JP2011027632A - Biomolecule immobilized substrate, biomolecule transport substrate, and biochip - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生体分子固定化基板、生体分子輸送基板及びバイオチップに関する。 The present invention relates to a biomolecule-immobilized substrate, a biomolecule transport substrate, and a biochip.
固体基板上に、生体分子を二次元的に配列して固定化したバイオチップは、医療診断、環境センシング、ナノバイオオプティクス・エレクトロニクスなどの幅広い分野における基盤素子として期待されている。特に、バイオ・環境センシング素子や医薬品開発においては、基板上に特定多数の生体分子を所望のパターンで固定化し、生体分子の種類や濃度、あるいは生体分子間の相互作用（活性検出、分子認識など。）をハイスループットで調査、診断できるバイオチップは、多大な市場価値をもたらすと期待されている。 Biochips in which biomolecules are two-dimensionally arranged and immobilized on a solid substrate are expected as basic devices in a wide range of fields such as medical diagnosis, environmental sensing, and nanobiooptics / electronics. In particular, in bio / environmental sensing devices and drug development, a large number of specific biomolecules are immobilized on a substrate in a desired pattern, and the types and concentrations of biomolecules, or interactions between biomolecules (activity detection, molecular recognition, etc.) .) Can be investigated and diagnosed at high throughput, and is expected to bring tremendous market value.
また、これらの産業分野だけでなく、酵素、抗体をはじめとするタンパク質やＤＮＡなどの機能性生体分子を、非破壊で安定して基板上に固定化する方法は、生体組織内で起こる生体分子間の反応機構を解明する基礎研究分野においても重要である。
生体組織は、細胞内で、タンパク質同士の相互作用や、イオン、電子、化学物質などの信号の伝達により、情報交換を行うことで生体機能を発現する。生体組織における生理学的な機構を解明する場合、細胞内のような多数の生体分子が存在する複雑系を用いると、分子レベルでの生体分子間の相互作用や信号伝達の解析は非常に難解となる。そのため、特定の生体分子を基板上に固定化し、簡略化した生体モデルを構築することで、各生体分子の相互作用や情報伝達機構、あるいは構造変化などの時間的変動を簡便に追跡できるバイオチップの開発が求められている。
In addition to these industrial fields, a method for stably immobilizing functional biomolecules such as enzymes and antibodies, such as proteins and DNA, on a substrate in a non-destructive manner is a biomolecule that occurs in a living tissue. It is also important in the basic research field to elucidate the reaction mechanism.
A biological tissue expresses biological functions by exchanging information in cells by exchanging information through interaction between proteins and transmission of signals such as ions, electrons, and chemical substances. When elucidating physiological mechanisms in biological tissues, it is very difficult to analyze interactions and signal transduction between biomolecules at the molecular level when using complex systems with many biomolecules such as cells. Become. Therefore, a biochip that can easily track temporal fluctuations such as interactions, information transmission mechanisms, or structural changes of each biomolecule by immobilizing specific biomolecules on a substrate and building a simplified biomodel Development is required.
特にタンパク質などの生体分子を基板上に固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン間の特異的な結合を利用する方法が広く用いられている（非特許文献１）。該方法では、一般的に、末端を修飾したビオチン分子を基板上に固定化し、該ビオチン分子に、ビオチンを特異的に認識するストレプトアビジンを結合させ、該ストレプトアビジンに、ビオチン化されたタンパク質を結合させる方法が用いられる。
また、自己組織化膜を形成した基板やレジストを塗布した基板に、紫外線を照射してパターンを描画し、該パターン上にビオチン−ストレプトアビジン結合を介してタンパク質を固定化する、タンパク質のパターンニング方法が知られている（非特許文献２、３）。
ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法では、タンパク質を、活性を保ったまま基板上に固定化できる。具体的には、アルカンチオールを脂質部分に有するビオチン脂質を金表面に結合させ、ストレプトアビジン、ビオチン標識したａｎｔｉ−ＨＣＧ（human chorionic gonadotropin）−Ｆａｂフラグメント、及びＨＣＧを順に結合させた場合に、固定化したタンパク質の分子認識能が保持されていることが表面プラズモン共鳴測定により確認されている（非特許文献４）。
しかし、該方法は、基板に結合するためのビオチン分子の末端修飾や、タンパク質の末端をビオチン化する修飾が必要であるため、その反応収率、時間的効率を考慮すると、バイオチップの大量生産には不向きである。
In particular, as a method for immobilizing biomolecules such as proteins on a substrate, a method utilizing specific binding between biotin and streptavidin is widely used (Non-patent Document 1). In this method, generally, a biotin molecule whose end is modified is immobilized on a substrate, streptavidin that specifically recognizes biotin is bound to the biotin molecule, and a biotinylated protein is bound to the streptavidin. A bonding method is used.
In addition, protein patterning is performed by drawing a pattern by irradiating a substrate on which a self-assembled film is formed or a substrate coated with a resist with ultraviolet rays, and immobilizing the protein on the pattern via a biotin-streptavidin bond. Methods are known (Non-Patent Documents 2 and 3).
In the method using the biotin-streptavidin bond, the protein can be immobilized on the substrate while maintaining the activity. Specifically, when biotin lipid having alkanethiol in the lipid portion is bound to the gold surface, streptavidin, biotin-labeled anti-HCG (human chorionic gonadotropin) -Fab fragment, and HCG are bound in order. It has been confirmed by surface plasmon resonance measurement that the molecular recognition ability of the converted protein is retained (Non-patent Document 4).
However, this method requires end modification of biotin molecules to bind to the substrate and modification to biotinylate the end of the protein, so considering the reaction yield and time efficiency, mass production of biochips Not suitable for.
また、基板上にタンパク質を固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法以外に、有機分子の自己組織化膜を用いる方法がある。例えば、下記に示す方法が挙げられる。
金基板上に、３−メルカプトプロピオン酸や１１−メルカプトウンデカン酸などの自己組織化膜を形成する。次いで、該自己組織化膜の上側に位置する末端のカルボキシ基に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミドを触媒として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをカップリングする。次いで、該自己組織化膜の最表面にあるスクシンイミド基と、タンパク質のアミノ酸末端（Ｎ末端）とを選択的に結合させ、タンパク質を基板上に固定化する（非特許文献５）。
しかし、該方法は、一般に末端がチオール化された化合物を用いる必要があるため、金基板のような特定の基板上にしかタンパク質を固定化することができない。また、最終的にタンパク質を結合するには、基板の前処理として、数種のスペーサー分子を結合させる必要があり、反応プロセスが多段階にわたるため工程が煩雑になる。また、反応が多段階になるほど、基板上にタンパク質を固定化する効率が低くなる。
Moreover, as a method for immobilizing a protein on a substrate, there is a method using a self-assembled film of an organic molecule other than a method using a biotin-streptavidin bond. For example, the method shown below is mentioned.
A self-assembled film such as 3-mercaptopropionic acid or 11-mercaptoundecanoic acid is formed on a gold substrate. Next, N-hydroxysuccinimide is coupled to the terminal carboxy group located on the upper side of the self-assembled film using 1-ethyl-3- (3-dimethylamino) propylcarbodiimide as a catalyst. Next, the succinimide group on the outermost surface of the self-assembled film and the amino acid terminal (N terminal) of the protein are selectively bound to immobilize the protein on the substrate (Non-patent Document 5).
However, the method generally requires the use of a compound having a thiol end, so that the protein can be immobilized only on a specific substrate such as a gold substrate. In addition, in order to finally bind proteins, it is necessary to bind several kinds of spacer molecules as a pretreatment of the substrate, and the reaction process is multistage, which makes the process complicated. In addition, the more the reaction is performed, the lower the efficiency of immobilizing the protein on the substrate.
その他、基板上にタンパク質を化学的に固定化したり、パターンニングしたりする方法が知られている。具体的には、タンパク質を、スペーサー分子を介した共有結合により、基板上に強固に固定化する方法が挙げられる（非特許文献６）。
しかし、生体分子は本来流動性のある媒質中で活動しているのに対し、該方法はスペーサー分子により生体分子を基板上に強固に固定するため、生体分子の流動性が失われる。また、スペーサー分子と共有結合することで、生体分子自体の構造が変化する可能性があるため、固定化により生体分子本来の機能や活動が制限され、生理機能が損なわれるおそれがある。
In addition, methods for chemically immobilizing or patterning proteins on a substrate are known. Specifically, there is a method in which a protein is firmly immobilized on a substrate by a covalent bond via a spacer molecule (Non-patent Document 6).
However, while biomolecules are originally active in a fluid medium, the method firmly fixes the biomolecules on the substrate by spacer molecules, so that the fluidity of the biomolecules is lost. In addition, since the structure of the biomolecule itself may change due to the covalent bond with the spacer molecule, immobilization may limit the original functions and activities of the biomolecule and may impair the physiological function.
固定化する生体分子の生理機能が損なわれることを抑制する方法としては、タンパク質を金基板上に固定化し、該タンパク質の周囲をチオール化脂質分子の自己組織化膜で被覆することで、基板上に擬似的な細胞膜構造を形成する方法が示されている（非特許文献７）。該方法では、タンパク質が脂質分子で包囲されているため、比較的生理条件に近い状態で生体分子を基板上に固定化できる。
しかし、該方法でバイオチップを作製すると、脂質分子が金−チオール結合により基板に強く結合され、形成される脂質膜に柔軟性がなくなるため、該脂質膜の機能が時間とともに低下するおそれがある。また、タンパク質も直接基板に担持されるため、基板との相互作用が強く、タンパク質本来の構造や機能を保持したまま長時間安定して固定化できない可能性がある。そのため、このような方法は、長期保存やバイオチップの用途としては信頼性が低い。
As a method for suppressing the loss of the physiological function of the biomolecule to be immobilized, the protein is immobilized on a gold substrate, and the periphery of the protein is coated with a self-assembled film of thiolated lipid molecules on the substrate. Shows a method of forming a pseudo cell membrane structure (Non-patent Document 7). In this method, since the protein is surrounded by lipid molecules, the biomolecule can be immobilized on the substrate in a state relatively close to physiological conditions.
However, when a biochip is produced by this method, lipid molecules are strongly bound to the substrate by a gold-thiol bond, and the formed lipid membrane loses flexibility, so that the function of the lipid membrane may decrease with time. . Further, since the protein is also directly supported on the substrate, the interaction with the substrate is strong, and there is a possibility that it cannot be stably immobilized for a long time while maintaining the original structure and function of the protein. Therefore, such a method is low in reliability for long-term storage and biochip applications.
以上のように、バイオセンサやバイオチップ等への適用が検討されている従来の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化手法が煩雑なために生産性が低く、固定化する基板が限定されるうえ、固定化した生体分子の流動性及び安定性が低くなり、該生体分子の生理機能が失活するおそれがある。また、従来の生体分子固定化基板では、生体分子の流動性が低いため、基板上で生体分子を移動させ、所望の位置に輸送することはできない。さらに、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化や配列化の制御はまだまだ不充分であり、それらの制御のさらなる向上が望まれている。 As described above, conventional biomolecule-immobilized substrates that have been studied for application to biosensors, biochips, etc. have low productivity due to complicated biomolecule immobilization methods, and the substrates to be immobilized are limited. In addition, the fluidity and stability of the immobilized biomolecule are lowered, and the physiological function of the biomolecule may be deactivated. Further, in the conventional biomolecule-immobilized substrate, since the fluidity of the biomolecule is low, the biomolecule cannot be moved on the substrate and transported to a desired position. Furthermore, control of the position and density of biomolecules immobilized on the substrate, patterning and arrangement is still insufficient, and further improvement of these controls is desired.
