JP2011053227A - Method for analyzing lipoprotein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試料中に含まれるリポプロテインを各サブクラスに分画することによって、各種疾患の診断に有効なデータ解析を可能とするリポプロテインの分析方法に関する。 The present invention relates to a lipoprotein analysis method that enables effective data analysis for diagnosis of various diseases by fractionating lipoproteins contained in a sample into subclasses.
ゲル濾過液体クロマトグラフィー法により被験試料に含まれるリポプロテインを粒子サイズに依存して分離し、その後、分離したリポプロテインに含まれるコレステロール及びトリアシルグリセロールを定量する方法において、得られたクロマトグラムをガウス分布曲線近似法等の波形処理によって、カイロミクロン、超低比重リポプロテイン、低比重リポプロテイン及び高比重リポプロテインに分画する方法が特開平９−１５２２５号公報に開示されている。 In the method of separating the lipoprotein contained in the test sample depending on the particle size by gel filtration liquid chromatography, and then quantifying the cholesterol and triacylglycerol contained in the separated lipoprotein, Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-15225 discloses a method of fractionating into chylomicron, ultra-low density lipoprotein, low density lipoprotein and high density lipoprotein by waveform processing such as Gaussian distribution curve approximation.
ゲル濾過液体クロマトグラフィー法により被験試料に含まれるリポプロテインを粒子サイズに依存して分離し、その後、分離したリポプロテインに含まれるコレステロール及びトリアシルグリセロールを定量する方法において、リポプロテインを２０個のサブクラスに分離する方法が特開２００２−１３９５０１号公報に開示されている。 In a method for separating lipoproteins contained in a test sample depending on the particle size by gel filtration liquid chromatography and then quantifying cholesterol and triacylglycerol contained in the separated lipoproteins, A method for separating into subclasses is disclosed in JP-A-2002-139501.
しかしながら、特許文献２に開示された分離方法は、特定のカラムを使用した場合にのみ適用され、２０個のサブクラスに関する各ピーク位置（すなわち粒子サイズ）についても根拠となる理論的な裏付けのないものであった。例えば、LDL（low density lipoprotein）の粒子サイズについても、GGE法（ポリアクリルアミド密度勾配ゲル電気泳動法）では25.5nmをカットオフ値に設定し、NMR法では電子顕微鏡で観察したサイズを基準にして20nm程度と設定し、ゲルろ過FPLC法ではGGE法におけるサイズを基準にして25.5nmと設定し、ゲルろ過HPLCではラテックスビーズや球状蛋白質を基準にして25.5nmと設定している。また、光散乱法を基準にすれば、これらサイズの見積もり方によってまちまちの値になる。さらに、超遠心平衡法で分子量を求めてサイズを計算すれば、また別の値になる。 However, the separation method disclosed in Patent Document 2 is applied only when a specific column is used, and there is no theoretical support that is the basis for each peak position (ie, particle size) for 20 subclasses. Met. For example, for LDL (low density lipoprotein) particle size, 25.5 nm is set as the cutoff value in the GGE method (polyacrylamide density gradient gel electrophoresis), and the size observed with an electron microscope is used as a reference in the NMR method. In the gel filtration FPLC method, it is set to 25.5 nm based on the size in the GGE method, and in the gel filtration HPLC, it is set to 25.5 nm based on latex beads and globular proteins. Moreover, if the light scattering method is used as a reference, the values vary depending on how the sizes are estimated. Furthermore, if the molecular weight is determined by the ultracentrifugation method and the size is calculated, another value is obtained.
従って、粒子サイズを基準にしてリポプロテインのサブクラスを規定し、血清サンプルに含まれるリポプロテインをサブクラス間で比較する事は混乱を生じることなる。 Therefore, defining subclasses of lipoproteins based on particle size and comparing lipoproteins in serum samples between subclasses can be confusing.
上述した実状に鑑みて、本発明者は、リポタンパク代謝からVLDL、LDL及びHDLサイズの範囲が狭いと考えられる代謝異常症患者などにおいて観測されるピークの位置を基準にすることによって、分離能や分離範囲の異なるゲルろ過カラムを使った場合であっても、複数のサンプルにおけるサブクラス間の比較が可能となることを見いだした。 In view of the above situation, the present inventor has determined the resolution by using the position of the peak observed in patients with metabolic abnormalities considered to have a narrow range of VLDL, LDL, and HDL sizes from lipoprotein metabolism. Even when gel filtration columns with different separation ranges were used, it was found that comparison between subclasses in multiple samples became possible.
本発明を適用したリポプロテインの分析方法は、被験試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質粒子に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（エクストラ・エッセンシャル・ピーク：extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号をもちいて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程とを含む。 The method for analyzing lipoproteins to which the present invention is applied comprises a step of separating a plurality of classes of lipoproteins contained in a test sample by liquid chromatography and detecting a signal derived from a component contained in the separated lipoprotein particles; Assuming that the protein is composed of subclasses estimated from component peaks consisting of anchor peaks and other essential peaks (extra essential peaks), the above detected signals are used to correspond to the component peaks. Calculating an approximate waveform to be performed.
また、分離したリポタンパク質粒子に含まれる上記成分の例としては、コレステロール、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等を挙げることができる。 本発明に係るリポプロテインの分析方法において、上記近似波形は、コレステロール、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等の少なくとも１つの成分に由来する、検出された信号に基づいて算出してもよい。 Examples of the components contained in the separated lipoprotein particles include cholesterol, triglyceride, free cholesterol, phospholipid, and apolipoprotein. In the lipoprotein analysis method according to the present invention, the approximate waveform may be calculated based on a detected signal derived from at least one component such as cholesterol, triglyceride, free cholesterol, phospholipid, and apolipoprotein. .
アンカーピークは実験的に決められるピークである。一方、他の必須ピークは数学的にピークの位置と幅が決まるものである。LDLとHDLにおいてサブクラスの分布幅はほぼ同じと仮定し、アンカーピークの間をほぼ等間隔に埋めるように、他の必須ピークの位置及び幅を決定する。 The anchor peak is an experimentally determined peak. On the other hand, other essential peaks are mathematically determined in terms of peak position and width. Assuming that the distribution widths of the subclasses in LDL and HDL are almost the same, the positions and widths of other essential peaks are determined so as to fill the space between anchor peaks at almost equal intervals.
コンポーネントピークの数としては、特に限定されないが、13〜20個とすることができる。例えば、液体クロマトグラフィーに使用するカラムとして、リポタンパクの分画範囲の広い（CMからHDLまで分子可能な）TSKのXLカラムを使用した場合には、最大で２０個のコンポーネントピークを設定することができる。また、カラムとしてVLDLからHDLが分画範囲（CMは分画範囲でない）のファルマシアのカラムでは、20個未満のコンポーネントピークを設定することができる。さらに、カラムとして例えばTSKのG3000SWXLを使用した場合には、最低13個のコンポーネントピークを設定することができる。 Although it does not specifically limit as a number of component peaks, It can be set as 13-20 pieces. For example, if you use a TSK XL column with a wide lipoprotein fraction range (which allows molecules from CM to HDL) as the column for liquid chromatography, set up to 20 component peaks. Can do. In addition, in the Pharmacia column in which the VLDL to HDL fractionation range (CM is not the fractionation range) is used as a column, it is possible to set less than 20 component peaks. Furthermore, for example, when TSK G3000SWXL is used as a column, at least 13 component peaks can be set.
アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、健常中年男性の集団由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズの平均溶出時間として定義することができる。また、アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズの平均溶出位置として定義することができる。さらに、アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるHDLサイズの平均溶出位置として定義することができる。さらにまた、アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、アポE2/2のIII型高脂血症例由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるVLDLサイズの平均溶出位置として定義するとこができる。 The anchor peak elution time (particle size) can be defined as the average elution time of VLDL size, LDL size, and HDL size in a profile obtained using the above-mentioned sample derived from a healthy middle-aged male population. In addition, the anchor peak elution time (particle size) is the average elution position of VLDL size, LDL size, and HDL size in the profile obtained using the above samples from cases with no or very low lipoprotein lipase activity. Can be defined as Furthermore, the elution time (particle size) of the anchor peak can be defined as the average elution position of the HDL size in the profile obtained using the above-mentioned sample derived from complete deficiency of cholesterol ester transfer protein. Furthermore, the elution time (particle size) of the anchor peak can be defined as the average elution position of the VLDL size in the profile obtained using the above-mentioned sample derived from an apo E2 / 2 type III hyperlipidemia case. .
コレステロール由来の検出信号に基づいて定義されたコンポーネントピークを用いて、コレステロール由来のプロファイルに関する近似曲線を算出しても良いが、コレステロール以外の成分、例えば、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等の成分由来のプロファイルに関する他の近似曲線を算出してもよい。 An approximate curve for a cholesterol-derived profile may be calculated using a component peak defined based on a cholesterol-derived detection signal, but components other than cholesterol, such as triglycerides, free cholesterol, phospholipids, apolipoproteins, etc. Another approximate curve related to the profile derived from the component may be calculated.
また、本発明を適用した内蔵脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法は、診断対象者から採取した被験試料を準備する工程と、上記試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離する工程と、分離したリポタンパク質に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピークからなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号をもちいて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程と、算出された近似波形を分析する工程とを含む。 Further, a method for diagnosing a disease caused by accumulation of built-in fat to which the present invention is applied includes a step of preparing a test sample collected from a person to be diagnosed, and separating a plurality of classes of lipoproteins contained in the sample by liquid chromatography Assuming that the lipoprotein is composed of a subclass estimated from a component peak consisting of an anchor peak and other essential peaks, and a step of detecting a signal derived from a component contained in the separated lipoprotein. A step of calculating an approximate waveform corresponding to the component peak using the detected signal and a step of analyzing the calculated approximate waveform are included.
内臓脂肪の蓄積に起因する疾患としては、例えば、虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患を挙げることができる。すなわち、近年、生活習慣の変遷に伴って栄養過多や運動不足に陥り、脂肪蓄積、肥満を来たし、その結果、多数のリスクファクターの集積を伴って虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患の増加を招いている。これはインスリン抵抗性を起こす遺伝的素因に肥満などの後天的因子が加わり、インスリン抵抗性が生じて発症するものである。上流に位置する成因基盤としては、腹腔内内臓脂肪蓄積が重要である。肥満者はもちろん非肥満者においても腹腔内内臓脂肪の蓄積は糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患（coronary artery disease (CAD)）の発症に密接に関与している。したがって、内臓脂肪おの蓄積に起因する疾患としては、糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患を挙げることができる。 Examples of the diseases caused by visceral fat accumulation include arteriosclerotic diseases centered on ischemic heart diseases. That is, in recent years, due to changes in lifestyle habits, overnutrition and lack of exercise have resulted in fat accumulation and obesity, resulting in the accumulation of a number of risk factors and atherosclerotic diseases centered on ischemic heart disease. Has led to an increase. This occurs when an acquired factor such as obesity is added to the genetic predisposition causing insulin resistance, resulting in insulin resistance. As an etiological base located upstream, abdominal visceral fat accumulation is important. In obese as well as non-obese individuals, the accumulation of intra-abdominal visceral fat is closely related to the onset of diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and coronary artery disease (CAD). Accordingly, examples of diseases caused by accumulation of visceral fat include diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and coronary artery disease.
本発明を適用した内臓脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法によれば、例えば、内臓脂肪面積と大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量とが正の相関を、また内臓脂肪面積と大中HDLサブクラスのコレステロール量とが負の相関を示した。言い換えれば、内臓脂肪の蓄積に起因する疾患は、大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量の増加、大中HDLサブクラスのコレステロール量の減少によって診断される。 According to the method for diagnosing a disease caused by visceral fat accumulation to which the present invention is applied, for example, the visceral fat area is positively correlated with the amount of cholesterol in the large / medium / small VLDL subclass and the small / medium minimal LDL subclass And the amount of cholesterol in the Onaka HDL subclass showed a negative correlation. In other words, diseases caused by the accumulation of visceral fat are diagnosed by an increase in the amount of cholesterol in the large, medium and small VLDL subclasses, a small and medium very small LDL subclass, and a decrease in the amount of cholesterol in the large and medium HDL subclass.
また、LDLのコレステロールの高値は、重要なリスク因子の１つである。LDLのコレステロール濃度が正常な群（LDL-C＜130mg/dL）では、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と負の相関を示したのに対して、大LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と正の相関を示した。これは、LDLの中に善玉LDLサブクラスが存在することを意味するもので、大LDLサブクラスが内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症を抑制する作用をもつことを意味している。大LDLサブクラスのコンポーネントピークは、他の必須ピークであり、VLDLとLDLの間の遷移成分として決められたものであるが、本発明により、臨床的意義をもつ新しいサブクラスとして新たに評価することができる。言い換えると、内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症は、大LDLサブクラスのコンポーネントピークのコレステロール量によって診断することができる。 In addition, high LDL cholesterol is one of the important risk factors. In the group with normal LDL cholesterol concentration (LDL-C <130 mg / dL), the cholesterol concentration of the small and extremely small LDL subclass was negatively correlated with the internal fat area, whereas the cholesterol concentration of the large LDL subclass was It showed a positive correlation with the internal fat area. This means that there is a good LDL subclass in LDL, and that the large LDL subclass has the action of suppressing the onset of arteriosclerosis due to the accumulation of internal fat. The component peak of the large LDL subclass is another essential peak and has been determined as a transition component between VLDL and LDL, but it can be newly evaluated as a new subclass with clinical significance according to the present invention. it can. In other words, the onset of arteriosclerosis due to visceral fat accumulation can be diagnosed by the amount of cholesterol in the component peak of the large LDL subclass.
また、冠動脈疾患では小VLDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の減少が見られることから、小VLDL、小及び極小LDL、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の測定によって、冠動脈疾患を診断することができる。 In coronary artery disease, small VLDL subclasses have increased cholesterol levels, small and very small LDL subclasses have increased cholesterol levels, and large HDL subclasses have decreased cholesterol levels. Coronary artery disease can be diagnosed by measuring the cholesterol concentration.
本発明に係る冠動脈疾患の診断方法において、診断対象者から採取した被験試料に含まれるリポタンパク質を本発明に係るリポタンパク質の分析方法を用いて分析する工程と、以下の（I）〜（V）から選ばれる少なくとも１つの式に基づいて値を算出する工程とを含んでいる。
(I) Vs + Ls - Hs;
(II) Vs + Ls;
(III) Ls;
(IV) (Vs + Ls)/Hs; and
(V) Ls/Hs,
In the method for diagnosing coronary artery disease according to the present invention, the steps of analyzing lipoproteins contained in a test sample collected from a diagnostic subject using the lipoprotein analysis method according to the present invention, and the following (I) to (V) ) from based on at least one formula selected and a step of calculating the value.
