JP2011053119A - Observation method of tissue of experimental small animal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体試料（生体組織又は実験用小動物）を、光学顕微鏡等を用いて観察するための方法に係り、より詳細には、簡便に生体試料の表層の血管構造をイメージングする方法に係る。 The present invention relates to a method for observing a biological sample (biological tissue or experimental small animal) using an optical microscope or the like, and more particularly, to a method for easily imaging a blood vessel structure on the surface layer of a biological sample. .
医学的、薬学的又は生物学的研究の分野に於いて、種々の態様にて生体試料の血管をin vivoにて可視化し顕微観察して、血管の構造及び機能を観測する試みが為されている。よく知られているように、血管は、発生段階の胚に於いて、或いは、（成体の）がんや炎症などの疾患部位に於いて新生され、栄養や酸素の供給経路となる。従って、血管を可視化し、その成長・消滅等の挙動を観測することにより、血管新生、動物の発生若しくはがんの増殖・転移のメカニズムの解明或いは診断に於いて有用な情報が得られることが期待される。また、新薬開発に於いて、がんに於ける血管新生を阻害する阻害剤は、抗がん剤として機能することが期待されることから、実験用小動物の血管をin vivoにて可視化する動物モデル実験が実施され、これによる小動物体内の血管の構造及び機能の観測結果が、抗がん剤等の新薬の評価を行うために用いられている。 In the field of medical, pharmaceutical or biological research, attempts have been made to observe the structure and function of blood vessels by visualizing and microscopically observing the blood vessels of biological samples in various ways in vivo. Yes. As is well known, blood vessels are renewed in developing embryos, or in disease sites such as (adult) cancer and inflammation, providing a nutrient and oxygen supply pathway. Therefore, by visualizing blood vessels and observing their growth / disappearance behavior, useful information can be obtained in elucidating or diagnosing the mechanism of angiogenesis, animal development or cancer growth / metastasis. Be expected. In addition, in the development of new drugs, inhibitors that inhibit angiogenesis in cancer are expected to function as anticancer agents, so animals that visualize the blood vessels of small experimental animals in vivo Model experiments have been conducted, and the observation results of the structure and function of blood vessels in small animals are used to evaluate new drugs such as anticancer drugs.
生体試料の血管のイメージングに於いては、典型的には、被写体（生体試料）の表面に可視光又は白色光が照射され、その戻り光又は反射光による被写体の像が撮像手段（カメラなど）により撮影される。しかしながら、血管量の豊富な試料に於いては、その像に於いて血管と血管外組織との像のコントラストが低く、明瞭に血管構造を写し出した画像を得ることは困難である。そこで、従来の技術に於いては、血管をコントラストよく可視化するための方法として、例えば、蛍光試薬の光を用いた蛍光イメージング技術による方法（非特許文献１−３）や狭帯域光観察による方法（特許文献１）などが提案されている。蛍光イメージングによる血管の可視化の例としては、例えば、生体試料の血管中に蛍光試薬（トレーサー分子）が投与され、血管中に滞留する蛍光試薬を光らせることにより血管のみを可視化する方法（非特許文献１、２）、実験用小動物に於いてＧＦＰ遺伝子が導入された移植腫瘍内の血管の形成を観察する方法（非特許文献３：ＧＦＰ遺伝子導入腫瘍細胞が蛍光を発するのに対して血管が蛍光を発しないことにより、血管構造の像がコントラストよく得られる。）などが報告されている。また、狭帯域光観察による方法では、血液に吸収されやすく血管外組織で反射されやすい波長の光を照明光として用い、血管像のコントラストを高くするといった手法が用いられている（内視鏡に於いて採用されている。）。 In imaging of blood vessels in a biological sample, typically, the surface of a subject (biological sample) is irradiated with visible light or white light, and an image of the subject by the return light or reflected light is imaged means (such as a camera). Taken by However, in a sample with a large amount of blood vessels, the contrast between the image of the blood vessel and the extravascular tissue is low in the image, and it is difficult to obtain an image that clearly shows the blood vessel structure. Therefore, in the prior art, as a method for visualizing blood vessels with good contrast, for example, a method using a fluorescence imaging technique using light of a fluorescent reagent (Non-Patent Document 1-3) or a method using narrowband light observation (Patent Document 1) and the like have been proposed. Examples of visualization of blood vessels by fluorescence imaging include, for example, a method in which a fluorescent reagent (tracer molecule) is administered into a blood vessel of a biological sample, and only the blood vessel is visualized by illuminating the fluorescent reagent that stays in the blood vessel (non-patent document) 1, 2), a method for observing the formation of blood vessels in a transplanted tumor into which a GFP gene has been introduced in a small experimental animal (Non-patent Document 3: GFP gene-introduced tumor cells emit fluorescence, whereas blood vessels are fluorescent In other words, an image of a blood vessel structure can be obtained with good contrast. In addition, in the method using narrow-band light observation, a method is used in which light having a wavelength that is easily absorbed by blood and easily reflected by extravascular tissue is used as illumination light, and the contrast of the blood vessel image is increased (for an endoscope). It is adopted in.)