本発明は、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御でき、固定化した生体分子の流動性及び安定性が高く、該生体分子の生理機能が失活するおそれが低く、生産性が高い生体分子固定化基板、及び基板上の所望の位置に生体分子を輸送できる生体分子輸送基板、並びにそれらを用いたバイオチップの提供を目的とする。 The present invention can highly control the position, density, patterning, and arrangement of biomolecules immobilized on a substrate, the fluidity and stability of the immobilized biomolecules are high, and the physiological functions of the biomolecules are lost. It is an object of the present invention to provide a biomolecule-immobilized substrate with low possibility of being active and high productivity, a biomolecule transport substrate capable of transporting a biomolecule to a desired position on the substrate, and a biochip using them.
本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする生体分子固定化基板。
［２］前記脂質二分子膜が、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有するニッケル錯体脂質分子を含み、前記生体分子がヒスチジン残基を有しており、前記ニッケル錯体脂質分子のニッケル錯体部位と、前記生体分子のヒスチジン残基の結合により該生体分子が固定化されている、前記［１］に記載の生体分子固定化基板。
［３］前記生体分子が、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質からなる群から選ばれる少なくとも１種の機能性タンパク質であり、かつ該機能性タンパク質の末端がヒスチジンタグ化されている、前記［２］に記載の生体分子固定化基板。
［４］前記脂質二分子膜が、前記ニッケル錯体脂質分子により形成されたドメイン領域、及びニッケル錯体部位を有さない脂質分子により形成されたドメイン領域からなる脂質二分子膜である、前記［２］又は［３］に記載の生体分子固定化基板。
［５］前記脂質二分子膜中に前記ニッケル錯体脂質分子が均一に分散している、前記［２］〜［４］のいずれかに記載の生体分子固定化基板。
［６］基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化された基板であって、前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成されることを特徴とする生体分子輸送基板。
［７］前記［１］〜［５］に記載の生体分子固定化基板又は前記［６］に記載の生体分子輸送基板を用いたバイオチップ。
［８］多検体の生体分子をハイスループットスクリーニング検出するバイオチップであって、種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜に固定化され、前記基板本体上の所定の位置に配置された、前記［７］に記載のバイオチップ。
The present invention employs the following configuration in order to solve the above problems.
[1] A biomolecule-immobilized substrate, wherein a lipid bilayer is formed on a substrate body, and a biomolecule is immobilized on the lipid bilayer.
[2] The lipid bilayer membrane includes a nickel complex lipid molecule having a nickel complex site that binds to a histidine residue, the biomolecule has a histidine residue, and the nickel complex site of the nickel complex lipid molecule And the biomolecule-immobilized substrate according to the above [1], wherein the biomolecule is immobilized by binding of histidine residues of the biomolecule.
[3] The biomolecule is at least one functional protein selected from the group consisting of an antigen, an antibody, an enzyme, a membrane protein, a receptor protein, a fluorescent protein, a cytoskeleton, and a motor protein, and the functional protein The biomolecule-immobilized substrate according to the above [2], wherein the end of is histidine-tagged.
[4] The lipid bilayer is a lipid bilayer composed of a domain region formed by the nickel complex lipid molecule and a domain region formed by a lipid molecule having no nickel complex site. ] Or the biomolecule-immobilized substrate according to [3].
[5] The biomolecule-immobilized substrate according to any one of [2] to [4], wherein the nickel complex lipid molecules are uniformly dispersed in the lipid bilayer membrane.
[6] A substrate in which a lipid bilayer is formed on a substrate body, and a biomolecule is immobilized on the lipid bilayer, and a predetermined pattern comprising a hydrophilic portion and a hydrophobic portion is formed on the substrate body. A biomolecule transport substrate, wherein the lipid bilayer membrane is formed by spontaneously developing a lipid bilayer membrane on which a biomolecule is immobilized on the surface of the hydrophilic portion.
[7] A biochip using the biomolecule-immobilized substrate according to [1] to [5] or the biomolecule transport substrate according to [6].
[8] A biochip for performing high-throughput screening detection of biomolecules of multiple specimens, wherein a plurality of biomolecules of different types and / or concentrations are immobilized on a lipid bilayer membrane, and a predetermined position on the substrate body The biochip according to [7], which is disposed in
本発明の生体分子固定化基板は、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御できる。また、固定化した生体分子の流動性及び安定性が高く、該生体分子の生理機能が失活するおそれが低く、生産性も高い。
本発明の生体分子輸送基板は、さらに基板上の所望の位置に生体分子を輸送できる。
また、本発明は、前記生体分子固定化基板又は生体分子輸送基板を用いたバイオチップを提供する。
The biomolecule-immobilized substrate of the present invention can highly control the position, density, patterning, and arrangement of biomolecules immobilized on the substrate. Moreover, the fluidity and stability of the immobilized biomolecule are high, the physiological function of the biomolecule is less likely to be deactivated, and the productivity is high.
The biomolecule transport substrate of the present invention can further transport biomolecules to a desired position on the substrate.
The present invention also provides a biochip using the biomolecule-immobilized substrate or the biomolecule transport substrate.
＜生体分子固定化基板＞
本発明の生体分子固定化基板は、基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化されていることを特徴とする。
<Biomolecule-immobilized substrate>
The biomolecule-immobilized substrate of the present invention is characterized in that a lipid bimolecular film is formed on a substrate body, and the biomolecule is immobilized on the lipid bimolecular film.
基板本体としては、安定に脂質二分子膜を形成できる親水性の基板が好ましく、例えば、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ（雲母）などからなる基板を用いることができる。また、疎水性の基板の表面に、化学洗浄、分子修飾などの処理を施し、表面を親水化したものを用いてもよい。
基板本体は、膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜を形成することが容易な点から、ナノメートルスケールの平坦性を有するものが好ましい。
基板本体の厚さは、０．１〜２０ｍｍが好ましい。
As the substrate body, a hydrophilic substrate capable of stably forming a lipid bimolecular film is preferable. For example, a substrate made of glass, quartz, silicon, sapphire, mica (mica), or the like can be used. Alternatively, the surface of a hydrophobic substrate may be subjected to treatment such as chemical cleaning or molecular modification to make the surface hydrophilic.
The substrate main body preferably has nanometer-scale flatness from the viewpoint of easily forming a lipid bimolecular film having a thickness of about 4 to 5 nm.
The thickness of the substrate body is preferably 0.1 to 20 mm.
本発明における脂質二分子膜とは、基板に支持された（人工）脂質二分子膜である。脂質二分子膜は、両親媒性分子であるリン脂質などの脂質分子が二層構造を形成した膜であり、生体膜の最も基本的な構造である。
脂質分子おいては、各脂質の疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。本明細書中では、アシル鎖中に二重結合部位を含まない脂質分子を飽和脂質分子、アシル鎖中に二重結合部位を含む脂質分子を不飽和脂質分子という。
脂質分子の種類としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質などが挙げられる。これら脂質分子は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
The lipid bilayer membrane in the present invention is an (artificial) lipid bilayer membrane supported on a substrate. The lipid bilayer membrane is a membrane in which lipid molecules such as phospholipids that are amphipathic molecules form a bilayer structure, and is the most basic structure of a biological membrane.
In the lipid molecule, the acyl chain length of the hydrophobic part of each lipid, the presence or absence of a double bond in the acyl chain, and the site and number of the double bond are not particularly limited. In the present specification, a lipid molecule that does not contain a double bond site in the acyl chain is called a saturated lipid molecule, and a lipid molecule that contains a double bond site in the acyl chain is called an unsaturated lipid molecule.
Examples of the lipid molecules include phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylinositol phosphate (PIP), phosphatidic acid (PA), phosphatidylglycerol ( PG) and sphingolipids. These lipid molecules may be used alone or in combination of two or more.
本発明の生体分子固定化基板における脂質二分子膜は、ニッケル錯体脂質分子を含むことが好ましい。すなわち、脂質二分子膜への生体分子の固定化は、ニッケル錯体脂質分子を用いて行うことが好ましい。ニッケル錯体脂質分子とは、ヒスチジン残基と結合するニッケル錯体部位を有する脂質分子である。ニッケル錯体部位は、ヒスチジン残基を有する分子と特異的に相互作用（配位結合）するため、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を脂質二分子膜表面に選択的に固定化できる。ニッケル錯体部位としては、ニトリロ三酢酸とニッケルの錯体が挙げられる。
基板本体上に、ニッケル錯体脂質分子を含む脂質二分子膜を形成させ、該脂質二分子膜に、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を作用させることで、該ニッケル錯体部位と生体分子のヒスチジン残基の結合により生体分子が固定化される。
The lipid bilayer membrane in the biomolecule-immobilized substrate of the present invention preferably contains nickel complex lipid molecules. That is, the immobilization of biomolecules on the lipid bilayer membrane is preferably performed using nickel complex lipid molecules. The nickel complex lipid molecule is a lipid molecule having a nickel complex site that binds to a histidine residue. Since the nickel complex site specifically interacts (coordination bond) with a molecule having a histidine residue, a biomolecule having a histidine residue at the terminal can be selectively immobilized on the surface of the lipid bilayer membrane. Examples of the nickel complex site include a complex of nitrilotriacetic acid and nickel.
By forming a lipid bilayer film including a nickel complex lipid molecule on a substrate body and allowing a biomolecule having a histidine residue at the terminal to act on the lipid bilayer film, the nickel complex site and the biomolecule histidine Biomolecules are immobilized by bonding of residues.
脂質二分子膜に固定化する生体分子は、当該生体分子との間に何らかの相互作用（化学結合の形成、吸着など。）を生じ得る特異結合物質が存在する生体由来の分子であり、末端にヒスチジン残基を有する。すなわち、検体となる試料中の目的物質や候補目的物質（生体に由来するタンパク質、ペプチド、低分子化合物など。）と特異的に結合または吸着でき、かつ末端にヒスチジン残基を有する分子である。 A biomolecule immobilized on a lipid bilayer membrane is a molecule derived from a living body in which a specific binding substance that can cause some kind of interaction (chemical bond formation, adsorption, etc.) exists with the biomolecule. Has a histidine residue. That is, it is a molecule that can specifically bind or adsorb to a target substance or a candidate target substance (a protein, peptide, low molecular weight compound, etc. derived from a living body) in a sample serving as a specimen and has a histidine residue at the terminal.
生体分子としては、生体分子間の特異的な相互作用を活かしたバイオチップを開発できる点から、末端がヒスチジンタグ化された機能性タンパク質が好ましい。
機能性タンパク質としては、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格及びモータータンパク質からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
ただし、生体分子は、特異的に相互作用する特異結合物質が存在し、末端にヒスチジン残基を有するものであれば、ヒスチジンタグ化された機能性タンパク質には限定されない。例えば、ヒスチジンタグ化された糖鎖化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを用いることもできる。
As the biomolecule, a functional protein having a histidine tag at its end is preferable because a biochip utilizing a specific interaction between biomolecules can be developed.
The functional protein is preferably at least one selected from the group consisting of antigen, antibody, enzyme, membrane protein, receptor protein, fluorescent protein, cytoskeleton and motor protein.
However, the biomolecule is not limited to a histidine-tagged functional protein as long as a specific binding substance that interacts specifically exists and has a histidine residue at the terminal. For example, histidine-tagged sugar chain compounds, DNA, RNA, and the like can be used.
ヒスチジンタグは、３〜１０個のヒスチジン残基が連なるヒスチジン連鎖が好ましい。ヒスチジン残基が３個以上であれば、ニッケル錯体部位との結合の安定性が向上する。また、ヒスチジン残基が１０個以下であれば、分子内での立体障害が生じにくい。
また、ニッケル錯体部位とヒスチジン残基の配位結合は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤を添加することで解離できる。そのため、脂質二分子膜上に固定化した生体分子は自由に脱離させることができるので、脂質二分子膜を形成した基板は再利用が可能である。
The histidine tag is preferably a histidine chain in which 3 to 10 histidine residues are linked. If there are three or more histidine residues, the stability of the bond with the nickel complex site is improved. In addition, when the number of histidine residues is 10 or less, steric hindrance in the molecule hardly occurs.
