JP2011041552A - Collagen vitrigel having suppressed calcium phosphate deposition - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、リン酸カルシウムの沈着を抑制したコラーゲンビトリゲルに関するものである。 The present invention relates to a collagen vitrigel that suppresses the deposition of calcium phosphate.
一般に、動物細胞の培養は、培養担体としてプラスチックシャーレを用いて２次元培養を行うが、特に初代培養細胞では、継代維持を繰り返すことにより、元来の細胞の機能発現を維持できなくなることがある。これに対して、細胞を３次元的に培養すると、その細胞が有している組織特異的機能を向上させ、維持できることが知られている。
このような３次元培養を行う手段としては、中空糸を利用して細胞を多層化培養する方法、多数のビーズ担体の周囲に細胞を培養する方法、ＰＵＦをはじめとするスポンジ担体の多孔質内で細胞を凝集培養する方法、温度感受性培養担体等の機能性培養担体を利用した多細胞性球状凝集塊（スフェロイド）培養法、ガーゼ等の通液性培養担体を用いた多細胞性再構築体の培養法、生体内臓器の細胞の足場である細胞外マトリックスを連続的３段階灌流法により培養担体に改変して臓器をまるごと培養する器官工学の技術を利用した培養法、および生体の組織を複雑な構造とその構成成分を保持している動物組織の切片から成る培養担体上で細胞を培養する方法等が知られている。
In general, animal cells are cultured in a two-dimensional culture using a plastic petri dish as a culture carrier. In particular, primary cultured cells may not maintain the original functional expression of cells by repeated passage maintenance. is there. In contrast, it is known that when cells are cultured three-dimensionally, the tissue-specific functions of the cells can be improved and maintained.
As a means for performing such three-dimensional culture, a method of culturing cells in layers using hollow fibers, a method of culturing cells around a large number of bead carriers, a porous carrier of a sponge carrier such as PUF, etc. A method for agglutinating and culturing cells, a multicellular spherical aggregate (spheroid) culture method using a functional culture carrier such as a temperature-sensitive culture carrier, and a multicellular reconstituted body using a liquid culture carrier such as gauze A culture method using an organ engineering technique for transforming an extracellular matrix, which is a scaffold for cells of an organ in a living body, into a culture carrier by a continuous three-stage perfusion method, and culturing the whole organ; A method of culturing cells on a culture carrier composed of a section of animal tissue holding a complicated structure and its constituent components is known.
上述したような種々の３次元培養法の中でも、特にコラーゲンの細胞外マトリックス構成成分を用いた培養方法は、細胞の分化誘導に優れているのみならず、上皮間充織細胞からなる皮膚等のオルガノイドを再構築できること、血管内皮細胞による血管新生モデルを構築できること、ガン細胞によるガン浸潤モデルを構築できることから、その有用性が実証されてきた。 Among the various three-dimensional culture methods as described above, the culture method using the extracellular matrix component of collagen is not only excellent in inducing differentiation of cells, but also in skin made of epithelial mesenchymal cells, etc. Its usefulness has been demonstrated because it can reconstruct organoids, can build an angiogenesis model with vascular endothelial cells, and can build a cancer invasion model with cancer cells.
しかしながら、コラーゲンゲルなどのハイドロゲルから成る３次元培養担体は、その調製作業の操作も煩雑であり、それを用いた３次元培養、さらに培養細胞の観察も困難であるという欠点があった。すなわち、コラーゲンゲルは、その調製時に、塩濃度、pHおよび温度の管理が必須であるが、特に温度は、ピペッティング操作などの際に低温を維持することが難しく、操作中にピペット内でゲル化が始まるなどの困難さがあった。 However, a three-dimensional culture carrier composed of a hydrogel such as collagen gel has a drawback that the preparation operation is complicated, and three-dimensional culture using the carrier and observation of cultured cells are difficult. That is, when preparing a collagen gel, it is essential to manage the salt concentration, pH, and temperature. However, it is difficult to maintain a low temperature particularly during pipetting operations, and the gel is not removed from the pipette during the operation. There were difficulties such as the start of conversion.
また、２種類の細胞を細胞外マトリックス構成成分のハイドロゲル培養担体を用いて共培養する手段としては、両方の細胞をゲル内に包埋培養する方法、一方の細胞をゲル内に培養し他方の細胞をゲル上に培養する方法、さらに両方の細胞をゲル上に共培養する方法が開発されてきたが、ハイドロゲルの表面と裏面に異なる細胞を共培養する方法は、片面に細胞を播種した後にハイドロゲル培養担体を裏返すことが困難であるがゆえに、これまで開発されていなかった。 In addition, as a means for co-culturing two types of cells using a hydrogel culture carrier that is an extracellular matrix component, a method in which both cells are embedded and cultured in a gel, one cell is cultured in a gel and the other is A method of culturing cells on the gel and a method of co-culturing both cells on the gel have been developed, but the method of co-culturing different cells on the front and back surfaces of the hydrogel is seeded on one side However, it has not been developed so far because it is difficult to turn the hydrogel culture carrier upside down.
そこで、竹澤等は細胞外マトリックス成分含有の溶液を保持体と共にゲル化させ、さらに乾燥させてガラス化し、次いで再水和することで保持体と一体化した細胞外マトリックス含有ハイドロゲル薄膜を作製する技術を報告した（特許文献１）。
すなわち、この技術は、細胞外マトリックス成分をはじめとするハイドロゲル培養担体が、柔らかく、取扱いが難しいこと等の問題点があることを解決すべく、ハイドロゲルよりも強度を高め、さらに支持体をつけることでその取扱いを簡便にしたものである。
しかしながら、この技術では、細胞外マトリックス含有ハイドロゲル薄膜を再現性良く作製するための条件が設定できておらず、また、充分な透明性を持たせることができていなかった。すなわち、特許文献１に記載された方法では、ハイドロゲル薄膜の強度をハイドロゲルよりも２倍程度上昇させることには成功していたものの、両面培養等の操作、もしくは細胞播種済みの状態での移動には、その強度は未だ不十分なものであった。また、顕微鏡観察にはハイドロゲル薄膜の透明性が必要であるが、特許文献１に記載の方法では、ハイドロゲル薄膜に濁りが残るという問題点があった。
Therefore, Takezawa et al. Make an extracellular matrix-containing hydrogel thin film integrated with the support by gelling the solution containing the extracellular matrix component together with the support, further drying and vitrifying, and then rehydrating. Technology was reported (Patent Document 1).
