JP2011055719A - Method for synthesizing polynucleotide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリヌクレオチドの合成法にかかり、詳細には、プライマーとしてオリゴＡを用いることによるＰｏｌｙ（Ｉ）、Ｐｏｌｙ（Ｃ）、或いはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）などについて、望ましい分子量、すなわち鎖長を有するポリヌクレオチドの合成法に関する。 The present invention relates to a method for synthesizing polynucleotides. Specifically, for Poly (I), Poly (C), or Poly (I: C) by using Oligo A as a primer, the desired molecular weight, that is, the chain length. The present invention relates to a method for synthesizing a polynucleotide having
二重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、或いは、一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）、Ｐｏｌｙ（Ｃ）は種々の薬理作用を発揮し、近年その薬理作用に基づく応用性が注目されている。
特に、ＩｇＡ抗体を誘導する経鼻投与アジュバントとして一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、さらに二重鎖ポリヌクレオチドとしてのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）又はＰｏｌｙ（Ａ：Ｃ）について注目がもたれている（特許文献１）。
Poly (I: C), which is a double-stranded polynucleotide, or Poly (I) and Poly (C), which are single-stranded polynucleotides, exhibit various pharmacological actions, and in recent years they have applicability based on their pharmacological actions. Attention has been paid.
In particular, Poly (I) or Poly (C) as a single-stranded polynucleotide as an intranasal adjuvant for inducing an IgA antibody, and Poly (I: C) or Poly (A: C) as a double-stranded polynucleotide It is attracting attention (Patent Document 1).
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の合成方法にあっては、化学的合成法と酵素的合成法があり、それぞれ長所及び短所がある。例えば、化学的合成法では、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の構成成分であるＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）について予め定められた鎖長の分子を合成することができ、ほぼ同じ長さをもつＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）をアニーリング（annealing）させることで、均一の二重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を作成することができる利点を有している。
しかしながら、必要とされる鎖長としての２００−ｍｅｒ以上のＰｏｌｙ（Ｉ）やＰｏｌｙ（Ｃ）を合成するには、多量の出発物質を必要とし、またその製造コストは膨大なものとなる。
Poly (I: C) synthesis methods include a chemical synthesis method and an enzymatic synthesis method, each having advantages and disadvantages. For example, in the chemical synthesis method, it is possible to synthesize molecules having a predetermined chain length for Poly (I) and Poly (C), which are constituent components of Poly (I: C), and have almost the same length. By annealing Poly (I) and Poly (C), there is an advantage that uniform double-chain Poly (I: C) can be produced.
However, in order to synthesize Poly (I) or Poly (C) of 200-mer or more as the required chain length, a large amount of starting material is required, and the production cost thereof is enormous.
一方、酵素的合成法は比較的安価にＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）を合成することができるが、それぞれの鎖長のコントロールが困難であり、非常に広範囲の分子量分布を持つ一重鎖のＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）が合成されてくる。したがって、そのようなＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）をアニーリングさせると、相補的に二重鎖を形成する部分以外にどちらかの鎖が余分になりフリーとなる。その結果、その部分に相補的な一重鎖が結合し、低分子のものから、非常に巨大な分子までの分子量分布の広い二重鎖が形成されることになる。そのため、得られた巨大Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む溶液は粘度が高くなり、容易に限外濾過膜を通過しない問題が生じ、精製をすることが困難のものとなる。 On the other hand, although the enzymatic synthesis method can synthesize Poly (I) and Poly (C) at a relatively low cost, it is difficult to control the length of each chain, and a single chain having a very wide molecular weight distribution is difficult to control. Poly (I) and Poly (C) are synthesized. Therefore, when such Poly (I) and Poly (C) are annealed, one of the strands becomes redundant and becomes free other than the portion that forms a complementary duplex. As a result, a complementary single chain is bound to the portion, and a double chain having a wide molecular weight distribution from a low molecular to a very large molecule is formed. Therefore, the obtained solution containing huge Poly (I: C) has a high viscosity, which causes a problem that it does not easily pass through the ultrafiltration membrane, and is difficult to purify.
