method of the present invention, as described above, the saccharide 3-O-sulfated hexuronic acid (ΔHexA (3S)) structure obtained by enzymatic digestion of sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide is analyzed by mass spectrometry. The saccharide includes at least one selected from the group consisting of a monosaccharide (monosaccharide), a disaccharide (disaccharide), and a trisaccharide (trisaccharide). The substance to be detected detected by mass spectrometry may contain the monosaccharide (monosaccharide), the disaccharide (disaccharide), or the trisaccharide (trisaccharide) itself. It is preferable that the substance to be detected includes, for example, a decomposition intermediate when the monosaccharide (monosaccharide), the disaccharide (disaccharide) or the trisaccharide (trisaccharide) is decomposed by enzymatic digestion. By detecting the degradation intermediate by mass spectrometry, the structure of the monosaccharide (monosaccharide), the disaccharide (disaccharide) or the trisaccharide (trisaccharide) can be analyzed more accurately and with high sensitivity. In the analysis method of the present invention, it is preferable to further include, for example, a step of fractionating the enzyme digestion product prior to the mass analysis step, for a more sensitive analysis. The means used for the fractionation is not particularly limited, but for example, gel filtration chromatography is more preferable.

また、本発明の分析方法では、前記硫酸化多糖は特に限定されないが、例えば、グリコサミノグリカンが好ましく、コンドロイチン硫酸およびその誘導体のうち少なくとも一方であることがより好ましく、前記コンドロイチン硫酸が、CS-A、CS-B、CS-C、CS-D、CS-E、CS-KおよびCS-H(DS-E)からなる群から選択される少なくとも一つであることがさらに好ましい。前記グリコサミノグリカンを消化する酵素は、コンドロイチナーゼが好ましく、例えばコンドロイチナーゼABCを含むことがより好ましい。 In the analysis method of the present invention, the sulfated polysaccharide is not particularly limited. For example, glycosaminoglycan is preferable, and at least one of chondroitin sulfate and a derivative thereof is more preferable. More preferably, it is at least one selected from the group consisting of -A, CS-B, CS-C, CS-D, CS-E, CS-K and CS-H (DS-E). The enzyme that digests glycosaminoglycan is preferably chondroitinase, and more preferably contains chondroitinase ABC, for example.

また、本発明の分析方法では、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖が、３−Ｏ−硫酸化グルクロン酸（GlcA(3S)）構造を含み、前記質量分析により解析される３−Ｏ−硫酸化ヘキスロン酸（ΔHexA(3S)）構造に基づき前記３−Ｏ−硫酸化グルクロン酸（GlcA(3S)）構造を検出することが好ましい。 In the analysis method of the present invention, the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide contains a 3-O-sulfated glucuronic acid (GlcA (3S)) structure, and is analyzed by the mass spectrometry. It is preferable to detect the 3-O-sulfated glucuronic acid (GlcA (3S)) structure based on the structured hexuronic acid (ΔHexA (3S)) structure.

また、本発明の分析方法では、前記酵素消化生成物が、前記モノサッカリド、ジサッカリドまたはトリサッカリドが酵素消化により分解される際の分解中間体をさらに含み、前記分解中間体を質量分析により検出することで、前記３−Ｏ−硫酸化ヘキスロン酸（ΔHexA(3S)）構造を検出することが好ましい。 In the analysis method of the present invention, the enzyme digestion product further includes a decomposition intermediate when the monosaccharide, disaccharide or trisaccharide is decomposed by enzyme digestion, and the decomposition intermediate is detected by mass spectrometry. Thus, it is preferable to detect the 3-O-sulfated hexuronic acid (ΔHexA (3S)) structure.

本発明の薬学的組成物の製造方法および医薬の製造方法は、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を活性成分として含む薬学的組成物の製造方法または医薬の製造方法であって、前記本発明の分析方法により前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析して生物活性を評価する工程を含む。前記薬学的組成物は、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を薬学的活性成分として含む組成物であることが好ましい。すなわち、前記本発明の分析方法によれば、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析することで、その生物活性等の品質を評価し、実用に適した医薬や薬学的組成物を製造することができる。前記薬学的活性成分は、例えば、細胞増殖阻害活性、細胞死誘導活性、腫瘍細胞増殖阻害活性、腫瘍細胞浸潤阻害活性、腫瘍細胞転移阻害活性、腫瘍細胞遊走阻害活性、腫瘍細胞死誘導活性、ウィルス感染阻害活性、デングウィルス感染阻害活性、神経突起伸長促進活性、および増殖因子結合活性からなる群から選択される少なくとも一つの活性を有することが好ましい。 The method for producing a pharmaceutical composition and the method for producing a pharmaceutical of the present invention include, for example, a method for producing a pharmaceutical composition or a method for producing a pharmaceutical comprising a sulfated polysaccharide or a sulfated oligosaccharide as an active ingredient. analysis method of the invention by analyzing the sulfated polysaccharide or the structure of the sulfated oligosaccharides comprises assessing the biological activity. The pharmaceutical composition is preferably a composition containing the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide as a pharmaceutically active ingredient. That is, according to the analysis method of the present invention, for example, by analyzing the structure of a sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide, the quality of its biological activity and the like is evaluated, and a pharmaceutical or pharmaceutical composition suitable for practical use. Can be manufactured. Examples of the pharmaceutically active ingredient include cell growth inhibitory activity, cell death inducing activity, tumor cell growth inhibitory activity, tumor cell invasion inhibitory activity, tumor cell metastasis inhibitory activity, tumor cell migration inhibitory activity, tumor cell death inducing activity, virus It preferably has at least one activity selected from the group consisting of infection inhibitory activity, dengue virus infection inhibitory activity, neurite outgrowth promoting activity, and growth factor binding activity.

また、本発明の医薬の製造方法において、増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを使用することが好ましい。また、本発明の医薬の製造方法において、デングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、およびCS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを使用することが好ましい。また、本発明の医薬の製造方法において、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減および予防からなる群から選択される少なくとも一つの用途に使用される医薬を製造するために、コンドロイチン硫酸E（CS-E）を活性物質として使用することが好ましい。Further, in the method for producing a medicament of the present invention, in order to produce a medicament for use in at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, symptom reduction and prevention of diseases associated with growth factor binding, CS- It is preferable to use at least one selected from the group consisting of K, oxidized CS-K and oxidized CS-E. Further, in the method for producing a medicament of the present invention, CS is produced in order to produce a medicament for use in at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, symptom reduction, and prevention of diseases related to dengue virus infection inhibition. It is preferable to use at least one selected from the group consisting of -E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K. In addition, in the method for producing a medicament of the present invention, chondroitin sulfate is used for producing a medicament for use in at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, symptom reduction and prevention of diseases relating to cell proliferation. It is preferred to use E (CS-E) as the active substance.

なお、本発明では、コンドロイチン硫酸（CS）とは、CS-Bすなわちデルマタン硫酸（DS）を含み、また、CS-H(DS-E)も含むものとする。また、「硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖」とは、天然由来構造のもののみならず、例えば酸化処理等により化学修飾した誘導体も含むものとする。特に、酸化処理した誘導体は、副作用の低減により、医薬や薬学的組成物への応用の有用性が期待できる。前記酸化処理は、例えば、過ヨウ素酸等の過ハロゲン化酸により行うことが好ましく、この場合の硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖は、例えばCSが好ましく、CS-EまたはCS-Kがより好ましい。 In the present invention, chondroitin sulfate (CS) includes CS-B, that is, dermatan sulfate (DS), and also includes CS-H (DS-E). The “sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide” includes not only a naturally derived structure but also a derivative chemically modified by, for example, oxidation treatment. In particular, the oxidation-treated derivatives can be expected to be useful for application to medicines and pharmaceutical compositions due to reduced side effects. The oxidation treatment is preferably performed with, for example, a perhalogenated acid such as periodic acid. In this case, the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide is preferably CS, and more preferably CS-E or CS-K. .

本発明の薬学的組成物または医薬に含まれる硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖は、中性分子の形態で用いても塩の形態で用いても良く、前記塩は、酸付加塩でも塩基付加塩でも良い。前記酸付加塩を形成する酸は、無機酸でも有機酸でも良い。無機酸としては、特に限定されないが、例えば、硫酸、リン酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸等が可能である。有機酸も特に限定されないが、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等が可能である。前記塩基付加塩を形成する塩基は、無機塩基でも有機塩基でも良い。無機塩基としては、特に限定されないが、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩等が可能であり、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム等が可能である。有機塩基も特に限定されないが、例えば、エタノールアミン、トリエチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が可能である。硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の塩の製造方法も特に限定されず、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖に、前記のような酸や塩基を公知の方法により適宜付加させる等の方法で製造することができる。 The sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide contained in the pharmaceutical composition or medicament of the present invention may be used in the form of a neutral molecule or in the form of a salt. The salt may be an acid addition salt or a base addition. It can be salt. The acid forming the acid addition salt may be an inorganic acid or an organic acid. Although it does not specifically limit as an inorganic acid, For example, a sulfuric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid etc. are possible. The organic acid is not particularly limited, and examples thereof include p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p-bromobenzenesulfonic acid, carbonic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, and acetic acid. The base forming the base addition salt may be an inorganic base or an organic base. Examples of the inorganic base include, but are not limited to, ammonium hydroxide, alkali metal hydroxide, alkaline earth metal hydroxide, carbonate, bicarbonate, and the like. More specifically, for example, Sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium hydrogen carbonate, calcium hydroxide, calcium carbonate and the like are possible. The organic base is not particularly limited, and for example, ethanolamine, triethylamine, tris (hydroxymethyl) aminomethane and the like are possible. The production method of the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide salt is not particularly limited. For example, the acid or base is appropriately added to the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide by a known method. Can be manufactured.

また、本発明の薬学的組成物または医薬において、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の１回当たりの投与量および投与間隔等は特に限定されず、その目的に応じて適宜選択することができる。それらは、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、病状、投与経路、患者の代謝・排泄機能のレベル、使用される剤形、投与される特定の硫酸化多糖および硫酸化オリゴ糖ならびにそれらの塩を含む種々の要素を考慮して、当業者によって選定される。 Moreover, in the pharmaceutical composition or medicament of the present invention, the dose per dose and the administration interval of sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. They include the patient's age, weight, gender, medical condition, medical condition, route of administration, patient's level of metabolic / excretion function, dosage form used, the particular sulfated polysaccharide and sulfated oligosaccharide administered and those It is selected by those skilled in the art in view of various factors including the salts of

本発明の薬学的組成物または医薬の投与形態は特に限定されず、その目的に応じて、経口的に、または非経口的に投与することができる。経口剤として投与する時の形態は、特に限定されず、通常のおよび腸溶性錠剤、カプセル、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶剤、懸濁剤、シロップ、固体もしくは液体エアロゾル、および乳濁液等、当業者が通常用いる形態を選択することができる。また、非経口投与時の形態も特に限定されず、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与等、当業者が通常用いる形態を選択することができる。 The administration form of the pharmaceutical composition or medicament of the present invention is not particularly limited, and can be administered orally or parenterally depending on the purpose. The form when administered as an oral preparation is not particularly limited, and normal and enteric-coated tablets, capsules, pills, powders, granules, elixirs, tinctures, solvents, suspensions, syrups, solid or liquid aerosols, The form normally used by those skilled in the art, such as an emulsion, can be selected. Moreover, the form at the time of parenteral administration is not specifically limited, The form normally used by those skilled in the art, such as intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, and intramuscular administration, can be selected.

本発明の薬学的組成物または医薬は、例えば、一種類以上の薬学的に許容可能な添加物をさらに含むことが好ましい。すなわち、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を、投与に先立ち、一種類以上の薬学的に許容可能な添加物と共に製剤することが好ましい。前記添加物は、特に限定されないが、例えば、担体、希釈剤、香料、甘味料、滑沢剤、溶解剤、懸濁剤、結合剤、錠剤崩壊剤、およびカプセル化材等の不活性物質である。また、これら以外にも、例えば、医薬の分野で一般に使用されている任意の添加物を適宜用いても良い。 The pharmaceutical composition or medicament of the present invention preferably further comprises, for example, one or more pharmaceutically acceptable additives. That is, for example, the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide is preferably formulated with one or more pharmaceutically acceptable additives prior to administration. The additive is not particularly limited, and examples thereof include inert substances such as carriers, diluents, fragrances, sweeteners, lubricants, solubilizers, suspending agents, binders, tablet disintegrating agents, and encapsulating materials. is there. Besides these, for example, any additive generally used in the field of medicine may be used as appropriate.

前記添加物は、経口投与する場合は、例えば、以下に列挙する物質を使用することができる。担体としては、例えば、ラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、炭酸ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、メチルセルロース等が可能である。崩壊剤としては、例えば、トウモロコシ粉、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、アルギン酸等が可能である。結合剤としては、例えば、ゼラチン、天然糖、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、天然および合成ゴム、アラビアゴム、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス等が可能である。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、食塩、タルク等が可能である。 When the additive is orally administered, for example, the substances listed below can be used. As the carrier, for example, lactose, starch, sucrose, glucose, sodium carbonate, mannitol, sorbitol, calcium carbonate, calcium phosphate, calcium sulfate, methylcellulose and the like can be used. Examples of the disintegrant include corn flour, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, alginic acid and the like. As the binder, for example, gelatin, natural sugar, beta-lactose, corn sweetener, natural and synthetic rubber, gum arabic, tragacanth, sodium alginate, carboxymethylcellulose, polyethylene glycol, wax and the like can be used. As the lubricant, for example, magnesium stearate, sodium stearate, stearic acid, sodium oleate, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, talc and the like can be used.