That is, in order to solve the problems that the hydrogel culture carrier including the extracellular matrix component is soft and difficult to handle, this technique increases the strength of the hydrogel and further supports the support. It is easy to handle by attaching.
However, with this technique, conditions for producing an extracellular matrix-containing hydrogel thin film with good reproducibility have not been set, and sufficient transparency has not been achieved. That is, although the method described in Patent Document 1 succeeded in increasing the strength of the hydrogel thin film about twice as much as that of the hydrogel, the operation such as double-sided culture or the state after cell seeding has been completed. The strength was still insufficient for movement. In addition, the transparency of the hydrogel thin film is necessary for microscopic observation, but the method described in Patent Document 1 has a problem that turbidity remains in the hydrogel thin film.
そして竹澤等は、上記特許文献１の欠点を克服するために、ハイドロゲルを十分時間乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜を報告した（特許文献２）。該薄膜の強度はハイドロゲルの強度より8倍に増加することができ、さらに該薄膜の400nmにおける吸光度をハイドロゲルの吸光度より60％減少させることができた。すなわち、特許文献２では、ハイドロゲル薄膜自体の透明度を向上させることに成功した。
また、竹澤等はこのハイドロゲル薄膜を新しい物性状態のゲルを意味する用語として、ビトリゲル（Vitrigel）という学術用語を設定した（参照：Takezawa T, et al., Cell Transplant. 13:463-473, 2004）。
これまでに、ビトリゲルの透明性を生かし、角膜上皮細胞を播種した後、ビトリゲルを角膜欠損患者に移植する方法は提案されていた。しかし、特許文献１および２で開示されている従来のコラーゲンビトリゲルでは、移植前の長期培養時に生じる白色物質の沈着についての知見がなく、白色物質の沈殿を防ぐことが出来なかった。
And Takezawa et al. Reported a hydrogel thin film prepared by rehydrating the hydrogel after it was vitrified by drying for a sufficient time in order to overcome the drawbacks of the above-mentioned Patent Document 1 (Patent Document 2). The strength of the thin film could be increased 8 times the strength of the hydrogel, and the absorbance of the thin film at 400 nm could be reduced by 60% from the absorbance of the hydrogel. That is, Patent Document 2 succeeded in improving the transparency of the hydrogel thin film itself.
Takezawa T, et al., Cell Transplant. 13: 463-473, also named Takezawa T, et al., Cell Transplant. 2004).
Heretofore, a method has been proposed in which the transparency of vitrigel is utilized and corneal epithelial cells are seeded, and then vitrigel is transplanted into a corneal defect patient. However, in the conventional collagen vitrigel disclosed in Patent Documents 1 and 2, there is no knowledge about the deposition of a white substance that occurs during long-term culture before transplantation, and the precipitation of the white substance cannot be prevented.
本発明者は、従来使用されているコラーゲンビトリゲルを使用して細胞を数日間、さらには長期間培養すると、コラーゲンビトリゲルに白色物質が沈着することを新たに発見した。
すなわち、コラーゲンハイドロゲルを十分乾燥させて得られたコラーゲンビトリゲル（従来のコラーゲンビトリゲル）を使用して、数日間、さらには長期間細胞を培養するとコラーゲンビトリゲルに白色物質の沈着が生じるという問題があった。
コラーゲンビトリゲル上では、種々の細胞培養が可能であり、特に細胞分化を目的とした培養では長期の培養が必要であるから、本発明者は、長期培養におけるコラーゲンビトリゲルの白色物質の沈着を防ぐ方法を提供することを解決すべき課題とした。加えて、長期間の培養でも白色物質の沈着を防ぐコラーゲンビトリゲルを提供することも解決すべき課題とした。
The present inventor newly discovered that when a cell is cultured for several days or even a long time using a conventionally used collagen vitrigel, a white substance is deposited on the collagen vitrigel.
That is, when collagen vitrigel obtained by sufficiently drying collagen hydrogel (conventional collagen vitrigel) is used and cells are cultured for several days or even for a long time, white matter is deposited on the collagen vitrigel. There was a problem.
Since various cell cultures are possible on collagen vitrigel, and long-term culture is necessary especially for culture aimed at cell differentiation, the present inventor has deposited white matter of collagen vitrigel in long-term culture. Providing a method to prevent it was an issue to be solved. In addition, another problem to be solved is to provide a collagen vitrigel that prevents the deposition of a white substance even during long-term culture.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、新規に「白色物質の主成分がリン酸カルシウムであること」を見出した。そして、コラーゲンビトリゲルを作製する培地、洗浄液及び細胞培養時の使用培地が長期間培養による白色物質の沈着に及ぼす影響について鋭意検討を重ねた結果、コラーゲンビトリゲル中に含有するカルシウム濃度及び／又はリン濃度を低減させることにより、長期間の培養でも白色物質の沈着を防ぐコラーゲンビトリゲルを提供することができた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have newly found that “the main component of the white substance is calcium phosphate”. And, as a result of intensive studies on the influence of the medium for producing collagen vitrigel, the washing solution and the medium used for cell culture on the deposition of white substances by long-term culture, the concentration of calcium contained in collagen vitrigel and / or By reducing the phosphorus concentration, it was possible to provide a collagen vitrigel that prevents the deposition of white substances even during long-term culture.
長期間の培養でも白色物質の沈着を防ぐことができるコラーゲンビトリゲルを提供することができた。本発明のコラーゲンビトリゲルは、長期培養を必要とする培養系、詳しくは、胚細胞培養、肝臓細胞培養、間葉系幹細胞の分化培養、さらに詳しくは透明性が重要となる角膜細胞分化の培養に好ましい。 It was possible to provide a collagen vitrigel that can prevent the deposition of a white substance even after long-term culture. The collagen vitrigel of the present invention is a culture system that requires long-term culture, specifically embryonic cell culture, liver cell culture, mesenchymal stem cell differentiation culture, and more particularly, culture of corneal cell differentiation in which transparency is important. Is preferable.