The coordination bond between the nickel complex site and the histidine residue can be dissociated by adding a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Therefore, since the biomolecules immobilized on the lipid bilayer membrane can be freely desorbed, the substrate on which the lipid bilayer membrane is formed can be reused.
このように、ニッケル錯体脂質分子と末端にヒスチジン残基を有する生体分子を用いることにより、脂質二分子膜に生体分子を固定化できる。脂質二分子膜は、ニッケル錯体脂質分子のみからなる膜であってもよく、ニッケル錯体脂質分子と他の脂質分子からなる膜であってもよい。ここで、他の脂質分子とは、ニッケル錯体部位を有さない飽和脂質分子又は不飽和脂質分子である。本発明の生体分子固定化基板では、ニッケル錯体脂質分子と、他の脂質分子を混合して脂質二分子膜中のニッケル錯体脂質分子の分布を制御することで、基板に固定化する生体分子の分布を制御できる。
具体的には、脂質二分子膜中に、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域と、他の脂質分子からなるドメイン領域とを形成させ、ニッケル錯体脂質分子を基板上で相分離させることで、基板上で生体分子を局在化させることができる。また、脂質二分子膜中でニッケル錯体分子と他の脂質分子を共に均一に分散させることで、基板上に生体分子を均一に固定化できる。
Thus, by using a nickel complex lipid molecule and a biomolecule having a histidine residue at the terminal, the biomolecule can be immobilized on the lipid bilayer membrane. The lipid bilayer membrane may be a membrane composed only of nickel complex lipid molecules or a membrane composed of nickel complex lipid molecules and other lipid molecules. Here, the other lipid molecule is a saturated lipid molecule or an unsaturated lipid molecule having no nickel complex site. In the biomolecule-immobilized substrate of the present invention, by mixing the nickel complex lipid molecule and other lipid molecules to control the distribution of the nickel complex lipid molecule in the lipid bilayer, the biomolecule immobilized on the substrate Distribution can be controlled.
Specifically, a domain region composed of a nickel complex lipid molecule and a domain region composed of another lipid molecule are formed in the lipid bilayer membrane, and the nickel complex lipid molecule is phase-separated on the substrate, whereby the substrate Biomolecules can be localized above. Moreover, a biomolecule can be uniformly fixed on a substrate by uniformly dispersing nickel complex molecules and other lipid molecules together in the lipid bilayer membrane.
以下、本発明の生体分子固定化基板の実施形態の一例を示して詳細に説明する。
（第１実施形態）
本実施形態の生体分子固定化基板１は、図１に示すように、基板本体１１と、基板本体１１上に形成された脂質二分子膜１２と、脂質二分子膜１２に固定化された生体分子１３とを有している。
Hereinafter, an exemplary embodiment of the biomolecule-immobilized substrate of the present invention will be described in detail.
(First embodiment)
As shown in FIG. 1, the biomolecule-immobilized substrate 1 of the present embodiment includes a substrate body 11, a lipid bilayer membrane 12 formed on the substrate body 11, and a living body immobilized on the lipid bilayer membrane 12. Molecule 13.
基板本体１１は、平板状の基板であり、ナノメートルスケールの平坦な表面を有する。
脂質二分子膜１２は、不飽和型のニッケル錯体脂質分子１４と、飽和脂質分子１５からなる。
本実施形態のニッケル錯体脂質分子１４は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジアセティックアシッド）スクシニル］（ニッケル塩）（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaceticacid)succinyl] (Nickel salt)）である。ニッケル錯体脂質分子１４は、図２（ａ）に示すように、二重結合を含むアシル鎖からなる疎水部１４ａと、疎水部１４ａと結合している親水部１４ｂと、親水部１４ｂに結合しているニッケル錯体部１４ｃとからなる。ニッケル錯体脂質分子１４のゲル−液晶相転移温度は−２０℃である。
飽和脂質分子１５は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＳＰＣ）である。飽和脂質分子１５は、図２（ｂ）に示すように、直鎖状のアシル鎖からなる疎水部１５ａと、疎水部１５ａと結合している親水部１５ｂとからなる。飽和脂質分子１５のゲル−液晶相転移温度は５５℃である。
生体分子１３は、末端にヒスチジンタグ１３ａを有している。
The substrate body 11 is a flat substrate and has a flat surface on a nanometer scale.
The lipid bilayer 12 includes an unsaturated nickel complex lipid molecule 14 and a saturated lipid molecule 15.
The nickel complex lipid molecule 14 of this embodiment is 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) ( 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiaceticacid) succinyl] (Nickel salt)). As shown in FIG. 2A, the nickel complex lipid molecule 14 is bonded to the hydrophobic portion 14a composed of an acyl chain including a double bond, the hydrophilic portion 14b bonded to the hydrophobic portion 14a, and the hydrophilic portion 14b. The nickel complex portion 14c. The gel-liquid crystal phase transition temperature of the nickel complex lipid molecule 14 is −20 ° C.
The saturated lipid molecule 15 is 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC). As shown in FIG. 2B, the saturated lipid molecule 15 includes a hydrophobic portion 15a made of a linear acyl chain and a hydrophilic portion 15b bonded to the hydrophobic portion 15a. The gel-liquid crystal phase transition temperature of the saturated lipid molecule 15 is 55 ° C.
The biomolecule 13 has a histidine tag 13a at the end.
生体基板固定化基板１では、不飽和型のニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５の混合脂質を用いることで、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５が相分離した脂質二分子膜１２が形成される。このように脂質分子が相分離してドメイン領域が形成されるのは、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５の流動性が異なるためである（L. J. Johnston、「ラングミュア（Langmuir）」、第２３巻、２００７年、第５８８６−５８９５頁）。
このドメイン領域を有する脂質二分子膜の構造は、多くの場合、アシル鎖同士の疎水性相互作用が強い飽和脂質分子（飽和脂質分子１５）が密に集合したドメイン領域を形成し、その周囲を流動性の高い不飽和脂質分子（ニッケル錯体脂質分子１４）が取り囲む相分離構造となる。ドメイン領域の大きさは、脂質二分子膜を形成する際、用いる各脂質分子のゲル−液晶相転移温度を考慮した最適な温度で熱処理を行うことで適宜変化させることができる。熱処理温度、熱処理時間、室温までの降温速度等がドメイン領域の大きさを決定する重要なパラメータとなる。また、ドメイン領域の大きさは、用いる各脂質分子のモル比を調節することによっても調節できる。
In the biological substrate immobilization substrate 1, a lipid bilayer membrane 12 in which the nickel complex lipid molecule 14 and the saturated lipid molecule 15 are phase-separated is obtained by using a mixed lipid of the unsaturated nickel complex lipid molecule 14 and the saturated lipid molecule 15. It is formed. The reason why the lipid molecules are phase-separated to form a domain region in this manner is that the fluidity of the nickel complex lipid molecule 14 and the saturated lipid molecule 15 is different (LJ Johnston, “Langmuir”, 23rd). Volume, 2007, 5886-5895).
The structure of the lipid bilayer membrane having this domain region often forms a domain region in which saturated lipid molecules (saturated lipid molecules 15) with strong hydrophobic interaction between acyl chains are densely assembled, A phase-separated structure surrounded by highly fluid unsaturated lipid molecules (nickel complex lipid molecules 14) is obtained. The size of the domain region can be appropriately changed by performing a heat treatment at an optimum temperature in consideration of the gel-liquid crystal phase transition temperature of each lipid molecule used when forming the lipid bilayer membrane. The heat treatment temperature, the heat treatment time, the cooling rate to room temperature, and the like are important parameters for determining the size of the domain region. The size of the domain region can also be adjusted by adjusting the molar ratio of each lipid molecule used.
生体分子１３は、ヒスチジンタグ１３ａとニッケル錯体脂質分子１４のニッケル錯体部位１４ｃが結合することで、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４上に選択的に固定化される。
生体分子固定化基板１では、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４のドメイン領域の大きさを調節することで、生体分子１３を自由に高密度化したり局在化させたりできる。また、生体分子１３は末端にヒスチジン残基を有するので、生体分子１３を脂質二分子膜１２上に配向を揃えて固定化できる。
The biomolecule 13 is selectively immobilized on the nickel complex lipid molecule 14 in the lipid bilayer membrane 12 by binding of the histidine tag 13a and the nickel complex site 14c of the nickel complex lipid molecule 14.
In the biomolecule-immobilized substrate 1, the biomolecules 13 can be freely densified or localized by adjusting the size of the domain region of the nickel complex lipid molecules 14 in the lipid bilayer membrane 12. In addition, since the biomolecule 13 has a histidine residue at the terminal, the biomolecule 13 can be immobilized on the lipid bilayer membrane 12 with its orientation aligned.
生体分子固定化基板１は、以下に示す方法で製造できる。
基板本体１１上に脂質二分子膜１２を形成する方法としては、緩衝液内に作製した脂質ベシクルを基板本体１１上に展開し、該脂質ベシクルが基板本体１１表面に衝突することで脂質二分子膜を形成させるベシクルフュージョン法が好ましい。ベシクルフュージョン法によれば、基板本体１１上に膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜１２の単分子膜を容易に形成できる。ただし、基板本体１１上に脂質二分子膜１２を形成する方法は、ベシクルフュージョン法には限定されず、基板本体１１上に安定して脂質二分子膜１２を形成できる方法であれば、公知のいずれの方法を適用してもよい。
生体分子１３を固定化する方法としては、生体分子を含む緩衝液を脂質二分子膜１２上に添加し、３０分〜数時間、室温で静置した後、緩衝液を滴下して上澄み液を取り除く処理を繰り返して洗浄し、未固定の生体分子１３を除去する方法が好ましい。
また、生体分子固定化基板１に固定化した生体分子１３は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を添加することで脱離させることができ、脂質二分子膜１２を有する基板は再利用できる。
The biomolecule-immobilized substrate 1 can be manufactured by the following method.
As a method of forming the lipid bilayer membrane 12 on the substrate body 11, a lipid vesicle produced in a buffer solution is developed on the substrate body 11, and the lipid vesicle collides with the surface of the substrate body 11, whereby the lipid bimolecule is formed. A vesicle fusion method for forming a film is preferred. According to the vesicle fusion method, a monomolecular film of the lipid bimolecular film 12 having a film thickness of about 4 to 5 nm can be easily formed on the substrate body 11. However, the method of forming the lipid bilayer membrane 12 on the substrate body 11 is not limited to the vesicle fusion method, and any known method can be used as long as the lipid bilayer membrane 12 can be stably formed on the substrate body 11. Any method may be applied.
As a method for immobilizing the biomolecule 13, a buffer solution containing a biomolecule is added onto the lipid bilayer membrane 12, and left at room temperature for 30 minutes to several hours, and then the buffer solution is dropped to obtain a supernatant. A method of removing the non-immobilized biomolecules 13 by washing by repeating the removing process is preferable.
Further, the biomolecule 13 immobilized on the biomolecule-immobilized substrate 1 can be detached by adding a chelating agent such as EDTA, and the substrate having the lipid bilayer membrane 12 can be reused.