本発明の薬学的組成物または医薬は、例えば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を、希釈剤と混合しても良いし、担体に封入しても良い。前記担体は、例えば、カプセル、小袋、紙その他の容器の形態が可能である。前記担体は希釈剤を兼ねてもよく、固体でも、半固体でも、ビヒクルとして作用する液体でも良い。また、本発明の医薬の形態は、特に限定されないが、例えば、錠剤、ピル、散剤、ローゼンジ、エリキシル、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル、軟膏、軟・硬ゼラチンカプセル、坐薬、滅菌注射用液および包装滅菌散剤等の種々の形態が可能である。 In the pharmaceutical composition or medicament of the present invention, for example, sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide may be mixed with a diluent or encapsulated in a carrier. The carrier can be in the form of, for example, a capsule, a sachet, paper or other container. The carrier may also serve as a diluent and may be solid, semi-solid, or liquid that acts as a vehicle. The form of the medicament of the present invention is not particularly limited. For example, tablets, pills, powders, lozenges, elixirs, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols, ointments, soft / hard gelatin capsules, suppositories Various forms such as sterile injectable solutions and packaged sterile powders are possible.

ヒトまたは動物の患者における疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法としては、例えば、前記本発明の分析方法により硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する工程と、前記硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖をヒトまたは動物の患者に投与する工程とを含む。そして、前記ヒトまたは動物の患者における疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法が、ヒトまたは動物の患者における増殖因子結合に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法である場合には、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含むことが好ましい。さらに、前記ヒトまたは動物の患者における疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法が、ヒトまたは動物の患者におけるデングウィルス感染阻害に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法である場合には、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、およびCS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含むことが好ましい。さらに、前記ヒトまたは動物の患者における疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法が、ヒトまたは動物の患者における細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減または予防をする方法である場合には、コンドロイチン硫酸E（CS-E）を活性物質として前記ヒトまたは動物の患者に投与する工程を含むことが好ましい。 Examples of a method for treating, diagnosing, or reducing or preventing a disease in a human or animal patient include, for example, a step of analyzing the structure of a sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide by the analysis method of the present invention, Administering the saccharified polysaccharide or sulfated oligosaccharide to a human or animal patient. The method of treating, diagnosing, or reducing or preventing a disease in a human or animal patient is a method of treating, diagnosing, or reducing or preventing a disease related to growth factor binding in a human or animal patient. In some cases, it is preferable to include the step of administering at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K and oxidized CS-E to the human or animal patient. Furthermore, the method for treating, diagnosing, or reducing or preventing a disease in a human or animal patient is a method for treating, diagnosing, or reducing or preventing a disease related to dengue virus infection inhibition in a human or animal patient. In this case, at least one selected from the group consisting of CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K. Preferably comprising the step of administering to said human or animal patient. Furthermore, the method for treating, diagnosing, or reducing or preventing a disease in a human or animal patient is a method for treating, diagnosing, or reducing or preventing a disease related to cell proliferation in a human or animal patient. In some cases, it preferably includes a step of administering chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance to the human or animal patient.

次に、本発明の種々の実施例について説明する。しかし、本発明は、これらの実施例には限定されない。 Next, various embodiments of the present invention will be described. However, the present invention is not limited to these examples.

［腫瘍細胞転移阻害］
本実施例は、コンドロイチン硫酸E（CS-E）を活性物質として含む前記本発明の第３の
薬学的組成物および医薬の腫瘍細胞転移阻害活性等に関する実施例である。 [Inhibition of tumor cell metastasis]
This example relates to the third pharmaceutical composition of the present invention containing chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance, the tumor cell metastasis inhibitory activity of the drug, and the like.

本実施例では、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸E（CS-E）による、ルイス肺癌セルラインH11の転移阻害を確認した。併せて、その他の種々のコンドロイチン硫酸についても同様に、ルイス肺癌セルラインH11の転移阻害を確認した。腫瘍細胞転移は、腫瘍細胞の接着、遊走および浸潤等を含む一連の複雑な現象に関連する。すなわち、コンドロイチン硫酸またはその誘導体が前記腫瘍細胞の転移を阻害することは、細胞の増殖に関する疾患の治療、診断、症状の軽減、予防等の用途に対する有用性を示す。 In this example, inhibition of metastasis of Lewis lung cancer cell line H11 by squid cartilage-derived chondroitin sulfate E (CS-E) was confirmed. In addition, other various chondroitin sulfates were similarly confirmed to inhibit the metastasis of Lewis lung cancer cell line H11. Tumor cell metastasis is associated with a series of complex phenomena including tumor cell adhesion, migration and invasion. That is, inhibition of tumor cell metastasis by chondroitin sulfate or a derivative thereof has utility for uses such as treatment, diagnosis, reduction of symptoms, and prevention of diseases related to cell proliferation.

まず、参考実験として、CSあるいはDSの腫瘍細胞転移への関連性を検証するために、ルイス肺癌の高転移性セルラインH11（Munesue, S., Kusano, Y., Oguri, K., Itano, N., Yoshitomi, Y., Nakanishi, H., Yamashina, I., and Okayama, M. (2002) The role of syndecan-2 in regulation of actin-cytoskeletal organization of Lewis lung carcinoma-derived metastatic clones. Biochem. J. 363, 201-209）をコンドロイチナーゼABCプロテアーゼフリー（生化学工業株式会社の商品名）で処理した場合と、非処理の場合の転移能を比較した。具体的には、まず、ルイス肺癌高転移H11細胞(4×10⁵個)を、200μlのDMEM(ダルベッコの修飾イーグル培地, Dulbecco’s modified Eagle’s medium)に懸濁させ、5mIU/mLのコンドロイチナーゼABCプロテアーゼフリー（生化学工業株式会社より購入）を加えて（処理）、または何も加えずに（非処理）、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、前記処理または非処理のルイス肺癌H11細胞を、各マウス(n=6)に、尾静脈を通じて注射した。前記癌細胞接種後３週間で前記マウスを殺し、そして、各マウス肺中の晶結節数に基づき肺転移を評価した。図１に、前記コンドロイチナーゼABC消化の、ルイス肺癌H11細胞の転移能に対する効果を示す。図示の通り、コンドロイチナーゼABC消化の結果、転移能が有意に減少した。このことは、細胞表面のCS/DS鎖がH11細胞の転移工程に関連することを示す。 First, as a reference experiment, in order to verify the relevance of CS or DS to tumor cell metastasis, Lewis lung cancer highly metastatic cell line H11 (Munesue, S., Kusano, Y., Oguri, K., Itano, N., Yoshitomi, Y., Nakanishi, H., Yamashina, I., and Okayama, M. (2002) The role of syndecan-2 in regulation of actin-cytoskeletal organization of Lewis lung carcinoma-derived metastatic clones.Biochem. J. 363, 201-209) was compared with the ability to transfer chondroitinase ABC protease free (trade name of Seikagaku Corporation) and untreated. Specifically, Lewis lung cancer highly metastasized H11 cells (4 × 10 ⁵ cells) were first suspended in 200 μl of DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) and 5 mIU / mL chondroitinase ABC. Protease-free (purchased from Seikagaku Corporation) was added (treated), or nothing was added (non-treated) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the treated or untreated Lewis lung cancer H11 cells were injected into each mouse (n = 6) through the tail vein. Three weeks after the cancer cell inoculation, the mice were killed and lung metastases were evaluated based on the number of crystal nodules in each mouse lung. FIG. 1 shows the effect of the chondroitinase ABC digestion on the metastatic ability of Lewis lung cancer H11 cells. As shown, chondroitinase ABC digestion resulted in a significant decrease in metastatic potential. This indicates that the cell surface CS / DS chain is involved in the metastatic process of H11 cells.

次に、種々の市販のCSおよびデルマタン硫酸（DS）製剤のマウス肺へのH11転移阻害能を、ヘパリンと併せて評価した。前記評価は、各CSまたはDS製剤100μgを尾静脈から注射し、その後同じルートでH11細胞を接種して行った。具体的には、種々のCSまたはDS製剤（各々、200μl DMEM中に100μg）を各マウス(n=6)にそれぞれ注射し、30分後、図１の説明で述べた前記癌細胞（非処理）を接種し、そして、図１の説明で述べた方法により肺転移を評価した。使用したCSまたはDS製剤は、CS-A, CS-B, CS-C, CS-DおよびCS-Eである。また、ウシ腸管粘膜ヘパリンを含む200μlのDMEMを比較例（陽性対照）として用い、200μlのDMEM単独を陰性対照として用いた。図２に、前記種々のCSアイソフォームによるルイス肺癌H11細胞転移阻害を示す。図示の通り、試験したCSおよびDS製剤の具体的な阻害活性は、CS-Eが90%、CS-Aが80%、CS-Dが47%およびCS-B(またはDS)が30%、ヘパリンが62%という数値であった。このように、試験したCSおよびDS製剤の全てが阻害活性を示した。特に、CS-EおよびCS-Aは、陽性対照であるヘパリンよりも強力な阻害活性を示し、中でもCS-Eは最も強力な阻害活性を示した。 Next, the ability of various commercially available CS and dermatan sulfate (DS) preparations to inhibit H11 metastasis to mouse lung was evaluated in combination with heparin. The evaluation was performed by injecting 100 μg of each CS or DS preparation from the tail vein and then inoculating H11 cells by the same route. Specifically, various CS or DS preparations (100 μg each in 200 μl DMEM) were injected into each mouse (n = 6), and 30 minutes later, the cancer cells (non-treated) described in the explanation of FIG. ) And was evaluated for lung metastases by the method described in the description of FIG. The CS or DS formulations used are CS-A, CS-B, CS-C, CS-D and CS-E. In addition, 200 μl of DMEM containing bovine intestinal mucosa heparin was used as a comparative example (positive control), and 200 μl of DMEM alone was used as a negative control. FIG. 2 shows the inhibition of Lewis lung cancer H11 cell metastasis by the various CS isoforms. As shown, the specific inhibitory activity of the tested CS and DS formulations is: CS-E 90%, CS-A 80%, CS-D 47% and CS-B (or DS) 30%, Heparin was 62%. Thus, all tested CS and DS formulations showed inhibitory activity. In particular, CS-E and CS-A showed stronger inhibitory activity than the positive control heparin, and CS-E showed the strongest inhibitory activity.

なお、ヘパリンは、強力な抗転移能を有することが長年知られている（Folkman, J., Langer, R., Linhardt, R. J., Haudenschild, C., and Taylor, S. (1983) Angiogenesis inhibition and tumor regression caused by heparin or a heparin fragment in the presence of cortisone. Science 221, 719-725, Borsig, L., Wong, R., Feramisco, J., Nadeau, D. R., Varki, N. M., and Varki, A. (2001) Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 3352-3357, Kragh, M., and Loechel, F. (2005) Non-anti-coagulant heparins: a promising approach for prevention of tumor metastasis. Int. J. Oncol. 27, 1159-1167, Stevenson, J. L., Choi, S. H., and Varki, A. (2005) Differential metastasis inhibition by clinically relevant levels of heparins--correlation with selectin inhibition, not antithrombotic activity. Clin. Cancer Res. 11, 7003-7011）。実際、本研究でも、図２の通り、ヘパリンは62%の阻害を示した。しかし、前述の通り、ヘパリンには出血などの副作用があるため臨床応用には至っていない。 Heparin has been known for many years to have potent antimetastatic potential (Folkman, J., Langer, R., Linhardt, RJ, Haudenschild, C., and Taylor, S. (1983) Angiogenesis inhibition and tumor regression caused by heparin or a heparin fragment in the presence of cortisone.Science 221, 719-725, Borsig, L., Wong, R., Feramisco, J., Nadeau, DR, Varki, NM, and Varki, A. (2001) Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3352-3357, Kragh, M., and Loechel, F. 2005) Non-anti-coagulant heparins: a promising approach for prevention of tumor metastasis. Int. J. Oncol. 27, 1159-1167, Stevenson, JL, Choi, SH, and Varki, A. (2005) Differential metastasis inhibition by clinically relevant levels of heparins--correlation with selectin inhi bition, not antithrombotic activity. Clin. Cancer Res. 11, 7003-7011). In fact, in this study, as shown in FIG. 2, heparin showed 62% inhibition. However, as described above, heparin has no clinical application due to side effects such as bleeding.

また、ルイス肺癌H11細胞の転移に対するCS-Eの阻害活性について、コンドロイチナーゼABC処理の効果を試験するために、コンドロイチナーゼABCによる消化前または消化後のCS−Eについて、図２の説明で述べた方法により、H11細胞の肺転移に対する阻害活性を評価した。図３に、その評価結果を示す。同図に示すとおり、CS-Eにおける阻害活性の80%は、CSase ABC消化により無効にされた。この結果は、CS-E製剤において、活性が不純物に由来するという可能性を排除する。 In order to examine the effect of chondroitinase ABC treatment on the inhibitory activity of CS-E on the metastasis of Lewis lung cancer H11 cells, CS-E before or after digestion with chondroitinase ABC is explained with reference to FIG. The inhibitory activity of H11 cells on lung metastasis was evaluated by the method described in. FIG. 3 shows the evaluation results. As shown in the figure, 80% of the inhibitory activity in CS-E was abolished by CSase ABC digestion. This result eliminates the possibility that activity is derived from impurities in the CS-E formulation.

