JP2010520750A

JP2010520750A - Method and kit for amplifying DNA

Info

Publication number: JP2010520750A
Application number: JP2009551981A
Authority: JP
Inventors: マイケルエム．ベッカー，; ワイ−チュンラム，; クリスティンダブリュー．リブジー，; スティーブンティー．ブレンタノ，; ダニエルピー．コルク，; アストリッドアール．ダブリュー．シュローダー，
Original assignee: ジェン−プロウブインコーポレイテッド
Priority date: 2007-03-01
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2010-06-17
Also published as: WO2008108843A3; CA2678799A1; EP2118305A4; EP2118305A2; AU2007348215A1; WO2008108843A2

Abstract

自己触媒的である（即ち、温度、ｐＨ、イオン強度などの反応条件の改変を必要とせずに、１回のサイクルの産物を次のサイクルで用いて自動的にサイクルさせることができる）標的核酸配列の複数のコピーを合成する新規な方法が開示されている。特に、副産物の出現を減少させると同時に確実かつ効率的である核酸増幅方法が開示されている。通常、こうした方法では、標的核酸の１種のセンスのみを標的にするプライミングオリゴヌクレオチド、３’末端からのポリメラーゼ伸長が阻止されるように改変されたプロモータオリゴヌクレオチド、及び、任意選択的に、プライマー伸長反応を停止させる手段を用いて、副産物の形成を低下又は実質的に排除しながら、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子をインビトロで増幅させる。今回開示した方法では、副産物の出現が最低限に抑えられるか実質的に排除されることによって高水準の特異性がもたらされる。Target nucleic acids that are autocatalytic (ie, can be cycled automatically using the product of one cycle in the next cycle without requiring modification of reaction conditions such as temperature, pH, ionic strength) A novel method for synthesizing multiple copies of a sequence has been disclosed. In particular, nucleic acid amplification methods are disclosed that are reliable and efficient while reducing the appearance of by-products. Typically, such methods involve priming oligonucleotides that target only one sense of the target nucleic acid, promoter oligonucleotides modified to prevent polymerase extension from the 3 'end, and optionally primers Means that stop the extension reaction are used to amplify RNA or DNA molecules in vitro while reducing or substantially eliminating the formation of by-products. The methods disclosed herein provide a high level of specificity by minimizing or substantially eliminating the appearance of by-products.

Description

本願は、２００５年８月２６日に出願された継続中の米国特許出願第１１／２１３，５１９号の一部継続出願である。米国特許出願第１１／２１３，５１９号は、２００４年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／６０４，８３０号および２００４年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６３９，１１０号の利益を主張し、それぞれの出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。 This application is a continuation-in-part of pending US patent application Ser. No. 11 / 213,519, filed Aug. 26, 2005. U.S. Patent Application No. 11 / 213,519 is filed with U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 604,830 filed on August 27, 2004 and U.S. Provisional Patent Application No. 60 filed on December 23, 2004. No. 639,110, the contents of each application are hereby incorporated by reference.

本発明は、単独で、又は核酸の均一もしくは不均一な混合物の(大きなもしくは小さな)成分として存在させることができる特定の核酸配列、即ち「標的配列」の複数のコピーを作製するための方法、反応混合物、組成物及びキットに関する。上記核酸の混合物は、診断的検査、血液製剤のスクリーニング、食物、水、工業もしくは環境試験、調査研究、クローニングなどの他のプロセス用の試薬もしくは材料の調製又は他の目的のために採取されるサンプル中に存在するものとすることができる。特定の核酸配列の選択的な増幅は、特異性を維持しながら診断的及び他の検出アッセイの感度を上げ、各種研究方法の感度、利便性、精度及び信頼性を増し、並びに種々の目的のために特定オリゴヌクレオチドの十分な供給をもたらすのに有用である。 The present invention provides a method for making multiple copies of a particular nucleic acid sequence, or “target sequence,” that can exist alone or as a (large or small) component of a homogeneous or heterogeneous mixture of nucleic acids, It relates to reaction mixtures, compositions and kits. The mixture of nucleic acids is collected for preparation of reagents or materials for diagnostic tests, blood product screening, food, water, industrial or environmental tests, research studies, other processes such as cloning, or other purposes It can be present in the sample. Selective amplification of specific nucleic acid sequences increases the sensitivity, convenience, accuracy and reliability of various research methods while maintaining specificity, increasing the sensitivity, convenience, accuracy and reliability of various research methods, and for various purposes. In order to provide a sufficient supply of specific oligonucleotides.

特定の核酸配列の検出及び／又は定量化は、微生物を同定して分類し、感染症を診断し、遺伝的異常を検出して特性化し、癌と関連づけられる遺伝子変化を特定し、病気に対する遺伝的罹病性を研究し、及び各種の治療に対する効果を測定するための重要な技術である。このよう方法は、食料品、水、工業及び環境サンプル、種子ストック、並びに特定の微生物の存在を監視する必要があると思われる他の種類の材料において微生物を検出して定量するのにも有用である。犯罪容疑者を特定し、父親論争を解決し、系図及び系統樹を構築し、種々の生命体の分類に役立てるために核酸配列間の関連性の分析が行われている法医科学、人間学、考古学及び生物学において別の用途が見出される。 Detection and / or quantification of specific nucleic acid sequences can identify and classify microorganisms, diagnose infections, detect and characterize genetic abnormalities, identify genetic changes associated with cancer, and inherit It is an important technique for studying susceptibility and measuring effects on various treatments. Such methods are also useful for detecting and quantifying microorganisms in foodstuffs, water, industrial and environmental samples, seed stocks, and other types of materials that may need to be monitored for the presence of specific microorganisms. It is. Forensic science, anthropology, where criminal suspects are identified, paternal disputes are resolved, genealogy and phylogenetic trees are constructed, and associations between nucleic acid sequences are analyzed to help classify various organisms Another application is found in archeology and biology.

核酸配列を検出及び／又は定量するいくつかの方法が当該分野で公知である。こうした方法としては、標識プローブとのハイブリッド形成、及び標識プローブとのハイブリッド形成と組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）の各種変更が挙げられる。例えば、Ｍｕｌｌｉｓほか、“ＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒＡｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎｄ／ｏｒＣｌｏｎｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第４，６８３，１９５号；Ｍｕｌｌｉｓ、“ＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒＡｍｐｌｉｆｙｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第４，６８３，２０２号；Ｍｕｌｌｉｓほか、“ＰｒｏｃｅｓｓｆｏｒＡｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇａｎｄ／ｏｒＣｌｏｎｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第４，８００，１５９号；非特許文献１；及び非特許文献２を参照されたい。いくつかの異なる極端な温度間の反応温度の繰り返しサイクルを必要とすることはＰＣＲ法の欠点である。ＰＣＲの使い勝手をよくするためには、高価なプログラム可能な熱サイクル装置を必要とする。さらに、転写媒介性増幅（ＴＭＡ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＭｅｄｉａｔｅｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いて、標的配列の複数のＲＮＡコピーが自己触媒的にさらにコピーを生ずる実質的に一定の温度、イオン強度及びｐＨの条件下で標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成することができる。例えば、Ｋａｃｉａｎほか、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ，”米国特許第５，３９９，４９１号及びＫａｃｉａｎほか、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ，”米国特許第５，８２４，５１８号を参照されたい。なお、これらの特許のそれぞれの内容は引用により本明細書に組み込まれている。ＴＭＡは、臨床、環境、法医学及び同様のサンプル中の特定の核酸配列を定量するためのアッセイ、プローブのクローニング及び作製を含む目的のために核酸標的配列のコピーを作製するのに有用である。ＴＭＡは、有効性が証明された確実で高感度の増幅系である。ＴＭＡはＰＣＲをベースとした増殖系に付随する問題の多くを解決している。特に、温度サイクルを必要としない。別の転写ベースの増幅法がＭａｌｅｋほか、“ＥｎｈａｎｃｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓ，”米国特許第５，１３０，２３８号；Ｄａｖｅｙほか、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓ，”米国特許第５，４０９，８１８号；Ｄａｖｅｙほか、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＲＮＡ），”米国特許第５，４６６，５８６号；Ｄａｖｅｙほか、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｒｏｃｅｓｓ，”米国特許第５，５５４，５１７号；Ｂｕｒｇほか、“ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴａｒｇｅｔＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第６，０９０，５９１号；及びＢｕｒｇほか、“ＳｅｌｅｃｔｉｖｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴａｒｇｅｔＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，”米国特許第６，４１０，２７６号に開示されている。 Several methods for detecting and / or quantifying nucleic acid sequences are known in the art. Such methods include hybridization with a labeled probe and various modifications of the polymerase chain reaction (PCR) combined with hybridization with the labeled probe. For example, Mullis et al., “Process for Amplifying, Detecting and / or Cloning Nucleic Acid Sequences,” US Pat. No. 4,683,195; Mullis, “Process for Amplifying Nucleic Acid 202” Mullis et al., “Process for Amplifying, Detecting and / or Cloning Nucleic Acid Sequences,” US Pat. No. 4,800,159; Non-Patent Document 1; It is a disadvantage of the PCR method that it requires repeated cycles of reaction temperature between several different extreme temperatures. In order to improve the ease of use of PCR, an expensive programmable thermal cycling apparatus is required. In addition, using transcription-mediated amplification (TMA) methods, multiple RNA copies of the target sequence can be autocatalytically further copied under conditions of substantially constant temperature, ionic strength and pH. Multiple copies of the target nucleic acid sequence can be synthesized autocatalytically. See, for example, Kacian et al., “Nucleic Acid Sequence Amplification Methods,” US Pat. No. 5,399,491 and Kacian et al., “Nucleic Acid Sequence Amplification Methods,” US Pat. No. 5,824. The contents of each of these patents are incorporated herein by reference. TMA is useful for making copies of nucleic acid target sequences for purposes including assays, probe cloning and production to quantify specific nucleic acid sequences in clinical, environmental, forensic and similar samples. TMA is a reliable and highly sensitive amplification system with proven effectiveness. TMA solves many of the problems associated with PCR-based propagation systems. In particular, no temperature cycle is required. Another transcription-based amplification method is described by Malek et al., “Enhanced Nucleic Acid Amplification Process,” US Pat. No. 5,130,238; Davey et al., “Nucleic Acid Amplification Process,” US Pat. No. 5,409,818; Et al., “Method for the Synthesis of Ribonucleic Acid (RNA),” US Pat. No. 5,466,586; Davey et al., “Nucleic Acid Amplification Process,” US Pat. No. 5,554,517; Amplification of Target Polynucleotide Se uences, "U.S. Pat. No. 6,090,591; and Burg addition," Selective Amplification of Target Polynucleotide Sequences, "are disclosed in U.S. Patent No. 6,410,276.

高感度核酸増幅系の固有の結果は副産物の出現である。副産物としては、系によってはその増幅反応を阻害することにより特異性を低下させることがある分子が挙げられる。これは、プライマー伸長産物及び転写産物の形成に必要なプライマー及び酵素を含む限られた増幅資源が副産物の形成に転用されるためである。時として、副産物の出現により種々の分子技術による単位複製配列の産生の分析が困難になることもある。 An inherent result of a highly sensitive nucleic acid amplification system is the appearance of by-products. By-products include molecules that may reduce specificity by inhibiting the amplification reaction in some systems. This is because limited amplification resources including primers and enzymes necessary for the formation of primer extension products and transcripts are diverted to the formation of by-products. Occasionally, the appearance of by-products can make it difficult to analyze the production of amplicons by various molecular techniques.

従って、副産物の出現を抑えることにより特異性を増大させ、増幅産物の検出及び定量を向上させる、実質的に一定の温度、イオン強度及びｐＨの条件下で標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成する確実な核酸増幅系が当該分野でなお求められている。 Thus, autocatalyzing multiple copies of a target nucleic acid sequence under conditions of substantially constant temperature, ionic strength and pH, increasing specificity by suppressing the appearance of byproducts and improving detection and quantification of amplification products There is still a need in the art for reliable nucleic acid amplification systems that synthesize synthetically.

Ｍｕｌｌｉｓほか、（１９８７年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：ｐ．３３５−３５０Mullis et al. (1987) Meth. Enzymol. 155: p. 335-350 Ｍｕｒａｋａｗａほか、（１９８８年）ＤＮＡ７：ｐ．２８７−２９５Murakawa et al. (1988) DNA 7: p. 287-295

本発明は、自己触媒的である（即ち、温度、ｐＨ、イオン強度などの反応条件の改変を必要とせずに、１回のサイクルの産物を次のサイクルで用いて自動的にサイクルさせることができる）標的配列の複数のコピーを合成する新規な方法にある。特に、本発明は、副産物の出現を減少させると同時に確実かつ効率的である核酸増幅方法を開示する。この方法では、プライミングオリゴヌクレオチド、それからのＤＮＡ合成の開始を阻止するよう改変されたプロモータオリゴヌクレオチド（例えば、３’ブロッキング部分を含む）及び、任意選択的に、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、結合分子及び／又は３’ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを用いてインビトロでＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を増幅する。この開示した方法に用いるプライマーは標的核酸の１個のセンスのみを標的にする。本発明の方法では、副産物の出現が最低限に抑えられるか実質的に排除されることによって高水準の特異性がもたらされる。さらに、副産物が出現すると、各種分子検出技術による増幅反応の分析が困難になる可能性がある。本発明では、この問題をできる限り少なくするか実質的に除去することによって高水準の感度が得られる。 The present invention is autocatalytic (i.e., the product of one cycle can be automatically cycled with the next cycle without requiring modification of reaction conditions such as temperature, pH, ionic strength, etc. There is a novel method for synthesizing multiple copies of a target sequence. In particular, the present invention discloses a nucleic acid amplification method that is reliable and efficient while reducing the appearance of by-products. In this method, a priming oligonucleotide, a promoter oligonucleotide (eg, comprising a 3 ′ blocking moiety) modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom, and optionally a displacer oligonucleotide, a binding molecule and / or A 3 'blocked extender oligonucleotide is used to amplify RNA or DNA molecules in vitro. The primers used in this disclosed method target only one sense of the target nucleic acid. The method of the present invention provides a high level of specificity by minimizing or substantially eliminating the appearance of by-products. Furthermore, when a by-product appears, it may be difficult to analyze the amplification reaction using various molecular detection techniques. In the present invention, a high level of sensitivity is obtained by minimizing or substantially eliminating this problem.

一実施態様において、本発明は、標的核酸の複数のコピーを合成する方法であって、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸をプライミングオリゴヌクレオチド及び結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチド）で処理し、このプライミングオリゴヌクレオチドは上記標的配列の３’末端とハイブリッドを形成することによりそこからプライマー伸長反応を開始させることが可能となるものとし、かつ、上記結合分子は上記標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の標的核酸に結合するものとする（「に隣接」とは、この結合分子が、上記標的配列の５’末端塩基に近く、この標的配列の十分５’側にあるこの標的核酸の塩基に結合することを意味している）工程、上記プライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いるプライマー伸長反応において伸長させて上記標的配列に対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物を得、このプライマー伸長産物は上記結合分子により決定される３’末端を有するものとし、このプライマー伸長産物の３’末端は上記標的配列の５’末端に対して相補性であるものとする工程、上記標的配列を選択的に分解する酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いて上記標的配列から上記プライマー伸長産物を分離する工程、第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで上記プライマー伸長産物を処理し、この第１の領域はこのプライマー伸長産物の３’領域とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドを形成するものとし、第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含み、第１の領域に対して５’側に位置するものとし、このプロモータオリゴヌクレオチドはそれからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分がこのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に位置し、ポリメラーゼ伸長を阻止する）工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッド中のプライマー伸長産物の３’末端を伸長して上記プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程、並びに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドから、上記プロモータオリゴヌクレオチドのプロモータを認識してそこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用い、上記プライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡ産物を転写する工程を含む方法に関する。この実施態様によれば、得られるＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一である。この実施態様の好ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は、上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されなかった場合よりも実質的に少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、このオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようにその３’末端にブロッキング部分をさらに含む。 In one embodiment, the invention is a method of synthesizing multiple copies of a target nucleic acid, wherein the target nucleic acid comprising an RNA target sequence is treated with a priming oligonucleotide and a binding molecule (eg, a stop oligonucleotide or a digested oligonucleotide). The priming oligonucleotide forms a hybrid with the 3 ′ end of the target sequence, so that a primer extension reaction can be initiated therefrom, and the binding molecule is the 5 ′ end of the target sequence. To the target nucleic acid adjacent to or near it ("adjacent to" means that this binding molecule is close to the 5 'terminal base of the target sequence and is sufficiently 5' to the target sequence. Meaning that it binds to the base of the target nucleic acid), the priming oligonucleotide A DNA primer extension product complementary to the target sequence, the primer extension product having a 3 ′ end determined by the binding molecule. A step in which the 3 ′ end of the primer extension product is complementary to the 5 ′ end of the target sequence, an enzyme that selectively degrades the target sequence (eg, RNase H activity) Separating the primer extension product from the target sequence using an enzyme having a first and second regions, treating the primer extension product with a promoter oligonucleotide comprising first and second regions, wherein the first region is the primer extension Hybridize with the 3 'region of the product to form a promoter oligonucleotide: primer extension product hybrid And the second region contains a promoter for RNA polymerase and is located 5 'to the first region so that the promoter oligonucleotide is prevented from initiating DNA synthesis therefrom. A step to be modified (eg, the blocking moiety is located at the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide to prevent polymerase extension), the 3 ′ end of the primer extension product in the promoter oligonucleotide: primer extension product hybrid; And adding a sequence complementary to the second region of the promoter oligonucleotide, and recognizing the promoter of the promoter oligonucleotide from the promoter oligonucleotide: primer extension product hybrid. RN to start transcription The present invention relates to a method comprising the step of using A polymerase to transcribe a plurality of RNA products complementary to the primer extension product. According to this embodiment, the base sequence of the obtained RNA product is substantially the same as the base sequence of the target sequence. In a preferred aspect of this embodiment, the activity of the DNA polymerase is substantially limited to the formation of a primer extension product comprising the priming oligonucleotide. In yet another preferred aspect of this embodiment, the formation of byproducts in this method is substantially less than if the promoter oligonucleotide was not modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom. In yet another preferred aspect of this embodiment, if the oligonucleotide used in the amplification reaction includes a promoter for RNA polymerase, the oligonucleotide is prevented from starting DNA synthesis therefrom. It further comprises a blocking moiety at the 3 ′ end.

本発明の第２の実施態様は、標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸を、この標的配列の３’末端とハイブリッドを形成することによりプライマー伸長反応をそこから開始させることができるプライミングオリゴヌクレオチドで処理する工程、このプライミングオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼ(例えば逆転写酵素)を用いるプライマー伸長反応において伸長させて不確定の３’末端を有し、かつ、その標的配列に対して相補性の塩基領域を含む第１のＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程、上記第１のプライマー伸長反応に対して相補性の上記標的核酸の部分を選択的に分解する酵素、例えばＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素を用いて上記標的核酸から上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物を分離する工程、上記第１のプライマー伸長産物を、第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで処理し、この第１の領域は上記第１のプライマー伸長産物の３’領域とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成するものとし、この第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含み、上記第１の領域に対して５’側にあるものとし、上記プロモータオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分が、上記プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端にあり、ポリメラーゼ伸長を阻止する）工程、並びに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドから、上記プロモータを認識してそこからの転写を開始させるＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部に対して相補性の複数の第１のＲＮＡ産物を転写し、得られる第１のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする工程を含む方法に関する。この実施態様の好ましい態様において、この方法におけるＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は、上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようには改変されなかった場合よりも少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様によれば、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、そのオリゴヌクレオチドはその３’末端にあってそこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するブロッキング部分をさらに含む。 A second embodiment of the present invention is a method for synthesizing multiple copies of a target sequence, wherein a primer extension reaction is performed by hybridizing a target nucleic acid comprising an RNA target sequence with the 3 ′ end of the target sequence. Treating with a priming oligonucleotide from which the priming oligonucleotide is extended in a primer extension reaction using a DNA polymerase (e.g. reverse transcriptase) and has an indeterminate 3 'end, and Obtaining a first DNA primer extension product comprising a base region complementary to the target sequence, an enzyme that selectively degrades the portion of the target nucleic acid that is complementary to the first primer extension reaction, For example, the first DNA primer extension product is produced from the target nucleic acid using an enzyme having RNase H activity. Treating the first primer extension product with a promoter oligonucleotide comprising first and second regions, wherein the first region hybridizes with the 3 ′ region of the first primer extension product. Formed to form a promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid, this second region comprising the RNA polymerase promoter and being 5 ′ to the first region, The promoter oligonucleotide shall be modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom (eg, the blocking moiety is at the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide to prevent polymerase extension), and From the above promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid A plurality of first RNA products complementary to at least a portion of the first primer extension product using an RNA polymerase that recognizes the promoter and initiates transcription therefrom; The present invention relates to a method comprising the step of assuming that the base sequence of one RNA product is substantially the same as the base sequence of the target sequence. In a preferred aspect of this embodiment, the activity of the DNA polymerase in this method is substantially limited to the formation of a primer extension product comprising the priming oligonucleotide. In yet another preferred aspect of this embodiment, the formation of byproducts in this method is less than if the promoter oligonucleotide was not modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom. According to yet another preferred aspect of this embodiment, if the oligonucleotide used in the amplification reaction includes a promoter for RNA polymerase, the oligonucleotide is at its 3 ′ end and DNA synthesis therefrom It further includes a blocking portion that prevents the initiation of.

好ましくは、この実施態様は、さらに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物から転写された第１のＲＮＡ産物を上記のプライミングオリゴヌクレオチドで処理してこのプライミングオリゴヌクレオチドからプライマー伸長反応を開始させることができるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１のＲＮＡ産物ハイブリッドを形成させる工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を用いるプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて上記第１のＲＮＡ産物に対して相補性の第２のＤＮＡプライマー伸長産物を得、この第２のプライマー伸長産物は上記第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の３’末端を有するものとする工程、上記第１のＲＮＡ産物を選択的に分解する酵素（例えばＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いてこの第１のＲＮＡ産物から上記第２のプライマー伸長産物を分離する工程、この第２のプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理することによって上記プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッド中の第２のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させて上記プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程、並びにプロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第２のプライマー伸長産物に対して相補性の複数の第２のＲＮＡ産物を転写させ、この第２のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする工程に関する。 Preferably, this embodiment further comprises treating the first RNA product transcribed from the promoter oligonucleotide: first primer extension product with the priming oligonucleotide to initiate a primer extension reaction from the priming oligonucleotide. A step of forming a priming oligonucleotide: first RNA product hybrid such that the priming oligonucleotide is extended into a first RNA product in a primer extension reaction using a DNA polymerase (eg, reverse transcriptase). Obtaining a complementary second DNA primer extension product, wherein the second primer extension product has a complementary 3 'end to the 5' end of the first RNA product, Selectively isolate first RNA product Separating the second primer extension product from the first RNA product using an enzyme (eg, an enzyme having RNase H activity), and treating the second primer extension product with the promoter oligonucleotide. A step of forming the promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid by extending the 3 ′ end of the second primer extension product in the promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid. Adding a sequence complementary to the second region of the oligonucleotide, and complementing the second primer extension product from the promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid using RNA polymerase. A plurality of second RNs of The product is transferred, the base sequence of the second RNA product is about process is assumed to be substantially identical to the nucleotide sequence of the target sequence.

本発明の第３の実施態様は、標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸を、第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで処理し、この第１の領域は上記標的配列の３’末端とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：標的核酸ハイブリッドを形成するものとし、第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含み、上記第１の領域の５’側に位置するものとし、上記プロモータオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分がこのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する）工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：標的核酸ハイブリッドから、上記プロモータを認識してそこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて上記標的配列に対して相補性の塩基領域を含む複数の第１のＲＮＡ産物を転写する工程、上記第１のＲＮＡ産物の３’領域とハイブリッドを形成することによりそこからプライマー伸長反応を開始させることができるプライミングオリゴヌクレオチドでこの第１のＲＮＡ産物を処理する工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を用いるプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて上記第１のＲＮＡ産物の少なくとも一部に対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物を得、このプライマー伸長産物は上記第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の３’末端を有するものとする工程、上記第１のＲＮＡ産物を選択的に分解する酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いて上記第１のＲＮＡ産物から上記プライマー伸長産物を分離する工程、上記プライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理してプロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる工程、並びに上記プロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼを用いてこのプライマー伸長産物に対して相補性の複数の第２のＲＮＡ産物を転写させ、この第２のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列に対して実質的に相補性であるものとする工程を含む方法に関する。この実施態様の好ましい態様では、この方法における上記ＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようには改変されなかった場合よりも実質的に少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様によれば、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、そのオリゴヌクレオチドはその３’末端に位置してそこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するブロッキング部分をさらに含む。さらに、この実施態様のいずれの方法にも、上記のプロモータオリゴヌクレオチド：プライマー伸長産物ハイブリッド中のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させてこのプロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程を含めることができる。 A third embodiment of the invention is a method of synthesizing multiple copies of a target sequence, wherein a target nucleic acid comprising a DNA target sequence is treated with a promoter oligonucleotide comprising first and second regions, The first region shall hybridize with the 3 ′ end of the target sequence to form a promoter oligonucleotide: target nucleic acid hybrid, the second region contains a promoter for RNA polymerase, and the first region And the promoter oligonucleotide is modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom (eg, the blocking moiety is located at the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide). And recognizing the promoter from the promoter oligonucleotide: target nucleic acid hybrid. A step of transcribing a plurality of first RNA products containing a base region complementary to the target sequence using an RNA polymerase that initiates transcription, a 3 ′ region of the first RNA product and a hybrid Treating the first RNA product with a priming oligonucleotide from which a primer extension reaction can be initiated, extending the priming oligonucleotide in a primer extension reaction using a DNA polymerase (eg, reverse transcriptase) To obtain a DNA primer extension product complementary to at least a portion of the first RNA product, the primer extension product having a 3 ′ end complementary to the 5 ′ end of the first RNA product. An enzyme that selectively degrades the first RNA product (e.g., Separating the primer extension product from the first RNA product using an enzyme having NA-degrading enzyme H activity, treating the primer extension product with the promoter oligonucleotide, and promoting a promoter oligonucleotide: primer extension product hybrid. A plurality of second RNA products complementary to the primer extension product using RNA polymerase from the promoter oligonucleotide: primer extension product hybrid. The present invention relates to a method comprising the step of assuming that the base sequence is substantially complementary to the base sequence of the target sequence. In a preferred aspect of this embodiment, the activity of the DNA polymerase in this method is substantially limited to the formation of a primer extension product comprising the priming oligonucleotide. In yet another preferred aspect of this embodiment, by-product formation in this method is substantially less than if the promoter oligonucleotide was not modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom. According to still another preferred aspect of this embodiment, when the oligonucleotide used in the amplification reaction contains a promoter for RNA polymerase, the oligonucleotide is located at its 3 ′ end and DNA from there It further includes a blocking moiety that prevents initiation of synthesis. In addition, in any of the methods of this embodiment, the 3 ′ end of the primer extension product in the promoter oligonucleotide: primer extension product hybrid described above is extended to be complementary to the second region of the promoter oligonucleotide. A step of adding a sequence can be included.

本発明の第４の実施態様は、標的配列の複数のコピーを合成する方法であって、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸をプライミングオリゴヌクレオチドで処理し、このプライミングオリゴヌクレオチドは上記標的配列の３’末端とハイブリッドを形成することによりそこからプライマー伸長反応を開始させることが可能となるものとする工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いたプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて第１のＤＮＡプライマー伸長産物を得、この第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部分は上記標的配列に対して相補性であるものとする工程、このプライマー伸長産物を第１及び第２の領域を含むプロモータオリゴヌクレオチドで処理し、この第１の領域は、上記標的配列の５’末端の領域に対応し、かつ、上記第１のプライマー伸長産物とハイブリッドを形成してプロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成する塩基配列を含むものとし、上記第２の領域はＲＮＡポリメラーゼのプロモータを含み、上記第１の領域の５’側にあるものとし、上記プロモータオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成が阻止されるように改変されるものとする（例えば、ブロッキング部分がこのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に位置し、ポリメラーゼ伸長を阻止する）工程、並びに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッドから、上記プロモータオリゴヌクレオチド中のプロモータを認識してそこからの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第１のプライマー伸長産物の少なくとも一部に対して相補性の複数の第１のＲＮＡ産物を転写する工程を含む方法に関する。ただし、上記第１のプライマー伸長産物が規定された３’末端を有する場合には、上記方法は上記標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の上記標的核酸に結合する結合分子で上記標的核酸を処理する工程をさらに含む。さらに、上記プライミングオリゴヌクレオチドは、上記標的核酸とハイブリッドを形成し、かつ、この標的核酸とハイブリッドを形成させた場合に酵素活性により選択的に分解されるＲＮＡ領域を含まないことを前提とする。この実施態様によれば、得られる第１のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一である。この実施態様の好ましい態様では、上記標的核酸は、プライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させる前に変性を受けるのに十分な条件（例えば、加熱及び／又は化学的変性剤）にさらされる二本鎖複合体の一部である。この実施態様の別の好ましい態様では上記ＤＮＡポリメラーゼの活性は上記プライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、この方法における副産物の形成は上記プロモータオリゴヌクレオチドがそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるようには改変されなかった場合よりも実質的に少ない。この実施態様のさらに別の好ましい態様では、上記増幅反応に用いられるオリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む場合には、そのオリゴヌクレオチドはその３’末端に位置してそこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するブロッキング部分をさらに含む。好ましくは、この実施態様の方法は、さらに、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物から転写された第１のＲＮＡ産物を上記のプライミングオリゴヌクレオチドで処理してこのプライミングオリゴヌクレオチドからプライマー伸長反応を開始させることができるようにプライミングオリゴヌクレオチド：第１のＲＮＡ産物ハイブリッドを形成させる工程、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を用いたプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させて上記第１のＲＮＡ産物に対して相補性の第２のＤＮＡプライマー伸長産物を得、この第２のプライマー伸長産物は上記第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の３’末端を有するものとする工程、上記第１のＲＮＡ産物を選択的に分解する酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性を有する酵素）を用いてこの第１のＲＮＡ産物から上記第２のプライマー伸長産物を分離する工程、この第２のプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理することによってプロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドを形成させる工程、上記プロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッド中の第２のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させて上記プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程、並びにプロモータオリゴヌクレオチド：第２のプライマー伸長産物ハイブリッドから、ＲＮＡポリメラーゼを用いて上記第２のプライマー伸長産物に対して相補性の複数の第２のＲＮＡ産物を転写させ、この第２のＲＮＡ産物の塩基配列は上記標的配列の塩基配列と実質的に同一であるものとする工程に関する。 A fourth embodiment of the present invention is a method for synthesizing multiple copies of a target sequence, wherein a target nucleic acid comprising a DNA target sequence is treated with a priming oligonucleotide, the priming oligonucleotide being 3 ′ of the target sequence. A step in which a primer extension reaction can be started by forming a hybrid with the terminal, in the primer extension reaction using a DNA polymerase (eg, reverse transcriptase), and the priming oligonucleotide is extended. Obtaining a first DNA primer extension product, wherein at least a portion of the first primer extension product is complementary to the target sequence, the primer extension product comprising first and second regions Treated with a promoter oligonucleotide, this first region is A nucleotide sequence corresponding to the region at the 5 ′ end of the sequence and hybridizing with the first primer extension product to form a promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid, The region should contain the RNA polymerase promoter and be 5 ′ to the first region, and the promoter oligonucleotide should be modified to prevent DNA synthesis therefrom (eg, a blocking moiety). Is located at the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide and prevents polymerase extension), and recognizes the promoter in the promoter oligonucleotide from the promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid. RNA polymerase that initiates transcription Using the zero method comprising the step of transferring a plurality of first RNA product complementary to at least a portion of the first primer extension product. However, when the first primer extension product has a defined 3 ′ end, the method is a binding molecule that binds to the target nucleic acid adjacent to or near the 5 ′ end of the target sequence. The method further includes the step of processing the nucleic acid. Furthermore, it is assumed that the priming oligonucleotide does not contain an RNA region that forms a hybrid with the target nucleic acid and that is selectively degraded by enzyme activity when the hybrid is formed with the target nucleic acid. According to this embodiment, the base sequence of the obtained first RNA product is substantially the same as the base sequence of the target sequence. In a preferred aspect of this embodiment, the target nucleic acid is subjected to conditions sufficient to undergo denaturation (eg, heating and / or chemical denaturing agents) prior to extending the priming oligonucleotide in a primer extension reaction. Part of this chain complex. In another preferred aspect of this embodiment, the activity of the DNA polymerase is substantially limited to the formation of a primer extension product comprising the priming oligonucleotide. In yet another preferred aspect of this embodiment, by-product formation in this method is substantially less than if the promoter oligonucleotide was not modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom. In yet another preferred aspect of this embodiment, when the oligonucleotide used in the amplification reaction includes a promoter for RNA polymerase, the oligonucleotide is located at its 3 ′ end and is used for DNA synthesis therefrom. It further includes a blocking moiety that prevents initiation. Preferably, the method of this embodiment further comprises treating the first RNA product transcribed from the promoter oligonucleotide: the first primer extension product with the priming oligonucleotide, and then performing a primer extension reaction from the priming oligonucleotide. A step of forming a priming oligonucleotide: first RNA product hybrid such that the priming oligonucleotide is extended in a primer extension reaction using a DNA polymerase (eg, reverse transcriptase) A second DNA primer extension product complementary to the RNA product of which has a 3 ′ end complementary to the 5 ′ end of the first RNA product; Selecting the first RNA product. Separating the second primer extension product from the first RNA product using an enzymatically degrading enzyme (for example, an enzyme having RNase H activity), and the second primer extension product is converted into the promoter. Treating with a oligonucleotide to form a promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid, extending the 3 ′ end of the second primer extension product in the promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid; Adding a sequence complementary to the second region of the promoter oligonucleotide, and from the promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid to the second primer extension product using RNA polymerase. Multiple second complementary The RNA products were transcribed, the base sequence of the second RNA product is about process is assumed to be substantially identical to the nucleotide sequence of the target sequence.

この実施態様の方法の別の態様は、上記標的核酸を結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチド）で処理し、この結合分子は上記標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の上記標的核酸に結合するものとする（上記に示したように、「に隣接」という語句は、この結合分子が、上記標的配列の５’末端塩基に近く、この標的配列に対して十分５’側にあるこの標的核酸の塩基配列に結合することを意味している）工程を含む。上記標的核酸は、ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長反応において上記プライミングオリゴヌクレオチドの伸長を開始させる前に、上記結合分子で処理することが好ましい。この態様では、上記第１のプライマー伸長産物は上記結合分子によって決定される３’末端を有し、このプライマー伸長産物の３’末端は上記標的配列の５’末端に対して相補性であるものとする。上記方法のこの態様は、上記プロモータオリゴヌクレオチドを上記第１のプライマー伸長産物とハイブリッド形成させた後、このプロモータオリゴヌクレオチド：第１のプライマー伸長産物ハイブリッド中の第１のプライマー伸長産物の３’末端を伸長させてこのプロモータオリゴヌクレオチドの上記第２の領域に対して相補性の配列を付加する工程をさらに含む。 Another aspect of the method of this embodiment is to treat the target nucleic acid with a binding molecule (eg, a stop or digest oligonucleotide) that is adjacent to or near the 5 ′ end of the target sequence. Suppose that it binds to the target nucleic acid (as indicated above, the phrase “adjacent to” means that the binding molecule is close to the 5 ′ terminal base of the target sequence and is sufficiently 5 ′ to the target sequence. Which means to bind to the base sequence of this target nucleic acid on the side). The target nucleic acid is preferably treated with the binding molecule prior to initiating extension of the priming oligonucleotide in a primer extension reaction using DNA polymerase. In this embodiment, the first primer extension product has a 3 ′ end determined by the binding molecule, and the 3 ′ end of the primer extension product is complementary to the 5 ′ end of the target sequence. And This aspect of the method comprises the step of hybridizing the promoter oligonucleotide with the first primer extension product and then the 3 ′ end of the first primer extension product in the promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid. And further adding a sequence complementary to the second region of the promoter oligonucleotide.

この実施態様の方法のさらに別の態様は、上記標的核酸をディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理し、このディスプレーサオリゴヌクレオチドは上記プライミングオリゴヌクレオチドから上流の標的核酸とハイブリッドを形成することによってそこからプライマー伸長反応を開始させることを可能にするものとする（これに関連して、「上流」という用語はこのディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端が上記プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドに対して５’側にあることを意味する）工程、及び、次いでＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長反応において上記ディスプレーサオリゴヌクレオチドを伸長して、上記標的核酸からの上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物と置換する第２のＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程を含む。好ましい態様では、上記ＤＮＡポリメラーゼの活性は、上記のディスプレーサオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物の形成に実質的に限定される。 Yet another aspect of the method of this embodiment is to treat the target nucleic acid with a displacer oligonucleotide, which displacer oligonucleotide undergoes a primer extension reaction by forming a hybrid with a target nucleic acid upstream from the priming oligonucleotide. (In this context, the term “upstream” means that the 3 ′ end of the displacer oligonucleotide is 5 ′ to the 3 ′ terminal nucleotide of the priming oligonucleotide. And a second DNA primer extension that extends the displacer oligonucleotide in a primer extension reaction using a DNA polymerase to replace the first DNA primer extension product from the target nucleic acid. It comprises obtaining a product. In a preferred embodiment, the activity of the DNA polymerase is substantially limited to the formation of a primer extension product comprising the displacer oligonucleotide and the priming oligonucleotide.

上記の実施態様のいずれかを実施するのに適した試薬及び条件については実施例の部に記載されている。 Suitable reagents and conditions for practicing any of the above embodiments are described in the Examples section.

本発明の方法は、臨床、食物、水、工業、環境、法医学及び類似のサンプルにおいて特定の核酸標的配列を検出及び／又は定量するための、或いは各種用途の特定標的配列のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの多数のコピーを作製するさめのアッセイの構成要素として用いることができる。（本明細書に用いている「コピー」という用語は、上記標的配列と同じ又は反対のセンスを有する増幅産物のことを言う。）こうした方法は、クローニング又はプローブ作製又は配列決定用ＲＮＡ及びＤＮＡコピーの作製に用いることもできる。 The method of the present invention is for detecting and / or quantifying specific nucleic acid target sequences in clinical, food, water, industrial, environmental, forensic and similar samples, or for specific uses of specific target sequence DNA and / or RNA. Can be used as a component in a pre-assay to make multiple copies of (As used herein, the term “copy” refers to an amplification product having the same or opposite sense as the target sequence.) Such methods include cloning and probing or sequencing RNA and DNA copies. It can also be used for manufacturing.

上記の実施態様のプライミングオリゴヌクレオチドには、そこからのＤＮＡ合成の開始を阻止するために、こうしたプライミングオリゴヌクレオチドのうちの１種で標的核酸又はＲＮＡ産物を処理する前にその３’末端とハイブリッド形成させた塩基領域を含むキャップを任意選択的に付加する。（本明細書に用いている「プライミングオリゴヌクレオチド」という用語にはディスプレーサオリゴヌクレオチドを含めている。）プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端塩基（即ち、最も３’側の塩基）にキャップの５’末端塩基（即ち、最も５’側の塩基）をハイブリッド形成させる。しかしながら、こうしたキャップは、標的核酸、プライマー伸長産物又はＲＮＡ産物によってプライミングオリゴヌクレオチドから優先的に外されるように設計される。本発明のキャップはキャッピングオリゴヌクレオチド単体の形をとってもよく、又はリンカーを介してプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させてもよい。キャッピングオリゴヌクレオチドは、そこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変される（例えば、その３’末端にブロッキング部分を含む）ことが好ましい。 The priming oligonucleotide of the above embodiment includes a hybrid with its 3 ′ end prior to treatment of the target nucleic acid or RNA product with one of these priming oligonucleotides to prevent initiation of DNA synthesis therefrom. A cap containing the formed base region is optionally added. (As used herein, the term “priming oligonucleotide” includes a displacer oligonucleotide.) The 3 ′ terminal base of the priming oligonucleotide (ie, the 3 ′ most base) is the 5 ′ terminal end of the cap. Hybridize the base (ie the 5 ′ most base). However, such caps are designed to be preferentially removed from the priming oligonucleotide by the target nucleic acid, primer extension product or RNA product. The cap of the present invention may take the form of a capping oligonucleotide alone or may be attached to the 5 'end of the priming oligonucleotide via a linker. The capping oligonucleotide is preferably modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom (eg, including a blocking moiety at its 3 'end).

標的核酸又はその相補体に対するプライミングオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるために、このプライミングオリゴヌクレオチドがプライマー伸長反応において伸長されるのを妨げず、又はこのプライミングオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成している鋳型ＲＮＡの切断を実質的に妨げない限り、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に、この標的核酸又はＲＮＡ産物へのこのプライミングオリゴヌクレオチドの結合特性（例えば、ハイブリッド形成又は塩基スタッキング）を向上させる１つ以上の改変部位を含ませることができる。こうした改変部位はプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端との間隔を少なくとも１５塩基分とり、最も好ましくは、このプライミングオリゴヌクレオチドの最も５’側の３又は５個のヌクレオチドに限定された領域をとる。好ましい改変部位としては２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド及び「ロックド核酸（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ）」又は「ロックドヌクレオシドアナログ（ＬＮＡ：ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅＡｎａｌｏｇｕｅｓ）」が挙げられる。Ｂｅｃｋｅｒほか、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＡｍｐｌｉｆｙｉｎｇＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＵｓｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＰｒｉｍｅｒｓ，”米国特許第６，１３，０３８号；Ｉｍａｎｉｓｈｉほか、“ＢｉｃｙｃｌｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅａｎｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｎａｌｏｇｕｅｓ，”米国特許第６，２６８，４９０号；及びＷｅｎｇｅｌほか、“ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｎａｌｏｇｕｅｓ，”米国特許第６，６７０，４６１号を参照されたい。上記引用文献のそれぞれの内容は引用により本明細書に組み込まれている。 Template that does not prevent the priming oligonucleotide from being extended in a primer extension reaction or hybridizes with the priming oligonucleotide to increase the binding affinity of the priming oligonucleotide to the target nucleic acid or its complement One or more that improves the binding properties (eg, hybridization or base stacking) of the priming oligonucleotide to the target nucleic acid or RNA product at the 5 ′ end of the priming oligonucleotide, so long as they do not substantially interfere with RNA cleavage. The modified sites can be included. Such modification sites are at least 15 bases apart from the 3 'end of the priming oligonucleotide, most preferably a region limited to the 3 or 5 nucleotides most 5' to the priming oligonucleotide. Preferred modification sites include 2'-O-methyl ribonucleotides and "Locked Nucleic Acids" or "Locked Nucleoside Analogues (LNA)". Becker et al., “Method for Amplifying Target Nucleic Acids Using Modified Primers,” US Pat. No. 6,13,038; Imanishi et al. See Oligonucleotide Analogues, “US Pat. No. 6,670,461. The contents of each of the above cited references are incorporated herein by reference.