(I) Vs + Ls-Hs;
(II) Vs + Ls;
(III) Ls;
(IV) (Vs + Ls) / Hs; and
(V) Ls / Hs,
ここで、“Vs”は小VLDLに含まれるコレステロール量を示し、“Ls”は小LDL及び極小LDLに含まれるコレステロール量の合計を示し、“Hs”は大HDLに含まれるコレステロール量を示している。 Here, “Vs” indicates the amount of cholesterol contained in the small VLDL, “Ls” indicates the total amount of cholesterol contained in the small LDL and the minimal LDL, and “Hs” indicates the amount of cholesterol contained in the large HDL. Yes.
本発明に係る冠動脈疾患の診断方法において、上記分析する工程は、更に算出された値を基準値と比較する工程を含むことが好ましい。 In the coronary artery disease diagnosis method according to the present invention, it is preferable that the analyzing step further includes a step of comparing the calculated value with a reference value.
なお、冠動脈疾患で有意に増加する小VLDLサブクラスのコンポーネントピークは、アポE2/2のIII型高脂血症のVLDLサイズから求めたアンカーピークであり、アポE2/2のIII型高脂血症で増加しているレムナントに相当するもので、冠動脈の重要なリスク因子であるレムナントを本プログラムにおける小VLDLサブクラスに対応するコンポーネントピークから見積もることができると評価できる。 The component peak of the small VLDL subclass that significantly increases in coronary artery disease is an anchor peak obtained from the VLDL size of apo E2 / 2 type III hyperlipidemia, and apo E2 / 2 type III hyperlipidemia It can be evaluated that the remnant, which is an important coronary risk factor, can be estimated from the component peak corresponding to the small VLDL subclass in this program.
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、分離能や分離範囲の異なるゲルろ過カラムを使った場合であっても、複数のサンプルにおけるサブクラス間の比較が可能となるリポタンパク質粒子の分析装置及び分析方法を提供することができる。本発明に係るリポタンパク質の分析装置及び分析方法によれば、従来公知の手法及び装置と比較して信頼性の高いデータを取得することができる。本発明に係るリポタンパク質の分析装置及び分析方法によって取得されたデータは、糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患といった内臓脂肪蓄積に起因する各種の疾患の診断に有効に利用することができる。 As described above in detail, according to the present invention, the lipoprotein particle can be compared between subclasses in a plurality of samples even when gel filtration columns having different resolution and separation ranges are used. An analysis apparatus and an analysis method can be provided. According to the lipoprotein analysis apparatus and analysis method of the present invention, it is possible to obtain highly reliable data as compared with conventionally known techniques and apparatuses. The data obtained by the lipoprotein analyzer and analysis method according to the present invention can be effectively used for diagnosis of various diseases caused by visceral fat accumulation such as diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and coronary artery disease. .
以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
本分析方法及び分析プログラムが適用されるリポタンパク質分析装置は、例えば、図１に示すように、被験試料に含まれるリポタンパク質成分を分離するためのカラム１と、カラム１から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液を２分配するスプリッター２と、スプリッター２によって分配された第１流路３及び第２流路４と、第１流路３に配置されたコレステロール（以下「TC」と称する）反応部５と、第２流路４に配置されたトリグリセリド（以下「TG」と称する）反応部６と、第１流路３におけるTC反応部５の下流に配置されたTC検出部７と、第２流路４におけるTG反応部６の下流に配置されたTG検出部８と、本装置の動作制御及びTC検出部７並びにTG検出部８から信号が入力されるシステムコントローラー９と、システムコントローラー９に接続された演算装置１０とを備えている。ここで、被験試料とは、特に限定されず、血清、血漿、髄液、組織液及びリンパ液等の生体由来液体サンプル、並びに細胞培養系由来の分泌粒子を含有するサンプルを意味する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
A lipoprotein analyzer to which the present analysis method and analysis program are applied includes, for example, a column 1 for separating a lipoprotein component contained in a test sample and a lipoprotein eluted from the column 1, as shown in FIG. The splitter 2 that distributes the eluent containing 2 in two, the first channel 3 and the second channel 4 distributed by the splitter 2, and the cholesterol (hereinafter referred to as “TC”) reaction arranged in the first channel 3 Section 5, a triglyceride (hereinafter referred to as "TG") reaction section 6 disposed in the second flow path 4, a TC detection section 7 disposed downstream of the TC reaction section 5 in the first flow path 3, A TG detection unit 8 disposed downstream of the TG reaction unit 6 in the two flow paths 4, a system controller 9 to which signals are input from the operation control and TC detection unit 7 and the TG detection unit 8, and a system controller 9 And an arithmetic device 10 connected to the. Here, the test sample is not particularly limited, and means a sample containing a biological fluid sample such as serum, plasma, spinal fluid, tissue fluid and lymph fluid, and a secretory particle derived from a cell culture system.
また、リポタンパク質分析装置は、血清試料をカラム１に供給するサンプラー１１と、カラム１に溶離液を供給するための第１ポンプ１２と、第１ポンプ１２によってカラム１に供給する溶離液から気体を除去するデガッサー１３とを備えている。 The lipoprotein analyzer also includes a sampler 11 for supplying a serum sample to the column 1, a first pump 12 for supplying an eluent to the column 1, and a gas from the eluent supplied to the column 1 by the first pump 12. And a degasser 13 for removing the.
リポタンパク質分析装置においてカラム１としては、特に限定されないが、ゲルろ過用充填剤を充填してなるカラムを用いることが特に好ましい。特に、カラム１としては、８００〜１２００オングストロームの平均細孔径の充填剤を有するものを例示できる。平均細孔径が８００オングストローム未満の充填剤ではＣＭやＶＬＤＬなどの分子サイズの大きいリポタンパク質は細孔内に入り難くなり、一方、平均細孔径が１２００オングストロームを超える充填剤ではＬＤＬやＨＤＬなどの分子サイズの小さいリポタンパク質の分離が悪化するため、前述の通り平均細孔径が８００〜１２００オングストロームのものが好ましい。中でも平均細孔径が９００〜１１００オングストロームの充填剤は、分離能に優れるため、最終的により精度の高いリポタンパク質の分析を行うことを可能とする。 In the lipoprotein analyzer, the column 1 is not particularly limited, but it is particularly preferable to use a column filled with a gel filtration filler. In particular, the column 1 can be exemplified by a column having a filler having an average pore diameter of 800 to 1200 angstroms. With fillers with an average pore size of less than 800 angstroms, lipoproteins with large molecular sizes such as CM and VLDL are difficult to enter into the pores, whereas with fillers with an average pore size of more than 1200 angstroms, molecules such as LDL and HDL Since separation of small-sized lipoproteins deteriorates, those having an average pore diameter of 800 to 1200 angstroms are preferable as described above. Among them, a filler having an average pore diameter of 900 to 1100 angstroms is excellent in resolution, so that it is possible to finally analyze a lipoprotein with higher accuracy.
また、充填剤としては、液体クロマトグラフィーでの使用に充分耐える機械的強度を有するものを選択する必要がある。このような充填剤は、例えば、シリカゲル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシメタクリレート及びその他の親水性樹脂を基材とするもの（例えばTSK gel Lipopropak、商品名、東ソー（株）製）を一例として例示することできる。 In addition, it is necessary to select a filler having a mechanical strength that can sufficiently withstand use in liquid chromatography. Examples of such fillers include, for example, those based on silica gel, polyvinyl alcohol, polyhydroxymethacrylate and other hydrophilic resins (for example, TSK gel Lipopropak, trade name, manufactured by Tosoh Corporation). it can.
溶離液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液等を例示できるが、リポタンパク質を分離できるものであれば特に制限はない。緩衝液の濃度としては２０〜２００ｍＭ、特に好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲が良い。緩衝液の濃度が２０ｍＭ未満では緩衝能が小さく、２００ｍＭを超えると後述の酵素試薬とTC又はTGの反応が阻害される恐れが生じるからである。緩衝液のｐＨは、５〜９、特に好ましくは７〜８である。緩衝液のｐＨが５未満、あるいはｐＨが９を超えると、前記同様、酵素試薬との反応が阻害される恐れが生じるからである。しかし、TC及び／又はTGの測定を、酵素を用いないで行う場合等はこの限りではない。 Examples of the eluent include phosphate buffer, Tris buffer, and bis-Tris buffer, but are not particularly limited as long as they can separate lipoproteins. The buffer concentration is 20 to 200 mM, particularly preferably 50 to 100 mM. This is because if the concentration of the buffer solution is less than 20 mM, the buffer capacity is small, and if it exceeds 200 mM, the reaction between the enzyme reagent described below and TC or TG may be inhibited. The pH of the buffer is 5-9, particularly preferably 7-8. This is because if the pH of the buffer solution is less than 5 or more than 9, the reaction with the enzyme reagent may be inhibited as described above. However, this is not the case when measuring TC and / or TG without using an enzyme.
TC反応部５は、カラム１から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液に含まれるTCを定量するための試薬を備えるTC用試薬タンク１４と第２ポンプ１５を介して連結されている。ここで、TCを定量するための試薬としては、特に限定されないが、例えば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、パーオキシダーゼなどの酵素と、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N'- サクシニルエチレンジアミン、4-アミノアンチピリン、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-m-アニシジンなどの色素とを組み合わせた酵素−色素試薬を用いることができる。試薬としては、例えば、市販のデタミナーL TCII(協和メデックス株式会社)、LタイプCHO・H（和光純薬工業株式会社）試薬を好適に用いることができる。なお、これらの試薬は、TCと反応して、蛍光検出器や紫外可視検出器などの分光器で検出可能な蛍光や吸収を有する反応生成物を与える。 The TC reaction unit 5 is connected via a second pump 15 to a TC reagent tank 14 provided with a reagent for quantifying TC contained in the eluent containing lipoprotein eluted from the column 1. Here, the reagent for quantifying TC is not particularly limited, and examples thereof include enzymes such as cholesterol esterase, cholesterol oxidase, peroxidase, and N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-succinyl. An enzyme-dye reagent in combination with a dye such as ethylenediamine, 4-aminoantipyrine, N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -m-anisidine can be used. As the reagent, for example, commercially available Determiner L TCII (Kyowa Medex Co., Ltd.), L type CHO.H (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) reagent can be suitably used. These reagents react with TC to give reaction products having fluorescence and absorption that can be detected by a spectroscope such as a fluorescence detector or an ultraviolet-visible detector.
TG反応部６は、カラム１から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液に含まれるTGを定量するための試薬を備えるTC用試薬タンク１６と第２ポンプ１５を介して連結されている。ここで、TGを定量するための試薬としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３リン酸オキシダーゼ、リポプロテインリパーゼ及びパーオキシダーゼ等の酵素と、キノン系発色色素等の色素とを組み合わせた酵素−色素試薬を用いることができる。キノン系発色色素としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン又はＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジンと４−アンチアミノピリジンの酸化縮合体が挙げられる。試薬としては、例えば、市販のデタミナーL TGII(協和メデックス株式会社)、LタイプTG・H（和光純薬工業株式会社）試薬を好適に用いることができる。 The TG reaction unit 6 is connected to a TC reagent tank 16 provided with a reagent for quantifying TG contained in the eluent containing lipoprotein eluted from the column 1 via the second pump 15. Here, the reagent for quantifying TG is not particularly limited. For example, enzymes such as ascorbate oxidase, glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase, lipoprotein lipase and peroxidase, and quinone coloring dyes are used. An enzyme-dye reagent in combination with the above dye can be used. Examples of quinone coloring dyes include oxidation of N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N′-succinylethylenediamine or N-ethyl-N- (3-sulfopropyl) -m-anisidine and 4-antiaminopyridine. A condensate is mentioned. As the reagent, for example, commercially available Determiner L TGII (Kyowa Medex Co., Ltd.), L type TG • H (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) reagent can be suitably used.
なお、これら、TC反応部５及びTG反応部６は、上述した試薬とTC又はTGとの反応温度を制御するための反応コイルをそれぞれ備えている。TC反応部５及びTG反応部６において、上述した試薬とTC又はTGとの反応温度は、３５〜５０℃、好ましくは４５〜５０℃とする。反応温度が３５℃未満では反応が不十分になりやすく、また、５０℃を超えると反応中に酵素が劣化する恐れが生じるからある。 The TC reaction unit 5 and the TG reaction unit 6 are each provided with a reaction coil for controlling the reaction temperature between the above-described reagent and TC or TG. In the TC reaction unit 5 and the TG reaction unit 6, the reaction temperature between the above-described reagent and TC or TG is 35 to 50 ° C, preferably 45 to 50 ° C. If the reaction temperature is less than 35 ° C, the reaction tends to be insufficient, and if it exceeds 50 ° C, the enzyme may be deteriorated during the reaction.
TC検出部７は、TC反応部５でTCと試薬とが反応して生成した反応生成物の吸光度を検出するための、例えば紫外可視光検出器を備えている。また、TG検出器８は、TG反応部６でTGと試薬とが反応して生成した反応生成物の吸光度を検出するための、例えば紫外可視光検出器を備えている。例えば、上述した試薬としてキノン系発色色素を用いた場合、紫外可視検出器の測定波長は、５４０〜５６０ｎｍとすれば良い。 The TC detection unit 7 includes, for example, an ultraviolet-visible light detector for detecting the absorbance of the reaction product generated by the reaction of TC and the reagent in the TC reaction unit 5. The TG detector 8 includes, for example, an ultraviolet-visible light detector for detecting the absorbance of the reaction product generated by the reaction of TG and the reagent in the TG reaction unit 6. For example, when a quinone coloring pigment is used as the reagent described above, the measurement wavelength of the ultraviolet-visible detector may be 540 to 560 nm.
システムコントローラー９は、TC検出部７及びTG検出部８からの出力信号が入力され、TCに関するクロマトグラム及びTGに関するクロマトグラムを結果として出力する機能を備えている。システムコントローラー９から出力されるクロマトグラムとしては、例えば、図２に示すように、横軸を溶出時間（min）とし、縦軸を検出値（mV）として、TCに関するクロマトグラムとTGに関するクロマトグラムとを重ねて表示することができる。 The system controller 9 has a function of receiving output signals from the TC detection unit 7 and the TG detection unit 8 and outputting a TC chromatogram and a TG chromatogram as a result. As the chromatogram output from the system controller 9, for example, as shown in FIG. 2, the horizontal axis is the elution time (min) and the vertical axis is the detection value (mV), and the chromatogram for TC and the chromatogram for TG. Can be displayed in a superimposed manner.
演算装置１０としては、例えば、後述する分析プログラムをインストールしたコンピュータを使用することができる。演算装置１０は、システムコントローラー９と接続されており、システムコントローラー９から出力されるクロマトグラムを分析プログラムによってデータ処理し、被験試料に含まれるリポタンパク質を２０個のコンポーネントピークに分離するとともにTC量及びTG量を算出する機能を有する。なお、この演算装置１０は、インターネット、LAN或いはイントラネット等の情報通信回線網を介してシステムコントローラー９と接続されていても良い。 As the arithmetic unit 10, for example, a computer in which an analysis program to be described later is installed can be used. The arithmetic unit 10 is connected to the system controller 9, processes the chromatogram output from the system controller 9 by an analysis program, separates lipoproteins contained in the test sample into 20 component peaks, and TC amount. And a function of calculating the amount of TG. The arithmetic device 10 may be connected to the system controller 9 via an information communication network such as the Internet, a LAN, or an intranet.