さらに、CS-E阻害活性の用量依存性を試験した。具体的には、種々の用量(10, 50, 100, 200および300μg)のCS-Eを、各マウス(n=6)について、図２の説明で述べた方法により肺転移阻害活性を試験した。図４に、その結果を示す。図示の通り、マウス１匹あたり100μgまでは用量依存性の阻害を示し、100μgで転移阻害効果が最も高くなった。 In addition, the dose dependence of CS-E inhibitory activity was tested. Specifically, various doses (10, 50, 100, 200 and 300 μg) of CS-E were tested for lung metastasis inhibitory activity for each mouse (n = 6) by the method described in the explanation of FIG. . FIG. 4 shows the result. As shown in the figure, the dose-dependent inhibition was shown up to 100 μg per mouse, and the metastasis inhibitory effect was the highest at 100 μg.

このように、コンドロイチン硫酸およびその誘導体、特にCS-EおよびCS-A、中でもCS-Eは、１つの抗転移薬剤としてヘパリンより有望な候補となり得る。また、抗凝血作用等の他の作用も期待できる。 Thus, chondroitin sulfate and its derivatives, in particular CS-E and CS-A, especially CS-E, can be more promising candidates than heparin as one anti-metastatic agent. In addition, other actions such as an anticoagulant action can be expected.

なお、本実施例において、ルイス肺癌H11細胞は、京都産業大学の岡山實（Minoru Okayama）教授から提供を受けた。C3H/HeNマウス（雌）は、日本エスエルシー株式会社（浜松）から購入した。CSおよびDS製剤は、特級品（superspecial grade）であり、生化学工業株式会社から購入した。CS-Eはイカ軟骨由来であり、CS-Aは鯨軟骨由来であり、CS-Dは鮫軟骨由来であり、そして、CS-B（またはDS）は、ブタの皮膚由来である。 In this example, Lewis lung cancer H11 cells were provided by Professor Minoru Okayama of Kyoto Sangyo University. C3H / HeN mice (female) were purchased from SLC Japan (Hamamatsu). The CS and DS preparations were superspecial grade and were purchased from Seikagaku Corporation. CS-E is derived from squid cartilage, CS-A is derived from whale cartilage, CS-D is derived from costal cartilage, and CS-B (or DS) is derived from porcine skin.

以上の通り、本実施例によれば、マウス由来高転移性ルイス肺癌H11細胞を用い、コンドロイチン硫酸およびその誘導体の中でも、特にCS-Eの腫瘍細胞転移阻害活性が強力であることを確認することができた。 As described above, according to this example, using mouse-derived highly metastatic Lewis lung cancer H11 cells , among chondroitin sulfate and its derivatives , it is confirmed that CS-E has particularly potent tumor cell metastasis inhibitory activity. I was able to.

［デングウィルス感染阻害］
本実施例は、CS-E、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）、CS-EPA（アルカリ処理したCS-EP）、およびCS-Kからなる群から選択される少なくとも一つを含む前記本発明の第２の薬学的組成物および医薬のデングウィルス感染阻害活性等に関する実施例である。 [Dengue virus infection inhibition]
This example comprises at least one selected from the group consisting of CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K. It is an Example regarding the dengue virus infection inhibitory activity etc. of the said 2nd pharmaceutical composition of this invention containing and a pharmaceutical.

本実施例では、各種多硫酸化CSのデングウイルスに対する感染阻害活性を測定した。本実施例における実験プロトコールは、Chie Aoki, Kazuya I.P.J. Hidari, Saki Itonori, Akihiro Yamada, Naonori Takahashi, Takeshi Kasama, Futoshi Hasebe, Mohammend Alimul Islam, Ken Hatano, Koji Matsuoka, Takao Taki, Chao-Tan Guo, Tadanobu Takahashi, Yuichi Sakano, Takashi Suzuki, Daisei Miyamoto, Mutsumi Sugita, Daiyo Terunuma, Koichi Morita and Yasuo Suzuki J. Biochem. (Tokyo) in press (2006)に記載の方法「焦点力価アッセイ（Focus-forming assay）」および「デンドリマーによるウィルス感染阻害（Inhibition of virus infection by dendrimers）」に準じて行った。すなわち、具体的には以下の通りである。 In this example, the infection inhibitory activity of various polysulfated CSs against dengue virus was measured. The experimental protocol in this example is Chie Aoki, Kazuya IPJ Hidari, Saki Itonori, Akihiro Yamada, Naonori Takahashi, Takeshi Kasama, Futoshi Hasebe, Mohammend Alimul Islam, Ken Hatano, Koji Matsuoka, Takao Taki, Chao-Tan Guo, Tadanobu Takahashi , Yuichi Sakano, Takashi Suzuki, Daisei Miyamoto, Mutsumi Sugita, Daiyo Terunuma, Koichi Morita and Yasuo Suzuki J. Biochem. (Tokyo) in press (2006) and “Focus-forming assay” and The test was performed according to “Inhibition of virus infection by dendrimers”. Specifically, it is as follows.

（焦点形成アッセイ）
ウィルス力価は、BHK-21細胞を用いた焦点形成アッセイにより決定した。BHK-21細胞は、96ウェルプレート上に播種し、そして、2% FBSを含むDMEM中、37℃で24時間培養した。培地除去後、血清フリーDMEMで連続的に希釈したウィルス溶液を前記プレート上に播種し、そして、前記細胞を37℃で2時間インキュベートした。前記ウィルス溶液除去後、上敷き培地（1% FBSおよび0.5%メチルセルロースを含むDMEM）を添加し、そして、プレートを37℃で44時間インキュベートした。前記細胞を固定化し、そして、5%パラホルムアルデヒドおよび1% NP-40をそれぞれ含むPBSで透過処理した。感染性病巣は、ヒト抗デング抗血清を一次抗体とし、HRP複合化ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを二次抗体として検出した。ウィルス感染性は、焦点形成ユニット（FFU）により決定した。 (Focus formation assay)
Virus titer was determined by a focus formation assay using BHK-21 cells. BHK-21 cells were seeded on 96-well plates and cultured at 37 ° C. for 24 hours in DMEM containing 2% FBS. After removal of the medium, virus solution serially diluted with serum-free DMEM was seeded on the plate and the cells were incubated at 37 ° C. for 2 hours. After removal of the virus solution, overlay medium (DMEM containing 1% FBS and 0.5% methylcellulose) was added and the plates were incubated at 37 ° C. for 44 hours. The cells were fixed and permeabilized with PBS containing 5% paraformaldehyde and 1% NP-40, respectively. Infectious lesions were detected using human anti-dengue antiserum as the primary antibody and HRP-conjugated goat anti-human immunoglobulin as the secondary antibody. Viral infectivity was determined by a focus forming unit (FFU).

（デンドリマーによるウィルス感染阻害）
DEN2(最終濃度1,800FFU/ml)を、扇形、球形およびダンベル形デンドリマーと、指示濃度で予備混合した。前記ウィルスとデンドリマーの予備混合物（125μl）を、続いて、48ウェルプレートで増殖させたBHK-21細胞に、37℃で2時間播種した。血清フリーDMEMで3回洗浄後、上敷き培地を添加し、そして、プレートを37℃で43時間インキュベートした。細胞の感染性病巣は、続いて、前述の焦点形成アッセイにより可視化し、そして、光学顕微鏡で計数した。播種ウィルスの最適力価は、1ウェルに少なくとも50の病巣が発現するように予備決定した。 (Inhibition of viral infection by dendrimers)
DEN2 (final concentration 1,800 FFU / ml) was premixed with the sector, spherical and dumbbell dendrimers at the indicated concentrations. The virus and dendrimer premix (125 μl) was then seeded on BHK-21 cells grown in 48 well plates at 37 ° C. for 2 hours. After washing 3 times with serum-free DMEM, overlay medium was added and the plates were incubated at 37 ° C. for 43 hours. Infectious lesions of the cells were subsequently visualized by the focus formation assay described above and counted with a light microscope. The optimal titer of disseminated virus was pre-determined so that at least 50 lesions were expressed in each well.

上記実験プロトコールに従い、デングウィルス２型感染の、コンドロイチン硫酸（CS）製剤による阻害を測定した。具体的には、 CS-A, CS-B, CS-C, CS-D, CS-E, CS-K, ヘパリンまたはヘパリン硫酸を5μg/mL濃度で用い、BHK-21細胞に対するデングウィルス２型感染を阻害した。ヘパリンは、陽性対照として用いた。図５に、その結果を示す。図中の「ウィルス（Virus）」は、デング２ウィルスエンベロープタンパク質を表し、そして、感染力％（% of Infectivity）は、インヒビターなしで得られた値との比較で表している。数値は３回の独立実験の平均値として得た。 According to the above experimental protocol, inhibition of dengue virus type 2 infection by a chondroitin sulfate (CS) preparation was measured. Specifically, dengue virus type 2 against BHK-21 cells using CS-A, CS-B, CS-C, CS-D, CS-E, CS-K, heparin or heparin sulfate at a concentration of 5 μg / mL Inhibited infection. Heparin was used as a positive control. FIG. 5 shows the result. “Virus” in the figure represents Dengue 2 virus envelope protein, and% of Infectivity is expressed in comparison with the value obtained without inhibitor. The numerical value was obtained as an average value of three independent experiments.

図５から分かる通り、いずれのCS製剤もデングウィルス感染に対する阻害活性を示した。特に、CS-EおよびCS-Kは、ヘパリンと同等以上の強力な阻害活性を示した。 As can be seen from FIG. 5, all CS preparations showed inhibitory activity against dengue virus infection. In particular, CS-E and CS-K showed potent inhibitory activity equivalent to or higher than heparin.

次に、CS-Eまたはヘパリンのデングウィルス２型感染に対する阻害効力を測定するために、濃度を次第に減少させて(0-5μg/mL範囲)、濃度依存阻害活性を測定した。図６に、その結果を示す。図中の用語については、図５と同様である。また、実験プロトコールの詳細も、前記と同様である。図６から分かる通り、CS-Eは濃度依存性の阻害活性を示した。 Next, in order to measure the inhibitory efficacy of CS-E or heparin against dengue virus type 2 infection, the concentration-dependent inhibitory activity was measured by gradually decreasing the concentration (0-5 μg / mL range). FIG. 6 shows the result. The terms in the figure are the same as those in FIG. The details of the experimental protocol are the same as described above. As can be seen from FIG. 6, CS-E showed concentration-dependent inhibitory activity.

さらに、酸化処理により化学修飾したCS-E（CS-E誘導体）製剤の、デングウィルス２型感染阻害活性を測定した。すなわち、CS-E, CS-EP (CS-Eを過ヨウ素酸で120時間処理したもの)およびCS-EPA(CS-EPを1M NaOHで加水分解したもの)を、5μg/mL濃度でデングウィルス２型感染阻害に用い、活性を測定した。図７に、その結果を示す。同図から分かる通り、CS-Eのみならず、酸化処理したCS-EPおよびCS-EPAも、有効なデングウィルス２型感染阻害活性を示した。これらCS-EPおよびCS-EPA等の化学修飾製剤は、酸化処理による副作用の軽減で、母体のCS-Eよりも臨床等の用途にさらに有用であることが期待される。なお、図中の用語については図５と同様であり、実験プロトコールも前記と同様である。 Furthermore, dengue virus type 2 infection inhibitory activity of a CS-E (CS-E derivative) preparation chemically modified by oxidation treatment was measured. That is, CS-E, CS-EP (CS-E treated with periodic acid for 120 hours) and CS-EPA (CS-EP hydrolyzed with 1M NaOH) at a concentration of 5 μg / mL The activity was measured using type 2 infection inhibition. FIG. 7 shows the result. As can be seen from the figure, not only CS-E, but also oxidized CS-EP and CS-EPA showed effective dengue virus type 2 infection inhibitory activity. These chemically modified preparations such as CS-EP and CS-EPA are expected to be more useful for clinical use than maternal CS-E because of reducing side effects due to oxidation treatment. In addition, about the term in a figure, it is the same as that of FIG. 5, and an experiment protocol is also the same as the above.