上記の方法に用いるプロモータオリゴヌクレオチドには、ＲＮＡ産物が形成される速度を高めるために選択した挿入配列をさらに含ませることができる。この挿入配列は、好ましくは５乃至２０ヌクレオチド長であり、上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１及び第２の領域の間又はこれらに隣接して配置する。本発明の好ましい挿入配列としては、配列番号１ The promoter oligonucleotide used in the above method can further include an insertion sequence selected to increase the rate at which the RNA product is formed. This insertion sequence is preferably 5-20 nucleotides in length and is located between or adjacent to the first and second regions of the promoter oligonucleotide. As a preferable insertion sequence of the present invention, SEQ ID NO: 1

の塩基配列及び配列番号２ Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2

の塩基配列が挙げられる。 The nucleotide sequence of

上記方法のいずれにおいてもエクステンダーオリゴヌクレオチドを含ませることによって増幅速度に影響を与えることもできる。エクステンダーオリゴヌクレオチドは、好ましくは１０乃至５０ヌクレオチド長であり、このエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端がプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に隣接するか、その近傍にくるように鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成するよう設計する。このエクステンダーオリゴヌクレオチドはそこからのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変する（例えば、３’末端ブロッキング部分を含ませる）ことが好ましい。 In any of the above methods, the amplification rate can also be influenced by including an extender oligonucleotide. The extender oligonucleotide is preferably 10 to 50 nucleotides in length and is designed to hybridize with the template DNA so that the 5 ′ end of the extender oligonucleotide is adjacent to or near the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide. To do. This extender oligonucleotide is preferably modified (eg, includes a 3 'end blocking moiety) to prevent initiation of DNA synthesis therefrom.

上記の方法の用途によっては、上記結合分子に、上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端と重なり合う５’末端を有するオリゴヌクレオチドを含ませることができる。上記プロモータオリゴヌクレオチドとこの結合分子とのハイブリッド形成を限定するために、このプロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端は、このプロモータオリゴヌクレオチドの上記結合分子とのハイブリッド形成を妨げるためにこの結合分子の５’末端とのミスマッチを十分数含むよう合成することができる。一般的に単一のミスマッチで十分であるはずであるが、上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域で必要とされる不安定化ミスマッチの数は、上記の重なり合う領域の長さ及び塩基組成によって決まることになる。 Depending on the use of the above method, the binding molecule can include an oligonucleotide having a 5 'end that overlaps the 5' end of the first region of the promoter oligonucleotide. In order to limit the hybridization of the promoter oligonucleotide with the binding molecule, the 5 ′ end of the first region of the promoter oligonucleotide is in order to prevent hybridization of the promoter oligonucleotide with the binding molecule. It can be synthesized to contain a sufficient number of mismatches with the 5 ′ end of the binding molecule. In general, a single mismatch should be sufficient, but the number of destabilizing mismatches required in the first region of the promoter oligonucleotide depends on the length and base composition of the overlapping region. It will be.

上記方法の適応に際しては、上記プライマー伸長産物又は第１のプライマー伸長産物を上記プロモータオリゴヌクレオチドで処理する前にこのプロモータオリゴヌクレオチドから上記ブロッキング部分を放出させることができる。このブロッキング部分の放出を容易にするために、オリゴデオキシヌクレオチドと予めハイブリッド形成させた反応混合物にこのプロモータオリゴヌクレオチドを供給する。このオリゴデオキシヌクレオチドは、十分な数の連続するリボヌクレオチドを含む上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の３’領域とハイブリッドを形成することにより、この３’領域のリボヌクレオチドを切断することができる酵素活性の存在下に上記プロモータオリゴヌクレオチドから上記ブロッキング部分を放出させる。このリボヌクレオチドの切断時には、上記オリゴデオキシヌクレオチドも上記プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域から放出され、この第１の領域の残りの非切断部分は上記のプライマー伸長産物又は第１のプライマー伸長産物とハイブリッドを形成する。リボヌクレオチドの３’セクションは、少なくとも６つの連続するリボヌクレオチドを含むことが好ましく、上記オリゴデオキシヌクレオチドは、リボヌクレオチドの３’セクションと同じ長さであり、かつ、これに対して完全に相補性であることが好ましい。このオリゴデオキシヌクレオチドは、これ単独の分子であっても、リンカーによって上記プロモータオリゴヌクレオチドに結合されていてもよい。 Upon adaptation of the method, the blocking moiety can be released from the promoter oligonucleotide before treating the primer extension product or the first primer extension product with the promoter oligonucleotide. In order to facilitate the release of the blocking moiety, the promoter oligonucleotide is supplied to a reaction mixture that has been previously hybridized with the oligodeoxynucleotide. This oligodeoxynucleotide can cleave the ribonucleotide of this 3 ′ region by forming a hybrid with the 3 ′ region of the first region of the promoter oligonucleotide containing a sufficient number of consecutive ribonucleotides. The blocking moiety is released from the promoter oligonucleotide in the presence of enzyme activity. Upon cleavage of the ribonucleotide, the oligodeoxynucleotide is also released from the first region of the promoter oligonucleotide, and the remaining uncleaved portion of the first region is combined with the primer extension product or the first primer extension product. Form a hybrid. The 3 ′ section of the ribonucleotide preferably comprises at least 6 consecutive ribonucleotides, and the oligodeoxynucleotide is the same length as the 3 ′ section of the ribonucleotide and is completely complementary thereto It is preferable that The oligodeoxynucleotide may be a single molecule or may be bound to the promoter oligonucleotide by a linker.

本発明はさらに、上記の方法を実施するのに有用な反応混合物に関する。本発明の反応混合物には、上記の方法を実施するために必要な各成分、又は成分間のいくつかの副次的組合せを添加することができる。 The invention further relates to a reaction mixture useful for carrying out the above process. To the reaction mixture of the present invention, each component necessary for carrying out the above-mentioned method, or several subcombinations between components can be added.

本発明の方法で使用する材料及び／又は試薬は、キット（例えば、臨床研究室もしくは犯罪研究室用の診断キット又は一般的な研究室用途の核酸増幅キット）の部分として組み込むことができる。従って、本発明は、本発明の方法を実施するのに必要な成分の一部又は全部を備えるキット及び上記に開示した方法を実施するために書面又は電子形式で提供される使用説明書を包含する。こうした成分としては、例えば、オリゴヌクレオチド、結合分子、ストック溶液、酵素、陽性及び陰性対照標的配列、検出試薬、容器（例えば、試験管、キュベット、カセット、プレート、マイクロ流体デバイスなど）が挙げられる。 The materials and / or reagents used in the methods of the invention can be incorporated as part of a kit (eg, a diagnostic kit for a clinical or crime laboratory or a nucleic acid amplification kit for general laboratory use). Accordingly, the present invention includes kits comprising some or all of the components necessary to carry out the methods of the invention and instructions provided in written or electronic form for carrying out the methods disclosed above. To do. Such components include, for example, oligonucleotides, binding molecules, stock solutions, enzymes, positive and negative control target sequences, detection reagents, containers (eg, test tubes, cuvettes, cassettes, plates, microfluidic devices, etc.).

本発明の特定の実施態様は、上記増幅反応混合物中の上記ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ産物の存在又は量を測定するための１種以上の検出プローブを含む。プローブは、この増幅反応後にＲＮＡ及び／又はＤＮＡ産物を検出（即ち、終点検出）するように、或いはこの増幅反応中にＲＮＡ及び／又はＤＮＡ産物を検出（即ち、リアルタイム検出は上記反応混合物中のプローブ：単位複製配列複合体に関連するシグナルの量を定期的に測定するものである）するように設計することができる。従って、こうしたプローブは、上記増幅反応の前、増幅反応中又は増幅反応の完了時に、上記反応混合物に供給することができる。上記の最初の２つの方法におけるＲＮＡ産物のリアルタイム検出の場合、上記第１のプライマー伸長反応が開始した（即ち、増幅酵素の添加）後に上記プローブを上記反応混合物に供給することが望ましいと考えられる。何故なら、プローブがＲＮＡ産物ではなく上記標的配列に結合することにより、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）が上記プライミングオリゴヌクレオチドを伸長させることができる速度が遅くなると考えられるからである。 Particular embodiments of the present invention include one or more detection probes for measuring the presence or amount of the RNA and / or DNA product in the amplification reaction mixture. The probe detects RNA and / or DNA products after this amplification reaction (ie, endpoint detection), or detects RNA and / or DNA products during this amplification reaction (ie, real-time detection occurs in the reaction mixture). Probe: which measures periodically the amount of signal associated with the amplicon complex). Accordingly, such probes can be supplied to the reaction mixture before, during or upon completion of the amplification reaction. In the case of real-time detection of RNA products in the first two methods described above, it may be desirable to supply the probe to the reaction mixture after the first primer extension reaction has started (ie, the addition of an amplification enzyme). . This is because it is thought that the rate at which an RNA-dependent DNA polymerase (eg, reverse transcriptase) can extend the priming oligonucleotide is slowed by binding of the probe to the target sequence rather than the RNA product. .

プローブは、検出を容易にするために１以上の結合標識を有することが好ましい。 The probe preferably has one or more bound labels to facilitate detection.

本発明はさらに、本明細書に記載したプライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、キャッピングオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド及び検出プローブを含む種々のオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡ（及びこれらの類似体）とすることができ、いずれの場合にも、本発明がＤＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ等価物及びＲＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ等価物を包含することは言うまでもない。以下に記載した好ましいプライミングオリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及び検出プローブを除いて、以下の諸段落に記載したオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼ存在下の合成反応におけるその関与が阻止されるように改変する（例えば、その３’末端にブロッキング部分を含ませる）ことが好ましい。 The present invention further relates to various oligonucleotides including the priming oligonucleotides, promoter oligonucleotides, stop oligonucleotides, displacer oligonucleotides, capping oligonucleotides, extender oligonucleotides and detection probes described herein. The oligonucleotides of the present invention can be DNA or RNA (and analogs thereof), and in any case, the present invention encompasses RNA equivalents of DNA oligonucleotides and DNA equivalents of RNA oligonucleotides. Needless to say. Except for the preferred priming oligonucleotides, displacer oligonucleotides and detection probes described below, the oligonucleotides described in the following paragraphs are modified to prevent their participation in the synthesis reaction in the presence of DNA polymerase (e.g. It is preferable to include a blocking moiety at the 3 ′ end thereof.

標的核酸がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ）５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３ For specific amplification reactions where the target nucleic acid contains a hepatitis C virus (HCV) 5 'untranslated region, the present invention provides a promoter oligo comprising a promoter sequence and a hybridization sequence up to 40 or 50 bases in length. Includes nucleotides. This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as TJ, T3 or SP6 RNA polymerase, preferably SEQ ID NO: 3

のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号４ Of the T7 RNA polymerase promoter sequence. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 4.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号５ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contains at least 10, 15, 20, 25, 30 or 32 of these bases, consists of these bases, consists essentially of these bases, overlaps with these bases, or these bases Contained within and incorporates these bases. The promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than a hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 5

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号４又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The nucleotide sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence and a hybridization sequence, which is an equivalent sequence containing uracil base substituted for SEQ ID NO: 4 or thymine base, and under amplification conditions Or consisting of at least 10, 15, 20, 25, 30 or 32 consecutive bases of the base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid, or contained in these bases, and incorporating these bases It is preferable.

標的核酸がＨＣＶ５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号６ For specific amplification reactions where the target nucleic acid includes an HCV 5 'untranslated region, the present invention encompasses priming oligonucleotides up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 6

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号６の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号６又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 A base sequence which is at least 80%, 90% or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or a thymine base and which forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Of at least 10, 15, 20, 25, 30 or 31 of these bases, consisting of these bases, consisting essentially of these bases, or overlapping with these bases, Includes oligonucleotides contained within and incorporating these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 6 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence. The base sequence of the priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 6 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and at least one of the base sequences that form a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferably composed of 10, 15, 20, 25, 30 or 31 consecutive bases or contained within these bases and incorporating these bases.

上記標的核酸がＨＣＶ５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号７ In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains an HCV 5 'untranslated region, the present invention further relates to a detection probe having a maximum length of 35, 50 or 100 bases. A preferred detection probe comprises a target binding region, which is the SEQ ID NO: 7

の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１０、１３又は１５個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号７の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号７の塩基配列、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１３又は１５個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。上記標的核酸がＨＣＶ５’非翻訳領域を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大４０又は５０塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号８ A target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions and at least 80%, 90% or 100% identical to an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base Contains, consists of, or consists essentially of, at least 10, 13, or 15 contiguous bases of a base sequence that preferentially hybridizes to (eg, non-human nucleic acids) Or overlap with these bases or are incorporated into and incorporate these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 7, its complement, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions More preferably, it comprises a base sequence that preferentially hybridizes with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is the base sequence of SEQ ID NO: 7, its complement, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions It is preferably composed of at least 10, 13 or 15 consecutive bases in a base sequence that preferentially hybridizes with the body, or is contained in these bases and incorporates these bases. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents. In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains an HCV 5 'untranslated region, the present invention further relates to a detection probe having a maximum length of 40 or 50 bases. A preferred detection probe comprises a target binding region which is SEQ ID NO: 8

の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号８の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号８の塩基配列、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。上記標的核酸がヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ）ｐｏｌ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号９ A target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions and at least 80%, 90% or 100% identical to an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base Contains, consists of, or consists essentially of, at least 18, 20, or 22 contiguous bases of a base sequence that preferentially hybridizes to (eg, non-human nucleic acids) Or overlap with these bases or are incorporated into and incorporate these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 8, its complement, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions More preferably, it comprises a base sequence that preferentially hybridizes with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is the base sequence of SEQ ID NO: 8, its complement or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions It is preferably composed of at least 18, 20, or 22 consecutive bases in a base sequence that preferentially hybridizes with the body, or contained in these bases, and incorporating these bases. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents. In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid comprises a human immunodeficiency virus (HIV) pol gene, the present invention provides a promoter oligonucleotide comprising a promoter sequence and a hybridization sequence having a maximum length of 40 or 50 bases. Is included. This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as TJ, T3 or SP6 RNA polymerase, and preferably comprises the T7 RNA polymerase promoter sequence of SEQ ID NO: 3. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 9.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号１０ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contain at least 10, 15, 20, 25, 30 or 31 of these bases, or consist of these bases, consist essentially of these bases, overlap with these bases, or these bases Contained within and incorporates these bases. This promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than the hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 10

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号９の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The base sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence and a hybridization sequence, and this hybridization sequence is the base sequence of SEQ ID NO: 9 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted with a thymine base, and It consists of at least 10, 15, 20, 25, 30, or 31 consecutive bases that form a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or is contained in these bases, and these bases It is preferably incorporated.

上記標的核酸がＨＩＶｐｏｌ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１１ In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains an HIV pol gene, the present invention encompasses priming oligonucleotides of up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 11.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１１の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Of at least 10, 15, 20, 25 or 27 consecutive bases of, consisting of, consisting essentially of these bases, overlapping with these bases, or within these bases And oligonucleotides that incorporate these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 11 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence. The base sequence of the priming oligonucleotide is a base sequence of SEQ ID NO: 11 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and a base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferable that it consists of at least 10, 15, 20, 25, or 27 consecutive bases, or is contained in these bases, and incorporates these bases.

上記標的核酸がＨＩＶｏｌ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号１２ In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains an HIV ol gene, the present invention further relates to a detection probe having a maximum length of 35, 50 or 100 bases. A preferred detection probe comprises a target binding region which is SEQ ID NO: 12

の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１３、１５又は１７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号１２の塩基配列、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号１２、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１３、１５又は１７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。 A target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions and at least 80%, 90% or 100% identical to an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base Contains, consists of, or consists essentially of, at least 13, 15 or 17 contiguous bases of a base sequence that preferentially hybridizes to (eg, non-human nucleic acids) Or overlap with these bases or are incorporated into and incorporate these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 12, its complement, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. More preferably, it comprises a base sequence that preferentially forms a hybrid with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is SEQ ID NO: 12, its complement or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and preferentially the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. Preferably, it consists of at least 13, 15 or 17 consecutive bases in the base sequence forming a hybrid, or is contained in these bases, and these bases are incorporated. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents.

上記標的核酸がヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ：ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）Ｅ６及びＥ７遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号１３ In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid comprises human papilloma virus (HPV) E6 and E7 genes, the present invention provides a promoter oligo comprising a promoter sequence and a hybridizing sequence up to 40 or 50 bases in length. Includes nucleotides. This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 RNA polymerase, and preferably comprises the T7 RNA polymerase promoter sequence of SEQ ID NO: 3. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 13.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号１４ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contain at least 10, 15, 20, 25 or 27 consecutive bases, consist of these bases, consist essentially of these bases, overlap with these bases, or within these bases Contained and incorporate these bases. This promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than the hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 14.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号１３又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The nucleotide sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence and a hybridization sequence, which is an equivalent sequence containing uracil base substituted for SEQ ID NO: 13 or thymine base, and under amplification conditions Or at least 10, 15, 20, 25, or 27 consecutive bases that form a hybrid with the target nucleic acid, or are contained in these bases and incorporate these bases. preferable.

上記標的核酸がＨＰＶＥ６及びＥ７遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１５ In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains HPV E6 and E7 genes, the present invention encompasses priming oligonucleotides up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 15

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５又は１９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１５の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１５又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５又は１９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Containing, consisting of, consisting essentially of these bases, overlapping with these bases or contained within these bases, Includes oligonucleotides that incorporate these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 15 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence. The base sequence of the priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 15 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and at least one of the base sequences that form a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferably composed of 10, 15 or 19 consecutive bases or contained within these bases and incorporating these bases.

上記標的核酸がＨＰＶＥ６及びＥ７遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号１６ In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains HPV E6 and E7 genes, the present invention further relates to a detection probe having a maximum length of 35, 50 or 100 bases. A preferred detection probe comprises a target binding region which is SEQ ID NO: 16

又はその相補体の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１５、１７又は１９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号１６又はその相補体の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号１６又はその相補体であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１５、１７又は１９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。標的核酸が西ナイルウイルス（ＷＮＶ：ＷｅｓｔＮｉｌｅＶｉｒｕｓ）非構造蛋白質５遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔｉ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号１７ Or a base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to the base sequence of its complement and preferentially hybridizes with the target nucleic acid or its complement (eg, non-human nucleic acid) under stringent hybridization conditions. Contains, consists of, consists essentially of, consists of, or overlaps with these bases of at least 15, 17, or 19 of the sequence These bases are incorporated. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe includes a base sequence that substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 16 or a complement thereof and preferentially hybridizes with the target nucleic acid or the complement thereof under stringent hybridization conditions. More preferably, it consists of a base sequence or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is SEQ ID NO: 16 or a complement thereof, and at least 15, 17 or a base sequence that preferentially hybridizes with the target nucleic acid or the complement thereof under stringent hybridization conditions. It preferably consists of 19 consecutive bases or is contained within these bases and incorporates these bases. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents. In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains a West Nile Virus (WNV) nonstructural protein 5 gene, the present invention provides a promoter oligonucleotide comprising a promoter sequence and a hybridization sequence having a maximum length of 40 or 50 bases. Is included. This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as TJ, Ti or SP6 RNA polymerase and preferably comprises the T7 RNA polymerase promoter sequence of SEQ ID NO: 3. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 17.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号１８ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contain at least 10, 15, 20, 25 or 27 consecutive bases, consist of these bases, consist essentially of these bases, overlap with these bases, or within these bases Contained and incorporate these bases. This promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than the hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 18.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号１７又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The nucleotide sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence and a hybridization sequence, which is an equivalent sequence containing uracil base substituted for SEQ ID NO: 17 or thymine base, and under amplification conditions Or at least 10, 15, 20, 25, or 27 consecutive bases that form a hybrid with the target nucleic acid, or are contained in these bases and incorporate these bases. preferable.

標的核酸がＷＮＶ非構造蛋白質５遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１９ For specific amplification reactions where the target nucleic acid contains the WNV nonstructural protein 5 gene, the present invention encompasses priming oligonucleotides up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 19.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０又は２３個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号１９の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１９又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０又は２３個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contain, consist of, consist essentially of, consist of, or overlap with or contain within these bases And include oligonucleotides that incorporate these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 19 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted with a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence. The base sequence of the priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 19 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and at least a base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferably composed of 10, 15, 20 or 23 consecutive bases or contained within these bases and incorporating these bases.

標的核酸がＷＮＶ非構造蛋白質５遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号２０ In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid contains the WNV nonstructural protein 5 gene, the present invention further relates to a detection probe having a maximum length of 35, 50 or 100 bases. A preferred detection probe comprises a target binding region, which is the SEQ ID NO: 20

、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非ヒト核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１４、１６又は１８個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号２０、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号２０、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１４、１６又は１８個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。 A target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions at least 80%, 90% or 100% identical to the base sequence of an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base Contains, consists of, or consists essentially of, at least 14, 16, or 18 contiguous bases of a base sequence that preferentially hybridizes to (eg, non-human nucleic acids) Or overlap with these bases or are incorporated into and incorporate these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 20, a complement thereof, or an equivalent sequence including a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions More preferably, it comprises a base sequence that preferentially forms a hybrid with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is SEQ ID NO: 20, its complement, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and preferentially the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. Preferably, it consists of at least 14, 16 or 18 consecutive bases in the base sequence forming a hybrid, or is contained in these bases, and these bases are incorporated. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents.

標的核酸がＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号２１ For specific amplification reactions where the target nucleic acid comprises a Chlamydia trachomatis 23S rRNA sequence, the present invention encompasses promoter oligonucleotides comprising promoter sequences and hybridization sequences up to 40 or 50 bases in length. This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 RNA polymerase, and preferably comprises the T7 RNA polymerase promoter sequence of SEQ ID NO: 3. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 21.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は３０個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２２ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contains at least 10, 15, 20, 25 or 30 consecutive bases, consists of these bases, consists essentially of these bases, overlaps with these bases, or within these bases Contained and incorporate these bases. This promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than the hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 22.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号２１又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は３０個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２３ Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The nucleotide sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence and a hybridization sequence, which is an equivalent sequence containing uracil base substituted for SEQ ID NO: 21 or thymine base, and under amplification conditions Or at least 10, 15, 20, 25, or 30 consecutive bases that form a hybrid with the target nucleic acid, or are contained in these bases and incorporate these bases. preferable. For specific amplification reactions where the target nucleic acid comprises a Chlamydia trachomatis 23S rRNA sequence, the invention encompasses priming oligonucleotides up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 23.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２３の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２３又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 A base sequence which is at least 80%, 90% or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or a thymine base and which forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Containing, consisting of, consisting essentially of, consisting of, or overlapping with, or within these bases And oligonucleotides that incorporate these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 23 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence. The base sequence of the priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 23 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and at least a base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferably composed of 10, 15, 20, 25 or 29 consecutive bases or contained within these bases and incorporating these bases.

標的核酸がＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの２３ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号２４ In the case of specific amplification reactions in which the target nucleic acid comprises a Chlamydia trachomatis 23S rRNA sequence, the invention further relates to a detection probe of up to 35, 50 or 100 bases in length. A preferred detection probe comprises a target binding region, which is the SEQ ID NO: 24

、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、非Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｓｉｔｔａｃｉ核酸）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１９、２２又は２４個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号２４、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号２４、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１９、２２又は２４個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。 , Its complement, or the base sequence of an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base, and at least 80%, 90% or 100% identical to the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions A base sequence that preferentially hybridizes with (eg, non-Chlamydia psittaci nucleic acids) comprises, consists of, or consists essentially of at least 19, 22, or 24 contiguous bases Or overlap with these bases or are incorporated into and incorporate these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 24, a complement thereof, or an equivalent sequence including a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions More preferably, it comprises a base sequence that preferentially forms a hybrid with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is SEQ ID NO: 24, its complement or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and preferentially the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. Preferably, it consists of at least 19, 22, or 24 consecutive bases in the base sequence forming a hybrid, or is contained in these bases, and these bases are incorporated. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents.

標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、ＴＪ、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号２５ For specific amplification reactions where the target nucleic acid comprises a 16S rRNA sequence of Mycobacterium tuberculosis, the present invention includes promoter oligonucleotides comprising promoter sequences and hybridization sequences up to 40 or 50 bases in length. This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as TJ, T3 or SP6 RNA polymerase, and preferably comprises the T7 RNA polymerase promoter sequence of SEQ ID NO: 3. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 25.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は３６個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２６ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contains at least 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 36 of these bases, consists of these bases, consists essentially of these bases, overlaps with these bases, or Of these bases and incorporate these bases. This promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than the hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 26.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号２５又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５又は３６個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号２７ Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The base sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence and a hybridization sequence, and this hybridization sequence is an equivalent sequence containing uracil base substituted for SEQ ID NO: 25 or thymine base, and under amplification conditions And comprises at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, or 36 consecutive bases of the base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid, or is contained in these bases and incorporates these bases. It is preferable that For specific amplification reactions where the target nucleic acid comprises a 16S rRNA sequence of Mycobacterium tuberculosis, the present invention includes promoter oligonucleotides comprising promoter sequences and hybridization sequences up to 40 or 50 bases in length. This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 RNA polymerase, and preferably comprises the T7 RNA polymerase promoter sequence of SEQ ID NO: 3. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 27.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contain at least 10, 15, 20, 25, 30 or 31 of these bases, or consist of these bases, consist essentially of these bases, overlap with these bases, or these bases Contained within and incorporates these bases. This promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than the hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 28.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号２７又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０又は３１個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The nucleotide sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence and a hybridization sequence, which is an equivalent sequence containing uracil base substituted for SEQ ID NO: 27 or thymine base, and under amplification conditions Or consisting of at least 10, 15, 20, 25, 30 or 31 contiguous bases of the base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid, or is contained in these bases and incorporates these bases It is preferable.

標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９ For specific amplification reactions where the target nucleic acid comprises a Mycobacterium tuberculosis 16S rRNA sequence, the invention encompasses priming oligonucleotides up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 29

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２９又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２７個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Of at least 10, 15, 20, 25 or 27 consecutive bases of, consisting of, consisting essentially of these bases, overlapping with these bases, or within these bases And oligonucleotides that incorporate these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 29 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence. The base sequence of the priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 29 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and at least a base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferably composed of 10, 15, 20, 25 or 27 consecutive bases or contained within these bases and incorporating these bases.

標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３０ In the case of specific amplification reactions in which the target nucleic acid comprises a 16S rRNA sequence of Mycobacterium tuberculosis, the invention further relates to a detection probe of up to 35, 50 or 100 bases in length. A preferred detection probe comprises a target binding region, which is the SEQ ID NO: 30

、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ複合生物に由来する核酸ではないもの）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号３０、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号３０、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。 , Its complement, or the base sequence of an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base, and at least 80%, 90% or 100% identical to the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions Whether or not it comprises at least 18, 20, or 22 consecutive bases of a base sequence that preferentially hybridizes with a nucleic acid (for example, not a nucleic acid derived from a Mycobacterium avium complex) Consists essentially of, overlaps with, or is incorporated into and incorporates these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 30, a complement thereof, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions More preferably, it comprises a base sequence that preferentially forms a hybrid with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is SEQ ID NO: 30, an equivalent sequence thereof, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and has priority over the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. Preferably, it consists of at least 18, 20, or 22 consecutive bases in a base sequence that forms a hybrid, or is contained in these bases and incorporates these bases. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents.

標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３１ In the case of specific amplification reactions in which the target nucleic acid comprises a 16S rRNA sequence of Mycobacterium tuberculosis, the invention further relates to a detection probe of up to 35, 50 or 100 bases in length. A preferred detection probe comprises a target binding region, which is the SEQ ID NO: 31

、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ複合生物に由来する核酸ではないもの）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも２２、２５又は２８個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号３１、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号３１、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも２２、２５又は２８個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、フルオロフォア／クエンチャー色素対を含ませる。標的核酸がＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ配列を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３２ A target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions at least 80%, 90% or 100% identical to the base sequence of an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base Whether or not it contains at least 22, 25, or 28 consecutive bases in a base sequence that preferentially hybridizes with a nucleic acid (for example, a nucleic acid that is not derived from a Mycobacterium avium complex) Consists essentially of, overlaps with, or is incorporated into and incorporates these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 31, a complement thereof, or an equivalent sequence including a thymine base substituted for a uracil base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions More preferably, it comprises a base sequence that preferentially forms a hybrid with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is SEQ ID NO: 31, its complement, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and preferentially has the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. Preferably, it consists of at least 22, 25 or 28 consecutive bases in the base sequence forming a hybrid, or is contained in these bases, and these bases are incorporated. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as a fluorophore / quencher dye pair. In the case of specific amplification reactions in which the target nucleic acid comprises a 16S rRNA sequence of Mycobacterium tuberculosis, the invention further relates to a detection probe of up to 35, 50 or 100 bases in length. A preferred detection probe comprises a target binding region, which is the SEQ ID NO: 32

、その相補体、又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ複合生物に由来する核酸ではないもの）と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブは、配列番号３２、その相補体、又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列の塩基配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この塩基配列からなるか、又は本質的にこの塩基配列からなることがより好ましい。上記検出プローブの塩基配列は、配列番号３２、その相補体又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１８、２０又は２２個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、ＡＥ置換基を含ませる。 A target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions at least 80%, 90% or 100% identical to the base sequence of an equivalent sequence comprising a uracil base substituted for a thymine base Whether or not it comprises at least 18, 20, or 22 consecutive bases of a base sequence that preferentially hybridizes with a nucleic acid (for example, not a nucleic acid derived from a Mycobacterium avium complex) Consists essentially of, overlaps with, or is incorporated into and incorporates these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 32, a complement thereof, or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions More preferably, it comprises a base sequence that preferentially hybridizes with the body, consists of this base sequence, or consists essentially of this base sequence. The base sequence of the detection probe is SEQ ID NO: 32, its complement, or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and preferentially the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. Preferably, it consists of at least 18, 20, or 22 consecutive bases in the base sequence forming a hybrid, or is contained in these bases, and these bases are incorporated. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, such as AE substituents.

標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長の、プロモータ配列及びハイブリッド形成配列を含むプロモータオリゴヌクレオチドを包含する。このプロモータ配列は、Ｔ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによって認識され、好ましくは、配列番号３ For specific amplification reactions where the target nucleic acid comprises the orfX gene of Staphylococcus aureus (eg, methicillin resistant strains), the present invention encompasses promoter oligonucleotides comprising promoter sequences and hybridization sequences up to 40 or 50 bases in length. . This promoter sequence is recognized by an RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 RNA polymerase, preferably SEQ ID NO: 3

のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列を含む。好ましいプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列は、配列番号３３ Of the T7 RNA polymerase promoter sequence. A preferred promoter oligonucleotide hybridization sequence is SEQ ID NO: 33.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含む等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込む。このプロモータオリゴヌクレオチドは、増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成するハイブリッド形成配列以外の領域を含まないことが好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号３４ A base sequence that is at least 80%, 90%, or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contains at least 10, 15, 20, 25 or 29 consecutive bases, consists of these bases, consists essentially of these bases, overlaps with these bases, or within these bases Contained and incorporate these bases. This promoter oligonucleotide preferably does not contain a region other than the hybridization sequence that hybridizes with the target nucleic acid under amplification conditions. The promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 34.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プロモータオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３などのプロモータ配列及びハイブリッド形成配列からなり、このハイブリッド形成配列は、配列番号３３又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２９個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。 Or a nucleotide sequence that substantially corresponds to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or consists of this sequence More preferably, it consists essentially of this sequence. The nucleotide sequence of the promoter oligonucleotide is composed of a promoter sequence such as SEQ ID NO: 3 and a hybridization sequence, and this hybridization sequence is an equivalent sequence containing uracil base substituted for SEQ ID NO: 33 or thymine base. And consisting of at least 10, 15, 20, 25, or 29 consecutive bases that form a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions, or contained within these bases, It is preferably incorporated.

標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３５ For specific amplification reactions in which the target nucleic acid comprises the orfX gene of Staphylococcus aureus (eg, a methicillin resistant strain), the invention encompasses priming oligonucleotides up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 35.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３５の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３５又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明は、最大４０又は５０塩基長のプライミングオリゴヌクレオチドを包含する。好ましいプライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３６ A base sequence which is at least 80%, 90% or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or a thymine base and which forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contain, consist of, consist essentially of, consist of, or overlap with these bases And oligonucleotides that incorporate these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 35 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence. The base sequence of the priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 35 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and at least a base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferably composed of 10, 15, 20, 25 or 26 consecutive bases or contained within these bases and incorporating these bases. For specific amplification reactions in which the target nucleic acid comprises the orfX gene of Staphylococcus aureus (eg, a methicillin resistant strain), the invention encompasses priming oligonucleotides up to 40 or 50 bases in length. A preferred priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 36.

の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に対して少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込むオリゴヌクレオチドを含む。上記プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号３６の塩基配列又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。 A base sequence which is at least 80%, 90% or 100% identical to an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base or a thymine base and which forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions Contain, consist of, consist essentially of, consist of, or overlap with these bases And oligonucleotides that incorporate these bases. The priming oligonucleotide substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 36 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted for a thymine base, and forms a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of this sequence.

上記プライミングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号３６又はチミン塩基に対して置換されたウラシル塩基を含有する等価配列であり、かつ増幅条件下で上記標的核酸とハイブリッドを形成する塩基配列のうちの少なくとも１０、１５、２０、２５又は２６個の連続する塩基からなるか、これらの塩基内に含有され、これらの塩基を組み込んでいることが好ましい。標的核酸がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性株）のｏｒｆＸ遺伝子を含む特定の増幅反応の場合、本発明はさらに、最大３５、５０又は１００塩基長の検出プローブに関する。好ましい検出プローブは標的結合領域を含み、この標的結合領域は、配列番号３７ The base sequence of the priming oligonucleotide is SEQ ID NO: 36 or an equivalent sequence containing a uracil base substituted with a thymine base, and at least one of the base sequences that form a hybrid with the target nucleic acid under amplification conditions It is preferably composed of 10, 15, 20, 25 or 26 consecutive bases or contained within these bases and incorporating these bases. In the case of a specific amplification reaction in which the target nucleic acid comprises the orfX gene of Staphylococcus aureus (eg methicillin resistant strain), the invention further relates to a detection probe of up to 35, 50 or 100 bases in length. A preferred detection probe comprises a target binding region which is SEQ ID NO: 37.

、その相補体、又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含む等価配列の塩基配列と少なくとも８０％、９０％又は１００％同一であり、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で標的核酸又はその相補体と優先的にハイブリッドを形成する塩基配列のうちの、少なくとも１０、１２、１５又は１７個の連続する塩基を含むか、これらの塩基からなるか、本質的にこれらの塩基からなるか、これらの塩基と重なり合うか、又はこれらの塩基に含まれこれらの塩基を組み込んでいる。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する標的結合領域以外の領域を含まないことが好ましい。上記検出プローブの標的結合領域の塩基配列は、配列番号３８の塩基配列、その相補体又はウラシル塩基に対して置換されたチミン塩基を含有する等価配列に実質的に対応し、かつ緊縮ハイブリッド形成条件下で上記標的核酸又はその相補体とハイブリッドを形成する塩基配列を含むか、この配列からなるか、本質的にこの配列からなることがより好ましい。この検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下で、後述のように、「分子ビーコン」又は「分子トーチ」のような、その末端間の自己ハイブリッド形成によるヘアピン分子を形成することが可能なものとすることができる。特定の実施態様において、上記プローブには、任意選択的に、１以上の検出可能な標識、例えば、１対の相互作用蛍光標識を含ませる。本発明の一部を構成しない増幅反応の場合、上記のプロモータオリゴヌクレオチドに対してそのプロモータ配列を排除するように改変することができ、及び／又は上記プライミングオリゴヌクレオチドに対してプロモータ配列を含むように改変することができる。さらに、標的配列に対する所望の特異性を得ることができる場合には、上記のプロモータオリゴヌクレオチド及び／又はプライミングオリゴヌクレオチドを改変して検出プローブとして用いることができる。また、上記の検出プローブは増幅用オリゴヌクレオチドとしての使用に適したものとすることができる。 A target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions at least 80%, 90% or 100% identical to the base sequence of an equivalent sequence comprising a thymine base substituted for a uracil base Comprising at least 10, 12, 15, or 17 consecutive bases of a base sequence that preferentially hybridizes with or consisting of these bases, consisting essentially of these bases, or These bases overlap or are incorporated into these bases. This detection probe preferably does not contain a region other than the target binding region that hybridizes with the target nucleic acid or its complement under stringent hybridization conditions. The base sequence of the target binding region of the detection probe substantially corresponds to the base sequence of SEQ ID NO: 38, its complement, or an equivalent sequence containing a thymine base substituted for a uracil base, and stringent hybridization conditions More preferably, it comprises, consists of, or consists essentially of a base sequence that forms a hybrid with the target nucleic acid or its complement below. This detection probe shall be capable of forming a hairpin molecule by self-hybridization between its ends, such as “molecular beacon” or “molecular torch”, as described below, under stringent hybridization conditions. be able to. In certain embodiments, the probe optionally includes one or more detectable labels, eg, a pair of interacting fluorescent labels. In the case of amplification reactions that do not form part of the present invention, the promoter sequence can be modified to exclude the promoter sequence and / or include a promoter sequence for the priming oligonucleotide. Can be modified. Furthermore, when the desired specificity for the target sequence can be obtained, the above promoter oligonucleotide and / or priming oligonucleotide can be modified and used as a detection probe. In addition, the above detection probe can be suitable for use as an amplification oligonucleotide.

この発明の他の特徴と利益とは、その好ましい実施態様に関する下記の説明及び特許請求の範囲から明白になるであろう。 Other features and advantages of the invention will be apparent from the following description of the preferred embodiments and from the claims.

本発明の１つの一般的な方法を示す図である。FIG. 2 illustrates one general method of the present invention. 本発明の１つの一般的な方法を示す図である。FIG. 2 illustrates one general method of the present invention. 本発明の１つの一般的な方法を示す図である。FIG. 2 illustrates one general method of the present invention. 本発明の１つの一般的な方法を示す図である。FIG. 2 illustrates one general method of the present invention. ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の伸長産物とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ａの一般的な方法を示す図である。FIG. 1B shows the general method of FIG. 1A further comprising hybridization of the 3 ′ extension product to the extender oligonucleotide for the blocked promoter oligonucleotide. ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の伸長産物とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ｂの一般的な方法を示す図である。FIG. 1B shows the general method of FIG. 1B further comprising hybridization of the 3 ′ extension product to the extender oligonucleotide to the blocked promoter oligonucleotide. ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の標的配列とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ｃの一般的な方法を示す図である。FIG. 1C shows the general method of FIG. 1C further comprising hybridization of the 3 ′ target sequence to the extender oligonucleotide to the blocked promoter oligonucleotide. ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドに対して３’側の標的配列とエクステンダーオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成をさらに含む、図１Ｄの一般的な方法を示す図である。FIG. 1D shows the general method of FIG. 1D further comprising hybridization of the 3 ′ target sequence to the blocked promoter oligonucleotide and the extender oligonucleotide. ３’ブロッキング部分を有するプロモータオリゴヌクレオチドの使用効果を示す変性アガロースゲルを示す図である。It is a figure which shows the modified | denatured agarose gel which shows the use effect of the promoter oligonucleotide which has 3 'blocking part. 図４Ａは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は０コピーであった。図４Ｂは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの非存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は０コピーであった。FIG. 4A is a diagram showing real-time accumulation of amplification products in a Mycobacterium tuberculosis system in the presence of a stop oligonucleotide modified to contain 2'-O-methyl ribonucleotides completely. The input target nucleic acid for this reaction was 0 copies. FIG. 4B shows real-time accumulation of amplification products in the Mycobacterium tuberculosis system in the absence of stop oligonucleotides modified to be completely containing 2'-O-methyl ribonucleotides. The input target nucleic acid for this reaction was 0 copies. 図４Ｃは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１００コピーであった。図４Ｄは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの非存在下のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１００コピーであった。FIG. 4C shows the real-time accumulation of amplification products in the Mycobacterium tuberculosis system in the presence of a stop oligonucleotide modified to contain 2'-O-methyl ribonucleotides completely. The input target nucleic acid for this reaction was 100 copies. FIG. 4D shows real-time accumulation of amplification products in the Mycobacterium tuberculosis system in the absence of stop oligonucleotides modified to be completely containing 2'-O-methyl ribonucleotides. The input target nucleic acid for this reaction was 100 copies. 図４Ｅは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの存在下におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１０００コピーであった。図４Ｆは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを完全に含むように改変した停止オリゴヌクレオチドの非存在下におけるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ系における増幅産物のリアルタイム累積を示す図である。この反応のための投入標的核酸は１０００コピーであった。FIG. 4E shows the real-time accumulation of amplification products in the Mycobacterium tuberculosis system in the presence of a stop oligonucleotide modified to contain completely 2'-O-methyl ribonucleotides. The input target nucleic acid for this reaction was 1000 copies. FIG. 4F shows real-time accumulation of amplification products in the Mycobacterium tuberculosis system in the absence of a stop oligonucleotide modified to contain 2'-O-methyl ribonucleotides completely. The input target nucleic acid for this reaction was 1000 copies. プライマー依存性副産物の形成を示す図である。It is a figure which shows formation of a primer dependence by-product. 図６Ａは、副産物形成を制限するためのキャップの使用を示す図である。このキャップおよびプライミングオリゴヌクレオチドは別々の分子である。図６Ｂは、副産物形成を制限するためのキャップの使用を示す図である。このキャップおよびプライミングオリゴヌクレオチドは互いに連結している。FIG. 6A illustrates the use of a cap to limit byproduct formation. The cap and priming oligonucleotide are separate molecules. FIG. 6B illustrates the use of a cap to limit byproduct formation. The cap and priming oligonucleotide are linked to each other. 図７Ａは、副産物形成におけるキャッピングオリゴヌクレオチドの効果を示す非変性アガロースゲルの図である。鋳型の添加なしの反応を示す。図７Ｂは、副産物形成におけるキャッピングオリゴヌクレオチドの効果を示す非変性アガロースゲルの図である。鋳型を添加した反応を示す。FIG. 7A is a non-denaturing agarose gel showing the effect of capping oligonucleotides on byproduct formation. The reaction without addition of template is shown. FIG. 7B is a non-denaturing agarose gel showing the effect of capping oligonucleotides on byproduct formation. The reaction to which a template was added is shown. 本発明の方法による、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、これを陰性対照に対して４コピーレベルで調べた。It is a figure which shows real-time accumulation | storage of the amplification product in a Staphylococcus aureus system | strain by the method of this invention. The target nucleic acid was double stranded DNA, which was examined at the 4 copy level relative to the negative control. 本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。この系では図１Ｄの方法を用いた。FIG. 3 shows real-time accumulation of amplification products in a specific Staphylococcus aureus system according to the method of the present invention. The target nucleic acid in this system was double stranded DNA and the system was tested with 10,000 copies of the target relative to the negative control. In this system, the method of FIG. 1D was used. 本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。図９Ａに用いた成分のうち停止オリゴヌクレオチドを除外した。FIG. 3 shows real-time accumulation of amplification products in a specific Staphylococcus aureus system according to the method of the present invention. The target nucleic acid in this system was double stranded DNA and the system was tested with 10,000 copies of the target relative to the negative control. Of the components used in FIG. 9A, the stop oligonucleotide was excluded. 本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。図９Ａに用いた成分のうちディスプレーサオリゴヌクレオチドを除外した。FIG. 3 shows real-time accumulation of amplification products in a specific Staphylococcus aureus system according to the method of the present invention. The target nucleic acid in this system was double stranded DNA and the system was tested with 10,000 copies of the target relative to the negative control. Displacer oligonucleotides were excluded from the components used in FIG. 9A. 本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。図９Ａに用いた成分のうちプライミングオリゴヌクレオチドを除外した。FIG. 3 shows real-time accumulation of amplification products in a specific Staphylococcus aureus system according to the method of the present invention. The target nucleic acid in this system was double stranded DNA and the system was tested with 10,000 copies of the target relative to the negative control. Priming oligonucleotides were excluded from the components used in FIG. 9A. 本発明の方法による、特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ系における増幅産物のリアルタイム蓄積を示す図である。この系における標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、系は陰性対照に対して標的の１０，０００コピーで調べた。この図の方法では変性工程を除外した。FIG. 3 shows real-time accumulation of amplification products in a specific Staphylococcus aureus system according to the method of the present invention. The target nucleic acid in this system was double stranded DNA and the system was tested with 10,000 copies of the target relative to the negative control. In the method of this figure, the denaturation step was excluded.