上述したリポタンパク質分析装置によれば、先ず、カラム１によって粒子サイズに依存して各種リポタンパク質を分離し、その後、カラム１から溶出された溶出液に含まれるTC及びTGを定量している。したがって、リポタンパク質分析装置によれば、カラム１の分離能に依存して、リポタンパク質のサブクラス毎にTC及びTGを定量することができる。 According to the lipoprotein analyzer described above, first, various lipoproteins are separated by the column 1 depending on the particle size, and then TC and TG contained in the eluate eluted from the column 1 are quantified. Therefore, according to the lipoprotein analyzer, TC and TG can be quantified for each subclass of lipoprotein depending on the resolution of the column 1.
なお、リポタンパク質は、その粒子の大きさ、水和密度、及び電気泳動度などの性質の違いにより幾つかのクラスに分類されている。本分析装置においては、以下に説明する分析プログラムに従って、血清試料に含まれるリポプロテインを２０個のコンポーネントピークに分離する。 Lipoproteins are classified into several classes depending on differences in properties such as particle size, hydration density, and electrophoretic mobility. In this analyzer, lipoproteins contained in a serum sample are separated into 20 component peaks according to an analysis program described below.
以下、分析プログラムについて説明する。分析プログラムは、ステップ１及びステップ２からなるフローチャートに従って演算装置１０を制御する。 The analysis program will be described below. The analysis program controls the arithmetic device 10 according to the flowchart consisting of step 1 and step 2.
先ず、ステップ１では、演算装置１０の入力手段を介してシステムコントローラー９から出力されるクロマトグラムを入力信号として入力する。すなわち、分析プログラムは、ステップ１によって、システムコントローラー９から出力されるクロマトグラムを入力信号として入力する検出手段としてコンピュータを実行させる。 First, in step 1, the chromatogram output from the system controller 9 is input as an input signal via the input means of the arithmetic unit 10. That is, in step 1, the analysis program causes the computer to execute as detection means for inputting the chromatogram output from the system controller 9 as an input signal.
ステップ１を詳細に説明すると、先ず、演算装置１０の入力手段を介して、図２に示したようなTCに関するクロマトグラムとTGに関するクロマトグラムとを入力すると、例えば、演算装置１０に内在する記憶装置或いは演算装置１０により記録可能な記録媒体にこれらクロマトグラム及び/又はクロマトグラムの基となる数値データが記憶される。 Step 1 will be described in detail. First, when the chromatogram relating to TC and the chromatogram relating to TG as shown in FIG. 2 are input via the input means of the arithmetic unit 10, for example, the memory inherent in the arithmetic unit 10 is stored. These chromatograms and / or numerical data on which the chromatograms are based are stored in a recording medium that can be recorded by the apparatus or the arithmetic unit 10.
次に、ステップ２では、入力したクロマトグラムを波形処理して２０個のサブクラスに分離し、ガウス近似波形を算出する。すなわち、分析プログラムは、ステップ２によって、ガウス近似波形を算出する波形処理手段としてコンピュータを実行させる。波形処理手段により、ステップ１で入力したクロマトグラムを２０個の独立したピークに分離することができる。以下の説明において、２０個の独立したピークを、サイズの大きいものから順にG1〜G20と称する。G1及びG2はカイロミクロン（CM）に相当するコンポーネントピークであり、G3〜G7は超低密度（比重）リポタンパク（VLDL）に相当するコンポーネントピークであり、G8〜G13は低密度リポタンパク（LDL）に相当するコンポーネントピークであり、G14〜G20は高密度リポタンパク（HDL）に相当するコンポーネントピークである。VLDLに相当するコンポーネントピークの中で、G3〜G5は大VLDLであり、G6は中VLDLであり、G7は小VLDLである。LDLに相当するコンポーネントピークのなかで、G8は大LDLであり、G9は中LDLであり、G10は小LDLであり、G11〜G13は極小LDLである。HDLに相当するコンポーネントピークのなかで、G14及びG15は極大HDLであり、G16は大HDLであり、G17は中HDLであり、G18は小HDLであり、G19及びG20は極小HDLである。 Next, in step 2, the input chromatogram is subjected to waveform processing and separated into 20 subclasses, and a Gaussian approximate waveform is calculated. That is, in step 2, the analysis program causes the computer to execute as waveform processing means for calculating a Gaussian approximate waveform. The chromatogram input in step 1 can be separated into 20 independent peaks by the waveform processing means. In the following description, 20 independent peaks are referred to as G1 to G20 in descending order of size. G1 and G2 are component peaks corresponding to chylomicron (CM), G3 to G7 are component peaks corresponding to very low density (specific gravity) lipoprotein (VLDL), and G8 to G13 are low density lipoprotein (LDL). ) And G14 to G20 are component peaks corresponding to high-density lipoprotein (HDL). Among the component peaks corresponding to VLDL, G3 to G5 are large VLDL, G6 is medium VLDL, and G7 is small VLDL. Among the component peaks corresponding to LDL, G8 is large LDL, G9 is medium LDL, G10 is small LDL, and G11 to G13 are minimal LDL. Among the component peaks corresponding to HDL, G14 and G15 are maximal HDL, G16 is large HDL, G17 is medium HDL, G18 is small HDL, and G19 and G20 are minimal HDL.
ステップ２における波形処理手段は、ステップ１で入力したクロマトグラム或いは数値データを２０個のコンポーネントピークに分離して、G1〜G20を含むガウス近似波形を算出する処理を演算装置１０に実行させる手段である。ここで、２０個のコンポーネントピークは、リポプロテインのサイズにより分類されるコンポーネントピークである。 The waveform processing means in step 2 is means for separating the chromatogram or numerical data input in step 1 into 20 component peaks and causing the arithmetic unit 10 to execute processing for calculating a Gaussian approximate waveform including G1 to G20. is there. Here, the 20 component peaks are component peaks classified according to the size of lipoprotein.
２０個のコンポーネントピークの各ピーク位置は、以下のように定義される。G1〜G20からなる２０個のピークについて、先ず基準となるピーク（アンカーピーク）のピーク位置（溶出時間）が決められ、次にアンカーピークを除くピーク（他の必須ピーク）のピーク位置が決められる。具体的に、一例として、G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17及びG18をアンカーピークとし、G1〜G4、G8、G11〜G14、G16、G19及びG20を他の必須ピークとする。G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17及びG18をアンカーピークとして定義する際の根拠となるデータの例を図３に示す。 Each peak position of the 20 component peaks is defined as follows. For the 20 peaks consisting of G1 to G20, the peak position (elution time) of the reference peak (anchor peak) is first determined, and then the peak positions of the peaks other than the anchor peak (other essential peaks) are determined. . Specifically, as an example, G5, G6, G7, G9, G10, G15, G17 and G18 are anchor peaks, and G1 to G4, G8, G11 to G14, G16, G19 and G20 are other essential peaks. FIG. 3 shows an example of data that is the basis for defining G5, G6, G7, G9, G10, G15, G17, and G18 as anchor peaks.
健常中年男性（３０〜４０歳代）の集団におけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズはある範囲の幅に分布することから、アンカーピークのうちG6、G9及びG17の溶出位置を決定する（図３(a)参照）。より具体的には、複数の健常中年男性（３０〜４０歳代）について、採取した血清試料を用いて図２に示したようなTCに関するクロマトグラム及びTGに関するクロマトグラムを取得する。取得したクロマトグラムには、大分類としてのVLDL、LDL及びHDLに相当するピークがこの順に出現している。複数の健常中年男性について取得したクロマトグラムにおける、VLDL、LDL及びHDLに相当するピーク位置の平均値を算出し、平均VLDLサイズ、平均LDLサイズ及び平均HDLサイズをそれぞれG6、G9及びG17の溶出位置（粒子サイズ）として定義する。 Since the VLDL size, LDL size, and HDL size are distributed over a certain range in the population of healthy middle-aged men (30-40 years old), the elution positions of G6, G9, and G17 of the anchor peaks are determined (Fig. 3 (a)). More specifically, the chromatogram for TC and the chromatogram for TG as shown in FIG. 2 are obtained using a collected serum sample for a plurality of healthy middle-aged men (30 to 40 years old). In the acquired chromatogram, peaks corresponding to VLDL, LDL, and HDL as major categories appear in this order. Calculate the average value of peak positions corresponding to VLDL, LDL, and HDL in chromatograms obtained for multiple healthy middle-aged men, and elute the average VLDL size, average LDL size, and average HDL size into G6, G9, and G17, respectively. Defined as position (particle size).
また、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例では、TGリッチリポタンパクのトリグリセリドが分解されず、VLDLは大サイズのまま血中に留まっている。従ってリポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低くい症例の集団はVLDLのサイズは健常男性より有意に大きく、所定のサイズの範囲内に分布している。このVLDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG5の溶出位置として定義する（図３(b)参照）。 In cases where lipoprotein lipase activity is absent or very low, TG-rich lipoprotein triglycerides are not degraded and VLDL remains large in the blood. Thus, the population of cases with no or very low lipoprotein lipase activity has a significantly larger VLDL size than healthy men and is distributed within a predetermined size range. The average elution position of VLDL is defined as the elution position of G5 in the anchor peak (see FIG. 3 (b)).
さらに、血中に存在するコレステロールエステル転送蛋白の働きによって、VLDLからLDLへトリグリセリドが渡され、その代わりにコレステロールエステルがLDLからVLDLに渡される。LDLはトリグリセリドリッチな粒子となり、肝性リパーゼによってLDL内のトリグリセリドが分解され、LDLは小型化する。この小型化されたLDLのサイズはリポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例の集団では、健常男性のLDLサイズより有意に小さく、あるサイズの範囲内に分布している。従って、このLDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG10の溶出位置として定義する（図３(b)参照）。 Furthermore, triglyceride is passed from VLDL to LDL by the action of cholesterol ester transfer protein present in the blood, and cholesterol ester is passed from LDL to VLDL instead. LDL becomes triglyceride-rich particles, and triglycerides in LDL are degraded by hepatic lipase, and LDL becomes smaller. The size of this miniaturized LDL is significantly smaller than the LDL size of healthy men and distributed within a certain size range in a population of cases with no or very low lipoprotein lipase activity. Therefore, the average elution position of LDL is defined as the elution position of G10 among the anchor peaks (see FIG. 3 (b)).
さらにまた、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例では、LDLやVLDLからHDLにトリグリセリドが渡され、その代わりにHDLからコレステロールエステルがLDLやVLDLに渡される。その結果、HDLはトリグリセリドリッチとなり、HDL内のトリグリセリドは肝性リパーゼによって分解されHDLは小型化する。したがって、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例の集団では、HDLのサイズは健常男性のHDLより有意にサイズ小さく、そのサイズもある範囲内に分布している。したがって、このHDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG18の溶出位置として定義する（図３(b)参照）。 Furthermore, in cases where lipoprotein lipase activity is absent or very low, triglycerides are passed from LDL or VLDL to HDL, and cholesterol esters are passed from HDL to LDL or VLDL instead. As a result, HDL becomes rich in triglycerides, triglycerides in HDL are decomposed by hepatic lipase, and HDL is reduced in size. Thus, in a population of cases with no or very low lipoprotein lipase activity, the size of HDL is significantly smaller than that of healthy males, and the size is also distributed within a certain range. Therefore, the average elution position of HDL is defined as the elution position of G18 in the anchor peak (see FIG. 3 (b)).
さらにまた、コレステロールエステル転送蛋白欠損症ではHDLからLDLやVLDLにコレステロールエステルを渡し、その代わりにLDLやVLDLからトリグリセリドを受け取れないため、HDLはコレステロールエステルリッチになってそのサイズは大型化する。特にコレステロールエステル転送蛋白完全欠損症ではHDL中にはトリグリセリドがほとんど存在しない。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症のHDLサイズは、健常男性より有意に大型化し、あるサイズの範囲内に分布している。したがって、このHDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG15の溶出位置として定義する（図３(d)参照）。 Furthermore, in cholesterol ester transfer protein deficiency, cholesterol ester is passed from HDL to LDL or VLDL, and instead of receiving triglycerides from LDL or VLDL, HDL becomes cholesterol ester rich and its size increases. Especially in cholesterol ester transfer protein complete deficiency, there is almost no triglyceride in HDL. The HDL size of cholesterol ester transfer protein deficiency is significantly larger than that of healthy men and distributed within a certain size range. Therefore, the average elution position of HDL is defined as the elution position of G15 in the anchor peak (see FIG. 3 (d)).
さらにまた、アポE2/2のIII型高脂血症例においては、アポEの158番目のArgがCysへ置換する事により、アポEをリガンドとするLDL受容体（アポB/E）、LDL受容体関連蛋白質、VLDL-受容体との結合領域のコンフォーメーション変異して、小VLDL(レムナント)の取り込みが低下し、血中に小VLDLに相当する成分が増加し、特異的なピークが観察される。従って、この症例群におけるVLDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG7の溶出位置として定義する（図３(c)参照）。小VLDLの溶出位置は、超遠心分離によって1.006 g/mlと1.019 g/mlの間に密度を有する画分として、アポE2/2のIII型高脂血症例を含む複数の被験者から分離された中密度（比重）リポタンパク（IDL）に対応している(Shinichi Usui, Yukichi Hara, Seijin Hosaki, and Mitsuyo Okazaki, Journal of Lipid Research, Volume 43, p 805-814, (2002)参照)。さらに、IDL画分のコレステロール量は、本発明における小VLDLにおけるコレステロール量と高度に相関している。したがって、アンカーピークG7によって規定される小VLDLは、アポE2/2のIII型高脂血症例において顕著に増加しており、レムナントリポタンパク質及び/又はIDLに対応している。 Furthermore, in the case of apoE2 / 2 type III hyperlipidemia, substitution of Apo E with 158th Arg to Cys results in LDL receptor (apo B / E) and LDL receptor with apo E as a ligand. Conformational mutation in the binding region of the body-associated protein, VLDL-receptor, decreases the uptake of small VLDL (remnant), increases the component corresponding to small VLDL in the blood, and a specific peak is observed The Therefore, the average elution position of VLDL in this case group is defined as the elution position of G7 among the anchor peaks (see FIG. 3 (c)). The elution position of small VLDL was separated from multiple subjects including apo E2 / 2 type III hyperlipidemia by ultracentrifugation as a fraction having a density between 1.006 g / ml and 1.019 g / ml It corresponds to medium density (specific gravity) lipoprotein (IDL) (see Shinichi Usui, Yukichi Hara, Seijin Hosaki, and Mitsuyo Okazaki, Journal of Lipid Research, Volume 43, p 805-814, (2002)). Furthermore, the amount of cholesterol in the IDL fraction is highly correlated with the amount of cholesterol in the small VLDL of the present invention. Thus, the small VLDL defined by the anchor peak G7 is markedly increased in cases of type III hyperlipidemia of apo E2 / 2, corresponding to remnant lipoproteins and / or IDL.