生体分子固定化基板１は、脂質二分子膜１２中のニッケル錯体脂質分子１４からなるドメイン領域１４Ａと飽和脂質分子１５からなるドメイン領域１５Ａを所定のパターンで形成し、生体分子１４を所定のパターンでより精密に制御して固定化できる。例えば、図３し示す（ａ）〜（ｆ）のパターンが挙げられる。
（ａ）円形状のドメイン領域１５Ｂと、基板１上のドメイン領域１５Ｂの周りを占めるドメイン領域１５Ａとが形成されるパターン。
（ｂ）長方形状のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂが、基板１を半分に分割するように形成されるパターン。
（ｃ）２つのドメイン領域１５Ａと２つのドメイン領域１５Ｂとを交互に、基板１を四分割するように配置されるパターン。
（ｄ）基板１の中心に円形状のドメイン領域１５Ｂが形成され、その周りに輪形状のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂが交互に２つずつ形成され、さらにその周囲の残りの領域にドメイン領域Ａが形成されているパターン。
（ｅ）複数のドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂを交互に縞状に形成されるパターン。
（ｆ）ドメイン領域１５Ａとドメイン領域１５Ｂを交互に碁盤目状に形成されるパターン。
The biomolecule-immobilized substrate 1 forms a domain region 14A composed of nickel complex lipid molecules 14 and a domain region 15A composed of saturated lipid molecules 15 in the lipid bilayer membrane 12 in a predetermined pattern, and the biomolecule 14 is formed in a predetermined pattern. Can be controlled and fixed more precisely. For example, there are patterns (a) to (f) shown in FIG.
(A) A pattern in which a circular domain region 15B and a domain region 15A occupying around the domain region 15B on the substrate 1 are formed.
(B) A pattern in which rectangular domain regions 15A and domain regions 15B are formed so as to divide the substrate 1 in half.
(C) A pattern in which the two domain regions 15A and the two domain regions 15B are alternately arranged to divide the substrate 1 into four.
(D) A circular domain region 15B is formed at the center of the substrate 1, and two ring-shaped domain regions 15A and two domain regions 15B are alternately formed around it, and the domain region is formed in the remaining region around the circular domain region 15B. A pattern in which A is formed.
(E) A pattern in which a plurality of domain regions 15A and domain regions 15B are alternately formed in stripes.
(F) A pattern in which the domain regions 15A and the domain regions 15B are alternately formed in a grid pattern.
図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターンの脂質二分子膜１２を形成する方法としては、例えば、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を有する方法が挙げられる。
（ｉ）基板本体１１表面にリソグラフィー技術で微細加工を施し、図４（ａ）に示すように、所望の形状の凹凸パターンを描画した基板本体１１Ａを得る。このとき、凸部上にレジスト薄膜１６を残存させる。
（ｉｉ）飽和脂質分子１５を基板本体１１Ａ上に展開し、図４（ｂ）に示すように、基板本体１１Ａの凹部に飽和脂質分子１５からなる脂質二分子膜を形成する。
（ｉｉｉ）図４（ｃ）に示すように、凸部上のレジスト薄膜１６を除去し、ニッケル錯体脂質分子１４を基板本体１１Ａ上に展開して、図４（ｄ）に示すように、基板本体１１Ａの凸部にニッケル錯体脂質分子１４からなる脂質二分子膜を形成する。
Examples of the method for forming the lipid bilayer membrane 12 having the pattern as illustrated in FIGS. 3A to 3F include methods having the following steps (i) to (iii).
(I) Fine processing is performed on the surface of the substrate main body 11 by a lithography technique to obtain a substrate main body 11A on which a concavo-convex pattern having a desired shape is drawn as shown in FIG. At this time, the resist thin film 16 is left on the convex portion.
(Ii) The saturated lipid molecules 15 are spread on the substrate body 11A, and as shown in FIG. 4B, a lipid bilayer film composed of the saturated lipid molecules 15 is formed in the recesses of the substrate body 11A.
(Iii) As shown in FIG. 4 (c), the resist thin film 16 on the convex portion is removed, and the nickel complex lipid molecules 14 are developed on the substrate body 11A. As shown in FIG. A lipid bilayer composed of nickel complex lipid molecules 14 is formed on the convex portion of the main body 11A.
工程（ｉ）：
基板本体１１表面への凹凸パターンの形成は、公知のリソグラフィー技術が適用できる。該凹凸パターンの大きさは、通常のリソグラフィー技術によれば、幅、深さ共に数１０ｎｍ〜数ｍｍの範囲で幅広く制御できる。凹部及び凸部の幅は、バイオチップの高密度化を考慮すると、１０ｎｍ〜１μｍが好ましい。また、凹部の深さ（凸部の高さ）は、同様の理由から、１０ｎｍ〜１００ｎｍが好ましい。
Step (i):
A known lithography technique can be applied to the formation of the concavo-convex pattern on the surface of the substrate body 11. The size of the concavo-convex pattern can be widely controlled in the range of several tens of nanometers to several millimeters in both width and depth according to a normal lithography technique. The width of the concave and convex portions is preferably 10 nm to 1 μm in view of increasing the density of the biochip. Further, the depth of the concave portion (height of the convex portion) is preferably 10 nm to 100 nm for the same reason.
工程（ｉｉ）：
飽和脂質分子１５は、ベシクルフュージョン法により基板本体１１Ａ上に展開する。脂質分子はレジスト薄膜１６上には吸着しない。基板本体１１Ａ上に飽和脂質分子１５を展開した後、６０〜８０℃の温度で熱処理を施すことにより、凹部のみで飽和脂質分子１５からなる安定な脂質二分子膜が形成される。
Step (ii):
The saturated lipid molecule 15 is developed on the substrate body 11A by the vesicle fusion method. Lipid molecules are not adsorbed on the resist thin film 16. After the saturated lipid molecules 15 are developed on the substrate body 11A, a stable lipid bilayer film composed of the saturated lipid molecules 15 is formed only by the recesses by performing a heat treatment at a temperature of 60 to 80 ° C.
工程（ｉｉｉ）：
凸部上に残存するレジスト薄膜１６を紫外線照射により除去し、緩衝液で基板上を繰り返し洗浄する。ニッケル錯体脂質分子１４をベシクルフュージョン法で基板本体１１Ａ上に展開する。ニッケル錯体脂質分子１４は、飽和脂質分子１５が膜形成していない凸部上に堆積し、脂質二分子膜を形成する。
凹部では飽和脂質分子１５が最密充填構造の密な脂質二分子膜を形成しており、該脂質二分子膜にニッケル錯体脂質分子１４が混入することはほとんどないと考えられる。飽和脂質分子１５の脂質二分子膜上に、ニッケル錯体脂質分子１４の脂質二分子膜が積層することも考えられるが、その場合は緩衝液で繰り返し洗浄することで積層膜を容易に除去できる。
Step (iii):
The resist thin film 16 remaining on the convex portion is removed by ultraviolet irradiation, and the substrate is repeatedly washed with a buffer solution. The nickel complex lipid molecule 14 is developed on the substrate body 11A by the vesicle fusion method. The nickel complex lipid molecule 14 is deposited on the convex portion where the saturated lipid molecule 15 is not formed into a film, and forms a lipid bilayer.
In the recess, the saturated lipid molecules 15 form a close-packed dense lipid bilayer, and it is considered that the nickel complex lipid molecules 14 are hardly mixed into the lipid bilayer. It is conceivable that the lipid bilayer of the nickel complex lipid molecule 14 is laminated on the lipid bilayer of the saturated lipid molecule 15, but in that case, the laminated membrane can be easily removed by repeatedly washing with a buffer solution.
前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）によるパターン形成方法では、基板本体１１としてガラス基板や金属基板などを用いる場合、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５で基板表面全体を被覆することが好ましい。ガラス基板や金属基板の表面には生体分子１４が吸着しやすい。そのため、それらの基板の表面が露出していると、ニッケル錯体脂質分子１４以外の場所でも生体分子１３が固定化され、所望のパターンで選択的に生体分子１３を固定化することが困難になる。
また、生体分子固定化基板１においては、工程（ｉｉ）において、飽和脂質分子１５の代わりにニッケル錯体脂質分子１４を用いて凹部に脂質二分子膜を形成させ、工程（ｉｉｉ）において、ニッケル錯体脂質分子１４の代わりに飽和脂質分子１５を用いて脂質二分子膜を形成させてもよい。
In the pattern formation method according to the steps (i) to (iii), when a glass substrate, a metal substrate, or the like is used as the substrate body 11, it is preferable to cover the entire substrate surface with the nickel complex lipid molecules 14 and the saturated lipid molecules 15. The biomolecules 14 are easily adsorbed on the surface of the glass substrate or metal substrate. Therefore, if the surfaces of these substrates are exposed, the biomolecules 13 are immobilized at places other than the nickel complex lipid molecules 14, and it is difficult to selectively immobilize the biomolecules 13 in a desired pattern. .
In the biomolecule-immobilized substrate 1, in step (ii), a lipid bilayer is formed in the concave portion using the nickel complex lipid molecule 14 instead of the saturated lipid molecule 15, and in step (iii), the nickel complex is formed. A lipid bilayer may be formed using saturated lipid molecules 15 instead of lipid molecules 14.
前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の後、基板本体１１Ａ上の所定のパターンの脂質二分子膜１２に、生体分子１３を作用させることで、図５に示すように、生体分子１３を基板本体１１Ａ上に所定のパターンで固定化できる。
このように、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５のドメイン領域を所定のパターンで形成した生体分子固定化基板１は、高効率、高密度で生体分子１３を固定化できるため、バイオチップとして好適である。さらに、ナノスケールでパターン化された生体分子固定化基板１を用いれば、図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターンで生体分子１３を配列させて固定化したり、分子レベルで孤立させて固定化したりすることもできる。このような基板は、分子レベルでの生体分子間の反応メカニズムを解析する基板材料として有用である。
なお、該方法を用いれば、ニッケル錯体脂質分子１４と飽和脂質分子１５のような、飽和脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせを用いなくても、図３（ａ）〜（ｆ）に例示したようなパターン化が可能である。例えば、不飽和型のニッケル錯体脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせであっても、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行うことにより所定のパターンで脂質二分子膜を形成し、そのパターンで生体分子を固定化できる。
After the steps (i) to (iii), the biomolecules 13 are allowed to act on the lipid bilayer membrane 12 having a predetermined pattern on the substrate body 11A, thereby bringing the biomolecules 13 into the substrate body as shown in FIG. 11A can be fixed in a predetermined pattern.
As described above, since the biomolecule-immobilized substrate 1 in which the domain regions of the nickel complex lipid molecules 14 and the saturated lipid molecules 15 are formed in a predetermined pattern can immobilize the biomolecules 13 with high efficiency and high density, Is preferred. Furthermore, if the biomolecule-immobilized substrate 1 patterned on the nanoscale is used, the biomolecules 13 are arranged and fixed in the patterns illustrated in FIGS. 3A to 3F, or isolated at the molecular level. It can also be fixed. Such a substrate is useful as a substrate material for analyzing a reaction mechanism between biomolecules at a molecular level.
In addition, if this method is used, even if it does not use the combination of a saturated lipid molecule and an unsaturated lipid molecule like the nickel complex lipid molecule 14 and the saturated lipid molecule 15, it illustrated in FIG. 3 (a)-(f). Such patterning is possible. For example, even if it is a combination of an unsaturated nickel complex lipid molecule and an unsaturated lipid molecule, a lipid bilayer membrane is formed in a predetermined pattern by performing the steps (i) to (iii), and Biomolecules can be immobilized.