本発明によれば、特定の核酸標的配列の検出及び／又は定量のためのアッセイに用いるそのような核酸標的配列の増幅のための、並びに各種用途の特定標的配列のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの多数のコピーの作製のための新規な方法、反応混合物、組成物並びにキットが提供される。特に、本発明の実施態様では、特異性および感度が増強された核酸標的配列の増幅方法が提供される。本発明の増幅方法は、標的核酸の１種のセンスのみを標的にするプライミングオリゴヌクレオチドを用いて実施するのが好ましく、この増幅方法に用いる他の全てのオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼがこれらを伸長することができないように、それらの３’末端にブロッキング部分を含むことが好ましい。 In accordance with the present invention, a large number of DNAs and / or RNAs of specific target sequences for amplification of such nucleic acid target sequences used in assays for detection and / or quantification of specific nucleic acid target sequences and for various applications Novel methods, reaction mixtures, compositions, and kits for making copies of are provided. In particular, embodiments of the invention provide methods for amplifying nucleic acid target sequences with enhanced specificity and sensitivity. The amplification method of the present invention is preferably performed using a priming oligonucleotide that targets only one sense of the target nucleic acid, and all other oligonucleotides used in this amplification method are extended by nucleic acid polymerases. It is preferred to include a blocking moiety at their 3 ′ end so that they cannot.

定義
以下の用語は、特に反対の意味に明記されない限り、以下の意味を有する。用語「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）ものとは、１以上のそのものを指すことに留意されたい。例えば、「１つの核酸（ａｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）」は、１以上の核酸を表すものと解釈される。従って、用語「１（つ）」（「ａ」または「ａｎ」））、「１（つ）以上」（「ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ」）および「少なくとも１（つ）」（「ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ」）は、本明細書では同じ意味で用いることがある。 Definitions The following terms have the following meanings unless expressly indicated to the contrary. Note that the term “a” (“a” or “an”) refers to one or more of itself. For example, “a nucleic acid” is interpreted to represent one or more nucleic acids. Thus, the terms “one” (“a” or “an”)), “one or more” (“one or more”) and “at least one” (“at least one”) In the present specification, the same meaning may be used.

１．核酸
「核酸」という用語は、単数の「核酸」及び複数の「核酸」を包含するものであり、２個以上のヌクレオチド、ヌクレオシド又は核酸塩基（例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）が共有結合した任意の鎖を意味する。核酸としては、ＤＮＡ又はＲＮＡのウイルスゲノム又はその一部、細菌ゲノム又はその一部、真菌、植物もしくは動物ゲノム又はそれらの一部、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ或いは合成ＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸は、線状（例えば、ｍＲＮＡ）、環状（例えば、プラスミド）又は分枝状の形、及び二本鎖又は一本鎖の形で供給することができる。核酸には、核酸の機能又は挙動を変えるために塩基を改変（例えば、核酸にさらにヌクレオチドが付加されるのをブロックするために３’末端にジデオキシヌクレオチドを付加）したものを含めることができる。本明細書に用いている核酸の「配列」という用語は、核酸を構成する塩基の配列のことを指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では核酸鎖を意味して用いることがある。本出願の全体を通じて、核酸は、５’末端および３’末端を有するものとして表される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、通常、「５’側から３’側へ」、即ち、伸びている核酸の３’末端にヌクレオチドを付加することによって合成される。 1. Nucleic acid The term “nucleic acid” includes a single “nucleic acid” and a plurality of “nucleic acids” and is any covalently linked two or more nucleotides, nucleosides or nucleobases (eg, deoxyribonucleotides or ribonucleotides). Means the chain. Nucleic acids include DNA or RNA viral genome or part thereof, bacterial genome or part thereof, fungal, plant or animal genome or part thereof, messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA ), Plasmid DNA, mitochondrial DNA, or synthetic DNA or RNA, but is not limited thereto. Nucleic acids can be supplied in linear (eg, mRNA), circular (eg, plasmid) or branched form, and in double-stranded or single-stranded form. Nucleic acids can include those in which bases have been modified to alter the function or behavior of the nucleic acid (eg, dideoxynucleotides added to the 3 ′ end to block the addition of additional nucleotides to the nucleic acid). As used herein, the term “sequence” of a nucleic acid refers to a sequence of bases constituting the nucleic acid. The term “polynucleotide” is sometimes used herein to mean a nucleic acid strand. Throughout this application, nucleic acids are represented as having a 5 ′ end and a 3 ′ end. Standard nucleic acids, such as DNA and RNA, are usually synthesized by adding nucleotides “5 ′ to 3 ′”, ie, to the 3 ′ end of the extending nucleic acid.

「ヌクレオチド」は、リン酸基、五炭糖および窒素塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡ中に存在する五炭糖はリボースである。ＤＮＡでは、五炭糖は２’−デオキシリボースである。この用語は、そのようなサブユニットのアナログ、例えば、リボースの２’位にメトキシ基（２’−Ｏ−Ｍｅ）を有するものをも包含する。本明細書に用いている用語「Ｔ」残基を含有するメトキシオリゴヌクレオチドは、リボース部分の２’位にメトキシ基及びそのヌクレオチドの塩基位置にウラシルを有する。 A “nucleotide” is a subunit of nucleic acid consisting of a phosphate group, a pentose sugar and a nitrogen base. The pentose sugar present in RNA is ribose. In DNA, the pentose sugar is 2'-deoxyribose. The term also encompasses analogs of such subunits, such as those having a methoxy group (2'-O-Me) at the 2 'position of ribose. As used herein, a methoxy oligonucleotide containing the term “T” residue has a methoxy group at the 2 ′ position of the ribose moiety and a uracil at the base position of the nucleotide.

「非ヌクレオチドユニット」は、ポリマーのハイブリッド形成に有意に関与しないユニットである。そのようなユニットは、例えば、ヌクレオチドとのいかなる有意な水素結合に関与してはならず、５つのヌクレオチド塩基またはそれらの類似体の１つを成分として有するユニットを除外することになる。 A “non-nucleotide unit” is a unit that is not significantly involved in polymer hybridization. Such a unit must not participate in any significant hydrogen bonding with nucleotides, for example, and will exclude units having as a component 5 nucleotide bases or one of their analogs.

２．オリゴヌクレオチド
本明細書に用いている「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」という用語は、単数の「オリゴヌクレオチド」及び複数の「オリゴヌクレオチド」を包含するものであり、本発明の増幅方法及びそれに続く検出方法において試薬として用いる２個以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸塩基またはこれらの関連化合物の任意のポリマーのことを意味する。このオリゴヌクレオチドはＤＮＡ及び／又はＲＮＡ及び／又はこれらの類似体とすることができる。用語オリゴヌクレオチドは、その試薬に特有の機能を表すのではなく、むしろ、本明細書に記載したそのような試薬全てを対象として含むように総称的に用いる。オリゴヌクレオチドは、種々様々な機能を果たすことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが相補鎖とハイブリッドを形成することができ、さらに核酸ポリメラーゼの存在下で伸長され得る場合には、プライマーとして機能することができ、オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写を可能にする場合には、プロモータとなることができ、オリゴヌクレオチドが適切な位置に置かれ、及び／又は改変される場合には、ハイブリッド形成を阻止し、又はプライマー伸長を妨げるように機能することができる。以下に本発明の特定のオリゴヌクレオチドについてさらに詳細に説明する。本明細書に用いているオリゴヌクレオチドは事実上任意の長さとすることができ、増幅反応または増幅反応の増幅産物の検出におけるその特定の機能によってのみ限定される。特定の配列及び化学構造のオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の技術、例えば、化学的もしくは生化学的合成、及び細菌性もしくはウイルス性ベクターなどの組換え核酸分子からのインビトロもしくはインビボ発現によって作製することができる。本開示が意味するオリゴヌクレオチドは、単に、野生型染色体ＤＮＡ又はそのインビボ転写産物からなるものではない。 2. Oligonucleotides As used herein, the term “oligonucleotide” or “oligomer” is intended to encompass a single “oligonucleotide” and a plurality of “oligonucleotides”, and the amplification method of the present invention followed by detection. It refers to any polymer of two or more nucleotides, nucleosides, nucleobases or related compounds used as reagents in the method. The oligonucleotide can be DNA and / or RNA and / or analogs thereof. The term oligonucleotide does not represent a function specific to that reagent, but rather is used generically to cover all such reagents described herein. Oligonucleotides can perform a wide variety of functions. For example, an oligonucleotide can function as a primer if the oligonucleotide can hybridize with a complementary strand and can be extended in the presence of a nucleic acid polymerase, and the oligonucleotide is recognized by RNA polymerase. Can be a promoter if it contains a sequence to be transcribed and can prevent transcription, or can prevent primer formation if the oligonucleotide is placed and / or modified in place Can function to prevent elongation. The specific oligonucleotide of the present invention is described in further detail below. As used herein, an oligonucleotide can be of virtually any length and is limited only by its specific function in the detection of amplification reactions or amplification products of amplification reactions. Oligonucleotides of specific sequence and chemical structure are made by techniques well known to those skilled in the art, for example, chemical or biochemical synthesis, and in vitro or in vivo expression from recombinant nucleic acid molecules such as bacterial or viral vectors be able to. Oligonucleotides meant by this disclosure are not simply composed of wild-type chromosomal DNA or its in vivo transcripts.

オリゴヌクレオチドは、所与の改変が所与のオリゴヌクレオチドの所望の機能に適合する限り、任意の方法で改変することができる。所与の改変が本発明の任意のオリゴヌクレオチドに適切なもの、又は望ましいものであるかどうかは、当業者であれば容易に確認することができる。改変としては、塩基の改変、糖の改変又は骨格の改変が挙げられる。塩基の改変としては、アデニン、シチジン、グアノシン、チミン及びウラシルの他に以下の塩基の使用が挙げられるが、これらに限定されるものではない：Ｃ−５プロピン、２−アミノアデノシン、５−メチルシチジン、イノシン、並びにｄＰ及びｄＫ塩基。ヌクレオシドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボース及びこれらの類似体とすることができ、例えば、リボフラノシル部分に対して２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシドが挙げられる。Ｂｅｃｋｅｒほか、米国特許第６，１３０，０３８号を参照されたい。他の糖改変としては、２’−アミノ，２’−フルオロ，（Ｌ）−α−スレオフラノシル及びペントプラノシル（ｐｅｎｔｏｐｕｒａｎｏｓｙｌ）の改変が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合、改変された結合などの結合、又はオリゴヌクレオチドとその相補性標的核酸とのハイブリッド形成を妨げない非ヌクレオチド部分によって連結させることができる。改変された結合としては、標準的なホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合のような異なる結合に置き換えられた結合が挙げられる。これらの核酸塩基サブユニットは、例えば、ＤＮＡの天然のデオキシリボースホスフェート骨格を偽ペプチド骨格（例えば、カルボキシメチルリンカーによって核酸塩基サブユニットを中央の第二級アミンに結合させる２−アミノエチルグリシン骨格）で置き換えることによって結合させることができる。（偽ペプチド骨格を有するＤＮＡ類似体は、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ：ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ」と呼ばれ、Ｎｉｅｌｓｅｎほか、“ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，”米国特許第５，５３９，０８２号に開示されている。）他の結合の改変としては、モルホリノ結合が挙げられるが、これに限定されるものではない。 Oligonucleotides can be modified in any manner as long as a given modification is compatible with the desired function of a given oligonucleotide. One skilled in the art can readily ascertain whether a given modification is appropriate or desirable for any oligonucleotide of the invention. Examples of the modification include base modification, sugar modification, or backbone modification. Base modifications include, but are not limited to, the use of the following bases in addition to adenine, cytidine, guanosine, thymine and uracil: C-5 propyne, 2-aminoadenosine, 5-methyl Cytidine, inosine, and dP and dK bases. The sugar group of the nucleoside subunit can be ribose, deoxyribose and analogs thereof, for example, ribonucleosides having a 2'-O-methyl substitution on the ribofuranosyl moiety. See Becker et al., US Pat. No. 6,130,038. Other sugar modifications include, but are not limited to, 2'-amino, 2'-fluoro, (L) -α-threofuranosyl and pentopuranosyl. These nucleoside subunits can be linked by bonds such as phosphodiester bonds, modified bonds, or non-nucleotide moieties that do not interfere with hybridization of the oligonucleotide to its complementary target nucleic acid. Modified linkages include linkages in which the standard phosphodiester linkage is replaced with a different linkage such as a phosphorothioate linkage or a methylphosphonate linkage. These nucleobase subunits are, for example, the natural deoxyribose phosphate backbone of DNA, a pseudopeptide backbone (eg, a 2-aminoethylglycine backbone that links the nucleobase subunit to a central secondary amine via a carboxymethyl linker). Can be combined by replacing with. (DNA analogs with pseudopeptide backbones are called “peptide nucleic acids” or “PNA: Peptide Nucleic Acids” and are disclosed in Nielsen et al., “Peptide Nucleic Acids,” US Pat. .) Other bond modifications include, but are not limited to, morpholino bonds.

本発明によって想定されているオリゴヌクレオチド又はオリゴマーとしては、二環式および三環式のヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体を含有する核酸類似体（ＬＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｉｍａｎｉｓｈｉほか、米国特許第６，２６８，４９０号及びＷｅｎｇｅｌほか、米国特許第６，６７０，４６１号を参照されたい。本発明では、改変されたオリゴヌクレオチドがその目的とする機能を果たす、例えば、緊縮ハイブリッド形成条件下もしくは増幅条件下で標的核酸とハイブリッドを形成し、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼと相互作用することにより伸長もしくは転写を開始することができるということを条件として、任意の核酸類似体を想定している。検出プローブの場合、こうした改変オリゴヌクレオチドは、緊縮ハイブリッド形成条件下に上記標的核酸と優先的にハイブリッドを形成することができることも必要である。 Oligonucleotides or oligomers envisioned by the present invention include, but are not limited to, nucleic acid analogs (LNA) containing bicyclic and tricyclic nucleosides and nucleotide analogs. See Imanishi et al., US Pat. No. 6,268,490 and Wengel et al., US Pat. No. 6,670,461. In the present invention, a modified oligonucleotide performs its intended function, for example, by hybridizing with a target nucleic acid under stringent hybridization conditions or amplification conditions, or by interacting with DNA or RNA polymerase. Alternatively, any nucleic acid analog is envisioned, provided that transcription can be initiated. In the case of detection probes, such modified oligonucleotides also need to be able to preferentially hybridize with the target nucleic acid under stringent hybridization conditions.

本発明のためのオリゴヌクレオチドの設計および配列は、下記のように、その機能によって決まるが、一般に、いくつかの変動要素を考慮に入れておく必要がある。最も重要なものには、長さ、融解温度（Ｔｍ）、特異性、系における他のオリゴヌクレオチドとの相補性、Ｇ／Ｃ含有量、ポリピリミジン（Ｔ、Ｃ）またはポリプリン（Ａ、Ｇ）ストレッチ、および３’末端配列がある。上記及び他の変動要素を制御することは、オリゴヌクレオチド設計の標準的かつ公知の態様であり、多数の候補オリゴヌクレオチドから最適なものをスクリーニングするために種々のコンピュータプログラムを容易に利用することができる。オリゴヌクレオチド（または他の核酸）の３’末端は、下記のように、ブロッキング部分を用いて種々の方法でブロックすることができる。「ブロック化」オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ−もしくはＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼによるその３’末端へのヌクレオチドの付加により伸長させてＤＮＡの相補鎖を生成させることができない。従って、「ブロック化」オリゴヌクレオチドは、「プライミングオリゴヌクレオチド」にはなり得ない。 The design and sequence of an oligonucleotide for the present invention depends on its function, as described below, but generally several variables need to be taken into account. Most importantly, length, melting temperature (Tm), specificity, complementation with other oligonucleotides in the system, G / C content, polypyrimidine (T, C) or polypurine (A, G) There is a stretch and a 3 ′ end sequence. Controlling these and other variables is a standard and well-known aspect of oligonucleotide design, and various computer programs can be readily used to screen the best from a large number of candidate oligonucleotides. it can. The 3 'end of an oligonucleotide (or other nucleic acid) can be blocked in various ways using a blocking moiety, as described below. A “blocked” oligonucleotide cannot be extended by the addition of a nucleotide to its 3 ′ end by a DNA- or RNA-dependent DNA polymerase to produce a complementary strand of DNA. Thus, a “blocked” oligonucleotide cannot be a “priming oligonucleotide”.

本開示に用いている一群の特定配列「から選ばれる配列「を含む」、この配列「からなる」又はこの配列「から本質的になる」核酸配列を有するオリゴヌクレオチド」という語句は、このオリゴヌクレオチドが、基本的および新規な特徴として、緊縮ハイブリッド形成条件下に、その群の列挙された核酸配列のうちの１つの正確な相補体を有する核酸と安定的にハイブリッドを形成することができることを意味している。正確な相補体は、対応するＤＮＡ又はＲＮＡ配列を包含する。「核酸配列に実質的に対応するオリゴヌクレオチド」という語句は、その言及されたオリゴヌクレオチドが、その基準核酸配列に十分類似し、その結果、そのオリゴヌクレオチドが、緊縮ハイブリッド形成条件下で同標的核酸配列とハイブリッドを形成するという点でその基準核酸配列と同様なハイブリッド形成特性を有することを意味する。本発明の「実質的に対応する」オリゴヌクレオチドが上記の言及された配列から変化してもなお、同標的核酸配列とハイブリッドを形成し得ることは、当業者であれば理解されよう。この核酸からの変化量は、その配列内の同一塩基の割合、またはそのプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の割合によって示すことができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、こうした塩基同一性または相補性の割合が１００％乃至約８０％である場合に、基準核酸配列に実質的に対応する。好ましい実施態様では、この割合は、１００％乃至約８５％である。より好ましい実施態様では、この割合は、１００％乃至約９０％とすることができ、別の好ましい態様では、この割合は、１００％乃至約９５％である。許容不能なレベルの非特異的なハイブリッド形成をもたらすことなく特定の標的核酸とのハイブリッド形成を可能にするために、種々の相補性の割合においてハイブリッド形成条件に対して様々な変更を加えることが必要とも考えられることは、当業者であれば理解されよう。 The phrase “an oligonucleotide having a nucleic acid sequence comprising”, “consisting of”, or “consisting essentially of” this sequence of a particular group of sequences used in this disclosure refers to this oligonucleotide Is, as a fundamental and novel feature, meant that it can stably hybridize with a nucleic acid having the exact complement of one of the listed nucleic acid sequences of the group under stringent hybridization conditions. is doing. The exact complement includes the corresponding DNA or RNA sequence. The phrase “oligonucleotide substantially corresponding to a nucleic acid sequence” means that the referenced oligonucleotide is sufficiently similar to its reference nucleic acid sequence so that the oligonucleotide is identical to the target nucleic acid under stringent hybridization conditions. It means that it has the same hybridization characteristics as its reference nucleic acid sequence in that it hybridizes with the sequence. One skilled in the art will appreciate that “substantially corresponding” oligonucleotides of the present invention can hybridize to the target nucleic acid sequence even when varied from the above-referenced sequences. The amount of change from this nucleic acid can be indicated by the percentage of identical bases in the sequence or the percentage of completely complementary bases between the probe or primer and the target sequence. Thus, an oligonucleotide of the invention substantially corresponds to a reference nucleic acid sequence when such a percentage of base identity or complementarity is between 100% and about 80%. In a preferred embodiment, this percentage is from 100% to about 85%. In a more preferred embodiment, this percentage can be from 100% to about 90%, and in another preferred aspect, this percentage is from 100% to about 95%. Various changes can be made to the hybridization conditions at various complementarity ratios to allow hybridization with specific target nucleic acids without resulting in unacceptable levels of non-specific hybridization. Those skilled in the art will understand that this may be necessary.

３．ブロッキング部分
本明細書に用いている「ブロッキング部分」とは、核酸ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドもしくは他の核酸を伸長させることができないようにそのオリゴヌクレオチドもしくは他の核酸の３’末端を「ブロックする」ために使用される物質である。ブロッキング部分は、小分子、例えば、リン酸基もしくはアンモニウム基であってもよく、又は改変ヌクレオチド、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチド、３’デオキシアデノシン５’三リン酸（コルジセピン）その他の改変ヌクレオチドであってもよい。別のブロッキング部分としては、例えば、３’末端に遊離のヒドロキシル基が存在しないように３’から５’の方向性を有するヌクレオチドもしくは短いヌクレオチド配列の使用、３’アルキル基、３’非ヌクレオチド部分（例えば、Ａｒｎｏｌｄほか、”Ｎｏｎ−ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＬｉｎｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｏｂｅｓ”，米国特許第６，０３１，０９１号（この内容は、引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい）、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）、３’末端の３’ヒドロキシル基を欠くヌクレオチド残基、または核酸結合蛋白質の使用が挙げられる。上記の３’ブロッキング部分は、３’から５’の方向性を有するヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、または３’非ヌクレオチド部分を含み、３’２’−ジデオキシヌクレオチドも遊離のヒドロキシル基を有する３’末端も含まないことが好ましい。３’ブロッキングオリゴヌクレオチドを調製する別の方法については当業者には公知である。 3. Blocking moiety As used herein, a “blocking moiety” is used to “block” the 3 ′ end of an oligonucleotide or other nucleic acid so that the nucleic acid polymerase cannot extend the oligonucleotide or other nucleic acid. It is a substance used for The blocking moiety may be a small molecule, such as a phosphate group or an ammonium group, or a modified nucleotide, such as a 3′2 ′ dideoxynucleotide, 3′deoxyadenosine 5′triphosphate (cordisepin), or other modified nucleotide It may be. Alternative blocking moieties include, for example, the use of nucleotides or short nucleotide sequences with a 3 ′ to 5 ′ orientation such that there is no free hydroxyl group at the 3 ′ end, 3 ′ alkyl groups, 3 ′ non-nucleotide moieties (See, eg, Arnold et al., “Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes”, US Pat. No. 6,031,091, the contents of which are incorporated herein by reference), phosphorothioates, Examples include alkanediol residues, peptide nucleic acids (PNA), nucleotide residues lacking the 3 ′ hydroxyl group at the 3 ′ end, or the use of nucleic acid binding proteins. Said 3 ′ blocking moiety comprises a nucleotide or nucleotide sequence having a 3 ′ to 5 ′ orientation, or a 3 ′ non-nucleotide moiety, neither a 3′2′-dideoxynucleotide nor a 3 ′ end with a free hydroxyl group. It is preferably not included. Other methods of preparing 3 ′ blocking oligonucleotides are known to those skilled in the art.

４．結合分子
本明細書に用いている「結合分子」とは、ＤＮＡプライマー伸長産物を所望の長さに制限する（即ち、プライマー伸長産物が概ね規定された３’末端を有する）ように、所望の標的配列の５’末端に隣接するかその近傍の標的核酸とハイブリッドを形成するか、それとも結合する物質である。本明細書に用いている「規定された３’末端」という語句は、結合分子の非存在下で生じるプライマー伸長反応に当てはまるようにプライマー伸長産物の３’末端が全く不確定ではなく、プライマー伸長産物の３’末端が小範囲の塩基内で概ね分かることを意味する。特定の実施態様において、結合分子は塩基領域を含む。この塩基領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ分子、又はこれらの類似体とすることができる。塩基領域を含む結合分子は、本明細書に記載したような１種以上の方法で改変することができる。例示的な塩基領域としては、下記のような停止及び消化オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の実施態様では、結合分子には、例えば、十分な親和性及び特異性によってＲＮＡと結合することによりＤＮＡプライマー伸長産物を所定の長さに限定することができる蛋白又は薬物を含ませることができる。 4). Binding molecule As used herein, “binding molecule” refers to any desired primer so that the DNA primer extension product is limited to a desired length (ie, the primer extension product has a generally defined 3 ′ end). A substance that hybridizes with or binds to a target nucleic acid adjacent to or near the 5 ′ end of the target sequence. As used herein, the phrase “defined 3 ′ end” means that the 3 ′ end of the primer extension product is not uncertain at all, as it applies to the primer extension reaction that occurs in the absence of the binding molecule. This means that the 3 'end of the product is generally known within a small range of bases. In certain embodiments, the binding molecule comprises a base region. This base region can be DNA, RNA, DNA: RNA chimeric molecules, or analogs thereof. A binding molecule comprising a base region can be modified by one or more methods as described herein. Exemplary base regions include stop and digest oligonucleotides as described below. In other embodiments, the binding molecule can include a protein or drug that can limit the DNA primer extension product to a predetermined length, for example, by binding to RNA with sufficient affinity and specificity. it can.

５．停止オリゴヌクレオチド
本発明において、「停止オリゴヌクレオチド」とは、標的配列５’末端の近傍の標的核酸のある領域に対して相補性の塩基配列を含むことにより、プライミングオリゴヌクレオチドを含む新生核酸のプライマー伸長を「停止させ」、それによって、この新生核酸鎖に規定された３’末端をもたらすオリゴヌクレオチドである。停止オリゴヌクレオチドは、上記新生核酸鎖に所望の３’末端をもたらすのに十分な位置で上記標的核酸とハイブリッドを形成するように設計する。停止オリゴヌクレオチドの位置決めは、その設計に応じてフレキシブルである。停止オリゴヌクレオチドは改変しても改変しなくてもよい。特定の実施態様において、停止オリゴヌクレオチドは少なくとも１種の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いて合成する。こうした改変ヌクレオチドは、相補二重鎖の熱安定性がより高いことが分かった。この２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの抵抗性を増大させることにより、改変オリゴヌクレオチドの半減期を増大させるようにも機能する。例えば、Ｍａｊｌｅｓｓｉほか、（１９８８年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：ｐ．２２２４−９を参照されたい。なお、この文献の内容は引用により本明細書に組み込まれている。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドに加えて、又はこれの代わりに、本明細書の他の箇所に記載した他の改変を利用することができる。例えば、停止オリゴヌクレオチドにＰＮＡ又はＬＮＡを含ませることができる。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎｅｔａｌ．（２０００）ＪＭｏＩ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１３，４４−５３を参照されたい。なお、この文献の内容は引用により本明細書に組み込まれている。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、伸長を阻止するためにその３’末端にブロッキング部分を含むことが、必要ではないが、好ましい。停止オリゴヌクレオチドには、ポリメラーゼによる新生核酸の更なる伸長を停止させるようにこのオリゴヌクレオチドに連結させて蛋白又はペプチドを含ませることができる。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、通常、少なくとも１０塩基長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０個又はそれ以上のヌクレオチドの長さまで伸ばすことができる。本明細書には適切かつ好ましい停止オリゴヌクレオチドを記載した。停止オリゴヌクレオチドは、通常又は必ず３’ブロッキング部分を含むが、「３’−ブロック化」オリゴヌクレオチドが必ずしも停止オリゴヌクレオチドではないことに留意されたい。本発明の他のオリゴヌクレオチド、例えば、プロモータオリゴヌクレオチドおよびキャッピングオリゴヌクレオチドも、通常又は必ず３’ブロック化される。 5). Stop oligonucleotide In the present invention, the term “stop oligonucleotide” means a primer for a nascent nucleic acid containing a priming oligonucleotide by containing a base sequence complementary to a region of the target nucleic acid near the 5 ′ end of the target sequence. An oligonucleotide that “stops” extension, thereby resulting in a defined 3 ′ end to this nascent nucleic acid strand. The stop oligonucleotide is designed to hybridize with the target nucleic acid at a position sufficient to provide the desired 3 ′ end to the nascent nucleic acid strand. The positioning of the stop oligonucleotide is flexible depending on its design. The stop oligonucleotide may or may not be modified. In certain embodiments, the stop oligonucleotide is synthesized using at least one 2′-O-methyl ribonucleotide. Such modified nucleotides were found to be more thermally stable in complementary duplexes. This 2′-O-methyl ribonucleotide also functions to increase the half-life of the modified oligonucleotide by increasing the resistance of the oligonucleotide to exonuclease. For example, Majlessi et al. (1988) Nucleic Acids Res. 26: p. See 2224-9. The content of this document is incorporated herein by reference. Other modifications described elsewhere herein can be utilized in addition to or in place of 2'-O-methyl ribonucleotides. For example, the stop oligonucleotide can include PNA or LNA. For example, Petersen et al. (2000) J MoI. Recognit. 13, 44-53. The content of this document is incorporated herein by reference. It is preferred, but not necessary, that the stop oligonucleotides of the invention contain a blocking moiety at their 3 ′ end to prevent extension. A stop oligonucleotide can include a protein or peptide linked to this oligonucleotide to stop further extension of the nascent nucleic acid by the polymerase. The stop oligonucleotides of the present invention are usually at least 10 bases long and can be extended to a length of 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 or more nucleotides. Appropriate and preferred stop oligonucleotides have been described herein. Note that stop oligonucleotides usually or necessarily contain a 3 ′ blocking moiety, but “3′-blocked” oligonucleotides are not necessarily stop oligonucleotides. Other oligonucleotides of the invention, such as promoter oligonucleotides and capping oligonucleotides, are also usually or necessarily 3 ′ blocked.

６．改変オリゴヌクレオチド（ＭｏｄｉｆｙｉｎｇＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）／消化オリゴヌクレオチド
改変オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長産物の３’末端が決定されるメカニズムをもたらす。通常、改変オリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端の近傍において１以上の塩基とハイブリッドを形成し、改変酵素、例えばヌクレアーゼによるプライマー伸長の停止を容易にするモチーフを含む。或いは、改変オリゴヌクレオチドは、標的配列の３’末端の近傍でハイブリッドを形成し、特定の改変酵素又はその後プライマー伸長を停止させることができる化学物質に繋がれた塩基領域を含むことができよう。 6). Modified Oligonucleotide / Digested Oligonucleotides Modified oligonucleotides provide a mechanism by which the 3 ′ end of the primer extension product is determined. Typically, modified oligonucleotides contain a motif that hybridizes with one or more bases near the 5 ′ end of the target sequence and facilitates termination of primer extension by a modified enzyme, such as a nuclease. Alternatively, the modified oligonucleotide could include a base region linked to a chemical that can form a hybrid near the 3 'end of the target sequence and stop the specific modified enzyme or subsequent primer extension.

特異的な改変オリゴヌクレオチドの１つは消化オリゴヌクレオチドである。消化オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、好ましくは少なくとも約６個のデオキシリボヌクレオチドのストレッチで構成される。この消化オリゴヌクレオチドは鋳型ＲＮＡとハイブリッドを形成し、このＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡは、本明細書に記載したような選択的ＲＮＡｓｅ、例えば、ＲＮＡｓｅＨ活性を有する酵素によって消化される。 One specific modified oligonucleotide is a digested oligonucleotide. Digested oligonucleotides are composed of DNA, preferably a stretch of at least about 6 deoxyribonucleotides. The digested oligonucleotide hybridizes with the template RNA, and the RNA of the RNA: DNA hybrid is digested with a selective RNAse as described herein, eg, an enzyme having RNAse H activity.

７．プロモータオリゴヌクレオチド／プロモータ配列
当該分野では公知であるが、「プロモータ」は、核酸に結合するためのシグナルとしてＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「トランスクリプターゼ」）によって認識され、特定の部位においてＲＮＡの転写を開始させる特殊な核酸配列である。結合のためには、一般には、そのようなトランスクリプターゼは、伸長反応を介してプロモータ配列を含む領域において二本鎖にされたＤＮＡを必要とすると考えられていたが、本発明者らは、ＲＮＡの効率的な転写は二本鎖プロモータが鋳型核酸を用いる伸長反応によって形成されない条件下でさえも起こり得ることを明らかにした。鋳型核酸（転写されるべき核酸）は、二本鎖である必要はない。個々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、転写促進の効率が顕著に異なり得る種々様々なプロモータ配列を認識する。ＲＮＡポリメラーゼがプロモータ配列に結合して転写を開始する場合、このプロモータ配列は、転写される配列の一部ではない。従って、それによって生成されるＲＮＡ転写産物は、この配列を含まないことになる。 7). Promoter Oligonucleotide / Promoter Sequence As is known in the art, a “promoter” is recognized by a DNA-dependent RNA polymerase (“transcriptase”) as a signal for binding to a nucleic acid and transcribes RNA at a specific site. Is a special nucleic acid sequence that initiates For binding, it was generally believed that such transcriptases required DNA that was double-stranded in the region containing the promoter sequence via an extension reaction. It has been shown that efficient transcription of RNA can occur even under conditions in which a double-stranded promoter is not formed by an extension reaction using a template nucleic acid. The template nucleic acid (the nucleic acid to be transcribed) need not be double stranded. Individual DNA-dependent RNA polymerases recognize a wide variety of promoter sequences that can vary significantly in the efficiency of transcription promotion. When RNA polymerase binds to a promoter sequence and initiates transcription, the promoter sequence is not part of the transcribed sequence. Thus, the RNA transcript produced thereby will not contain this sequence.

本発明において、「プロモータオリゴヌクレオチド」とは、第１の領域および第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変されたオリゴヌクレオチドのことを言う。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドの上記「第１の領域」は、鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する塩基配列を含み、このハイブリッド形成配列は、プロモータ領域の３’側に位置するが、必ずしもプロモータ領域に隣接しない。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部分は、通常、少なくとも１０ヌクレオチド長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長またはそれ以上の長さまで伸長させることができる。上記「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータを含む。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドは、そのプロモータオリゴヌクレオチドがＲＮＡ依存性又はＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素、によって伸長させることができず、好ましくは上記のように、その３’末端にブロッキング部分を含むように設計される。本明細書には、好適かつ好ましいプロモータオリゴヌクレオチドを記載した。 In the present invention, the “promoter oligonucleotide” refers to an oligonucleotide that includes a first region and a second region and has been modified so that initiation of DNA synthesis from the 3 ′ end is prevented. The “first region” of the promoter oligonucleotide of the present invention includes a base sequence that forms a hybrid with the template DNA. This hybridizing sequence is located 3 ′ to the promoter region, but is not necessarily adjacent to the promoter region. do not do. The hybridization portion of a promoter oligonucleotide of the present invention is usually at least 10 nucleotides in length and can be extended to a length of 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 nucleotides or more. The “second region” includes a promoter for RNA polymerase. The promoter oligonucleotide of the present invention cannot be extended by an RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase, such as reverse transcriptase, and preferably is blocked at its 3 ′ end as described above. Designed to include parts. Described herein are suitable and preferred promoter oligonucleotides.

本発明のプロモータオリゴヌクレオチドは、第１の領域のリボヌクレオチド含有セクションに結合したオリゴデオキシヌクレオチドを含む反応混合物に供給することができる。このリボヌクレオチド含有セクションは上記第１の領域の３’末端もしくはその近傍に位置する少なくとも６個の連続するリボヌクレオチドを含むことが好ましく、上記オリゴデオキシヌクレオチドは上記第１の領域のリボヌクレオチド含有セクションと同じ長さであり、かつこのセクションに対して完全に相補性であることが好ましい。ＲＮＡ：ＤＮＡ二核酸二重鎖のＲＮＡを切断することができる酵素（例えば、ＲＮＡｓｅＨ活性）を作用させると、上記プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端のブロッキング部分が放出され、上記第１の領域の残りは、鋳型ＤＮＡとのハイブリッド形成に利用可能な一本鎖の形をとる。上記第１の領域の残りの非切断部分は、上記のように、長さが１０乃至５０ヌクレオチド長であることが好ましい。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドを本明細書に開示した方法で用いることにより、上記標的配列内の変動領域間又は反応混合物中に存在すると考えられる標的配列と非標的核酸との間（例えば、一塩基多型（「ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」）又は近縁の微生物もしくは株間のミスマッチ）を識別することができる。標的核酸と高度の配列同一性を共有するプライマー伸長産物又は核酸がプロモータオリゴヌクレオチドの標的結合部分との１以上の塩基ミスマッチを含有する場合、こうしたミスマッチ塩基の相補体が転写産物に組み込まれた後、これらのミスマッチ塩基は、初回及び／又はその後繰り返されるプライマー伸長において複製されることにより増幅反応の効率及び感度に影響を及ぼす。さらに、プロモータオリゴヌクレオチドの標的結合部分とプライマー伸長産物との間のミスマッチは逆転写酵素の存在下の二本鎖プロモータ配列の形成を妨害することにより増幅反応の効率にさらに影響を及ぼすことがある。増幅反応に対するこうした悪影響を利用することにより、プロモータオリゴヌクレオチドが標的とする領域において配列変化を示す核酸間を識別することができる。 The promoter oligonucleotides of the invention can be supplied to a reaction mixture comprising oligodeoxynucleotides bound to a ribonucleotide-containing section of the first region. Preferably, the ribonucleotide-containing section comprises at least 6 consecutive ribonucleotides located at or near the 3 ′ end of the first region, the oligodeoxynucleotide being the ribonucleotide-containing section of the first region And is completely complementary to this section. When an enzyme capable of cleaving RNA of RNA: DNA double nucleic acid duplex (for example, RNAse H activity) is allowed to act, the blocking portion at the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide is released, and the first region of the first region is released. The rest takes the form of single strands that can be used for hybridization with the template DNA. The remaining uncut portion of the first region is preferably 10 to 50 nucleotides in length as described above. By using the promoter oligonucleotides of the present invention in the methods disclosed herein, between target sequences and non-target nucleic acids that are believed to be present between variable regions in the target sequence or in the reaction mixture (eg, single bases). Polymorphisms (“SNP: single nucleotide polymorphism”) or related microorganisms or strain mismatches can be identified. If the primer extension product or nucleic acid that shares a high degree of sequence identity with the target nucleic acid contains one or more base mismatches with the target binding portion of the promoter oligonucleotide, after the complement of these mismatched bases is incorporated into the transcript These mismatched bases affect the efficiency and sensitivity of the amplification reaction by being replicated in the initial and / or subsequent repeated primer extensions. Furthermore, mismatches between the target binding portion of the promoter oligonucleotide and the primer extension product may further affect the efficiency of the amplification reaction by preventing the formation of a double stranded promoter sequence in the presence of reverse transcriptase. . By taking advantage of these adverse effects on the amplification reaction, it is possible to discriminate between nucleic acids exhibiting sequence changes in the region targeted by the promoter oligonucleotide.

８．挿入配列
本明細書に用いている「挿入配列」は、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域（即ち、鋳型結合部分）と第２の領域との間に位置する配列である。挿入配列は、長さが５乃至２０ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは６乃至１８ヌクレオチド長、最も好ましくは６乃至１２ヌクレオチド長である。プロモータオリゴヌクレオチド中に挿入配列を含めると、ＲＮＡ増幅産物が形成される速度が増大する。本明細書に例示的な挿入配列を記載している。 8). Insertion Sequence As used herein, an “insertion sequence” is a sequence located between a first region (ie, a template binding portion) and a second region of a promoter oligonucleotide. The inserted sequence is preferably 5 to 20 nucleotides in length, more preferably 6 to 18 nucleotides in length, and most preferably 6 to 12 nucleotides in length. Inclusion of an insert sequence in the promoter oligonucleotide increases the rate at which RNA amplification products are formed. Exemplary insert sequences are described herein.

９．エクステンダーオリゴヌクレオチド
エクステンダーオリゴヌクレオチドは、プロモータオリゴヌクレオチドの上記第１の領域の３’末端に隣接するかその近傍の鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。エクステンダーオリゴヌクレオチドは、このエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基がプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の３、２もしくは１塩基以内にあるように、鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成させることが好ましい。エクステンダーオリゴヌクレオチドおよびプロモータオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成させる場合には、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基をプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基に隣接させることが最も好ましい。エクステンダーオリゴヌクレオチドの伸長を阻止するため、通常、３’末端にブロッキング部分を含ませる。エクステンダーオリゴヌクレオチドの長さは１０乃至５０ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは２０乃至４０ヌクレオチド長、最も好ましくは３０乃至３５ヌクレオチド長である。 9. Extender oligonucleotide An extender oligonucleotide is an oligonucleotide that hybridizes to the template DNA adjacent to or near the 3 'end of the first region of the promoter oligonucleotide. The extender oligonucleotide is preferably hybridized with the template DNA such that the 5 ′ terminal base of the extender oligonucleotide is within 3, 2 or 1 base of the 3 ′ terminal base of the promoter oligonucleotide. When the extender oligonucleotide and the promoter oligonucleotide are hybridized with the template DNA, it is most preferable that the 5 ′ terminal base of the extender oligonucleotide is adjacent to the 3 ′ terminal base of the promoter oligonucleotide. In order to prevent extension of the extender oligonucleotide, a blocking moiety is usually included at the 3 ′ end. The length of the extender oligonucleotide is preferably 10 to 50 nucleotides in length, more preferably 20 to 40 nucleotides in length, and most preferably 30 to 35 nucleotides in length.