なお、本実施例で用いたCS-Eは、実施例１と同じく、生化学工業株式会社から購入した。CS-Kは、当業者であれば、技術常識に基づいて、過度の試行錯誤や複雑高度な実験を行うことなく、カブトガニ軟骨から単離精製することができる。前記単離精製方法としては、具体的には、例えば、Seno, N., Yamashiro, S., and Anno, K. (1974) Biochim. Biophys. Acta 343, 423-426等に記載の方法、あるいは他のプロテオグリカンの単離精製方法と同様の方法を用いることができる。本実施例で用いたCS-Kは、Seno, N., Yamashiro, S., and Anno, K. (1974) Biochim. Biophys. Acta 343, 423-426に記載の方法に準じて単離精製した。すなわち、まず、カブトガニの鰓の軟骨部分を他の組織と分離し、小片に切断した後、アセトン処理により脱脂した。この軟骨を乾燥させた後、プロナーゼで徹底消化した。この消化物をトリクロロ酢酸処理し、セチルピリジニウムクロリドを用いたエタノール沈殿法によりムコ多糖を抽出した。そのムコ多糖を、陰イオン交換樹脂カラムDowex1（Sigma社の商品名、X-2、200-400メッシュ、Cl^-フォーム、2.8cm×40cm）にかけた。0.15M NaCl水溶液と0.5M NaCl水溶液で前記カラムを順次洗浄後、2.0M NaCl水溶液によりCS-Kを溶出させ、透析および凍結乾燥の後、本実施例に用いた。 Note that CS-E used in this example was purchased from Seikagaku Corporation in the same manner as in Example 1. A person skilled in the art can isolate and purify CS-K from horseshoe crab cartilage without excessive trial and error and complicated advanced experiments based on common general knowledge. As the isolation and purification method, specifically, for example, the method described in Seno, N., Yamashiro, S., and Anno, K. (1974) Biochim. Biophys. Acta 343, 423-426, or the like, or A method similar to the method for isolating and purifying other proteoglycans can be used. CS-K used in this example was isolated and purified according to the method described in Seno, N., Yamashiro, S., and Anno, K. (1974) Biochim. Biophys. Acta 343, 423-426. . That is, first, the cartilage portion of the horseshoe crab shark was separated from other tissues, cut into small pieces, and then degreased by acetone treatment. The cartilage was dried and thoroughly digested with pronase. This digest was treated with trichloroacetic acid, and mucopolysaccharide was extracted by ethanol precipitation using cetylpyridinium chloride. The mucopolysaccharide, an anion exchange resin column Dowex 1 (Sigma trade name, X-2,200-400 mesh, Cl ^- form, 2.8 cm × 40 cm) was subjected to. The column was washed successively with 0.15 M NaCl aqueous solution and 0.5 M NaCl aqueous solution, CS-K was eluted with 2.0 M NaCl aqueous solution, dialyzed and freeze-dried, and used in this example.

以上の通り、本実施例によれば、培養細胞を用い、CS-K、CS-Eおよびその誘導体のデングウイルスに対する感染阻害活性を確認することができた。また、過ヨウ素酸で酸化処理したCS-Eについても、同様の活性を確認した。 As described above, according to this embodiment, using cultured cells, it was possible to confirm infection inhibitory activity against dengue virus of CS-K, CS-E and its derivatives. Similar activity was confirmed for CS- E oxidized with periodic acid.

［増殖因子結合活性等］
本実施例は、CS-K、酸化処理したCS-Kおよび酸化処理したCS-Eからなる群から選択される少なくとも一つを含む前記本発明の第１の薬学的組成物および医薬の増殖因子結合活性等に関する実施例である。 [Growth factor binding activity, etc.]
The present Example includes the first pharmaceutical composition of the present invention and a pharmaceutical growth factor comprising at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K and oxidized CS-E It is an Example regarding a binding activity etc.

本実施例では、まず、精製コンドロイチン硫酸K（CS-K、カブトガニ由来）の、種々の増殖因子および神経栄養性因子に対する結合活性を測定した。すなわち、ビオチン化CS-Kをストレプトアビジン被覆センサーチップ上に固定化し、増殖因子および神経栄養性因子との結合を確認した。具体的には、50ngのHGFまたは種々の因子各100ngを灌流させ、そして、Nandini, C. D., Mikami, T., Ohta, M., Itoh, N., Nambu, F. A., and Sugahara, K. (2004) J. Biol. Chem. 279(49), 50799-50809.に記載の方法で、BIAcoreシステム（商品名）中、ランニングバッファを用い、各因子を固定化CS-Kと4分間相互作用させて行った。より詳しくは以下のとおりである。 In this example, first, the binding activity of purified chondroitin sulfate K (CS-K, derived from horseshoe crab) to various growth factors and neurotrophic factors was measured. That is, biotinylated CS-K was immobilized on a streptavidin-coated sensor chip, and binding to growth factors and neurotrophic factors was confirmed. Specifically, 50 ng HGF or 100 ng each of various factors were perfused, and Nandini, CD, Mikami, T., Ohta, M., Itoh, N., Nambu, FA, and Sugahara, K. (2004 ) In the method described in J. Biol. Chem. 279 (49), 50799-50809., Each factor was allowed to interact with immobilized CS-K for 4 minutes using a running buffer in the BIAcore system (trade name). went. More details are as follows.

すなわち、まず、ストレプトアビジン被覆センサーチップ（商品名BIAcore AB）を、製品マニュアルに従い、1M NaClと50mM NaOHを用いて１分間コンディショニングし、それを３回繰り返した。ビオチン化CS-Kをリン酸緩衝食塩水中で灌流し、リン酸緩衝食塩水で、前記センサー表面と３分間相互作用させた。固定化は、応答ユニット（response units、RU）の増加により確認した。相互作用解析は、前記CS-Kを固定化したセンサーチップを用い、BIAcore Jシステム（商品名）により行った。HGF（50ng）または他の各増殖因子（各100ng）は、それぞれ、ランニングバッファ(10mM HEPES-NaOH(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3mM EDTA,および0.005% Tween 20)中において、前記固定化CS-Kとの結合を確認した。流速は、製品マニュアルに従い、中程度の30μl/minに保った。各増殖因子は、固定化CS-Kと４分間相互作用させ、これを会合段階（association phase）とした。さらに追加の2分間で、増殖因子の解離（解離段階、dissociation phase）をさせた。その後、1M NaClを2分間注入して、前記センサーチップを再生させた。神経栄養性因子（各100ng）は、60μl/minの高い流速で固定化CS-Kと相互作用させた。会合段階および解離段階は、それぞれ４分間および2分間とした。 That is, first, a streptavidin-coated sensor chip (trade name BIAcore AB) was conditioned for 1 minute using 1M NaCl and 50 mM NaOH according to the product manual, and this was repeated three times. Biotinylated CS-K was perfused in phosphate buffered saline and allowed to interact with the sensor surface for 3 minutes in phosphate buffered saline. Immobilization was confirmed by an increase in response units (RU). The interaction analysis was performed with a BIAcore J system (trade name) using a sensor chip on which the CS-K was immobilized. HGF (50 ng) or each other growth factor (100 ng each) was added to the immobilized CS in a running buffer (10 mM HEPES-NaOH (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, and 0.005% Tween 20), respectively. Confirmed binding to -K. The flow rate was kept at a moderate 30 μl / min according to the product manual. Each growth factor interacted with immobilized CS-K for 4 minutes, and this was regarded as an association phase. Further, the growth factor was dissociated (dissociation phase) in an additional 2 minutes. Thereafter, 1M NaCl was injected for 2 minutes to regenerate the sensor chip. Neurotrophic factors (100 ng each) were allowed to interact with immobilized CS-K at a high flow rate of 60 μl / min. The association and dissociation phases were 4 and 2 minutes, respectively.

結合の結果として得られた会合段階は、応答ユニット（RU）によって測定した応答として扱った。図８に、その結果を示す。 The association phase obtained as a result of binding was treated as a response measured by the response unit (RU). FIG. 8 shows the result.

さらに、表面プラズモン共鳴測定装置（商品名BIAcore）による固定化CS-Kと増殖因子の相互作用の速度論的解析を行い、動力学的パラメータを決定した。表１に、その結果を示す。 Furthermore, kinetic parameters were determined by analyzing the kinetics of the interaction between immobilized CS-K and growth factors using a surface plasmon resonance measurement device (trade name BIAcore). Table 1 shows the results.

表１中、動力学的パラメータka（会合定数）、kd（解離定数）およびKd（解離平衡定数）値は、Nandini, C. D., Mikami, T., Ohta, M., Itoh, N., Nambu, F. A., and Sugahara, K. (2004) J. Biol. Chem. 279(49), 50799-50809.と同様、BIAevaluation 3.1ソフトウェア（商品名）により、１：１ラングミュア結合モデルを用い、物質輸送により決定した。各因子の結合および解離速度値は、５の異なる濃度の平均±S.E.M.として表現した。 In Table 1, the kinetic parameters ka (association constant), kd (dissociation constant) and Kd (dissociation equilibrium constant) values are Nandini, CD, Mikami, T., Ohta, M., Itoh, N., Nambu, FA, and Sugahara, K. (2004) Same as J. Biol. Chem. 279 (49), 50799-50809. Determined by mass transport using BIAevaluation 3.1 software (trade name) using 1: 1 Langmuir binding model did. The binding and dissociation rate values for each factor were expressed as the mean ± S.E.M. Of 5 different concentrations.

図８および表１から分かる通り、CS-Kは、各因子に対応した結合活性を示した。 As can be seen from FIG. 8 and Table 1, CS-K showed binding activity corresponding to each factor.

次に、CS-Kの神経突起伸長活性を、CS-Eと併せて測定した。すなわち、E16海馬ニューロン(10,000個細胞/cm²)を、P-ORN（ポリオルニチン）でプレコートした基層上で２４時間伸長させ、CS-E（陽性対照）またはCS-Kで固定し、そして、2. Hikino, M., Mikami, T., Faissner, A., Vilela-Silva, A.E.S., Pavao, M.S.G., and Sugahara, K. (2003) J. Biol. Chem. 278(44), 43744-43754.に記述の方法により、微小管結合タンパク質２およびニューロフィラメントを染色した。より詳しくは以下のとおりである。 Next, the neurite outgrowth activity of CS-K was measured together with CS-E. E16 hippocampal neurons (10,000 cells / cm ² ) were stretched for 24 hours on P-ORN (polyornithine) pre-coated substratum, fixed with CS-E (positive control) or CS-K, and 2. Hikino, M., Mikami, T., Faissner, A., Vilela-Silva, AES, Pavao, MSG, and Sugahara, K. (2003) J. Biol. Chem. 278 (44), 43744-43754. Microtubule-binding protein 2 and neurofilament were stained by the method described in 1). More details are as follows.

まず、E16マウス胚を解剖して海馬を取り出し、ハンクス液（Hanks’ balanced salt solution）で10回洗浄し、0.25%(w/v)トリプシンを含む同じハンクス液を用いて37℃で10分間解離させ、続いて穏やかに倍散させた。単一の細胞を、N2サプリメント(Invitrogen社、日本国、東京)、0.1mM ピルビン酸塩、0.1%(w/v)卵白アルブミン、0.029% L-グルタミン、0.2% 炭酸水素ナトリウムおよび5mM HEPESを含むイーグルの最小必須培地（Eagle’s minimum essential medium）に再懸濁させた。この細胞を、続いて、P-ORN（ポリオルニチン）でプレコートした基層上、10,000個細胞/cm²密度に接種し、組織培養インキュベータ中、5％CO₂雰囲気下、37℃に保った。24時間培養後、前記細胞を、4%(w/v)パラホルムアルデヒドで30分間固定化し、PBSで3回洗浄し、0.2%(w/v) Triton X-100（商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を含むPBSを用いて室温で30分間透過処理した。この細胞を、100倍希釈の抗微小管結合タンパク質２（anti-microtuble-associated protein 2、Leico Technologies Inc.社、ミズーリ州セントルイス）および250倍希釈の抗ニューロフィラメント(anti-neurofilament、シグマ社、ニューロフィラメントHサブユニットのリン酸化または非リン酸化形態と特異的に反応する)、および3%(w/v)ウシ血清アルブミンを含む抗体含有PBSで免疫染色した。そして、3,3’−ジアミノベンジジンを色素源とし、Vectastain ABCキット(Vector Laboratories Inc.社（カナダ国Burlingame）の商品名)で展開した。各培養条件について、２回の実験を行った。 First, dissect the E16 mouse embryo, remove the hippocampus, wash 10 times with Hanks' balanced salt solution, and dissociate for 10 minutes at 37 ° C using the same Hanks solution containing 0.25% (w / v) trypsin Followed by gentle trituration. Single cells contain N2 supplement (Invitrogen, Tokyo, Japan), 0.1 mM pyruvate, 0.1% (w / v) ovalbumin, 0.029% L-glutamine, 0.2% sodium bicarbonate and 5 mM HEPES Resuspended in Eagle's minimum essential medium. The cells were subsequently seeded at a density of 10,000 cells / cm ² on a P-ORN (polyornithine) pre-coated substrate and kept at 37 ° C. in a tissue culture incubator under a 5% CO ₂ atmosphere. After culturing for 24 hours, the cells were fixed with 4% (w / v) paraformaldehyde for 30 minutes, washed 3 times with PBS, 0.2% (w / v) Triton X-100 (trade name, GE Healthcare Bio Permeabilization was performed for 30 minutes at room temperature using PBS containing Science Co., Ltd. The cells were divided into 100-fold diluted anti-microtuble-associated protein 2 (Leico Technologies Inc., St. Louis, MO) and 250-fold diluted anti-neurofilament (anti-neurofilament, Sigma, Neuro Immunostained with antibody-containing PBS containing 3% (w / v) bovine serum albumin, which specifically reacts with phosphorylated or non-phosphorylated forms of the filament H subunit. Then, 3,3′-diaminobenzidine was used as a coloring source and developed with a Vectastain ABC kit (trade name of Vector Laboratories Inc. (Burlingame, Canada)). Two experiments were performed for each culture condition.