本発明者は、コラーゲンビトリゲルの長期培養にて得られた白色物質を解析し、白色物質の主成分がリン酸カルシウムであることを特定した。
さらに、本発明者は、上記知見を基にして、コラーゲンビトリゲル中に含有するカルシウム濃度及び／又はリン濃度を低減させることにより、長期間の培養でも白色物質の沈着を防ぐことができるコラーゲンビトリゲルを提供することに成功した。
The present inventor analyzed a white substance obtained by long-term culture of collagen vitrigel, and identified that the main component of the white substance was calcium phosphate.
Furthermore, based on the above findings, the present inventor has reduced the calcium concentration and / or phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel, thereby preventing the deposition of white matter even during long-term culture. Succeeded in providing Rigel.
（コラーゲンビトリゲル）
「コラーゲンビトリゲル」とは、コラーゲンゲルを乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製される細胞培養単体である（参照：インターネットURL：http://atg.ushop.jp/rika/hbin/collagen.htm）。
(Collagen Vitrigel)
“Collagen vitrigel” is a single cell culture produced by rehydration of collagen gel after drying and vitrification (Reference: Internet URL: http://atg.ushop.jp/rika/ hbin / collagen.htm).
（ガラス化）
「ガラス化（vitrification）」とは、鶏卵のタンパク質（白身）を熱変性させたもの（ハイドロゲル）を、十分乾燥することで固くて透明な物質に変えるガラス化技術（Ｔａｋｕｓｈｉ Ｅ．，Ｅｄｉｂｌｅ ｅｙｅｂａｌｌｓ ｆｒｏｍ ｆｉｓｈ．Ｎａｔｕｒｅ３４５，２９８，１９９０）で定義される。
(Vitrification)
“Vitrification” means vitrification technology (Takushi E., Editable Eyeballs) that transforms a protein (white gel) of a chicken egg that has been heat-denatured (hydrogel) into a hard and transparent substance by sufficiently drying. from fish.Nature 345,298, 1990).
（乾燥方法）
コラーゲンビトリゲルの「乾燥方法」としては、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができるが、特に限定されない。
なお、上記風乾の方法としては、10℃、40％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、もしくは無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等といった方法がある。さらに、風乾後は無菌状態を保ったままで、室温もしくは4℃で無菌的に保管する。この保管時間が１ヶ月以上になると、強度・透明度が有意に上昇することが確認されている。
(Drying method)
As a “drying method” for collagen vitrigel, there are various methods such as air drying, drying in a sealed container (circulating the air in the container and always supplying dry air), and drying in an environment where silica gel is placed. Although it can be used, it is not particularly limited.
Examples of the air drying method include drying in an incubator kept sterile at 10 ° C. and 40% humidity for 2 days, or drying at room temperature all day and night in a clean bench. Furthermore, after air-drying, store aseptically at room temperature or 4 ° C while maintaining aseptic conditions. It has been confirmed that when the storage time is one month or more, the strength and transparency are significantly increased.
（乾燥時間）
コラーゲンビトリゲルを充分に乾燥させる時間は、その含有水分量の違いによって異なるが、圧縮破壊強度、透明度、重量の変化を検討した結果、コラーゲンビトリゲル乾燥体の乾燥重量が、コラーゲンゲル重量の１／５０〜１／１００に減少する範囲となるように乾燥時間を設定することにより、強度及び透明性に優れた薄膜を作製することができる。
(Drying time)
The time for sufficiently drying the collagen vitrigel differs depending on the moisture content, but as a result of examining changes in the compressive fracture strength, transparency, and weight, the dry weight of the collagen vitrigel is 1% of the collagen gel weight. By setting the drying time so as to fall within the range of / 50 to 1/100, a thin film excellent in strength and transparency can be produced.
（厚み）
コラーゲンビトリゲルの厚みを1μｍ〜1ｍｍの範囲で作製することが好ましい。なお、コラーゲンビトリゲルの厚みが1μｍより薄いと、必要な強度を得られない。一方、乾燥前のゲルの量を増やすことで、1ｍｍ以上の厚みのコラーゲンビトリゲルを作製することは可能であるが、乾燥させるのに長時間を要する。
加えて、コラーゲンビトリゲルの単位面積あたりのコラーゲン含有量は、100μｇ／ｃｍ２〜1ｍｇ／ｃｍ２、好ましくは約250μｇ／ｃｍ２が最適濃度である。コラーゲン含有量が100μｇ／ｃｍ２以下だと、コラーゲンの濃度が薄すぎてゲル化が弱く、充分な強度を有するコラーゲンビトリゲルを作製することができない。
(Thickness)
It is preferable to produce the collagen vitrigel in the range of 1 μm to 1 mm. If the thickness of the collagen vitrigel is thinner than 1 μm, the required strength cannot be obtained. On the other hand, it is possible to produce a collagen vitrigel having a thickness of 1 mm or more by increasing the amount of gel before drying, but it takes a long time to dry.
In addition, the optimum concentration of collagen per unit area of the collagen vitrigel is 100 μg / cm 2 to 1 mg / cm 2 , preferably about 250 μg / cm 2 . When the collagen content is 100 μg / cm 2 or less, the collagen concentration is too thin and gelation is weak, and a collagen vitrigel having sufficient strength cannot be produced.
（コラーゲン）
「コラーゲン」としては、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ及びタイプＶ等、いかなるタイプのコラーゲンもゲル化ができれば使用可能であるが、好ましくはタイプＩを使用する。
また、コラーゲンの溶解に用いる溶媒としては、コラーゲンが溶解し、コラーゲンを変質させるものでなければ特に限定されない。例えば、水、塩酸溶液、メチルアルコール、エチルアルコール、リン酸緩衝液、及びこれらを混合したものを用いることができる。
さらに、コラーゲンをゲル化する方法としては、コラーゲンを至適な塩濃度とpH（好ましくはpH6〜10）に調製し、至適温度（好ましくは37℃）でゲル化することができる。
(collagen)
As the “collagen”, any type of collagen such as type I, type II, type III and type V can be used as long as it can be gelled, but type I is preferably used.
The solvent used for dissolving the collagen is not particularly limited as long as it does not dissolve the collagen and alter the collagen. For example, water, hydrochloric acid solution, methyl alcohol, ethyl alcohol, phosphate buffer, and a mixture thereof can be used.