したがって、本発明は上記の現状を鑑み、問題点を解決した望ましい鎖長を有する一重鎖ポリヌクレオチド、或いは二重鎖ポリヌクレオチド、特にＰｏｌｙ（Ｉ）、Ｐｏｌｙ（Ｃ）並びにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の合成法を提供することを課題とする。 Accordingly, in view of the above situation, the present invention is a single-stranded polynucleotide or a double-stranded polynucleotide having a desirable chain length that has solved the problems, and in particular, Poly (I), Poly (C), and Poly (I: C). It is an object of the present invention to provide a synthesis method.
かかる課題を解決するための本発明は、具体的には以下の構成からなる。
（１）基質に対して適当量のオリゴＡを添加することによる望ましい鎖長の一重鎖ポリヌクレオチドを製造する方法。
（２）望ましい鎖長が２００〜５００塩基対である上記１に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（３）オリゴＡの量が、基質の１／１０〜１／１００の濃度であることを特徴とする上記１又は２に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（４）基質がポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼ（ＰＮＰ）である上記１、２又は３に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（５）５’末端に一定の塩基を付加することによりランダムなアニーリングを防ぎ、望ましい鎖長の二重鎖ポリヌクレオチドを製造する方法。
（６）一重鎖ポリヌクレオチドが、Ｐｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）である上記１〜４のいずれかに記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（７）二重鎖ポリヌクレオチドがＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である上記５に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（７）オリゴＡが、ｐＡｐＡ（ｎ＝２）、ｐＡｐＡｐＡ（ｎ＝３）、ｐＡｐＡｐＡｐＡ（ｎ＝４）、ＡｐＡ（n＝２）又はＡｐＡｐA（n＝４）である上記１に記載のポリヌクレオチドを製造する方法。
（但し、Ａはアデニンヌクレオチドを示し、ｐはリン酸基を示す）
である。
Specifically, the present invention for solving this problem has the following configuration.
(1) A method for producing a single-stranded polynucleotide having a desired chain length by adding an appropriate amount of oligo A to a substrate.
(2) The method for producing the polynucleotide according to 1 above, wherein the desired chain length is 200 to 500 base pairs.
(3) The method for producing a polynucleotide according to (1) or (2) above, wherein the amount of oligo A is 1/10 to 1/100 of the substrate.
(4) The method for producing a polynucleotide according to the above 1, 2 or 3, wherein the substrate is polyribonucleotide phosphorylase (PNP).
(5) A method for producing a double-stranded polynucleotide having a desired chain length by adding a certain base to the 5 ′ end to prevent random annealing.
(6) The method for producing the polynucleotide according to any one of 1 to 4 above, wherein the single-stranded polynucleotide is Poly (I) or Poly (C).
(7) The method for producing a polynucleotide according to 5 above, wherein the double-stranded polynucleotide is Poly (I: C).
(7) The polynucleotide according to 1 above, wherein the oligo A is pApA (n = 2), pApApA (n = 3), pApApApA (n = 4), ApA (n = 2) or ApApA (n = 4) How to manufacture.
(However, A represents an adenine nucleotide and p represents a phosphate group)
It is.
本発明が提供する、これまで高価な化学的な製造方法により合成されていた一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、或いは二重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、簡便な方法により安価に合成し得る利点を有している。
また、本発明法による合成されるポリヌクレオチドは望ましい鎖長を有するものであり、低分子のものから、非常に巨大な分子までの分子量分布の広い二重鎖が形成される酵素的合成法に比較して、ほぼ同じ長さをもつＰｏｌｙ（Ｉ）及びＰｏｌｙ（Ｃ）をアニーリング（annealing）させることで、均一の二重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を作成することができる利点を有している。
Poly (I) or Poly (C) which is a single-stranded polynucleotide synthesized by an expensive chemical production method provided by the present invention, or Poly (I: C) which is a double-stranded polynucleotide. Can be synthesized inexpensively by a simple method.
In addition, the polynucleotide synthesized by the method of the present invention has a desirable chain length, and is an enzymatic synthesis method in which a duplex having a wide molecular weight distribution from a low molecular weight molecule to a very large molecule is formed. In comparison, Poly (I) and Poly (C) having approximately the same length are annealed, thereby having the advantage that a uniform double-strand Poly (I: C) can be produced. Yes.