上記の如き血管のイメージングに於いて、血管中に蛍光試薬を導入し血管のみを光らせてイメージングする方法の場合、観察を行う度に蛍光試薬が必要であり、ランニングコストがかかる上、血中に投与された蛍光試薬の多くが時間と伴に血管外に漏出してしまい、血管の周囲の輝度（バックグラウンド）が上がりＳ／Ｎ比（コントラスト）が低減してしまうという不具合がある。そして、一旦、Ｓ／Ｎ比が低減してしまった個体で再び高いＳ／Ｎ比で血管を観察するためには、その個体から血管外に拡散した蛍光試薬が排除された後（クリアランスされた後）に、再度蛍光試薬を血管中に導入するといった過程が必要となるところ、蛍光試薬のクリアランスには、一般に数日間を要するので、例えば、１日毎に血管の変化を継続して観察するといったことが困難となる。また、ＧＦＰ遺伝子導入細胞を用いる方法では、遺伝子導入技術を要するなど、やや特別な処理過程及び処理設備が必要となり、利用可能な実験用小動物、細胞種及び実施可能な環境が高度に制限される。一方、狭帯域光観察による方法は、単色光照明を行うための装備を要し、高価で複雑な装置が必要となる。また、観察装置に於いて、試料に白色光ではなく単色光が照射されるようになっている場合、単色光では血管外組織の状況を把握することが困難となり、手術等の処置を行うことが困難である。 In the case of imaging of blood vessels as described above, in the method of imaging by introducing a fluorescent reagent into the blood vessel and illuminating only the blood vessel, a fluorescent reagent is required each time observation is performed, and it requires a running cost and is in the blood. Many of the administered fluorescent reagents leak out of the blood vessel with time, resulting in a problem that the luminance around the blood vessel (background) increases and the S / N ratio (contrast) decreases. In order to observe a blood vessel again at a high S / N ratio in an individual whose S / N ratio has once decreased, the fluorescent reagent diffused outside the blood vessel from the individual was excluded (cleared) Later, the process of reintroducing the fluorescent reagent into the blood vessel is necessary, and the clearance of the fluorescent reagent generally requires several days. For example, the blood vessel changes are continuously observed every day. It becomes difficult. In addition, the method using GFP gene-transferred cells requires a slightly special processing process and processing equipment, such as requiring a gene transfer technique, and the available experimental small animals, cell types, and the environment in which they can be implemented are highly limited. . On the other hand, the method by narrow band light observation requires equipment for performing monochromatic light illumination, and requires an expensive and complicated device. In addition, when the sample is irradiated with monochromatic light instead of white light in the observation device, it becomes difficult to grasp the condition of the extravascular tissue with monochromatic light, and treatment such as surgery is performed. Is difficult.
かくして、本発明の一つの課題は、蛍光イメージングを用いずに、また、観察中の試料（実験用小動物の組織）の血管外組織の状況を容易に把握できる態様にて、コントラストの高い血管像の取得を可能にする生体試料の顕微観察を行う方法を提供することである。 Thus, one object of the present invention is to provide a high-contrast blood vessel image without using fluorescence imaging and in a mode in which the state of the extravascular tissue of the sample (small experimental animal tissue) being observed can be easily grasped. It is to provide a method for performing microscopic observation of a biological sample that makes it possible to acquire the above.
また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き生体試料の顕微観察方法であって、観察試料（実験用小動物）を選ばず、且つ、比較的簡便に血管の構造及び形成又は新生の経時的な観察を実施することのできる方法を提供することである。 Another subject of the present invention is a method for microscopic observation of a biological sample as described above, and does not select an observation sample (small experimental animal), and it is relatively easy to determine the structure and formation of a blood vessel or the time course of neoplasia. It is to provide a method by which a typical observation can be performed.
本発明によれば、上記の課題を解決する新規な方法が提供される。本発明の実験用小動物の組織を観察する方法は、可視光領域を含む照明光を実験用小動物の組織の観察領域に照射する過程と、光学顕微鏡を用いて得られる観察領域からの照明光の戻り光による観察領域の像を撮像手段にて取得する過程とを含み、組織の観察領域の血管の像を取得する際には、撮像手段へ入射する戻り光の波長帯域を、緑色光の所定の波長帯域に制限することを特徴とする。かかる構成に於いて、「実験用小動物の組織」とは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験用小動物の個体、胚などの生きた生物試料の任意の部位又はそれらの生物試料から取り出した任意の組織であってよい。「可視光領域を含む照明光」は、この分野に於いて光学顕微鏡による明視野観察の際に利用される光源、例えば、ハロゲンランプなど、により得られる、所謂、白色光であってよい。また、「光学顕微鏡」は、この分野で通常使用される任意の生物顕微鏡、実体顕微鏡等であってよい。更に、「撮像手段」は、この分野に於いて光学顕微鏡による明視野観察の際に利用されるカメラ、例えば、ＣＣＤカメラなど、であってよい。戻り光の波長帯域の所定の波長帯域への制限は、撮像手段へ入射する戻り光をバンドパスフィルターに通過させることにより達成されるようになっていてよい。そして、「緑色光」は、定義にもよるが、略５００〜６００ｎｍの範囲に入る波長の光であり、「所定の波長帯域」は、かかる緑色光のうちの所定の波長帯域である。 According to the present invention, a novel method for solving the above problems is provided. The method for observing the tissue of a small experimental animal according to the present invention includes a process of irradiating the observation region of the tissue of the small experimental animal with illumination light including a visible light region, and illumination light from the observation region obtained using an optical microscope. A step of acquiring an image of the observation region by the return light by the imaging unit, and when acquiring an image of a blood vessel in the observation region of the tissue, the wavelength band of the return light incident on the imaging unit is set to a predetermined value of green light It is characterized by limiting to the wavelength band. In such a configuration, “the tissue of a small laboratory animal” means an individual of a small laboratory animal such as a mouse, a rat, a guinea pig, or a rabbit, an arbitrary part of a living biological sample such as an embryo or the biological sample. It can be any organization. “Illumination light including a visible light region” may be so-called white light obtained in this field by a light source used for bright field observation with an optical microscope, such as a halogen lamp. The “optical microscope” may be any biological microscope, stereomicroscope, or the like that is usually used in this field. Further, the “imaging means” may be a camera used in the field for bright field observation with an optical microscope, such as a CCD camera. The limitation of the wavelength band of the return light to the predetermined wavelength band may be achieved by allowing the return light incident on the imaging unit to pass through the band pass filter. The “green light” is light having a wavelength that falls within a range of approximately 500 to 600 nm, although it is defined, and the “predetermined wavelength band” is a predetermined wavelength band of the green light.