Furthermore, as a method for gelling collagen, collagen can be prepared at an optimum salt concentration and pH (preferably
（生理活性物質の添加）
コラーゲンビトリゲルが、ゲル構成要素である高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、またはゲル化しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、ビトロネクチン、エンタクチン、オステオポエチン等が挙げられる。また、これらを複数含有させることも可能である。
上記の様な生理活性物質を含んだコラーゲンビトリゲルは、まずゲル化する前のゲル構成高分子溶液に、含有させたい生理活性物質を混合し、その後、ゲル化・ガラス化等のコラーゲンビトリゲルの作製工程を経て作製することができる。これにより、細胞増殖・分化・接着などに必要な因子をコラーゲンビトリゲル側から供給することができるので、より良い培養環境を実現することができる。また、含有させた生理活性物質の細胞に対する影響を調べる試験を行うのに非常に有用である。
(Addition of bioactive substances)
Collagen vitrigel may have a physiologically active substance in addition to the polymer that is a gel component. Examples of this physiologically active substance include cell growth factor, differentiation-inducing factor, cell adhesion factor, antibody, enzyme, cytokine, hormone, lectin, or non-gelling extracellular matrix component such as fibronectin, vitronectin, entactin, osteopoietin, etc. Can be mentioned. It is also possible to contain a plurality of these.
Collagen vitrigel containing a physiologically active substance as described above is prepared by first mixing the physiologically active substance to be contained in the gel-constituting polymer solution before gelation, and then collagen vitrigel such as gelation and vitrification. It can be manufactured through the manufacturing process. Thereby, factors necessary for cell growth / differentiation / adhesion and the like can be supplied from the collagen vitrigel side, so that a better culture environment can be realized. Moreover, it is very useful for conducting a test for examining the effect of the contained physiologically active substance on cells.
（細胞培養担体としての利用）
コラーゲンビトリゲルは、培養容器に挿入して動物細胞を培養する細胞培養担体として用いることができる。培養する動物細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、受精卵、およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した細胞が挙げられる。さらに、それらの細胞が、未分化な幹細胞、分化過程にある細胞、終末分化した細胞、および脱分化した細胞であっても良い。また、それらの細胞の培養を開始する手段としては、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元再構築した多細胞性凝集塊の播種が挙げられる。つまり、既存の方法で培養できる接着性の細胞は本コラーゲンビトリゲル上で培養することが可能である。
また、上述したような動物細胞を、コラーゲンビトリゲルの片面はもちろんのこと、両面に１種類以上の細胞を培養することが可能である。さらに、両面培養においては、各々の面に異種の細胞を培養することが可能である。特に、コラーゲンビトリゲルの一方の面には上皮系細胞、他方の面には間充織細胞を培養することで、上皮間充織相互作用を有した経皮吸収モデルや腸管吸収モデルなど、また、一方の面には血管内皮細胞、他方の面にはガン細胞を培養することで、血管新生モデルやガン浸潤モデルなどの細胞機能アッセイを可能とする。
(Use as cell culture carrier)
Collagen vitrigel can be used as a cell culture carrier for culturing animal cells by inserting it into a culture vessel. Examples of animal cells to be cultured include primary cultured cells, established cells, fertilized eggs, and cells obtained by introducing a foreign gene into these cells. Furthermore, these cells may be undifferentiated stem cells, cells in the process of differentiation, terminally differentiated cells, and dedifferentiated cells. Moreover, as means for initiating the culture of these cells, seeding of cell suspension, minced tissue pieces, fertilized eggs, or three-dimensionally reconstructed multicellular aggregates can be mentioned. That is, adherent cells that can be cultured by existing methods can be cultured on the collagen vitrigel.
Moreover, it is possible to culture one or more types of cells on the both sides of the animal cell as described above as well as one side of the collagen vitrigel. Furthermore, in double-sided culture, it is possible to culture different types of cells on each side. In particular, by culturing epithelial cells on one side of the collagen vitrigel and mesenchymal cells on the other side, a percutaneous absorption model or intestinal absorption model with epithelial-mesenchymal interaction, etc. By culturing vascular endothelial cells on one surface and cancer cells on the other surface, cell function assays such as an angiogenesis model and a cancer invasion model are made possible.
（動物実験の代替）
さらに、コラーゲンビトリゲルを用いて培養した上皮間充織相互作用のある再構築体を、動物実験の代替モデル、培養臓器の開発および培養臓器の移植に適応することができる。コラーゲンビトリゲル担体のみで、臓器癒着防止に応用可能であるが、さらにコラーゲンビトリゲルの片面もしくは両面に細胞を培養し、かつその透明性を生かした角膜上皮細胞を播種した後、コラーゲンビトリゲルを角膜欠損患者へ移植する方法、あるいは高齢化社会に伴い、数回に渡る開腹手術により腹膜中皮組織が欠損し、腸管臓器癒着から腸閉塞等の合併症を引き起こす問題が起きているが、これに対し本培養担体上で腹膜のみならず胸膜、心膜の中皮を培養して、潤滑成分（ヒアルロン酸等）を分泌する優れた培養担体を移植することが可能となる。
(Alternative to animal experiments)
Furthermore, the reconstructed body with epithelial-mesenchymal interaction cultured using collagen vitrigel can be applied to an alternative model for animal experiments, development of cultured organs, and transplantation of cultured organs. Collagen vitrigel carrier alone can be applied to prevent organ adhesion, but after culturing cells on one or both sides of collagen vitrigel and seeding corneal epithelial cells taking advantage of its transparency, collagen vitrigel is used. With the method of transplanting to patients with corneal defects or with an aging society, several laparotomy operations have resulted in the loss of peritoneal mesothelial tissue, causing problems such as intestinal organ adhesion and complications such as intestinal obstruction. On the other hand, it is possible to culture not only the peritoneum but also the pleura and pericardial mesothelium on the main culture carrier and transplant an excellent culture carrier that secretes a lubricating component (such as hyaluronic acid).