図９（Ａ）に、前記CS-EまたはCS-K被覆基層上で培養したニューロン（神経細胞）の、増大した神経長および代表的形態を示す。また、生成した神経突起を定量的に分析した。すなわち、１００個のランダムに選択した個々のニューロンを、各条件下における最長神経細胞の平均長測定に用い、２回の個別実験により得られた値を、平均±S.E.M.として表現した。図９（Ｂ）に、その結果を示す。図９（Ａ）および（Ｂ）から分かる通り、CS-K培養ニューロンは、CS-Eに匹敵する量および神経長を示した。 FIG. 9 (A) shows the increased nerve length and representative morphology of neurons (neural cells) cultured on the CS-E or CS-K coated base layer. In addition, the generated neurites were analyzed quantitatively. That is, 100 randomly selected individual neurons were used for measuring the average length of the longest nerve cell under each condition, and the values obtained by two individual experiments were expressed as the mean ± S.E.M. FIG. 9B shows the result. As can be seen from FIGS. 9A and 9B, CS-K cultured neurons showed comparable amounts and nerve lengths to CS-E.

さらに、本実施例では、酸化処理により化学修飾したCS-Eを用い、ニューロンを刺激した。すなわち、E16マウス由来の海馬ニューロン(10,000個細胞/cm²)を、P-ORNおよび続いてCS-E（陽性対照）、CS-EP（過ヨウ素酸処理したCS-E）またはCS-EPA（1M NaOHで処理したCS-EP）でプレコートした種々の基層で24時間かけて伸長させ、固定し、そして、微小管結合タンパク質2（MAP2）およびニューロフィラメントを染色した。より詳しい操作は、前述と同様である。図１０（Ａ）に、CS-E, CS-EPまたはCS-EPA被覆基層で培養したニューロンの、増加した神経突起長および形態学的特徴（代表的形態）を示す。CS-EPで培養したニューロンは、CS-Eについて観測したそれと比較して顕著に長い神経突起を示した。一方、CS-EPA被覆基層上の細胞は、複数の神経突起を示した。 Furthermore, in this example, neurons were stimulated using CS-E chemically modified by oxidation treatment. That is, hippocampal neurons (10,000 cells / cm ² ) from E16 mice were transformed into P-ORN followed by CS-E (positive control), CS-EP (periodic acid-treated CS-E) or CS-EPA ( CS-EP treated with 1M NaOH) was stretched over 24 hours with various sublayers, fixed, and stained for microtubule-associated protein 2 (MAP2) and neurofilament. More detailed operations are the same as described above. FIG. 10 (A) shows increased neurite length and morphological characteristics (typical morphology) of neurons cultured in CS-E, CS-EP or CS-EPA coated substratum. Neurons cultured with CS-EP showed significantly longer neurites compared to those observed for CS-E. On the other hand, cells on the CS-EPA coated substrate showed multiple neurites.

さらに、生成した神経突起を定量的に分析した。すなわち、100のランダムに選択した個々のニューロンを、各条件下での最長神経突起長の平均値測定に用い、２回の個別実験により得られた値を、平均値±S.E.Mで表した。図１０（Ｂ）に、その結果を示す。同図から分かる通り、化学修飾（酸化処理）による副作用の軽減が期待されるCS-EPおよびCS-EPAも、CS-Eとほぼ遜色ない神経突起伸長促進活性を示した。 Furthermore, the generated neurites were analyzed quantitatively. That is, 100 randomly selected individual neurons were used to measure the average value of the longest neurite length under each condition, and the values obtained by two individual experiments were expressed as the mean value ± S.E.M. FIG. 10B shows the result. As can be seen from the figure, CS-EP and CS-EPA, which are expected to reduce side effects by chemical modification (oxidation treatment), also showed neurite outgrowth-promoting activity comparable to CS-E.

なお、本実施例において、CS-Kは、実施例２と同様の方法で単離精製したものを用いた。CS-Eは、生化学工業株式会社から購入した。 In this example, CS-K used was isolated and purified in the same manner as in Example 2. CS-E was purchased from Seikagaku Corporation.

以上の通り、本実施例によれば、マウスの培養海馬ニューロンを用い、CS-Kおよび酸化処理CS-Eに、神経突起伸長促進活性およびその基盤となると考えられる細胞増殖因子結合活性が存在することを確認することができた。また、同様に、過ヨウ素酸により酸化処理したCS-Kおよびさらにアルカリ処理したCS-Kについても、同様の活性を認めた。これらCSおよびその誘導体は、培養液中に細胞から分泌される種々の増殖因子と糖鎖が結合し、細胞に提示していると推測され、これらのCSおよびその誘導体自体が増殖因子結合医薬として有効利用できると考えられる。 As described above, according to this example, cultured mouse hippocampal neurons are used, and CS-K and oxidation-treated CS-E have neurite outgrowth promoting activity and cell growth factor binding activity that is considered to be the basis thereof. I was able to confirm that. Similarly, CS-K oxidized with periodic acid and CS-K further treated with alkali showed similar activity. These CS and its derivatives are presumed to be presented to the cells by binding various growth factors secreted from the cells into the culture medium and sugar chains, and these CS and their derivatives themselves are growth factor-binding drugs. It can be used effectively.

［参考例１：3-O-硫酸化グルクロン酸を含むCS-KテトラサッカリドのコンドロイチナーゼABCによる消化、および分解生成物であるジサッカリド中間体の構造決定］ [ Reference Example 1: Digestion of CS-K tetrasaccharide containing 3-O-sulfated glucuronic acid with chondroitinase ABC and determination of the structure of a disaccharide intermediate which is a degradation product]

本参考例は、質量分析を用いて硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する前記本発明の分析方法に関する。 This reference example relates to the analysis method of the present invention, wherein the structure of a sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide is analyzed using mass spectrometry .

本発明者らは、以前、カブトガニ軟骨から単離したCS-K由来の希少なテトラサッカリドGlcA(3S)β1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(3S)β1-GalNAc(4S) (K-K)の構造を決定した（Sugahara, K., Tanaka, Y., Yamada, S., Seno, N., and Kitagawa, H. (1996) J. Biol. Chem. 271(43), 26745-26754.）。上記テトラサッカリドのコンドロイチナーゼABC(CSase ABC)消化は、還元末端から形成されるΔHexA(3S)を含む不安定なジサッカリドユニットを生成し、非還元末端からは、飽和ジサッカリドユニットのみを生ずる。 The present inventors have previously described the structure of a rare tetrasaccharide GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S) β1-4GlcA (3S) β1-GalNAc (4S) (KK) derived from CS-K isolated from horseshoe crab cartilage (Sugahara, K., Tanaka, Y., Yamada, S., Seno, N., and Kitagawa, H. (1996) J. Biol. Chem. 271 (43), 26745-26754.). Digestion of the above tetrasaccharides with chondroitinase ABC (CSase ABC) produces unstable disaccharide units containing ΔHexA (3S) formed from the reducing end, and only non-reducing ends produce saturated disaccharide units. .

本参考例では、CSase ABC消化後のΔHexA(3S)α1-3GalNAc(4S)分解生成物をESI-MSのネガティブイオンモードで分析し、従来の分析方法では検出不可能であった構造を検出した。 In this reference example , the ΔHexA (3S) α1-3GalNAc (4S) degradation product after CSase ABC digestion was analyzed in the negative ion mode of ESI-MS, and a structure that could not be detected by the conventional analysis method was detected. .

さらに、検出された構造から、前記CSase ABC消化において起こりうるメカニズムを推測した。前記推測されるメカニズムの概要は以下の通りである。すなわち、分解（消化）は、ΔHexAユニットからの水分子、二酸化硫黄およびアセチレンの損失に関連する。ΔHexA(3S)ユニットからの二酸化硫黄損失の間、C₃-C₄炭素は、隣接炭素C₅およびC₆に水素化物イオンを連続的に与えて5,6-ジヒドロキシ-6-[GalNAc(3S)-4-オキシ]-ヘキサ-1-イン-3,4-ジオンを形成し、SP²混成となる。さらに、分解工程中においては、中間体である1-ヒドロキシ-1-[GalNAc(3S)-4-オキシ]-ブタ-3-イン-2-オンを生じ、前記中間体は、最終生成物としてGalNAc(4S)を与える。ただし、この推測は、本発明をなんら限定するものではない。 Furthermore, a possible mechanism in the CSase ABC digestion was inferred from the detected structure. The outline of the presumed mechanism is as follows. That is, degradation (digestion) is associated with the loss of water molecules, sulfur dioxide and acetylene from the ΔHexA unit. During sulfur dioxide loss from the ΔHexA (3S) unit, the C ₃ -C ₄ carbon continuously gives hydride ions to adjacent carbons C ₅ and C ₆ to give 5,6-dihydroxy-6- [GalNAc (3S ) -4-oxy] -hexa-1-yne-3,4-dione, which is a hybrid of SP ² . Further, during the decomposition step, 1-hydroxy-1- [GalNAc (3S) -4-oxy] -but-3-in-2-one, which is an intermediate, is produced, and the intermediate is used as a final product. Give GalNAc (4S). However, this assumption does not limit the present invention.

以下、本参考例における分析方法および前記推測されるメカニズムについて、さらに詳しく説明する。 Hereinafter, the analysis method and the presumed mechanism in this reference example will be described in more detail.

［CS-KテトラサッカリドのCSase ABCによる消化］
まず、実施例２と同様の方法により、カブトガニ軟骨からCS-Kを単離した。そのCS-Kを、Sugahara, K., Shigeno, K., Masuda, M., Fujii, N., Kurosaka, A., and Takeda, K. (1994) Carbohydr. Res. 255, 145-163.に記述されている方法で消化してCS-Kテトラサッカリドを調製した。すなわち、まず、50mgのCS-Kを、2.0mLの0.05M Tris・HCl緩衝液（pH8.0、60mM酢酸ナトリウムおよび100μg/mLウシ血清アルブミンを含む）中、0.9ユニットのコンドロイチナーゼABC（生化学工業株式会社より購入）により37℃で22時間消化した。その後、0.1ユニットのコンドロイチナーゼABCを追加してさらに18時間消化した。反応は、波長232nmにおけるUV吸収で追跡した。この反応混合物に1M AcOHを加えてpHを6.5に調整し、100℃で1分間煮沸して反応を停止させた。この消化物を、Sephadex G-15（GEヘルスケアバイオサイエンス社の商品名）カラムでゲルろ過した。溶出液には、0.25M NH₄HC0₃-7% 1−プロパノール水溶液を用いた。ゲルろ過物に水を加え、エバポレーションにより脱塩し、再度水に溶解させ、HPLCにより精製して目的のテトラサッカリドを得た。このCS-Kテトラサッカリド(K-K)[GlcA(3S)β1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(3S)β1-GalNAc(4S)](0.5nmol)を、Sugahara, K., Shigeno, K., Masuda, M., Fujii, N., Kurosaka, A., and Takeda, K. (1994) Carbohydr. Res. 255, 145-163.に記述されている標準条件（CS-Kテトラサッカリド0.5nmolに対するコンドロイチナーゼABCの使用量40μL、温度37℃、緩衝液中）で１０分間、5mIU/mL コンドロイチナーゼABC（生化学工業株式会社から購入）により消化した。その反応混合物を、ナトリウム化に基づくピーク（sodiated peaks）を抑制するために、０．１％酢酸を含む５０％アセトニトリルに溶解させて溶液(90:10)とし、ESI-MSのネガティブモードにかけた。図１１に、CS-Kテトラサッカリド(K-K)のCSase ABC消化物におけるESI-MSスペクトル（200〜700m/z amu間）を示す。図１２に、９７における硫酸基（sulfite group）についてのプリカーサーイオンモードにより得られたESI-MSスペクトルを示す。図１３に、３００[GalNAc (4S)]についてのプリカーサーイオンモードにより得られたESI-MSスペクトルを示す。 [Digestion of CS-K tetrasaccharide with CSase ABC]
First, CS-K was isolated from horseshoe crab cartilage by the same method as in Example 2. The CS-K was transferred to Sugahara, K., Shigeno, K., Masuda, M., Fujii, N., Kurosaka, A., and Takeda, K. (1994) Carbohydr. Res. 255, 145-163. CS-K tetrasaccharide was prepared by digestion as described. That is, first, 50 mg of CS-K was added to 0.9 units of chondroitinase ABC (live) in 2.0 mL of 0.05 M Tris · HCl buffer (pH 8.0, containing 60 mM sodium acetate and 100 μg / mL bovine serum albumin). Digested at 37 ° C. for 22 hours. Thereafter, 0.1 unit of chondroitinase ABC was added and digested for an additional 18 hours. The reaction was followed by UV absorption at a wavelength of 232 nm. 1M AcOH was added to this reaction mixture to adjust the pH to 6.5, and the reaction was stopped by boiling at 100 ° C. for 1 minute. This digest was subjected to gel filtration with a Sephadex G-15 (trade name of GE Healthcare Bioscience) column. As an eluent, 0.25M NH ₄ HC0 ₃ -7% 1-propanol aqueous solution was used. Water was added to the gel filtrate, desalted by evaporation, dissolved again in water, and purified by HPLC to obtain the desired tetrasaccharide. This CS-K tetrasaccharide (KK) [GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S) β1-4GlcA (3S) β1-GalNAc (4S)] (0.5 nmol) was converted to Sugahara, K., Shigeno, K., Masuda , M., Fujii, N., Kurosaka, A., and Takeda, K. (1994) Carbohydr. Res. 255, 145-163., Standard condition (chondroit for 0.5 nmol of CS-K tetrasaccharide) The enzyme was digested with 5 mIU / mL chondroitinase ABC (purchased from Seikagaku Corporation) for 10 minutes at a usage amount of 40 μL of enzyme ABC, at a temperature of 37 ° C. in a buffer solution. The reaction mixture was dissolved in 50% acetonitrile containing 0.1% acetic acid to give a solution (90:10) and subjected to ESI-MS negative mode in order to suppress sodiumated peaks. . FIG. 11 shows an ESI-MS spectrum (between 200 and 700 m / z amu) in a CSase ABC digest of CS-K tetrasaccharide (KK). FIG. 12 shows an ESI-MS spectrum obtained by the precursor ion mode for the sulfate group 97 in FIG. FIG. 13 shows an ESI-MS spectrum obtained by the precursor ion mode for 300 [GalNAc (4S)].