上記の構成から理解される如く、本発明の方法の基本的な構成は、典型的な、実験用小動物の組織の明視野観察と同様である。実験用小動物の組織の観察領域自体は、所謂白色光にて照明されているので、観察領域全体の状況は、白色光の戻り光から把握することができ、従って、観察領域に対して手術等の処置が容易に行うことができるようになっている。しかしながら、本発明の方法に於いては、特に、組織の観察領域の血管の像を取得する際に、撮像手段へ入射する戻り光の波長帯域が、照明光の波長帯域内のうちの緑色光の波長帯域に制限される。かかる構成によれば、観察領域から撮像手段へ入射される光は、緑色光の波長帯域の成分のみとなるところ、ヘモグロビンの光吸収は、約５００〜６００ｎｍの波長、即ち、緑色光の波長帯域に於いて高くなることが分かっているので（非特許文献４のFig．1参照）、かかる光成分は、観察領域内の血管の位置では、血中のヘモグロビンに相当に吸収され、従って、血管の位置から撮像手段へ入射される光の成分の強度は大幅に低減されることとなる。その結果、血管自体の像は暗くなり、血管外の組織の像は（光成分が低減しないので）明るくなり、かくして、高いコントラストにて血管の像が写し出された画像が得られることとなる。 As can be understood from the above configuration, the basic configuration of the method of the present invention is the same as a typical bright field observation of a tissue of a small experimental animal. Since the observation area of the tissue of the experimental small animal itself is illuminated with so-called white light, the situation of the entire observation area can be grasped from the return light of the white light. Can be easily performed. However, in the method of the present invention, particularly when acquiring an image of a blood vessel in the observation region of the tissue, the wavelength band of the return light incident on the imaging means is the green light within the wavelength band of the illumination light. Is limited to the wavelength band. According to such a configuration, the light incident on the imaging means from the observation region is only the component of the wavelength band of green light, and the light absorption of hemoglobin has a wavelength of about 500 to 600 nm, that is, the wavelength band of green light. (See Fig. 1 of Non-Patent Document 4), such a light component is considerably absorbed by hemoglobin in the blood at the position of the blood vessel in the observation region. Thus, the intensity of the light component incident on the imaging means from the position is greatly reduced. As a result, the image of the blood vessel itself becomes dark and the image of the tissue outside the blood vessel becomes bright (because the light component is not reduced), thus obtaining an image in which the image of the blood vessel is projected with high contrast.
上記の本発明の構成に於いて、所定の波長帯域は、特に、ヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む所定の波長帯域であることが好ましい。ヘモグロビンの光吸収が極大となる波長の近傍の帯域の光成分は、血管内のヘモグロビンに相当に吸収され、従って、戻り光に於いて光吸収の極大波長の近傍の成分がその他の波長帯域に比して大幅に低減されることとなる。そうすると、血管の存在領域からの戻り光の光強度のみが大幅に低減されることとなり、戻り光が結像されたとき、血管の像のコントラストが相当に改善されることとなる。また、実施の形態に於いて示されている如く、戻り光の波長帯域の所定の波長帯域への制限は、実質的に５１０ｎｍから５５０ｎｍまでの光を透過するバンドパスフィルターを用いて為されてよく、従って、所定の波長帯域は、実質的に５１０ｎｍから５５０ｎｍまでの帯域であってよい。なお、バンドパスフィルターの透過波長帯域をヘモグロビンの光吸収が極大となる波長に適合するよう最適化することにより、血管の像のコントラストがより高くなることは理解されるべきである。 In the configuration of the present invention described above, the predetermined wavelength band is preferably a predetermined wavelength band including a wavelength at which the light absorption of hemoglobin is maximized. The light component in the band near the wavelength where the light absorption of hemoglobin is maximized is absorbed considerably by hemoglobin in the blood vessel, so the component in the vicinity of the maximum wavelength of light absorption in the return light is in other wavelength bands. As compared with this, it is greatly reduced. In this case, only the light intensity of the return light from the region where the blood vessel exists is greatly reduced, and when the return light is imaged, the contrast of the blood vessel image is considerably improved. Further, as shown in the embodiment, the limit of the wavelength band of the return light to a predetermined wavelength band is made by using a band pass filter that substantially transmits light from 510 nm to 550 nm. Well, therefore, the predetermined wavelength band may be substantially from 510 nm to 550 nm. It should be understood that the contrast of the blood vessel image can be increased by optimizing the transmission wavelength band of the band-pass filter to match the wavelength at which the light absorption of hemoglobin is maximized.
また、上記の本発明の構成に於いて、撮像手段はＲ成分（赤色成分）、Ｇ成分（緑色成分）及びＢ成分（青成分）を合成してなるカラー画像の取得が可能な撮像手段であってよく、これにより、観察領域全体の画像が白色光の戻り光にて得られ、撮像手段の画像上に於いて、観察領域全体の状況が把握し易くなる。その場合、血管と血管外組織の像のコントラストが顕著に表れるのは、Ｇ成分の画像になるので、カラー画像の前記Ｇ成分の像が、前記の撮像手段により得られた組織の観察領域の血管の像として採用されるようになっていてよい。 In the above-described configuration of the present invention, the imaging means is an imaging means capable of acquiring a color image formed by combining the R component (red component), the G component (green component), and the B component (blue component). Accordingly, an image of the entire observation region can be obtained by the white light return light, and the state of the entire observation region can be easily grasped on the image of the imaging unit. In this case, the contrast between the image of the blood vessel and the extravascular tissue is noticeable in the G component image. Therefore, the G component image of the color image is an image of the tissue observation region obtained by the imaging means. It may be adopted as an image of a blood vessel.
上記の本発明の方法によれば、実施例に示されている如く、非常にコントラストのよい血管像が得られる。そこで、更に、得られた組織の観察領域の血管の像に基づいて、血管の直径、分岐数又は面積を測定する過程が実行されるようになっていてよく、それらの結果は、種々の実験の評価に用いられてよい。 According to the above-described method of the present invention, a blood vessel image with very good contrast can be obtained as shown in the embodiment. Therefore, a process of measuring the diameter, the number of branches, or the area of the blood vessel may be executed based on the blood vessel image of the obtained observation region of the tissue. May be used to evaluate
上記の本発明の方法は、観察領域を白色光にて照明して、観察者による領域の全体の状況の把握を容易にしながら、簡便な手法にてコントラストの高い血管像の取得を可能にするものであるということができる。本発明によれば、例えば、観察領域に於いて手術等の処置を施す際、観察者は、血管像で血管の構造を確認しながら、白色光で照らされた観察領域に於いて種々の操作が行いやすくなるという利点が得られる（狭帯域光観察による方法の如く照明光を単色光にすると、観察者にとって観察領域が見づらくなってしまう。）。従って、本発明の方法は、手術用顕微鏡による観察に於いて適用されてよい。また、バンドパスフィルターを用いて戻り光の波長帯域の所定の波長帯域への制限を行う態様によれば、撮像手段の光の入射口の手前に於いてバンドパスフィルターを出し入れするだけで、コントラストの高い血管像の取得が可能となり、観察者は、通常の明視野画像と血管の像が強調された画像とを容易に観察することが可能となり、有利である。かくして、本発明によれば、従前に比して、より簡便に、種々の態様にて、或いは、広範囲にて、血管の構造又は形成の観測を含む実験が実施できるようになることが期待される。 The above-described method of the present invention illuminates the observation area with white light, and makes it possible to obtain a high-contrast blood vessel image by a simple method while making it easy for the observer to grasp the overall state of the area. It can be said that it is a thing. According to the present invention, for example, when performing a procedure such as surgery in the observation region, the observer performs various operations in the observation region illuminated with white light while confirming the blood vessel structure in the blood vessel image. (If the illumination light is monochromatic light as in the narrow band light observation method, it is difficult for the observer to see the observation region). Therefore, the method of the present invention may be applied in observation with a surgical microscope. Further, according to the aspect of limiting the wavelength band of the return light to the predetermined wavelength band using the band pass filter, the contrast can be obtained only by inserting and removing the band pass filter in front of the light incident port of the imaging means. It is possible to acquire a high blood vessel image, and an observer can easily observe a normal bright field image and an image in which a blood vessel image is emphasized, which is advantageous. Thus, according to the present invention, it is expected that an experiment including observation of the structure or formation of blood vessels can be performed more easily and in various modes or in a wider range than before. The
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。 Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following description of preferred embodiments of the present invention.