図３に示したデータは、TSKgel LipopropalXLカラム（東ソー（株）製）を使用して得られたデータであるが、アンカーピークとして定義する際の根拠となるデータとしては、他のカラムを使用して得られるデータを使用しても良い。 The data shown in FIG. 3 is data obtained using a TSKgel Lipopropal XL column (manufactured by Tosoh Corporation), but other columns are used as the data used as the basis for defining the anchor peak. You may use the data obtained.
例えば、図４に示すように、Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムファルマシア社製）を用いて同様にデータを得ることができ、このデータに基づいてアンカーピークを定義することもできる。この場合、健常中年男性（３０〜４０歳代）プロファイルからG9及びG17の溶出位置を定義できる（図４(a)）。リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例のプロファイルからG10及びG18の溶出位置を定義できる（図４(b)）。アポE2/2のIII型高脂血症例のプロファイルからG7の溶出位置を定義できる（図４(c)）。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症のプロファイルからG15の溶出位置を定義できる（図４(d)）。 For example, as shown in FIG. 4, data can be similarly obtained using a Superose 6HR 10/30 column (manufactured by Amersham Pharmacia), and an anchor peak can be defined based on this data. In this case, the elution positions of G9 and G17 can be defined from the profile of healthy middle-aged men (30-40 years old) (FIG. 4 (a)). From the profile of cases with no or very low lipoprotein lipase activity, the elution positions of G10 and G18 can be defined (FIG. 4 (b)). The elution position of G7 can be defined from the profile of apo E2 / 2 type III hyperlipidemia (FIG. 4 (c)). The elution position of G15 can be defined from the complete defect profile of cholesterol ester transfer protein (FIG. 4 (d)).
更に、図５に示すように、SkylightPak-LDLカラム(スカイライトバイオテック社製)を用いて同様にデータを得ることができ、このデータに基づいてアンカーピークを定義することもできる。この場合、健常中年男性（３０〜４０歳代）プロファイルからG6、G9及びG17の溶出位置を定義することができる（図5(a)）。リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例のプロファイルからG10及びG18の溶出位置を定義することができる（図5(b)）。アポE2/2のIII型高脂血症例のプロファイルからG7の溶出位置を定義できる（図5(c)）。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症のプロファイルからG15の溶出位置を定義できる（図5(d)）。 Furthermore, as shown in FIG. 5, data can be similarly obtained using a SkylightPak-LDL column (manufactured by Skylight Biotech), and anchor peaks can be defined based on this data. In this case, the elution positions of G6, G9 and G17 can be defined from the profile of healthy middle-aged men (30 to 40 years old) (FIG. 5 (a)). The elution positions of G10 and G18 can be defined from the profile of cases with no or very low lipoprotein lipase activity (FIG. 5 (b)). The elution position of G7 can be defined from the profile of apo E2 / 2 type III hyperlipidemia (Fig. 5 (c)). The elution position of G15 can be defined from the complete defect profile of cholesterol ester transfer protein (FIG. 5 (d)).
以上のようにして、G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17及びG18をアンカーピークとして、それぞれの溶出位置を定義する。 As described above, the elution positions are defined with G5, G6, G7, G9, G10, G15, G17 and G18 as anchor peaks.
次に、他の必須ピークについては、数学的にピークの位置と幅が決まるものである。他の必須ピークは、コンポーネントピークのサイズとその分布を固定した（時間と幅固定）ガウス近似によるコンポーネントピークの解析をするために必要なピークである。他の必須ピークに相当するリポタンパク質のサブクラスの分布幅は、LDLとHDLではほぼ同じと仮定し、アンカーピークの間をほぼ等間隔に埋めるもとする。G10とG15の間には4個の他の必須ピーク (peak11-14)を設定し、G7とG９の間には1個の他の必須ピーク (peak8)を設定し、G15とG17の間には1個の他の必須ピーク (peak16)を設定し、G18の後に2個の他の必須ピーク(peak19-20)を設定する。なお、HDLに属する他の必須ピーク (peak 16-20)の位置は、別のHDL専用カラムによる分析で、健常者集団のピーク観測頻度と再クロマトによる実験値との対応を参考に定義することができる。 Next, for other essential peaks, the position and width of the peak are mathematically determined. Another essential peak is a peak necessary for analyzing a component peak by Gaussian approximation in which the size and distribution of the component peak are fixed (time and width are fixed). The distribution widths of the lipoprotein subclasses corresponding to other essential peaks are assumed to be approximately the same in LDL and HDL, and the anchor peaks are filled at approximately equal intervals. Four other mandatory peaks (peak11-14) are set between G10 and G15, one other mandatory peak (peak8) is set between G7 and G9, and between G15 and G17. Sets one other mandatory peak (peak16), and two other mandatory peaks (peak19-20) after G18. In addition, the position of other essential peaks (peak 16-20) belonging to HDL should be defined with reference to the correspondence between the peak observation frequency of the healthy population and the experimental values obtained by rechromatography in the analysis using a separate column for HDL. Can do.
またコンポーネントピークのG8〜G20については、ほぼその位置は等間隔で幅も同等となるように決めた。さらにコンポーネントピークの2,3,4はVoidのpeak1とアンカーピークのG5の間におけるガウス近似をするために必要なピークで、ピーク間隔と幅の規則から決めた。 In addition, the component peaks G8 to G20 were determined so that their positions were almost equally spaced and equal in width. In addition, component peaks 2, 3, and 4 are peaks necessary for Gaussian approximation between Void peak 1 and anchor peak G5, and were determined from the rules of peak interval and width.
さらに、コンポーネントピークの幅の最小値は、その分析系で得られる遊離グリセロール（分子量92のサイズが単一の粒子であり、図２中FGと表記）幅、最大値は隣り合うピーク間隔の2倍と定義することができる。 Furthermore, the minimum value of the component peak width is the width of free glycerol (molecular weight 92 is a single particle, expressed as FG in FIG. 2) obtained by the analytical system, and the maximum value is 2 between the adjacent peak intervals. Can be defined as double.
20個のコンポーネントピークに対して、ピーク幅は、SD(分)＝ピークの半値幅（秒）÷143で表される数値で設定することができる。具体的に20個のコンポーネントピークのピーク幅としては、G01について0.33 min、G02について0.40 min、G03について0.55 min、G04について0.55 min、G05について0.55 min、G06について0.50 min、G07について0.40 min、G08について0.38 min、G09について0.38 min、G10について0.38 min、G11について0.38 min、G12について0.38 min、G13について0.38 min、G14について0.38 min、G15について0.38 min、G16について0.38 min、G17について0.38 min、G18について0.38 min、G19について0.38 min、G20について0.48minを入力或いは予め設定する。 For 20 component peaks, the peak width can be set as a numerical value represented by SD (min) = half width of peak (seconds) ÷ 143. Specifically, the peak width of 20 component peaks is 0.33 min for G01, 0.40 min for G02, 0.55 min for G03, 0.55 min for G04, 0.55 min for G05, 0.50 min for G06, 0.40 min for G07, G08 0.38 min for G09, 0.38 min for G10, 0.38 min for G11, 0.38 min for G12, 0.38 min for G13, 0.38 min for G14, 0.38 min for G15, 0.38 min for G16, 0.38 min for G17, G18 0.38 min for G19, 0.38 min for G19, and 0.48 min for G20 are input or preset.
ステップ２における波形処理手段は、例えば、ガウス波形処理計算アルゴリズムを適用して実行することができる。ガウス波形処理計算アルゴリズムによれば、以下のようにして２０個のコンポーネントピークに分離することができる。 The waveform processing means in step 2 can be executed by applying a Gaussian waveform processing calculation algorithm, for example. According to the Gaussian waveform processing calculation algorithm, it can be separated into 20 component peaks as follows.
すなわち、先ず、クロマトグラム上の単一ピークの形を対称ガウス分布であると仮定すると、時刻tにおけるピークの高さh(t)は、
h(t)=H×exp(-(t-T)2/2σ2)
と書ける。ここで、Tはピーク位置でありσは幅（標準偏差）であり、（Hはピークの高さの最大値）。なお、ピーク形は他に、(1)Peason VII, (2)Lorentzian, (3)exponentially modified Gaussian, (4)Weibull, (5)bi-Gaussian, (6)poisson, (7)Gram-Charlier, (8)combination of Gauss and Cauchy functions, (9)combination of statistical moments, (10)cam-driven analog peakなどが知られており、これら(1)〜(8)のいずれかの形であると仮定することも可能である。
That is, first, assuming that the shape of a single peak on the chromatogram is a symmetric Gaussian distribution, the peak height h (t) at time t is
h (t) = H × exp (- (tT) 2 / 2σ 2)
Can be written. Here, T is the peak position, σ is the width (standard deviation), and H is the maximum value of the peak height. Other peak shapes are (1) Peason VII, (2) Lorentzian, (3) exponentially modified Gaussian, (4) Weibull, (5) bi-Gaussian, (6) poisson, (7) Gram-Charlier, (8) combination of Gauss and Cauchy functions, (9) combination of statistical moments, (10) cam-driven analog peak, etc. are known and assumed to be in any form of (1)-(8) It is also possible to do.
そして、n番目のピークの高さhn(t)は、n番目のピークの位置Tn、幅（標準偏差）σnをもちいて
hn(t)= Hn×exp(-(t-Tn)2/2σn2) …I
と書ける（Hnはｎ番目のピーク最大値（高さ））。
The height hn (t) of the nth peak is determined by using the position Tn of the nth peak and the width (standard deviation) σn.
hn (t) = Hn × exp (-(t-Tn) 2 / 2σn 2 )… I
(Hn is the n-th peak maximum value (height)).
ここで、exp(-(t-Tn)2/2σn2)=Gn(t)とおくと式Iは
hn(t)= Hn×Gn(t) …II
と書ける。
Where exp (-(t-Tn) 2 / 2σn 2 ) = Gn (t)
hn (t) = Hn × Gn (t)… II
Can be written.
N個のピークはそれぞれ独立であると仮定すると、時刻tにおける合成波形A(t)は、
A(t)＝h1(t)+ h2(t)+・・・・+ hn-1(t)+ hn(t)
= H1×G1(t)+ H2×G2(t) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(t) + Hn×Gn(t) …III
となる。
Assuming the N peaks are each independently synthesized waveform A at time t (t) is
A (t) = h1 (t) + h2 (t) + ... + hn-1 (t) + hn (t)
= H1 × G1 (t) + H2 × G2 (t) + ・ ・ ・ ・ + Hn-1 × Gn-1 (t) + Hn × Gn (t)… III
It becomes.
データポイント数をmとすると、III式は下のようにｍ個かける。
A(t1)= H1×G1(t1)+ H2×G2(t1) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(t1) + Hn×Gn(t1)
A(t2)= H1×G1(t2)+ H2×G2(t2) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(t2) + Hn×Gn(t2)
・・・・・
A(tm)= H1×G1(tm)+ H2×G2(tm) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(tm) + Hn×Gn(tm)
時刻tにおける実際のクロマトグラム波形をR(t)とすると、R(t)＝A(t)となるようなピーク数n、ピークの位置T、幅（標準偏差）σを求めるのが、curve fitting methodである。実際には、非線形最小二乗法により、すべての時刻でR(t)＝A(t)とはならないから、(R(t)-A(t))2の和が最小となるパラメータを求める。
If the number of data points is m, the formula III is multiplied by m as shown below.
A (t1) = H1 × G1 (t1) + H2 × G2 (t1) + ・ ・ ・ ・ + Hn-1 × Gn-1 (t1) + Hn × Gn (t1)
A (t2) = H1 × G1 (t2) + H2 × G2 (t2) + ・ ・ ・ ・ + Hn-1 × Gn-1 (t2) + Hn × Gn (t2)
...
A (tm) = H1 × G1 (tm) + H2 × G2 (tm) + ・ ・ ・ ・ + Hn-1 × Gn-1 (tm) + Hn × Gn (tm)
If the actual chromatogram waveform at time t is R (t), the number of peaks n, the peak position T, and the width (standard deviation) σ such that R (t) = A (t) is obtained. fitting method. Actually, R (t) = A (t) does not become true at all times by the non-linear least squares method, so a parameter that minimizes the sum of (R (t) −A (t)) 2 is obtained.
なお、curve fitting method以外でも、例えば、iterative method (Fletcher Powell, Marquardt, Newton-Raphson, Simplex minimization, Box-Complex methodなど)を適用することもできる。但し、curve fitting method以外の手法においては、initial valueが計算結果に影響を及ぼすこと、波形（GaussianなのかLorentzianなのか）をあらかじめ仮定しなければならないこと、ピーク数が大きいと（４個以上）収束が難しいこと、などが欠点とされている。したがって、いかに真の値に近い初期値を求めるかがポイントとなり、これらの欠点をクリアするためのピーク分離法として、(1)factor analysis、(2)moments analysis、(3)orthogonal polynominal analysis及び(4)inverse diffusion modelなどが最近報告され、これらを本アルゴリズムに適用することもできる。 In addition to the curve fitting method, for example, an iterative method (Fletcher Powell, Marquardt, Newton-Raphson, Simplex minimization, Box-Complex method, etc.) can also be applied. However, in methods other than the curve fitting method, the initial value affects the calculation result, the waveform (Gaussian or Lorentzian) must be assumed in advance, and the number of peaks is large (4 or more) The difficulty is that it is difficult to converge. Therefore, how to find an initial value close to the true value is the point, and as peak separation methods to clear these drawbacks, (1) factor analysis, (2) moments analysis, (3) orthogonal polynominal analysis and ( 4) Inverse diffusion models have recently been reported and can be applied to this algorithm.
ここで ti (i=1,2,・・・,m)は定数であるため、任意のGn(ti)も定数となる。すると上記III式は、
A(t1)= H1×G1(t1)+ H2×G2(t1) + ・・・・+ H19×Gn-1(t1) + H20×G20(t1)
A(t2)= H1×G1(t2)+ H2×G2(t2) + ・・・・+ H19×Gn-1(t2) + H20×G20(t2)
・・・・・
A(tm)= H1×G1(tm)+ H2×G2(tm) + ・・・・+ H19×G19(tm) + H20×G20(tm)
のようにｍ個できる。R(t)＝A(t)とすると、未知数がH1、H2、・・・・、H19、H20の20個で構成される一次式がｍ個できることとなる。仮に、m=20なら解は一次連立方程式を解くことにより、解は求まる。
Here, since ti (i = 1, 2,..., M) is a constant, any Gn (ti) is also a constant. Then, the above formula III is
A (t1) = H1 × G1 (t1) + H2 × G2 (t1) + ・ ・ ・ ・ + H19 × Gn-1 (t1) + H20 × G20 (t1)
A (t2) = H1 × G1 (t2) + H2 × G2 (t2) + ・ ・ ・ ・ + H19 × Gn-1 (t2) + H20 × G20 (t2)
...