（本発明のコラーゲンビトリゲルの作製方法）
本発明のコラーゲンビトリゲルは、上記従来のコラーゲンビトリゲルの特性を維持しつつ、従来のコラーゲンビトリゲルと比較して、含有するカルシウム濃度及び／又はリン濃度を低減させたものである。下記実施例から明らかなように、コラーゲンビトリゲルが含有するカルシウム濃度及び／又はリン濃度を予め低くしておけば、該コラーゲンを細胞培養の使用時に使用する培地及び緩衝液中のカルシウム濃度及び／又はリン濃度に影響されることなく、長期間に渡って白色物質の沈着を防ぐことができる。
よって、本発明のコラーゲンビトリゲルの作製方法は、該コラーゲンビトリゲルが含有するカルシウム濃度及び／又はリン濃度を低減させることができれば特に限定されない。
例えば、ドーナツ状の支持体を培養用シャーレに入れる。一方、コラーゲン水溶液を予めカルシウム濃度及び／又はリン濃度を低減させた作製培地に入れ、均一に混和する。混和したコラーゲン混合液を先の支持体を入れた培養用シャーレに入れた後、5％CO2／95％空気存在下の37℃の保湿インキュベーターで２時間維持してゲル化する。
さらに、このゲルをクリーンベンチ内で蓋をはずした状態で無菌的に数日間乾燥することでガラス化させる。ガラス化した乾燥コラーゲンビトリゲルにPBSを加えることで、再水和する。
さらに、再水和したコラーゲンビトリゲルを超純水又はPBSで洗浄する。なお、PBSで洗浄した場合には、さらには超純水で追加の洗浄を行うことが好ましい。
さらにクリーンベンチ内で蓋をはずした状態で無菌的に２日間完全に乾燥させ、コラーゲンビトリゲル乾燥体を得る。
その後、室温で無菌的に保管維持し、さらに、使用前に超純水、PBSもしくは使用する培養液で水和することでコラーゲンビトリゲルは作製される。また、シャーレの内壁を周囲に沿って先の鋭敏なピンセットでなぞることで、支持体がついた強度のあるコラーゲンビトリゲルとしてシャーレより脱着回収することが可能である。
(Method for producing the collagen vitrigel of the present invention)
The collagen vitrigel of the present invention has a reduced calcium concentration and / or phosphorus concentration as compared with the conventional collagen vitrigel while maintaining the properties of the conventional collagen vitrigel. As is apparent from the examples below, if the calcium concentration and / or phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel is previously reduced, the calcium concentration in the medium and buffer used when the collagen is used in cell culture and / or Or deposition of a white substance can be prevented over a long period of time without being affected by the phosphorus concentration.
Therefore, the method for producing the collagen vitrigel of the present invention is not particularly limited as long as the calcium concentration and / or phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel can be reduced.
For example, a donut-shaped support is placed in a culture dish. On the other hand, the collagen aqueous solution is put in a preparation medium in which the calcium concentration and / or phosphorus concentration is reduced in advance and mixed uniformly. The mixed collagen mixture is placed in a culture dish containing the above support and then gelled by maintaining in a 37 ° C. moisturizing incubator in the presence of 5% CO 2 /95% air for 2 hours.
Furthermore, this gel is vitrified by drying aseptically for several days with the lid removed in a clean bench. Rehydrate by adding PBS to vitrified dry collagen vitrigel.
Further, the rehydrated collagen vitrigel is washed with ultrapure water or PBS. In the case of washing with PBS, it is preferable to perform additional washing with ultrapure water.
Further, it is aseptically dried for 2 days with the lid removed in a clean bench to obtain a dried collagen vitrigel.
Thereafter, the collagen vitrigel is prepared by aseptically storing and maintaining at room temperature, and further hydrating with ultrapure water, PBS or a culture solution to be used before use. Further, by tracing the inner wall of the petri dish with the sharp tweezers along the circumference, it can be desorbed and collected from the petri dish as a strong collagen vitrigel with a support.
上記作製工程において、コラーゲンビトリゲル作製培地の含有カルシウム濃度は、好ましくは72mg/L未満であり、より好ましくは42mg/L未満であり、最も好ましくは12mg/L未満である。
しかしながら、カルシウム濃度の高い培地を用いても、その後の洗浄によりコラーゲンビトリゲルに含有するカルシウムを除去すれば良い。
In the preparation step, the calcium concentration in the collagen vitrigel preparation medium is preferably less than 72 mg / L, more preferably less than 42 mg / L, and most preferably less than 12 mg / L.
However, even if a medium having a high calcium concentration is used, the calcium contained in the collagen vitrigel may be removed by subsequent washing.
以上により、本発明のコラーゲンビトリゲルの好ましい作製方法を記載した。しかし、本発明のコラーゲンビトリゲルの作製方法は、公知のコラーゲンビトリゲルの作製工程に、コラーゲンビトリゲルが含有するカルシウム濃度、さらにはリン濃度を低減させる工程を追加すれば良い。 Thus, a preferred method for producing the collagen vitrigel of the present invention has been described. However, in the method for producing a collagen vitrigel of the present invention, a step of reducing the calcium concentration and further the phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel may be added to the known collagen vitrigel production step.
（コラーゲンビトリゲル乾燥体）
本発明の「コラーゲンビトリゲル乾燥体」とは、コラーゲンゲル重量の１／５０〜１／１００の範囲まで重量を減少させたものである。
また、コラーゲンビトリゲル乾燥体とは、上記「コラーゲンビトリゲル」を、好ましくは上記記載の乾燥方法で乾燥させて重量を減少させて得る。
(Dried collagen vitrigel)
The “collagen vitrigel dried product” of the present invention is one in which the weight is reduced to the range of 1/50 to 1/100 of the collagen gel weight.
The dried collagen vitrigel is obtained by reducing the weight by drying the “collagen vitrigel” preferably by the drying method described above.
（本発明のコラーゲンビトリゲル）
本発明のコラーゲンビトリゲルの含有するカルシウム濃度は、乾燥重量当たり0.2％以下であり、好ましくは0.06％以下、より好ましくは0.03％以下である。
また、本発明のコラーゲンビトリゲルの含有するリン濃度は、乾燥重量当たり0.8％以下であり、好ましくは0.48％以下、より好ましくは0.08％以下である。
上記のようにコラーゲンビトリゲルの含有するカルシウム濃度及び／又はリン濃度を低減することにより、少なくとも７日間以上、好ましくは２０日間以上、より好ましくは２８日間以上において白色物質の沈着を防いで細胞培養することが可能である。
(Collagen Vitrigel of the Present Invention)
The calcium concentration contained in the collagen vitrigel of the present invention is 0.2% or less per dry weight, preferably 0.06% or less, more preferably 0.03% or less.