（第２実施形態）
本実施形態の生体分子固定化基板２は、図６（ａ）に示すように、基板本体２１と、基板本体２１上に形成された脂質二分子膜２２と、脂質二分子膜２２に固定化された生体分子２３とを有している。
基板本体２１は、平板状の基板であり、ナノメートルスケールの平坦な表面を有する。
脂質二分子膜２２は、不飽和型のニッケル錯体脂質分子２４と、不飽和脂質分子２５からなる。
ニッケル錯体脂質分子２４は、第１実施形態のニッケル錯体脂質分子１４と同じである。
不飽和脂質分子２５は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、ＤＯＰＣ）である。不飽和脂質分子２５は、図６（ｂ）に示すように、二重結合を含むアシル鎖からなる疎水部２５ａと、疎水部２５ａと結合している親水部２５ｂとからなる。不飽和脂質分子２５のゲル−液晶相転移温度は−２２℃である。
生体分子２３は、第１実施形態の生体分子１３と同様に、末端にヒスチジンタグ２３ａを有している。生体分子２３は、生体分子１３と同じものが挙げられ、好ましい態様も同じである。
(Second Embodiment)
As shown in FIG. 6A, the biomolecule-immobilized substrate 2 of the present embodiment is immobilized on the substrate body 21, the lipid bilayer membrane 22 formed on the substrate body 21, and the lipid bilayer membrane 22. The biomolecules 23 are made.
The substrate body 21 is a flat substrate and has a flat surface on a nanometer scale.
The lipid bilayer 22 includes an unsaturated nickel complex lipid molecule 24 and an unsaturated lipid molecule 25.
The nickel complex lipid molecule 24 is the same as the nickel complex lipid molecule 14 of the first embodiment.
The unsaturated lipid molecule 25 is 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC). As shown in FIG. 6B, the unsaturated lipid molecule 25 includes a hydrophobic portion 25a composed of an acyl chain containing a double bond, and a hydrophilic portion 25b bonded to the hydrophobic portion 25a. The gel-liquid crystal phase transition temperature of the unsaturated lipid molecule 25 is −22 ° C.
The biomolecule 23 has a histidine tag 23a at the end, like the biomolecule 13 of the first embodiment. Examples of the biomolecules 23 are the same as those of the biomolecules 13, and the preferred embodiments are also the same.
生体分子固定化基板２では、共に流動性の高い不飽和脂質分子同士を用いるため、ニッケル錯体脂質分子２４と不飽和脂質分子２５がそれぞれ均一に分散した脂質二分子膜２２が形成される。この脂質二分子膜２２のニッケル錯体脂質分子２４に生体分子２３を固定化することで、脂質二分子膜２２上に、生体分子２３を均一に分散させて固定化できる。
生体分子固定化基板２の製造方法は、ニッケル錯体脂質分子２４と不飽和脂質分子の混合脂質を用いる以外は、第１実施形態の生体分子固定化基板１と同じ製造方法が用いられる。また、生体分子固定化基板２に固定化した生体分子２３は、ＥＤＴＡなどのキレート剤を添加することで脱離させることができ、脂質二分子膜２２を有する基板は再利用できる。
Since the biomolecule-immobilized substrate 2 uses unsaturated lipid molecules having high fluidity, a lipid bilayer film 22 in which nickel complex lipid molecules 24 and unsaturated lipid molecules 25 are uniformly dispersed is formed. By immobilizing the biomolecules 23 on the nickel complex lipid molecules 24 of the lipid bilayer membrane 22, the biomolecules 23 can be uniformly dispersed and immobilized on the lipid bilayer membrane 22.
The manufacturing method of the biomolecule-immobilized substrate 2 is the same as that of the biomolecule-immobilized substrate 1 of the first embodiment, except that a mixed lipid of nickel complex lipid molecules 24 and unsaturated lipid molecules is used. Further, the biomolecule 23 immobilized on the biomolecule-immobilized substrate 2 can be detached by adding a chelating agent such as EDTA, and the substrate having the lipid bilayer membrane 22 can be reused.
以上説明した本発明の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化に脂質二分子膜を利用している。脂質二分子膜は細胞膜の基本構造であり、基板上に形成した脂質二分子膜に生体分子を固定化することで、生理条件に近い環境で生体分子が存在し得る。そのため、生体分子を非破壊で、かつ生理機能を保持したまま、長期間安定して基板上に担持でき、生体分子の生理機能の失活を抑制できる。また、不飽和型のニッケル錯体脂質分子を利用すれば、固定化した生体分子の流動性が特に優れた生体分子固定化基板が得られる。また、用いる脂質分子の種類及び混合比の調節、前記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のようなパターン形成方法により、基板上に固定化する生体分子の位置や密度、パターン化、配列化を高度に制御できる。また、生体分子固定化基板は、固定化の際の基板に対する処理が比較的少なく生産性が高い。 The biomolecule-immobilized substrate of the present invention described above uses a lipid bilayer for immobilizing biomolecules. A lipid bilayer membrane is a basic structure of a cell membrane. By immobilizing a biomolecule on a lipid bilayer membrane formed on a substrate, the biomolecule can exist in an environment close to physiological conditions. Therefore, the biomolecule can be stably supported on the substrate for a long time while maintaining the physiological function in a non-destructive manner, and the deactivation of the physiological function of the biomolecule can be suppressed. Moreover, if an unsaturated nickel complex lipid molecule is used, a biomolecule-immobilized substrate in which the fluidity of the immobilized biomolecule is particularly excellent can be obtained. In addition, by adjusting the type and mixing ratio of lipid molecules to be used and the pattern formation method as in the steps (i) to (iii), the position, density, patterning, and arrangement of biomolecules immobilized on the substrate are advanced. Can be controlled. In addition, the biomolecule-immobilized substrate has a relatively low amount of processing on the substrate at the time of immobilization and high productivity.
なお、本発明の生体分子固定化基板は、前述の生体分子固定化基板１、２には限定されない。例えば、飽和型のニッケル錯体脂質分子と飽和脂質分子の組み合わせ、又は飽和型のニッケル錯体脂質分子と不飽和脂質分子の組み合わせを用いて脂質二分子膜を形成した生体分子固定化基板であってもよく、ニッケル錯体脂質分子のみを用いて脂質二分子膜を形成した生体分子固定化基板であってもよい。
また、脂質二分子膜への生体分子の固定化は、ニッケル錯体脂質分子と、末端にヒスチジン残基を有する生体分子を用いる方法には限定されず、例えば、ビオチン化された脂質分子にストレプトアビジンを介して、ビオチン化タンパク質を固定化する方法であってもよい。
The biomolecule-immobilized substrate of the present invention is not limited to the biomolecule-immobilized substrates 1 and 2 described above. For example, even a biomolecule-immobilized substrate in which a lipid bilayer is formed using a combination of a saturated nickel complex lipid molecule and a saturated lipid molecule, or a combination of a saturated nickel complex lipid molecule and an unsaturated lipid molecule. It may be a biomolecule-immobilized substrate in which a lipid bilayer film is formed using only nickel complex lipid molecules.
The immobilization of biomolecules on the lipid bilayer membrane is not limited to a method using a nickel complex lipid molecule and a biomolecule having a histidine residue at the end. For example, streptavidin is added to a biotinylated lipid molecule. Alternatively, a method of immobilizing a biotinylated protein may be used.
＜生体分子輸送基板＞
本発明の生体分子輸送基板は、前述した生体分子固定化基板と同様に、基板本体上に脂質二分子膜が形成され、該脂質二分子膜に生体分子が固定化される基板であり、前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成される基板である。
室温で流動性の高い不飽和脂質分子（不飽和脂質分子２５、卵黄由来のホスファチジルコリンなど。）及び不飽和型のニッケル錯体脂質分子（ニッケル錯体脂質分子１４など。）を混合した脂質二分子膜は、自発展開現象を発現する。また、特開２００７−２４８２９０号公報には、基板表面に親水部及び疎水部からなるパターンを形成することで、脂質二分子膜の自発展開を制御できることが示されている。自発展開とは、基板表面上を、脂質二分子膜が自己組織化によって成長しつつ広がっていくことをいう。自発展開は、通常、緩衝液中で生じる。
本発明の生体分子輸送基板は、生体分子を固定化した脂質二分子膜の自発展開を制御することで、生体分子の基板上での輸送を可能にしたものである。
<Biomolecular transport substrate>
The biomolecule transport substrate of the present invention is a substrate in which a lipid bimolecular film is formed on a substrate body, and a biomolecule is immobilized on the lipid bilayer membrane, similar to the biomolecule-immobilized substrate described above, A predetermined pattern consisting of a hydrophilic portion and a hydrophobic portion is formed on the substrate body, and the lipid bilayer membrane is formed by spontaneously developing a lipid bilayer membrane having biomolecules immobilized on the hydrophilic portion surface. The substrate to be processed.
A lipid bilayer membrane in which unsaturated lipid molecules having high fluidity at room temperature (unsaturated lipid molecule 25, phosphatidylcholine derived from egg yolk, etc.) and unsaturated nickel complex lipid molecules (such as nickel complex lipid molecule 14) are mixed. , Expresses spontaneous development phenomenon. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-248290 discloses that spontaneous development of a lipid bilayer can be controlled by forming a pattern composed of a hydrophilic part and a hydrophobic part on a substrate surface. Spontaneous development means that the lipid bilayer grows and grows on the substrate surface by self-assembly. Spontaneous development usually occurs in buffer.
The biomolecule transport substrate of the present invention enables transport of biomolecules on the substrate by controlling the spontaneous development of the lipid bilayer membrane on which the biomolecules are immobilized.
以下、本発明の生体分子輸送基板の実施形態の一例を示して詳細に説明する。
本実施形態の生体分子輸送基板３は、図７に示すように、表面に親水部３２及び疎水部３３からなるパターンが形成された基板本体３１を有しており、生体分子３５が固定化された脂質二分子膜３４が親水部３２に自発展開される。すなわち、基板本体３１表面における親水部３２が脂質二分子膜３４を自発展開させる流路となり、該流路である親水部３２を経由して生体分子３５が輸送される。
Hereinafter, an example of an embodiment of the biomolecule transport substrate of the present invention will be shown and described in detail.
As shown in FIG. 7, the biomolecule transport substrate 3 of the present embodiment has a substrate body 31 on the surface of which a pattern composed of a hydrophilic portion 32 and a hydrophobic portion 33 is formed, and the biomolecule 35 is immobilized. The lipid bilayer 34 is spontaneously developed on the hydrophilic portion 32. That is, the hydrophilic part 32 on the surface of the substrate body 31 becomes a flow path for spontaneously developing the lipid bilayer membrane 34, and the biomolecule 35 is transported via the hydrophilic part 32 that is the flow path.
基板本体３１の材質としては、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ（雲母）などが挙げられる。更に、基板の表面を親水性にするような表面修飾を施したものを用いてもよい。 Examples of the material of the substrate body 31 include glass, quartz, silicon, sapphire, mica (mica), and the like. Furthermore, you may use what gave the surface modification which makes the surface of a board | substrate hydrophilic.
疎水部３３の材質としては、例えば、フォトレジストなどの樹脂、金、チタンなどの金属類が用いられる。
親水部３２は、試料収容部３２ａ及び３２ｂと、試料収容部３２ａと試料収容部３２ｂを連絡する複数の流路案内部３２ｃからなる。親水部３２は、すべて基板本体３１の親水性の表面から構成される。すなわち、親水部３２は、親水性の表面を有する基板本体３１の表面に、フォトレジストなどで疎水膜を形成し、該疎水膜を所定のパターンで剥離することにより形成される。
表面に親水部３２及び疎水部３３からなるパターンが形成された基板本体３１は、特開２００７−２４８２９０号公報に記載の方法で製造できる。
As a material of the hydrophobic portion 33, for example, a resin such as a photoresist, or a metal such as gold or titanium is used.
The hydrophilic portion 32 includes sample storage portions 32a and 32b, and a plurality of flow path guide portions 32c that connect the sample storage portion 32a and the sample storage portion 32b. All of the hydrophilic portions 32 are constituted by the hydrophilic surface of the substrate body 31. That is, the hydrophilic portion 32 is formed by forming a hydrophobic film with a photoresist or the like on the surface of the substrate body 31 having a hydrophilic surface and peeling the hydrophobic film in a predetermined pattern.