A (tm) = H1 × G1 (tm) + H2 × G2 (tm) + ・ ・ ・ ・ + H19 × G19 (tm) + H20 × G20 (tm)
You can make m. If R (t) = A (t), m primary expressions composed of 20 unknowns H1, H2,..., H19, H20 can be formed. If m = 20, the solution can be found by solving the linear simultaneous equations.
実際のデータにおいてはデータポイント数が20ではないが、本アルゴリズムにおいては、高速処理するために計算しやすい20ポイント（例えば、２０個のサブクラムにおけるピークの位置20ヵ所）を便宜的に選んで計算する。なお、本アルゴリズムにおいては、データポイント数を20ヶ所に選択せずに、最小二乗法で求めることも可能である。 In actual data, the number of data points is not 20, but in this algorithm, 20 points that are easy to calculate for high-speed processing (for example, 20 peak positions in 20 subcrumbs) are selected for convenience. To do. In this algorithm, the number of data points can be determined by the least square method without selecting 20 points.
以上で説明したステップ１及びステップ２からなるフローチャートによれば、システムコントローラー９から出力されたクロマトグラム（例えば図２に示すクロマトグラム）を２０個のサブクラスに分離することができる。２０個のサブクラスに分離することによって得られるプロファイルは、内臓脂肪面積 (VFA)との相関関係が顕著に見られることから、VFAの蓄積に起因する疾患のリスクを検査する際に有効に利用される。 According to the flowchart consisting of Step 1 and Step 2 described above, the chromatogram (for example, the chromatogram shown in FIG. 2) output from the system controller 9 can be separated into 20 subclasses. The profile obtained by segregating into 20 subclasses can be used effectively in examining the risk of diseases caused by VFA accumulation because of the significant correlation with visceral fat area (VFA). The
内臓脂肪の蓄積に起因する疾患としては、例えば、虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患を挙げることができる。すなわち、近年、生活習慣の変遷に伴って栄養過多や運動不足に陥り、脂肪蓄積、肥満を来たし、その結果、多数のリスクファクターの集積を伴って虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患の増加を招いている。これはインスリン抵抗性を起こす遺伝的素因に肥満などの後天的因子が加わり、インスリン抵抗性が生じて発症するものである。上流に位置する成因基盤としては、腹腔内内臓脂肪蓄積が重要である。肥満者はもちろん非肥満者においても腹腔内内臓脂肪の蓄積は糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患（coronary artery disease (CAD)）の発症に密接に関与している。したがって、内臓脂肪の蓄積に起因する疾患としては、糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患を挙げることができる。 Examples of the diseases caused by visceral fat accumulation include arteriosclerotic diseases centered on ischemic heart diseases. That is, in recent years, due to changes in lifestyle habits, overnutrition and lack of exercise have resulted in fat accumulation and obesity, resulting in the accumulation of a number of risk factors and atherosclerotic diseases centered on ischemic heart disease. Has led to an increase. This occurs when an acquired factor such as obesity is added to the genetic predisposition causing insulin resistance, resulting in insulin resistance. As an etiological base located upstream, abdominal visceral fat accumulation is important. In obese as well as non-obese individuals, the accumulation of intra-abdominal visceral fat is closely related to the onset of diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and coronary artery disease (CAD). Accordingly, examples of diseases caused by visceral fat accumulation include diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and coronary artery disease.
本発明を適用した内臓脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法によれば、例えば、内臓脂肪面積と大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量とが正の相関を、また内臓脂肪面積と大中HDLサブクラスのコレステロール量とが負の相関を示した。言い換えれば、内臓脂肪の蓄積に起因する疾患は、大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量の増加、大中HDLサブクラスのコレステロール量の減少によって診断される。 According to the method for diagnosing a disease caused by visceral fat accumulation to which the present invention is applied, for example, the visceral fat area is positively correlated with the amount of cholesterol in the large / medium / small VLDL subclass and the small / medium minimal LDL subclass, And the amount of cholesterol in the Onaka HDL subclass showed a negative correlation. In other words, diseases caused by the accumulation of visceral fat are diagnosed by an increase in the amount of cholesterol in the large, medium and small VLDL subclasses, a small and medium very small LDL subclass, and a decrease in the amount of cholesterol in the large and medium HDL subclass.
また、LDLのコレステロールの高値は、重要なリスク因子の１つである。LDLのコレステロール濃度が正常な群（LDL-C＜130mg/dL）では、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と負の相関を示したのに対して、大LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と正の相関を示した。これは、LDLの中に善玉LDLサブクラスが存在することを意味するもので、大LDLサブクラスが内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症を抑制する作用をもつことを意味している。大LDLサブクラスのコンポーネントピークは、他の必須ピークであり、VLDLとLDLの間の遷移成分として決められたものであるが、本発明により、臨床的意義をもつ新しいサブクラスとして新たに評価することができる。言い換えると、内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症は、大LDLサブクラスのコンポーネントピークのコレステロール量によって診断することができる。 In addition, high LDL cholesterol is one of the important risk factors. In the group with normal LDL cholesterol concentration (LDL-C <130 mg / dL), the cholesterol concentration of the small and extremely small LDL subclass was negatively correlated with the internal fat area, whereas the cholesterol concentration of the large LDL subclass was It showed a positive correlation with the internal fat area. This means that there is a good LDL subclass in LDL, and that the large LDL subclass has the action of suppressing the onset of arteriosclerosis due to the accumulation of internal fat. The component peak of the large LDL subclass is another essential peak and has been determined as a transition component between VLDL and LDL, but it can be newly evaluated as a new subclass with clinical significance according to the present invention. it can. In other words, the onset of arteriosclerosis due to visceral fat accumulation can be diagnosed by the amount of cholesterol in the component peak of the large LDL subclass.
また、冠動脈疾患では小VLDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の減少が見られることから、小VLDL、小及び極小LDL、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の測定によって、冠動脈疾患を診断することができる。 In coronary artery disease, small VLDL subclasses have increased cholesterol levels, small and very small LDL subclasses have increased cholesterol levels, and large HDL subclasses have decreased cholesterol levels. Coronary artery disease can be diagnosed by measuring the cholesterol concentration.
したがって、本発明によれば、冠動脈疾患の診断方法を提供することができる。冠動脈疾患の診断方法は、上述したステップ１及びステップ２から構成されるフローチャートに従って分離された２０個のコンポーネントピークを利用する。具体的に、冠動脈疾患の診断方法は、診断対象の被験者から採取した被験試料に含まれるリポタンパク質を上述したステップ１及びステップ２から構成されるフローチャートに従って分析して、当該被験者由来の２０個のコンポーネントピークを取得する工程と、以下の（I）〜（V）から選ばれる少なくとも１つの式に基づいて値を算出する工程とを含んでいる。
(I) Vs + Ls - Hs;
(II) Vs + Ls;
(III) Ls;
(IV) (Vs + Ls)/Hs; and
(V) Ls/Hs,
Therefore, according to the present invention can provide a diagnostic method for coronary artery disease. The method for diagnosing coronary artery disease uses 20 component peaks separated according to the flowchart composed of Step 1 and Step 2 described above. Specifically, in the method for diagnosing coronary artery disease, a lipoprotein contained in a test sample collected from a subject to be diagnosed is analyzed according to the flowchart composed of steps 1 and 2 described above, and 20 samples derived from the subject are analyzed. A step of acquiring a component peak, and a step of calculating a value based on at least one formula selected from the following (I) to (V).
(I) Vs + Ls-Hs;
(II) Vs + Ls;
(III) Ls;
(IV) (Vs + Ls) / Hs; and
(V) Ls / Hs,
ここで、“Vs”は小VLDLに含まれるコレステロール量を示し、“Ls”は小LDL及び極小LDLに含まれるコレステロール量の合計を示し、“Hs”は大HDLに含まれるコレステロール量を示している。 Here, “Vs” indicates the amount of cholesterol contained in the small VLDL, “Ls” indicates the total amount of cholesterol contained in the small LDL and the minimal LDL, and “Hs” indicates the amount of cholesterol contained in the large HDL. Yes.
冠動脈疾患の診断方法によって取得された上記値は、冠動脈疾患の臨床検査に有用である。冠動脈疾患の診断方法において、上記分析する工程は、算出された上記値を基準値と比較する工程を更に含んでいても良い。この基準値は、標準の被験者群及び冠動脈疾患の被験者群を解析した結果に基づいて算出された、所定の数値として設定することができる。基準値は、年代別、人種別及び性別についてそれぞれ設定してもよい。 The above values obtained by the diagnostic method for coronary artery disease are useful for clinical examination of coronary artery disease. In the diagnostic method for coronary artery disease, the analyzing step may further include a step of comparing the calculated value with a reference value. This reference value can be set as a predetermined numerical value calculated based on the result of analyzing the standard subject group and the coronary artery disease subject group. The reference value may be set for each age, person type, and gender.
なお、冠動脈疾患で有意に増加する小VLDLサブクラスのコンポーネントピークは、アポE2/2のIII型高脂血症のVLDLサイズから求めたアンカーピークであり、アポE2/2のIII型高脂血症で増加しているレムナントに相当するもので、冠動脈の重要なリスク因子であるレムナントを本プログラムにおける小VLDLサブクラスに対応するコンポーネントピークから見積もることができると評価できる。 The component peak of the small VLDL subclass that significantly increases in coronary artery disease is an anchor peak obtained from the VLDL size of apo E2 / 2 type III hyperlipidemia, and apo E2 / 2 type III hyperlipidemia It can be evaluated that the remnant, which is an important coronary risk factor, can be estimated from the component peak corresponding to the small VLDL subclass in this program.
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例１]
<方法>
被験者
本実験では、１５人の健常者ボランティアと４７人の大阪大学病院に入院している４７人の患者を含む６２人の男性（２２〜６７歳）が登録された。全ての被験者は、大阪大学病院倫理委員会に従って、本実験を行う前にインフォームドコンセントを行った。全ての患者は、重度の肝疾患又は腎疾患を患っておらず、且つ、インスリン作用又は血清リポタンパク質レベルに影響することが知られている如何なる薬剤も投与されていない。静脈血は、夜間絶食の後に採取された。血清サンプルは、冷蔵庫に保管され、血液採取から７日以内に分析に供された
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
[Example 1]
<Method>
Subjects In this experiment, 62 men (22 to 67 years old) were registered, including 15 healthy volunteers and 47 patients admitted to Osaka University Hospital. All subjects performed informed consent prior to conducting this experiment according to the Osaka University Hospital Ethics Committee. All patients do not have severe liver or kidney disease and have not been administered any drug known to affect insulin action or serum lipoprotein levels. Venous blood was collected after an overnight fast. Serum samples were stored in the refrigerator and subjected to analysis within 7 days of blood collection.
HPLC Method
簡単に述べると、5mlの全血清サンプルを２連のTSKgel LipopropakXL (東ソー社製)カラムに注入し、TSKeluent Lp-1 (東ソー社製)によって溶出された。カラムからの溶出液を、市販のキット、デタミナーL TC (協和メデックス社製)を用いたオンライン酵素反応の後、550nmで連続的にモニターした。主要リポタンパク質及びそのサブクラスに含まれるコレステロール濃度は、数学的処理によって重複するピークを解く修正されたガウス分布曲線近似法によって、複合的なクロマトグラムを処理するように設計された独自のコンピュータープログラムによって算出した。
HPLC Method
Briefly, 5 ml of whole serum sample was injected into duplicate TSKgel LipopropakXL (Tosoh) columns and eluted with TSKeluent Lp-1 (Tosoh). The eluate from the column was continuously monitored at 550 nm after an online enzyme reaction using a commercially available kit, Determiner LTC (manufactured by Kyowa Medex). Cholesterol concentrations in major lipoproteins and their subclasses are determined by a proprietary computer program designed to process complex chromatograms using a modified Gaussian curve fitting method that resolves overlapping peaks by mathematical processing. Calculated.
我々は、サブクラス解析のため各ガウス・コンポーネントピークを決定し、動物及びヒト由来の様々なサンプルの十分な曲線適合分析を、各ガウス波形におけるピーク幅及びピーク位置を変更することなく一定の条件下で実行した。この目的のため、先ず、健常な正常血中脂質男性（n=28）におけるVLDL及びLDL粒子サイズの平均値を優先的に参照した。したがって、コンポーネントピーク6及び9の位置は、健常な被験者における、それぞれVLDLの位置 (36.8±2.5 nm)及びLDLの位置(25.5±0.4 nm)とした。同様に、ピーク5及び10の位置は、リポタンパクリパーゼ(LPL)を有する又は有しない極度の高トリグリセリド血症の被験者（>1000 mg/dL、n=9）における、それぞれVLDLの位置(44.5±2.1 nm)及びLDLの位置(23.0±0.5 nm)とした。ピーク7はアポE2/2のIII型高脂血症例(n=5)におけるLDL (又はVLDL; 31.3±1.0 nm)に対応していた。ピーク15はコレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症(n=6)におけるHDL(13.5±0.4 nm)に対応していた。HDLサブクラスにおける他のコンポーネントピーク(ピーク16 〜20)は、HDLの範囲のみ分離するゲル浸透カラム(G3000SW)を用いたHPLCによって決定された５つのサブクラスに基づくもとした。上述した実験的裏付けによって決定された１１個のコンポーネントピークに加えて、９つの追加ピーク(ピーク1〜4、8及び11〜14)を導入し、各ガウス曲線の高さのみを変更することによって最良の曲線近似解析を可能とした。ピーク８の位置(28.6 nm)を、ピーク７とピーク９の中間位置として決定した。このピーク８は、TGリッチなレムナントリポタンパク質からLDLへのtransition componentを示している。４つのピーク(ピーク11〜14)は、ピーク８からピーク２０までの間隔と類似するようにピーク１０〜１５の間に一定の間隔で挿入された。さらに、最良の曲線近似を実行するため、３つのピーク（ピーク2〜4）を、少なくともボイド（ピーク1）とピーク5の間に導入した。追加のピークを異なるように設定しても、オリジナルのクロマトグラムに関する曲線近似分析の精度を低下させる結果となった。溶出時間の粒子径への変換は、標準サンプルにおける粒子径の対数を溶出時間に対してプロットしたカラム較正曲線を用いて行った。標準サンプルとしては、25nm径並びに37nm径のラテックスビーズ（マグスフィア社製）及びチログロブリン(17 nm)、フェリチン(12.2 nm)、カタラーゼ(9.2 nm)、アルブミン(7.1 nm)並びにオボアルブミン(6.1 nm)を含む高分子量キャリブレーター（ファルマシア社製）を用いた。 We determined each Gaussian component peak for subclass analysis and performed a sufficient curve fitting analysis of various samples from animals and humans under certain conditions without changing the peak width and peak position in each Gaussian waveform. Executed with. For this purpose, first, preferential reference was made to the average values of VLDL and LDL particle sizes in healthy normal blood lipid men (n = 28). Therefore, the positions of component peaks 6 and 9 were the VLDL position (36.8 ± 2.5 nm) and the LDL position (25.5 ± 0.4 nm), respectively, in healthy subjects. Similarly, the positions of peaks 5 and 10 are the positions of VLDL (44.5 ± 4) in extremely hypertriglyceridemic subjects (> 1000 mg / dL, n = 9) with or without lipoprotein lipase (LPL), respectively. 2.1 nm) and the position of LDL (23.0 ± 0.5 nm). Peak 7 corresponded to LDL (or VLDL; 31.3 ± 1.0 nm) in apoE2 / 2 type III hyperlipidemic cases (n = 5). Peak 15 corresponded to HDL (13.5 ± 0.4 nm) in cholesterol ester transfer protein deficiency (n = 6). The other component peaks in the HDL subclass (peaks 16-20) were based on five subclasses determined by HPLC using a gel permeation column (G3000SW) that only separated the HDL range. In addition to the eleven component peaks determined by the experimental support described above, nine additional peaks (peaks 1-4, 8 and 11-14) are introduced and only the height of each Gaussian curve is changed. The best curve approximation analysis was made possible. The position of peak 8 (28.6 nm) was determined as an intermediate position between peak 7 and peak 9. This peak 8 shows the transition component from TG-rich remnant lipoprotein to LDL. Four peaks (peaks 11-14) were inserted at regular intervals between peaks 10-15, similar to the interval from peak 8 to peak 20. In addition, three peaks (peaks 2-4) were introduced at least between void (peak 1) and peak 5 to perform the best curve approximation. Setting additional peaks differently resulted in reduced accuracy of the curve approximation analysis for the original chromatogram. The conversion of the elution time to the particle size was performed using a column calibration curve in which the logarithm of the particle size in the standard sample was plotted against the elution time. As standard samples, latex beads (manufactured by Magsphere) and thyroglobulin (17 nm), ferritin (12.2 nm), catalase (9.2 nm), albumin (7.1 nm) and ovalbumin (6.1 nm) ) -Containing high molecular weight calibrator (Pharmacia) was used.