Further, the phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel of the present invention is 0.8% or less per dry weight, preferably 0.48% or less, more preferably 0.08% or less.
By reducing the calcium concentration and / or phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel as described above, cell culture can be performed while preventing the deposition of white substances for at least 7 days or more, preferably 20 days or more, more preferably 28 days or more. Is possible.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
（コラーゲンビトリゲルに沈着する白色物質の特定）
従来のコラーゲンビトリゲル上で細胞培養を長期間行うことによる該コラーゲンビトリゲルに沈着する白色物質の主成分を特定した。詳細は、以下の通りである。
(Identification of white substance deposited on collagen vitrigel)
The main component of the white substance deposited on the collagen vitrigel by long-term cell culture on the conventional collagen vitrigel was identified. Details are as follows.
（従来のコラーゲンビトリゲルの作製）
外径33mm、内径24mmの円形中空の支持体をナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ＃ＲＰＮ１７８２Ｂ）を切り抜いて作製し、滅菌処理後、疎水性ポリスチレン製培養用シャーレ（φ35mm：IWAKI＃1000-035）に入れた。氷上で冷却した50ｍｌ容量の滅菌コニカルチューブ（ＩＷＡＫＩ＃２３４２−０５０）に2.5ｍｌの細胞培養液｛10％非動化ウシ胎児血清（FBS）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ＃１５６３０−０８０）｝含有ダルベッコ改変イーグル培地（Mediatech＃10-017-CV）と2.5ｍｌの0.5％Ｉ型コラーゲン水溶液（高研＃ＩＡＣ５０）を加え、均一に混和した。最終濃度0.25％のコラーゲン混合液を先の支持体を入れた疎水性ポリスチレン製培養用シャーレに2.0ｍｌ入れた後、5％CO2／95％空気存在下の37℃の保湿インキュベーターで２時間維持してゲル化した。この終濃度0.25％コラーゲンゲルを、クリーンベンチ内でふたをはずした状態で無菌的に２日間完全に乾燥することでガラス化させた。3ｍｌのPBSをガラス化させたコラーゲンビトリゲル乾燥体に加えることで、再水和した。さらに２回3ｍｌのPBSでリンスした。さらにこのコラーゲンビトリゲルを、クリーンベンチ内でふたをはずした状態で無菌的に２日間完全に乾燥させた。その後、室温で無菌的に保管維持した。さらに、使用前には培養液で水和した。
(Preparation of conventional collagen vitrigel)
A circular hollow support having an outer diameter of 33 mm and an inner diameter of 24 mm was prepared by cutting out a nylon membrane (Amersham # RPN1782B). Containing 2.5 ml of cell culture {10% non-immobilized fetal bovine serum (FBS), 20 mmol / l HEPES (GIBCO # 15630-080)} in a 50 ml sterile conical tube (IWAKI # 2342-050) cooled on ice Dulbecco's modified Eagle medium (Mediatech # 10-017-CV) and 2.5 ml of 0.5% type I collagen aqueous solution (Koken # IAC50) were added and mixed uniformly. After 2.0 ml of the collagen mixture with a final concentration of 0.25% is placed in a hydrophobic polystyrene culture dish containing the above support, it is maintained for 2 hours in a 37 ° C moisturizing incubator in the presence of 5% CO 2 /95% air. And gelled. This final concentration 0.25% collagen gel was vitrified by aseptically drying for 2 days with the lid removed in a clean bench. It rehydrated by adding 3 ml of PBS to the vitrified collagen vitrigel. Further, it was rinsed twice with 3 ml of PBS. Furthermore, this collagen vitrigel was aseptically dried for two days with the lid removed in a clean bench. Thereafter, it was kept aseptically stored at room temperature. Furthermore, it was hydrated with the culture solution before use.
（コラーゲンビトリゲルに沈着する白色物質の回収）
上記で作製したコラーゲンビトリゲル上でTIG-3細胞を5×104cells/cm2で播種し、10％FBS/DMEM培地を用いて７日間培養した。そして、該コラーゲンビトリゲルに白色物質が沈着していることを確認した後に、白色物質を含むコラーゲンビトリゲルを培養液から回収し、乾燥させた。また、白色物質の沈着のないコラーゲンビトリゲルを培養液から回収し、乾燥させた。
さらに、回収した白色物質を含むコラーゲンビトリゲル乾燥体をＥＰＭＡ（電子プローブマイクロアナライザー）及びFT-RIにより分析した。加えて、白色物質の沈着のないコラーゲンビトリゲル乾燥体をFT-RIにより分析した。
(Recovery of white substance deposited on collagen vitrigel)
TIG-3 cells were seeded at 5 × 10 4 cells / cm 2 on the collagen vitrigel prepared above, and cultured for 7 days using 10% FBS / DMEM medium. Then, after confirming that the white substance was deposited on the collagen vitrigel, the collagen vitrigel containing the white substance was recovered from the culture solution and dried. In addition, collagen vitrigel without white substance deposition was recovered from the culture and dried.
Further, the dried collagen vitrigel containing the collected white substance was analyzed by EPMA (Electron Probe Microanalyzer) and FT-RI. In addition, dried collagen vitrigel without white matter deposition was analyzed by FT-RI.
上記ＥＰＭＡによる分析結果では、白色物質から主にカルシウムが検出された。
また、回収した白色物質を含むコラーゲンビトリゲル乾燥体のFT-RI分析結果を図１に示し、白色物質の沈着のないコラーゲンビトリゲル乾燥体のFT-RI分析結果を図２に示す。
なお、各図中の「（１）」は、「ポリアミド化合物類のピーク」を示し、「（２）」は、「リン酸塩素系化合物類」を示す。図１の結果及び図２の結果の比較から明らかなように、白色物質の主成分はリン酸塩系化合物であることが判明した。
本発明者は、以上の分析結果より、白色物質の主成分がリン酸カルシウムであることを特定した。
As a result of the above-mentioned analysis by EPMA, calcium was mainly detected from the white substance.
Further, FIG. 1 shows the FT-RI analysis result of the dried collagen vitrigel containing the collected white substance, and FIG. 2 shows the FT-RI analysis result of the dried collagen vitrigel without white substance deposition.