１０．プライミングオリゴヌクレオチド
プライミングオリゴヌクレオチドは、少なくともその３’末端が鋳型核酸に対して相補性であり、この鋳型とハイブリッドを形成して、ＲＮＡ依存性もしくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始に適切なプライミングオリゴヌクレオチド：鋳型ハイブリッドを生じるオリゴヌクレオチドである。プライミングオリゴヌクレオチドは、その３’末端に共有結合される複数のヌクレオチドの付加によって伸長され、これらのヌクレオチドは鋳型に対して相補性である。その結果がプライマー伸長産物である。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドの長さは、通常、少なくとも１０ヌクレオオチド長であり、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０ヌクレオチド長またはそれ以上の長さまで伸長することができる。本明細書には適切かつ好ましいプライミングオリゴヌクレオチドを記載した。周知である実質的にすべてのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、ＤＮＡ合成を開始するためにオリゴヌクレオチドが一本鎖鋳型とハイブリッドを形成すること（「プライミング」）を必要とするが、ＲＮＡ複製および転写（ＤＮＡからＲＮＡのコピー）は一般的にプライマーを必要としない。プライミングオリゴヌクレオチドには、その機能上、ＤＮＡポリメラーゼ存在下に伸長を阻止する３’ブロッキング部分を含ませることができない。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的核酸と優先的にハイブリッドを形成し、この標的核酸とハイブリッド形成した場合にリボヌクレアーゼがこれを切断することができないように設計することが好ましい。 10. Priming oligonucleotide A priming oligonucleotide is primed at least at its 3 'end to be complementary to a template nucleic acid and hybridizes with this template to initiate synthesis by an RNA-dependent or DNA-dependent DNA polymerase. Oligonucleotide: An oligonucleotide that produces a template hybrid. A priming oligonucleotide is extended by the addition of a plurality of nucleotides covalently linked to its 3 ′ end, which are complementary to the template. The result is a primer extension product. The length of a priming oligonucleotide of the invention is usually at least 10 nucleotides long and can be extended to a length of 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 nucleotides or more. Described herein are suitable and preferred priming oligonucleotides. While virtually all DNA polymerases (including reverse transcriptases) that are well known require the oligonucleotide to hybridize with a single-stranded template ("priming") to initiate DNA synthesis, RNA replication and transcription (DNA to RNA copy) generally do not require primers. The priming oligonucleotide cannot contain a 3 ′ blocking moiety that prevents extension in the presence of DNA polymerase due to its function. The priming oligonucleotide is preferably designed so that it preferentially hybridizes with the target nucleic acid and cannot be cleaved by ribonuclease when hybridized with the target nucleic acid.

１１．ディスプレーサオリゴヌクレオチド
「ディスプレーサオリゴヌクレオチド」とは、標的配列の３’末端とハイブリッド形成した近傍のプライミングオリゴヌクレオチド（本明細書では「フォワードプライミングオリゴヌクレオチド」と称する）より上流側にある鋳型核酸とハイブリッドを形成するプライミングオリゴヌクレオチドである。「上流側」とは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端がフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に対して５’側の鋳型核酸と複合体を形成することを意味する。この鋳型核酸とハイブリッド形成させる場合、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基はフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基に隣接させるか、これから隔てることが好ましい。さらに好ましくは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基をフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基から５乃至３５塩基隔てる。ディスプレーサオリゴヌクレオチドは、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドと同時に、又はフォワードプライミングオリゴヌクレオチドが鋳型核酸とハイブリッドを形成する時間を十分とった後に、反応混合物に供給することができる。フォワードプライミングオリゴヌクレオチドの伸長は、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの反応混合物への供給の前又はこの供給の後に開始することができる。増幅条件下で、このディスプレーサオリゴヌクレオチドは鋳型依存性に伸長されることにより、この鋳型核酸と複合体が形成される上記フォワードプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物と置換する。一旦標的核酸から置換されると、このフォワードプライミングオリゴヌクレオチドを含むプライマー伸長産物はプロモータオリゴヌクレオチドとの複合体形成に利用可能となる。上記のフォワードプライミングオリゴヌクレオチド及びディスプレーサオリゴヌクレオチドはいずれも標的核酸と優先的にハイブリッドを形成する。 11. Displacer oligonucleotide A “displacer oligonucleotide” refers to a hybrid between a template nucleic acid and a hybrid upstream of a neighboring priming oligonucleotide hybridized with the 3 ′ end of a target sequence (referred to herein as a “forward priming oligonucleotide”). Priming oligonucleotide to be formed. The “upstream side” means that the 3 ′ end of the displacer oligonucleotide forms a complex with the template nucleic acid on the 5 ′ side with respect to the 3 ′ end of the forward priming oligonucleotide. When hybridizing with this template nucleic acid, the 3 ′ terminal base of the displacer oligonucleotide is preferably adjacent to or separated from the 5 ′ terminal base of the forward priming oligonucleotide. More preferably, the 3 ′ terminal base of the displacer oligonucleotide is separated from the 5 ′ terminal base of the forward priming oligonucleotide by 5 to 35 bases. The displacer oligonucleotide can be supplied to the reaction mixture simultaneously with the forward priming oligonucleotide or after sufficient time for the forward priming oligonucleotide to hybridize with the template nucleic acid. Extension of the forward priming oligonucleotide can be initiated before or after feeding the displacer oligonucleotide to the reaction mixture. Under amplification conditions, the displacer oligonucleotide is extended in a template-dependent manner, replacing the primer extension product comprising the forward priming oligonucleotide that is complexed with the template nucleic acid. Once displaced from the target nucleic acid, the primer extension product containing the forward priming oligonucleotide is available for complex formation with the promoter oligonucleotide. Both the forward priming oligonucleotide and the displacer oligonucleotide are preferentially hybridized with the target nucleic acid.

１２．キャップ又はキャッピングオリゴヌクレオチド
本明細書に用いている「キャップ」は、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に対して相補性のオリゴヌクレオチドを含み、このキャップの５’末端塩基は上記プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端とハイブリッドを形成する。本発明によるキャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端と優先的にハイブリッドを形成する（例えば、プロモータオリゴヌクレオチドとはハイブリッドを形成しない）が、プライミングオリゴヌクレオチドと標的核酸とがハイブリッドを形成することによりこのキャップが置換されるように設計する。キャップはキャッピングオリゴヌクレオチド単体の形をとることができ、又はこれはリンカー領域を介してプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に連結させることにより増幅条件下でプライミングオリゴヌクレオチドとステム−ループ構造を形成させることができる。このようなリンカー領域には、通常のヌクレオチド、無塩基ヌクレオチドもしくはその他の点で改変されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド領域を含めることができる。本明細書により詳細に記載されるように、適切なキャップの長さは、少なくとも３塩基長であり、約１４塩基未満の長さである。代表的なキャップの長さは約５乃至７塩基長である。 12 Cap or Capping Oligonucleotide As used herein, a “cap” includes an oligonucleotide that is complementary to the 3 ′ end of the priming oligonucleotide, and the 5 ′ terminal base of this cap is the 3 ′ end of the priming oligonucleotide. Forms a hybrid with the end. The cap according to the present invention preferentially hybridizes with the 3 ′ end of the priming oligonucleotide (eg, does not form a hybrid with the promoter oligonucleotide), but the priming oligonucleotide and the target nucleic acid form a hybrid. Design this cap to be replaced. The cap can take the form of a capping oligonucleotide alone, or it can form a stem-loop structure with the priming oligonucleotide under amplification conditions by linking it to the 5 'end of the priming oligonucleotide via a linker region. Can do. Such linker regions can include normal nucleotides, abasic nucleotides or otherwise modified nucleotides or non-nucleotide regions. As described in more detail herein, a suitable cap length is at least 3 bases long and less than about 14 bases long. A typical cap length is about 5 to 7 bases in length.

１３．プローブ
「プローブ」又は「検出プローブ」とは、検出しようとする標的配列の各センスを含有する増幅産物の領域に対して部分的もしくは完全に相補性の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことによって緊縮ハイブリッド形成条件下でこれとハイブリッドを形成する分子を意味する。当業者であれば理解されようが、プローブは、単一の核酸分子又はその類似体を、人間が介入しなければ天然には存在しない（例えば、異種核酸を用いて組み換えられるか、単離されるか、ある程度精製された）形態で含む。 13. Probe A “probe” or “detection probe” is stringent by including an oligonucleotide having a base sequence that is partially or fully complementary to the region of the amplification product that contains each sense of the target sequence to be detected. Means a molecule that hybridizes with this under hybridization conditions. As will be appreciated by those skilled in the art, a probe is not naturally occurring without human intervention (e.g., recombined or isolated using a heterologous nucleic acid). Or to some extent) form.

本発明のプローブは、標的とされる領域の外側に別のヌクレオチド類を、そのようなヌクレオチド類が緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成に実質的に影響を及ぼさず、検出プローブの場合には、標的配列との優先的なハイブリッド形成を妨げない限り、有することができる。また、標的捕捉配列（一般的には、ポリＡ、ポリＴまたはポリＵテイルのようなホモポリマー区域）、プロモータ配列、ＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位のような非相補配列も含ませることができ、又は、この非相補配列には、上記プローブもしくは上記標的核酸又はこれらの両者に触媒活性部位もしくはヘアピン構造のような所望の二次もしくは三次構造を付与する配列を含ませることができる。上記プローブは、少なくとも１種の検出可能な標識を含むことが好ましい。上記プローブは、少なくとも１種の検出可能な標識を含むことが好ましい。この標識は、任意の適切な標識物質とすることができ、このようなものとして放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、発色団、上記の条件下で標的核酸と安定にハイブリッドを形成することができない塩基配列領域、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい一実施態様において、この標識はアクリジニウムエステルである。こうしたプローブには、そのプローブが標的配列とハイブリッドを形成したかどうかによって異なるシグナルを発する相互作用標識を含ませることができる。相互作用標識の例としては、酵素／基質、酵素／補因子、ルミネッセント／クエンチャー、ルミネッセント／アダクト、色素二量体、およびフォレスターエネルギー転移対が挙げられる。本発明の特定のプローブは標識を含まない。例えば、非標識「捕捉」プローブを用いて標的配列又はその複製物を濃縮することができ、次いでこれを第２の「検出」プローブによって検出することができる。例えば、Ｗｅｉｓｂｕｒｇほか、“Ｔｗｏ−ＳｔｅｐＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄＣａｐｔｕｒｅｏｆａＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，”米国特許第６，５３４，２７３号を参照されたい。なお、この特許の内容は、引用により本明細書に組み込まれている。検出プローブは通常標識されるが、特定の検出技術を用いれば、増幅産物の検出のためにこのプローブを標識する必要がない。例えば、Ｎｙｇｒｅｎほか、“ＤｅｖｉｃｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＯｐｔｉｃａｌＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、米国特許第６，０６０，２３７号を参照されたい。 The probes of the present invention provide additional nucleotides outside the targeted region, such nucleotides do not substantially affect hybridization under stringent hybridization conditions, and in the case of detection probes, As long as it does not prevent preferential hybridization with the target sequence. Also, non-complementary sequences such as target capture sequences (typically homopolymer sections such as poly A, poly T or poly U tail), promoter sequences, binding sites for RNA transcription, restriction endonuclease recognition sites Or the non-complementary sequence includes a sequence that imparts the desired secondary or tertiary structure, such as a catalytically active site or hairpin structure, to the probe or the target nucleic acid or both. be able to. The probe preferably includes at least one detectable label. The probe preferably includes at least one detectable label. The label can be any suitable labeling substance, such as radioisotopes, enzymes, enzyme cofactors, enzyme substrates, dyes, haptens, chemiluminescent molecules, fluorescent molecules, phosphorescent molecules, electrical molecules Examples include, but are not limited to, chemiluminescent molecules, chromophores, base sequence regions that cannot stably form hybrids with the target nucleic acid under the above conditions, and mixtures thereof. In one particularly preferred embodiment, the label is an acridinium ester. Such probes can include interacting labels that emit different signals depending on whether the probe has hybridized to the target sequence. Examples of interaction labels include enzymes / substrates, enzymes / cofactors, luminescent / quenchers, luminescent / adducts, dye dimers, and Forrester energy transfer pairs. Certain probes of the invention do not contain a label. For example, an unlabeled “capture” probe can be used to enrich the target sequence or a replica thereof, which can then be detected by a second “detection” probe. See, for example, Weisburg et al., “Two-Step Hybridization and Capture of a Polynucleotide,” US Pat. No. 6,534,273. The contents of this patent are incorporated herein by reference. Although the detection probe is usually labeled, it is not necessary to label this probe for detection of amplification products using a specific detection technique. See, for example, Nygren et al., “Devices and Methods for Optical Detection of Nucleic Acid Hybridization, US Pat. No. 6,060,237.

「安定な」または「検出のために安定な」とは、反応混合物の温度が核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度は、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも５℃低いことがより好ましく、核酸二重鎖の融解温度よりも少なくとも１０℃低いことがさらにより好ましい。 “Stable” or “stable for detection” means that the temperature of the reaction mixture is at least 2 ° C. below the melting temperature of the nucleic acid duplex. More preferably, the temperature of the reaction mixture is at least 5 ° C. below the melting temperature of the nucleic acid duplex, and even more preferably at least 10 ° C. below the melting temperature of the nucleic acid duplex.

「優先的にハイブリッドを形成する」とは、緊縮ハイブリッド形成条件下において、本発明のプローブが標的配列の各センスを含有する増幅産物とハイブリッドを形成して安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成し、同時に安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成を最小限に抑えることを意味する。従って、プローブが非標的配列に対してよりも十分高い程度に標的配列又はその複製物とハイブリッドを形成することにより、当業者が増幅時に形成される標的配列のＲＮＡ複製物または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を正確に定量することができるようになる。特定の配列のプローブは、化学合成、組換え核酸分子からのインビボもしくはインビトロ発現などの当業者に周知の技術によって作製することができる。プローブの長さは１０乃至１００ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは１２乃至５０塩基長、さらにより好ましくは１８乃至３５塩基長である。 “Preferentially hybridize” means that under stringent hybridization conditions, the probe of the present invention hybridizes to an amplification product containing each sense of the target sequence to form a stable probe: target hybrid; At the same time stable probe: means minimizing the formation of non-target hybrids. Thus, an RNA replica or complementary DNA (cDNA) of the target sequence formed by one of ordinary skill in the art by hybridizing the target sequence or a replica thereof to a degree sufficiently higher than the non-target sequence. Can be accurately quantified. Probes of a specific sequence can be made by techniques well known to those skilled in the art such as chemical synthesis, in vivo or in vitro expression from recombinant nucleic acid molecules. The length of the probe is preferably 10 to 100 nucleotides, more preferably 12 to 50 bases, and even more preferably 18 to 35 bases.

１４．ハイブリッドを形成する／ハイブリッド形成
核酸ハイブリッド形成とは、完全にもしくは部分的に相補性のヌクレオチド配列を有する２本の核酸鎖が所定の反応条件下で一体となり安定な２本鎖ハイブリッドを形成する過程である。いずれか一方の核酸鎖をデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）又はこれらの類似体とすることができる。従って、ハイブリッド形成はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド又はこれらの類似体の生成に関係する。この二本鎖構造体（ハイブリッドと呼ばれることがある）の２本の構成鎖は、水素結合によって結合される。これらの水素結合は、最も一般的には、一本鎖核酸に塩基のアデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間で形成されるが、塩基対はこれらの「標準的」対のメンバーではない塩基間でも形成され得る。非標準的塩基対については当該分野で公知である。（例えば、ＲＯＧＥＲＬ．Ｐ．ＡＤＡＭＳＥＴＡＬ．、ＴＨＥＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＯＦＴＨＥＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳ（第１１版、１９９２年）を参照されたい。）
「緊縮ハイブリッド形成条件」又は「緊縮条件」とは、特定の検出プローブが、標的配列の各センスを反応混合物中に存在する他の核酸を上回って含む増幅産物とハイブリッドを形成することができる条件のことを言う。こうした条件が、プローブのＧＣ含量および長さ、ハイブリッド形成温度、ハイブリッド形成用試薬または溶液の組成並びに求められるハイブリッド形成特異性の程度を含む要因によって異なることは明瞭に理解されよう。特定の緊縮ハイブリッド形成条件について以下の開示において示した。 14 Hybridization / Hybridization Nucleic acid hybridization is a process in which two nucleic acid strands having completely or partially complementary nucleotide sequences are united under a predetermined reaction condition to form a stable double-stranded hybrid. It is. Either nucleic acid strand can be deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) or an analog thereof. Thus, hybridization is associated with the production of RNA: RNA hybrids, DNA: DNA hybrids, RNA: DNA hybrids or analogs thereof. The two constituent chains of this double-stranded structure (sometimes called a hybrid) are linked by hydrogen bonding. These hydrogen bonds are most commonly formed between nucleotides containing the bases adenine and thymine or uracil (A and T or U) or cytosine and guanine (C and G) in single-stranded nucleic acids, Base pairs can also be formed between bases that are not members of these “standard” pairs. Non-standard base pairs are known in the art. (See, for example, ROGER L. P. ADAMS ETAL., THE BIOCHEMISTRY OF THE NUCLEIC ACIDS (11th edition, 1992).)
“Stringent hybridization conditions” or “stringent conditions” refers to conditions under which a particular detection probe can form a hybrid with an amplification product that contains each sense of the target sequence in excess of other nucleic acids present in the reaction mixture. Say that. It will be clearly understood that these conditions will depend on factors including the GC content and length of the probe, the hybridization temperature, the composition of the hybridization reagent or solution and the degree of hybridization specificity sought. Specific stringent hybridization conditions are indicated in the following disclosure.

「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」または「二重鎖」とは、二本鎖の水素結合領域を含む核酸構造であって、各鎖が他方の鎖に対して相補性であるものとし、この領域が限定されない例として挙げられる化学発光もしくは蛍光の光検出、オートラジオグラフィー、又はゲル電気泳動を含む手段により検出するのに緊縮ハイブリッド形成条件下で十分安定であるものとする核酸構造を意味する。このようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、またはＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖分子を含むことができる。 “Nucleic acid hybrid” or “hybrid” or “duplex” refers to a nucleic acid structure comprising double stranded hydrogen bonding regions, each strand being complementary to the other strand. Means a nucleic acid structure that is sufficiently stable under stringent hybridization conditions to be detected by means including chemiluminescent or fluorescent light detection, autoradiography, or gel electrophoresis, which are given as non-limiting examples. Such hybrids can include RNA: RNA, RNA: DNA, or DNA: DNA duplex molecules.

「相補性」とは、２つの一本鎖核酸の類似の領域のヌクレオチド配列又は同じ一本鎖核酸の２つの異なる領域のヌクレオチド配列が、その一本鎖領域同士が緊縮ハイブリッド形成又は増幅条件下で共に安定な二本鎖水素結合領域としてハイブリッドを形成するのを可能にするヌクレオチド組成を有することを意味する。一方の一本鎖領域のヌクレオチドの連続する配列が、他方の一本鎖領域のヌクレオチドの類似配列と、ＡがＵもしくはＴと対になりＣがＧと対になるように一連の「標準的」水素結合塩基対を形成することができる場合、これらのクレオチド配列は「完全に」相補性である。 “Complementarity” means a nucleotide sequence of similar regions of two single-stranded nucleic acids or a nucleotide sequence of two different regions of the same single-stranded nucleic acid, under the condition that the single-stranded regions are stringently hybridized or amplified. Both have a nucleotide composition that allows them to form hybrids as stable double stranded hydrogen bonding regions. A series of “standard” sequences in which a contiguous sequence of nucleotides in one single-stranded region is paired with a similar sequence of nucleotides in the other single-stranded region and A is paired with U or T and C is paired with G These nucleotide sequences are “fully” complementary if they can form hydrogen-bonded base pairs.

「優先的にハイブリッドを形成する」とは、緊縮ハイブリッド形成条件下で特定の相補的なヌクレオチド配列がハイブリッドを形成して他の安定性の低い二重鎖よりも優先的に安定なハイブリッドを形成することを意味する。 “Preferentially hybridize” means that a specific complementary nucleotide sequence hybridizes under stringent hybridization conditions to form a preferentially stable hybrid over other less stable duplexes. It means to do.

１５．「核酸」同一性
特定の実施態様において、本発明の核酸は、基準核酸の連続する塩基領域と少なくとも８０％、９０％または１００％同一である連続する塩基領域を含む。短い核酸、例えば、本発明の特定のオリゴヌクレオチドの場合、「照会」核酸の塩基配列と基準核酸の塩基配列との間の同一性の程度は手動のアラインメントによって測定することができる。「同一性」は、比較対象の核酸の糖および骨格領域に関係なく、窒素塩基の配列だけを比較することによって測定する。従って、照会:基準塩基配列アラインメントは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、あるいはこれらの任意の組み合わせ又は類似体とすることができる。等価なＲＮＡおよびＤＮＡ塩基配列は、（ＲＮＡの）ウリジン残基を（ＤＮＡの）チミジン残基で置き換えることによって比較することができる。 15. “Nucleic acid” identity In certain embodiments, a nucleic acid of the invention comprises a contiguous base region that is at least 80%, 90% or 100% identical to a contiguous base region of a reference nucleic acid. In the case of short nucleic acids, eg, certain oligonucleotides of the invention, the degree of identity between the base sequence of the “query” nucleic acid and the base sequence of the reference nucleic acid can be determined by manual alignment. “Identity” is measured by comparing only the sequences of nitrogen bases, regardless of the sugar and backbone regions of the nucleic acids to be compared. Thus, the query: reference sequence alignment can be DNA: DNA, RNA: RNA, DNA: RNA, RNA: DNA, or any combination or analog thereof. Equivalent RNA and DNA base sequences can be compared by replacing uridine residues (of RNA) with thymidine residues (of DNA).

１６．標的核酸／標的配列
「標的核酸」は、増幅対象の「標的配列」を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載したように、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができ、一本鎖又は二本鎖のいずれかとすることができる。この標的核酸は、標的核酸以外に、増幅されないこともあり得る他の配列を含むことができる。代表的な標的核酸としては、ウイルスゲノム、細菌ゲノム、真菌ゲノム、植物ゲノム、動物ゲノム、ウイルス、細菌もしくは真核生物細胞由来のｒＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、又は染色体ＤＮＡが挙げられる。標的核酸は、実行される増幅アッセイの目的に基づいて、任意の数の供給源から単離することができる。標的核酸の供給源としては、犯罪の証拠に由来する臨床標本（例えば、血液、尿、唾液、糞便、精液又は髄液）、環境サンプル（例えば、水又は土壌サンプル）、食物、工業サンプル、ｃＤＮＡライブラリー、あるいは全細胞ＲＮＡに由来する標本が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「単離された」とは、標的核酸を含むサンプルがその天然の環境から取得されることを意味するが、この用語は、精製のいかなる程度も暗示するものではない。必要な場合、本発明の標的核酸は、本発明の種々のオリゴヌクレオチドと相互作用させるために利用することができる。これには、例えば、細胞から標的核酸を放出させるために細胞溶解または細胞透過化処理を行った後、一連の単離および洗浄工程などの１つ以上の精製工程を行うことを含めることができる。例えば、Ｃｌａｒｋほか、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＥｘｔｒａｃｔｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｆｒｏｍａＷｉｄｅＲａｎｇｅｏｆＯｒｇａｎｉｓｍｓ，” 米国特許第５，７８６，２０８号を参照されたい。なお、この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている。このことは、サンプルが、例えば、血液サンプル中に存在するヘムなどの増幅反応を妨害し得る成分を含有すると考えられる場合に特に重要である。Ｒｙｄｅｒほか、“ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｆｒｏｍＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌｓＵｓｉｎｇＩｒｏｎＣｏｍｐｌｅｘｉｎｇａｎｄＯｔｈｅｒＡｇｅｎｔｓ，” 米国特許第５，６３９，５９９号を参照されたい。なお、この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている。増幅のために種々の供給源から標的核酸を調製する方法は、当業者には公知である。本発明の標的核酸は、本明細書に記載した増幅反応の前にある程度精製することができるが、他の場合では、サンプルは、さらなる操作を全く行わずに増幅反応に加える。 16. Target Nucleic Acid / Target Sequence A “target nucleic acid” is a nucleic acid that contains a “target sequence” to be amplified. The target nucleic acid can be DNA or RNA, as described herein, and can be either single stranded or double stranded. The target nucleic acid can include other sequences besides the target nucleic acid that may not be amplified. Exemplary target nucleic acids include viral genomes, bacterial genomes, fungal genomes, plant genomes, animal genomes, rRNA, tRNA or mRNA, mitochondrial DNA, or chromosomal DNA from viruses, bacteria or eukaryotic cells. The target nucleic acid can be isolated from any number of sources based on the purpose of the amplification assay being performed. Sources of target nucleic acids include clinical specimens (eg, blood, urine, saliva, stool, semen or cerebrospinal fluid) derived from criminal evidence, environmental samples (eg, water or soil samples), food, industrial samples, cDNA Examples include, but are not limited to, libraries or specimens derived from total cellular RNA. “Isolated” means that the sample containing the target nucleic acid is obtained from its natural environment, but the term does not imply any degree of purification. If necessary, the target nucleic acids of the invention can be utilized to interact with the various oligonucleotides of the invention. This can include, for example, performing a cell lysis or cell permeabilization treatment to release the target nucleic acid from the cell followed by one or more purification steps such as a series of isolation and washing steps. . See, for example, Clark et al., “Method for Extracting Nucleic Acids from a Wide Range of Organisms,” US Pat. No. 5,786,208. The contents of this patent are incorporated herein by reference. This is particularly important when the sample is believed to contain components that can interfere with the amplification reaction, such as heme present in the blood sample. See Ryder et al., “Amplification of Nucleic Acids from Monoclear Cells Using Iron Complexing and Other Agents,” US Pat. No. 5,639,599. The contents of this patent are incorporated herein by reference. Methods for preparing target nucleic acids from various sources for amplification are known to those skilled in the art. The target nucleic acid of the invention can be purified to some extent prior to the amplification reaction described herein, but in other cases the sample is added to the amplification reaction without any further manipulation.

「標的配列」という用語は、増幅させることになる標的核酸の特定のヌクレオチド配列のことを言う。この「標的配列」は、本発明のプロセス中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモータオリゴヌクレオチド）が複合体化した複合配列を含む。標的核酸が元々一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸に存在するような「標的配列」に対して相補性の配列をも指す。「標的核酸」が元々二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。標的配列を選択する際、関連のない、又は密接に関連する標的核酸同士を識別するために「独特の」配列を選択する必要があることは、当業者であれば理解されよう。当業者であれば理解されようが、「独特の」配列は試験環境から判断する。少なくとも検出プローブによって認識される配列は（本明細書の他の箇所でより詳細に記載したが）、試験対象の環境において独特である必要があるが、考えられる全ての配列の範囲内で独特である必要はない。さらに、標的配列は検出プローブによる認識のための「独特の」配列を含む必要があるが、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモータオリゴヌクレオチドは必ずしも「独特の」配列を認識している訳ではない。一部の実施態様では、類縁生物のファミリーに共通する標的配列、例えば、サンプル中に存在する可能性のある全てのＨＩＶ株に共通する配列、を選択することが望ましいことがある。他の場合では、近縁の生物同士、例えば、病原性及び非病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、を識別するために、極めて特異的な標的配列、又は少なくとも検出プローブによって認識される非常に特異的な領域を有する標的配列が選択されることになる。本発明の標的配列は、任意の実用的な長さとすることができる。標的配列は、最小限、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補体）とハイブリッドを形成する領域、プロモータオリゴヌクレオチド（又はその相補体）のハイブリッド形成領域とハイブリッドを形成する領域、及び検出のために使用される領域、例えば、本明細書の他の箇所でより詳細に記載した、検出プローブとハイブリッドを形成する領域を含む。検出プローブとハイブリッドを形成する領域は、プライミングオリゴヌクレオチド（又はその相補体）とハイブリッドを形成する領域あるいはプロモータオリゴヌクレオチド（又はその相補体）のハイブリッド形成領域と重なり合うかこれらの領域内に含まれてもよい。 The term “target sequence” refers to the specific nucleotide sequence of the target nucleic acid to be amplified. The “target sequence” includes a composite sequence in which oligonucleotides (eg, priming oligonucleotides and / or promoter oligonucleotides) are complexed during the process of the present invention. When the target nucleic acid is originally single stranded, the term “target sequence” also refers to a sequence that is complementary to the “target sequence” as present in the target nucleic acid. Where the “target nucleic acid” is originally double-stranded, the term “target sequence” refers to both the sense (+) strand and the antisense (−) strand. One skilled in the art will appreciate that when selecting a target sequence, it is necessary to select a “unique” sequence to distinguish between unrelated or closely related target nucleic acids. As will be appreciated by those skilled in the art, the “unique” sequence is determined from the test environment. At least the sequence recognized by the detection probe (as described in more detail elsewhere herein) must be unique in the environment under test, but unique within all possible sequences. There is no need. Furthermore, while the target sequence must include a “unique” sequence for recognition by the detection probe, the priming oligonucleotide and / or promoter oligonucleotide does not necessarily recognize the “unique” sequence. In some embodiments, it may be desirable to select a target sequence that is common to a family of related organisms, eg, a sequence that is common to all HIV strains that may be present in a sample. In other cases, closely related organisms, such as pathogenic and non-pathogenic E. coli. In order to identify E. coli, a very specific target sequence, or at least a target sequence having a very specific region recognized by the detection probe will be selected. The target sequence of the present invention can be of any practical length. The target sequence is minimally used for the region that hybridizes with the priming oligonucleotide (or its complement), the region that hybridizes with the hybridization region of the promoter oligonucleotide (or its complement), and for detection. Regions, eg, regions that hybridize with detection probes, as described in more detail elsewhere herein. The region that hybridizes with the detection probe overlaps or is included in the region that hybridizes with the priming oligonucleotide (or its complement) or the hybridization region of the promoter oligonucleotide (or its complement). Also good.

上記の最小限の要件の他に、標的配列の最適な長さは、いくつかの考慮すべき事項、例えば、配列中の二次構造又は自己ハイブリッド形成領域の量、によって決まる。最適な長さの決定は、型どおりの最適化方法を用いて当業者により容易に達成される。通常、本発明の標的配列の長さは約１００ヌクレオチド長から約１５０乃至約２５０ヌクレオチド長の範囲である。その最適又は好ましい長さは、様々な条件下で異なると考えられ、こうした条件は、本明細書に記載した方法によって当業者が容易に調べることができる。「単位複製配列」という用語は、増幅工程において生成し、標的配列内に含有される配列と実質的に相補性であるか同一である核酸分子のことを言う。 In addition to the above minimum requirements, the optimal length of the target sequence depends on several considerations, such as the amount of secondary structure or self-hybridizing regions in the sequence. The determination of the optimal length is readily accomplished by those skilled in the art using routine optimization methods. Typically, the length of target sequences of the present invention ranges from about 100 nucleotides to about 150 to about 250 nucleotides in length. The optimal or preferred length will vary under various conditions, and these conditions can be readily examined by those skilled in the art by the methods described herein. The term “amplicon” refers to a nucleic acid molecule that is generated in an amplification process and that is substantially complementary or identical to a sequence contained within a target sequence.

１７．鋳型
「鋳型」とは、核酸ポリメラーゼによってコピーされることになる核酸分子である。鋳型は、このポリメラーゼに応じて一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖とすることができる。この合成されたコピーは、その鋳型、または二本鎖鋳型もしくは部分的に二本鎖の鋳型のうちの少なくとも一方の鎖に対して相補性である。ＲＮＡおよびＤＮＡはいずれも、通常、５’から３’の方向に合成され、核酸二重鎖の２つの鎖は、その２つの鎖の５’末端がその二重鎖の正反対の端部にある（その結果、必然的に３’末端もそのようになる）ように整列化される。本発明では「標的配列」は常に「鋳型」であるが、鋳型は二次的なプライマー伸長産物および増幅産物を含むこともできる。 17. Template A “template” is a nucleic acid molecule that is to be copied by a nucleic acid polymerase. The template can be single stranded, double stranded or partially double stranded depending on the polymerase. This synthesized copy is complementary to at least one strand of the template, or a double-stranded template or a partially double-stranded template. Both RNA and DNA are usually synthesized in the 5 ′ to 3 ′ direction, and the two strands of a nucleic acid duplex have the 5 ′ ends of the two strands at the opposite ends of the duplex (As a result, the 3 ′ end is necessarily so). In the present invention, the “target sequence” is always a “template”, but the template may include secondary primer extension products and amplification products.

１８．ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、鋳型ＤＮＡから相補性ＤＮＡコピーを合成する酵素である。その例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、又はバクテリオファージＴ４、Ｐｈｉ−２９、Ｍ２、もしくはＴ５由来ＤＮＡポリメラーゼがある。本発明のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、細菌もしくはバクテリオファージから単離された天然の酵素、または組み換え技術によって発現された酵素とすることができ、或いは特定の望ましい特徴（例えば、熱安定性）、又は種々の鋳型改変体からＤＮＡ鎖を認識もしくは合成する能力を有するように設計された改変型又は「進化」型とすることができる。公知の全てのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、合成を開始するために相補性プライマーを必要とする。適切な条件下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは鋳型ＲＮＡから相補性ＤＮＡコピーを合成し得ることが知られている。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下で説明する）もまた、通常、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。 18. DNA-dependent DNA polymerase "DNA-dependent DNA polymerase" is an enzyme that synthesizes a complementary DNA copy from a template DNA. Examples include E.I. E. coli derived DNA polymerase I, bacteriophage T7 DNA polymerase, or bacteriophage T4, Phi-29, M2 or T5 derived DNA polymerase. The DNA-dependent DNA polymerase of the present invention can be a natural enzyme isolated from bacteria or bacteriophage, or an enzyme expressed by recombinant techniques, or certain desirable characteristics (eg, thermal stability), Or it can be a modified or “evolved” version designed to have the ability to recognize or synthesize DNA strands from various template variants. All known DNA-dependent DNA polymerases require a complementary primer to initiate synthesis. Under appropriate conditions, DNA-dependent DNA polymerases are known to be able to synthesize complementary DNA copies from template RNA. RNA-dependent DNA polymerases (described below) also usually have DNA-dependent DNA polymerase activity.

１９．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（トランスクリプターゼ）
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」又は「トランスクリプターゼ」は、通常は二本鎖であるプロモータ配列を有する二本鎖もしくは部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から、複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。このＲＮＡ分子（「転写物」）は、プロモータのすぐ下流の特定の位置から始まって、５’から３’の方向に合成される。トランスクリプターゼの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがある。 19. DNA-dependent RNA polymerase (transcriptase)
“DNA-dependent RNA polymerase” or “transcriptase” is an enzyme that synthesizes multiple RNA copies from a double-stranded or partially double-stranded DNA molecule having a promoter sequence that is usually double-stranded. is there. This RNA molecule (“transcript”) is synthesized in the 5 ′ to 3 ′ direction, starting from a specific position just downstream of the promoter. Examples of transcriptases include E. coli. There are DNA-dependent RNA polymerases from E. coli and bacteriophages T7, T3 and SP6.

２０．ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）
「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」又は「逆転写酵素」（「ＲＴ」）は、鋳型ＲＮＡから相補性ＤＮＡコピーを合成する酵素である。公知の全ての逆転写酵素は、鋳型ＤＮＡから相補性ＤＮＡコピーを作製する能力をも有するので、これらはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでもＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼでもある。ＲＴはＲＮＡｓｅＨ活性を示すこともできる。Ｍａｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスに由来する逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）が好ましい。鋳型ＲＮＡ及び鋳型ＤＮＡの両方を用いて合成を開始するには、プライマーが必要とされる。 20. RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase)
“RNA-dependent DNA polymerase” or “reverse transcriptase” (“RT”) is an enzyme that synthesizes a complementary DNA copy from a template RNA. Since all known reverse transcriptases also have the ability to make complementary DNA copies from template DNA, they are both RNA- and DNA-dependent DNA polymerases. RT can also exhibit RNAse H activity. A reverse transcriptase (MMLV-RT) derived from Maloney murine leukemia virus is preferred. Primers are required to initiate synthesis using both template RNA and template DNA.

２１．選択的ＲＮＡｓｅ
本明細書に用いている「選択的ＲＮＡｓｅ」とは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ部分を分解するが、一本鎖ＲＮＡも二本鎖ＲＮＡも二本鎖ＤＮＡも分解しない酵素である。例示的な選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡｓｅＨである。同じもしくは類似の活性を有するＲＮＡｓｅＨ以外の酵素も、本発明で想定されている。選択的ＲＮＡｓｅはエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとすることができる。ほとんどの逆転写酵素は、そのポリメラーゼ活性に加えてＲＮＡｓｅＨ活性を有する。しかしながら、付随するポリメラーゼ活性を伴わないＲＮＡｓｅＨの他の供給源が入手可能である。分解されると、ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体からＲＮＡが分離し得る。或いは、選択的ＲＮＡｓｅは、ＲＮＡの部分が融解し、又は酵素がＲＮＡの部分を巻き戻すことを可能にするように種々の位置で単純にＲＮＡを切断することができる。本発明のＲＮＡ標的配列またはＲＮＡ産物を選択的に分解する他の酵素があり得ることは、当業者には容易に理解されよう。 21. Selective RNAse
As used herein, “selective RNAse” is an enzyme that degrades the RNA portion of an RNA: DNA duplex, but does not degrade single-stranded RNA, double-stranded RNA, or double-stranded DNA. An exemplary selective RNAse is RNAse H. Enzymes other than RNAse H having the same or similar activity are also contemplated by the present invention. The selective RNAse can be an endonuclease or an exonuclease. Most reverse transcriptases have RNAse H activity in addition to their polymerase activity. However, other sources of RNAse H without the associated polymerase activity are available. Once degraded, RNA can be separated from the RNA: DNA complex. Alternatively, selective RNAse can simply cleave RNA at various positions to allow the RNA portion to melt or the enzyme to unwind the RNA portion. One skilled in the art will readily appreciate that there may be other enzymes that selectively degrade the RNA target sequences or RNA products of the present invention.

２２．センス／アンチセンス鎖（単数または複数）
核酸合成の議論は、核酸二重鎖の２つの相補鎖を名付ける用語を採用することによって大いに単純化かつ明確になる。従来から、蛋白質又は構造ＲＮＡを生成するために用いられる配列をコードする鎖は「センス（＋）」鎖と呼ばれ、その相補体は「アンチセンス（−）」鎖と呼ばれている。多くの場合、いずれの鎖も機能することができ、その結果、一方に「センス」、他方に「アンチセンス」の名称を割り当てるのは任意なものとならざるを得ないことが現在知られている。それでも、この用語は、核酸の配列の方向性を示すのに非常に有用であり、本明細書ではその目的で用いることになる。 22. Sense / antisense strand (s)
The discussion of nucleic acid synthesis is greatly simplified and clarified by employing the term naming the two complementary strands of a nucleic acid duplex. Traditionally, the strand encoding the sequence used to produce the protein or structural RNA is called the “sense (+)” strand, and its complement is called the “antisense (−)” strand. In many cases, it is now known that either strand can function, so assigning the name “sense” to one and “antisense” to the other must be arbitrary. Yes. Nevertheless, this term is very useful to indicate the directionality of the nucleic acid sequence and will be used herein for that purpose.

２３．系の特異性
増幅系との関連での「特異性」という用語は、本明細書では、配列及びアッセイ条件によって標的配列と非標的配列とを識別する能力を表す増幅系の特徴を意味して用いている。核酸増幅に関しては、一般的に、特異性は、下記により詳細に説明する、副産物の数に対して産生される特定の単位複製配列の数の割合（即ち、シグナル対ノイズ比）を意味する。 23. System Specificity The term “specificity” in the context of an amplification system, as used herein, refers to the characteristics of an amplification system that represent the ability to distinguish between target and non-target sequences by sequence and assay conditions. Used. For nucleic acid amplification, in general, specificity refers to the ratio of the number of specific amplicons produced to the number of byproducts (ie, signal to noise ratio), described in more detail below.

２４．感度
「感度」という用語は、本明細書では、核酸増幅反応を検出又は定量することができる精度を意味して用いている。増幅反応の感度は、一般的に、その増幅系で確実に検出することができる標的核酸の最小コピー数の目安であり、例えば、利用される検出アッセイおよび増幅反応の特異性、即ち、副産物に対する特定の単位複製配列の割合によって決まる。 24. Sensitivity The term “sensitivity” is used herein to mean the accuracy with which a nucleic acid amplification reaction can be detected or quantified. The sensitivity of the amplification reaction is generally a measure of the minimum copy number of the target nucleic acid that can be reliably detected in the amplification system, eg, the specificity of the detection assay used and the amplification reaction, i.e., byproduct. Depends on the proportion of specific amplicons.

２５．増幅条件
「増幅条件」とは、本発明による核酸増幅を可能にする条件を意味する。増幅条件は、一部の実施態様では、本明細書に記載した「緊縮ハイブリッド形成条件」よりも低緊縮性とすることができる。本発明の増幅反応で用いるオリゴヌクレオチドは、増幅条件下でその対象とする標的とハイブリッドを形成するが、緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することもあれば形成しないこともある。一方、本発明の検出プローブは、緊縮ハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成する。下記の実施例のセクションでは本発明に従って標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件を示すが、本発明に従って核酸増幅を行うために許容される他の条件については用いられる具体的な増幅方法に応じて当業者が容易に確認することができよう。 25. Amplification conditions “Amplification conditions” means conditions that allow nucleic acid amplification according to the present invention. Amplification conditions can be less stringent in some embodiments than the “stringent hybridization conditions” described herein. The oligonucleotide used in the amplification reaction of the present invention hybridizes with the target of interest under amplification conditions, but may or may not hybridize under stringent hybridization conditions. On the other hand, the detection probe of the present invention forms a hybrid under stringent hybridization conditions. The Examples section below shows preferred amplification conditions for amplifying the target nucleic acid sequence according to the present invention, but other conditions permitted for performing nucleic acid amplification according to the present invention are described in the specific amplification method used. Accordingly, those skilled in the art can easily confirm this.