他の臨床及び脂質パラメーター分析
血清TC及びTGは、市販のキット（協和メディックス社製）を用いて酵素的に決定した。HDL-Cはヘパリン- Ca2+沈殿法によって定量した。LDL-Cは、Friedewaldらの式から算出した。尿酸（UA）絶食時免疫反応性インスリン（IRI）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（PAI）-1は、それぞれ酵素法及び二抗体ラジオイムノアッセイによって測定した。
Other clinical and lipid parameter analysis Serum TC and TG were determined enzymatically using a commercially available kit (manufactured by Kyowa Medix). HDL-C heparin - was determined by Ca 2+ precipitation method. LDL-C was calculated from the Friedewald formula al. Uric acid (UA) fasting immunoreactive insulin (IRI) and plasminogen activator inhibitor (PAI) -1 were measured by enzymatic method and two-antibody radioimmunoassay, respectively.
体脂肪分布は、以前に報告した背臥位におけるコンピュータ断層撮影（CT）スキャン(ゼネラル・エレクトリック社製：General Electric CT/T scanner)によって決定した。ハウンズフィールド単位-40から-140までの注目領域とし、皮膚及び筋肉の間における腹膜腔外領域への脂肪層を、皮下脂肪面積（SFA）として定義した。SFAと同じ密度である腹腔内の領域をVFAとして定義した。SFA及びVFAは臍孔のレベルで測定した。 Body fat distribution was determined by a previously reported computed tomography (CT) scan in the supine position (General Electric CT / T scanner). The area of interest from Hounsfield units -40 to -140 was defined as the fat layer to the extraperitoneal space between skin and muscle as the subcutaneous fat area (SFA). The area within the abdominal cavity that was the same density as SFA was defined as VFA. SFA and VFA were measured at the level of the umbilicus.
統計分析
データは、別段明記した場合を除き、平均±SDで表示した。様々な変数間の相関は、統計的に相違すると考えられるP-value <0.05であるピアソン相関係数（r-value）として示した。
Statistical analysis data, except where otherwise stated, were displayed at an average ± SD. Correlations between various variables are shown as Pearson correlation coefficients (r-values) with P-value <0.05, which is considered statistically different.
<結果>
被験者における臨床的特徴及び脂質レベル
本実験における６２人の男性に関する被験者における臨床的特徴及び脂質レベルを表１に示す。
<Result>
Clinical characteristics and lipid levels in subjects Clinical characteristics and lipid levels in subjects for 62 men in this experiment are shown in Table 1.
広い範囲の体脂肪値（肥満度指数(BMI)が21〜43 kg/cm2であり、 VFAが24〜255 cm2であり、 SFAが55〜512 cm2である）をカバーするように被験者を募集したため、大幅に広い範囲の身体測定値を得ることができた。代謝パラメータは、基準値と比較して変動を示した。例えば、UAは3.8から12.5 mg/dLであり、IRIは2〜43 μU/mLであり、PAI-1は5.0から75.7 ng/mLであった。 Subjects to cover a wide range of body fat values (body mass index (BMI) 21-43 kg / cm 2 , VFA 24-255 cm 2 , SFA 55-512 cm 2 ) for they were recruited, it was possible to obtain the body measurements of significantly wide range. Metabolic parameters showed variation compared to the baseline value. For example, UA was 3.8 to 12.5 mg / dL, IRI was 2 to 43 μU / mL, and PAI-1 was 5.0 to 75.7 ng / mL.
主要リポタンパク質及びそのサブクラスにおける血清コレステロールレベルの決定に対するHPLC分析性能
表２に示すように、3つのVLDLサブクラス(大、中及び小)、4つのLDLサブクラス(大、中、小、及び極小)及び5つのHDLサブクラス(極大、大、中、小及び極小)をリポタンパク質の粒子サイズに基づいて定義した（カイロミクロン(>80 nm、ピーク1〜2)、VLDL(30〜nm、ピーク3〜7)、LDL(16〜30 nm、ピーク8〜13)及びHDL(8〜16 nm、ピーク14〜20)）。
HPLC analysis performance for determination of serum cholesterol levels in major lipoproteins and their subclasses As shown in Table 2, three VLDL subclasses (large, medium and small), four LDL subclasses (large, medium, small and minimal) and Five HDL subclasses (maximum, large, medium, small and minimal) were defined based on lipoprotein particle size (chylomicron (> 80 nm, peak 1-2), VLDL (30-nm, peak 3-7) ), LDL (16-30 nm, peak 8-13) and HDL (8-16 nm, peak 14-20)).
正常血中脂質被験者(TC=131mg/dL、TG=39mg/dL)及び高脂血症被験者 (LPL欠損症、TC=219mg/dL、TG=1420mg/dL)について、曲線近似解析した代表的なクロマトグラムを図６に示した。 Representative subjects of normal blood lipid analysis (TC = 131mg / dL, TG = 39mg / dL) and hyperlipidemia subjects (LPL deficiency, TC = 219mg / dL, TG = 1420mg / dL) The chromatogram is shown in FIG.
図６において、（a）は健康な女性の代表的なHPLCパターンを示し、（b）はLPL欠損症患者の代表的なHPLCパターンを示している。5μLの血清サンプルを２連のゲル透過カラム(TSKgel LipopropakXL)に注入し、TSKeluent LP-1 を用いて 流速0.7mL/minで溶出した。実線はTC試薬によるオンライン酵素反応によって検出された実際のHPLCパターンである。破線は、ガウス総和法を用いた曲線近似によって決定した、個々のサブクラス及びそれらのガウス曲線の合計である。血清TCレベル及び血清TGレベルは、それぞれ（a）において131mg/dL及び39mg/dLであり、（b）において219mg/dL及び1420mg/dLであった。観察されたピーク時間から決定される粒子径(nm)も示した。 In FIG. 6, (a) shows a typical HPLC pattern of healthy women, and (b) shows a typical HPLC pattern of patients with LPL deficiency. 5 μL of the serum sample was injected into a duplicate gel permeation column (TSKgel LipopropakXL) and eluted with TSKeluent LP-1 at a flow rate of 0.7 mL / min. The solid line is the actual HPLC pattern detected by online enzyme reaction with TC reagent. The dashed line is the sum of individual subclasses and their Gaussian curves, determined by curve approximation using the Gaussian summation method. Serum TC and serum TG levels were 131 mg / dL and 39 mg / dL in (a) and 219 mg / dL and 1420 mg / dL in (b), respectively. The particle size (nm) determined from the observed peak time is also shown.
２０個のサブクラス及び主要クラスにおけるコレステロール決定の同時再現性は、２つの異なる集団サンプルを用いて決定した。表２に示すように、集団１はTC=177mg/dL及びTG=56 mg/dLであり、集団２はTC=163mg/dL及びTG=428mg/dLであった。 The simultaneous reproducibility of the cholesterol determination in the 20 subclasses and the main class was determined using two different population samples. As shown in Table 2, population 1 had TC = 177 mg / dL and TG = 56 mg / dL, and population 2 had TC = 163 mg / dL and TG = 428 mg / dL.
LDL粒子サイズ及びHDL粒子サイズについての同時再現性は、集団１においてそれぞれ25.20±0.07 nm (変動係数[CV]は0.27%) 及び11.25±0.04 nm (CVは0.36%)であり、集団２においてそれぞれ25.63±0.14 nm (CVは0.56%)及び11.03±0.05 nm (CVは0.45%)であった。 The simultaneous reproducibility for LDL particle size and HDL particle size is 25.20 ± 0.07 nm (Coefficient of variation [CV] is 0.27%) and 11.25 ± 0.04 nm (CV is 0.36%) in Group 1, respectively. They were 25.63 ± 0.14 nm (CV was 0.56%) and 11.03 ± 0.05 nm (CV was 0.45%).
２０個のガウス曲線の合計面積は、元々のクロマトグラムにおける面積に対して100.2±0.4%（なお、99.1〜101.7%であった（n=62））であった。HDLに対応するピーク（ピーク１４〜２０）の合計面積は、元々のクロマトグラムにおけるHDｌピーク面積に対して99.7±1.1%（なお98.3〜103.9%であった（n=62））であった。 The total area of the 20 Gaussian curves was 100.2 ± 0.4% (99.1 to 101.7% (n = 62)) with respect to the area in the original chromatogram. The total area of peaks corresponding to HDL (peaks 14 to 20) was 99.7 ± 1.1% (still 98.3 to 103.9% (n = 62)) with respect to the HDl peak area in the original chromatogram.
沈殿法によって決定したHDL-C（x軸とする）と、HPLCによって決定した全てのHDLサブクラスを含む全HDL（y軸とする）との間にははっきりとした相関が得られた（なおy=0.975x+5.29 (r=0.973, n=62, P<0.0001)）。また、Friedewald方程式により算出されたLDL-C（x軸とする）と、HPLCによって決定した全てのLDLサブクラスを含む全LDL-C（y軸とする）との間にもまたはっきりとした相関が得られた（y=0.903x+6.28 (r=0.977, n=62, P<0.0001)）。 A clear correlation was obtained between HDL-C determined by precipitation (x-axis) and all HDL containing all HDL subclasses determined by HPLC (y-axis) (y = 0.975x + 5.29 (r = 0.973, n = 62, P <0.0001)). There is also a clear correlation between LDL-C calculated by the Friedewald equation (assuming x-axis) and all LDL-C including all LDL subclasses determined by HPLC (assuming y-axis). (Y = 0.903x + 6.28 (r = 0.977, n = 62, P <0.0001)).
HPLCによるコレステロールプロファイルと臨床パラメータとの相関
主要リポタンパク質とそれらのサブクラスにおけるコレステロールレベルと、様々な臨床パラメータ(年齢、BMI、VFA、SFA、UA、IRI及びPAI-1)及び血清TGとの単純な相関を表３にまとめた。さらに、LDL粒子サイズとHDL粒子サイズとの相関もまた表３に示した。
Correlation between cholesterol profile and clinical parameters by HPLC Simple cholesterol levels in major lipoproteins and their subclasses with various clinical parameters (age, BMI, VFA, SFA, UA, IRI and PAI-1) and serum TG The correlation is summarized in Table 3. Further, correlation between LDL particle size and HDL particle size were also shown in Table 3.
年齢については、中HDL-Cと小HDL-Cとの間に有意な負の相関(P<0.01)が見られた。BMIについては、HDLパラメータ（すなわち、大HDL-C (P<0.01)及びHDL粒子サイズ(P<0.01)）についてのみ有意な負の相関が見られた。SFAとリポタンパク質サブクラスの全てとの間には相関が見られなかったが、VFAとVLDL-Cサブクラス（大、中及び小）との間及びVFAとLDL-C（中、小及び極小）との間には有意な正の相関(P<0.01)がみられ、また、VFAと大HDL-C及び中HDL-Cとの間、VFAとLDLとの間並びにVFAとHDL粒子サイズとの間に有意な負の相関(P<0.01)が見られた。 Regarding age, there was a significant negative correlation (P <0.01) between medium HDL-C and small HDL-C. For BMI, there was a significant negative correlation only for HDL parameters (ie, large HDL-C (P <0.01) and HDL particle size (P <0.01)). No correlation was found between SFA and all lipoprotein subclasses, but between VFA and VLDL-C subclasses (large, medium and small) and between VFA and LDL-C (medium, small and minimal) There is a significant positive correlation (P <0.01) between VFA and large HDL-C and medium HDL-C, between VFA and LDL, and between VFA and HDL particle size. There was a significant negative correlation (P <0.01).
UAについては、VLDL-Cサブクラス（中及び小）との間に正の相関(P<0.01)が見られ、大HDL-C及びHDL粒子サイズとの間に負の相関(P<0.01)が見られた。IRIの場合には、小LDL-C及び極小LDL-Cとの間に正の相関(P<0.01)が見られ、大HDL-C及びHDL粒子サイズとの間に負の相関(P<0.01)が見られた。PAI-1については、小HDL-C及び極小HDL-Cとの間に正の相関(P<0.01)が見られた。血清TGレベルについては、VFAとVLDL-Cサブクラス（大、中及び小）との間並びにVFAとLDL-Cサブクラス（小及び極小）との間に有意な正の相関(P_0.01)が見られ、VFAと大LDL-Cとの間、VFAとHDL-Cサブクラス（大及び中）との間、VFAとLDLとの間並びにVFAとHDL粒子サイズとの間に負の相関(P<0.01)が見られた。 For UA, there is a positive correlation (P <0.01) with VLDL-C subclasses (medium and small), and a negative correlation (P <0.01) with large HDL-C and HDL particle size. It was seen. In the case of IRI, a positive correlation (P <0.01) is observed between small LDL-C and minimal LDL-C, and a negative correlation (P <0.01) between large HDL-C and HDL particle size. )has seen. For PAI-1, a positive correlation (P <0.01) was observed between small HDL-C and minimal HDL-C. For serum TG levels, a significant positive correlation (P_0.01) was found between VFA and VLDL-C subclasses (large, medium and small) and between VFA and LDL-C subclasses (small and extremely small). Negative correlations between VFA and large LDL-C, between VFA and HDL-C subclasses (large and medium), between VFA and LDL, and between VFA and HDL particle size (P <0.01) )has seen.