以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。 The present invention will now be described in detail with reference to a few preferred embodiments with reference to the accompanying drawings.
観察方法の概要
本発明による実験用小動物の組織の観察方法は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験用小動物の個体、胚などの生きた生物試料又はそのような生物試料から摘出された臓器などの組織の、血管の構造及び形成過程の観察を含む任意の観察又は計測の一部として実行されてよい。例えば、本発明の方法は、胚に於ける血管新生、成体に於ける腫瘍の成長・増殖・転移・死滅に於ける血管新生又は消滅のメカニズムを解明するため、或いは、任意の薬剤の検査又は評価の情報を得るための、実験用小動物に検査されるべき薬剤を与えて動物内に形成した腫瘍細胞の成長、増殖、転移又は死滅の過程を観測することにより薬剤の作用を評価するといったモデル実験に於いて、腫瘍近傍の血管の新生若しくはその阻害又は消滅の過程の観察又は計測をする場合に採用されてよい。これらの場合、本発明の方法により得られた血管の像から更に、血管の直径、分岐数、面積が経時的に計測され、血管の新生若しくはその阻害又は消滅が判定され或いは考察されることとなる。また、本発明の方法では、以下に述べられる如く、観察される試料が白色光にて照明されるので、観察対象に対して手術等の処置を行う際に観察対象の状態の把握が容易であり、有利である。
Outline of Observation Method The method for observing the tissue of an experimental small animal according to the present invention includes an individual of an experimental small animal such as a mouse, rat, guinea pig, and rabbit, a living biological sample such as an embryo, or an organ extracted from such a biological sample. May be performed as part of any observation or measurement, including observation of the structure and formation process of blood vessels, such as tissue. For example, the method of the present invention can be used to elucidate the mechanism of angiogenesis or extinction in angiogenesis in the embryo, tumor growth, proliferation, metastasis, and death in the adult, A model that evaluates the action of a drug by observing the process of growth, proliferation, metastasis, or death of tumor cells formed in the animal by giving the drug to be examined to a small experimental animal in order to obtain evaluation information In the experiment, it may be adopted when observing or measuring the process of neovascularization or inhibition or extinction of blood vessels in the vicinity of a tumor. In these cases, the diameter, the number of branches, and the area of the blood vessel are further measured over time from the blood vessel image obtained by the method of the present invention, and the neovascularization or its inhibition or disappearance is determined or considered. Become. Further, in the method of the present invention, as described below, since the observed sample is illuminated with white light, it is easy to grasp the state of the observation target when performing a procedure such as surgery on the observation target. Yes, it is advantageous.
観察の手順
（ｉ）試料について
実験用小動物は、既に触れた如く、この分野で通常使用されているマウス、ラット、モルモット、ウサギ等の生きた成体又は胚などの生物試料や、そのような生物試料から摘出された臓器を含む任意の組織であってよい。また、任意の腫瘍細胞が任意の部位に公知の態様にて移植された生物試料が用いられてもよい。
Observation procedure (i) Samples As already mentioned, small experimental animals are biological samples such as living adults or embryos such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, etc., which are usually used in this field, and such organisms. It may be any tissue including an organ extracted from a sample. Alternatively, a biological sample in which an arbitrary tumor cell is transplanted to an arbitrary site in a known manner may be used.
（ii）観察装置について
観察を行うための装置の基本的な構成は、図１（Ａ）に例示されている如き、生物試料の明視野による顕微鏡観察が可能な任意のイメージング装置の構成であってよい。例えば、本実施形態に於いて、イメージング装置２０は、顕微鏡で得られる像をＣＣＤカメラ２６により撮影するよう構成された公知の任意の形式のイメージング装置（例えば、オリンパス社ＯＶ１００／１１０、ＩＶ１００など）であってよい。かかるイメージング装置２０に於いて、顕微鏡は、通常の形式の生物顕微鏡又は実体顕微鏡であってよく、そこに於いて、まず、ハロゲンランプ等の白色光を発する光源２４からの照明光Ｌが光ファイバ２４ｂを通して試料１０の観察領域上に照射される（照明光Ｌの光路に於いて赤外線又は紫外線をカットするためのフィルター２４ａが設けられていてよい。）。そして、観察領域からの戻り光又は反射光が対物レンズ系２２により集光され、観察者が直接に（肉眼で）領域の観察が可能となるようにハーフミラー２５により戻り光の一部が反射されて接眼レンズへ向けられ、また、ＣＣＤカメラ２６により領域の像の撮影が可能となるように戻り光の一部がハーフミラー２５を透過し、ＣＣＤカメラ２６の受光面（図示せず）に於いて試料の像が形成される。光源２４とＣＣＤカメラ２６の作動は、コントローラ３０により制御され、ＣＣＤカメラ２６で取得された画像は、通常の態様にてコントローラにより処理されて画像記録装置（図示せず）に記録され、画像は、モニター３０ａにて表示されるようになっていてよい。更に、コントローラは、取得された画像に於ける輝度値を取得し、輝度値が任意の画像処理等の演算処理に利用できるよう構成されたものであってよい。
(Ii) Observation apparatus The basic configuration of an observation apparatus is that of an arbitrary imaging apparatus capable of observing a biological sample in a bright field as illustrated in FIG. It's okay. For example, in the present embodiment, the imaging apparatus 20 is an arbitrary type of imaging apparatus (for example, Olympus OV100 / 110, IV100, etc.) configured to take an image obtained by a microscope with the CCD camera 26. It may be. In the imaging apparatus 20, the microscope may be a normal type biological microscope or a stereomicroscope, in which the illumination light L from the light source 24 that emits white light such as a halogen lamp is an optical fiber. The observation area of the sample 10 is irradiated through 24b (a filter 24a for cutting infrared rays or ultraviolet rays in the optical path of the illumination light L may be provided). Then, the return light or reflected light from the observation area is condensed by the objective lens system 22, and a part of the return light is reflected by the half mirror 25 so that the observer can observe the area directly (with the naked eye). Then, a part of the return light passes through the half mirror 25 so that the CCD camera 26 can take an image of the area, and passes to the light receiving surface (not shown) of the CCD camera 26. An image of the sample is formed there. The operation of the light source 24 and the CCD camera 26 is controlled by the controller 30, and the image acquired by the CCD camera 26 is processed by the controller in a normal manner and recorded in an image recording device (not shown). It may be displayed on the monitor 30a. Further, the controller may be configured to acquire a luminance value in the acquired image and use the luminance value for arithmetic processing such as arbitrary image processing.