本発明は、高い特異性および感度でＲＮＡ又はＤＮＡ標的配列の多数のＲＮＡコピーを合成する自己触媒増幅法を提供する。本発明の重要な特徴は、増幅時の副産物の生成がごくわずかであることである。副産物の例としては、オリゴヌクレオチドダイマーおよび自己複製分子が挙げられる。標的核酸は、増幅の対象となる標的配列を含む。標的配列は、プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、及び任意選択的に結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチドもしくは改変オリゴヌクレオチド（以下により詳細に説明する））、及び／又は天然の標的核酸末端によって両端で規定される標的核酸の領域であり、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む。本発明のプロモータオリゴヌクレオチドは、そこからのＤＮＡの合成が阻止されるように改変される。このプロモータオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼの存在下のプライマー伸長を阻止するためにその３’末端に結合させたブロッキング部分を含むことが好ましい。実際には、本発明では、プロモータを含む、増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも約８０％は３’ブロッキング部分をさらに含む。別の実施態様では、プロモータを含む、増幅反応に供給されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％は、３’ブロッキング部分を含むようにさらに改変される。特定の実施態様では、プロモータ配列を含む、本発明の増幅反応に用いるいずれのオリゴヌクレオチドも３’末端ブロッキング部分をさらに含む必要がある。 The present invention provides an autocatalytic amplification method that synthesizes multiple RNA copies of an RNA or DNA target sequence with high specificity and sensitivity. An important feature of the present invention is that very little by-product is produced during amplification. Examples of by-products include oligonucleotide dimers and self-replicating molecules. The target nucleic acid contains a target sequence to be amplified. The target sequence may be end-ended by a priming oligonucleotide, a promoter oligonucleotide, and optionally a binding molecule (eg, a stop or modified oligonucleotide (described in more detail below)) and / or a natural target nucleic acid end. A defined region of a target nucleic acid that includes both sense and antisense strands. The promoter oligonucleotides of the present invention are modified to prevent synthesis of DNA therefrom. The promoter oligonucleotide preferably includes a blocking moiety attached to its 3 'end to prevent primer extension in the presence of polymerase. Indeed, in the present invention, at least about 80% of the oligonucleotides present in the amplification reaction, including the promoter, further comprise a 3 'blocking moiety. In another embodiment, at least about 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% of the oligonucleotides supplied to the amplification reaction, including a promoter, are 3 ′ Further modification to include a blocking moiety. In certain embodiments, any oligonucleotide used in the amplification reaction of the present invention that contains a promoter sequence must further include a 3 'end blocking moiety.

本発明の一実施態様は、ＲＮＡ標的配列を含む標的核酸の増幅を含む。図１Ａ及び図１Ｂを参照されたい。標的核酸は、所望のＲＮＡ標的配列に対して不確定の３’末端及び５’末端を有する。この標的核酸は、上記ＲＮＡ標的配列の３’領域に対して十分に相補性の塩基領域を有するプライミングオリゴヌクレオチドで処理することによりこれとハイブリッドを形成する。図１Ａ及び図１Ｂの工程１を参照されたい。プライミングオリゴヌクレオチドは、当業者に公知のプライマー設計法に従って、任意の所望の標的配列の適切な領域とハイブリッドを形成するように設計する。適切なプライミングオリゴヌクレオチドについては本明細書でさらに詳細に説明する。本発明のプライミングオリゴヌクレオチドには、任意選択的に、標的配列とハイブリッドを形成する領域に対して５’側に位置する非ハイブリッド形成塩基領域を含めることができるが、本発明では、プライミングオリゴヌクレオチドの５’領域には、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータ配列を含めない。さらに、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端には、プライミングオリゴヌクレオチドのプライミング機能又はプライミングオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成している鋳型ＲＮＡの切断を実質的に妨害しない限り、後でさらに十分述べるように、標的配列またはＲＮＡ増幅産物に対するプライミングオリゴヌクレオチドの結合特性（例えば、ハイブリッド形成または塩基スタッキング）を改善する１以上の改変部位を含めることができる。ヌクレオシド三リン酸並びに緩衝剤、塩及び補因子の存在下に、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端を、鋳型としてＲＮＡ標的配列を用いる伸長反応において適切なＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「逆転写酵素」））によって伸長させることにより、鋳型ＲＮＡに対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物が得られる。図１Ａ及び図１Ｂの工程２及び３を参照されたい。 One embodiment of the invention involves amplification of a target nucleic acid comprising an RNA target sequence. Please refer to FIG. 1A and FIG. 1B. The target nucleic acid has an indefinite 3 'end and 5' end relative to the desired RNA target sequence. This target nucleic acid is hybridized with this by treating with a priming oligonucleotide having a base region sufficiently complementary to the 3 'region of the RNA target sequence. See Step 1 in FIGS. 1A and 1B. The priming oligonucleotide is designed to hybridize with the appropriate region of any desired target sequence according to primer design methods known to those skilled in the art. Suitable priming oligonucleotides are described in further detail herein. The priming oligonucleotide of the present invention can optionally include a non-hybridizing base region located 5 ′ to the region that hybridizes with the target sequence. The 5 ′ region of does not include a promoter sequence recognized by RNA polymerase. In addition, the 5 ′ end of the priming oligonucleotide has a target as described more fully below, as long as it does not substantially interfere with the priming function of the priming oligonucleotide or the cleavage of the template RNA that is hybridized with the priming oligonucleotide. One or more modification sites that improve the binding properties (eg, hybridization or base stacking) of the priming oligonucleotide to the sequence or RNA amplification product can be included. In the presence of nucleoside triphosphates and buffers, salts and cofactors, the 3 ′ end of the priming oligonucleotide is used as a suitable DNA polymerase (eg, RNA-dependent DNA polymerase (“ By extension by reverse transcriptase ")), a DNA primer extension product complementary to the template RNA is obtained. See steps 2 and 3 of FIGS. 1A and 1B.

このＤＮＡプライマー伸長産物を、鋳型ＲＮＡを分解する酵素を用いて鋳型ＲＮＡから（少なくとも部分的に）分離する。図１Ａ及び図１Ｂの工程４を参照されたい。好適な酵素は、即ち、「選択的ＲＮＡｓｅ」はＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖に作用する酵素であり、このようなものとしてはＲＮＡｓｅＨ活性を含む酵素が挙げられる。一部の逆転写酵素はＲＮＡｓｅＨ活性を含み、このような酵素としてモロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）および鳥類の骨髄芽細胞症ウイルス（「ＡＭＶ」）由来のものが挙げられる。この方法によれば、上記選択的ＲＮＡｓｅは、逆転写酵素のＲＮＡｓｅＨ活性として、又は別の酵素として、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡｓｅＨもしくはＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮＡｓｅＨとして供給される。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖に存在するＲＮＡを選択的に分解する他の酵素も用いることができる。 The DNA primer extension product is (at least partially) separated from the template RNA using an enzyme that degrades the template RNA. See step 4 in FIGS. 1A and 1B. Suitable enzymes, ie, “selective RNAses” are those that act on the RNA strand of an RNA: DNA complex, such as those containing RNAse H activity. Some reverse transcriptases contain RNAse H activity, such enzymes include those derived from Moloney murine leukemia virus (“MMLV”) and avian myeloblastosis virus (“AMV”). According to this method, the selective RNAse is expressed as RNAse H activity of reverse transcriptase or as another enzyme, for example, E. coli. coli RNAse H or T. coli supplied as thermophilus RNAse H. Other enzymes that selectively degrade RNA present in RNA: DNA duplexes can also be used.

一部の特定の実施態様では、本発明の方法は、上記のように標的核酸を処理して、ＤＮＡプライマー伸長産物の長さを特定の所望の長さに限定する工程をさらに含む。このような長さの限定は、通常、所望の標的配列の５’末端に隣接するかこれの近傍にあるＲＮＡ標的核酸とハイブリッドを形成するかそれとも結合する「結合分子」を用いることにより実施する。図１Ａの工程１を参照されたい。 In some specific embodiments, the methods of the invention further comprise processing the target nucleic acid as described above to limit the length of the DNA primer extension product to a particular desired length. Such length limitation is usually accomplished by using a “binding molecule” that hybridizes to or binds to an RNA target nucleic acid that is adjacent to or near the 5 ′ end of the desired target sequence. . See Step 1 in FIG. 1A.

特定の実施態様において、結合分子は塩基領域を含む。この塩基領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ分子又はこれらの類似体とすることができる。塩基領域を含む結合分子は、本明細書中の他の箇所に記載したように、１種以上の方法で改変することができる。好適な結合分子としては、ＲＮＡに結合してその結合領域を越えるプライマー伸長を阻止する停止オリゴヌクレオチドもしくは停止蛋白質を含む結合分子、又は改変分子（例えば、消化オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成したＲＮＡ標的の部分の加水分解を誘導する「消化」オリゴヌクレオチドのような改変オリゴヌクレオチド）もしくはＲＮＡ標的を切断する配列特異的ヌクレアーゼを含む結合分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端に隣接するか、これの近傍にあるか、又はこれと重なり合う領域の標的核酸に対して十分に相補性の５’塩基領域を有することによって標的核酸とハイブリッドを形成する。特定の実施態様において、停止オリゴヌクレオチドは１以上の改変ヌクレオチドを含むように合成する。例えば、本発明の特定の停止オリゴヌクレオチドは、１以上の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含むか、又はもっぱら２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで合成される。例えば、Ｍａｊｌｅｓｓｉほか、（１９９８年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２６：ｐ．２２２４−２２２９を参照されたい。本発明の停止オリゴヌクレオチドは、通常、停止オリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとして機能することを阻止するために、その３’末端にブロッキング部分を含む。一部の実施態様では、本発明の停止オリゴヌクレオチドの５’末端は、標的配列の５’末端の少なくとも約２個のヌクレオチドと重なり、これらに対して相補性である。通常、本発明の停止オリゴヌクレオチドの５’末端は、標的配列の５’末端の少なくとも３個、４個、５個、６個、７個又は８個のヌクレオチドと重なり合い、これらに対して相補性であるが、こうなるのは標的配列の５’末端の約１０個以下のヌクレオチドとである。（本発明に用いている「末端」という用語は、オリゴヌクレオチド、核酸もしくは核酸領域の５’末端塩基もしくは３’末端塩基を含む、それぞれ、オリゴヌクレオチド、核酸または核酸領域の５’領域もしくは３’領域のことを指す。）本明細書では好適な停止オリゴヌクレオチドについて、さらに詳細に記載する。 In certain embodiments, the binding molecule comprises a base region. This base region can be DNA, RNA, DNA: RNA chimeric molecules or analogs thereof. A binding molecule comprising a base region can be modified in one or more ways, as described elsewhere herein. Suitable binding molecules include binding molecules containing stop oligonucleotides or stop proteins that bind to RNA and prevent primer extension beyond the binding region, or modified molecules (eg, RNA targets hybridized with digested oligonucleotides). Modified oligonucleotides such as “digested” oligonucleotides that induce partial hydrolysis) or binding molecules including, but not limited to, sequence specific nucleases that cleave RNA targets. The stop oligonucleotide of the present invention has a 5 ′ base region sufficiently complementary to the target nucleic acid in a region adjacent to, in the vicinity of or overlapping with the 5 ′ end of the target sequence. Forms a hybrid with the target nucleic acid. In certain embodiments, the stop oligonucleotide is synthesized to include one or more modified nucleotides. For example, certain stop oligonucleotides of the invention contain one or more 2'-O-methyl ribonucleotides or are synthesized exclusively with 2'-O-methyl ribonucleotides. For example, Majlessi et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26: p. See 2224-2229. The stop oligonucleotide of the present invention typically includes a blocking moiety at its 3 'end to prevent the stop oligonucleotide from functioning as a primer for a DNA polymerase. In some embodiments, the 5 'end of the stop oligonucleotide of the invention overlaps with and is complementary to at least about 2 nucleotides at the 5' end of the target sequence. Usually, the 5 ′ end of the stop oligonucleotide of the invention overlaps with and is complementary to at least 3, 4, 5, 6, 7 or 8 nucleotides of the 5 ′ end of the target sequence. However, this is not more than about 10 nucleotides at the 5 ′ end of the target sequence. (As used herein, the term “terminal” includes the 5 ′ terminal base or 3 ′ terminal base of an oligonucleotide, nucleic acid or nucleic acid region, respectively, 5 ′ region or 3 ′ of an oligonucleotide, nucleic acid or nucleic acid region. (This refers to the region.) Suitable stop oligonucleotides are described in more detail herein.

停止オリゴヌクレオチドが標的配列と重なり合う５’塩基領域を有する限りにおいては、停止オリゴヌクレオチドのプロモータオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を最小限に抑えるか阻止するために、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域の５’末端中に１箇所以上の塩基ミスマッチを導入することが望ましいと考えられる。何故なら、停止オリゴヌクレオチド：プロモータオリゴヌクレオチドハイブリッドが形成されると、増幅反応の速度に悪影響が及ぶと考えられるからである。一般には、重なり合う部分の領域中の１個の塩基ミスマッチで十分である筈であるが、必要とされる正確な数は、重なり合う領域の長さ及び塩基組成並びに増幅反応の条件などの要因によって決まることになる。改変プロモータオリゴヌクレオチドに上記の利点が考えられるにもかかわらず、プロモータオリゴヌクレオチドの第一の領域に変異を加えると、このプロモータオリゴヌクレオチドが増幅用の鋳型として低品質なものになる可能性があることに注意する必要がある。さらに、所与の増幅系において、停止オリゴヌクレオチド：プロモーターオリゴヌクレオチドハイブリッドを形成させると、有利なことに、プライマー伸長に利用可能な３’末端を有するプライミングオリゴヌクレオチド：プロモーターオリゴヌクレオチドハイブリッドの形成を阻止又は妨害することが完全に可能である。図５（プライマー依存性副産物の形成）を参照されたい。 As long as the stop oligonucleotide has a 5 ′ base region that overlaps with the target sequence, 5 of the first region of the promoter oligonucleotide is used to minimize or prevent hybridization of the stop oligonucleotide with the promoter oligonucleotide. 'It may be desirable to introduce one or more base mismatches in the termini. This is because the formation of a stop oligonucleotide: promoter oligonucleotide hybrid is thought to adversely affect the rate of the amplification reaction. In general, one base mismatch in the overlapping region should be sufficient, but the exact number required depends on factors such as the length and base composition of the overlapping region and the conditions of the amplification reaction. It will be. Despite the potential benefits of the modified promoter oligonucleotide, adding a mutation to the first region of the promoter oligonucleotide may result in a poor quality oligonucleotide template for amplification. It is necessary to note that. In addition, forming a stop oligonucleotide: promoter oligonucleotide hybrid in a given amplification system advantageously prevents the formation of a priming oligonucleotide: promoter oligonucleotide hybrid with a 3 ′ end available for primer extension. Or it is completely possible to disturb. See FIG. 5 (Formation of primer-dependent byproducts).

改変オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長産物の３’末端が決定されるメカニズムをもたらす。改変オリゴヌクレオチドは、改変酵素、例えばヌクレアーゼによるプライマー伸長の停止を容易にする、ＲＮＡ標的配列の５’末端の近傍に１個以上の塩基を含むモチーフをもたらすことができる。 The modified oligonucleotide provides a mechanism by which the 3 'end of the primer extension product is determined. The modified oligonucleotide can provide a motif that includes one or more bases near the 5 'end of the RNA target sequence that facilitates termination of primer extension by a modified enzyme, such as a nuclease.

或いは、改変オリゴヌクレオチドが特異的改変酵素又は化学物質に繋がれることにより、プライマー伸長の停止が可能となるとも考えられる。 Alternatively, it is considered that the primer extension can be stopped by connecting the modified oligonucleotide to a specific modifying enzyme or chemical substance.

特異的改変酵素の１つは消化オリゴヌクレオチドである。消化オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、好ましくは少なくとも約６個のデオキシリボヌクレオチドのストレッチで構成される。この消化オリゴヌクレオチドは鋳型ＲＮＡとハイブリッドを形成し、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡが、本明細書に記載したような選択的ＲＮＡｓｅ、例えば、ＲＮＡｓｅＨ活性によって消化される。 One specific modifying enzyme is a digested oligonucleotide. Digested oligonucleotides are composed of DNA, preferably a stretch of at least about 6 deoxyribonucleotides. This digested oligonucleotide hybridizes with the template RNA, and the RNA of the RNA: DNA hybrid is digested by selective RNAse, eg, RNAse H activity, as described herein.

次いで、規定された３’末端または不確定の３’末端のいずれかを有する、一本鎖ＤＮＡプライマー伸長産物または「第１の」ＤＮＡプライマー伸長産物を、ＤＮＡプライマー伸長産物の３’^〜領域に対してこれとハイブリッドを形成させるのに十分相補性の第１の領域、並びにＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ）のためのプロモータを含む第２の領域（第一の領域に対して５’側、例えば、第１の領域の直ぐ５’側又は第１の領域から間隔を開けた５’側にあり、プロモータオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼのためのプライマーとして機能することを阻止するように改変されている（例えば、プロモータオリゴヌクレオチドが、その３’末端に結合させたブロッキング部分を含む））を含むプロモータオリゴヌクレオチドを用いて処理する。図１Ａ及び図１Ｂの工程５を参照されたい。所望のハイブリッド形成「第１の領域」を特定すると、当業者であれば、型どおりの手順のみによって好適なプロモータオリゴヌクレオチドを構築することができる。プロモータ領域が所与のＲＮＡポリメラーゼによる認識に必要とされる特定のヌクレオチドを有することは、当業者なら容易に理解されよう。さらに、プロモータ配列に特定のヌクレオチド変更（挿入配列の使用を含む）を行うと、所与の酵素によるプロモータの機能化が改善されるとも考えられる。 A single-stranded DNA primer extension product or “first” DNA primer extension product having either a defined 3 ′ end or an undefined 3 ′ end is then placed in the 3′ ^- region of the DNA primer extension product. A first region sufficiently complementary to hybridize to it, as well as a second region containing a promoter for RNA polymerase (eg, T7 polymerase) (5 ′ to the first region; For example, immediately 5 ′ of the first region or 5 ′ spaced from the first region and modified to prevent the promoter oligonucleotide from functioning as a primer for the DNA polymerase. (Eg, the promoter oligonucleotide comprises a blocking moiety attached to its 3 ′ end) Used for processing. See step 5 in FIGS. 1A and 1B. Once the desired hybridization “first region” has been identified, one skilled in the art can construct suitable promoter oligonucleotides by routine procedures only. One skilled in the art will readily appreciate that the promoter region has specific nucleotides required for recognition by a given RNA polymerase. In addition, certain nucleotide changes (including the use of insert sequences) in the promoter sequence may also improve the functionalization of the promoter by a given enzyme.

挿入配列は、プロモータオリゴヌクレオチドの第1の領域と第2の領域との間に配置すると、増幅速度を増大させる働きをする。増幅速度の増大はいくつかの要因に起因すると考えられる。第一に、挿入配列は、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端とプロモータ配列との間の距離を増加させるので、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端に結合したポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列への結合を妨げる可能性が低くなり、それによって、転写が開始され得る速度が増大する。第二に、選択された挿入配列は、それ自体が、転写のための鋳型として標的配列よりも良好に機能することによって転写速度を高めることができる。第三に、ＲＮＡポリメラーゼは、挿入配列において転写を開始するので、鋳型としてＲＮＡ転写産物を用いてプライミングオリゴヌクレオチドにより合成されたプライマー伸長産物は、プライマー伸長産物の３’末端方向に挿入配列の相補体を含むことになる。プロモータオリゴヌクレオチドは、より大きな標的結合領域（すなわち、挿入配列の相補体を含むもの）を用意することによって、より速くプライマー伸長産物に結合し、それによって、追加のＲＮＡ転写産物がより速く産生されることが可能となる。 When the insertion sequence is placed between the first region and the second region of the promoter oligonucleotide, it serves to increase the amplification rate. The increase in amplification rate is thought to be due to several factors. First, the insert sequence increases the distance between the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide and the promoter sequence, so that a polymerase (eg, reverse transcriptase) bound to the 3 ′ end of the promoter oligonucleotide is Are less likely to interfere with binding to the promoter sequence, thereby increasing the rate at which transcription can be initiated. Secondly, the selected insert sequence can increase the rate of transcription by itself functioning better than the target sequence as a template for transcription. Third, since RNA polymerase initiates transcription at the insert sequence, the primer extension product synthesized by the priming oligonucleotide using the RNA transcript as a template is complementary to the insert sequence in the direction of the 3 ′ end of the primer extension product. Will include the body. Promoter oligonucleotides bind to primer extension products faster by providing a larger target binding region (ie, one that contains the complement of the inserted sequence), thereby producing additional RNA transcripts faster. It is possible to

挿入配列は、好ましくは、５〜２０ヌクレオチド長であり、分子内折り畳みおよび増幅反応混合物中に存在する他のオリゴヌクレオチドとの分子間結合を最小限に抑えるように設計する必要がある。二次構造を最小化するのを支援するプログラムは、当該分野で公知であり、このようなものとしては最隣接熱力学則を用いて、ＲＮＡおよびＤＮＡの二次構造を予測するための、ＭｉｃｈａｅｌＺｕｃｋｅｒのｍｆｏｌｄソフトウェアが挙げられる。 The insert sequence is preferably 5-20 nucleotides in length and should be designed to minimize intramolecular folding and intermolecular binding with other oligonucleotides present in the amplification reaction mixture. Programs that assist in minimizing secondary structure are known in the art, such as Michael Zucker, for predicting RNA and DNA secondary structures using nearest neighbor thermodynamic rules. Mfold software.

ＭｉｃｈａｅｌＺｕｃｋｅｒのｍｆｏｌｄソフトウェアの最新のバージョンは、ＵＲＬ中にハイパーテキスト転送プロトコル（ｈｔｔｐ）を用いた、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄにおいて、Ｗｅｂ上でアクセス可能である。現在好ましい挿入配列としては、配列番号３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列と組み合せた、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列が挙げられる。Ｉｋｅｄａほか、（１９９２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．２６４０−２６４９を参照されたい。他の有用な挿入配列は、当該分野で公知のインビトロ選択法を用いて特定することができる。 The latest version of Michael Zucker's mfold software uses the hypertext transfer protocol (http) in the URL, www. bioinfo. rpi. It is accessible on the web at edu / applications / mfold. Presently preferred insert sequences include the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in combination with the T7 RNA polymerase promoter sequence of SEQ ID NO: 3. Ikeda et al. (1992) J. Am. Biol. Chem. 267: p. See 2640-2649. Other useful insertion sequences can be identified using in vitro selection methods known in the art.

プロモータ配列中に変化を有するプロモータオリゴヌクレオチドのアッセイについては、当業者が型どおりの方法を用いて容易に行うことができる。さらに、異なるＲＮＡポリメラーゼを利用することが望ましい場合には、プロモータオリゴヌクレオチド中のプロモータ配列を異なるプロモータにより容易に置換することができる。異なるプロモータ配列の置換は、十分に、当業者の理解および能力の範囲内にある。本発明では、増幅反応混合物に供給されるプロモータオリゴヌクレオチドは、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始が阻止されるように改変され、好ましくは、その３’末端に結合させたブロッキング部分を含むことに留意されたい。改変オリゴヌクレオチド及びキャッピングオリゴヌクレオチド、さらには、本発明の方法において使用されるプローブも、任意選択的に、これらの３’末端に結合させたブロッキング部分を含む。 Assays for promoter oligonucleotides having changes in the promoter sequence can be readily performed by those skilled in the art using routine methods. Furthermore, if it is desired to utilize a different RNA polymerase, the promoter sequence in the promoter oligonucleotide can be easily replaced by a different promoter. Replacement of different promoter sequences is well within the understanding and capabilities of those skilled in the art. In the present invention, the promoter oligonucleotide supplied to the amplification reaction mixture is modified to prevent initiation of DNA synthesis from its 3 ′ end, and preferably comprises a blocking moiety attached to its 3 ′ end. Please note that. Modified and capping oligonucleotides, as well as probes used in the methods of the invention, optionally also include a blocking moiety attached to their 3 'ends.

停止オリゴヌクレオチドを用いる場合、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、ＤＮＡプライマー伸長産物の所望の３’末端と、実質的ではあるが、必ずしも正確ではない精度でハイブリッドを形成するように設計する。次いで、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域を鋳型としての役割を果たさせることにより、第１のＤＮＡプライマー伸長産物をさらに伸長させてプロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域（即ち、プロモータ配列を含む領域）に対して相補性の塩基領域を付加してこのプロモータを二本鎖にすることができる。図１Ａの工程６及び７を参照されたい。プロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼは、プロモータ配列に結合してＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡのコピーの転写を開始するが、こうしたコピーは標的配列と実質的に同一である。「実質的に同一」とは、複数のＲＮＡのコピーが、例えば、「標的配列」の境界、転写開始点、又はプライミングオリゴヌクレオチドがプライマー領域の５’側に追加のヌクレオチド（例えば、本明細書中に記載した連結された「キャップ」）を含むかどうかによって、標的配列に対して５’側もしくは３’側のいずれかのヌクレオチドを増やすことができ、又は標的配列に対して５’側もしくは３’側のいずれかのヌクレオチドを減らすことができる。標的配列がＤＮＡである場合、本明細書では、そのＲＮＡコピーの配列は、標的配列に対して「実質的に同一」であるものとして記載している。また一方、ＤＮＡ標的配列のチミジン残基の代わりにウリジン残基を有するＲＮＡ配列も、やはり「実質的に同一」な配列を有することは言うまでもない。このようにして生成したＲＮＡ転写物は、更に調節を加えることなく、上記の系において自動的に再利用させることができる。従って、この反応は、自己触媒的である。結合分子、又はプライマー伸長反応を停止させる他の手段を用いない実施態様では、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端の５’側であると考えられる第１のＤＮＡプライマー伸長産物の特定の領域とハイブリッドを形成するように設計するが、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端は不確定であるので、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、おそらく、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の実際の３’末端ではないであろう。この実施態様では、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の少なくとも３’末端の塩基がプロモータオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成しないことは一般的に言えることである。図１Ｂの工程５を参照されたい。従って、この実施態様において、第１のＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて二本鎖プロモータを形成する可能性は低いことになる。 When using a stop oligonucleotide, the first region of the promoter oligonucleotide is designed to hybridize with the desired 3 'end of the DNA primer extension product with substantial but not necessarily accurate accuracy. The second region of the promoter oligonucleotide is then extended to serve as a template, thereby further extending the first DNA primer extension product to produce the second region of the promoter oligonucleotide (ie, the region containing the promoter sequence). This promoter can be made double stranded by adding a complementary base region to. See steps 6 and 7 in FIG. 1A. An RNA polymerase that recognizes the promoter binds to the promoter sequence and initiates transcription of multiple RNA copies that are complementary to the DNA primer extension product, which copies are substantially identical to the target sequence. “Substantially identical” refers to copies of multiple RNAs, for example, a “target sequence” boundary, transcription start point, or priming oligonucleotide additional nucleotides 5 ′ to the primer region (eg, Depending on whether it contains a linked “cap”) described in the above, either 5 ′ or 3 ′ nucleotides relative to the target sequence can be increased, or 5 ′ or Any nucleotide on the 3 'side can be reduced. Where the target sequence is DNA, the sequence of the RNA copy is described herein as being “substantially identical” to the target sequence. On the other hand, it goes without saying that an RNA sequence having a uridine residue instead of a thymidine residue in the DNA target sequence also has a “substantially identical” sequence. The RNA transcript generated in this way can be automatically recycled in the above system without further regulation. This reaction is therefore autocatalytic. In embodiments that do not use a binding molecule or other means of stopping the primer extension reaction, the first region of the promoter oligonucleotide is considered to be 5 'to the 3' end of the first DNA primer extension product. Although designed to hybridize with a specific region of the first DNA primer extension product, the 3 ′ end of the first DNA primer extension product is indeterminate, so the region where the promoter oligonucleotide forms a hybrid is Probably not the actual 3 'end of the first DNA primer extension product. In this embodiment, it is generally true that at least the 3 'terminal base of the first DNA primer extension product does not hybridize with the promoter oligonucleotide. See step 5 in FIG. 1B. Thus, in this embodiment, it is unlikely that the first DNA primer extension product will be further extended to form a double stranded promoter.

本発明者らは、意外にも、鋳型核酸を伸長させることにより二本鎖プロモータを形成させることが第１のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性のＲＮＡの転写の開始を可能にするのに必要ではないことを発見した。図１Ｂの工程６を参照されたい。得られる「第１の」ＲＮＡ産物は、標的配列と実質的に同一であり、転写開始点により規定される５’末端と、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の５’末端により規定される３’末端とを有する。図１Ｂの工程７を参照されたい。図１Ｂに示したように、十分な数の第１のＲＮＡ産物が生成されて、更に調節を加えなくてもこの系において自動的に再利用される。プライミングオリゴヌクレオチドは、第１のＲＮＡ産物の３’末端とハイブリッドを形成し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、第２のＤＮＡプライマー伸長産物を形成する。停止オリゴヌクレオチド又は他の結合分子を用いることなく形成される第１のＤＮＡプライマー伸長産物とは異なり、第２のＤＮＡプライマー伸長産物は、第１のＲＮＡ産物の５’末端に対して相補性の、規定された３’末端を有する。図１Ｂの工程８乃至１０を参照されたい。第２のＤＮＡプライマー伸長産物は、鋳型ＲＮＡを選択的に分解する酵素を用いて、（少なくとも部分的に）鋳型ＲＮＡから分離させる。図１Ｂの工程１１を参照されたい。次いで、一本鎖の第２のＤＮＡプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理すると、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域が鋳型の働きをし、その結果、第２のＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の塩基領域（すなわち、プロモータ配列を含む領域）が付加され、プロモータが二本鎖になる。図１Ｂの工程１２乃至１４を参照されたい。プロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼは、プロモータ配列に結合し、第２のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性であり、かつ標的配列と実質的に同一である複数の「第２の」ＲＮＡ産物の転写を開始する。図１Ｂの工程１５を参照されたい。このようにして生成された第２のＲＮＡ転写物は、さらに調節を加えなくても、上記の系において自動的に再利用される。従って、この反応は自己触媒的である。図１Ｂの工程７乃至１５を参照されたい。 The inventors have surprisingly found that forming a double stranded promoter by extending the template nucleic acid allows initiation of transcription of RNA complementary to the first DNA primer extension product. I found it not necessary. See step 6 in FIG. 1B. The resulting “first” RNA product is substantially identical to the target sequence and is 3 ′ defined by the 5 ′ end defined by the transcription start point and the 5 ′ end of the first DNA primer extension product. With ends. See step 7 in FIG. 1B. As shown in FIG. 1B, a sufficient number of first RNA products are generated and automatically reused in this system without further adjustment. The priming oligonucleotide hybridizes with the 3 'end of the first RNA product and is extended by DNA polymerase to form a second DNA primer extension product. Unlike the first DNA primer extension product, which is formed without using a stop oligonucleotide or other binding molecule, the second DNA primer extension product is complementary to the 5 ′ end of the first RNA product. Has a defined 3 'end. See steps 8-10 of FIG. 1B. The second DNA primer extension product is separated (at least in part) from the template RNA using an enzyme that selectively degrades the template RNA. See step 11 in FIG. 1B. Then, when the single-stranded second DNA primer extension product is treated with the promoter oligonucleotide described above, the second region of the promoter oligonucleotide acts as a template, so that the second DNA primer extension product further increases. Elongation adds a base region complementary to the second region of the promoter oligonucleotide (ie, the region containing the promoter sequence), and the promoter becomes double stranded. See steps 12-14 of FIG. 1B. An RNA polymerase that recognizes the promoter binds to the promoter sequence, is complementary to the second DNA primer extension product, and transcribes a plurality of “second” RNA products that are substantially identical to the target sequence. To start. See step 15 in FIG. 1B. The second RNA transcript produced in this way is automatically reused in the above system without further regulation. This reaction is therefore autocatalytic. See steps 7-15 of FIG. 1B.

別の実施態様において、本発明は、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸から、標的配列の複数のコピーを合成する方法に関する。図１Ｃにこの実施態様を図示した。標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ、部分的一本鎖ＤＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡのいずれかとすることができる。ＤＮＡが二本鎖である場合、このＤＮＡは、増幅の前に、変性させるか、部分的に変性させる。ＤＮＡ標的核酸は、規定された３’末端を有する必要はない。一本鎖ＤＮＡ標的核酸、部分的一本鎖ＤＮＡ標的核酸、又は変性ＤＮＡ標的核酸は、上記のようなプロモータオリゴヌクレオチドで処理する。プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、所望の標的配列の３’領域における標的配列の特定の領域とハイブリッドを形成するように設計するが、標的核酸の３’末端は、標的配列の３’末端とコターミナル（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）である必要はないので、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、標的核酸配列の３’末端又はその近傍にもない可能性が高いことになる。図１Ｃの工程１を参照されたい。従って、プロモータオリゴヌクレオチドのプロモータ領域は、一本鎖のままである可能性が高いことになる。 In another embodiment, the present invention relates to a method of synthesizing multiple copies of a target sequence from a target nucleic acid comprising a DNA target sequence. This embodiment is illustrated in FIG. 1C. The target nucleic acid can be either single-stranded DNA, partially single-stranded DNA, or double-stranded DNA. If the DNA is double stranded, the DNA is denatured or partially denatured prior to amplification. The DNA target nucleic acid need not have a defined 3 'end. Single-stranded DNA target nucleic acids, partially single-stranded DNA target nucleic acids, or denatured DNA target nucleic acids are treated with a promoter oligonucleotide as described above. The first region of the promoter oligonucleotide is designed to hybridize with a specific region of the target sequence in the 3 ′ region of the desired target sequence, while the 3 ′ end of the target nucleic acid is the 3 ′ end of the target sequence. Therefore, it is highly likely that the region where the promoter oligonucleotide forms a hybrid is not at or near the 3 ′ end of the target nucleic acid sequence. See Step 1 in FIG. 1C. Therefore, the promoter region of the promoter oligonucleotide is likely to remain single stranded.

上述のように、本発明者らは、意外にも、プロモータ配列が対応するＲＮＡポリメラーゼにより認識され、この際、ＤＮＡ標的配列に対して相補性のＲＮＡの転写を開始するためには、プロモータオリゴヌクレオチド上の一本鎖プロモータ配列が鋳型核酸の伸長により二本鎖プロモータを形成する必要がないことを発見した。図１Ｃの工程２を参照されたい。得られる「第１のＲＮＡ産物」は、プロモータのための転写開始点により規定される５’末端を有するが、３’領域は、不確定のままであることになる。図１Ｃの工程３を参照されたい。次いで、こうした第１のＲＮＡ産物は、プライミングオリゴヌクレオチドで処理する。プライミングオリゴヌクレオチドは、所望の標的配列の５’領域に対して相補的な位置において、第１のＲＮＡ産物の領域とハイブリッドを形成し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されて、ＤＮＡプライマー伸長産物を形成する。図１Ｃの工程４乃至６を参照されたい。このＤＮＡプライマー伸長産物は、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端と重なる５’末端と、第一のＲＮＡ産物の５’末端と重なる３’末端とを有する。図１Ｃの工程６を参照されたい。ＤＮＡプライマー伸長産物は、上記のように、鋳型ＲＮＡを選択的に分解する酵素を用いて、その鋳型ＲＮＡから（少なくとも部分的に）分離させる。図１Ｃの工程７を参照されたい。次いで、ＤＮＡプライマー伸長産物を上記のプロモータオリゴヌクレオチドで処理すると、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域が鋳型の働きをし、その結果、ＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の塩基領域（すなわち、プロモータ配列を含む領域）が付加され、プロモータが二本鎖になる。図１Ｃの工程８乃至１０を参照されたい。プロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼは、プロモータ配列に結合し、ＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡ産物の転写を開始する。図１Ｃの工程１１を参照されたい。こうした「第２のＲＮＡ産物」の配列は、所望の標的配列に対して実質的に相補性である。このようにして生成されたＲＮＡ産物は、さらに調節を加えなくても、上記の系において自動的に再利用される。従って、この反応は自己触媒的である。図１Ｃの工程３乃至１１を参照されたい。 As mentioned above, the present inventors surprisingly recognize that the promoter sequence is recognized by the corresponding RNA polymerase, in order to initiate transcription of RNA complementary to the DNA target sequence. It has been discovered that a single stranded promoter sequence on a nucleotide need not form a double stranded promoter by extension of the template nucleic acid. See Step 2 in FIG. 1C. The resulting “first RNA product” will have a 5 ′ end defined by the transcription start point for the promoter, but the 3 ′ region will remain indeterminate. See step 3 in FIG. 1C. Such first RNA product is then treated with a priming oligonucleotide. The priming oligonucleotide hybridizes with the region of the first RNA product at a position complementary to the 5 'region of the desired target sequence and is extended by DNA polymerase to form a DNA primer extension product. See steps 4-6 of FIG. 1C. This DNA primer extension product has a 5 'end that overlaps the 5' end of the priming oligonucleotide and a 3 'end that overlaps the 5' end of the first RNA product. See step 6 in FIG. 1C. The DNA primer extension product is separated (at least in part) from the template RNA using an enzyme that selectively degrades the template RNA as described above. See step 7 in FIG. 1C. Then, when the DNA primer extension product is treated with the promoter oligonucleotide described above, the second region of the promoter oligonucleotide serves as a template, and as a result, the DNA primer extension product is further extended to generate a second promoter oligonucleotide. A complementary base region (that is, a region containing a promoter sequence) is added to this region, and the promoter becomes a double strand. See steps 8-10 of FIG. 1C. An RNA polymerase that recognizes the promoter binds to the promoter sequence and initiates transcription of a plurality of RNA products that are complementary to the DNA primer extension product. See step 11 in FIG. 1C. The sequence of such a “second RNA product” is substantially complementary to the desired target sequence. The RNA product thus generated is automatically reused in the above system without further regulation. This reaction is therefore autocatalytic. See steps 3-11 of FIG. 1C.

さらに別の実施態様において、本発明は、ＤＮＡ標的配列を含む標的核酸から、標的配列の複数のコピーを合成する方法に関する。図１Ｄにこの実施態様の一態様を示した。この実施態様における増幅の前の標的核酸は、一本鎖、部分的一本鎖、又は二本鎖のいずれかとすることができる。標的配列を含有する標的核酸の領域が二本鎖であれば、増幅の前に変性又は部分変性させてこの標的配列をプライミングオリゴヌクレオチドに接触可能にする。図１Ｄの工程１を参照されたい。変性は熱、高ｐＨ及び／又は低イオン強度によって行うことができる。（有用な化学的変性剤としては、イミダゾール、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、尿素及び／又は水酸化ナトリウムが挙げられる。）上記接触可能な標的配列は、後述のようにプライミングオリゴヌクレオチドで処理し、これを標的配列の３’末端とハイブリッド形成させる。図１Ｄの工程２を参照されたい。ヌクレオシド三リン酸並びに緩衝剤、塩及び補因子の存在下に、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端を、鋳型としてＤＮＡ標的配列を用いる伸長反応においてＤＮＡポリメラーゼによって伸長させることにより、鋳型に対して相補性の第１のＤＮＡプライマー伸長産物が得られる。図１Ｄの工程３及び４を参照されたい。この実施態様の一態様では、標的配列の５’末端に隣接して、又はこれの近傍で標的核酸とハイブリッドを形成させるか、それとも結合させることにより上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物の長さを限定する結合分子を含ませる。この結合分子は、ＤＮＡ標的配列を含有する標的核酸に適切な、本明細書に記載した結合分子のうちのいずれかとすることができるが、好ましくは停止オリゴヌクレオチドである。図１Ｄの工程２乃至４を参照されたい。停止オリゴヌクレオチドの１つの利点は、これが、第１のＤＮＡプライマー伸長産物上に規定された３’末端を創出するのに制限エンドヌクレアーゼの使用を必要としないことである。 In yet another embodiment, the invention relates to a method of synthesizing multiple copies of a target sequence from a target nucleic acid comprising a DNA target sequence. FIG. 1D shows one aspect of this embodiment. The target nucleic acid prior to amplification in this embodiment can be either single stranded, partially single stranded, or double stranded. If the region of the target nucleic acid containing the target sequence is double stranded, it is denatured or partially denatured prior to amplification to make this target sequence accessible to the priming oligonucleotide. See Step 1 in FIG. 1D. Denaturation can be performed by heat, high pH and / or low ionic strength. (Useful chemical modifiers include imidazole, dimethyl sulfoxide, formamide, urea and / or sodium hydroxide.) The accessible target sequence is treated with a priming oligonucleotide as described below, and Hybridize with the 3 'end of the target sequence. See Step 2 in FIG. 1D. Complementation to the template by extending the 3 'end of the priming oligonucleotide by DNA polymerase in an extension reaction using the DNA target sequence as a template in the presence of nucleoside triphosphates and buffers, salts and cofactors The first DNA primer extension product is obtained. See steps 3 and 4 in FIG. 1D. In one aspect of this embodiment, the length of the first DNA primer extension product is increased by hybridizing with or binding to the target nucleic acid adjacent to or near the 5 ′ end of the target sequence. Include limited binding molecules. The binding molecule can be any of the binding molecules described herein suitable for a target nucleic acid containing a DNA target sequence, but is preferably a stop oligonucleotide. See steps 2-4 in FIG. 1D. One advantage of a stop oligonucleotide is that it does not require the use of a restriction endonuclease to create a defined 3 'end on the first DNA primer extension product.