VFAとリポタンパク質サブクラスの間の相関に対する従来の脂質パラメータの影響
表３に示した身体測定値のなかで、VFAレベルがリポタンパク質サブクラスに対して最も強い相関を示した。したがって、VFAとリポタンパク質サブクラスの間の相関に対する従来の脂質パラメータの影響を、血清TGレベル、血清TCレベル及びLDL-Cレベルのそれぞれ（表４）の調整によって検討した。VFAと小LDL-Cとの間及びVFAと極小LDL-Cとの間の正の相関は、それぞれTG、TC、HDL-C及びLDL-Cの調整の後においても有意(P<0.01)のままであった。
Effect of conventional lipid parameters on correlation between VFA and lipoprotein subclass Of the physical measurements shown in Table 3, VFA levels showed the strongest correlation to lipoprotein subclass. Therefore, the effect of conventional lipid parameters on the correlation between VFA and lipoprotein subclass was examined by adjusting each of serum TG level, serum TC level and LDL-C level (Table 4). Positive correlations between VFA and small LDL-C and between VFA and minimal LDL-C were significant (P <0.01) even after adjustment for TG, TC, HDL-C, and LDL-C, respectively. It remained.
VLDLサブクラスについては、単純相関解析によって、全てのVLDLサブクラスはVFAに正に相関するが、血清TGレベルの調整の後に大VLDL及び小VLDLはそれぞれ負に相関及び正に相関していた。LDLサブクラスの場合、LDL-Cの調整によって大LDLとVFAとの間に有意な正の相関(P<0.01)が見られたが、中LDLとVFAとの間の有意な正の相関は除外された。 For the VLDL subclass, all VLDL subclasses positively correlated with VFA by simple correlation analysis, but after adjustment of serum TG levels, large and small VLDL were negatively and positively correlated, respectively. For the LDL subclass, LDL-C adjustment showed a significant positive correlation between large LDL and VFA (P <0.01), but excluded a significant positive correlation between medium LDL and VFA It was done.
VFAとLDLサブクラスとの間の相関に及ぼすLDL-Cの影響
被験体を、全LDL-Cレベル（全てのLDLサブクラスの総和）の中間値によって、低LDL-C集団(n=31であり、LDL-C<130 mg/dLである)と高LDL-C集団(n=31であり、LDL-C≧130 mg/dLである)からなるサブ集団に分けた。全集団(n=62)において、表３に示したように、VFAと全LDL-Cとの間に有意な正の相関(r=0.431, P<0.001)が見られた。低LDL-C集団においては、VFAと全LDL-Cとの間に相関が無かったが、高LDL-C集団においては有意な正の相関(r=0.546, P<0.002)が見られた。VFAとLDLサブクラスとの間の散布図を図７に示す。
The effect of LDL-C on the correlation between VFA and LDL subclasses is determined by the median of all LDL-C levels (sum of all LDL subclasses), and the low LDL-C population (n = 31) LDL-C <130 mg / dL) and high LDL-C population (n = 31 and LDL-C ≧ 130 mg / dL). In all populations (n = 62), as shown in Table 3, a significant positive correlation (r = 0.431, P <0.001) was observed between VFA and total LDL-C. There was no correlation between VFA and total LDL-C in the low LDL-C population, but a significant positive correlation (r = 0.546, P <0.002) was found in the high LDL-C population. A scatter plot between the VFA and the LDL subclass is shown in FIG.
図７において、(a)は大LDL-Cに対するVFAの散布図であり、(b)は小LDL-Cに対するVFAの散布図であり、(c)は極小LDL-Cに対するVFAの散布図であり、高LDL-C集団については（○）で示し、低LDL-C集団着いては（●）で示した。破線は低LDL-C集団についての直線回帰を示している。相関係数及びP値は低LDL-C集団について示している(n=31)。 In FIG. 7, (a) is a scatter diagram of VFA for large LDL-C, (b) is a scatter diagram of VFA for small LDL-C, and (c) is a scatter diagram of VFA for minimal LDL-C. Yes, the high LDL-C population is indicated by (◯), and the low LDL-C population is indicated by (●). The dashed line shows linear regression for the low LDL-C population. Correlation coefficients and P values are shown for the low LDL-C population (n = 31).
大LDL-Cは、全集団及び高LDL-C集団においてVFAと有意な相関を示さなかったが、低LDL-C集団においては有意な負の相関(r= -0.446及びP<0.02)を示した。小LDL-C及び極小LDL-Cは、全集団及び両サブ集団においてVFAと有意な正の相関を示したが、高LDL-C集団において極小LDL-CはVFAと相関を示さなかった。 Large LDL-C did not show significant correlation with VFA in the entire population and high LDL-C population, but significant negative correlation (r = -0.446 and P <0.02) in the low LDL-C population It was. Small LDL-C and minimal LDL-C showed significant positive correlation with VFA in all populations and both subpopulations, whereas minimal LDL-C did not correlate with VFA in the high LDL-C population.
〔実施例２〕
<方法>
被験者
1996年12月から1998年12月までの2年間に山形大学木病院で心臓カテーテルを経験した609人の男性患者から62人の被験者を選抜した。なお、被験者は、いかなる脂質低下治療も行われておらず、糖尿病や腎臓及び肝臓疾患に罹患していない者である。被験者は、本実験に入る前に山形大学病院倫理委員会に従ってインフォームドコンセントを行った。
[Example 2]
<Method>
subject
62 subjects were selected from 609 male patients who experienced cardiac catheterization at Yamagata University Ki Hospital for two years from December 1996 to December 1998. The subject is a person who has not undergone any lipid lowering treatment and does not suffer from diabetes, kidney or liver disease. The subject gave informed consent according to the Yamagata University Hospital Ethics Committee before entering this experiment.
62±9歳である選択された被験者(41〜76歳の範囲)は、CADの存在に基づいて２つのグループに分けられた。CADを伴う患者群においては、21人の患者が心筋梗塞(MI)の病歴を有しており（３名が急性心筋梗塞、1ヶ月以内の心筋梗塞が11名、陳旧性心筋梗塞が7名）、7人の患者が労作性狭心症であり、11人の患者が血管攣縮性狭心症であり、4人の患者が不安定狭心症であり、2名の患者は重篤な冠動脈狭窄を伴う心臓疾患の症状を有していなかった(無症候性心筋虚血)。CADを有しないコントロール群(n=17)においては、4人の患者が非典型的胸痛であり、6人の患者が心筋症であり、4人の患者が大動脈弁疾患であり、3人の患者が心電図異常であった。 Selected subjects (range 41-76 years) who were 62 ± 9 years were divided into two groups based on the presence of CAD. In patients with CAD, 21 patients had a history of myocardial infarction (MI) (3 with acute myocardial infarction, 11 with myocardial infarction within one month, 7 with old myocardial infarction) Name), 7 patients have exertion angina, 11 patients have vasospastic angina, 4 patients have unstable angina, and 2 patients are severe Did not have symptoms of heart disease with coronary stenosis (asymptomatic myocardial ischemia). In the control group without CAD (n = 17), 4 patients had atypical chest pain, 6 patients had cardiomyopathy, 4 patients had aortic valve disease, 3 The patient had abnormal ECG.
本実験において、血管疾患の重篤性を評価することを目的として、以下の5つのランク（-1から3）を定義した。”-1”は血管疾患なし、”0”は75％未満の狭窄を伴う血管疾患、”1”は75％以上の狭窄を伴う一枝疾患、”2”は75％以上の狭窄を伴う二枝疾患、”3”は75％以上の狭窄を伴う三枝疾患。
夜間絶食の後に静脈血が採取された。血漿試料は冷蔵庫に保管され、採血から7日以内に分析された。
In this experiment, the following five ranks (-1 to 3) were defined for the purpose of evaluating the severity of vascular disease. "-1" is no vascular disease, "0" is vascular disease with less than 75% stenosis, "1" is one branch disease with more than 75% stenosis, "2" is bifurcation with more than 75% stenosis The disease, “3”, is a three-branch disease with more than 75% stricture.
Venous blood was collected after an overnight fast. Plasma samples were stored in a refrigerator and analyzed within 7 days from the collection.
HPLC法
血漿リポタンパク質は実施例１に記載した方法に従って分析した。
HPLC Method plasma lipoproteins were analyzed according to the method described in Example 1.
他の臨床及び脂質パラメータ解析
血漿TGは市販のキット（協和メディックス社製）を用いて酵素的に決定した。血漿アポリポタンパク質A-I、A-II、B、C-II、C-III及びEレベルは、第一化学薬品（東京、日本）の免疫比濁法によって決定した。空腹時血糖は酵素法によって測定した。病歴とアンケートを利用して、年齢、体重、身長、喫煙履歴、家系、血圧、陳旧性心筋梗塞、狭心症、糖尿病及び薬剤使用に関するデータを取得した。肥満度指数(BMI)は、体重及び身長から算出した（体重(kg)/[身長(m)]2）。
Other clinical and lipid parameter analysis Plasma TG was determined enzymatically using a commercially available kit (manufactured by Kyowa Medix). Plasma apolipoprotein AI, A-II, B, C-II, C-III and E levels were determined by immunoturbidimetry of Daiichi Chemical (Tokyo, Japan). Fasting blood glucose was measured by enzymatic method. Data on age, weight, height, smoking history, family history, blood pressure, old myocardial infarction, angina pectoris, diabetes and drug use were obtained using medical history and questionnaire. The body mass index (BMI) was calculated from weight and height (weight (kg) / [height (m)] 2 ).
統計解析
データは、別段明記した場合を除き、平均±SDで表示した。スチューデントt-検定を用いて群間の統計的有意差を決定した。様々な変数間の相関は、統計的に相違すると考えられるP-value <0.05であるピアソン相関係数（r-value）として示した。
Statistical analysis data were expressed as mean ± SD unless otherwise specified. Student t-test was used to determine statistical significance between groups. Correlations between various variables are shown as Pearson correlation coefficients (r-values) with P-value <0.05, which is considered statistically different.
結果
臨床的特徴、脂質レベル及びリポタンパク質の比較
本実験における62人の男性について臨床的特徴、脂質レベル及びリポタンパク質レベルを表５に示した。年齢、BMI、FBS、危険マーカーの百分率分布（現在喫煙者、高血圧及び家系）、血漿TCレベル及び血漿TGレベルについては、患者群及びコントロール群間に有意差はなかった。アポリポタンパク質プロファイルについては、アポリポタンパク質B及びアポリポタンパク質Eは患者群において有意に高い値が得られた（それぞれP<0.05及びP<0.01）。
result
Comparison of clinical characteristics, lipid levels and lipoproteins Table 5 shows the clinical characteristics, lipid levels and lipoprotein levels for 62 men in this experiment. There were no significant differences between patients and controls in terms of age, BMI, FBS, percentage distribution of risk markers (currently smokers, hypertension and family), plasma TC levels and plasma TG levels. Regarding the apolipoprotein profile, apolipoprotein B and apolipoprotein E were significantly higher in the patient group (P <0.05 and P <0.01, respectively).
主要リポタンパク質（全VLDL、全LDL及び全HDL）とともに、３つのVLDLサブクラス（大、中及び小）、４つのLDLサブクラス（大、中、小及び極小）、５つのHDLサブクラス（極大、大、中、小及び極小）についてHPLC後の成分分析によってコレステロールレベルを決定した。表６に患者群における主要リポタンパク質及びそれらのサブクラスにおけるコレステロールレベルをコントロール群と比較した。 Along with major lipoproteins (all VLDL, all LDL and all HDL), three VLDL subclasses (large, medium and small), four LDL subclasses (large, medium, small and minimal), and five HDL subclasses (maximum, large, Cholesterol levels were determined by component analysis after HPLC for medium, small and minimal). Table 6 compares the cholesterol levels in the major lipoproteins and their subclasses in the patient group with the control group.
主要リポタンパク質クラスについては、患者群において有意に高い全LDL-C(P<0.05)及び有意に低い全HDL-C(P<0.05)を示したが、全VLDL-Cレベルに有意差はなかった。リポタンパク質サブクラスについては、患者群において有意に小VLDL-C(P<0.001)、小LDL-C(P<0.05)及び極小LDL-C(P<0.001)が増加していたが、有意に大HDH-C(P<0.001)が減少していた。従来の危険マーカー、非HDL、TC/HDL-C並びにLDL-C/HDL-Cの比率がコントロール群よりも患者群において有意に高い値を示した。 For the major lipoprotein classes, the patient group showed significantly higher total LDL-C (P <0.05) and significantly lower total HDL-C (P <0.05), but there was no significant difference in total VLDL-C levels It was. Regarding lipoprotein subclasses, small VLDL-C (P <0.001), small LDL-C (P <0.05) and minimal LDL-C (P <0.001) increased significantly in the patient group, but significantly larger HDH-C (P <0.001) decreased. The ratio of conventional risk markers, non-HDL, TC / HDL-C and LDL-C / HDL-C was significantly higher in the patient group than in the control group.
より明確に2つの群を識別するため、幾つかの派生した変数を各サブクラスから算出した。患者群において有意に増加した３つのサブクラス（小VLDL、小LDL及び極小LDL）を組み合わせて“Vs+Ls”と表現した。“Vs”は小VLDL中のコレステロールレベルを示している。“Ls”は小LDL及び極小LDLにおけるコレステロールレベルの合計を示している。層化したサブクラス(Vs+Ls)、及び減少したサブクラス（大HDL）の差又は比は、“Vs + Ls - Hs”、“(Vs + Ls)/Hs”又は“Ls/Hs”と表現することができる。“Hs”は大HDL中のコレステロールレベルを示している。 In order to distinguish the two groups more clearly, several derived variables were calculated from each subclass. Three subclasses (small VLDL, small LDL, and minimal LDL) that significantly increased in the patient group were combined and expressed as “Vs + Ls”. “Vs” indicates the cholesterol level in the small VLDL. “Ls” indicates the sum of cholesterol levels in small LDL and minimal LDL. Difference or ratio of stratified subclass (Vs + Ls) and reduced subclass (large HDL) is expressed as “Vs + Ls-Hs”, “(Vs + Ls) / Hs” or “Ls / Hs” be able to. “Hs” indicates cholesterol level in large HDL.