The substrate body 31 having a surface formed with a pattern including the hydrophilic portion 32 and the hydrophobic portion 33 can be manufactured by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-248290.
試料収容部３２ａに生体分子が固定化された脂質二分子膜３４を配置し（図７、点Ｓ）、親水部３２が覆われるように基板本体３１表面に緩衝液を滴下する。これにより、脂質二分子膜３４が流路案内部３２ｃを経由して他方の試料収容部３２ｂまで自発展開し、脂質二分子膜３４に固定化された生体分子３５が試料収容部３２ｂまで輸送される。 A lipid bilayer membrane 34 in which biomolecules are immobilized is disposed in the sample storage portion 32a (FIG. 7, point S), and a buffer solution is dropped onto the surface of the substrate body 31 so that the hydrophilic portion 32 is covered. As a result, the lipid bilayer membrane 34 spontaneously expands to the other sample storage portion 32b via the flow path guide portion 32c, and the biomolecule 35 immobilized on the lipid bilayer membrane 34 is transported to the sample storage portion 32b. The
以上説明した本発明の生体分子輸送基板は、生体分子を脂質二分子膜に固定化するため、固定化した生体分子の流動性が高く、基板上で生体分子を輸送できる。また、脂質二分子膜上に固定化することで生体分子の安定性が高くなるため、その生理機能の失活を抑制できる。また、生体分子輸送基板は、生産性が高い。
なお、本発明の生体分子輸送基板は、前述した生体分子固定化基板３には限定されない。例えば、親水部３２及び疎水部３３からなるパターンは特に限定されず、所望の流路が形成されるように適宜選定できる。
Since the biomolecule transport substrate of the present invention described above immobilizes biomolecules on the lipid bilayer membrane, the immobilized biomolecules have high fluidity and can transport biomolecules on the substrate. In addition, immobilization on a lipid bilayer increases the stability of biomolecules, so that the deactivation of physiological functions can be suppressed. In addition, the biomolecule transport substrate has high productivity.
The biomolecule transport substrate of the present invention is not limited to the biomolecule-immobilized substrate 3 described above. For example, the pattern composed of the hydrophilic portion 32 and the hydrophobic portion 33 is not particularly limited, and can be appropriately selected so that a desired flow path is formed.
＜バイオチップ＞
本発明のバイオチップは、前述した本発明の生体分子固定化基板又は生体分子輸送基板を用いたものである。
生体分子の診断、検出では、多くの場合、試料中には多検体の分子が含まれる。そのため、バイオチップには、多検体の分子を同時に、短時間で、分子選択的に判定、定量できるように素子構造化されることが求められる。すなわち、バイオチップには、検体となる生体分子のハイスループットスクリーニング機能が付与されることが求められる。
<Biochip>
The biochip of the present invention uses the aforementioned biomolecule-immobilized substrate or biomolecule transport substrate of the present invention.
In diagnosis and detection of biomolecules, in many cases, a sample contains many analyte molecules. Therefore, the biochip is required to have an element structure so that multiple analyte molecules can be simultaneously determined and quantified in a short time in a short time. That is, the biochip is required to be provided with a high-throughput screening function for biomolecules serving as specimens.
本発明のバイオチップは、検出部として、種類及び／又は濃度が異なる特定の生体分子がそれぞれ固定化された脂質二分子膜が形成される生体分子配置部を複数設けることで、ハイスループットスクリーニング機能が付与できる。かかるバイオチップの素子構造としては、基板本体上の親水部及び疎水部のパターンを利用した流路型が好ましい。
以下、本発明のバイオチップの実施形態の一例として、親水部及び疎水部からなるパターンを有する生体分子輸送基板を利用した、流路型の素子構造を有するバイオチップを示して詳細に説明する。
The biochip of the present invention has a high-throughput screening function by providing a plurality of biomolecule arrangement portions on which lipid bilayer membranes each of which specific biomolecules of different types and / or concentrations are immobilized are formed as detection portions. Can be granted. As a device structure of such a biochip, a flow path type utilizing a pattern of hydrophilic and hydrophobic portions on the substrate body is preferable.
Hereinafter, as an example of an embodiment of a biochip of the present invention, a biochip having a flow channel element structure using a biomolecule transport substrate having a pattern composed of a hydrophilic portion and a hydrophobic portion will be described in detail.
本実施形態のバイオチップ４は、図８に示すように、基板本体４１上に、３つの試料配置部４２ａ〜４２ｃと、１つの試薬配置部４３と、１つの検出部（ドレイン）４４とが設けられている。検出部４４には、３つの生体分子配置部４４ａ〜４４ｃが設けられている。各々の生体分子配置部４４ａ〜４４ｃには、それぞれ異なる種類の生体分子ａ〜ｃが固定化された脂質二分子膜が形成されている。また、試料配置部４２ａ〜４２ｃと、試薬配置部４３と、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃとは、流路案内部４５により連絡されている。
試料配置部４２ａ〜４２ｃ、試薬配置部４３、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃ及び流路案内部４５は、親水部である。基板本体４１上のそれ以外の部分は、金属やレジストなどからなる疎水部である。
流路案内部４５の幅は、１〜１００μｍが好ましい。
As shown in FIG. 8, the biochip 4 of the present embodiment includes three sample placement units 42 a to 42 c, one reagent placement unit 43, and one detection unit (drain) 44 on a substrate body 41. Is provided. The detection unit 44 is provided with three biomolecule arrangement units 44a to 44c. Each biomolecule arrangement part 44a-44c is formed with a lipid bilayer membrane in which different types of biomolecules a-c are immobilized. The sample placement units 42 a to 42 c, the reagent placement unit 43, and the biomolecule placement units 44 a to 44 c are communicated with each other by a flow path guide unit 45.
The sample placement portions 42a to 42c, the reagent placement portion 43, the biomolecule placement portions 44a to 44c, and the flow path guide portion 45 are hydrophilic portions. The other part on the substrate body 41 is a hydrophobic part made of metal, resist or the like.
The width of the channel guide 45 is preferably 1 to 100 μm.
バイオチップ４による診断・検出は、例えば、以下の手順で実施できる。
３つの試料配置部４２ａ〜４２ｃに脂質二分子膜を形成し、それぞれの脂質二分子膜上に、検体として末端にヒスチジン残基を有する異なる種類の生体分子を含む検体試料を配する。各試料は、脂質二分子膜の自発展開により輸送され、流路案内部４５に流入して混合される。流路案内部４５では、試薬配置部４３から任意に試薬を流入させて、混合試料に試薬を混合し、試料中の生体分子と反応させることもできる。混合試料は、生体分子配置部４４ａ〜４４ｃに流入する。
Diagnosis / detection by the biochip 4 can be performed, for example, by the following procedure.
Lipid bilayers are formed on the three sample placement sections 42a to 42c, and specimen samples containing different types of biomolecules having histidine residues at the ends are arranged as specimens on the respective lipid bilayers. Each sample is transported by the spontaneous development of the lipid bilayer, and flows into the channel guide 45 and mixed. In the flow path guide unit 45, a reagent can be arbitrarily introduced from the reagent arrangement unit 43, the reagent can be mixed with the mixed sample, and reacted with a biomolecule in the sample. The mixed sample flows into the biomolecule arrangement portions 44a to 44c.
検出部４４では、例えば、試料中に生体分子ａと結合する標的分子がある場合、該標的分子が生体分子配置部４４ａにおいて生体分子ａと結合する。オプティカルプローブ５０により各生体分子配置部４４ａ〜４４ｃの分光測定を行うことで、検体試料中の標的分子が特異的に結合した生体分子配置部４４ａ〜４４ｃにおいてのみ、分光信号が観測される。
この流路型のバイオチップ４を用いることにより、試料中に含まれる標的分子を、分子選択的に、同定、定量、診断することが可能となる。
In the detection unit 44, for example, when there is a target molecule that binds to the biomolecule a in the sample, the target molecule binds to the biomolecule a in the biomolecule arrangement unit 44a. By performing spectroscopic measurement of each biomolecule arrangement part 44a to 44c with the optical probe 50, a spectroscopic signal is observed only in the biomolecule arrangement part 44a to 44c to which the target molecule in the specimen sample is specifically bound.
By using this flow path type biochip 4, it becomes possible to identify, quantify, and diagnose target molecules contained in a sample in a molecular selective manner.
以上説明したバイオチップでは、検出部における生体分子配置部に短時間、かつ高収率で生体分子を固定化できる。また、生体分子は脂質二分子膜に固定化するため、固定化された生体分子の流動性及び安定性が高く、生理機能が長期間にわたり保持される。さらに、固定化する生体分子の位置及び密度の制御、パターンニング、生体分子の輸送などが容易に達成できる。そのため、バイオチップ上の反応点（検出部）を高密度に集積させることが可能であり、バイオチップのスループットの向上、高感度化、小型化、生体分子の輸送に伴う逐次的な生体分子反応計測などの付加価値が得られる。 In the biochip described above, it is possible to immobilize biomolecules in a short time and in a high yield on the biomolecule arrangement part in the detection part. Further, since the biomolecule is immobilized on the lipid bilayer membrane, the immobilized biomolecule has high fluidity and stability, and the physiological function is maintained for a long time. Furthermore, control of the position and density of the biomolecule to be immobilized, patterning, transport of the biomolecule, and the like can be easily achieved. Therefore, it is possible to integrate the reaction points (detection parts) on the biochip with high density, and the biomolecule reaction is a sequential biomolecule reaction that is accompanied by improved biochip throughput, higher sensitivity, smaller size, and transport of biomolecules. Added value such as measurement.
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
本実施例では、生体分子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用い、生体分子固定化基板及び生体分子輸送基板を作製した。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Comparative Examples. However, the present invention is not limited by the following description.
In this example, green fluorescent protein (GFP) was used as a biomolecule, and a biomolecule-immobilized substrate and a biomolecule transport substrate were produced.
＜生体分子固定化基板＞
以下、生体分子固定化基板を作製した例について説明する。
［実施例１］
（脂質二分子膜の形成）
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＳＰＣ、１０ｍＭ）のクロロホルム溶液と、ニッケル錯体脂質分子（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［（Ｎ−（５−アミノ−１−カルボキシペンチル）イミノジアセティックアシッド）スクシニル］（ニッケル塩）、１ｍＭ）のクロロホルム溶液をそれぞれ調製した。その後、脂質全体の質量が２．０ｍｇ、かつ、混合比がＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝５０：５０（ｍｏｌ％）となるように、それぞれのクロロホルム溶液をガラス瓶内で混合した。その後、混合液にアルゴンガスを吹き付けてクロロホルム溶液を蒸発させ、混合脂質分子からなる膜をガラス瓶の内壁に形成した。さらに、真空下で終夜乾燥し、クロロホルムを完全に除去した。次に、該ガラス瓶に、１．０ｍＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を加え、１分間超音波処理を施し、該緩衝液内で脂質ベシクルを形成した。さらに、該緩衝液をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈（脂質濃度０．２ｍｇ／ｍＬ）し、試料溶液とした。
次に、へき開したマイカ基板上に、前記試料溶液を２０μＬ滴下し、さらにＰＢＳ緩衝液を２００μＬ程度加えた後、該マイカ基板を３０分間、６０℃でアニール処理した。該アニール処理により、脂質ベシクルが素早くマイカ基板上に吸着し、脂質二分子膜が形成された。３０分間静置して試料を室温に戻した後、マイカ基板上の試料の上澄み溶液を吸い取り、脂質分子を含まない以外は試料溶液と同じ組成の緩衝液を滴下する洗浄処理を５回繰り返し、マイカ基板に吸着していない脂質分子を除去して清浄化した。
得られた基板は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）で観察した。該基板のＡＦＭ像を図９（ａ）に示す。
<Biomolecule-immobilized substrate>
Hereinafter, the example which produced the biomolecule fixed board | substrate is demonstrated.