かかるイメージング装置２０に於いて、特に、本発明の方法により、観察領域の血管の像を撮影する際には、観察領域（又はハーフミラー２５）とＣＣＤカメラ２６との間に、照明光の波長帯域内のうちの緑色光の所定の波長帯域、好ましくは、ヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む所定の波長帯域のみを実質的に透過するバイパスフィルター２８が取り外し可能に配置され、戻り光の波長帯域が制限される。既に触れた通り、実験用動物の組織に於いて特に血管量の豊富な領域の場合、白色光照明では、血管と血管外組織との像のコントラストが低く、血管構造を明瞭に写し出した画像を得ることは困難である。そこで、血管と血管外組織との像のコントラストを増大するために、照明光の波長帯域を緑色光の波長帯域に制限すれば、血管では緑色光が相対的に強く吸収されるため、血管と血管外組織との像のコントラストが高い画像を得ることが可能となるが、その場合、観察者の直接の領域の観察のために接眼レンズへ向けられる光も緑色光の波長帯域となってしまい、領域の全体的な状況を把握することが困難となり、手術等の処置が行い難くなってしまう。かくして、本発明では、上記の如く、照明光の波長制限をするのではなく、観察領域は、白色光で照明して、観察者の直接の領域の観察を容易にする状態を確保するとともに、ＣＣＤカメラ２６に向かう光のみ、血管と血管外組織との像のコントラストが増大するよう波長制限が為される。（なお、バイパスフィルター２８は、図中、破線２８’にて示されている如く、対物レンズ２２とハーフミラー２５との間に配置されてもよい。その場合でも、試料を目視する際には、観察領域は、白色光で照明されているので、状態が把握しやすくなっている。） In such an imaging apparatus 20, particularly when an image of a blood vessel in the observation region is taken by the method of the present invention, the wavelength of the illumination light is between the observation region (or the half mirror 25) and the CCD camera 26. A bypass filter 28 that substantially transmits only a predetermined wavelength band of green light within the band, preferably a predetermined wavelength band including a wavelength at which light absorption of hemoglobin is maximized, is detachably disposed, and the return light. Is limited. As already mentioned, especially in the regions of experimental animals where the amount of blood vessels is abundant, with white light illumination, the contrast between the images of the blood vessels and extravascular tissues is low, and an image that clearly displays the blood vessel structure can be obtained. It is difficult to get. Therefore, if the wavelength band of the illumination light is limited to the wavelength band of the green light in order to increase the contrast of the image between the blood vessel and the extravascular tissue, the green light is relatively strongly absorbed in the blood vessel. Although it is possible to obtain an image with a high contrast of the image with the extravascular tissue, in that case, the light directed to the eyepiece for observing the direct region of the observer is also in the wavelength band of green light. This makes it difficult to grasp the overall situation of the region, and makes it difficult to perform a procedure such as surgery. Thus, in the present invention, as described above, the wavelength of the illumination light is not limited, but the observation area is illuminated with white light to ensure a state that facilitates observation of the direct area of the observer, Only the light directed to the CCD camera 26 is wavelength-limited so that the contrast of the image between the blood vessel and the extravascular tissue is increased. (Note that the bypass filter 28 may be disposed between the objective lens 22 and the half mirror 25 as indicated by a broken line 28 'in the drawing. The observation area is illuminated with white light, so the state is easy to grasp.)
図１（Ｂ）上段、中段は、イメージング装置２０に於ける光源（ハロゲンランプ）２４の発光波長特性、バイパスフィルター２８の透過光波長特性をそれぞれ示したものである。図から理解される如く、本実施形態では、照明光の波長が略可視光領域全般に亙るようにすることにより、観察領域の状態は、観察者の直接の観察に適したものとなり、カメラ２６へ向かう光は、バイパスフィルター２８により緑色光のみ（図示の例では、実質的に５１０〜５５０ｎｍの領域のみ）に制限され、これにより、カメラで形成される像は、血管と血管外組織との像のコントラストが高いものとなる。 1B shows the emission wavelength characteristics of the light source (halogen lamp) 24 and the transmitted light wavelength characteristics of the bypass filter 28 in the imaging apparatus 20, respectively. As understood from the figure, in this embodiment, the wavelength of the illumination light extends over the entire visible light region, so that the state of the observation region is suitable for direct observation by the observer, and the camera 26. The light going to the camera is limited to only green light by the bypass filter 28 (in the illustrated example, substantially only the region of 510 to 550 nm), so that the image formed by the camera The contrast of the image is high.