上記分析の結果として、CSase ABCにより消化されたCS-Kテトラサッカリド(K-K)は、還元末端からは、主要な不飽和ジサッカリドは何も生成しなかった。584.8におけるピークの存在（図１１）は、飽和のCS-Kジサッカリドユニットであるとアサインすることが出来る。本発明者らは、ΔHexA(3S)α1-3GalNAc(4S)ユニットについて可能性のある分解生成物ピークを300.3に同定し、そして、１つの中間体のピークを382に同定した。CSオリゴサッカリド類は、それらの構造に関係なく、全て硫酸基（sulfate group）を含む。そのため、本発明者らは、ネガティブイオンモードにおいて９７を硫酸基（sulfite group）のプリカーサーイオンと分析した。その結果、主要なピークが300.3, 382.4に得られ、そして、検出可能な中間体ピークが440.5に得られた（図１２）。さらに、300におけるプリカーサーイオンピークは、358.1, 382.0, 416.3および440.1に、可能性のある親中間体単独としての主要ピークを与えた（図１３）。 As a result of the above analysis, CS-K tetrasaccharide (K-K) digested with CSase ABC did not produce any major unsaturated disaccharide from the reducing end. The presence of a peak at 584.8 (FIG. 11) can be assigned to be a saturated CS-K disaccharide unit. We identified a potential degradation product peak at 300.3 for the ΔHexA (3S) α1-3GalNAc (4S) unit and identified one intermediate peak at 382. CS oligosaccharides all contain sulfate groups regardless of their structure. Therefore, the present inventors analyzed 97 as a sulfate ion precursor ion in the negative ion mode. As a result, a main peak was obtained at 300.3, 382.4, and a detectable intermediate peak was obtained at 440.5 (FIG. 12). In addition, the precursor ion peak at 300 gave major peaks as potential parent intermediates alone at 358.1, 382.0, 416.3 and 440.1 (FIG. 13).

上記ESI-MSスペクトルに基づき、本発明者らは、ΔHexA(3S)α1-3GalNAc(4S)の分解において可能性のあるメカニズムを、下記スキーム１、２および３のように推測した。ただし、前述の通り、この推測は、本発明をなんら限定するものではない。 Based on the ESI-MS spectrum, the present inventors presumed possible mechanisms in the decomposition of ΔHexA (3S) α1-3GalNAc (4S) as shown in the following schemes 1, 2 and 3. However, as described above, this estimation does not limit the present invention.

上記スキーム１、２および３についての説明は、以下の通りである。すなわち、まず、GlcA(3S)β1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(3S)β1-GalNAc(4S) [K-K]のCSase ABC酵素による消化は、不安定なジサッカリドユニットΔK（化合物３）を生じた。ESI-MSスペクトルによれば、さらに多くのフラグメントピークが明らかになった。それらは、CSase ABC消化後に生じる分解した低分子量および不安定な中間体である可能性があり、本発明者らは、GalNAc(4S)（化合物９）に加え、アセチレン中間体すなわち1-ヒドロキシ-1-[GalNAc(3S)-4-オキシ]-ブタ-3-イン-2-オン（化合物７）と同定した。最初に親テトラサッカリドから遊離したΔHexA(3S)α1-3GalNAc(4S)は、不安定であり、隣接するβ-不飽和酸(C₄およびC₅)を攻撃する3-O硫酸エステル基（sulfate group）の影響により分解した（スキーム２）。C₅炭素は隣接するC₄炭素の電子を吸引し、それによりΔHexA環は開裂し、そして、続いて、C₄炭素に隣接するC₃炭素も、水分子が脱離して化合物５が形成されるまでこの工程に関与する（スキーム３）。HexAユニットにおいて高い歪みのかかったC₃およびC₄炭素は、SO₂分子を喪失して5,6-ジヒドロキシ-6-[GalNAc(3S)-4-オキシ]-ヘキサ-1-イン-3,4-ジオン（化合物５）に達することでSP²となることが示される。前記中間体５は、さらに、熱的に不安定であり、同様の方式でのアセチレン脱離により、すぐに3,4-dihydroxy-2-oxo-4-[GalNAc(3S)-4-oxy]-butanal６を形成する。一般的には、隣接するα-ケトカルボアルデヒドは、不安定である。そのために、中間体６は、水分子の脱離により安定な中間体1-ヒドロキシ-1-[GalNAc(3S)-4-オキシ]-ブタ-3-イン-2-オン（化合物７）を形成する。化合物７は、ESI-MSスペクトル中において、プリカーサーイオンモードスペクトルにより得られたGalNAc(4S)とともに、m/z 382amuとして見出された。前記中間体７は、アセチレンの遊離により中間体８すなわち2-ヒドロキシ-2-[GalNAc(3S)-4-オキシ]-アセトアルデヒドを与える。前記中間体８は、すぐに水分子およびアセチレン基を失い、安定化合物GalNAc (4S)（化合物９）を最終生成物として与える。 The description of the above schemes 1, 2, and 3 is as follows. That is, first, digestion of GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S) β1-4GlcA (3S) β1-GalNAc (4S) [KK] with CSase ABC enzyme yields an unstable disaccharide unit ΔK (compound 3). It was. The ESI-MS spectrum revealed more fragment peaks. They may be degraded low molecular weight and unstable intermediates that occur after CSase ABC digestion, and we have added in addition to GalNAc (4S) (compound 9), an acetylene intermediate, ie 1-hydroxy- It was identified as 1- [GalNAc (3S) -4-oxy] -but-3-in-2-one (Compound 7). ΔHexA (3S) α1-3GalNAc (4S), first released from the parent tetrasaccharide, is a 3-O sulfate group that is unstable and attacks adjacent β-unsaturated acids (C ₄ and C ₅ ). group) (Scheme 2). The C ₅ carbon attracts the electrons of the adjacent C ₄ carbon, thereby cleaving the ΔHexA ring, and then the water molecule is also eliminated from the C ₃ carbon adjacent to the C ₄ carbon to form compound 5. Until it is involved in this process (Scheme 3). The highly strained C ₃ and C ₄ carbons in the HexA unit lose the SO ₂ molecule, resulting in 5,6-dihydroxy-6- [GalNAc (3S) -4-oxy] -hex-1-yne-3, Reaching 4-dione (compound 5) is shown to be SP ² . The intermediate 5 is further thermally unstable and immediately upon acetylene elimination in a similar manner, 3,4-dihydroxy-2-oxo-4- [GalNAc (3S) -4-oxy] -Form butanal6. In general, the adjacent α-ketocarbaldehyde is unstable. Therefore, intermediate 6 forms the stable intermediate 1-hydroxy-1- [GalNAc (3S) -4-oxy] -but-3-in-2-one (compound 7) by elimination of water molecules. To do. Compound 7 was found in the ESI-MS spectrum as m / z 382amu with GalNAc (4S) obtained by the precursor ion mode spectrum. Said intermediate 7 gives intermediate 8 ie 2-hydroxy-2- [GalNAc (3S) -4-oxy] -acetaldehyde by the release of acetylene. The intermediate 8 immediately loses water molecules and acetylene groups to give the stable compound GalNAc (4S) (compound 9) as the final product.

なお、多くの文献は、光化学反応中、アジド溶液中に捕捉することによるC-グリコシル-α-アミノ酸の調製について、C-グリコシルアセチレンを強力かつベターな中間体として、その使用に脚光を当てている（(a) Dondoni, A., Giovannini, P. P., and Massi, A. (2004) Organic Letters, 6(17), 2929-2932、(b) Dondoni, A., Mariotti, G., and Marra, A. (2002) J. Org. Chem. 67, 4475-4486 および(c) Dondoni, A., and Marra, A. (2000) Chem. 100, 4395-4421.）。このことも、GalNAc-O-アセチレン形成がグリコプロテイン生合成の出発原料であるというメカニズムの推測の理由付けとなる。また、このメカニズムは、3-O-硫酸化ΔHexA分解に対し一般的に適用可能である可能性がある。 It should be noted that many references have highlighted the use of C-glycosylacetylene as a powerful and better intermediate for the preparation of C-glycosyl-α-amino acids by capture in azide solutions during photochemical reactions. ((A) Dondoni, A., Giovannini, PP, and Massi, A. (2004) Organic Letters, 6 (17), 2929-2932, (b) Dondoni, A., Mariotti, G., and Marra, A. (2002) J. Org. Chem. 67, 4475-4486 and (c) Dondoni, A., and Marra, A. (2000) Chem. 100, 4395-4421.). This is also the reason for speculating the mechanism that GalNAc-O-acetylene formation is the starting material for glycoprotein biosynthesis. This mechanism may also be generally applicable to 3-O-sulfated ΔHexA degradation.

以上の通り、本参考例では、カブトガニ軟骨から得られた3-O-硫酸化グルクロン酸を含むテトラサッカリドGlcA(3S)β1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(3S)β1-GalNAc(4S)をCSase ABCにより消化した後の分解において、中間体と考えられる1-ヒドロキシ-1-[GalNAc(3S)-4-オキシ]-ブタ-3-イン-2-オンを同定した。また、GalNAc(4S)を最終生成物として与える前記分解工程中において推測されるメカニズムについては、前述の通りである。 As described above, in this reference example , tetrasaccharide GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S) β1-4GlcA (3S) β1-GalNAc (4S) containing 3-O-sulfated glucuronic acid obtained from horseshoe crab cartilage was used. In the degradation after digestion with CSase ABC, 1-hydroxy-1- [GalNAc (3S) -4-oxy] -but-3-in-2-one, which is thought to be an intermediate, was identified. The mechanism presumed during the decomposition step of giving GalNAc (4S) as a final product is as described above.

［参考例２：種々のGAGsの構造解析］ [ Reference Example 2: Structural analysis of various GAGs]

本参考例は、質量分析を用いて硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を解析する前記本発明の分析方法に関する。本参考例では、CS-KのみならずCS-Eについても酵素消化（分解）物のESI-MSによる分析を行い、3-O-硫酸化グルクロン酸を含むジサッカリドを検出した。これにより、本発明の分析方法が種々の硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖に適用可能であることを示した。なお、CS-Kは、前記と同様に調製したものを用い、CS-Eは市販品を用いた。 This reference example relates to the analysis method of the present invention, wherein the structure of a sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide is analyzed using mass spectrometry . In this reference example , not only CS-K but also CS-E was analyzed by enzyme digestion (degradation) by ESI-MS to detect disaccharides containing 3-O-sulfated glucuronic acid. Thus, it was shown that the analysis method of the present invention can be applied to various sulfated polysaccharides or sulfated oligosaccharides. CS-K was prepared in the same manner as above, and CS-E was a commercial product.

前述の通り、CS-KおよびCS-EをコンドロイチナーゼACIIやACIで消化して硫酸化オリゴ糖とし、NMR測定することにより、CS-Kがグルクロン酸3-O-硫酸[GlcA(3S)]を多く含むことが報告されていた。コンドロイチナーゼABC(CSase ABC)消化によるGlcA(3S)の分解のため、GlcA(3S)は、アニオン交換HPLCクロマトグラフィー分析による伝統的なジサッカリド分析では検出できない（非特許文献９）。本参考例では、CS-KおよびCS-EのCSase ABC消化（分解）物を質量分析することにより、GlcA(3S)を検出した。具体的には、CS-KおよびCS-EのCSase ABC消化後における消化（分解）物に含まれる、分解中間体と思われる物質をモニターすることにより、有意な量のGlcA(3S)を含むことを確認した。 As described above, CS-K is converted to glucuronic acid 3-O-sulfate [GlcA (3S) by digesting CS-K and CS-E with chondroitinase ACII or ACI to form sulfated oligosaccharides and measuring NMR. ] Has been reported. Due to degradation of GlcA (3S) by digestion with chondroitinase ABC (CSase ABC), GlcA (3S) cannot be detected by traditional disaccharide analysis by anion exchange HPLC chromatography analysis (Non-patent Document 9). In this reference example , GlcA (3S) was detected by mass spectrometry of CS-K and CS-E digested (degraded) products of CSase ABC. Specifically, it contains a significant amount of GlcA (3S) by monitoring substances that appear to be degradation intermediates in the digested (degraded) products after CSase ABC digestion of CS-K and CS-E. It was confirmed.