[Example 1]
(Formation of lipid bilayer)
A chloroform solution of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC, 10 mM) and a nickel complex lipid molecule (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N- (5- Amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt), 1 mM) in chloroform was prepared. Thereafter, the respective chloroform solutions were mixed in a glass bottle so that the mass of the whole lipid was 2.0 mg and the mixing ratio was DSPC: nickel complex lipid molecule = 50: 50 (mol%). Then, argon gas was sprayed on the mixed solution to evaporate the chloroform solution, and a film composed of mixed lipid molecules was formed on the inner wall of the glass bottle. Furthermore, it dried under vacuum all night and chloroform was removed completely. Next, 1.0 mL of phosphate buffer (PBS buffer, 0.1 M sodium phosphate, 0.15 M sodium chloride, pH 7.2) is added to the glass bottle, and subjected to ultrasonic treatment for 1 minute. Lipid vesicles were formed in the liquid. Further, the buffer solution was diluted 10 times with a PBS buffer solution (lipid concentration: 0.2 mg / mL) to obtain a sample solution.
Next, 20 μL of the sample solution was dropped on the cleaved mica substrate, and about 200 μL of PBS buffer solution was further added, and then the mica substrate was annealed at 60 ° C. for 30 minutes. By the annealing treatment, lipid vesicles were quickly adsorbed on the mica substrate, and a lipid bilayer film was formed. After allowing the sample to stand for 30 minutes and returning the sample to room temperature, the supernatant solution on the mica substrate is sucked off, and a washing process in which a buffer solution having the same composition as that of the sample solution is added except that it does not contain lipid molecules is repeated five times Lipid molecules not adsorbed on the mica substrate were removed and cleaned.
The obtained substrate was observed with an atomic force microscope (AFM). An AFM image of the substrate is shown in FIG.
（生体分子の固定化）
末端がヒスチジンタグ化された緑色蛍光タンパク質（rTurbo GFP、Evogen社製）にＰＢＳ緩衝液を加え、１０μｇ／ｍＬのＧＦＰ溶液を調製した。マイカ基板上に形成した脂質二分子膜上に、該ＧＦＰ溶液を２０μＬ滴下し、吸着時間として３０分静置した。添加したＧＦＰの分子数は７．４×１０−１２ｍｏｌであり、脂質二分子膜内のニッケル錯体脂質分子の分子数（５０ｍｏｌ％混合比）は２．２×１０−９ｍｏｌであった。
その後、ＧＦＰ溶液の上澄み溶液を吸い取り、試料の上澄み溶液を吸い取り、ＰＢＳ緩衝液を滴下し、その上澄み液を吸い取る洗浄処理を５回繰り返し、ニッケル錯体脂質分子に吸着していないＧＦＰを除去して清浄化し、生体分子固定化基板を得た。
ＧＦＰ添加前の基板と、ＧＦＰを添加して得られた生体分子固定化基板は、レーザー蛍光顕微鏡（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター、４０倍対物レンズ）にて観察した。ＧＦＰ添加前の基板の蛍光像を図１０（ａ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｂ）に示す。
(Immobilization of biomolecules)
PBS buffer solution was added to green fluorescent protein (rTurbo GFP, manufactured by Evogen) whose end was histidine-tagged to prepare a 10 μg / mL GFP solution. 20 μL of the GFP solution was dropped onto a lipid bilayer formed on a mica substrate, and left for 30 minutes as an adsorption time. The number of GFP molecules added was 7.4 × 10 −12 mol, and the number of nickel complex lipid molecules in the lipid bilayer membrane (50 mol% mixing ratio) was 2.2 × 10 −9 mol.
Thereafter, the supernatant solution of the GFP solution is aspirated, the supernatant solution of the sample is aspirated, PBS buffer solution is added dropwise, and the washing process of aspirating the supernatant solution is repeated 5 times to remove GFP that is not adsorbed on the nickel complex lipid molecules. The substrate was cleaned to obtain a biomolecule-immobilized substrate.
The substrate before GFP addition and the biomolecule-immobilized substrate obtained by adding GFP are applied to a laser fluorescence microscope (excitation: 488 nm argon laser, observation: fluorescence filter for 505-525 nm region observation, 40 × objective lens). And observed. FIG. 10 (a) shows the fluorescence image of the substrate before the addition of GFP, and FIG. 10 (b) shows the fluorescence image of the substrate after the addition of GFP.
［実施例２］
ＤＳＰＣとニッケル錯体脂質分子の混合比を、ＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝７０：３０（ｍｏｌ％）とした以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。脂質二分子膜を形成した基板のＡＦＭ像を図９（ｂ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｃ）に示す。
[Example 2]
A lipid bilayer was formed in the same manner as in Example 1 except that the mixing ratio of DSPC and the nickel complex lipid molecule was DSPC: nickel complex lipid molecule = 70: 30 (mol%), and GFP was immobilized. A biomolecule-immobilized substrate was obtained. FIG. 9B shows an AFM image of the substrate on which the lipid bilayer membrane is formed, and FIG. 10C shows a fluorescence image of the substrate after the addition of GFP.
［実施例３］
ＤＳＰＣとニッケル錯体脂質分子の混合比を、ＤＳＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝９０：１０（ｍｏｌ％）とした以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。脂質二分子膜を形成した基板のＡＦＭ像を図９（ｃ）、ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１０（ｄ）に示す。
[Example 3]
A lipid bilayer was formed in the same manner as in Example 1 except that the mixing ratio of DSPC and the nickel complex lipid molecule was DSPC: nickel complex lipid molecule = 90: 10 (mol%), and GFP was immobilized. A biomolecule-immobilized substrate was obtained. FIG. 9C shows an AFM image of the substrate on which the lipid bilayer membrane is formed, and FIG. 10D shows a fluorescence image of the substrate after the addition of GFP.
図７（ａ）に示すように、実施例１では、マイカ基板上に脂質二分子膜を形成した際、直径約１〜２μｍのドメイン領域（以下、「ドメイン領域Ａ」という。）と、ドメイン領域Ａとの高さの差が１ｎｍのドメイン領域（以下、「ドメイン領域Ｂ」という。）が観測された。また、図７（ｂ）、（ｃ）に示すように、実施例２及び３でＤＳＰＣの割合を増加させた場合、ドメイン領域Ａの面積が増大した。このことから、ドメイン領域ＡがＤＳＰＣからなるドメイン領域であり、ドメイン領域Ｂがニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域であることがわかった。ドメイン領域Ａはマイカ基板からの高さが約５ｎｍであった。また、ドメイン領域Ａ、Ｂは、ともに脂質二分子膜の単分子膜構造を形成していた。
観測したＡＦＭ像から、ドメイン領域Ａの面積を計測したところ、脂質二分子膜全体に対する面積比は、実施例１が４７％、実施例２が８１％、実施例３が９４％であり、各例における試料溶液中の混合比とほぼ一致していた。このように、アシル鎖同士の分子間の相互作用が強い飽和型のＤＳＰＣと、不飽和型のニッケル錯体脂質分子を用いることにより、飽和型のＤＳＰＣの周りを不飽和型のニッケル錯体脂質分子が流動的に取り囲んだドメイン領域を有する脂質二分子膜を形成できることが確認された。
As shown in FIG. 7A, in Example 1, when a lipid bilayer was formed on a mica substrate, a domain region having a diameter of about 1 to 2 μm (hereinafter referred to as “domain region A”), and a domain A domain region having a height difference of 1 nm from the region A (hereinafter referred to as “domain region B”) was observed. Further, as shown in FIGS. 7B and 7C, when the ratio of DSPC was increased in Examples 2 and 3, the area of the domain region A increased. From this, it was found that the domain region A is a domain region composed of DSPC, and the domain region B is a domain region composed of nickel complex lipid molecules. The domain region A had a height from the mica substrate of about 5 nm. The domain regions A and B both formed a monolayer structure of a lipid bilayer.
When the area of the domain region A was measured from the observed AFM image, the area ratio to the entire lipid bilayer membrane was 47% in Example 1, 81% in Example 2, and 94% in Example 3. It almost coincided with the mixing ratio in the sample solution in the example. As described above, by using saturated DSPC having strong interaction between molecules of acyl chains and unsaturated nickel complex lipid molecules, unsaturated nickel complex lipid molecules are surrounded around saturated DSPC. It was confirmed that a lipid bilayer membrane having a fluidly surrounded domain region can be formed.
また、実施例１におけるＧＦＰの固定化については、図１０（ａ）に示すように、ＧＦＰ添加前は脂質二分子膜の蛍光像は得られないが、ＧＦＰを添加した後は、図１０（ｂ）に示すように、緑色の蛍光像が得られた。また、図１０（ｂ）の蛍光像と図９（ａ）のＡＦＭ像との対応から、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域Ｂのみから蛍光が観測されていることが分かった。すなわち、末端がヒスチジンタグ化されたＧＦＰは、ニッケル錯体脂質分子と特異的に結合した。同様に、実施例２及び３についても、図１０（ｃ）及び図１０（ｄ）に示すように、緑色の蛍光像が観測され、図９（ｂ）及び図９（ｃ）との対応から、ニッケル錯体脂質分子からなるドメイン領域Ｂのみから蛍光が観測されていることが確認された。
このように、ニッケル錯体脂質分子と、末端がヒスチジンタグ化された生体分子を用いることにより、生体分子を特定の領域のみに選択的に固定化できることが確認された。
In addition, regarding the immobilization of GFP in Example 1, as shown in FIG. 10 (a), a fluorescence image of the lipid bilayer membrane is not obtained before GFP addition, but after addition of GFP, FIG. As shown in b), a green fluorescent image was obtained. Further, from the correspondence between the fluorescence image of FIG. 10B and the AFM image of FIG. 9A, it was found that fluorescence was observed only from the domain region B made of nickel complex lipid molecules. That is, the histidine-tagged GFP specifically bound to the nickel complex lipid molecule. Similarly, in Examples 2 and 3, as shown in FIGS. 10 (c) and 10 (d), a green fluorescent image is observed, and from the correspondence with FIGS. 9 (b) and 9 (c). It was confirmed that fluorescence was observed only from the domain region B composed of nickel complex lipid molecules.
Thus, it was confirmed that a biomolecule can be selectively immobilized only in a specific region by using a nickel complex lipid molecule and a biomolecule having a histidine tag at the end.
［実施例４］
ＤＳＰＣを１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォコリン（ＤＯＰＣ）に変更し、６０℃でのアニール処理を施さずに室温で静置して脂質二分子膜を形成した以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成した。その結果、各脂質分子はドメイン領域を形成せず、それぞれが均一に分散した脂質二分子膜が形成された（図示せず）。これは、不飽和型のＤＯＰＣとニッケル錯体脂質は、室温で両者とも液晶相であり、双方が流動的に混ざり合うためである。
次に、実施例１と同様にして、脂質二分子膜上にＧＦＰを固定化して生体分子固定化基板を得た。ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１１（ａ）に示す。
[Example 4]
Except that DSPC was changed to 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and left at room temperature without annealing at 60 ° C. to form a lipid bilayer. A lipid bilayer was formed in the same manner as in Example 1. As a result, each lipid molecule did not form a domain region, and a lipid bilayer membrane in which each was uniformly dispersed was formed (not shown). This is because unsaturated DOPC and nickel complex lipid are both in a liquid crystal phase at room temperature, and both are fluidly mixed.
Next, in the same manner as in Example 1, GFP was immobilized on the lipid bilayer membrane to obtain a biomolecule-immobilized substrate. The fluorescence image of the substrate after the addition of GFP is shown in FIG.