なお、ＣＣＤカメラ２６は、好適には、カラーＣＣＤカメラ、即ち、像のＲＧＢ成分を別々に取得し、これらを合成してカラー画像を形成する形式のカメラであってよい。その場合、例えば、図１（Ｂ）の下段に示されている如き波長帯域を有するＲ成分、Ｇ成分、Ｂ成分の像がカメラにより別々に形成される。ここに於いて、バイパスフィルター２８を透過してくる光成分は、主として、Ｇ成分に含まれるので、血管の画像としては、Ｇ成分の像が採用されてよく、かかるＧ成分の像を用いて、血管の直径、分岐数、面積などが計測されてよい。 The CCD camera 26 may preferably be a color CCD camera, that is, a camera of a type that obtains RGB components of an image separately and combines them to form a color image. In that case, for example, R, G, and B component images having wavelength bands as shown in the lower part of FIG. 1B are separately formed by the camera. Here, since the light component transmitted through the bypass filter 28 is mainly contained in the G component, an image of the G component may be adopted as the blood vessel image, and the image of the G component is used. The diameter, the number of branches, the area, etc. of the blood vessel may be measured.
（iii）血管像の観察について
上記の装置を用いて生物試料を観察する際には、所望の領域が対物レンズの視野に入るように、試料１０がイメージング装置の試料台１０ａに配置され、照明光が照射され、接眼レンズによって領域の状態が観察される一方で、ＣＣＤカメラ２６により血管像が撮影される。かかる血管像に於いては、既に触れた通り、実質的に緑色光のみにより像形成が為されているところ、血管の存在領域では、ヘモグロビンの光吸収の作用により緑色光が減衰しているので、血管の輝度のみが周囲に比して低くなり、これにより、血管の像が把握されることとなる。かくして、撮影された像は、画像処理装置に於いて画像データとして取り込まれ、バックグラウンド補正、シェーディング補正等の公知の画像補正処理が施される。そして、得られた画像から、任意の手法により、血管の直径、分岐数、面積が計測されてよい。［より厳密には、ここで、撮影される血管像は、試料の表層の血管の像となる。本実施形態では、カメラに入射される光が緑色光（５１０〜５５０ｎｍ）に制限されているところ、緑色光は、生体試料の深部まで到達せず、表層で反射される。従って、緑色光で形成される像は、生体試料の表層の像であるので、ここで得られる血管像は、表層の血管の像である。なお、戻り光を、ヘモグロビンの、より短波長側の吸収波長（４００〜４５０ｎｍ）、より詳細には、吸収極大波長に制限しても或る程度の高いコントラストでの観察が可能である。その場合、写し出される像は、より表層の血管の像となろう。］
(Iii) Observation of blood vessel image When observing a biological sample using the above-described apparatus, the sample 10 is placed on the sample stage 10a of the imaging apparatus so that a desired region falls within the field of view of the objective lens. Light is irradiated and the state of the region is observed by the eyepiece, while a blood vessel image is taken by the CCD camera 26. In this blood vessel image, as already mentioned, an image is formed substantially only with green light, but in the region where the blood vessel exists, the green light is attenuated by the action of light absorption of hemoglobin. Only the luminance of the blood vessel is lower than that of the surroundings, whereby an image of the blood vessel is grasped. Thus, the photographed image is captured as image data in the image processing apparatus, and known image correction processing such as background correction and shading correction is performed. Then, the diameter, the number of branches, and the area of the blood vessel may be measured from the obtained image by an arbitrary method. [To be more precise, the blood vessel image to be photographed here is an image of a blood vessel on the surface layer of the sample. In this embodiment, when the light incident on the camera is limited to green light (510 to 550 nm), the green light does not reach the deep part of the biological sample and is reflected by the surface layer. Therefore, since the image formed with green light is an image of the surface layer of the biological sample, the blood vessel image obtained here is an image of the blood vessel of the surface layer. Note that even if the return light is limited to the absorption wavelength (400 to 450 nm) on the shorter wavelength side of hemoglobin, more specifically, the absorption maximum wavelength, observation with a certain degree of contrast is possible. In that case, the projected image will be a more superficial blood vessel image. ]
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。 In order to verify the effectiveness of the present invention described above, the following experiment was conducted. It should be understood that the following examples illustrate the effectiveness of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
本実施例に於いては、生きたラットの肝臓の血管をｉｎ ｖｉｖｏ観察した。操作処理過程は、以下の通りとした。 In this example, the liver blood vessels of live rats were observed in vivo. The operation process was as follows.
１．試料の準備として、健常Ｆ３４４雄ラットに気化麻酔（イソフランを使用）により麻酔をかけた後、開腹して肝臓を露出させた。
２．イメージング装置ＯＶ１００（オリンパス社）に於いて、露出された肝臓を明視野観察した。照明光光源として、１００ＷハロゲンランプＬＧ−ＰＳ２を用い（発光波長特性は、図１（Ｂ）上段）、対物レンズを１．６７倍に設定した。検出装置として、カラーＣＣＤカメラ（ＤＰ７１、オリンパス社）を用い（ＲＧＢ各成分の応答波長特性は、図１（Ｂ）下段）、血管像の撮影に於いては、適宜、カメラの入射光路に緑色バンドパスフィルター（ＢＡ５１０−５５０、透過光波長特性は、図１（Ｃ）中段）を配置した。
1. As a sample preparation, healthy F344 male rats were anesthetized by vaporization anesthesia (using isoflurane) and then laparotomized to expose the liver.
2. In the imaging apparatus OV100 (Olympus), the exposed liver was observed in bright field. A 100 W halogen lamp LG-PS2 was used as the illumination light source (the emission wavelength characteristic is the upper part of FIG. 1B), and the objective lens was set to 1.67 times. As a detection device, a color CCD camera (DP71, Olympus) is used (response wavelength characteristics of RGB components are shown in the lower part of FIG. 1B). A band-pass filter (BA510-550, transmitted light wavelength characteristics: middle stage in FIG. 1C) was disposed.