したがって、インフルエンザウイルスに対するワクチン療法におけるＩｇＡ抗体を誘導する経鼻投与アジュバントとしてのＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、更には、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｃ）を安価に提供し得ものであり、その産業上の利点は多大なものである。 Therefore, Poly (I) or Poly (C) as a nasal administration adjuvant for inducing IgA antibody in vaccine therapy against influenza virus, and Poly (A: C) can be provided at low cost. The above advantages are enormous.
本発明者等は、経済的に効率的な酵素法を用いることにより、合成される一重鎖のＰｏｌｙ（Ｉ）およびＰｏｌｙ（Ｃ）の分子量を制限することにより、最終的に得られ二重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をある一定の分子量範囲に収めることを目的とし、一重鎖Ｐｏｌｙ（Ｉ）およびＰｏｌｙ（Ｃ）を効率よく合成する方法検討した。 The present inventors have finally obtained a double chain by limiting the molecular weight of the synthesized single chain Poly (I) and Poly (C) by using an economically efficient enzymatic method. For the purpose of keeping Poly (I: C) within a certain molecular weight range, a method for efficiently synthesizing single-chain Poly (I) and Poly (C) was examined.
その結果、ポリリボヌクレオチドフォスフォリラーゼ（ＰＮＰ）はリボ核酸二ヌクレオチドを基質としてポリリボ核酸を合成するのに用いられている。このＰＮＰはオリゴＡなどのプライマーを用いることで、その反応速度が数倍から１０倍以上速くなることが知られており、この反応速度の違いを利用して、ポリリボ核酸を合成しようと試みた。
その結果、ＰＮＰを基質として用いることにより、酵素反応は選択的にプライマーを取り合うことなり、同時に起こるプライマーを利用しない反応はゆっくり進むので、大部分の基質を消費したところで、できるポリリボ核酸は短鎖のものと長鎖のものの混合物となることを確認した。
As a result, polyribonucleotide phosphorylase (PNP) has been used to synthesize polyribonucleic acids using ribonucleic acid dinucleotides as substrates. This PNP is known to increase the reaction rate from several times to 10 times or more by using a primer such as Oligo A. Using this difference in reaction rate, an attempt was made to synthesize polyribonucleic acid. .
As a result, by using PNP as a substrate, the enzyme reaction selectively contacts the primer, and the reaction that does not use the simultaneous primer proceeds slowly. Therefore, when most of the substrate is consumed, the resulting polyribonucleic acid is a short chain. It was confirmed to be a mixture of a long chain and a long chain.
しかしながら、従来の酵素法と異なり、低分子から高分子まで一様に分布するものでなく、低分子のものとある一定の鎖長をもつ高分子のものとの混合物となる。これを分子篩等の方法で分離することにより分子量分布の狭いポリリボ核酸を得ることができることことを確認した。
したがって、かかる方法を用いて、特異的な薬理作用をもつ望ましい分子量分布の限られたＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を製造することが可能となった。
その具体的方法の実際を図示すれば、図１に示したようにまとめられる。
However, unlike the conventional enzymatic method, it is not uniformly distributed from a low molecule to a polymer, but becomes a mixture of a low molecule and a polymer having a certain chain length. It was confirmed that a polyribonucleic acid having a narrow molecular weight distribution can be obtained by separating it by a method such as molecular sieve.
Accordingly, it has become possible to produce Poly (I: C) having a specific pharmacological action and having a desirable molecular weight distribution limited.
If the actual method is illustrated, it can be summarized as shown in FIG.
以下に本発明について、実施例を挙げて具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
実施例１：
反応組成として以下のものを使用した。
Tris-HCl（ｐＨ９．５） ７４ｍＭ
EDTA ０．６７ｍＭ
塩化マグネシウム ５３ｍＭ
ＮＤＰ（ヌクレオチド二リン酸） ６．６ｍＭ
ＡｐＡｐＡ（プライマー） ０．０７ｍＭ
Ｅｎｚｙｍｅ ２００units
全 量 ２００μＬ
反応条件としては、６５℃にて６０分間反応させた。
Example 1:
The following reaction compositions were used.