［比較例１］
ニッケル錯体脂質分子を用いない以外は、実施例１と同様にして脂質二分子膜を形成し、ＧＦＰの固定化を行った。ＧＦＰ添加後の基板の蛍光像を図１１（ｂ）に示す。
[Comparative Example 1]
A lipid bilayer was formed in the same manner as in Example 1 except that nickel complex lipid molecules were not used, and GFP was immobilized. FIG. 11B shows a fluorescence image of the substrate after the addition of GFP.
ＤＯＰＣ：ニッケル錯体脂質分子の混合比を５０：５０（ｍｏｌ％）で形成した脂質二分子膜上にＧＦＰ溶液を添加した実施例４では、図１１（ａ）に示すように、脂質間二分子膜全体に均一に緑色の蛍光像が観測された。
一方、ＤＯＰＣのみからなる脂質二分子膜にＧＦＰ溶液を添加した比較例１では、脂質二分子膜上にヒスチジン残基の吸着サイトが存在しないため、図１１（ｂ）に示すように、ＧＦＰは膜上には固定化されず、蛍光像は観測されなかった。
以上のように、本発明の生体分子固定化基板では、ニッケル錯体脂質分子と組み合わせる脂質分子の種類（飽和・不飽和）や、その混合比などを変化させることにより、タンパク質などの生体分子の固定化密度、固定化領域（局所的あるいは分散）を容易に制御できることが確認された。
In Example 4 in which a GFP solution was added onto a lipid bilayer formed with a mixing ratio of DOPC: nickel complex lipid molecules of 50:50 (mol%), as shown in FIG. A uniform green fluorescent image was observed throughout the film.
On the other hand, in Comparative Example 1 in which a GFP solution was added to a lipid bilayer consisting only of DOPC, since there is no adsorption site for histidine residues on the lipid bilayer, as shown in FIG. It was not immobilized on the film and no fluorescence image was observed.
As described above, the biomolecule-immobilized substrate of the present invention can immobilize biomolecules such as proteins by changing the type (saturation / unsaturation) of lipid molecules combined with nickel complex lipid molecules and the mixing ratio thereof. It was confirmed that the density and the immobilization area (local or dispersion) can be easily controlled.
＜生体分子輸送基板＞
以下、生体分子輸送基板を作製した例について説明する。
［実施例５］
実施例４と同じＤＯＰＣとニッケル錯体脂質分子からなる脂質二分子膜を用い、室温でのＧＦＰの輸送を試みた。
（タンパク質輸送用試料）
実施例１と同様にして、ＤＯＰＣ：ニッケル錯体脂質分子＝５０：５０（ｍｏｌ％）（合計脂質量：２ｍｇ）になるように、それぞれのクロロホルム溶液を混合した。その混合溶液中に、ＰＢＳ緩衝液で１０μｇ／ｍＬの濃度に調製したＧＦＰ（rTurbo GFP、Evogen社製）を２００μＬ添加した（ＧＦＰ量：２μｇ）。次に、双溶性溶媒であるエタノール１００μＬ程度を、双方の溶液が均一に混合するように添加した。その後、アルゴンガスを吹き付けて、全ての溶液を蒸発させ、ＧＦＰが固定化された混合脂質分子を含む脂質二分子膜をガラス瓶の内壁に形成した。これを真空下で終夜乾燥させ、残存する溶液を完全に除去した。さらに、再度、試料を微量のクロロホルムに浸し、クロロホルムを乾燥させてタンパク質輸送用試料とした。該試料中のＧＦＰの分子数は７．４×１０−１１ｍｏｌであり、混合脂質中のニッケル錯体脂質分子の分子数（５０ｍｏｌ％混合比）は２．２×１０−７ｍｏｌであった。
<Biomolecular transport substrate>
Hereinafter, an example of producing a biomolecule transport substrate will be described.
[Example 5]
The transport of GFP at room temperature was attempted using the same lipid bilayer membrane composed of DOPC and nickel complex lipid molecules as in Example 4.
(Sample for protein transport)
In the same manner as in Example 1, each chloroform solution was mixed so that DOPC: nickel complex lipid molecule = 50: 50 (mol%) (total lipid amount: 2 mg). In the mixed solution, 200 μL of GFP (rTurbo GFP, manufactured by Evogen) adjusted to a concentration of 10 μg / mL with PBS buffer was added (GFP amount: 2 μg). Next, about 100 μL of ethanol, which is a bi-soluble solvent, was added so that both solutions were uniformly mixed. Thereafter, argon gas was blown to evaporate all the solutions, and a lipid bilayer film containing mixed lipid molecules in which GFP was immobilized was formed on the inner wall of the glass bottle. This was dried overnight under vacuum to completely remove the remaining solution. Furthermore, the sample was again immersed in a small amount of chloroform, and the chloroform was dried to obtain a sample for protein transport. The number of GFP molecules in the sample was 7.4 × 10 −11 mol, and the number of nickel complex lipid molecules in the mixed lipid (50 mol% mixing ratio) was 2.2 × 10 −7 mol.
（パターン化流路基板）
ガラス基板（ガラスウエハ）上に、プライマーとしてヘキサメチルジシロキサンを滴下し、毎分５００回転で３０秒間、引き続き毎分２０００回転で３０秒間のスピンコートを行った。次いで、フォトレジスト（ＴＳＭＲ−Ｖ３、東京応化工業社製）を滴下し、毎分５００回転で３０秒間、引き続き毎分２０００回転で３０秒間のスピンコートを行った。このガラス基板を１２０℃のオーブンで９０秒間ベーキングした。これをフォトマスクによって露光し、引き続き現像した。次に、スパッタ蒸着法によって、ガラス基板上にチタンを５ｎｍ蒸着し、さらに金を４５ｎｍ蒸着した。スパッタ蒸着後のガラス基板を、メチルエチルケトンに浸漬して超音波処理し、リフトオフプロセスによりレジストを溶解・剥離した。次いで、純水流水下で洗浄し、図７に例示した、親水部及び疎水部からなるパターンを有するパターン化流路基板を得た。その後、該パターン化流路基板を、ピラニア溶液（過酸化水素水：硫酸＝１：４）、及びフッ化アンモニウム溶液を用いて洗浄し、ガラス表面のＳｉＯ２面をエッチングして親水化処理を施した。
(Pattern channel substrate)
Hexamethyldisiloxane was dropped as a primer on a glass substrate (glass wafer), and spin coating was performed at 500 rpm for 30 seconds, followed by 2000 rpm for 30 seconds. Next, a photoresist (TSMR-V3, manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) was dropped, and spin coating was performed at 500 rpm for 30 seconds, followed by 2000 rpm for 30 seconds. This glass substrate was baked in an oven at 120 ° C. for 90 seconds. This was exposed with a photomask and subsequently developed. Next, 5 nm of titanium was vapor-deposited on the glass substrate by sputtering, and gold was further vapor-deposited by 45 nm. The sputter-deposited glass substrate was immersed in methyl ethyl ketone and subjected to ultrasonic treatment, and the resist was dissolved and peeled off by a lift-off process. Next, the substrate was washed under running pure water to obtain a patterned flow path substrate having a pattern composed of a hydrophilic portion and a hydrophobic portion, as exemplified in FIG. Thereafter, the patterned flow path substrate is washed with a piranha solution (hydrogen peroxide solution: sulfuric acid = 1: 4) and an ammonium fluoride solution, and the SiO 2 surface of the glass surface is etched to perform a hydrophilic treatment. gave.
（タンパク質の輸送）
前記タンパク質輸送用試料をガラス製キャピラリーの先端に付着させ、前記パターン化流路基板の一方の試料収容部（図７、試料収容部３２ａ）に配置した。その後のパターン化流路基板をレーザー蛍光顕微鏡で観察したところ、青色入射光の励起により、前記試料収容部でＧＦＰ由来の緑色発光が確認された（図示せず）。この状態で、レーザー蛍光顕微鏡の対物レンズ（４０倍レンズ使用）と試料との間に、ＰＢＳ緩衝液を静かに注入した。該ＰＢＳ緩衝液の注入から３０、３００、６００、９００、１２００、１５００秒後の蛍光像を図１２（ａ）〜（ｆ）に示す。
(Protein transport)
The protein transport sample was attached to the tip of a glass capillary and placed in one sample storage part (FIG. 7, sample storage part 32a) of the patterned flow path substrate. When the subsequent patterned flow path substrate was observed with a laser fluorescence microscope, green light emission derived from GFP was confirmed in the sample container by excitation of blue incident light (not shown). In this state, a PBS buffer solution was gently injected between the objective lens (using a 40 × lens) of the laser fluorescence microscope and the sample. Fluorescence images 30, 300, 600, 900, 1200, 1500 seconds after injection of the PBS buffer are shown in FIGS.
図１２（ａ）〜（ｆ）に示すように、流動性の高い脂質分子が親水性の流路内で自発展開し、その自発展開に伴って脂質二分子膜上に固定化されたＧＦＰが輸送された。このＧＦＰの輸送は、疎水的な金属からなる流路外の部分には展開しなかった。また、この生体分子輸送基板は、表面を洗浄して親水性処理を施していたため、有機物質の不純物の存在などによって自発展開速度が遅延するなどの不都合は確認されなかった。 As shown in FIGS. 12 (a) to (f), lipid molecules having high fluidity spontaneously expand in a hydrophilic flow path, and GFP immobilized on the lipid bilayer membrane accompanying the spontaneous expansion is produced. Was transported. This GFP transport did not develop in the portion outside the channel made of hydrophobic metal. In addition, since the biomolecule transport substrate was subjected to a hydrophilic treatment by cleaning the surface, inconveniences such as a delay in the spontaneous development speed due to the presence of impurities of the organic substance were not confirmed.
１、２ 生体分子固定化基板 １１ 基板本体 １２ 脂質二分子膜 １３ 生体分子 １４ ニッケル錯体脂質分子 １５ 飽和脂質分子 ３ 生体分子輸送基板 ３１ 基板本体 ３２ 親水部 ３３ 疎水部 ３４ 脂質二分子膜 ４ バイオチップ 1, 2 Biomolecule-immobilized substrate 11 Substrate body 12 Lipid bilayer membrane 13 Biomolecule 14 Nickel complex lipid molecule 15 Saturated lipid molecule 3 Biomolecule transport substrate 31 Substrate body 32 Hydrophilic portion 33 Hydrophobic portion 34 Lipid bilayer membrane 4 Biochip
Claims (8)
前記ニッケル錯体脂質分子のニッケル錯体部位と、前記生体分子のヒスチジン残基の結合により該生体分子が固定化されている、請求項１に記載の生体分子固定化基板。 The lipid bilayer membrane includes a nickel complex lipid molecule having a nickel complex site that binds to a histidine residue, and the biomolecule has a histidine residue;
The biomolecule-immobilized substrate according to claim 1, wherein the biomolecule is immobilized by binding of a nickel complex site of the nickel complex lipid molecule and a histidine residue of the biomolecule.
前記基板本体上に親水部と疎水部からなる所定のパターンが形成されており、
前記脂質二分子膜が、前記親水部表面に、生体分子が固定化された脂質二分子膜を自発展開させて形成されることを特徴とする生体分子輸送基板。 A lipid bilayer film is formed on a substrate body, and a biomolecule is immobilized on the lipid bilayer film,
A predetermined pattern consisting of a hydrophilic part and a hydrophobic part is formed on the substrate body,
The biomolecule transport substrate, wherein the lipid bilayer membrane is formed by spontaneously developing a lipid bilayer membrane having biomolecules immobilized on the surface of the hydrophilic portion.
種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜に固定化され、前記基板本体上の所定の位置に配置された、請求項７に記載のバイオチップ。 A biochip for high-throughput screening detection of biomolecules of multiple specimens,
The biochip according to claim 7, wherein a plurality of biomolecules having different types and / or concentrations are immobilized on a lipid bilayer membrane and arranged at predetermined positions on the substrate body.
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