図２は、ラットの肝臓の明視野像を示している。同図に於いて、上段（Ａ）は、本発明の方法に従って、緑色バンドパスフィルター（ＧＦ）を用いて、撮影した像であり、下段（Ｂ）は、ＧＦを用いずに撮影した像である。図から理解される如く、全体像（ＲＧＢ合成）について、（Ａ）、（Ｂ）のものを比較すると、（Ｂ）の像に比して、（Ａ）の像に於いて、血管の構造が明瞭に観察された。更に、それぞれ、全体像中の枠内の部分について、Ｇ成分の像を比較すると、（Ａ）の像に於いて、血管の像のコントラストは、更に高くなった。かかるＧ成分の像を二値化すると（画像処理は、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いてバックグラウンド減算処理を施した後、適当な閾値にて二値化した。）、（Ａ）の像に於いて、（Ｂ）の像に比して、血管の構造が明瞭に検出された。 FIG. 2 shows a bright field image of the rat liver. In the figure, the upper part (A) is an image taken using a green bandpass filter (GF) according to the method of the present invention, and the lower part (B) is an image taken without using GF. is there. As understood from the figure, when comparing the whole image (RGB composition) with those of (A) and (B), the structure of blood vessels in the image of (A) compared to the image of (B). Was clearly observed. Further, when the G component images were compared with respect to the portion in the frame in the whole image, the contrast of the blood vessel image was further increased in the image of (A). When the image of the G component is binarized (the image processing is performed by performing background subtraction using image processing software ImageJ and then binarized at an appropriate threshold), the image of (A) In comparison with the image of (B), the blood vessel structure was clearly detected.
本実施例に於いては、ラットから摘出された心臓の血管を観察した。操作処理過程は、以下の通りとした。 In this example, the blood vessels of the heart extracted from the rat were observed. The operation process was as follows.
１．試料の準備として、健常Ｆ３４４雄ラットを安楽死させた直後に心臓を摘出した。
２．イメージング装置ＯＶ１００に於いて、摘出された心臓を明視野観察した。照明光光源として、１００ＷハロゲンランプＬＧ−ＰＳ２を用い、対物レンズを２倍に設定した。検出装置として、カラーＣＣＤカメラ（ＤＰ７１）を用い、血管像の撮影に於いては、適宜、カメラの入射光路に緑色バンドパスフィルターを配置した。
1. As a sample preparation, the heart was removed immediately after euthanizing healthy F344 male rats.
2. In the imaging apparatus OV100, the extracted heart was observed in a bright field. A 100 W halogen lamp LG-PS2 was used as the illumination light source, and the objective lens was set to double. A color CCD camera (DP71) was used as the detection device, and a green bandpass filter was appropriately disposed in the incident light path of the camera in taking a blood vessel image.
図３は、ラットの心臓の明視野像を示している。同図に於いて、上段（Ａ）は、本発明の方法に従って、緑色バンドパスフィルター（ＧＦ）を用いて、撮影した像であり、下段（Ｂ）は、ＧＦを用いずに撮影した像である。図から理解される如く、（Ａ）、（Ｂ）のそれぞれに於いて、ＲＧＢ合成像とＧ成分像とを比較して、Ｇ成分像に於いて、血管の像が明瞭であることが観察され、（Ａ）の像と（Ｂ）の像とを比較して、（Ａ）の像に於いて、より明瞭に血管の像が高いコントラストにて写し出されている様子が観察できる。かかるＧ成分の像を実施例１と同様に二値化すると（Ａ）の像に於いて、（Ｂ）の像に比して、血管の構造が細部に亙って検出された。 FIG. 3 shows a bright field image of the rat heart. In the figure, the upper part (A) is an image taken using a green bandpass filter (GF) according to the method of the present invention, and the lower part (B) is an image taken without using GF. is there. As understood from the figure, in each of (A) and (B), the RGB composite image and the G component image are compared, and it is observed that the blood vessel image is clear in the G component image. Then, by comparing the image of (A) and the image of (B), it can be observed that the image of the blood vessel is more clearly projected with high contrast in the image of (A). When the G component image was binarized in the same manner as in Example 1, the structure of the blood vessel was detected in detail in the image of (A) compared to the image of (B).
本実施例に於いては、生きたラットの甲状腺の血管をｉｎ ｖｉｖｏ観察した。実験に於いては、健常ラットの甲状腺と、甲状腺二段階発がんモデルラットの甲状腺をそれぞれ観察した。操作処理過程は、以下の通りとした。 In this example, the thyroid blood vessels of live rats were observed in vivo. In the experiment, the thyroid gland of a healthy rat and the thyroid gland of a two-stage carcinogenic model rat were observed. The operation process was as follows.
１．試料の準備として、発がんモデルラットは、６週齢のＦ３４４雄ラットにイニシエーターとしてＤＨＰＮを皮下投与し、１週間後にプロモーターとしてＳＤＭを２４週間飲水投与して作成した。かくして、作成した発がんモデルラットと健常Ｆ３４４雄ラットのそれぞれに気化麻酔（イソフランを使用）により麻酔をかけた後、切開して甲状腺を露出させた。
２．イメージング装置ＯＶ１００に於いて、露出された甲状腺を明視野観察した。照明光光源として、１００ＷハロゲンランプＬＧ−ＰＳ２を用い、対物レンズを０．５６倍に設定した。検出装置として、カラーＣＣＤカメラ（ＤＰ７１）を用い、血管像の撮影に於いては、適宜、カメラの入射光路に緑色バンドパスフィルターを配置した。
1. As a sample preparation, carcinogenic model rats were prepared by subcutaneously administering DHPN as an initiator to a 6-week-old F344 male rat, and administering SDM as a promoter for 24 weeks after drinking water for one week. Thus, the carcinogenic model rat and the healthy F344 male rat were each anesthetized by vaporization anesthesia (using isoflurane) and then incised to expose the thyroid gland.
2. In the imaging apparatus OV100, the exposed thyroid gland was observed in a bright field. A 100 W halogen lamp LG-PS2 was used as the illumination light source, and the objective lens was set to 0.56 times. A color CCD camera (DP71) was used as the detection device, and a green bandpass filter was appropriately disposed in the incident light path of the camera in taking a blood vessel image.