In each figure, “(1)” indicates “peaks of polyamide compounds”, and “(2)” indicates “chlorine phosphate compounds”. As is clear from the comparison of the results of FIG. 1 and FIG. 2, it has been found that the main component of the white substance is a phosphate compound.
The present inventor has identified that the main component of the white substance is calcium phosphate from the above analysis results.
（作製時の培地、培養時の培地及び洗浄液による沈着する白色物質への影響の確認）
コラーゲンビトリゲル作製時の培地の種類、培養時の培地の種類及び洗浄液の種類によるコラーゲンビトリゲルに沈着する白色物質への影響を確認した。詳しくは、３種類の作製時の培地及び培養時の培地を使用し、さらに作製時の洗浄液の種類｛PBS（リン酸緩衝生理食塩水）又はddw（超純水）｝による白色物質の沈着開始時期を確認した。また、実施例１とは異なり、ＦＢＳの影響を避けるためにコラーゲンビトリゲル作製時の培地からFBSを除いた。
(Confirmation of the effect on the white substance deposited by the medium during preparation, the medium during culture, and the washing solution)
The influence on the white substance deposited on the collagen vitrigel by the kind of the medium at the time of collagen vitrigel preparation, the kind of the medium at the time of culturing, and the kind of the washing solution was confirmed. Specifically, using three types of production medium and culture medium, and starting the deposition of white matter by the type of washing liquid {PBS (phosphate buffered saline) or ddw (ultra pure water)) at the time of production Check the time. Moreover, unlike Example 1, FBS was removed from the culture medium at the time of collagen vitrigel preparation in order to avoid the influence of FBS.
（本発明のコラーゲンビトリゲルの作製）
下記の使用した培地及び洗浄液以外は上記実施例１で記載のコラーゲンビトリゲルの作製方法に従って、本発明のコラーゲンビトリゲルを作製した。
（１）使用した培地
DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）
カルシウム濃度72mg/L、リン濃度28mg/L
DF50（DMEM:Ham'sF12=1:1）
カルシウム濃度42mg/L、リン濃度15mg/L
Ham's Ｆ１２
カルシウム濃度12mg/L、リン濃度31mg/L
（２）使用した洗浄液
PBS（リン酸緩衝生理食塩水）リン濃度345mg/L
ddw（超純水）
(Preparation of collagen vitrigel of the present invention)
A collagen vitrigel of the present invention was produced according to the method for producing a collagen vitrigel described in Example 1 except for the medium and washing solution used below.
(1) Used medium
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
Calcium concentration 72mg / L, phosphorus concentration 28mg / L
DF50 (DMEM: Ham'sF12 = 1: 1)
Calcium concentration 42mg / L, phosphorus concentration 15mg / L
Ham's F12
Calcium concentration 12mg / L, phosphorus concentration 31mg / L
(2) Cleaning solution used
PBS (phosphate buffered saline) phosphorus concentration 345mg / L
ddw (ultra pure water)
（白色物質沈着確認試験）
上記作製した各コラーゲンビトリゲル3種類に10％FBSのMedium（DMEM, DF50, Ham's F12）を2ml/wellで添加し、適宜培地交換（培地交換日：３,６,９,１３,１６,２０,２３,２７日）を行いながら4週間放置した。
なお、サンプルＡのみ、TIG-3細胞を5×103cells/mで、培地は10％FBS/DMEMを用いて播き込んだ。
(White substance deposition confirmation test)
Medium of 10% FBS (DMEM, DF50, Ham's F12) is added to each of the three types of collagen vitrigel prepared above at 2 ml / well, and the medium is replaced as appropriate (medium replacement date: 3, 6, 9, 13, 16, 20). 23, 27 days) and left for 4 weeks.
For sample A only, TIG-3 cells were seeded at 5 × 10 3 cells / m and the medium was seeded with 10% FBS / DMEM.
上記白色物質の沈着確認試験の結果を下記表１に示す。
最終的に４種類のサンプル（Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｈ）において白色物質の沈着を確認した。白色物質の沈着があったサンプルの中で比較すると、サンプルＡ及びＢでは白色物質がコラーゲンビトリゲルの表面全体に沈着して、顕微鏡下ではコラーゲンビトリゲル表面を全く観察することが出来なかった。それに比べ、サンプルＥは白色物質の沈着度合いが低いため、顕微鏡下で観察すると、ビトリゲル表面を確認することができた。サンプルＨの白色物質の沈着は、サンプルＥの白色物質の沈着と比較して少なかった。
次に、２晩乾燥後の洗浄に使用したPBSとddwの相違において、白色物質が沈着した5種類のサンプルの中で、洗浄する際の溶液のみが異なるサンプルＢ及びＥを比較すると、PBSで洗浄したサンプルＢの白色物質沈着は１週間後に開始したのに対し、サンプルＥの白色物質沈着は3週間後に開始した。この結果よりPBSが白色物質の沈着に関与していると考えられる。
実際に培養する際の培養液の違いであるが、同一作製条件で、培養に用いる培地のみ異なるサンプルBCD、EFG及びHIJをそれぞれ比較すると、DMEM以外の培地を培養に使用することで、白色物質の沈着を抑えることができることから、培養に用いる培地中のカルシウム濃度がコラーゲンビトリゲルの白色物質の沈着に影響を与えていることがわかった。
一方、作製時の培地が異なり、培養時の培地は同一のDMEMを用いたサンプルEHKの内、Kのみが白色物質の沈着が確認されなかった。
すなわち、培養時に用いる培地のカルシウム濃度及びリン濃度はコラーゲンビトリゲルの白色物質の沈着に影響を与えるが、作製時の培地中のカルシウム濃度、さらにはリン濃度を低減させることで白色物質の沈着を抑制できることがわかった。
以上の結果より、コラーゲンビトリゲルが含有するカルシウム濃度及び／又はリン濃度を予め低くしておけば、該コラーゲンビトリゲルを細胞培養に使用する培地及び緩衝液中のカルシウム濃度及び／又はリン濃度に関係なく、長期間に渡って白色物質の沈着を防ぐことができることがわかった。
The results of the white substance deposition confirmation test are shown in Table 1 below.