鋳型から上記第１のＤＮＡプライマー伸長産物を分離するために、本実施態様の別の態様において、標的核酸をディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理することができる。図１Ｄの工程５を参照されたい。このディスプレーサオリゴヌクレオチドはプライミング機能を有し、プライミングオリゴヌクレオチド（この実施態様では「フォワードプライミングオリゴヌクレオチド」と称する）より上流側にある標的核酸とハイブリッドを形成するように設計されている。「上流側」とは、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端がフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端より上流側にある標的核酸とハイブリッドを形成することを意味する。従って、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドは標的核酸の重複又は異なる領域とハイブリッドを形成することができる。好ましい実施態様では、ディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端は、標的核酸を基準にしてフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に隣接させるか、これから最大５乃至３５塩基隔てる（即ち、上記のディスプレーサオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチドの両者を標的核酸とハイブリッド形成させた場合、標的核酸は、このディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端塩基との間にある最大５乃至３５個の連続する非結合ヌクレオチドを有する）。このディスプレーサオリゴヌクレオチドは、一般に１０乃至５０ヌクレオチド長であり、ディスプレーサオリゴヌクレオチドのプライミング機能を実質的に妨害しない限り、標的核酸に対するディスプレーサオリゴヌクレオチドの結合特性（例えば、ハイブリッド形成または塩基スタッキング）を改善する１以上の改変部位を含むことができる。ディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドは同じ条件下で標的核酸とハイブリッドを形成するように設計する。標的核酸は、フォワードプライミングオリゴヌクレオチドが標的核酸とハイブリッドを形成する時間を十分とった後に、ディスプレーサオリゴヌクレオチドで処理することが好ましい。或いは、標的核酸をディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドで処理した後に、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及びフォワードプライミングオリゴヌクレオチドの各３’末端を伸長するのに適したポリメラーゼをこの混合物に作用させる。ＤＮＡポリメラーゼの存在下でディスプレーサオリゴヌクレオチドの３’末端を鋳型依存性に伸長させて標的核酸から第１のＤＮＡプライマー伸長産物と置換する第２のＤＮＡプライマー伸長産物を形成させることによってこれをプロモータオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に利用可能にする。図１Ｄの工程６及び７を参照されたい。別のアプローチにおいて、プロモータオリゴヌクレオチドが、例えば、ＤＮＡブリーシング（例えば、ＡＴリッチ領域）、低塩条件及び／又はＤＭＳＯ及び／又は浸透圧調節物質（例えば、ベタイン）の使用により促進されるスタンド侵入によって第１のＤＮＡプライマー伸長産物にアクセスする条件を確立することができた。この実施態様のプロモータオリゴヌクレオチドは前記のものと同じであり、同様に、プロモータオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼのためのプライミングオリゴヌクレオチドとして機能するのを妨げるように改変されている（例えば、このプロモータオリゴヌクレオチドはその３’末端にブロッキング部分を含む）。 In another aspect of this embodiment, the target nucleic acid can be treated with a displacer oligonucleotide to separate the first DNA primer extension product from the template. See step 5 in FIG. 1D. This displacer oligonucleotide has a priming function and is designed to form a hybrid with a target nucleic acid upstream of the priming oligonucleotide (referred to as “forward priming oligonucleotide” in this embodiment). “Upstream” means that the 3 ′ end of the displacer oligonucleotide hybridizes with a target nucleic acid that is upstream from the 3 ′ end of the forward priming oligonucleotide. Thus, displacer oligonucleotides and forward priming oligonucleotides can hybridize with overlapping or different regions of the target nucleic acid. In a preferred embodiment, the 3 ′ end of the displacer oligonucleotide is adjacent to the 5 ′ end of the forward priming oligonucleotide relative to the target nucleic acid, or is separated from it by up to 5 to 35 bases (ie, the displacer oligonucleotide and the priming described above). When both oligonucleotides are hybridized to the target nucleic acid, the target nucleic acid will have a maximum of 5 to 35 consecutive non-nucleotides between the 3 ′ terminal base of the displacer oligonucleotide and the 5 ′ terminal base of the priming oligonucleotide. With bound nucleotides). The displacer oligonucleotide is generally 10 to 50 nucleotides long and improves the binding properties (eg, hybridization or base stacking) of the displacer oligonucleotide to the target nucleic acid as long as it does not substantially interfere with the priming function of the displacer oligonucleotide. One or more modification sites can be included. The displacer oligonucleotide and the forward priming oligonucleotide are designed to hybridize with the target nucleic acid under the same conditions. The target nucleic acid is preferably treated with the displacer oligonucleotide after allowing sufficient time for the forward priming oligonucleotide to form a hybrid with the target nucleic acid. Alternatively, after treating the target nucleic acid with a displacer oligonucleotide and a forward priming oligonucleotide, a suitable polymerase is applied to this mixture to extend each 3 'end of the displacer oligonucleotide and the forward priming oligonucleotide. In the presence of DNA polymerase, the 3 ′ end of the displacer oligonucleotide is template-dependently extended to form a second DNA primer extension product that displaces the first DNA primer extension product from the target nucleic acid. Make available for hybridization with nucleotides. See steps 6 and 7 in FIG. 1D. In another approach, promoter oligonucleotides are facilitated by stand entry, eg, by DNA breathing (eg, AT-rich regions), low salt conditions and / or use of DMSO and / or osmotic regulators (eg, betaine). Could establish conditions for accessing the first DNA primer extension product. The promoter oligonucleotide in this embodiment is the same as described above, and has also been modified to prevent the promoter oligonucleotide from functioning as a priming oligonucleotide for DNA polymerase (eg, the promoter oligonucleotide Contains a blocking moiety at its 3 'end).

第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端を確定することができる停止オリゴヌクレオチド又は他の結合分子を用いる場合、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、プロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域を鋳型としての役割を果たさせることにより、第１のＤＮＡプライマー伸長産物をさらに伸長させてプロモータオリゴヌクレオチドの第２の領域に対して相補性の塩基領域を付加するのに十分な精度で第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端とハイブリッドを形成するように設計する。図１Ｄの工程８乃至１０を参照されたい。この伸長反応によって上記プロモータ配列を含有する領域は二本鎖になる。このプロモータを認識するＲＮＡポリメラーゼはプロモータ配列に結合して、第１のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性の複数のＲＮＡコピーの転写を開始するが、この場合、ＲＮＡコピーは、この用語について先に定義したように、標的配列と実質的に同一である。図１Ｄの工程１１及び１２を参照されたい。このようにして生成されたＲＮＡ転写物は、この実施態様の方法で自動的に再利用させることができ、従って、この反応は自己触媒的である。図１Ｄの工程９乃至１７を参照されたい。その後の増幅の繰り返しでは、プロモータオリゴヌクレオチドを含有し、ＲＮＡ転写物に対して相補性である第３のＤＮＡプライマーを形成した後、ＲＮＡ転写物を選択的に分解する酵素（例えば、ＭＭＬＶ又はＡＭＶ由来の逆転写酵素のようなＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素）を用いてこのＤＮＡプライマー伸長産物をＲＮＡ転写物から（少なくとも部分的に）分離する。図１Ｄの工程１３乃至１６を参照されたい。 When using a stop oligonucleotide or other binding molecule that can determine the 3 ′ end of the first DNA primer extension product, the first region of the promoter oligonucleotide is the second region of the promoter oligonucleotide as a template. The first DNA primer extension product to further extend the first DNA with sufficient accuracy to add a complementary base region to the second region of the promoter oligonucleotide. It is designed to form a hybrid with the 3 ′ end of the primer extension product. See steps 8-10 of FIG. 1D. By this extension reaction, the region containing the promoter sequence becomes a double strand. An RNA polymerase that recognizes this promoter binds to the promoter sequence and initiates transcription of a plurality of RNA copies that are complementary to the first DNA primer extension product, in which case the RNA copy is earlier in this term. Is substantially identical to the target sequence as defined above. See steps 11 and 12 of FIG. 1D. The RNA transcript produced in this way can be automatically recycled by the method of this embodiment, and thus the reaction is autocatalytic. See steps 9-17 of FIG. 1D. In subsequent iterations of amplification, an enzyme (eg, MMLV or AMV) that selectively degrades the RNA transcript after forming a third DNA primer that contains the promoter oligonucleotide and is complementary to the RNA transcript. This DNA primer extension product is (at least partially) separated from the RNA transcript using an RNase H activity enzyme such as reverse transcriptase derived from. See steps 13-16 of FIG. 1D.

プライマー伸長反応を停止させる結合分子又は他の手段を用いない本実施態様の態様では、プロモータオリゴヌクレオチドの第１の領域は、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の３’末端の５’側にあると考えられる第１のＤＮＡプライマー伸長産物の特定の領域とハイブリッドを形成するように設計する。第１のＤＮＡプライマー伸長産物の3’末端は不確定であるので、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、プロモータオリゴヌクレオチドがハイブリッドを形成する領域は、おそらく、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の実際の３’末端ではないであろう。この実施態様では、第１のＤＮＡプライマー伸長産物の少なくとも３’末端の塩基がプロモータオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成しないことは一般的に言えることである。従って、この実施態様において、第１のＤＮＡプライマー伸長産物がさらに伸長されて二本鎖プロモータを形成する可能性は低いことになる。上述のように、本発明者らは、意外にも、鋳型核酸を伸長させることにより二本鎖プロモータを形成させることが第１のＤＮＡプライマー伸長産物に対して相補性のＲＮＡの転写の開始を可能にするのに必要ではないことを発見した。しかしながら、その後の増幅の繰り返しでは、ＲＮＡ転写物は規定された３’末端を含むことになり、このＲＮＡ転写物に対して相補性のＤＮＡプライマー伸長産物はプロモータオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成し、伸長されてプロモータ配列を含有するプロモータオリゴヌクレオチドの領域に対して相補性の配列が付加される。 In aspects of this embodiment that do not use a binding molecule or other means to stop the primer extension reaction, the first region of the promoter oligonucleotide is 5 ′ to the 3 ′ end of the first DNA primer extension product. Designed to hybridize with a particular region of a possible first DNA primer extension product. Since the 3 ′ end of the first DNA primer extension product is indeterminate, the region where the promoter oligonucleotide is hybridized is probably the region where the promoter oligonucleotide is hybridized to that of the first DNA primer extension product. It will not be the actual 3 'end. In this embodiment, it is generally true that at least the 3 'terminal base of the first DNA primer extension product does not hybridize with the promoter oligonucleotide. Thus, in this embodiment, it is unlikely that the first DNA primer extension product will be further extended to form a double stranded promoter. As described above, the present inventors surprisingly found that forming a double-stranded promoter by extending a template nucleic acid initiates transcription of RNA complementary to the first DNA primer extension product. I discovered that it is not necessary to make it possible. However, in subsequent amplification iterations, the RNA transcript will contain a defined 3 'end, and a DNA primer extension product complementary to this RNA transcript will hybridize with the promoter oligonucleotide and extend. A sequence complementary to the region of the promoter oligonucleotide containing the promoter sequence is then added.

図２Ａ乃至図２Ｄに示したように、本発明者らは、反応混合物にエクステンダーオリゴヌクレオチドを供給することによって増幅速度を向上させることができることを発見した。（図２Ａ及び図２Ｂの各工程５、図２Ｃの工程４及び図２Ｄの工程８。）
エクステンダーオリゴヌクレオチドは、一般に、長さが１０乃至５０ヌクレオチド長であり、プロモータオリゴヌクレオチドより下流の鋳型ＤＮＡ（即ち、ＤＮＡ標的配列、又は本明細書に記載したＤＮＡプライマー伸長産物のうちのいずれか）とハイブリッドを形成する。エクステンダーオリゴヌクレオチドを含める場合、このオリゴヌクレオチドとプロモータオリゴヌクレオチドとが鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する際、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基はプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基の近傍に、又はこれに隣接して位置する。(「に隣接して」とは、両オリゴヌクレオチドが鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する際に、鋳型ＤＮＡが、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基との間に非結合塩基を有しないことを意味する。) 最も好ましくは、エクステンダーオリゴヌクレオチドは、エクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基が、鋳型ＤＮＡを基準にしてプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とヌクレオチド3個より多くの間隔をあけない（即ち、鋳型ＤＮＡは、両オリゴヌクレオチドが鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成する際に、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とエクステンダーオリゴヌクレオチドの５’末端塩基との間に位置する連続する非結合ヌクレオチドを最大で３個有する）ように、鋳型ＤＮＡとハイブリッドを形成させる。エクステンダーオリゴヌクレオチドがプライマー伸長反応においてプライミングオリゴヌクレオチドとして機能することを阻止するために、エクステンダーオリゴヌクレオチドに３’末端ブロッキング部分を含ませることが好ましい。理論にとらわれることを望まないが、エクステンダーオリゴヌクレオチドの３’末端におけるリン酸は、ＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）を、プロモータオリゴヌクレオチドのプロモータ配列からさらに遠くへ引き離すように機能することによって転写におけるＲＮＡポリメラーゼの結合および前進が妨げられるのを最小限に抑えると考えられる。エクステンダーオリゴヌクレオチドが、標的配列内の二次構造を制限することによって、転写反応をさらに促進する可能性もある。 As shown in FIGS. 2A-2D, the inventors have discovered that the amplification rate can be improved by supplying an extender oligonucleotide to the reaction mixture. (Each step 5 in FIGS. 2A and 2B, step 4 in FIG. 2C, and step 8 in FIG. 2D.)
Extender oligonucleotides are generally 10 to 50 nucleotides in length and are template DNA downstream of the promoter oligonucleotide (ie, either the DNA target sequence or the DNA primer extension product described herein). And form a hybrid. When an extender oligonucleotide is included, when the oligonucleotide and the promoter oligonucleotide form a hybrid with the template DNA, the 5 ′ terminal base of the extender oligonucleotide is near or adjacent to the 3 ′ terminal base of the promoter oligonucleotide. Is located. ("Adjacent to" means that when both oligonucleotides form a hybrid with the template DNA, the template DNA is not between the 3 'terminal base of the promoter oligonucleotide and the 5' terminal base of the extender oligonucleotide. Most preferably, the extender oligonucleotide has a 5 ′ terminal base of the extender oligonucleotide that is greater than the 3 ′ terminal base of the promoter oligonucleotide and 3 nucleotides relative to the template DNA. (Ie, the template DNA is a continuous sequence located between the 3 ′ terminal base of the promoter oligonucleotide and the 5 ′ terminal base of the extender oligonucleotide when both oligonucleotides hybridize with the template DNA. Have a maximum of 3 unbound nucleotides to do) Thus, a hybrid is formed with the template DNA. In order to prevent the extender oligonucleotide from functioning as a priming oligonucleotide in the primer extension reaction, it is preferred to include a 3 ′ end blocking moiety in the extender oligonucleotide. Without wishing to be bound by theory, a phosphate at the 3 ′ end of the extender oligonucleotide functions to pull the DNA-dependent DNA polymerase (eg, reverse transcriptase) further away from the promoter sequence of the promoter oligonucleotide. This is believed to minimize hindering RNA polymerase binding and advancement in transcription. Extender oligonucleotides may further facilitate the transcription reaction by limiting secondary structure within the target sequence.

一態様において、本発明は、核酸増幅反応において副産物の形成を最小限に抑えることに関する。本明細書では、副産物の１種を「オリゴヌクレオチドダイマー」と称する。この副産物は、プライミングオリゴヌクレオチドが増幅反応物において別の核酸（例えば、プロモーターオリゴヌクレオチド）と非特異的に塩基対形成する場合に生じる。プライミングオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得るので、二本鎖型のプロモータオリゴヌクレオチドが生じる可能性があり、これが非特異的な増幅可能副産物に転写されることがある。プライミングオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドダイマーの形成に関与することを阻止するための１つの選択肢は、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に短い相補性ヌクレオチド「キャップ」を付加することである。図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドと反応物中の他の核酸（例えば、プロモータオリゴヌクレオチド）との間の非特異的ハイブリッド形成を抑えることによって「オリゴヌクレオチドダイマー」副産物の生成をなくすか、もしくはキャップの使用を伴わないこと以外は同一の条件下で行った増幅反応と比較して実質的に抑えると考えられる。本明細書に用いているキャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域に相補性の塩基領域を含み、これは、増幅反応混合物中に導入する前に、プライミングオリゴヌクレオチドと予めハイブリッド形成させておくことが好ましい。適切なキャップの長さは、塩基含量、緊縮条件などによって異なるが、通常、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端における最大３個、６個、９個、１２個、１５個、１８個または２０個の連続するか又は連続しないヌクレオチドとハイブリッドを形成することになる。適切なキャップは５乃至１０塩基長の範囲であることが好ましい。相補性キャップ領域の長さは、いくつかの変動要素（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端と共に形成される二本鎖ハイブリッドの融解温度）によって決まる。一般的に、効率的なキャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域と、増幅反応物中に存在する他のオリゴヌクレオチドとのどの非特異的反応よりも強く、特異的にハイブリッドを形成するが、プライミングオリゴヌクレオチドと所望のテンプレートとの特異的ハイブリッド形成を優先して直ちに置き換えられることになる。例示的なキャップは、キャップの５’末端塩基がプライミングオリゴヌクレオチドの３’末端塩基とハイブリッドを形成するように、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域とハイブリッドを形成する５乃至７塩基の長さのオリゴヌクレオチドを含むか、これから本質的に成るか、又はこれから成る。通常、キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域の８個、９個または１０個以下のヌクレオチドとハイブリッドを形成する。 In one aspect, the present invention relates to minimizing the formation of byproducts in nucleic acid amplification reactions. Herein, one type of by-product is referred to as an “oligonucleotide dimer”. This by-product occurs when the priming oligonucleotide non-specifically base pairs with another nucleic acid (eg, a promoter oligonucleotide) in the amplification reaction. Since the priming oligonucleotide can be extended by DNA polymerase, a double-stranded promoter oligonucleotide can be generated, which can be transcribed into a non-specific amplifiable byproduct. One option to prevent the priming oligonucleotide from participating in the formation of oligonucleotide dimers is to add a short complementary nucleotide “cap” to the 3 ′ end of the priming oligonucleotide. See FIGS. 6A and 6B. The cap eliminates the formation of “oligonucleotide dimer” byproducts by suppressing non-specific hybridization between the priming oligonucleotide and other nucleic acids in the reaction (eg, promoter oligonucleotide), or the use of a cap It is considered that it is substantially suppressed as compared with the amplification reaction carried out under the same conditions except that the reaction is not accompanied. As used herein, the cap includes a complementary base region at the 3 ′ end region of the priming oligonucleotide that is prehybridized with the priming oligonucleotide prior to introduction into the amplification reaction mixture. It is preferable to keep it. The appropriate cap length depends on the base content, stringency conditions, etc., but is usually up to 3, 6, 9, 12, 15, 18, or 20 at the 3 ′ end of the priming oligonucleotide. It will form hybrids with contiguous or non-contiguous nucleotides. Suitable caps preferably range from 5 to 10 bases in length. The length of the complementary cap region depends on several variables (eg, the melting temperature of the double-stranded hybrid formed with the 3 'end of the priming oligonucleotide). In general, an efficient cap is stronger than any non-specific reaction of the 3 ′ end region of the priming oligonucleotide with any other oligonucleotide present in the amplification reaction, and specifically hybridizes. Will be immediately replaced in favor of specific hybridization of the priming oligonucleotide and the desired template. Exemplary caps are 5-7 bases in length that hybridize with the 3 ′ end region of the priming oligonucleotide such that the 5 ′ end base of the cap hybridizes with the 3 ′ end base of the priming oligonucleotide. Consisting of, consisting essentially of, or consisting of: Usually, the cap hybridizes with no more than 8, 9, or 10 nucleotides in the 3 'end region of the priming oligonucleotide.

キャップは、キャッピングオリゴヌクレオチド、即ち、プライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に直接又はリンカーを介して結合させた塩基領域の形をとることができる。図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。キャッピングオリゴヌクレオチドは、プライミングオリゴヌクレオチドとは別個のオリゴヌクレオチドとして合成され、通常は、図６Ａに図示したように、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を阻止するためにその３’末端にブロッキング部分を含む。或いは、キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端の領域に相補性の塩基領域を含み、この塩基領域を、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のヌクレオチドを含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成る連結領域を介してプライミングオリゴヌクレオチドの５’末端に接続させる。図６Ｂを参照されたい。通常、この連結領域のヌクレオチドは、無塩基ヌクレオチドである。「無塩基ヌクレオチド」とは、リン酸基および糖基を含むが塩基の基を含まないヌクレオチドを意味する。５’末端に結合するキャップを有するプライミングオリゴヌクレオチドを構築することによってプライミング部分およびキャップの両方を含む単一のオリゴヌクレオチドのみの合成が必要となることでオリゴヌクレオチド合成が簡素化される。 The cap can take the form of a capping oligonucleotide, ie, a base region attached to the 5 'end of the priming oligonucleotide, either directly or through a linker. See FIGS. 6A and 6B. The capping oligonucleotide is synthesized as an oligonucleotide separate from the priming oligonucleotide, and usually includes a blocking moiety at its 3 'end to prevent primer extension by DNA polymerase, as illustrated in FIG. 6A. Alternatively, the cap includes a complementary base region in the 3 ′ end region of the priming oligonucleotide, and this base region is 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 It is connected to the 5 'end of the priming oligonucleotide via a linking region comprising, consisting essentially of, or consisting of. See FIG. 6B. Usually, the nucleotide of this linking region is an abasic nucleotide. “Abasic nucleotide” means a nucleotide containing a phosphate group and a sugar group but no base group. Constructing a priming oligonucleotide with a cap attached to the 5 'end simplifies oligonucleotide synthesis by requiring the synthesis of only a single oligonucleotide containing both the priming moiety and the cap.

本明細書に記載したキャップは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下の伸長反応に関与することができる遊離３’−ヒドロキシルを有する、ディスプレーサ及びエクステンダーを含む、反応混合物に供給する他のオリゴヌクレオチドと共に用いることもできる。キャップの重要性は、３’−ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチドの数と共に増す。 The caps described herein can also be used with other oligonucleotides that feed the reaction mixture, including displacers and extenders, that have a free 3′-hydroxyl that can participate in the extension reaction in the presence of DNA polymerase. it can. The importance of the cap increases with the number of oligonucleotides having a 3'-hydroxyl.

上述の実施態様のいずれかにおいて、標的配列の所望の領域が一旦特定されると、この領域を分析して、選択的ＲＮａｓｅ分解がＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からのＲＮＡの部分の切断又は除去を最適に生じる箇所を明らかにすることができる。分析を行うことによって、ＡＭＶ逆転写酵素もしくはＭＭＬＶ逆転写酵素に存在するＲＮａｓｅＨ活性もしくは外から添加されたＲＮａｓｅ活性を有する選択的酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅＨもしくは他の供給源由来のＲＮａｓｅ活性を有する選択的酵素）又はこれらの組合せによる標的配列のＲＮａｓｅ分解の効果を明らかにすることができる。このような分析の後に、プライミングオリゴヌクレオチドが反応混合物中に存在する選択的ＲＮａｓｅによって実質的に分解されないＲＮＡの部分とハイブリッドを形成するようにプライミングオリゴヌクレオチドを選択することができる。何故なら、プライミングオリゴヌクレオチドの結合部位で実質的な分解が起こると、ＤＮＡ合成の開始が阻害され、プライマーの最適な伸長が妨げられるからである。言い換えると、プライミングオリゴヌクレオチドは、通常、ＲＮＡ標的核酸の領域もしくはＤＮＡ標的核酸の相補体とハイブリッドを形成するように選択し、ＲＮＡが選択的ＲＮａｓｅ分解を受けた場合に、プライマー伸長産物の形成を妨げる分解が実質的に生じないように配置する。 In any of the above embodiments, once the desired region of the target sequence is identified, this region is analyzed to allow selective RNase degradation to cleave or remove portions of the RNA from the RNA: DNA duplex. It is possible to clarify the optimal location. By performing the analysis, a selective enzyme having an RNase H activity present in AMV reverse transcriptase or MMLV reverse transcriptase or an externally added RNase activity (for example, RNase from E. coli RNase H or other sources) The effect of RNase degradation of the target sequence by a selective enzyme having activity) or a combination thereof can be revealed. Following such analysis, the priming oligonucleotide can be selected such that it hybridizes with a portion of RNA that is not substantially degraded by the selective RNase present in the reaction mixture. This is because substantial degradation at the binding site of the priming oligonucleotide prevents initiation of DNA synthesis and prevents optimal primer extension. In other words, the priming oligonucleotide is usually selected to hybridize with a region of the RNA target nucleic acid or with the complement of the DNA target nucleic acid, and when the RNA has undergone selective RNase degradation, it forms a primer extension product. Arrange so as to prevent substantial disruption.

逆の言い方をすれば、プロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部位は、ＲＮＡ鎖の十分な分解が生じることによりプロモータオリゴヌクレオチドのＤＮＡ鎖との効率的なハイブリッド形成が可能となるように選択することができる。通常、選択的ＲＮａｓｅ分解によってＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡの一部分のみが除去され、従って、ＲＮＡ鎖のいくつかの部分は二重鎖中に残ることになる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖に対する選択的ＲＮａｓｅ分解の結果、ハイブリッドからＲＮＡの小片群が分離する。ＲＮＡが選択的に分解される位置は、標準的ハイブリッド形成分析によって決定することができる。従って、選択的ＲＮａｓｅ分解の後にＤＮＡとより効率的に結合する（即ち、ＲＮＡフラグメントが選択的に除去されている領域に結合する）プロモータオリゴヌクレオチドを選択することができる。 In other words, the promoter oligonucleotide hybridization site can be selected to allow efficient hybridization with the DNA strand of the promoter oligonucleotide by sufficient degradation of the RNA strand. . Usually, selective RNase degradation removes only a portion of the RNA from the RNA: DNA duplex, and thus some portion of the RNA strand remains in the duplex. As a result of selective RNase degradation on the RNA strand of the RNA: DNA hybrid, small pieces of RNA are separated from the hybrid. The location where RNA is selectively degraded can be determined by standard hybridization analysis. Thus, promoter oligonucleotides can be selected that bind more efficiently to DNA after selective RNase degradation (ie, bind to regions where RNA fragments have been selectively removed).

図１Ａ〜図１Ｄおよび図２Ａ〜図２Ｄは、選択的ＲＮａｓｅ分解後に残り得るＲＮＡ部分を示していない。しかしながら、図１Ａ〜図１Ｄおよび図２Ａ〜図２ＤがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からのＲＮＡの完全な除去を示しているとしても、特定の条件下では、実際には部分的な除去しか起こらないことは言うまでもない。実際、図１Ａ〜図１Ｄおよび図２Ａ〜図２Ｄに図示したような増幅は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖の実質的部分が分解されずに残り、従ってプロモータオリゴヌクレオチドおよび／または任意選択的にエクステンダーオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成が妨げられる場合に、阻害される可能性がある。しかしながら、当業者は、本出願及びＫａｃｉａｎほかの米国特許第５，３３９，４９１号に開示された原則及び方法に基づき、本発明の教示に従って、型どおりの修正を行うことによってＲＮＡの増幅のための効果的かつ効率的な手順を得ることができる。 Figures 1A-1D and 2A-2D do not show the portion of RNA that can remain after selective RNase degradation. However, even though FIGS. 1A-1D and FIGS. 2A-2D show complete removal of RNA from RNA: DNA duplexes, only partial removal actually occurs under certain conditions. Needless to say. In fact, amplification as illustrated in FIGS. 1A-1D and 2A-2D leaves a substantial portion of the RNA strand of the RNA: DNA hybrid undegraded, and thus, promoter oligonucleotides and / or optionally It may be inhibited if hybridization of the extender oligonucleotide is prevented. However, those skilled in the art will be able to amplify RNA by making routine modifications in accordance with the teachings of the present invention, based on the principles and methods disclosed in this application and in U.S. Pat. No. 5,339,491 to Kacian et al. An effective and efficient procedure can be obtained.

要約すると、本発明は、反応条件（例えば、温度、イオン強度およびｐＨ）の調節を繰り返すことなく標的核酸から標的配列の複数のコピーを自己触媒的に合成するための方法を提供する。この方法は、反応混合物中に以下を混合する工程を含む：ＲＮＡ標的配列、一本鎖もしくは部分的一本鎖ＤＮＡ標的配列、又は少なくとも部分的に一本鎖にされている二本鎖ＤＮＡ標的配列のいずれかを含む標的核酸；プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、並びに任意選択的に、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド及び／又は結合分子もしくはプライマー伸長反応を停止させるための他の手段（全て上述の通りである）；逆転写酵素又はＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素活性（例えば、ＲＮａｓｅＨ活性）；ならびにプロモータオリゴヌクレオチド中のプロモータ配列を認識するＲＮＡポリメラーゼ。この反応混合物は、核酸増幅に必要な構成成分（例えば、ヌクレオチド三リン酸）、緩衝液、塩および安定化剤をも含む。反応混合物のこれらの成分は、段階的に混合しても、一度に混合してもよい。この反応混合物を、オリゴヌクレオチド：標的核酸が形成される条件下でインキュベートすると、ＤＮＡプライミングおよび核酸合成を、標的配列もしくはその相補体の複数のコピーを生成させるのに十分な時間生じさせることができる。この反応は、反応構成成分（例えば、酵素）の安定性を維持するのに適切な条件下で、増幅反応過程で反応条件の修正もしくは調節することを必要とすることなく行うことが有利である。従って、一部の実施態様の反応は、実質的に等温であり、実質的に一定のイオン強度およびｐＨを含む条件下で行うことができる。 In summary, the present invention provides a method for autocatalytically synthesizing multiple copies of a target sequence from a target nucleic acid without repeated adjustment of reaction conditions (eg, temperature, ionic strength and pH). The method includes mixing the following into the reaction mixture: an RNA target sequence, a single-stranded or partially single-stranded DNA target sequence, or a double-stranded DNA target that is at least partially single-stranded. Target nucleic acids comprising any of the sequences; priming oligonucleotides, promoter oligonucleotides, and, optionally, displacer oligonucleotides, extender oligonucleotides and / or other means for terminating the binding molecule or primer extension reaction (all above Reverse transcriptase or RNA-dependent DNA polymerase and DNA-dependent DNA polymerase; RNA: enzyme activity that selectively degrades RNA strands of DNA complexes (eg, RNase H activity); and promoter oligonucleotides Promoter sequence in Identify the RNA polymerase. The reaction mixture also includes components necessary for nucleic acid amplification (eg, nucleotide triphosphates), buffers, salts and stabilizers. These components of the reaction mixture may be mixed stepwise or mixed at once. When this reaction mixture is incubated under conditions where oligonucleotide: target nucleic acid is formed, DNA priming and nucleic acid synthesis can occur for a time sufficient to produce multiple copies of the target sequence or its complement. . This reaction is advantageously performed under conditions suitable to maintain the stability of the reaction components (eg, enzymes), without the need to modify or adjust the reaction conditions during the amplification reaction. . Thus, some embodiments of the reaction can be conducted under conditions that are substantially isothermal and include a substantially constant ionic strength and pH.

従って、本発明の増幅方法では、プライミングオリゴヌクレオチドの伸長時に生成されるＲＮＡ：ＤＮＡ複合体を分離するための変性工程を繰り返す必要がない。変性工程は、反応混合物の温度を実質的に（一般に室温から約８０℃と約１０５℃との間の温度まで）上げること、そのイオン強度を（通常１０分の１以下に）下げること、又はｐＨを変えること（通常ｐＨ１０以上に上げること）によるような、反応条件の調節を必要とすることになる。反応条件のこのような調節は、酵素活性に有害な影響をもたらす結果、さらに酵素の添加を必要とし、また、更なる核酸合成のために反応混合物を適切な条件に戻すための更なる調節をも必要とする場合が多い。標的核酸が二本鎖ＤＮＡである実施態様では、最初の変性工程を必要とする場合が多い。変性は、上述のように、反応混合物の残りの構成成分を添加する前に、温度、イオン強度、および／またはｐＨを変えることによって実施することができる。一旦、残りの構成成分を添加すると、反応混合物を更に調節する必要はない。 Therefore, in the amplification method of the present invention, it is not necessary to repeat the denaturation step for separating the RNA: DNA complex produced when the priming oligonucleotide is extended. The denaturation step raises the temperature of the reaction mixture substantially (generally from room temperature to a temperature between about 80 ° C. and about 105 ° C.), lowers its ionic strength (usually less than 1/10), or It will be necessary to adjust the reaction conditions, such as by changing the pH (usually raising the pH above 10). Such adjustment of reaction conditions has a detrimental effect on enzyme activity, necessitates the addition of enzymes, and further adjustments to return the reaction mixture to the appropriate conditions for further nucleic acid synthesis. Is often required. In embodiments where the target nucleic acid is double stranded DNA, an initial denaturation step is often required. Denaturation can be performed as described above by changing the temperature, ionic strength, and / or pH before adding the remaining components of the reaction mixture. Once the remaining components are added, there is no need to further adjust the reaction mixture.

本発明の方法は、増幅反応における副産物形成を低減させるか、減少させるか、又は実質的に排除するように設計されている。例えば、副産物の低減、減少又は実質的な排除は、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を阻止するように改変されたプロモータオリゴヌクレオチドの利用を介して、通常は、そのプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端にブロッキング部分を含めることによって行う。別の実施態様では、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端にある領域とハイブリッドを形成するキャップを用いることによってオリゴヌクレオチドダイマー形成を阻止することにより副産物形成を低減させるか、減少させるか、又は実質的に排除する。本発明では、プロモータを含む増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドのうちのほとんど（例えば、少なくとも約９０％）は、プライマー伸長を阻止するために３’ブロッキング部分をさらに含む。特定の実施態様において、プロモータを含む増幅反応において使用される任意のオリゴヌクレオチド（プロモータオリゴヌクレオチドだけではない）は、３’ブロッキング部分をさらに含む。特定の好ましい実施態様では、増幅反応のために必要な、（使用される場合、ディスプレーサオリゴヌクレオチドを含む）プライミングオリゴヌクレオチド以外のほとんど（例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、又は全て）のオリゴヌクレオチドは、３’ブロッキング部分を含む。従って、特定の実施態様では、増幅反応における（全てではないにしても）ほとんどのＤＮＡポリメラーゼ活性は、プライミングオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡプライマー伸長産物の形成に限定される。 The methods of the invention are designed to reduce, reduce or substantially eliminate by-product formation in amplification reactions. For example, the reduction, reduction or substantial elimination of by-products is usually achieved through the use of a promoter oligonucleotide that has been modified to prevent primer extension by DNA polymerase, usually at the 3 'end of the promoter oligonucleotide. By including. In another embodiment, byproduct formation is reduced or substantially reduced by preventing oligonucleotide dimer formation by using a cap that hybridizes with the region at the 3 ′ end of the priming oligonucleotide. Exclude. In the present invention, most (eg, at least about 90%) of the oligonucleotides present in an amplification reaction involving a promoter further include a 3 'blocking moiety to prevent primer extension. In certain embodiments, any oligonucleotide (not just the promoter oligonucleotide) used in an amplification reaction involving a promoter further comprises a 3 'blocking moiety. In certain preferred embodiments, most (eg, at least about 80%, 90%, 95%, 96%) other than the priming oligonucleotide (including displacer oligonucleotide, if used) required for the amplification reaction. 97%, 98% or 99%, or all) oligonucleotides contain a 3 ′ blocking moiety. Thus, in certain embodiments, most (if not all) of the DNA polymerase activity in the amplification reaction is limited to the formation of DNA primer extension products including priming oligonucleotides.

本発明の方法において使用されるプロモータオリゴヌクレオチドに組込むのに適切なプロモータ又はプロモータ配列は、核酸配列（天然に存在するか、合成により生成されるか、または制限酵素消化産物であるかのいずれか）であり、この核酸配列は、その配列を認識してこれに結合し、かつ転写プロセスを開始してＲＮＡ転写物が生成されるようにするＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される。代表的で公知の有用なプロモータとしては、特定のバクテリオファージポリメラーゼにより認識されるプロモータ（例えば、バクテリオファージＴ３、ＴＪ及びＳＰ６由来のプロモータ）並びにＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモータが挙げられる。その配列は、安定性の付加、または分解プロセスに対する感受性、又は転写効率の増大を付与することができるＲＮＡポリメラーゼの実際の認識部位を越えて伸長するヌクレオチド塩基を、任意選択的に含むことができる。開始配列を認識することができる、周知の利用可能なポリメラーゼが存在するプロモータ配列が、使用するのに特に適切である。 Suitable promoters or promoter sequences for incorporation into the promoter oligonucleotides used in the methods of the invention are either nucleic acid sequences, either naturally occurring, synthetically produced, or restriction enzyme digestion products. The nucleic acid sequence is specifically recognized by RNA polymerase that recognizes and binds to the sequence and initiates the transcription process to produce an RNA transcript. Representative and known useful promoters include promoters recognized by certain bacteriophage polymerases (eg, promoters from bacteriophage T3, TJ and SP6) and E. coli. and a promoter derived from E. coli. The sequence can optionally include nucleotide bases that extend beyond the actual recognition site of RNA polymerase, which can confer added stability, or sensitivity to degradation processes, or increased transcription efficiency. . Promoter sequences in which there are well-known available polymerases that can recognize the starting sequence are particularly suitable for use.

好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、逆転写酵素が挙げられる。特に好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素が挙げられる。ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素などの、本発明の方法において使用するのに好適な逆転写酵素は、ＲＮＡｓｅＨ活性を有する。実際、本発明の特定の実施態様では、上記逆転写酵素によって増幅反応における唯一の選択的ＲＮＡｓｅ活性が得られ、別の選択的ＲＮＡｓｅを添加しない。しかしながら、状況によっては、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡｓｅＨなどの選択的ＲＮＡｓｅを外から添加することは有用なこともある。外からの選択的ＲＮＡｓｅの添加は、特定の条件下では必要ではないが、例えば、ＡＭＶ逆転写酵素中に存在するＲＮＡｓｅＨ活性は、反応混合物中に存在する他の成分によって阻害または不活化されることがある。そのような状況では、外からの選択的ＲＮＡｓｅの添加は望ましいと考えられる。例えば、比較的大量の異種ＤＮＡが反応混合物中に存在する場合、ＡＭＶ逆転写酵素の天然のＲＮＡｓｅＨ活性が、幾分阻害されることがあり、従って、それに応じて生成される標的配列のコピー数は減少することがある。標的核酸が、存在する核酸のうちのほんの少量を構成する（例えば、サンプルが、かなりの量の異種ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む）条件下では、外からの選択的ＲＮＡｓｅを添加することは特に有用である。例えば、Ｋａｃｉａｎほか、米国特許第５，３９９，４９１号を参照されたい。なお、この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている(実施例8参照)。 Suitable DNA polymerases include reverse transcriptase. Particularly suitable DNA polymerases include AMV reverse transcriptase and MMLV reverse transcriptase. Suitable reverse transcriptases for use in the methods of the invention, such as AMV reverse transcriptase and MMLV reverse transcriptase, have RNAse H activity. In fact, in certain embodiments of the invention, the reverse transcriptase provides the only selective RNAse activity in the amplification reaction and does not add another selective RNAse. However, in some situations, E.I. It may be useful to add a selective RNAse such as E. coli RNAse H from the outside. The addition of exogenous selective RNAse is not necessary under certain conditions, but for example, RNAse H activity present in AMV reverse transcriptase is inhibited or inactivated by other components present in the reaction mixture. Sometimes. In such situations, the addition of external selective RNAse may be desirable. For example, if a relatively large amount of heterologous DNA is present in the reaction mixture, the natural RNAse H activity of AMV reverse transcriptase may be somewhat inhibited and thus a corresponding copy of the target sequence produced. The number may decrease. In particular, under conditions where the target nucleic acid constitutes only a small amount of the nucleic acid present (eg, the sample contains a significant amount of heterologous DNA and / or RNA), it is particularly useful to add exogenous selective RNAse. Useful. See, for example, Kacian et al., US Pat. No. 5,399,491. The contents of this patent are incorporated herein by reference (see Example 8).

上記の方法により生成されるＲＮＡ増幅産物は、上記の機構によって標的配列に関連する別の増幅産物を生成するための鋳型としての機能を果たすことができる。この機構は、自己触媒性であり、本発明の方法による増殖は、反応条件（例えば、温度、ｐＨ、イオン強度など）を繰り返し修正もしくは変更することを必要とせずに、行われる。こうした方法は、高価な熱サイクリング装置を必要とせず、増幅反応過程で酵素または他の試薬を数回添加する必要もない。 The RNA amplification product generated by the above method can serve as a template for generating another amplification product related to the target sequence by the mechanism described above. This mechanism is autocatalytic, and growth by the method of the present invention is performed without the need to repeatedly modify or change reaction conditions (eg, temperature, pH, ionic strength, etc.). Such methods do not require expensive thermal cycling equipment and do not require the addition of enzymes or other reagents several times during the amplification reaction.

本発明の方法は、臨床、環境、法医学および同様の分野のサンプル中の核酸標的配列を検出及び／又は定量するためのアッセイにおいて、或いは種々の用途のために特定の標的配列から多数のＲＮＡ増幅産物を生成するために、有用である。例えば、本発明は、臨床サンプル（例えば、血液、尿、糞便、唾液、精液、もしくは髄液）、食物、水、実験室サンプル及び／又は産業サンプルを、特定の核酸の有無についてスクリーニングするのに有用である。本発明は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物の有無を検出するために使用することができる。本発明は、遺伝子スクリーニングのためのヒト、動物もしくは植物の核酸を検出するのに、又は臨床調査、考古学的研究もしくは社会学的研究においても有用である。 The methods of the present invention can be used to amplify multiple RNAs from specific target sequences in assays to detect and / or quantify nucleic acid target sequences in clinical, environmental, forensic and similar samples. Useful for producing products. For example, the present invention can be used to screen clinical samples (eg, blood, urine, feces, saliva, semen, or cerebrospinal fluid), food, water, laboratory samples, and / or industrial samples for the presence or absence of specific nucleic acids. Useful. The present invention can be used, for example, to detect the presence of viruses, bacteria, fungi, or parasites. The present invention is also useful for detecting human, animal or plant nucleic acids for genetic screening, or in clinical research, archaeological research or sociological research.

代表的アッセイでは、増幅対象の標的核酸を含むサンプルを、緩衝剤、塩、マグネシウム、三リン酸、オリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、必要に応じてディスプレーサオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド及び／又は結合分子（例えば、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチド及び／又はキャッピングオリゴヌクレオチド）、並びに他の試薬を含む濃縮緩衝液と混合する。この反応物は、任意選択的に、ある温度（例えば、６０℃乃至１００℃）で標的核酸の全ての二次構造を変性させ、又は二本鎖ＤＮＡ標的核酸を変性させるのに充分な時間、インキュベートすることができる。冷却した後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、そして望ましい場合には別個の選択的ＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅＨ）を添加し、この反応物を、上記の試薬および他の反応条件に応じて、特定の時間（例えば、約１０分間乃至約１２０分間）、最適温度（例えば、約２０℃乃至約５５℃以上）でインキュベートする。ディスプレーサオリゴヌクレオチドを用いる場合には、これを上記酵素と共に供給して、プライミングオリゴヌクレオチドが、増幅を開始する前に標的核酸とハイブリッドを形成する十分な時間をもたらすことができる。 In a typical assay, a sample containing the target nucleic acid to be amplified is transferred to a buffer, salt, magnesium, triphosphate, oligonucleotide (eg, priming oligonucleotide, promoter oligonucleotide, displacer oligonucleotide, extender oligonucleotide as required). And / or mixed with a concentration buffer containing binding molecules (eg, stop or digest oligonucleotides and / or capping oligonucleotides), and other reagents. , 60 ° C. to 100 ° C.) for a sufficient time to denature all secondary structures of the target nucleic acid or to denature the double-stranded DNA target nucleic acid. RNA polymerase, and hope In some cases, a separate selective RNAse (eg, RNAse H) is added and the reaction is allowed to run for a specific time (eg, about 10 minutes to about 120 minutes), depending on the reagents and other reaction conditions described above. Incubate at an optimal temperature (eg, about 20 ° C. to about 55 ° C. or more) If a displacer oligonucleotide is used, it can be supplied with the enzyme so that the priming oligonucleotide can interact with the target nucleic acid before starting amplification. Sufficient time to form a hybrid can be provided.