これらすべての派生変数もまた、コントロール群よりも患者群において有意に高い値を示し、なかでも“Vs + Ls - Hs”が最も強い有意差を示す。 All these derived variables also show significantly higher values in the patient group than in the control group, with “Vs + Ls−Hs” showing the strongest significant difference.
主要リポタンパク質、それらのサブクラス及び派生変数におけるコレステロールレベルと血管疾患スコアとの相関
主要リポタンパク質及びそれらのサブクラスにおけるコレステロールレベルとCADの指標となるVDスコアとの単純相関を表７に示した。VDスコアは、小VLDL-C及び小LDL-Cとの間において強く正に相関しており(P<0.01)、大HDL-Cとの間に負に相関していた(P<0.01)。
Correlation of Cholesterol Levels in Major Lipoproteins, Their Subclasses and Derived Variables with Vascular Disease Scores Table 7 shows simple correlations between cholesterol levels in major lipoproteins and their subclasses and VD scores as an indicator of CAD. VD scores were strongly positively correlated with small VLDL-C and small LDL-C (P <0.01) and negatively correlated with large HDL-C (P <0.01).
VDスコアと表６に示した幾つかの派生変数との相関を検討した。表７に示すように、すべての派生変数は、VDスコアに対してr=0.333 (n=62, P<0.01) 以上の高さで強く正に相関しており、最も強い相関(r=0.428, P<0.001)は“Vs + Ls - Hs”において見られた。従来の脂質危険マーカーについては、VDスコアは、LDL-C/HDL-C比及びLDL-C/HDL-C比との有意な相関(P<0.01)が見られたが非HDL-Cについては相関していなかった（データは示さず）。 The correlation between the VD score and some of the derived variables shown in Table 6 was examined. As shown in Table 7, all derived variables are strongly positively correlated with the VD score at a height of r = 0.333 (n = 62, P <0.01) or higher, with the strongest correlation (r = 0.428). , P <0.001) was found in “Vs + Ls-Hs”. For conventional lipid risk markers, VD scores were significantly correlated with LDL-C / HDL-C ratio and LDL-C / HDL-C ratio (P <0.01), but for non-HDL-C There was no correlation (data not shown).
CAD重篤度のリポタンパク質サブクラス及びそれらの派生変数への相関に対する、従来の脂質パラメータの影響
VDスコア、リポタンパク質及びそれらの派生変数の間の相関に対する従来の脂質パラメータの影響を検討し、CAD重篤度に関連するそれら変数の臨床的有用性を評価した。表７は、従来の各変数（TG、TC、HDL-C、LDL-C及びアポリポタンパク質B）、又は非HDL-C、TC/HDL-C及びLDL-C/HDL-Cといった変数の各組み合わせをコントロールした後におけるHPLC変数とVD変数との間の部分相関係数を示している。血漿TG、TC及びHDL-Cについてコントロールしても、VDスコアとHPLC変数との間の相関には大きな影響がなかった。一方、極小LDL-CとVDスコアとの正の相関については、LDL-C、アポリポタンパク質B又は非HDL-Cのコントロール後には有意差がなくなっていった。LDL-Cの調整の後に大LDL-CとVDスコアとの有意な負の相関が見られた。TC/HDL-C又はLDL-C/HDL-Cについてコントロールすることによってすべての有意な相関はなくなったが、TC/HDL-Cをコントロールすることによって中VLDL-CとVDスコアとの負の相関はより有意になった。“Vs + Ls - Hs”とVDスコアとの正の相関は、いかなる要素をコントロールした後においても有意なままであった。さらに、“Vs + Ls”とVDスコアとの有意な正の相関は、TC/HDL-C又はLDL-C/HDL-Cをコントロールした場合を除いて、維持された。
Impact of conventional lipid parameters on the correlation of CAD severity to lipoprotein subclasses and their derived variables
The effects of conventional lipid parameters on the correlation between VD scores, lipoproteins and their derived variables were examined, and the clinical usefulness of those variables related to CAD severity was evaluated. Table 7 shows the conventional variables (TG, TC, HDL-C, LDL-C and apolipoprotein B), or combinations of variables such as non-HDL-C, TC / HDL-C and LDL-C / HDL-C. The partial correlation coefficient between the HPLC variable and the VD variable after controlling is shown. Control of plasma TG, TC and HDL-C did not significantly affect the correlation between VD scores and HPLC variables. On the other hand, regarding the positive correlation between minimal LDL-C and VD score, there was no significant difference after control of LDL-C, apolipoprotein B or non-HDL-C. There was a significant negative correlation between large LDL-C and VD score after adjustment of LDL-C. By controlling for TC / HDL-C or LDL-C / HDL-C, all significant correlations disappeared, but by controlling TC / HDL-C, the negative correlation between medium VLDL-C and VD score Became more significant. The positive correlation between “Vs + Ls−Hs” and the VD score remained significant after controlling any factor. Furthermore, a significant positive correlation between “Vs + Ls” and VD score was maintained except when TC / HDL-C or LDL-C / HDL-C was controlled.
〔実施例３〕
本実施例では、Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムファルマシア社製）及び２つのTSKgel LipopropalXLカラム（東ソー（株）製）を用いて、表８に示す59サンプルについて分析し、得られた結果を比較した。
Example 3
In this example, 59 samples shown in Table 8 were analyzed using a Superose 6HR 10/30 column (Amersham Pharmacia) and two TSKgel LipopropalXL columns (Tosoh Corp.), and the results obtained were compared. did.
本実施例では、Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムファルマシア社製）及び２つのTSKgel LipopropalXLカラム（東ソー（株）製）を用いて、表９に示す44サンプルについて更に分析し、得られた結果を比較した。 In this example, the Superose 6HR 10/30 column (manufactured by Amersham Pharmacia) and two TSKgel Lipopropal XL columns (manufactured by Tosoh Corporation) were further analyzed for 44 samples shown in Table 9, and the results obtained were obtained. Compared.
本実施例では、表１０に示すように、20個のコンポーネントピークの溶出時間（粒子サイズ）を定義した。 In this example, as shown in Table 10, the elution time (particle size) of 20 component peaks was defined.
健常被験者から採取されたプールされた血清について、Superose 6HR 10/30カラムを用いて得られた分析結果を図８(a)及び(b)に示し、TSKgel LipopropakXLカラムを用いて得られた分析結果を図９(a)及び(b)に示し、SkylightPak-LDLカラムを用いて得られた分析結果を図１０(a)及び(b)に示す。図８(a)、９(a)及び１０(a)において太線は、コンポーネントピークに分割する前のコレステロールのプロファイルを示している。図８(b)、９(b)及び１０(b)において太線は、コンポーネントピークに分割する前のトリグリセリドのプロファイルを示している。 The analysis results obtained using the Superose 6HR 10/30 column for pooled sera collected from healthy subjects are shown in FIGS. 8 (a) and (b), and the analysis results obtained using the TSKgel LipopropakXL column. Are shown in FIGS. 9 (a) and (b), and the analysis results obtained using the SkylightPak-LDL column are shown in FIGS. 10 (a) and 10 (b). In FIGS. 8 (a), 9 (a), and 10 (a), the thick line indicates the cholesterol profile before being divided into component peaks. In FIGS. 8 (b), 9 (b) and 10 (b), the thick line shows the triglyceride profile before being divided into component peaks.
図１１は、表８に示した59人の被験者についてSuperose 6HR 10/30カラムを使用して得られた結果（図８(a)）に基づいて、ピークG7〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１２は、表８に示した59人の被験者についてTSKgel LipopropakXLカラムを使用して得られた結果（図９(a)）に基づいて、ピークG7〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１３は、表８に示した59人の被験者における図１１及び１２に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG7〜G13（小VLDL〜LDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、Superose 6HR 10/30カラムを使用した場合とTSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合との比較結果を示している。さらに、図１４は、表８に示した59人の被験者における図１１及び１２に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG14〜G20（HDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、両カラムを使用した場合の比較結果を示している。 FIG. 11 shows the amount of cholesterol contained in each of peaks G7 to G20 based on the results obtained using the Superose 6HR 10/30 column for 59 subjects shown in Table 8 (FIG. 8 (a)). The result of calculating the average of is shown. FIG. 12 shows the average amount of cholesterol contained in each of the peaks G7 to G20 based on the results obtained using the TSKgel LipopropakXL column for 59 subjects shown in Table 8 (FIG. 9 (a)). The calculated result is shown. FIG. 13 shows the amount of cholesterol contained in the component peaks G7 to G13 (corresponding to the small VLDL to LDL subclass) based on the results shown in FIGS. 11 and 12 in 59 subjects shown in Table 8. The comparison result between the case of using the 10/30 column and the case of using the TSKgel LipopropakXL column is shown. Furthermore, FIG. 14 shows both columns for the amount of cholesterol contained in the component peaks G14 to G20 (corresponding to the HDL subclass) based on the results shown in FIGS. 11 and 12 in 59 subjects shown in Table 8. The comparison result when used is shown.
図８(a)、９(a)及び１１〜１４から判るように、１４個のコンポーネントピークG7〜G20に含まれるコレステロール量は、Superose 6HR 10/30カラム及びTSKgel LipopropakXLカラムのいずれを用いた場合においてもほぼ一致していた。 As can be seen from FIGS. 8 (a), 9 (a), and 11-14, the amount of cholesterol contained in the 14 component peaks G7-G20 is when using either a Superose 6HR 10/30 column or a TSKgel LipopropakXL column. Was almost the same.
図１５は、表９に示した44人の被験者についてTSKgel LipopropakXLカラムを使用して得られた結果（図９(a)）に基づいて、ピークG6〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１６は、表９に示した44人の被験者についてSkylightPak-LDLカラムを使用して得られた結果（図１０(a)）に基づいて、ピークG6〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１７は、表９に示した44人の被験者における図１５及び１６に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG6〜G13（中VLDL〜LDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、TSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合とSkylightPak-LDLカラムを使用した場合との比較結果を示している。さらに、図１８は、表９に示した44人の被験者における図１５及び１６に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG14〜G20（HDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、両カラムを使用した場合の比較結果を示している。 FIG. 15 shows the average amount of cholesterol contained in each of the peaks G6 to G20 based on the results obtained using the TSKgel LipopropakXL column for the 44 subjects shown in Table 9 (FIG. 9 (a)). The calculated result is shown. FIG. 16 shows the average amount of cholesterol contained in each of the peaks G6 to G20 based on the results obtained using the SkylightPak-LDL column for the 44 subjects shown in Table 9 (FIG. 10 (a)). The calculation result is shown. FIG. 17 shows the amount of cholesterol contained in the component peaks G6 to G13 (corresponding to the middle VLDL to LDL subclass) based on the results shown in FIGS. 15 and 16 in 44 subjects shown in Table 9, and TSKgel LipopropakXL The comparison result with the case where the column is used and the case where the SkylightPak-LDL column is used is shown. Further, FIG. 18 shows the results of the results shown in FIGS. 15 and 16 for the 44 subjects shown in Table 9, with both columns for the amount of cholesterol contained in the component peaks G14 to G20 (corresponding to the HDL subclass). The comparison result when used is shown.
図９(a)、１０(a)及び１５〜１８から判るように、１５個のコンポーネントピークG6〜G20に含まれるコレステロール量は、TSKgel LipopropakXLカラム及びSkylightPak-LDLカラムのいずれを用いた場合においてもほぼ一致していた。 As can be seen from FIGS. 9 (a), 10 (a), and 15-18, the amount of cholesterol contained in the 15 component peaks G6 to G20 is the same when either the TSKgel LipopropakXL column or the SkylightPak-LDL column is used. It was almost the same.
したがって、本発明に係る分析方法によれば、分離能等の特性に関わらず如何なるカラムを用いても、信頼性に優れたデータ解析結果を示すことができる。また、図８(b)、９(b)及び１０(b)に示すように、本発明に係る分析方法は、上述したコレステロールの解析と同様にトリグリセリドの解析にも適用できる。言い換えれば、本発明に係る分析方法によれば、コレステロールに由来する検出信号に基づいて定義されたコンポーネントピークを用いて、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等に由来するプロファイルについて近似曲線を算出することができる。 Therefore, according to the analysis method of the present invention, it is possible to show a highly reliable data analysis result regardless of the column used regardless of characteristics such as resolution. Further, as shown in FIGS. 8 (b), 9 (b) and 10 (b), the analysis method according to the present invention can be applied to the analysis of triglyceride as well as the analysis of cholesterol described above. In other words, according to the analysis method of the present invention, an approximate curve is obtained for profiles derived from triglycerides, free cholesterol, phospholipids, apolipoproteins, etc., using component peaks defined based on detection signals derived from cholesterol. Can be calculated.
Claims (15)
リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（エクストラ・エッセンシャル・ピーク：extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程とを含む、
リポタンパク質粒子の分析方法。 Separating a plurality of classes of lipoproteins contained in a test sample by liquid chromatography, and detecting a signal derived from a component contained in the separated lipoprotein particles;
Assuming that lipoproteins are composed of subclasses estimated from component peaks consisting of anchor peaks and other essential peaks (extra essential peaks), and using the detected signals, Calculating a corresponding approximate waveform,
Method for analyzing lipoprotein particles.
上記被験試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質粒子に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、
リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程と、
上記算出した近似波形を解析する工程とを含む、
内臓脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法。 Preparing a test sample collected from a diagnostic subject;
Separating a plurality of classes of lipoproteins contained in the test sample by liquid chromatography, and detecting a signal derived from a component contained in the separated lipoprotein particles;
Assuming that lipoproteins are composed of subclasses estimated from component peaks consisting of anchor peaks and other essential peaks, calculate approximate waveforms corresponding to component peaks using the detected signals. And a process of
Analyzing the calculated approximate waveform,
A method for diagnosing a disease caused by visceral fat accumulation.
(I)〜(V)から選ばれる少なくとも１つの式により値を算出する工程とを含む、
(I) Vs + Ls - Hs;
(II) Vs + Ls;
(III) Ls;
(IV) (Vs + Ls)/Hs
(V) Ls/Hs,
（“Vs”は小VLDLに含まれるコレステロール量を示し、“Ls”は小LDL及び極小LDLに含まれるコレステロール量の合計を示し、“Hs”は大HDLに含まれるコレステロール量を示している。）
冠動脈疾患の診断方法。 Using the method for analyzing lipoproteins according to any one of claims 1 to 5, analyzing lipoproteins contained in a test sample collected from a diagnostic subject;
Calculating a value according to at least one formula selected from (I) to (V),
(I) Vs + Ls-Hs;
(II) Vs + Ls;
(III) Ls;
(IV) (Vs + Ls) / Hs
(V) Ls / Hs,
(“Vs” represents the amount of cholesterol contained in the small VLDL, “Ls” represents the total amount of cholesterol contained in the small LDL and the minimal LDL, and “Hs” represents the amount of cholesterol contained in the large HDL. )
A method for diagnosing coronary artery disease.
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