Finally, the deposition of a white substance was confirmed in four types of samples (A, B, E, H). In comparison with the samples in which the white substance was deposited, in Samples A and B, the white substance was deposited on the entire surface of the collagen vitrigel, and the collagen vitrigel surface could not be observed at all under the microscope. Compared with that, since the degree of deposition of the white substance was low in Sample E, the Vitrigel surface could be confirmed when observed under a microscope. Sample H white matter deposition was less than Sample E white matter deposition.
Next, in the difference between PBS and ddw used for washing after drying for 2 nights, among the five types of samples in which white substances were deposited, only samples B and E, which differ only in the solution used for washing, were compared with PBS. The white matter deposition of the washed sample B started after one week, whereas the white matter deposition of sample E started after three weeks. From this result, it is considered that PBS is involved in the deposition of white matter.
Although it is the difference in the culture solution when actually cultivating, when comparing the samples BCD, EFG and HIJ, which differ only in the medium used for culture under the same production conditions, by using a medium other than DMEM for the cultivation, a white substance From this, it was found that the calcium concentration in the medium used for the culture affects the deposition of the white substance of the collagen vitrigel.
On the other hand, the culture medium at the time of preparation was different, and only the K of the sample EHK using the same DMEM as the culture medium at the time of culturing was not confirmed.
In other words, the calcium concentration and phosphorus concentration of the medium used during culture affect the deposition of white matter in collagen vitrigel, but the white matter is deposited by reducing the calcium concentration in the medium at the time of preparation, and also the phosphorus concentration. It turned out that it can suppress.
From the above results, if the calcium concentration and / or phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel is lowered in advance, the calcium concentration and / or phosphorus concentration in the medium and buffer used for cell culture of the collagen vitrigel. Regardless, it has been found that the deposition of white matter can be prevented over a long period of time.
（本発明のコラーゲンビトリゲルのカルシウム及びリンの含有量の確認）
本発明のコラーゲンビトリゲルのカルシウム及びリンの含有量を測定した。詳細は、以下の通りである。
(Confirmation of content of calcium and phosphorus in collagen vitrigel of the present invention)
The calcium and phosphorus contents of the collagen vitrigel of the present invention were measured. Details are as follows.
（コラーゲンビトリゲルの作製）
上記「実施例２」で得られた３種類の培地及び２種類の洗浄方法を用いて作製したコラーゲンビトリゲルをシャーレの内壁を周囲に沿って先の鋭敏なピンセットでなぞることで、支持体がついたコラーゲンビトリゲルとしてシャーレより脱着回収した。これを風乾して分析に供した。
(Preparation of collagen vitrigel)
By tracing the collagen vitrigel prepared using the three types of medium and the two types of washing methods obtained in the above “Example 2” with the sharp tweezers along the inner wall of the petri dish, the support can be obtained. The attached collagen vitrigel was desorbed and collected from the petri dish. This was air-dried for analysis.
（コラーゲンビトリゲルのカルシウム及びリンの含有量の測定）
上記により得られたコラーゲンビトリゲル試料を２分割した。分割した試料をそれぞれ秤量し、硝酸及び硫酸で加水分解した後に、希硝酸で加温溶解して定容とした。この溶液について、ICP発光分光分析法で下記測定条件で、カルシウム及びリン濃度を測定し、試料中の含有量を測定した。
測定条件：測定波長 Ca 393.3nm、P 213.6nm
高周波出力 1.3kW
プラズマガス流量 16L／min
補助ガス流量 0.5L／min
キャリアガス流量 1.0L／min
測光高さ 15mm
(Measurement of calcium and phosphorus content of collagen vitrigel)
The collagen vitrigel sample obtained as described above was divided into two. Each of the divided samples was weighed, hydrolyzed with nitric acid and sulfuric acid, and then heated and dissolved with dilute nitric acid to obtain a constant volume. With respect to this solution, the calcium and phosphorus concentrations were measured by ICP emission spectroscopic analysis under the following measurement conditions, and the content in the sample was measured.
Measurement conditions: Measurement wavelength Ca 393.3nm, P 213.6nm
High frequency output 1.3kW
Plasma gas flow rate 16L / min
Auxiliary gas flow rate 0.5L / min
Carrier gas flow rate 1.0L / min
Metering height 15mm
上記測定結果を下記表２に示す。なお、下記表２の値は、上記測定方法によって得られた値から、支持体の重量を減算し求めた、支持体なしのコラーゲンビトリゲルの乾燥重量当たりのカルシウム濃度及びリン濃度である。
下記表から明らかなように、本発明のコラーゲンビトリゲルの含有するカルシウム濃度は、乾燥重量当たり0.2％以下であり、好ましくは0.06％以下、より好ましくは0.03％以下である。また、本発明のコラーゲンビトリゲルの含有するリン濃度は、乾燥重量当たり0.8％以下であり、好ましくは0.48％以下、より好ましくは0.08％以下である。
なお、下記表中のカルシウム濃度の「＜」は、検出限界値以下であることを示している。
The measurement results are shown in Table 2 below. The values in Table 2 below are the calcium concentration and phosphorus concentration per dry weight of the collagen vitrigel without a support obtained by subtracting the weight of the support from the value obtained by the above measurement method.
As is apparent from the table below, the calcium concentration contained in the collagen vitrigel of the present invention is 0.2% or less per dry weight, preferably 0.06% or less, more preferably 0.03% or less. Further, the phosphorus concentration contained in the collagen vitrigel of the present invention is 0.8% or less per dry weight, preferably 0.48% or less, more preferably 0.08% or less.
In addition, “<” of the calcium concentration in the table below indicates that it is below the detection limit value.
長期間の培養でも白色物質（主成分がリン酸カルシウム）の沈着が起こらないコラーゲンビトリゲルを提供することができる。本発明のコラーゲンビトリゲルは長期培養を必要とする培養系、詳しくは、胚細胞培養、肝臓細胞培養、間葉系幹細胞の分化培養、さらに詳しくは特に透明性が重要となる角膜細胞分化の培養に好ましい。 It is possible to provide a collagen vitrigel that does not cause deposition of a white substance (main component is calcium phosphate) even after long-term culture. The collagen vitrigel of the present invention is a culture system that requires long-term culture, specifically, embryo cell culture, liver cell culture, differentiation culture of mesenchymal stem cells, and more particularly, culture of corneal cell differentiation in which transparency is particularly important. Is preferable.
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