図４は、健常ラットの甲状腺の明視野像を、図５は、発がんモデルラットの甲状腺の明視野像を、それぞれ、示している。各図に於いて、上段（Ａ）は、本発明の方法に従って、緑色バンドパスフィルター（ＧＦ）を用いて、撮影した像であり、下段（Ｂ）は、ＧＦを用いずに撮影した像である。図４及び図５から理解される如く、（Ａ）、（Ｂ）のそれぞれに於いて、ＲＧＢ合成像とＧ成分像とを比較して、Ｇ成分像に於いて、血管の像が明瞭であることが観察され、（Ａ）の像と（Ｂ）の像とを比較して、（Ａ）の像に於いて、より明瞭に血管の像が高いコントラストにて写し出されている様子が観察できる。かかるＧ成分の像を、それぞれ、実施例１と同様に二値化すると、（Ａ）の像に於いて、（Ｂ）の像に比して、血管の構造が細部に亙って検出された。そこで、図５（Ａ）、（Ｂ）の二値化画像に於いて、実線枠内のシグナル領域（黒色領域）の面積を算出したところ（画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用）、ＧＦを用いたときの血管像の面積は、ＧＦを用いないときの面積の略２倍の値となった（図６参照）。このことは、ＧＦを用いることにより、血管の像をより細部まで捉えることが可能となったことを示している。また、図４（Ａ）の二値化像と図５の（Ａ）の二値化像を比較して、発がんモデルラットの甲状腺に於いて、血管新生が亢進している様子が、図４（Ｂ）の二値化像と図５の（Ｂ）の二値化像を比較する場合よりも、明瞭に観察することが可能であった。 FIG. 4 shows a bright field image of the thyroid gland of a healthy rat, and FIG. 5 shows a bright field image of the thyroid gland of a carcinogenic model rat. In each figure, the upper (A) is an image taken using a green bandpass filter (GF) according to the method of the present invention, and the lower (B) is an image taken without using GF. is there. As can be understood from FIGS. 4 and 5, the RGB composite image and the G component image are compared in each of (A) and (B), and the blood vessel image is clear in the G component image. The image of (A) is compared with the image of (B), and it is observed that the image of the blood vessel is projected more clearly in the image of (A) with high contrast. it can. When each G component image is binarized in the same manner as in the first embodiment, the blood vessel structure is detected in detail in the image of (A) compared to the image of (B). It was. Therefore, in the binarized images of FIGS. 5A and 5B, the area of the signal region (black region) within the solid line frame is calculated (using image processing software ImageJ), and when GF is used. The area of the blood vessel image was approximately twice the area when GF was not used (see FIG. 6). This indicates that the use of GF makes it possible to capture a blood vessel image in more detail. Further, comparing the binarized image of FIG. 4A and the binarized image of FIG. 5A, it is shown that the angiogenesis is enhanced in the thyroid gland of the carcinogenic model rat. It was possible to observe clearly compared with the case where the binarized image of (B) and the binarized image of (B) of FIG. 5 are compared.
かくして、上記の実施例から、実験用小動物の観察に於いて、観察試料に照明光として白色光を当てながら、カメラ前に戻り光波長を緑色光に制限するバンドパスフィルターにて制限することにより、簡便にコントラストの高い血管の像を捉えることができることが示された。かかる構成によれば、観察試料に照明光として白色光を当てられているので、例えば、観察者は、血管の像の撮影中に、接眼レンズにて白色光で照明された試料を観察ながら、切開領域を広げたり、試料の向きを変えるといった操作を容易に行うことが可能となる。 Thus, from the above examples, in observing small experimental animals, while applying white light as the illumination light to the observation sample, by returning to the front of the camera with a bandpass filter that limits the light wavelength to green light. It was shown that a high-contrast blood vessel image can be easily captured. According to such a configuration, since the observation sample is irradiated with white light as illumination light, for example, an observer observes the sample illuminated with white light with an eyepiece lens while photographing a blood vessel image. Operations such as expanding the incision area and changing the direction of the sample can be easily performed.
以上の説明は、本発明の実施の形態に関連してなされているが、当業者にとつて多くの修正及び変更が容易に可能であり、本発明は、上記に例示された実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の概念から逸脱することなく種々の方法に適用されることは明らかであろう。 Although the above description has been made in relation to the embodiment of the present invention, many modifications and changes can be easily made by those skilled in the art, and the present invention is limited to the embodiment exemplified above. It will be apparent that the invention is not limited and applies to various methods without departing from the inventive concept.
例えば、上記の実施例に於いて、バンドパスフィルターは、任意に出し入れできるようになっていてよく、これにより、簡便に、観察領域のカラー画像と血管像を切り換えることができるようになっていてよい。また、ハーフミラー２５に代えて、戻り光の光路の向きを接眼レンズ側とカメラ側との間で任意に切り換えられる切換ミラーが用いられていてもよい。本発明の方法の原理、即ち、撮像手段へ入射する戻り光の波長帯域を照明光の波長帯域内の緑色光の波長帯域又はヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む所定の帯域に狭められるよう制限し、これにより、高コントラストの血管の像を得るという原理は、実験用動物の観察だけでなく、任意の生体の組織に於ける血管の観察に於いても適用可能であることは理解されるべきである。 For example, in the above-described embodiment, the bandpass filter may be arbitrarily inserted and removed so that the color image and the blood vessel image in the observation region can be easily switched. Good. Instead of the half mirror 25, a switching mirror that can arbitrarily switch the direction of the optical path of the return light between the eyepiece lens side and the camera side may be used. The principle of the method of the present invention, that is, the wavelength band of the return light incident on the imaging means is narrowed to a predetermined band including the wavelength band of green light within the wavelength band of illumination light or the wavelength at which the absorption of hemoglobin is maximized. It is understood that the principle of obtaining a high-contrast blood vessel image can be applied not only to observation of experimental animals but also to observation of blood vessels in any living tissue. It should be.
１０…試料（実験用小動物）
２０…イメージング装置
２２…対物レンズ系
２４…光源
２５…ハーフミラー
２６…ＣＣＤカメラ
２６ａ…検出光用フィルター
２８…バンドパスフィルター
３０…コントローラ
３０ａ…モニター
10 ... Sample (small experimental animal)
DESCRIPTION OF SYMBOLS 20 ... Imaging apparatus 22 ... Objective lens system 24 ... Light source 25 ... Half mirror 26 ... CCD camera 26a ... Filter for detection light 28 ... Band pass filter 30 ... Controller 30a ... Monitor
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Cited By (2)
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| CN113057743A (en) * | 2017-03-16 | 2021-07-02 | 卡尔蔡司医疗技术股份公司 | Operating microscope |
| US11543747B2 (en) | 2017-03-24 | 2023-01-03 | Fujifilm Corporation | Composition, color filter, and hemoglobin sensor |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20121106 |