第一に、標準的なΔA-Kテトラサッカリド[ΔHexAα1-3GalNAc(4S)β1-4 GlcA(3S)β1-3GalNAc(4S)]（Kinoshita, A., Yamada, S., Haslam, M.S., Morris, H.R., Dell, A., and Sugahara K. (1997) J. Biol. Chem. 272, 19656-19665）を、モデル化合物としてCSase ABCで消化し、そして、その消化物を、優れた感度および分解能のためにフルオロフォア2-ABで標識した（Kinoshita, A., and Sugahara, K. (1999) Anal. Biochem. 269, 367-378）。続いて、前記生成物を、アニオン交換HPLCおよびアミノ結合シリカPA-03カラム(株式会社ワイエムシィ（日本国、京都）のYMC-Pack PA（商品名）)を用い、下記フローチャート１に記載の伝統的条件Aで分析した。 First, the standard ΔA-K tetrasaccharide [ΔHexAα1-3GalNAc (4S) β1-4 GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S)] (Kinoshita, A., Yamada, S., Haslam, MS, Morris, HR, Dell, A., and Sugahara K. (1997) J. Biol. Chem. 272, 19656-19665) were digested with CSase ABC as a model compound, and the digest was obtained with excellent sensitivity and resolution. For this purpose, it was labeled with fluorophore 2-AB (Kinoshita, A., and Sugahara, K. (1999) Anal. Biochem. 269, 367-378). Subsequently, the product was subjected to traditional anion exchange HPLC and amino-bonded silica PA-03 column (YMC-Pack PA (trade name) of YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan) as described in Flowchart 1 below. Analysis was performed under condition A.

図１４に、ΔA-KテトラサッカリドCSase ABC消化物のアニオン交換HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、前記CSase ABC消化物は、ΔA[ΔHexAα1-3GalNAc(4S)]ジサッカリドユニットおよびΔO[ΔHexAα1-3GalNAc]を、モル比45.7:54.3で含んでいた。このピークをさらにキャラクタライズするために、CSase ABC消化物の一定分量を、ゲル濾過でフラクション化（分画）した（フローチャート１）。前記フラクションを集め、ESI-MSにかけた。図１５に、そのESI-MSスペクトルを示す。図示の通り、前記ESI-MS（ネガティブイオンモード）の特性は、m/z 420に主なシグナルを示した。これは、2-ABで標識した一硫酸化GalNAcの分子量に対応する。このシグナルが示す物質については、必ずしも全てが明らかではないが、ΔHexAα1-3GalNAc(4S)の分解に由来する物質であり、CSase ABCのGalNAc(4S)に対する作用により生成されたと考えるのが合理的である。この生成メカニズムは、例えば、参考例１で述べたように推測される。 FIG. 14 shows an anion exchange HPLC chromatogram of the ΔA-K tetrasaccharide CSase ABC digest. As shown, the CSase ABC digest contained ΔA [ΔHexAα1-3GalNAc (4S)] disaccharide unit and ΔO [ΔHexAα1-3GalNAc] in a molar ratio of 45.7: 54.3. To further characterize this peak, an aliquot of CSase ABC digest was fractionated (fractionated) by gel filtration (Flowchart 1). The fractions were collected and subjected to ESI-MS. FIG. 15 shows the ESI-MS spectrum. As shown in the figure, the characteristic of the ESI-MS (negative ion mode) showed a main signal at m / z 420. This corresponds to the molecular weight of monosulfated GalNAc labeled with 2-AB. All of the substances indicated by this signal are not necessarily clear, but it is reasonable to think that they are substances derived from the degradation of ΔHexAα1-3GalNAc (4S) and produced by the action of CSase ABC on GalNAc (4S). is there. This generation mechanism is estimated as described in Reference Example 1 , for example.

第二に、CS-Kの試験サンプルを、前記フローチャート１に示す工程に従ってCSase ABC消化にかけた。図１６に、このようにしてCSase ABC消化し2-AB標識したCS-Kポリサッカリド製剤のアニオン交換HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、このHPLC特性は、GalNAc(4S)の位置にピークの存在を示した。このことは、ESI-MSにより確認された（データ示さず）。ΔAピークに観測されたスモールショルダーは、以下に述べる通りGalNAc(4S,6S)と推測される。また、下記表２に、HPLCにより決定したCS-Kの糖組成を示す。 Second, the CS-K test sample was subjected to CSase ABC digestion according to the steps shown in Flowchart 1 above. FIG. 16 shows an anion exchange HPLC chromatogram of the CS-K polysaccharide preparation thus digested with CSase ABC and labeled with 2-AB. As shown, this HPLC characteristic indicated the presence of a peak at the position of GalNAc (4S). This was confirmed by ESI-MS (data not shown). The small shoulder observed in the ΔA peak is presumed to be GalNAc (4S, 6S) as described below. Table 2 below shows the sugar composition of CS-K determined by HPLC.

2-AB-標識ΔOユニットおよび2-AB-標識GalNAc(4S)の保持時間は互いに近い。このため、本発明者らは、アニオン交換HPLCにおいてこれらのピークをより良く分解するために、前記フローチャート１に示した伝統的条件AをHPLC条件Bに改変した測定も行った。HPLC条件AとHPLC条件Bとの相違点は、緩衝液勾配である。具体的には、HPLC条件Aでは、緩衝液A（1M NaH₂PO₄）と緩衝液B（16mM NaH₂PO₄）の勾配を、60分間に対し緩衝液B濃度100%〜47%としたのに対し、HPLC条件Bでは、最初の20分間は緩衝液B濃度100%とし、次の40分間は47%に減少させた。図１７に、2-AB-標識不飽和CSジサッカリド標準およびGalNAc(4S)標準の、HPLC条件B下におけるアニオン交換HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、HPLC条件B下では、ΔOユニットの2-AB誘導体およびGalNAc(4S)が良く分解された。 The retention times of 2-AB-labeled ΔO unit and 2-AB-labeled GalNAc (4S) are close to each other. For this reason, the present inventors also performed measurement by changing the traditional condition A shown in the flowchart 1 to the HPLC condition B in order to better resolve these peaks in anion exchange HPLC. The difference between HPLC condition A and HPLC condition B is the buffer gradient. Specifically, under HPLC condition A, the gradient of buffer A (1M NaH ₂ PO ₄ ) and buffer B (16 mM NaH ₂ PO ₄ ) was set to a buffer B concentration of 100% to 47% for 60 minutes. In contrast, under HPLC condition B, the buffer B concentration was 100% for the first 20 minutes and decreased to 47% for the next 40 minutes. FIG. 17 shows anion exchange HPLC chromatograms under HPLC condition B of 2-AB-labeled unsaturated CS disaccharide standard and GalNAc (4S) standard. As shown in the figure, under HPLC condition B, the 2-AB derivative of ΔO unit and GalNAc (4S) were well decomposed.

第三に、イカ軟骨由来のCS-Eを分析した。 Third, squid cartilage-derived CS-E was analyzed.

イカ軟骨が約10%のGlcA(3S)を含むことは知られており、そして、100mgのCS-EをCSase ACIIで徹底消化した後、テトラサッカリドΔA-L[ΔHexAα1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(3S)β1-3GalNAc(6S)], ΔA-K[ΔHexAα1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(3S)β1-3GalNAc(4S)], ΔA-M[ΔHexAα1-3GalNAc(4S)β1-4GlcA(3S)β1-3GalNAc(4S,6S)], ΔE-K[ΔHexAα1-3GalNAc(4S,6S)β1-4GlcA(3S)β1-3GalNAc(4S)]およびΔE-M[ΔHexAα1-3GalNAc(4S,6S)β1-4GlcA(3S)β1-3GalNAc(4S,6S)]が285, 243, 508, 48および195mgの収量で得られ、GlcA(3S)含有構造が単離されている（Kinoshita, A., Yamada, S., Haslam, M.S., Khoo, K.H., Sugiura, M., Morris, R.H., Dell, A., and Sugahara, K. (2004) Biochemistry 43, 11063-11074）。本発明者らは、今回、下記フローチャート２によりCS-Eの消化（分解）生成物を分析した。そして、CSases ACIおよびACII抵抗性テトラサッカリドフラクションの2-AB標識後におけるアニオン交換HPLCクロマトグラフィーで、GalNAc(6S)およびGalNAc(4S,6S)であると推定される２つの生成物をさらに検出するという進歩があった。図１８に、2-AB標識後の、CSases ACIおよびACII抵抗性CS-EテトラサッカリドフラクションCSase ABC消化物のアニオン交換HPLCクロマトグラムを示す。 Squid cartilage is known to contain about 10% GlcA (3S), and after thorough digestion of 100 mg CS-E with CSase ACII, tetrasaccharide ΔA-L [ΔHexAα1-3GalNAc (4S) β1- 4GlcA (3S) β1-3GalNAc (6S)], ΔA-K [ΔHexAα1-3GalNAc (4S) β1-4GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S)], ΔA-M [ΔHexAα1-3GalNAc (4S) β1-4GlcA ( 3S) β1-3GalNAc (4S, 6S)], ΔE-K [ΔHexAα1-3GalNAc (4S, 6S) β1-4GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S)] and ΔE-M [ΔHexAα1-3GalNAc (4S, 6S) β1-4GlcA (3S) β1-3GalNAc (4S, 6S)] was obtained in yields of 285, 243, 508, 48 and 195 mg, and the GlcA (3S) containing structure was isolated (Kinoshita, A., Yamada , S., Haslam, MS, Khoo, KH, Sugiura, M., Morris, RH, Dell, A., and Sugahara, K. (2004) Biochemistry 43, 11063-11074). The present inventors analyzed the digestion (decomposition) product of CS-E this time according to the following flowchart 2. Anion exchange HPLC chromatography after 2-AB labeling of CSases ACI and ACII resistant tetrasaccharide fractions further detects two products presumed to be GalNAc (6S) and GalNAc (4S, 6S) There has been progress. FIG. 18 shows an anion exchange HPLC chromatogram of CSases ACI and ACII resistant CS-E tetrasaccharide fraction CSase ABC digest after 2-AB labeling.

CSase ABCは、ΔA-KおよびΔE-KからGalNAc(4S)を、ΔA-LからGalNAc(6S)を、ΔA-MおよびΔE-MからGalNAc(4S,6S)を、1.00：0.98：2.42のモル比で生じさせた。GlcA(3S)を含むと思われるテトラサッカリドフラクションは、第一に、CS-EをCSases ACIとACIIの混合物で消化して得た。これは、GlcA(3S)に対するN-アセチルガラクトサミン結合が、前記２つの酵素に抵抗性であり、前記酵素に抵抗性のテトラサッカリドフラクション中に濃縮されやすいためである。したがって、上記フローチャート２の通り、その後のステップで、前記抵抗性テトラサッカリドフラクションを、GlcA(3S)-含有構造の分析に用いた。 CSase ABC is obtained from ΔA-K and ΔE-K to GalNAc (4S), ΔA-L to GalNAc (6S), ΔA-M and ΔE-M to GalNAc (4S, 6S), 1.00: 0.98: 2.42. It was generated in a molar ratio. The tetrasaccharide fraction that appears to contain GlcA (3S) was first obtained by digesting CS-E with a mixture of CSases ACI and ACII. This is because the N-acetylgalactosamine bond to GlcA (3S) is resistant to the two enzymes and is likely to be concentrated in the tetrasaccharide fraction resistant to the enzymes. Therefore, as shown in Flowchart 2, the resistant tetrasaccharide fraction was used for the analysis of the GlcA (3S) -containing structure in the subsequent steps.

しかしながら、ΔA-L, ΔA-MおよびΔE-M由来のGalNAc(4S), GalNAc(6S)および／またはGalNAc(4S,6S)は、内部シーケンスのみならず、CS-Eポリサッカリド鎖の非還元末端からも生成されている可能性がある。それゆえに、対照実験で、前記CS-Eポリサッカリド製剤をCSases ACIとACIIの混合物により消化したところ、アニオン交換HPLCのGalNAc(4S), GalNAc(6S)またはGalNAc(4S,6S)部位には、何のピークも与えなかった。この結果は、CS-Eが、ポリサッカリド鎖の非還元末端に、感知できるほどの量のGalNAc(4S), GalNAc(6S)またはGalNAc(4S,6S)を含まないことを示す。 However, GalAc (4S), GalNAc (6S) and / or GalNAc (4S, 6S) from ΔA-L, ΔA-M and ΔE-M are not only reduced to the internal sequence but also to the non-reduced CS-E polysaccharide chain. It may also be generated from the end. Therefore, when the CS-E polysaccharide preparation was digested with a mixture of CSases ACI and ACII in a control experiment, the GalNAc (4S), GalNAc (6S) or GalNAc (4S, 6S) sites of anion exchange HPLC were No peak was given. This result indicates that CS-E does not contain appreciable amounts of GalNAc (4S), GalNAc (6S) or GalNAc (4S, 6S) at the non-reducing end of the polysaccharide chain.

さらに、CS-Eサンプル中のGlcA(3S)-結合GalNAc(6S)およびGalNAc(4S,6S)をGlcA(3S)-結合GalNAc(4S)とともに検出するために、CSases ACIおよびACIIに抵抗性のCS-EテトラサッカリドフラクションをCSase ABC消化にかけ、2-ABで標識した。続いて、この2-AB標識消化物の一定分量を、0.2M炭酸水素アンモニウムを溶出剤として用いたSuperdex（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社の商品名）ペプチドカラムによるゲル濾過で分画した。図１９に、このゲル濾過のクロマトグラムを示す。 Furthermore, in order to detect GlcA (3S) -bound GalNAc (6S) and GalNAc (4S, 6S) together with GlcA (3S) -bound GalNAc (4S) in CS-E samples, it is resistant to CSases ACI and ACII. The CS-E tetrasaccharide fraction was subjected to CSase ABC digestion and labeled with 2-AB. Subsequently, an aliquot of the 2-AB-labeled digest was fractionated by gel filtration using a Superdex (trade name of GE Healthcare Biosciences) peptide column using 0.2M ammonium bicarbonate as an eluent. FIG. 19 shows a chromatogram of this gel filtration.