Tris-HCl (pH 9.5) 74 mM
EDTA 0.67mM
Magnesium chloride 53 mM
NDP (nucleotide diphosphate) 6.6 mM
ApApA (primer) 0.07 mM
Enzyme 200units
Total volume 200μL
As reaction conditions, the reaction was carried out at 65 ° C. for 60 minutes.
所望の反応時間後、過剰のＣＤＴＡ又は酢酸を添加して反応を終了させ、アガロース電気泳動にて分子量分布を調べた。
その電気泳動の結果から、分子量ピークの分布は、約２００塩基対（ヌクレオチド）であり、±１σでは３００〜７００塩基対（ヌクレオチド）であった。
なお、プライマーとしてオリゴＡを用いないで反応させた場合には、反応速度が遅く、生成されるポリヌクレオチドの分子量分布が広く、±１σに相当する分子量分布は、約５０〜１７００塩基対（ヌクレオチド）であった。
実施例２：
After the desired reaction time, excess CDTA or acetic acid was added to terminate the reaction, and the molecular weight distribution was examined by agarose electrophoresis.
From the result of the electrophoresis, the distribution of the molecular weight peak was about 200 base pairs (nucleotides), and ± 1σ was 300 to 700 base pairs (nucleotides).
When the reaction was performed without using oligo A as a primer, the reaction rate was slow, the molecular weight distribution of the produced polynucleotide was wide, and the molecular weight distribution corresponding to ± 1σ was about 50 to 1700 base pairs (nucleotides). )Met.
Example 2:
同様の方法により、ＡＤＰからＰｏｌｙ（Ａ）を合成し、その蔗糖密度勾配遠心法で分析したものを図２として示した。
また、同様の方法により、ＧＤＰからＰｏｌｙ（Ｇ）を合成し、その蔗糖密度勾配遠心法で分析したものを図３として示した。
図２から判明するように、Ｐｏｌｙ（Ａ）のピークは約７ｓであり、２００程度の塩基対（ヌクレオチド）であった。
また、図３から判明するように、Ｐｏｌｙ（Ｇ）のピークは約８ｓであり、３００程度の塩基対（ヌクレオチド）であった。
Poly (A) was synthesized from ADP by the same method and analyzed by sucrose density gradient centrifugation as shown in FIG.
Further, Poly (G) was synthesized from GDP by the same method and analyzed by sucrose density gradient centrifugation as shown in FIG.
As can be seen from FIG. 2, the peak of Poly (A) was about 7 s, which was about 200 base pairs (nucleotides).
As can be seen from FIG. 3, the peak of Poly (G) was about 8 s, which was about 300 base pairs (nucleotides).
発明により、これまで高価な化学的な製造方法により合成されていた一重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、或いは二重鎖ポリヌクレオチドであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を、簡便な方法により安価に合成される。
本発明が提供するポリヌクレオチドは、望ましい分子量としての鎖長を有するものであり、品質も良好なものであることから、インフルエンザウイルスに対するワクチン療法におけるＩｇＡ抗体を誘導する経鼻投与アジュバントとしてのＰｏｌｙ（Ｉ）又はＰｏｌｙ（Ｃ）、更には、Ｐｏｌｙ（I：Ｃ）を安価に提供し得ものである。
したがって、その産業上の利点は多大なものである。
According to the invention, Poly (I) or Poly (C), which is a single-stranded polynucleotide that has been synthesized by an expensive chemical production method, or Poly (I: C), which is a double-stranded polynucleotide, can be conveniently used. Can be synthesized inexpensively by a simple method.
Since the polynucleotide provided by the present invention has a chain length as a desirable molecular weight and has a good quality, Poly (as a nasal administration adjuvant for inducing IgA antibody in vaccine therapy against influenza virus) I) or Poly (C), and furthermore, Poly (I: C) can be provided at low cost.
Therefore, the industrial advantages are tremendous.
Claims (8)
（但し、Ａはアデニンヌクレオチドを示し、ｐはリン酸基を示す） The polynucleotide according to claim 1, wherein the oligo A is pApA (n = 2), pApApA (n = 3), pApApApA (n = 4), ApA (n = 2) or ApApA (n = 4). how to.
(However, A represents an adenine nucleotide and p represents a phosphate group)
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