増幅産物は、任意選択的に標識した検出プローブのハイブリッドを形成させることによって検出することができ、得られるハイブリッドは任意の通常の方法で測定することができる。特定の標的配列を検出するためのプローブを選択する際の設計基準は、当該分野において公知であり、例えば、Ｈｏｇａｎほか、“ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＭａｋｉｎｇＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｏｂｅｓｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ／ｏｒＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆＮｏｎ−ＶｉｒａｌＯｒｇａｎｉｓｍｓ，”米国特許第６，１５０，５１７号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）に記載されている。Ｈｏｇａｎは、プローブは、標的配列に対する相同性を最大にし、考えられる非標的配列に対する相同性は最小にするように、設計する必要があることを教示している。非標的配列との安定性を最小にするために、Ｈｏｇａｎは、グアニン及びシトシンがリッチな領域を回避する必要があること、プローブは、可能な限り多くの不安定なミスマッチにまたがる必要があること、及び非標的配列に対して完全な相補性の長さは最小限にする必要があることを、指示している。これとは逆に、そのプローブと標的配列との安定性は、最大にする必要があり、アデニン及びチミンがリッチな領域は回避するべきであり、プローブ：標的ハイブリッドはグアニン及びシトシンの塩基対で終端させるのが好ましく、過剰な自己相補性は一般的に回避されるべきであり、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度は、アッセイ温度よりも約２℃乃至約１０℃高いものとする必要がある。 Amplification products can be detected by forming hybrids of optionally labeled detection probes, and the resulting hybrids can be measured by any conventional method. Design criteria for selecting probes for detecting specific target sequences are well known in the art, for example, see Hogan et al. "US Pat. No. 6,150,517, the contents of which are incorporated herein by reference. Hogan teaches that probes should be designed to maximize homology to target sequences and to minimize homology to possible non-target sequences. To minimize stability with non-target sequences, Hogan needs to avoid regions rich in guanine and cytosine, and probes must span as many unstable mismatches as possible , And that the length of complete complementarity to non-target sequences should be minimized. Conversely, the stability of the probe and the target sequence should be maximized, regions that are rich in adenine and thymine should be avoided, and the probe: target hybrid should be in guanine and cytosine base pairs. Termination is preferred and excessive self-complementarity should generally be avoided, and the probe: target hybrid melting temperature should be about 2 ° C. to about 10 ° C. above the assay temperature.

具体的には、増幅産物は、ハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイ（「ＨＰＡ（ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｓｓａｙ）」）によって検定することができる。ＨＰＡは、標的配列に対して化学発光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、アクリジニウムエステル標識（「ＡＥ（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｅｓｔｅｒ−ｌａｂｅｌｅｄ）」）プローブ）をハイブリッド形成させ、ハイブリッド形成していないプローブ上に存在する化学発光標識を選択的に加水分解し、残余のプローブからもたらされる化学発光を測定するものである。例えば、Ａｒｎｏｌｄほか、“ＨｏｍｏｇｅｎｏｕｓＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｓｓａｙ，”米国特許第５，２８３，１７４号及びＮＯＲＭＡＮＣ．ＮＥＬＳＯＮほか、ＮＯＭＳＯＴＯＰＩＣＰＲＯＢＩＮＧ，ＢＬＯＴＴＩＮＧ，ＡＮＤＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ、第１７章（ＬａｒｒｙＪ．Ｋｒｉｃｋａ編、第２版１９９５年）（これらの文献のそれぞれは、その全体が引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。ＡＥプローブを使用してＨＰＡを実行するための具体的方法は、本明細書中の以下の実施例のセクションに開示した。 Specifically, the amplification product can be assayed by a hybridization protection assay (“HPA (Hybridization Protection Assay)”). HPA hybridizes a chemiluminescent oligonucleotide probe (eg, an acridinium ester-labeled (“AE”) probe) to a target sequence and the chemistry present on the non-hybridized probe. The luminescent label is selectively hydrolyzed and the chemiluminescence resulting from the remaining probe is measured. See, for example, Arnold et al., “Homogeneous Protection Assay,” US Pat. No. 5,283,174 and NORMAN C. NELSON et al., NOMSOTOPIC PROBING, BLOTTING, AND SEQUENCING, Chapter 17 (Larry J. Kricka, 2nd edition 1995), each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Please refer. Specific methods for performing HPA using AE probes are disclosed in the Examples section below.

別の実施態様において、本発明は、本明細書に記載の方法による、リアルタイムでの増幅プロセスの定量的評価方法を提供する。「リアルタイム」での増幅プロセスの評価法は、一般に、増幅反応時における反応混合物中のプローブ：単位複製配列複合体に関連するシグナルの量を定期的に測定するものであり、測定した値はサンプル中に最初に存在する標的配列の量を計算するのに用いる。リアルタイム増幅法に基づいてサンプル中に存在する初期の標的配列の量を決定する方法には種々のものがある。このようなものとしては、Ｌｉｇｈｔほか、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅＡｍｏｕｎｔｏｆａｎＡｎａｌｙｔｅｉｎａＳａｍｐｌｅ，” 米国特許出願公開第２００６−０２７６９７２号（段落５０５乃至５４９）、Ｌｅｅほか、“ＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆａＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎ，”米国特許出願公開第２００６−０２８６５８７号、Ｃａｒｒｉｃｋほか、“ＭｅｔｈｏｄａｎｄＡｌｇｏｒｉｔｈｍｆｏｒＱｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”米国特許出願公開第２００６−０２９２６１９号、Ｗｉｔｔｗｅｒほか、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＡｎａｌｙｔｅ，”米国特許第６，３０３，３０５号及びＹｏｋｏｙａｍａほか、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＡｓｓａｙｉｎｇＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ，”米国特許第６，５４１，２０５号に開示されているものが挙げられる。（これらの文献のそれぞれ、又はその示された部分は、引用により本明細書に組み込まれている。）サンプル中に最初に存在した標的配列の量を測定するための別の方法（しかし、これはリアルタイム増幅法には基づかない）が、Ｒｙｄｅｒほか、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＰｒｅ− ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＬｅｖｅｌｓｏｆａＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴａｒｇｅｔＳｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍＰｏｓｔ−ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＬｅｖｅｌｓｏｆＰｒｏｄｕｃｔ，”米国特許第５，７１０，０２９号（この特許の内容は引用により本明細書に組み込まれている）に開示されている。本発明は、リアルタイム評価のために特に適切である。何故なら、副産物の生成が、低減、減少、又は実質的に排除されるからである。 In another embodiment, the present invention provides a method for quantitative evaluation of an amplification process in real time according to the methods described herein. Evaluation methods for amplification processes in “real time” generally measure the amount of signal associated with the probe: amplicon complex in the reaction mixture at the time of the amplification reaction, and the measured value is a sample. Used to calculate the amount of target sequence initially present therein. There are various ways to determine the amount of initial target sequence present in a sample based on real-time amplification. These include Light et al., “Method for Determining the Amount of an Analyte in a Sample,” US Patent Application Publication No. 2006-0276972 (paragraphs 505 to 549), Lee et al. Nucleic Acid Amplification Reaction, “US Patent Application Publication No. 2006-0286587, Carrick et al.,“ Method and Algorithm for Quantitating Polynucleotides, ”US Patent Application Publication No. 2006-0292619erQ ication of an Analyte, "U.S. Patent 6,303,305 No. and Yokoyama addition," Method for Assaying Nucleic Acid, "include those disclosed in U.S. Patent No. 6,541,205. (Each of these documents, or indicated parts thereof, is hereby incorporated by reference.) Another method for measuring the amount of target sequence initially present in a sample (but this Is not based on the real-time amplification method), but Rydder et al., “Method for Determining Pre-Amplification Levels of a Nucleic Acid Target Sequence No. 10, Patent 7th Prof. No. 7”. The contents of which are incorporated herein by reference). The present invention is particularly suitable for real-time evaluation. This is because the production of by-products is reduced, reduced or substantially eliminated.

増幅産物は、種々の自己ハイブリッド形成プローブ（そのほとんどは、ステムループ構造を有する）を使用することによって、リアルタイムで検出することができる。このような自己ハイブリッド形成プローブは、このプローブが、自己ハイブリッド形成状態にあるのか、又は標的配列に対するハイブリッド形成によって変化した状態にあるのかに応じて、様々に検出可能なシグナルを発するように標識する。例えば、「分子トーチ」は、異なる自己相補性領域（「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる）を含む型の自己ハイブリッド形成プローブであり、これらの自己相補性領域は、結合領域（例えば、非ヌクレオチドリンカー）によって接続され、かつ所定のハイブリッド形成アッセイ条件下で互いにハイブリッドを形成する。好ましい実施態様では、分子トーチは、標的結合ドメイン中に１塩基長乃至約１０塩基長の一本鎖塩基領域を含み、鎖置換条件下で増幅産物中に存在する標的配列とのハイブリッド形成に利用できる。この一本鎖領域は、例えば、末端領域又は内部領域（例えば、ループ領域）とすることができる。或いは、上記の鎖置換条件は、この分子トーチの二本鎖末端領域においてブリーシングを引き起こすことによって標的配列とのハイブリッド形成に利用できる一過性一本鎖領域をその末端領域で生じる。標的結合ドメイン中に存在する一本鎖領域に結合し、標的閉鎖ドメインの全てもしくは一部を置換する標的配列の存在下を除いて、鎖置換条件下では、この分子トーチの２つの相補性領域（完全に相補的であっても、部分的に相補的であってもよい）のハイブリッド形成が行われる。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインには、検出可能な標識、又は一対の相互作用標識（例えば、発光標識／クエンチャー標識）を含める。これらの標識は、その分子トーチが標的配列とハイブリッド形成した場合とは異なるシグナルを、その分子トーチが自己ハイブリッド形成した場合に生成し、それによってハイブリッド形成していない分子トーチの存在下に試験サンプル中のプローブ：標的二重鎖の検出が可能となるようにする配置する。分子トーチ類および種々の相互作用標識対がＢｅｃｋｅｒほか、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｏｒｃｈｅｓ，” 米国特許第６，５３４，２７４号に開示されており、その内容は引用により本明細書に組み込まれている。 Amplification products can be detected in real time by using various self-hybridizing probes, most of which have a stem-loop structure. Such self-hybridizing probes are labeled to emit various detectable signals depending on whether the probe is in a self-hybridizing state or altered by hybridization to a target sequence. . For example, a “molecular torch” is a type of self-hybridizing probe that includes different self-complementary regions (referred to as “target-binding domains” and “target-closure domains”), these self-complementary regions being bound regions ( For example, non-nucleotide linkers) and hybridize to each other under certain hybridization assay conditions. In a preferred embodiment, the molecular torch comprises a single stranded base region from 1 base to about 10 bases long in the target binding domain and is utilized for hybridization with a target sequence present in the amplification product under strand displacement conditions. it can. This single-stranded region can be, for example, a terminal region or an internal region (eg, a loop region). Alternatively, the strand displacement conditions described above produce a transient single stranded region at that end region that can be utilized for hybridization with the target sequence by causing a breathing in the double stranded end region of this molecular torch. Two complementary regions of this molecular torch under chain displacement conditions except in the presence of a target sequence that binds to a single stranded region present in the target binding domain and replaces all or part of the target closing domain Hybridization takes place (which may be fully complementary or partially complementary). The target binding domain and target closure domain of the molecular torch include a detectable label or a pair of interaction labels (eg, luminescent / quencher labels). These labels produce a different signal when the molecular torch hybridizes to the target sequence when the molecular torch self-hybridizes, thereby causing the test sample in the presence of the unhybridized molecular torch. Inside probe: Positioned to allow detection of the target duplex. Molecular torches and various interacting label pairs are disclosed in Becker et al., “Molecular Torches,” US Pat. No. 6,534,274, the contents of which are hereby incorporated by reference.

自己相補性を示す検出プローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的相補体配列を含む核酸分子と、増幅産物中に存在する標的配列の非存在下にプローブを閉鎖型構造（ｃｌｏｓｅｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）で保持するアフィニティ対（または核酸アーム）と、そのプローブが閉鎖型構造にある場合に相互作用する標識対とを含む。標的配列と標的相補体配列とをハイブリッド形成させることにより、上記アフィニティ対のメンバーが分離し、これによって、プローブが開放型構造（ｏｐｅｎｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）へとシフトする。この開放型構造へのシフトは、標識対（これは、例えば、発蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る）の相互作用の低下に起因して、検出可能である。この開放型構成へのシフトは、標識対（例えば、発蛍光団およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）とすることができる）の相互作用の低下によって検出可能である。分子ビーコンは、Ｔｙａｇｉほか、“ＤｅｔｅｃｔａｂｌｙＬａｂｅｌｅｄＤｕａｌＣｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｏｂｅｓ，ＡｓｓａｙｓａｎｄＫｉｔｓ，” 米国特許第５，９２５，５１７号及びＴｙａｇｉほか、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＰｒｏｂｅｓＨａｖｉｎｇＮｏｎ−ＦＲＥＴＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＱｕｅｎｃｈｉｎｇａｎｄＫｉｔｓａｎｄＡｓｓａｙｓＩｎｃｌｕｄｉｎｇＳｕｃｈＰｒｏｂｅｓ，” 米国特許第６，１５０，０９７号（これらのそれぞれは、引用により本明細書に組み込まれている）に開示されている。 Another example of a detection probe that exhibits self-complementarity is a “molecular beacon”. A molecular beacon comprises a nucleic acid molecule containing a target complement sequence, an affinity pair (or nucleic acid arm) that holds the probe in a closed configuration in the absence of the target sequence present in the amplification product, and the probe And a pair of labels that interact when they are in a closed structure. By hybridizing the target sequence and the target complement sequence, the members of the affinity pair are separated, thereby shifting the probe to an open configuration. This shift to an open structure is detectable due to the reduced interaction of the label pair (which can be, for example, a fluorophore and a quencher (eg, DABCYL and EDANS)). This shift to an open configuration can be detected by a decrease in the interaction of the label pair (eg, can be a fluorophore and quencher (eg, DABCYL and EDANS)). Molecular beacons are described in Tyagi et al., “Detectable Labeled Dual Conformation Oligotide Probes, Assays and Kits and Nursing and Influids in Kits, United States Patent No. 5,925,517 and Tyagi et al. Probes, "U.S. Patent No. 6,150,097, each of which is incorporated herein by reference.

本発明において使用するための他の自己ハイブリッド形成プローブは、当業者に公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、“ＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＨｏｍｏｇｅｎｏｕｓＡｓｓａｙ，” 米国特許第５，９２８，８６２号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）に開示されているような相互作用標識を有するプローブ結合対は、本発明に使用するのに適するものとすることができる。一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために使用されるプローブ系も、本発明において利用することができる。別の検出系としては、Ａｒｎｏｌｄほか、“ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＣｏｍｐｒｉｓｉｎｇａＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｗｉｔｃｈ，” 米国特許出願公開第ＵＳ２００５−００４２６３８号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）に開示されているような「分子スイッチ」が挙げられる。挿入色素および／または蛍光色素を含むプローブなどの他のプローブは、本発明における増幅産物の検出のために有用とすることができる。例えば、Ｉｓｈｉｇｕｒｏほか、“ＭｅｔｈｏｄｏｆＤｅｔｅｃｔｉｎｇＳｐｅｃｉｆｉｃＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｓ，” 米国特許第５，８１４，４４７号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。 Other self-hybridizing probes for use in the present invention are known to those skilled in the art. For example, a probe binding pair having an interactive label as disclosed in Morrison, “Competitive Homogenous Assay,” US Pat. No. 5,928,862, the contents of which are incorporated herein by reference. Can be suitable for use in the present invention. Probe systems used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) can also be utilized in the present invention. Another detection system is the “molecule” as disclosed in Arnold et al., “Oligonucleotides Compiling a Molecular Switch,” US Patent Application Publication No. US2005-0042638, the contents of which are incorporated herein by reference. Switch ". Other probes such as probes containing intercalating dyes and / or fluorescent dyes can be useful for the detection of amplification products in the present invention. See, for example, Ishiguro et al., “Method of Detecting Specific Nucleic Acid Sequences,” US Pat. No. 5,814,447, the contents of which are incorporated herein by reference.

最初の標的配列とそのＲＮＡ転写産物とが同じセンスを共有する本発明の方法では、リアルタイム検出のためにプローブを添加する前に増幅を開始することが望ましいと考えられる。増幅反応を開始する前にプローブを添加すると、増幅速度が遅くなることがある。何故なら、最初の標的配列に結合するプローブが、プライマー伸長の間に置換され、そうでない場合は除去されて、標的配列の相補体を有するプライマー伸長産物を完成させなければならないからである。増幅の開始は、増幅酵素（例えば、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼ）の添加によって判断される。 In the methods of the invention where the initial target sequence and its RNA transcript share the same sense, it may be desirable to initiate amplification before adding the probe for real-time detection. If the probe is added before starting the amplification reaction, the amplification rate may be slow. This is because the probe that binds to the initial target sequence must be displaced during primer extension, otherwise removed to complete the primer extension product with the complement of the target sequence. The start of amplification is determined by the addition of amplification enzymes (eg, reverse transcriptase and RNA polymerase).

本明細書に記載した方法の他に、本発明は、本発明の方法を実施するために必要な試薬のうちの１種以上を含むキットに関する。本発明を実施する際に使用する種々の成分を含むキットは、核酸標的分子の増幅を必要とする任意の手順において使用するために設定することができ、そのようなキットは、種々様々なエンドユーザーのために特別に製造することができる。例えば、血液スクリーニング、疾病診断、環境分析、感染対策、臨床検査、又は他の法医学的分析、遺伝子分析、考古学的分析もしくは社会学的分析、又は一般的実験室用途のために適切なキットを調製することができる。本発明のキットは、本発明に従って核酸増幅を実施するために必要な成分のうちの１種以上を提供する。キットには、１つの特定の標的から核酸を増幅するために適切な試薬を含めてもよく、又は複数の標的を増幅するために適切な試薬を含めてもよい。本発明のキットは、単一のサンプル中の１種以上の核酸標的のリアルタイム検出のための試薬（例えば、上記の１種以上の自己ハイブリッド形成プローブ）をさらに提供することができる。キットは、バイアル、試験管、ウェルなどの１つ以上の容器を厳重に閉じ込めて収容するように区画化されたキャリアを含むことができる。そのような容器のうちの少なくとも１つは、本発明の増幅方法を実施するのに必要な１種以上の成分または成分の混合物を含むことが好ましい。本発明によるキットには、例えば、１つ以上の容器中に、プライミングオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を防止するように改変された（例えば、３’ブロッキング部分を含むように改変された）プロモータオリゴヌクレオチド、結合分子、又はプライマー伸長反応を停止させるための他の手段、及び任意選択的に、本明細書に記載したようなエクステンダーオリゴヌクレオチド及び／又はキャッピングオリゴヌクレオチドを含ませることができる。リアルタイム検出が行われる場合、上記の１つ以上の容器には、単一のサンプル中の少なくとも１種の核酸標的配列のリアルタイム検出のための１種以上の試薬（例えば、上記の１種以上の自己ハイブリッド形成プローブ）を入れることができる。別の容器には、酵素試薬（例えば、逆転写酵素（ＲＮＡｓｅＨ活性を有するか、有さないもの）と、ＲＮＡポリメラーゼと、任意選択的に別の選択的ＲＮＡｓｅ酵素との混合物）を入れることができる。(ディスプレーサオリゴヌクレオチドを含める場合には、これを上記酵素試薬を含有する容器内に供給することができる。) これらの酵素は、通常は酵素の安定性を促進する形態で、濃縮形態または使用濃度で供給することができる。上記酵素試薬は凍結乾燥形態で供給することもできる。Ｓｈｅｎほか、“ＳｔａｂｉｌｉｚｅｄＥｎｚｙｍｅＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｆｏｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”米国特許第５，８３４，２５４号（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。別の１つ以上の容器には、濃縮形態（例えば、１０×、５０×もしくは１００×）、で、又は使用濃度で増幅試薬を入れることができる。増幅試薬は、増幅反応を実施するために必要な成分（例えば、緩衝液、ＭｇＣｌ_２、ＫＣｌ、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、ＥＤＴＡ、安定剤など）のうちの１種以上を含むことになる。特定の上記成分（例えば、ＭｇＣｌ_２およびｒＮＴＰ）を残りの成分とは別々に供給することによって、エンドユーザーは、より最適な増幅反応を達成するためにこれらの試薬を徐々に増やすことが可能になる。別の１つ以上の容器には、１つ以上の任意選択的に標識した検出プローブを含む、増幅産物の検出のための試薬を入れることができる。一部の実施態様では、本発明のキットには、本発明のキットには、エンドユーザーにより実施される試験増幅を確認するために増幅実験において利用することができる、１種以上の陽性対照及び陰性対照標的核酸を含む、１つ以上の容器をも含めることになる。一部の実施態様では、上記した試薬のうちの１種以上は、内部コントロールと組み合わせることができる。これらの試薬のうちの１種以上を、単一チューブまたは他の容器中で組み合わすことも可能である。 In addition to the methods described herein, the present invention relates to kits that include one or more of the reagents necessary to carry out the methods of the present invention. Kits containing the various components used in practicing the present invention can be set up for use in any procedure that requires amplification of a nucleic acid target molecule, and such kits can be used in a wide variety of ends. Can be specially manufactured for users. For example, suitable kits for blood screening, disease diagnosis, environmental analysis, infection control, clinical testing, or other forensic analysis, genetic analysis, archaeological or sociological analysis, or general laboratory use Can be prepared. The kit of the present invention provides one or more of the components necessary to perform nucleic acid amplification according to the present invention. The kit may include appropriate reagents for amplifying nucleic acids from one specific target, or may include appropriate reagents for amplifying multiple targets. The kits of the invention can further provide reagents for real-time detection of one or more nucleic acid targets in a single sample (eg, one or more self-hybridizing probes described above). The kit can include a carrier that is compartmentalized to tightly contain and contain one or more containers, such as vials, test tubes, wells, and the like. Preferably, at least one of such containers contains one or more components or mixture of components necessary to carry out the amplification method of the present invention. A kit according to the present invention includes, for example, a promoter modified in one or more containers to prevent primer extension by a priming oligonucleotide, DNA polymerase (eg, modified to include a 3 ′ blocking moiety). Oligonucleotides, binding molecules, or other means for terminating the primer extension reaction, and optionally extender oligonucleotides and / or capping oligonucleotides as described herein can be included. Where real-time detection is performed, the one or more containers include one or more reagents for real-time detection of at least one nucleic acid target sequence in a single sample (eg, one or more of the above-described ones). A self-hybridizing probe). In a separate container, place an enzyme reagent (eg, a mixture of reverse transcriptase (with or without RNAse H activity), RNA polymerase, and optionally another selective RNAse enzyme). Can do. (If a displacer oligonucleotide is included, it can be supplied into a container containing the enzyme reagent.) These enzymes are usually in a form that promotes the stability of the enzyme in concentrated form or concentration used. Can be supplied at. The enzyme reagent can also be supplied in lyophilized form. See, Shen et al., “Stabilized Enzyme Compositions for Nucleic Acid Amplification,” US Pat. No. 5,834,254, the contents of which are incorporated herein by reference. Another one or more containers can contain amplification reagents in concentrated form (eg, 10 ×, 50 × or 100 ×) or at the working concentration. The amplification reagent will contain one or more components necessary for carrying out the amplification reaction (eg, buffer, MgCl ₂ , KCl, dNTP, rNTP, EDTA, stabilizer, etc.). By supplying certain of the above components (eg, MgCl ₂ and rNTP) separately from the remaining components, end users can gradually increase these reagents to achieve a more optimal amplification reaction Become. Another one or more containers can contain reagents for the detection of amplification products, including one or more optionally labeled detection probes. In some embodiments, the kits of the invention include a kit of the invention comprising one or more positive controls that can be utilized in an amplification experiment to confirm test amplification performed by an end user. One or more containers containing negative control target nucleic acids will also be included. In some embodiments, one or more of the reagents described above can be combined with an internal control. It is also possible to combine one or more of these reagents in a single tube or other container.

本発明とともに使用するために適切な支持体（例えば、試験管、マルチチューブユニット、マルチウェルプレート、キュベット、軟質容器、遠心分析器に用いるための分析カードもしくはディスクを含むマイクロ流体デバイスなど）も本発明の試薬と共に供給することができる。最後に、本発明のキットには、書面又はＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ及びビデオテープを含む電子的形態で提供される１つ以上の指示書を含ませることができる。本発明のキットには、上述の、又は本明細書の他の箇所に記載されている成分の、事実上あらゆる組み合わせを含ませることができる。当業者であれば認めるであろうが、本発明のキットに含まれる成分は、そのキットの目的とする用途及び対象とするエンドユーザーによって様々に異なることになる。従って、キットは、本願において記載した種々の機能を実施するために具体的に設計することができ、そのようなキットの成分は、それに応じて異なることになる。 Supports suitable for use with the present invention (eg, microfluidic devices including test tubes, multi-tube units, multi-well plates, cuvettes, soft containers, analysis cards or disks for use in centrifuge analyzers, etc.) are also included in this book. Can be supplied with the inventive reagents. Finally, the kits of the present invention may include one or more instructions provided in writing or electronic form including CD-ROM, DVD and videotape. The kits of the present invention can include virtually any combination of the components described above or described elsewhere herein. As will be appreciated by those skilled in the art, the components included in the kits of the invention will vary depending on the intended use of the kit and the intended end user. Thus, kits can be specifically designed to perform the various functions described herein, and the components of such kits will vary accordingly.

本発明はさらに、プライミングオリゴヌクレオチド、プロモータオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、エクステンダーオリゴヌクレオチド、キャッピングオリゴヌクレオチド及び本明細書に記載の検出プローブを含む種々のオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ、ＲＮＡ，ＤＮＡ：ＲＮＡキメラ、及びこれらの類似体とすることができ、どの場合にでも、本発明は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ等価物、及びＲＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ等価物を包含するものである。好ましいプライミングオリゴヌクレオチド（ディスプレーサオリゴヌクレオチドを含む）及び上記の検出プローブを除き、先に記載したオリゴヌクレオチドはその３’末端にブロッキング部分を含むことが好ましい。 The invention further relates to various oligonucleotides including priming oligonucleotides, promoter oligonucleotides, stop oligonucleotides, displacer oligonucleotides, extender oligonucleotides, capping oligonucleotides and detection probes as described herein. The oligonucleotides of the present invention can be DNA, RNA, DNA: RNA chimeras, and analogs thereof, and in any case, the present invention provides RNA equivalents of DNA oligonucleotides and DNA equivalents of RNA oligonucleotides. The thing is included. Except for preferred priming oligonucleotides (including displacer oligonucleotides) and the detection probes described above, the oligonucleotides described above preferably include a blocking moiety at the 3 'end.

本発明の検出プローブは、いくつかの代替的方法で、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、核タグ、生体発光標識、挿入色素、または酵素標識を用いて、標識することができる。上記検出プローブには、このプローブを標的配列又はその相補体とハイブリッドを形成させた時に検出可能なシグナルの変化を示す相互作用標識の基を含ませることができる。種々の実施態様において、これらの標識プローブは、任意選択的に、又は好ましくは、少なくとも１つの改変型ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）を含むように合成し、或いは、これらの標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、任意選択的に、又は好ましくは、もっぱら改変型ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）で合成される。 The detection probes of the present invention can be labeled in a number of alternative ways, for example using radioisotopes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, nuclear tags, bioluminescent labels, intercalating dyes, or enzyme labels. . The detection probe can include an interaction label group that exhibits a detectable change in signal when the probe is hybridized to a target sequence or its complement. In various embodiments, these labeled probes are optionally or preferably synthesized to include at least one modified nucleotide (eg, 2′-O-methyl ribonucleotide), or these Labeled oligonucleotide probes are optionally or preferably synthesized exclusively with modified nucleotides (eg, 2′-O-methyl ribonucleotides).

本明細書に記載した方法および組成物に対する他の適切な修正および適合があり得ることは、当業者にとって周知である種々の情報を考慮すれば、本明細書に含まれる本発明の説明から容易に明らかであり、こうした修正および適合が本発明の範囲又はその全ての実施形態から逸脱することなくなされ得ることは、当業者によって理解されよう。以上に本発明を詳細に説明したが、本発明は、以下の実施例によって、より明確に理解されよう。以下の実施例は、もっぱら例証のためにここに記載されたものであり、、本発明を限定するものではない。 It will be readily apparent from the description of the invention contained herein that it will be appreciated that other suitable modifications and adaptations to the methods and compositions described herein may be made in view of various information well known to those of skill in the art. It will be apparent to those skilled in the art that such modifications and adaptations can be made without departing from the scope of the invention or all embodiments thereof. Although the present invention has been described in detail above, the present invention will be more clearly understood from the following examples. The following examples are described herein for purposes of illustration only and are not intended to limit the invention.

本発明の種々の態様及び実施態様を例示する実施例を以下に示す。これらの実施例は、実際に実施される実験の詳細を正確に反映すると考えられるが、実際に実施される作業と以下に記載される実験の詳細との間には、これらの実験の結果には影響を与えないものの、いくらかの軽微な不一致が存在する可能性がある。こうした実施例がそこに記載されている特定の実施態様に本発明を限定するものではないことは、当業者であれば理解されよう。 Examples illustrating various aspects and embodiments of the invention are provided below. Although these examples are believed to accurately reflect the details of the experiments actually performed, the results of these experiments are not between the work actually performed and the details of the experiments described below. Does not affect, but some minor discrepancies may exist. Those skilled in the art will appreciate that these examples do not limit the invention to the specific embodiments described therein.

さらに、当業者なら、本明細書に記載の技術、材料及び方法を用いて、任意の標的配列を検出及び／又は定量するための代替的な増幅方法を容易に考案し、最適化することができよう。 In addition, one skilled in the art can readily devise and optimize alternative amplification methods for detecting and / or quantifying any target sequence using the techniques, materials and methods described herein. I can do it.

本発明の実施においては、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学、組換えＤＮＡ、および化学の従来技術を用いる。このような技術については、文献で十分に説明されている。例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ：（１９８９年）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓほか、米国特許第４，６８３，１９５号；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ１Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅＴｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ｔｈｅｔｒｅａｔｉｓｅ，ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；並びにｉｎＡｕｓｕｂｅｌほか、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ボルティモア、メリーランド州（１９８９年）を参照されたい。 In practicing the present invention, unless otherwise indicated, conventional techniques of molecular biology, recombinant DNA, and chemistry within the skill of the art are used. Such techniques are explained fully in the literature. For example, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, I and II volumes (D.N. M. J. Gait, 1984); Mullis et al., U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B1 D. Hames & S. J. Higgins, 1984); Perbale, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatment, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc., Ny Y .; See Maryland (1989).

特に示さない限り、以下の実施例のオリゴヌクレオチドおよび改変オリゴヌクレオチドは、種々の方法が当該分野において周知である標準的なホスホラミダイト化学反応を用いて合成した。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓほか、１５４ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２８７（１９８７年）（その内容は引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。 Unless otherwise indicated, the oligonucleotides and modified oligonucleotides of the following examples were synthesized using standard phosphoramidite chemistry, in which various methods are well known in the art. See, for example, Carruthers et al., 154 Methods in Enzymology, 287 (1987), the contents of which are incorporated herein by reference.

本明細書に特記しない限り、改変ヌクレオチドは、２’−メチルリボヌクレオチドであり、これをそのホスホラミダイト類似体として合成に用いた。本出願人は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９ＤＮＡ合成機（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ）を用いてオリゴヌクレオチドを調製した。種々の試薬を以下の実施例において特定した。これらの試薬としては、増幅試薬、酵素試薬、ハイブリッド形成試薬、選択試薬および検出試薬が挙げられる。これらの試薬の処方およびｐＨ値（関連する場合）は、以下の通りであった。 Unless otherwise specified herein, modified nucleotides are 2'-methyl ribonucleotides, which were used in the synthesis as their phosphoramidite analogs. Applicants prepared oligonucleotides using an Expedite ™ 8909 DNA synthesizer (PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass). Various reagents were identified in the following examples. These reagents include amplification reagents, enzyme reagents, hybridization reagents, selection reagents and detection reagents. The formulation and pH values (if relevant) of these reagents were as follows:

増幅試薬：「増幅試薬」は、１１．６ｍＭＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝液、１５ｍＭＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩酸塩緩衝液、２２．７ｍＭＭｇＣｌ_２、２３．３ｍＭＫＣｌ、３．３３％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０５ｍＭ酢酸亜鉛、０．６６５ｍＭｄＡＴＰ、０．６６５ｍＭｄＣＴＰ、０．６６５ｍＭｄＧＴＰ、０．６６５ｍＭｄＴＴＰ、０．０２％（ｖ／ｖ）ＰｒｏＣｌｉｎ３００Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ；カタログ番号４８１２６）、５．３２ｍＭＡＴＰ、５．３２ｍＭＣＴＰ、５．３２ｍＭＧＴＰ、５．３２ｍＭＵＴＰ、及び６ＭＨＣｌ（２２℃でｐＨ７．８１〜８．０）を含んだ。 Amplification reagent: “Amplification reagent” is 11.6 mM Trizma® base buffer, 15 mM Trizma® hydrochloride buffer, 22.7 mM MgCl ₂ , 23.3 mM KCl, 3.33% (v / v) Glycerol, 0.05 mM zinc acetate, 0.665 mM dATP, 0.665 mM dCTP, 0.665 mM dGTP, 0.665 mM dTTP, 0.02% (v / v) ProClin 300 Preservative (Supelco, Bellefonte, PA; catalog No. 48126), 5.32 mM ATP, 5.32 mM CTP, 5.32 mM GTP, 5.32 mM UTP, and 6 M HCl (pH 7.81-8.0 at 22 ° C.).

酵素試薬：「酵素試薬」は、７０ｍＭＮ−アセチル−Ｌ−システイン、１０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２界面活性剤、１６ｍＭＨＥＰＥＳ、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２０ｍＭＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝液、５０ｍＭＫＣｌ、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１５０ｍＭトレハロース、４ＭＮａＯＨ（ｐＨ７）並びに２２４ＲＴＵ／μＬモロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素、及び１４０Ｕ／μＬＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含んだ。この場合、１ＲＴＵのＲＴ活性は基質としてｐｏｌｙ（ｒＡ）−ｐ（ｄＴ）_{１２・１８}を用いて３７℃２０分でＤＥ８１フィルター結合産物中に１ｎｍｏｌのｄＴＭＰを取り込ませ、１ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ活性は３７℃２０分で５ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物を生成する。 Enzyme reagent: “Enzyme reagent” is 70 mM N-acetyl-L-cysteine, 10% (v / v) TRITON® X-102 surfactant, 16 mM HEPES, 3 mM EDTA, 0.05% (w / v) Sodium azide, 20 mM Trizma® base buffer, 50 mM KCl, 20% (v / v) glycerol, 150 mM trehalose, 4 M NaOH (pH 7) and 224 RTU / μL Moloney murine leukemia virus (“MMLV”) reversal The transcriptase and 140 U / μL T7 RNA polymerase were included. In this case, RT activity 1RTU is allowed to ingest the _{poly (rA) -p (dT)} 12 · 18 dTMP of 1nmol the DE81 the filter bound product at 37 ° C. 20 minutes using as a substrate, T7 RNA polymerase activity 1U is Generate 5 fmol RNA transcript at 20 minutes at 37 ° C.

ハイブリッド形成試薬：「ハイブリッド形成試薬」は、１００ｍＭコハク酸、２％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、２３０ｍＭＬｉＯＨ、１５ｍＭアルドリチオール−２、１．２ＭＬｉＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＥＧＴＡ、３．０％（ｖ／ｖ）エチルアルコール及び２ＭＬｉＯＨ（ｐＨ４．７）を含んだ。 Hybridization reagent: “Hybridization reagent” consists of 100 mM succinic acid, 2% (w / v) lithium lauryl sulfate, 230 mM LiOH, 15 mM aldrithiol-2, 1.2 M LiCl, 20 mM EDTA, 20 mM EGTA, 3.0 % (V / v) ethyl alcohol and 2M LiOH (pH 4.7).

選択試薬：「選択試薬」は、６００ｍＭＨ_３ＢＯ_３、１８２ｍＭＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００界面活性剤、および４ＭＮａＯＨ（ｐＨ８．５）を含んだ。 Selection Reagent: “Selection Reagent” included 600 mM H ₃ BO ₃ , 182 mM NaOH, 1% (v / v) TRITON® X-100 surfactant, and 4M NaOH (pH 8.5).

検出試薬Ｉ：「検出試薬Ｉ」は、１ｍＭＨ_３ＮＯ_３および３０ｍＭＨ_２Ｏ_２を含んだ。 Detection reagent I: “Detection reagent I” contained 1 mM H ₃ NO ₃ and 30 mM H ₂ O ₂ .

検出試薬ＩＩ：「検出試薬ＩＩ」は、１ＭＮａＯＨおよび２％（ｗ／ｖ）Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４界面活性剤を含んだ。 Detection Reagent II: “Detection Reagent II” contained 1M NaOH and 2% (w / v) Zwittergent® 3-14 surfactant.

オイル試薬: 「オイル試薬」は、シリコーンオイル（ＵｎｉｔｅｄＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＰＡ；カタログ番号ＰＳ０３８）を含んだ。
（実施例１）
ブロック化及び非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドの比較
この実験は、Ｃ型肝炎ウイルス（「転写物」）の５’非翻訳領域由来のクローニングされた転写物の領域（「標的領域」）を増幅のための標的とした本発明による増幅法の特異性を評価するために行った。この実験のために、本発明者らは、同一の塩基配列を有する２組のプライミングおよびプロモータオリゴヌクレオチドを調製した。この２組のオリゴヌクレオチドはプロモータオリゴヌクレオチドの３’末端ブロッキング部分の有無によって異なる。 Oil Reagent: “Oil reagent” included silicone oil (United Chemical Technologies, Bristol, PA; catalog number PS038).
Example 1
Comparison of Blocked and Unblocked Promoter Oligonucleotides This experiment is intended to amplify the cloned transcript region (“target region”) from the 5 ′ untranslated region of hepatitis C virus (“transcript”) This was carried out in order to evaluate the specificity of the amplification method according to the present invention which was the target of the above. For this experiment, we prepared two sets of priming and promoter oligonucleotides with identical base sequences. The two sets of oligonucleotides differ depending on the presence or absence of the 3 ′ end blocking portion of the promoter oligonucleotide.

各組のプロモータオリゴヌクレオチドは標的領域の５’末端内に含有される配列の相補体を標的とし、配列番号５ Each set of promoter oligonucleotides targets the complement of the sequence contained within the 5 'end of the target region,

の塩基配列を有したが、配列中、プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分はＴ’７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、非下線部分はハイブリッド形成配列（配列番号４）を表す。各組のプライミングオリゴヌクレオチドは、標的領域の３’末端内に含有される配列を標的とし、配列番号６の塩基配列を有した。配列番号３８ In the sequence, the underlined portion of the promoter oligonucleotide constitutes the T'7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3), and the non-underlined portion represents the hybridizing sequence (SEQ ID NO: 4). Each set of priming oligonucleotides targeted the sequence contained within the 3 'end of the target region and had the base sequence of SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 38

の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成される停止オリゴヌクレオチドもこの増幅方法に加えられる。停止オリゴヌクレオチドは、３’末端ブロッキング部分を有し、標的領域に対してちょうど５’側の転写物の領域を標的とした。停止オリゴヌクレオチドの５’末端とプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端とは、６塩基が重なり合う。プロモータオリゴヌクレオチドおよび停止オリゴヌクレオチドの両方の３’末端ブロッキング部分は、３’−ジメチルトリチル−Ｎ−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン、５’−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；カタログ番号２０−０１０２−０１）を用いて調製される３’−３’結合で構成された。 A stop oligonucleotide composed of 2'-O-methyl ribonucleotides having the following nucleotide sequence is also added to this amplification method. The stop oligonucleotide had a 3 'end blocking moiety and targeted the region of the transcript that was just 5' to the target region. The 5 'end of the stop oligonucleotide and the 5' end of the promoter oligonucleotide hybridization sequence overlap by 6 bases. The 3 ′ end blocking moieties of both promoter and stop oligonucleotides are 3′-dimethyltrityl-N-benzoyl-2′-deoxycytidine, 5′-succinoyl-long chain alkylamino-CPG (Glen Research Corporation, Sterling, VA; Catalog No. 20-0102-01) composed of 3′-3 ′ linkages.

増幅のために、７５μＬの上記増幅試薬を、８つの反応チューブの各々に添加した。次いで、この増幅試薬を、３０ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド、３０ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチドおよび５ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドと混合した。１組の４本のチューブに３０ｐｍｏｌの非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド（Ｉ群）を供給し、別の組の４本のチューブに３０ｐｍｏｌのブロック化プロモータオリゴヌクレオチド（ＩＩ群）を供給した。次に、１０００コピー／μＬの転写物を含む１μＬの０．１％（ｗ／ｖ）硫酸ラウリルリチウム（「ＬＬＳ」）緩衝液を、各群の２本のチューブに添加し、一方、各群の残りの２本のチューブを、陰性対照とした。反応混合物に２００μＬのオイル試薬をかけ、次いで、チューブを密閉して５乃至１０秒間水平に手で振盪した後、チューブを６０℃の水浴で１０分間インキュベートした。次いで、チューブを、４１．５℃の水浴に移し、１５分間インキュベートした後に、２５μＬの酵素試薬を各チューブに添加した。酵素試薬を添加した後、チューブを密閉し、水浴から取り出し、５乃至１０秒間、水平に手で振盪して、反応混合物の成分を十分に混合した。チューブを、４１．５℃の水浴に戻し、さらに６０分間インキュベートして、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下で標的領域の増幅を促進した。増幅後、チューブを、４１．５℃の水浴から取り出し、１０乃至１５分間、室温で冷却させた。 For amplification, 75 μL of the amplification reagent was added to each of the 8 reaction tubes. This amplification reagent was then mixed with 30 pmol promoter oligonucleotide, 30 pmol priming oligonucleotide and 5 pmol stop oligonucleotide. One set of four tubes was supplied with 30 pmol of unblocked promoter oligonucleotide (Group I), and another set of four tubes was supplied with 30 pmol of blocked promoter oligonucleotide (Group II). Next, 1 μL of 0.1% (w / v) lithium lauryl sulfate (“LLS”) buffer containing 1000 copies / μL transcript was added to two tubes in each group, while each group The remaining two tubes were used as negative controls. The reaction mixture was loaded with 200 μL of oil reagent, then the tube was sealed and shaken horizontally by hand for 5-10 seconds, and then the tube was incubated in a 60 ° C. water bath for 10 minutes. The tubes were then transferred to a 41.5 ° C. water bath and incubated for 15 minutes before adding 25 μL of enzyme reagent to each tube. After the enzyme reagent was added, the tube was sealed and removed from the water bath and shaken horizontally by hand for 5-10 seconds to thoroughly mix the components of the reaction mixture. The tube was returned to the 41.5 ° C. water bath and incubated for an additional 60 minutes to facilitate target region amplification in the presence of MMLV reverse transcriptase and T7 RNA polymerase. After amplification, the tube was removed from the 41.5 ° C. water bath and allowed to cool at room temperature for 10-15 minutes.