図１９に示すフラクション1〜5を個別に採取し、そして、各フラクションをESI-MSにかけた。ネガティブモードによる前記ESI-MSでは、フラクション1は未同定分子イオンシグナルを示し、一方、フラクション2および3は、それぞれ、2-ABで標識した二硫酸化および一硫酸化ジサッカリドに対応する分子イオンシグナルを示した（データ示さず）。フラクション5は、m/z 420に主なシグナルを示した。これは、2-ABで標識した一硫酸化GalNAcの分子量に対応する。このことは、GalNAc(4S)もしくはGalNAc(6S)または両方に対応する生成物が、ΔA-KおよびΔE-KまたはΔA-Lの分解に由来することを示している。図２０に、図１９におけるフラクション４のESI-MSスペクトルを示す。図示の通り、フラクション4では、前記スペクトルは、m/z 522に分子イオンシグナルを示した。これは、2-ABで標識した一ナトリウム化二硫酸化GalNAcの分子質量に対応する。この生成物は、ΔA-MおよびΔE-MのCSase ABC消化後の分解により生じたGalNAc(4S,6S)であると考えるのが合理的である。 Fractions 1-5 shown in FIG. 19 were collected individually and each fraction was subjected to ESI-MS. In the ESI-MS in negative mode, fraction 1 shows an unidentified molecular ion signal, while fractions 2 and 3 are molecular ion signals corresponding to 2-AB labeled disulfated and monosulfated disaccharides, respectively. (Data not shown). Fraction 5 showed the main signal at m / z 420. This corresponds to the molecular weight of monosulfated GalNAc labeled with 2-AB. This indicates that products corresponding to GalNAc (4S) or GalNAc (6S) or both are derived from the degradation of ΔA-K and ΔE-K or ΔA-L. FIG. 20 shows an ESI-MS spectrum of fraction 4 in FIG. As shown, in fraction 4, the spectrum showed a molecular ion signal at m / z 522. This corresponds to the molecular mass of monosodium disulfated GalNAc labeled with 2-AB. It is reasonable to consider that this product is GalNAc (4S, 6S) produced by degradation of ΔA-M and ΔE-M after CSase ABC digestion.

本発明者らは、前記ゲル濾過HPLCによるフラクション４の溶出位置にさらに注目し、前記フローチャート２に記載の通り、前記フラクション４の一定分量をアニオン交換HPLCにかけた。図２１に、図１９におけるフラクション４の、フローチャート２に記載のHPLC条件B下でのアニオン交換HPLCクロマトグラムを示す。図示の通り、HPLC特性は、ΔAの溶出位置に単一の主要なピークを示した。 The inventors further paid attention to the elution position of the fraction 4 by the gel filtration HPLC, and applied an aliquot of the fraction 4 to the anion exchange HPLC as described in the flowchart 2. FIG. 21 shows an anion exchange HPLC chromatogram of the fraction 4 in FIG. 19 under the HPLC condition B described in the flowchart 2. As shown, the HPLC characteristics showed a single major peak at the elution position of ΔA.

さらに、図１９におけるフラクション４を、HPLC条件B下でのアニオン交換HPLCクロマトグラフィーにより、信頼性のあるΔCSジサッカリド標準および2-AB標識GalNAc(4S)標準混合物との共クロマトグラフィーにかけた。図２２に、そのクロマトグラムを示す。図示の通り、このクロマトグラムは、ΔAのショルダーピークとして特異的に、ΔCとΔAの間のフラクション４ピーク溶出を示した。このピークのモルパーセンテージは、表に示す通り、ACIおよびACIIに抵抗性のテトラサッカリドフラクションにおけるジサッカリド組成物全量の29%に相当する。これは、ΔA-MおよびΔE-Mユニットの両方に由来するGalNAc(4S,6S)の検出についての最初の報告である。対照実験として、CS-Eポリサッカリド製剤をCSases ACIおよびACIIの混合物で消化したところ、アニオン交換HPLCではGalNAc(4S,6S)溶出位置に何の有意なピークも与えなかった。このことは、前述の通り、CS-Eはポリサッカリド鎖の非還元末端に検出可能な量のGalNAc(4S,6S)を含まないことを示す。興味深いことに、CS-KのCSase ABC消化物もまたΔAにショルダーピークを示した。このショルダーピークは、CS-KのMユニットに由来するGalNAc(4S,6S)を表すと思われる。 In addition, fraction 4 in FIG. 19 was subjected to co-chromatography with a reliable ΔCS disaccharide standard and 2-AB labeled GalNAc (4S) standard mixture by anion exchange HPLC chromatography under HPLC condition B. FIG. 22 shows the chromatogram. As shown, this chromatogram showed fraction 4 peak elution specifically between ΔC and ΔA, specifically as the shoulder peak of ΔA. The molar percentage of this peak corresponds to 29% of the total disaccharide composition in the tetrasaccharide fraction resistant to ACI and ACII, as shown in the table. This is the first report on the detection of GalNAc (4S, 6S) from both ΔA-M and ΔE-M units. As a control experiment, a CS-E polysaccharide formulation was digested with a mixture of CSases ACI and ACII, and anion exchange HPLC did not give any significant peak at the GalNAc (4S, 6S) elution position. This indicates that CS-E does not contain a detectable amount of GalNAc (4S, 6S) at the non-reducing end of the polysaccharide chain, as described above. Interestingly, the CSase ABC digest of CS-K also showed a shoulder peak at ΔA. This shoulder peak appears to represent GalNAc (4S, 6S) derived from the CS-K M unit.

以上の結果は、本参考例においてフローチャート１および２等で述べた工程が、ΔA-KおよびΔE-K由来のGalNAc(4S)とΔA-MおよびΔE-Mシーケンス由来のGalNAc(4S,6S)の検出および定量を可能にすることを明確に示す。すなわち、本発明の分析方法は、単純ヘルペスウィルス感染を阻害する強力な生物活性を有するCS-EおよびCS-K製剤の質の確認に適用できる。なお、CS-EおよびCS-Kの単純ヘルペスウィルス感染阻害については、Bergefall, K., Trybala, E., Johansson, M., Uyama, T., Naito, S., Yamada, S., Kitagawa, H., Sugahara, K., and Bergstrom, T. (2005) J. Biol. Chem. 280, 32193-32199およびBergefall, K., Trybala, E., Johansson, M., Uyama, T., Naito, S., Yamada, S., Kitagawa, H., Sugahara, K., Bergestrom, T. (2005) in Abstract of International Symposium on “Proteoglycans in Signaling”, Sep. 7-11, 2005, Stockholm, Sweden, abstract 81に記載されている。 The above results indicate that the steps described in the flowcharts 1 and 2 in this reference example are performed using GalNAc (4S) derived from ΔA-K and ΔE-K and GalNAc (4S, 6S) derived from ΔA-M and ΔE-M sequences. It clearly shows that the detection and quantification of can be performed. That is, the analysis method of the present invention can be applied to confirm the quality of CS-E and CS-K preparations having a strong biological activity that inhibits herpes simplex virus infection. Regarding herpes simplex virus infection inhibition of CS-E and CS-K, Bergefall, K., Trybala, E., Johansson, M., Uyama, T., Naito, S., Yamada, S., Kitagawa, H., Sugahara, K., and Bergstrom, T. (2005) J. Biol. Chem. 280, 32193-32199 and Bergefall, K., Trybala, E., Johansson, M., Uyama, T., Naito, S., Yamada, S., Kitagawa, H., Sugahara, K., Bergestrom, T. (2005) in Abstract of International Symposium on “Proteoglycans in Signaling”, Sep. 7-11, 2005, Stockholm, Sweden, abstract 81.

以上の通り、本参考例によれば、質量分析を用い、GlcA(3S)含有二糖単位を高感度で簡易に検出し、CS-EとCS-Kにおけるその含量を決定することに成功した。 As described above, according to this reference example , using mass spectrometry, GlcA (3S) -containing disaccharide units were easily detected with high sensitivity, and their contents in CS-E and CS-K were successfully determined. .

以上説明した通り、本発明によれば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の構造を高感度で解析できる分析方法を提供することができる。本発明の分析方法によれば、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の生物活性の基盤となりうる構造、例えばコンドロイチン硫酸中に含まれるGlcA(3S)構造等を高感度で簡易に検出することができる。これにより、例えば、癌転移阻害、ウィルス感染阻害等の基盤となっている構造を解明することで、癌転移、ウイルス感染のメカニズム解明等の基礎医学分野への応用も期待できる。また、前記のような構造を検出することで、硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖の生物活性等の品質を評価し、抗癌剤、制癌剤、抗ウィルス薬開発等の創薬分野に応用することができる。 As described above, according to the present invention, it is possible to provide an analysis method capable of analyzing the structure of a sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide with high sensitivity. According to the analysis method of the present invention, a structure that can serve as a basis for the biological activity of a sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide, such as a GlcA (3S) structure contained in chondroitin sulfate, can be easily detected with high sensitivity. . Thus, for example, by elucidating the structure underlying the inhibition of cancer metastasis, virus infection, etc., application to basic medical fields such as elucidation of the mechanism of cancer metastasis and virus infection can also be expected. Moreover, by detecting the structure as described above, the quality of the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide can be evaluated for the biological activity and the like, and can be applied to drug discovery fields such as the development of anticancer drugs, anticancer drugs, and antiviral drugs. .

また、本発明によれば、優れた生物活性を有する硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を含む薬学的組成物および医薬を提供することができる。本発明の薬学的組成物および医薬は、前記特定の硫酸化多糖または硫酸化オリゴ糖を活性物質として含むことにより、その活性物質に対応した優れた生物活性を有し、その生物活性や副作用の軽減により、種々の分野への適用が可能である。例えば、酸化処理による副作用の軽減は、GAGのみならず、糖脂質、糖タンパク質等の糖鎖生物学、基礎医学、応用医学、創薬分野、糖鎖工学に新しい分野を切り開く突破口となると考えられる。 Moreover, according to this invention, the pharmaceutical composition and pharmaceutical containing the sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide which have the outstanding biological activity can be provided. The pharmaceutical composition and medicament of the present invention contain the above-mentioned specific sulfated polysaccharide or sulfated oligosaccharide as an active substance, thereby having excellent biological activity corresponding to the active substance, The reduction can be applied to various fields. For example, the reduction of side effects due to oxidation treatment is considered to be a breakthrough that opens up new fields not only in GAG but also in glycobiology such as glycolipids and glycoproteins, basic medicine, applied medicine, drug discovery, and glycoengineering. .

Claims

A group comprising chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance and comprising cell growth inhibition, cell death induction, tumor cell growth inhibition, tumor cell invasion inhibition, tumor cell metastasis inhibition, tumor cell migration inhibition, and tumor cell death induction The pharmaceutical composition used for the use regarding at least one selected from.

A medicament comprising chondroitin sulfate E (CS-E) as an active substance and used for at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, alleviation and prevention of diseases related to cell proliferation.

Diseases related to cell proliferation are brain tumor, head and neck cancer, neuroblastoma, sinus cancer, pharyngeal cancer, esophageal cancer, lung cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, bladder Cancer, testicular cancer, breast cancer, uterine cancer, uterine fibroid, cervical cancer, ovarian cancer, acute leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, malignant lymphoma, erythrocytosis, true polycythemia, essential thrombocytosis The medicament according to claim 2, which is at least one disease selected from the group consisting of symptom, myeloma, osteosarcoma, choriocarcinoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, glioblastoma, astrocytoma, and soft tissue sarcoma .

The medicament according to claim 2 or 3, which is used for at least one application selected from the group consisting of an antitumor agent, an anticancer agent, an anticancer agent and an antimetastatic agent.

Dengue virus infection comprising at least one selected from the group consisting of CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K A pharmaceutical composition for use in inhibition.

Dengue virus infection comprising at least one selected from the group consisting of CS-E, CS-EP (periodic acid-treated CS-E), CS-EPA (alkali-treated CS-EP), and CS-K A medicament used for at least one application selected from the group consisting of treatment, diagnosis, symptom reduction and prevention of diseases relating to inhibition.

A pharmaceutical composition for use in connection with growth factor binding, comprising at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K, and oxidized CS-E.

The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the oxidation treatment is an oxidation treatment with a perhalogen acid.

The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the perhalogenic acid is periodic acid.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 7 to 9, wherein the oxidized CS-K or CS-E is CS-K or CS-E that has been oxidized and further alkali-treated.

Contains at least one selected from the group consisting of CS-K, oxidized CS-K, and oxidized CS-E, and selected from the group consisting of treatment, diagnosis, relief and prevention of diseases related to growth factor binding Medicament used for at least one use.

The medicament according to claim 11, wherein the oxidation treatment is an oxidation treatment with a perhalogen acid.

The medicament according to claim 12, wherein the perhalogenic acid is periodic acid.

The pharmaceutical according to any one of claims 11 to 13, wherein the oxidized CS-K or CS-E is an oxidized CS-K or CS-E after the oxidation treatment.