各反応混合物の５μＬアリコートを、チューブから取り、２×Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−尿素サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号ＬＣ６８７６）で１：１に希釈し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥ−尿素変性ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号ＥＣ６８６５ＢＯＸ）上にロードした。ゲルを、ＸｃｅｌｌＳｕｒｅｌｏｃｋ（商標）Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ＥＩ０００１）によって保持し、脱イオン水で１：４に希釈した５×Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ＬＣ６６７５）を用いて１８０ボルトで５０分間電気泳動した。その後、ゲルを、１×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ）溶液中０．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドで染色し、ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ（登録商標）ＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＴｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＩｎｃ．，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ；ＭｏｄｅｌＮｏ．ＦＢ−ＴＩＶ−８１６Ａ）上で可視化し、Ｐｏｌａｒｏｉｄ６６７フィルムを用いて携帯用のカメラで撮影した。 A 5 μL aliquot of each reaction mixture is removed from the tube and diluted 1: 1 with 2 × Novex® TBE-urea sample buffer (Invitrogen, Carlsbad, Calif .; catalog number LC6876) and Novex®. Loaded on TBE-urea denaturing gel (Invitrogen; catalog number EC6865BOX). The gel was retained by Xcell Surelock ™ Mini-Cell (Invitrogen; catalog number EI0001) and diluted 1: 4 with deionized water 5 × Novex® TBE running buffer (Invitrogen; catalog number LC6675) Was electrophoresed at 180 volts for 50 minutes. The gel was then stained with 0.5 μg / mL ethidium bromide in 1 × TBE (Tris-Borate-EDTA) solution and FisherBiotech® Ultraviolet Transilluminator (Fisher Scientific International Inc., Hampton, NH; FB-TIV-816A) and photographed with a portable camera using Polaroid 667 film.

この実験の結果を、撮影した図３のゲルに示した。上記の各番号の写真のゲルは、異なるレーンを表し、レーン１は、１００、２００、３００、４００、５００、７５０および１０００塩基のオリゴヌクレオチドのＲＮＡラダーであり、残りのレーンは、以下の反応混合物に対応する：（ｉ）レーン２および３は、Ｉ群（非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド）の転写物含有複製に対応し；（ｉｉ）レーン４および５は、ＩＩ群（ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド）の転写物含有複製に対応し；（ｉｉｉ）レーン６および７は、Ｉ群の転写物陰性複製に対応し；並びに（ｉｖ）レーン８および９は、ＩＩ群の転写物陰性複製。レーン２乃至５の最初の目に見えるバンドは、標的領域の増幅に由来する単位複製配列を構成する。レーン２、３、６および７のバンドの残りは、非特異的増幅産物を構成する。従って、以上の結果から、完全にブロック化されたプロモータオリゴヌクレオチドを用いる増幅のみが特異的であることが分かった。何故なら、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む転写物含有又は転写物陰性反応混合物のいずれにおいても目に見える副産物の形成がなかったのに対し、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む転写物含有及び転写物陰性反応混合物のいずれにおいても目に見える副産物が形成されたからである。
（実施例２）
複製分子形成の減少
この実験は、本発明の増幅法においてブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを使用することによって、標準的な転写ベースの増幅手順と比較して複製分子形成の減少が生じる否かを評価するためにデザインした。複製分子は一般に、プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端がヘアピン構造を形成し、ポリメラーゼの存在下で伸長することにより二本鎖プロモータ配列が形成される場合に形成されると考えられている。二本鎖プロモータ配列から転写が開始されると、アンチセンス型のプロモータ配列を含む単位複製配列が形成される。 The results of this experiment are shown in the photographed gel of FIG. Each numbered photographic gel represents a different lane, lane 1 is an RNA ladder of 100, 200, 300, 400, 500, 750 and 1000 base oligonucleotides and the remaining lanes are the following reactions: Corresponding to the mixture: (i) lanes 2 and 3 correspond to transcript-containing replication of group I (unblocked promoter oligonucleotide); (ii) lanes 4 and 5 are group II (blocked promoter oligonucleotide) (Iii) Lanes 6 and 7 correspond to group I transcript negative replicates; and (iv) Lanes 8 and 9 are group II transcript negative replicates. The first visible band in lanes 2-5 constitutes an amplicon derived from amplification of the target region. The rest of the bands in lanes 2, 3, 6 and 7 constitute non-specific amplification products. Thus, the above results indicate that only amplification using a fully blocked promoter oligonucleotide is specific. Because there was no visible by-product formation in either transcript-containing or transcript-negative reaction mixtures containing blocked promoter oligonucleotides, transcript-containing and transcripts containing unblocked promoter oligonucleotides. This is because visible by-products were formed in any of the negative reaction mixtures.
(Example 2)
This experiment evaluates whether the use of blocked promoter oligonucleotides in the amplification method of the present invention results in a decrease in replication molecule formation compared to standard transcription-based amplification procedures. Designed for. A replication molecule is generally considered to be formed when the 3 ′ end of a promoter oligonucleotide forms a hairpin structure and is extended in the presence of a polymerase to form a double stranded promoter sequence. When transcription is initiated from a double-stranded promoter sequence, an amplicon containing an antisense promoter sequence is formed.

この実験では、本発明者らは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１６ＳｒＲＮＡ（「標的核酸」）の領域（「標的領域」）を標的とする２種の検出プローブの１種を用いてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＡＴＣＣ番号２５１７７）由来の精製ｒＲＮＡの存在下または非存在下で３’末端がブロックされた、又はブロックされていなプロモータオリゴヌクレオチドを含む増幅反応において複製分子の生成を比較した。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドおよび非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドは、標的領域の５’末端の相補体内に含まれる配列を標的とした。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２６ In this experiment, we used Mycobacterium tuberculosis (ATCC number 25177) using one of two detection probes targeting the region of 16S rRNA (“target nucleic acid”) of Mycobacterium tuberculosis (“target nucleic acid”). The production of replication molecules was compared in amplification reactions involving promoter oligonucleotides that were blocked or unblocked at the 3 ′ end in the presence or absence of purified rRNA from Blocked and non-blocked promoter oligonucleotides targeted sequences contained within the complement of the 5 'end of the target region. The blocked promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 26

の塩基配列を有し、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８ The non-blocked promoter oligonucleotide has the following sequence:

の塩基配列を有した。但し、各プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分は、Ｔ７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、下線のない部分は、ハイブリッド形成配列（配列番号２５および配列番号２７）を表す。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的配列の３’末端内に含まれる配列を標的し、配列番号２９の塩基配列を有した。配列番号３９ The base sequence was However, the underlined portion of each promoter oligonucleotide constitutes the T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3), and the unlined portion represents the hybridization sequence (SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27). The priming oligonucleotide targeted the sequence contained within the 3 'end of the target sequence and had the base sequence of SEQ ID NO: 29. SEQ ID NO: 39

の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成される停止オリゴヌクレオチドも含めた。停止オリゴヌクレオチドは、標的領域に対してちょうど５’側の標的核酸の領域を標的とし、３’末端ブロッキング部分を含んだ。停止オリゴヌクレオチドとプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端とは、６塩基が重なり合った。ブロックオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドの両方の３’末端ブロッキング部分は、実施例１に記載した３’−３’結合からなった。さらに検出のために、２種の検出プローブを合成した。第１の検出プローブ（「検出プローブＩ」）は、標的領域内に含まれる配列を標的し、配列番号３０ A stop oligonucleotide composed of 2'-O-methylribonucleotides having the nucleotide sequence of The stop oligonucleotide targeted a region of the target nucleic acid just 5 'to the target region and included a 3' end blocking moiety. Six bases overlapped the 5 'end of the hybridization sequence of the stop oligonucleotide and the promoter oligonucleotide. The 3 'end blocking portion of both the blocking oligonucleotide and the stop oligonucleotide consisted of the 3'-3' linkage described in Example 1. In addition, two detection probes were synthesized for detection. The first detection probe (“detection probe I”) targets a sequence contained within the target region and is

の塩基配列を有した。第２の検出プローブ（「検出プローブＩＩ」）は、Ｔ７プロモータ配列内に含まれる領域のアンチセンスを標的とし、配列番号４０ The base sequence was The second detection probe (“Detection Probe II”) targets the antisense of the region contained within the T7 promoter sequence and is SEQ ID NO: 40

の塩基配列を有した。両方の検出プローブ配列中の星印は、Ａｒｎｏｌｄら、「ＬｉｎｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｒｏｂｅｓ」、米国特許第５，５８５，４８１号（その内容は、引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに連結される４−（２−スクシニミジルオキシカルボニルエチル）−フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートアクリジニウムエステル標識（「標準ＡＥ」）の位置を示す。 The base sequence was The asterisks in both detection probe sequences are described in Arnold et al., “Linking Reagents for Nucleotide Probes”, US Pat. No. 5,585,481, the contents of which are incorporated herein by reference. As shown in FIG. 4, a 4- (2-succinimidyloxycarbonylethyl) -phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylate fluorosulfonate acridinium ester label (" Standard AE ") is indicated.

全部で８種の異なる増幅反応を５回反復して実施した。増幅反応のために使用した全ての反応チューブに、７５μＬの増幅試薬、続いて、各々５ｐｍｏｌのブロック化プロモータオリゴヌクレオチド又は非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、及び停止オリゴヌクレオチドを供給した。２組のチューブに２５０コピー／μＬの標的核酸を含む各２μＬの０．２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を供給し、もう一方の２組のチューブには標的核酸を供給しなかった。反応混合物に２００μＬのオイル試薬を重畳し、チューブを密閉して、５乃至１０秒間、水平に手で振盪した後、６０℃の水浴中で１０分間、インキュベートした。次いで、チューブを、４１．５℃の水浴に移し、１０分間、インキュベートした後に、２５μＬの酵素試薬を各チューブに添加した。酵素試薬を添加した後、チューブを密閉して、水浴から取り出し、５乃至１０秒間、水平に手で振盪して、反応混合物の成分を十分に混合した。標的配列の増幅を可能にするために、チューブを４１．５℃の水浴に戻し、さらに６０分間インキュベートした。増幅後、チューブを４１．５℃の水浴から取り出し、１０乃至１５分間、室温で冷却させた。 A total of 8 different amplification reactions were performed 5 times. All reaction tubes used for the amplification reaction were supplied with 75 μL of amplification reagent, followed by 5 pmol each of blocked or unblocked promoter oligonucleotide, priming oligonucleotide, and stop oligonucleotide. Two sets of tubes were supplied with 2 μL each of 0.2% (w / v) LLS buffer containing 250 copies / μL of target nucleic acid, and the other two sets of tubes were not supplied with target nucleic acid. The reaction mixture was overlaid with 200 μL of oil reagent, the tube was sealed, shaken horizontally by hand for 5-10 seconds, and then incubated in a 60 ° C. water bath for 10 minutes. The tubes were then transferred to a 41.5 ° C. water bath and incubated for 10 minutes before adding 25 μL of enzyme reagent to each tube. After the enzyme reagent was added, the tube was sealed and removed from the water bath and shaken horizontally by hand for 5-10 seconds to thoroughly mix the components of the reaction mixture. The tubes were returned to the 41.5 ° C. water bath and incubated for an additional 60 minutes to allow amplification of the target sequence. After amplification, the tube was removed from the 41.5 ° C. water bath and allowed to cool at room temperature for 10-15 minutes.

検出工程を、Ａｒｎｏｌｄほか、”ＨｏｍｏｇｅｎｏｕｓＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｓｓａｙ”、米国特許第５，２８３，１７４号に開示されるハイブリダイゼーション・プロテクション・アッセイに従って実施した。この工程において、５２ｆｍｏｌの検出プローブＩまたは１０．２ｆｍｏｌの検出プローブＩＩのいずれかを含む１００μＬのハイブリッド形成試薬を、各チューブに添加した。検出プローブを添加した後、チューブを密閉して、５乃至１０秒間、水平に手で振盪して、６０℃の水浴中で１５分間インキュベートして、検出プローブをその対応する標的配列とハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成させた後、２５０μＬの選択試薬をチューブに添加し、チューブを密閉して、５乃至１０秒間、水平に手で振盪した後、６０℃の水浴中で１０分間インキュベートすることによってハイブリッド形成していないプローブと結合したアクリジニウムエステル標識を加水分解した。このサンプルを少なくとも１０分間、室温で冷却させた後、検出試薬Ｉの自動注入に続いて、検出試薬ＩＩの自動注入を装備したＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号４７４７）で分析した。チューブから発されたシグナルを、化学発光の目安である相対発光量（「ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｕｎｉｔ）」）で測定した。 The detection step was performed according to the hybridization protection assay disclosed in Arnold et al., “Homogenous Protection Assay”, US Pat. No. 5,283,174. In this step, 100 μL of hybridization reagent containing either 52 fmol detection probe I or 10.2 fmol detection probe II was added to each tube. After adding the detection probe, the tube is sealed, shaken by hand for 5-10 seconds, and incubated in a 60 ° C. water bath for 15 minutes to allow the detection probe to hybridize with its corresponding target sequence. It was. After hybridization, 250 μL of selection reagent was added to the tube, the tube was sealed, shaken horizontally by hand for 5-10 seconds, and then incubated for 10 minutes in a 60 ° C. water bath. The acridinium ester label bound to the non-probe was hydrolyzed. The sample was allowed to cool for at least 10 minutes at room temperature, followed by LEADER® HC + Lumometer® (Gen-Probe Incorporated, equipped with automatic injection of detection reagent II, followed by automatic injection of detection reagent II. (San Diego, CA; catalog number 4747). The signal emitted from the tube was measured by the relative luminescence amount (“RLU (relative light unit)”) which is a measure of chemiluminescence.

結果を、各組の反応条件毎に平均化し、以下の表１に示した。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む上記増幅反応は標的核酸の標的領域を増幅させる時に非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む上記増幅反応と同様に機能したことが分かる。しかしながら、転写物の存在下および非存在下の両方において、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含むそれらの増幅反応では、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む増幅反応の場合よりも、複製分子の生成は実質的に少なかった。 The results were averaged for each set of reaction conditions and are shown in Table 1 below. It can be seen that the amplification reaction containing the blocked promoter oligonucleotide functioned similarly to the amplification reaction containing the non-blocked promoter oligonucleotide when amplifying the target region of the target nucleic acid. However, in those amplification reactions involving blocked promoter oligonucleotides, both in the presence and absence of transcripts, the production of replication molecules is substantially greater than in amplification reactions involving unblocked promoter oligonucleotides. There were few.

（実施例３）
ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを用いる増幅アッセイの感度
この実験では、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＡＴＣＣＮｏ．ＶＲ−８７８）由来の精製された２３ＳｒＲＮＡ（「標的核酸」）の領域（「標的領域」）を増幅のための標的とする本発明による増幅系の感度を調べた。この実験には、３’末端ブロッキング部分を有するプロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、３’末端部分を有する停止オリゴヌクレオチド、及び標識検出プローブを含めた。プロモータオリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端内に含まれる配列の相補体を標的とし、配列番号２２ (Example 3)
Sensitivity of Amplification Assay with Blocked Promoter Oligonucleotide and Stop Oligonucleotide In this experiment, a region of purified 23S rRNA (“target nucleic acid”) from Chlamydia trachomatis (ATCC No. VR-878) (“target region”) The sensitivity of the amplification system according to the present invention, which is targeted for amplification, was examined. This experiment included a promoter oligonucleotide having a 3 ′ end blocking moiety, a priming oligonucleotide, a stop oligonucleotide having a 3 ′ end moiety, and a labeled detection probe. The promoter oligonucleotide targets the complement of the sequence contained within the 5 ′ end of the target sequence and is SEQ ID NO: 22

の塩基配列を有した。配列中、プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分はＴ７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、下線のない部分は、ハイブリッド形成配列（配列番号２１）を示す。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的領域の３’末端内に含まれる配列を標的とし、配列番号２３の塩基配列を有した。停止オリゴヌクレオチドは、配列番号４１ The base sequence was In the sequence, the underlined portion of the promoter oligonucleotide constitutes the T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3), and the non-underlined portion indicates the hybridization sequence (SEQ ID NO: 21). The priming oligonucleotide targeted the sequence contained within the 3 'end of the target region and had the base sequence of SEQ ID NO: 23. The stop oligonucleotide is SEQ ID NO: 41.

の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、標的領域に対してちょうど５’側の標的核酸の領域を標的とした。停止オリゴヌクレオチドとプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端とは、４塩基が重なり合った。プロモータオリゴヌクレオチドおよび停止オリゴヌクレオチドの両方の３’末端ブロッキング部分は、実施例１に記載した３’−３’結合からなった。検出プローブは、標的領域内に含まれる配列を標的とし、配列番号２４ The target nucleic acid region was composed of 2'-O-methyl ribonucleotide having the nucleotide sequence of 5 'and exactly 5' to the target region. Four bases overlapped the 5 'end of the hybridization sequence of the stop oligonucleotide and the promoter oligonucleotide. The 3 'end blocking portion of both the promoter and stop oligonucleotides consisted of the 3'-3' linkage described in Example 1. The detection probe targets a sequence contained within the target region and is SEQ ID NO: 24

の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成された。但し、星印は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させた標準ＡＥ標識の位置を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。 It consisted of 2'-O-methyl ribonucleotides having the base sequence: The asterisk indicates the position of the standard AE label attached to the probe by a non-nucleotide linker. See Arnold et al., US Pat. No. 5,585,481.

この実験における増幅は、基本的に実施例１に記載したようにして行った。各増幅反応を３回反復して実施し、標的核酸を、１０、１００、１０００又は１０，０００コピー／μＬを含む０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液からの、それぞれ１０、１００、１０００又は１０，０００のコピー数の各組の複製において各反応チューブに添加した。プロモータおよびプライミングオリゴヌクレオチドを各々、３０ｐｍｏｌ／反応量においてチューブに添加し、５ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドを各チューブに添加した。検出は、この実験のＣｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓプローブを用いて基本的に実施例２に記載したようにして実施した。この実験の結果を以下の表２に示したが、これにより、この増幅系について１００コピーの感度が示され、１０，０００を超える平均ＲＬＵ値がポジティブな結果となった。 Amplification in this experiment was basically performed as described in Example 1. Each amplification reaction was performed in triplicate, and the target nucleic acid was 10, 100, respectively from 0.1% (w / v) LLS buffer containing 10, 100, 1000 or 10,000 copies / μL. 1000 or 10,000 copy numbers were added to each reaction tube in each set of replicates. Promoters and priming oligonucleotides were each added to the tubes at 30 pmol / reaction volume, and 5 pmoles of stop oligonucleotides were added to each tube. Detection was performed essentially as described in Example 2 using the Chlamydia trachomatis probe of this experiment. The results of this experiment are shown in Table 2 below, which showed a sensitivity of 100 copies for this amplification system, with an average RLU value exceeding 10,000 being positive.

（実施例４）
二本鎖標的配列の増幅
この実施例では、ヒト乳頭腫ウイルス１６型（「ＨＰＶ−１６」）のＥ６およびＥ７遺伝子由来のクローン化二本鎖転写物（「転写物」）の領域（「標的領域」）を増幅のための標的とした本発明による増幅系を調べる。図１Ｃを参照されたい。この実験には、３’末端ブロッキング部分を有するプロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド、及び標識検出プローブを含めた。このプロモータオリゴヌクレオチドは、標的配列の５’末端内に含まれる配列の相補体を標的とし、配列番号１４ Example 4
Amplification of double stranded target sequence In this example, a region of cloned double stranded transcript ("transcript") from the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 ("HPV-16") ("target The amplification system according to the present invention with the region “) targeted for amplification is examined. See FIG. 1C. This experiment included a promoter oligonucleotide having a 3 ′ end blocking moiety, a priming oligonucleotide, and a labeled detection probe. This promoter oligonucleotide targets the complement of the sequence contained within the 5 'end of the target sequence and is SEQ ID NO: 14

の塩基配列を有した。配列中、プロモータオリゴヌクレオチドの下線部分は、Ｔ７プロモータ配列（配列番号３）を構成し、下線のない部分は、ハイブリッド形成配列（配列番号１３）を表す。プロモータオリゴヌクレオチドの３’末端ブロッキング部分は、実施例１に記載される３’−３’結合からなる。プライミングオリゴヌクレオチドは、標的領域の３’末端内に含まれる配列を標的とし、配列番号１５の塩基配列を有した。２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドからなる検出プローブは、配列番号１６ The base sequence was In the sequence, the underlined portion of the promoter oligonucleotide constitutes the T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3), and the non-underlined portion represents the hybridization sequence (SEQ ID NO: 13). The 3 'end blocking portion of the promoter oligonucleotide consists of the 3'-3' linkage described in Example 1. The priming oligonucleotide targeted the sequence contained within the 3 'end of the target region and had the base sequence of SEQ ID NO: 15. The detection probe consisting of 2'-O-methylribonucleotide is SEQ ID NO: 16.

の塩基配列を有し、標的領域内に含まれる配列を標的とした。星印は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合した標準ＡＥ標識の位置を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。 And the sequence contained in the target region was targeted. The asterisk indicates the position of the standard AE label attached to the probe by a non-nucleotide linker. See Arnold et al., US Pat. No. 5,585,481.

この実験の増幅反応を５回反復して実施し、各チューブには、０、５０、１００、５００、１０００又は５０００コピーの転写物を含む７５μＬの増幅試薬を含ませた。各チューブには、４０ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド及び１５ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチドをも供給した。反応混合物に、２００μＬのオイル試薬を重畳し、次いで、チューブを密閉して、５乃至１０秒間水平に手で振盪した。二本鎖転写物の相補鎖を分離するために、チューブを９５℃で１０分間、ヒートブロック中でインキュベートした。このインキュベーションの終了時に、チューブをヒートブロックから取り出し、５分間氷上で急速に冷却して、プライミングオリゴヌクレオチドと転写物の標的領域との結合を促進した。次いで、チューブを、４１．５℃の水浴中で１０分間、インキュベートした。増幅を開始させるために、２５μＬの酵素試薬をチューブに添加し、次いで、これを密閉して５乃至１０秒間水平に手で振盪して、増幅試薬および酵素試薬を十分に混合した。次いで、チューブを４１．５℃の水浴に戻して１時間のインキュベーションを行うことにより増幅を実施した。 The amplification reaction of this experiment was performed 5 times and each tube contained 75 μL of amplification reagent containing 0, 50, 100, 500, 1000 or 5000 copies of transcript. Each tube was also supplied with 40 pmol promoter oligonucleotide and 15 pmol priming oligonucleotide. The reaction mixture was overlaid with 200 μL of oil reagent, then the tube was sealed and shaken horizontally by hand for 5-10 seconds. To separate the complementary strand of the double stranded transcript, the tube was incubated in a heat block at 95 ° C. for 10 minutes. At the end of this incubation, the tube was removed from the heat block and rapidly cooled on ice for 5 minutes to facilitate binding of the priming oligonucleotide to the target region of the transcript. The tubes were then incubated for 10 minutes in a 41.5 ° C. water bath. To initiate amplification, 25 μL of enzyme reagent was added to the tube, which was then sealed and shaken horizontally by hand for 5-10 seconds to thoroughly mix amplification reagent and enzyme reagent. Amplification was then performed by returning the tube to a 41.5 ° C. water bath and incubating for 1 hour.

増幅後、増幅産物の検出を、１００ｆｍｏｌ／反応の検出プローブを用いて、実施例２に記載した方法で実施した。この実験の結果を以下の表２に示したが、これにより、この増幅系について５００コピーの感度が示され、１０，０００以上の平均ＲＬＵ値がポジティブな結果となった。 After amplification, detection of the amplified product was performed by the method described in Example 2 using a detection probe of 100 fmol / reaction. The results of this experiment are shown in Table 2 below, which showed a sensitivity of 500 copies for this amplification system, with an average RLU value of 10,000 or more being positive.

（実施例５）
ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドと非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドとの比較
この実験の目的は、実施例１のＨＣＶ増幅系において停止オリゴヌクレオチドを含ませることの利点を評価することであった。図１Ａを参照されたい。この実験のために、停止オリゴヌクレオチドの存在下又は非存在下で実施例１の転写物を０または１０コピー含む４種の異なる反応混合物を、１０回反復して用意した。プロモータ、プライミングおよび停止オリゴヌクレオチドは、実施例１で使用したものと同一であった。実施例１とは異なり、この実験には、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから作製され、増幅のための標的にされる転写物の領域内に含まれる配列を標的とする２種の検出プローブを含ませた。第１の検出プローブは、配列番号７ (Example 5)
Comparison of blocked and unblocked promoter oligonucleotides The purpose of this experiment was to evaluate the benefits of including a stop oligonucleotide in the HCV amplification system of Example 1. See FIG. 1A. For this experiment, four different reaction mixtures containing 0 or 10 copies of the transcript of Example 1 in the presence or absence of a stop oligonucleotide were prepared in 10 replicates. The promoter, priming and stop oligonucleotides were identical to those used in Example 1. Unlike Example 1, this experiment included two detection probes made from 2'-O-methyl ribonucleotides that target sequences contained within the region of the transcript targeted for amplification. Included. The first detection probe is SEQ ID NO: 7

の塩基配列を有し、第２の検出プローブは、配列番号８ And the second detection probe has the sequence number 8

を有した。各検出プローブは、「コールド（ｃｏｌｄ）」すなわち非標識型、および「ホット（ｈｏｔ）」すなわち標識された型を有した。（極めて過剰な単位複製配列の存在下にホットプローブが飽和するのを回避するために、この実験ではコールドプローブを使用し、それによって、増幅の範囲を評価することが可能となった。）星印は、非ヌクレオチドリンカーによってホットプローブに結合された標準ＡＥ標識の位置を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。 Had. Each detection probe had a “cold” or unlabeled form and a “hot” or labeled form. (To avoid saturating the hot probe in the presence of extremely excessive amplicons, this experiment used a cold probe, which made it possible to assess the extent of amplification.) The indicia indicate the position of the standard AE label attached to the hot probe by a non-nucleotide linker. See Arnold et al., US Pat. No. 5,585,481.

増幅反応は、基本的に、３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド並びに各１５ｐｍｏｌ／反応のプライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２に記載の方法で行った。検出は、以下の表４に示した比に相当する量で各１００ｆｍｏｌ／反応の２種のホットプローブ及び２種のコールドプローブを用いて、実施例２に記載したようにして実施した。平均化した結果を、相対発光量（「ＲＬＵ」）で表４に示したが、これにより、停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物のみが、ＨＣＶ増幅系において１０コピーレベルの感度を有したことが分かる。試験した異なるコピーレベルについて表４に示される変動係数値（「％ＣＶ」）は、パーセンテージとしての複製の平均に対するする複製の標準偏差を構成する。 The amplification reaction was basically carried out by the method described in Example 2 using 30 pmol / reaction promoter oligonucleotide and 15 pmol / reaction priming oligonucleotide and stop oligonucleotide. Detection was performed as described in Example 2 using two hot probes and two cold probes at 100 fmol / reaction each in an amount corresponding to the ratio shown in Table 4 below. The averaged results are shown in Table 4 in terms of relative luminescence (“RLU”), which indicates that only the reaction mixture containing the stop oligonucleotide had a sensitivity of 10 copy levels in the HCV amplification system. . The coefficient of variation values (“% CV”) shown in Table 4 for the different copy levels tested constitutes the standard deviation of replication relative to the average of replication as a percentage.

（実施例６）
プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の塩基の重なりの種々の長さ
この実験において、本発明者らは、実施例１のＨＣＶ増幅系において増幅効率に対するブロック化プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の種々の長さの重なりの効果を検討した。反応混合物を４回反復して用意し、各組に０または５０コピーの実施例１の転写物を供給した。存在する場合、プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の重なりの量は、各組の反応混合物について２塩基、４塩基又は６塩基であった。プロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド及び検出プローブは、実施例５に使用したものと同一であった。コールドプローブおよびホットプローブを４：１の比で使用した。この実験の３つの停止オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、以下の塩基配列を有した：（ｉ）配列番号４２ (Example 6)
Various lengths of base overlap between promoter and stop oligonucleotides In this experiment, we determined that the blocked promoter oligonucleotide and stop oligonucleotide for amplification efficiency in the HCV amplification system of Example 1 The effect of overlap of various lengths between was studied. The reaction mixture was prepared 4 times and 0 or 50 copies of the transcript of Example 1 was fed to each set. When present, the amount of overlap between the promoter oligonucleotide and the stop oligonucleotide was 2 bases, 4 bases or 6 bases for each set of reaction mixtures. The promoter oligonucleotide, priming oligonucleotide and detection probe were the same as those used in Example 5. Cold probe and hot probe were used in a ratio of 4: 1. The three stop oligonucleotides in this experiment were composed of 2'-O-methyl ribonucleotides and had the following base sequence: (i) SEQ ID NO: 42

（２塩基重なり）；（ｉｉ）配列番号４３ (Double base overlap); (ii) SEQ ID NO: 43

（４塩基重なり）；及び（ｉｉｉ）配列番号３８（６塩基重なり）。 (4 base overlap); and (iii) SEQ ID NO: 38 (6 base overlap).

増幅反応を、３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及び各１５ｐｍｏｌ／反応のプライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを用い、実施例５に記載した方法で反応チューブにおいて行った。検出を、各１００ｆｍｏｌ／反応の２種のホットプローブ、及び各４００ｆｍｏｌ／反応の２種のコールドプローブを用いて、実施例２に記載したようにして実施した。平均化した結果を、相対発光量（「ＲＬＵ」）で表５に示したが、これにより、試験した条件下で、プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の６塩基の重なりが、ＨＣＶ増幅系について最適であることが分かる。当業者であれば、この方法を任意の増幅系に適用して、型どおりの実験以外を用いないで、プロモータオリゴヌクレオチドと停止オリゴヌクレオチドとの間の重なりの最適な量を決定することができよう。 The amplification reaction was carried out in a reaction tube as described in Example 5 using 30 pmol / reaction promoter oligonucleotide and 15 pmol / reaction priming oligonucleotide and stop oligonucleotide. Detection was performed as described in Example 2 using two hot probes at 100 fmol / reaction and two cold probes at 400 fmol / reaction each. The averaged results are shown in Table 5 in terms of relative luminescence (“RLU”), which indicates that under the conditions tested, the 6 base overlap between the promoter oligonucleotide and the stop oligonucleotide is HCV amplified. It turns out that it is optimal for the system. One skilled in the art can apply this method to any amplification system to determine the optimal amount of overlap between the promoter and stop oligonucleotides without using routine experimentation. Like.

（実施例７）
停止オリゴヌクレオチドの存在下又は非存在下におけるリアルタイム増幅アッセイの比較
この実験は、停止オリゴヌクレオチドが、リアルタイム増幅アッセイにおいて増幅能力を向上させるか否かを明らかにするために行った。この実験のために、本発明者らは、配列番号２８の塩基配列を有する非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、配列番号２９の塩基配列を有するプライミングオリゴヌクレオチド、および配列番号３９の塩基配列を有するブロック化停止オリゴヌクレオチドを含ませた実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系を用いた。配列番号３１の塩基配列を有する分子ビーコン検出プローブもまた含ませた。検出プローブを、ＢＨＱ−２ＧｌｙｃｏｌａｔｅＣＰＧ（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ；カタログ番号ＣＧ５−５０４２Ｇ−１）を用いてその３’末端に結合させたＢＨＱ−２ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｄｙｅ、およびＣｙ（商標）５−ＣＥホスホラミダイト（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社；カタログ番号１０５９１５−９０）を用いてその５’末端に結合させたＣｙ（商標）５Ｄｙｅを含むように合成した。こうした反応は、ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓＷｈｉｔｅＣｌｉｎｉｐｌａｔｅ９６（ＶＷＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ；カタログ番号２８２９８−６１０）のウェル中で行い、各反応ウェルには、０、１００又は１，０００コピーの実施例２の標的核酸を添加した。試験した各コピー数については、停止オリゴヌクレオチドを含む４つの複製、および停止オリゴヌクレオチドを含まない４つの複製が存在した。増幅および検出のために、７５μＬの増幅試薬を各反応ウェルに添加し、続いて、５０コピー／μＬを含む２μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を１組の複製の各チューブに添加し、５００コピー／μＬを含む２μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を、別の組の複製の各チューブに添加した。プロモータオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチド及び、含ませる場合、停止オリゴヌクレオチドを、各々、５ｐｍｏｌ／反応量でチューブに添加し、２ｐｍｏｌ／反応量の検出プローブを各チューブに添加した。標的核酸を、示した量で反応ウェルに供給し、反応混合物に８０μＬのオイル試薬を重畳した。プレートを、ＴｈｅｒｍａｌＳｅａｌＲＴ（商標）フィルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；製品番号Ｚ３６９６７５）で密閉して、プレートの内容物を、ＳｏｌｏＨＴＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＩｎｃｕｂａｔｏｒ（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；型番５１６１５８０）中で６０℃のインキュベーションを１５分間、続いて、このＳｏｌｏＨＴＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＩｎｃｕｂａｔｏｒ中で４２℃のインキュベーションを１０分間行った。次に、２５μＬの酵素試薬（４２℃に予熱した）を各ウェルに添加して、その内容物を、ピペットを用いて数回混合した。次いで、プレートの内容物を、Ｂｉｏｌｕｍｉｎ（商標）９６０ＭｉｃｒｏＡｓｓａｙＲｅａｄｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）中で４２℃で１２０分間、インキュベートして、Ｃｙ（商標）５Ｄｙｅチャネルからの蛍光を、１分間隔において時間の関数として観察した。この観察の結果を、グラフとして図４Ａ乃至図Ｆに示したが、これにより、停止オリゴヌクレオチドが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓリアルタイム増幅アッセイにおいて標的配列の増幅を劇的に向上させたことが分かる。
（実施例８）
停止オリゴヌクレオチド対消化オリゴヌクレオチド
この実験では、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド又は非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドの存在下に停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチドを用いて、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系の増幅レベルを比較した。この実施態様の停止オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに結合して、物理的に逆転写酵素の活性をブロックするように設計したが、ＤＮＡからなる消化オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに結合してＲＮＡｓｅＨ活性による基質ＲＮＡの消化を導くように設計した。停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチドを使用すると、規定された３’末端を有する鋳型−相補鎖又はｃＤＮＡが形成される。プロモータオリゴヌクレオチドは、その鋳型結合部分が、鋳型−相補鎖に存在する３’末端配列とハイブリッドを形成することにより、逆転写酵素の存在下に二本鎖プロモータ配列の形成を促進するように設計する。 (Example 7)
Comparison of real-time amplification assays in the presence or absence of stop oligonucleotides This experiment was performed to determine whether stop oligonucleotides improve amplification capability in real-time amplification assays. For this experiment, we have unblocked promoter oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 28, priming oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 29, and blocking having the base sequence of SEQ ID NO: 39. The Mycobacterium tuberculosis amplification system of Example 2 containing a stop oligonucleotide was used. A molecular beacon detection probe having the base sequence of SEQ ID NO: 31 was also included. BHQ-2 Black Hole Quencher ™ Dye conjugated with a detection probe at its 3 ′ end using BHQ-2 Glycolate CPG (Biosearch Technologies, Novato, Calif .; catalog number CG5-5042G-1), and Cy (Trademark) 5-CE phosphoramidite (Glen Research; catalog number 105915-90) was used to synthesize Cy (trademark) 5Dye linked to its 5 'end. These reactions were performed in the wells of Thermo Labsystems White Cliniplate 96 (VWR International, West Chester, PA; catalog number 28298-610), each reaction well containing 0, 100 or 1,000 copies of Example 2. Target nucleic acid was added. For each copy number tested, there were 4 replicates with a stop oligonucleotide and 4 replicates without a stop oligonucleotide. For amplification and detection, 75 μL of amplification reagent is added to each reaction well, followed by 2 μL of 0.1% (w / v) LLS buffer containing 50 copies / μL in each set of replicate tubes. 2 μL of 0.1% (w / v) LLS buffer containing 500 copies / μL was added to each tube of another set of replicates. Promoter oligonucleotides, priming oligonucleotides and, if included, stop oligonucleotides were each added to the tubes at 5 pmol / reaction amount and 2 pmol / reaction amounts of detection probe were added to each tube. The target nucleic acid was supplied to the reaction well in the indicated amount, and 80 μL of oil reagent was superimposed on the reaction mixture. The plate is sealed with ThermalSeal RT ™ film (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; product number Z369675) and the contents of the plate are subjected to a Solo HT Microplate Incubator (Thermo Electron, Waltham MA; Model number; 5161580) at 60 ° C. for 15 minutes, followed by incubation at 42 ° C. for 10 minutes in the Solo HT Microplate Incubator. Next, 25 μL of enzyme reagent (preheated to 42 ° C.) was added to each well and the contents were mixed several times using a pipette. The contents of the plate were then incubated for 120 minutes at 42 ° C. in a Biolumin ™ 960 Micro Assay Reader (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif.) To allow fluorescence from the Cy ™ 5Dye channel for 1 minute. Observed as a function of time in the interval. The results of this observation are shown graphically in FIGS. 4A-F, indicating that the stop oligonucleotide dramatically improved the amplification of the target sequence in the Mycobacterium tuberculosis real-time amplification assay.
(Example 8)
Stop oligonucleotide vs. digested oligonucleotide In this experiment, the stop level or digested oligonucleotide was used in the presence of blocked or unblocked promoter oligonucleotide to determine the amplification level of the Mycobacterium tuberculosis amplification system of Example 2. Compared. The stop oligonucleotide of this embodiment was designed to bind to the target RNA and physically block the activity of reverse transcriptase, whereas the digested oligonucleotide consisting of DNA binds to the target RNA and RNAse H activity Designed to guide the digestion of substrate RNA by Using a stop or digested oligonucleotide forms a template-complementary strand or cDNA with a defined 3 'end. Promoter oligonucleotides are designed so that their template-binding portion promotes the formation of a double-stranded promoter sequence in the presence of reverse transcriptase by hybridizing with the 3 ′ end sequence present in the template-complementary strand. To do.

実施例２のように、この実験のプロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８の塩基配列を有し、プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９の塩基配列を有した。停止オリゴヌクレオチドは、配列番号４４ As in Example 2, the promoter oligonucleotide of this experiment had the base sequence of SEQ ID NO: 28, and the priming oligonucleotide had the base sequence of SEQ ID NO: 29. The stop oligonucleotide is SEQ ID NO: 44.

の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、消化オリゴヌクレオチドは、配列番号４５ The digested oligonucleotide is composed of 2'-O-methyl ribonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 45

の塩基配列を有した。実施例２で特定した停止オリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の５’末端は、４塩基が重なり合い、消化オリゴヌクレオチドの５’末端から伸長する最初の１４塩基は、プロモータオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成配列の最も５’側の１４塩基と重なり合った。ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド及び消化オリゴヌクレオチドは全て、実施例１に記載される３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を含んだ。さらに、検出プローブは、配列番号３２ The base sequence was The 5 ′ end of the hybridization sequence of the stop oligonucleotide and promoter oligonucleotide identified in Example 2 overlaps 4 bases, and the first 14 bases extending from the 5 ′ end of the digested oligonucleotide are the hybrids of the promoter oligonucleotide. It overlapped with 14 bases at the 5 ′ end of the sequence. The blocked promoter oligonucleotide, stop oligonucleotide and digested oligonucleotide all contained a 3 'end blocking moiety consisting of the 3'-3' linkage described in Example 1. Further, the detection probe is SEQ ID NO: 32

の塩基配列を有した。配列中、星印は非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させた標準ＡＥ標識の部分を示す。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。 The base sequence was In the sequence, the asterisk indicates the portion of the standard AE label attached to the probe by a non-nucleotide linker. See Arnold et al., US Pat. No. 5,585,481.

全部で６つの異なる反応を、以下の表６に示すように２回反復して実施した。鋳型ポジティブ反応には、各々、実施例２の５０コピー／μＬのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的核酸を含む１μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液を供給し、鋳型ネガティブ反応には、標的核酸を含ませなかった。増幅および検出は、基本的に、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチド、５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチド、３０ｐｍｏｌ／反応の消化オリゴヌクレオチド、並びに１０ｆｍｏｌ／反応の検出プローブを用いて、実施例２と同様にして行った。これらの反応の結果は、相対発光量（「ＲＬＵ」）として測定し、表６に示したが、これにより、この増幅系の増幅が、停止オリゴヌクレオチド又は消化オリゴヌクレオチドの存在下で類似していたが、能力は、消化オリゴヌクレオチドを用いるといくらか向上したことが分かる。さらに、この結果から、このコピー数でのこの増幅系における増幅レベルが、消化オリゴヌクレオチドの存在下で向上したことが分かる。 A total of 6 different reactions were performed in duplicate as shown in Table 6 below. Each template positive reaction was supplied with 1 μL of 0.1% (w / v) LLS buffer containing 50 copies / μL of Mycobacterium tuberculosis target nucleic acid of Example 2; Not included. Amplification and detection are basically performed using a promoter oligonucleotide and a priming oligonucleotide of 30 pmol / reaction, a stop oligonucleotide of 5 pmol / reaction, a digested oligonucleotide of 30 pmol / reaction, and a detection probe of 10 fmol / reaction, respectively. Performed as in Example 2. The results of these reactions were measured as relative luminescence (“RLU”) and are shown in Table 6, which allows the amplification of this amplification system to be similar in the presence of a stop or digested oligonucleotide. However, it can be seen that the performance was somewhat improved using digested oligonucleotides. Furthermore, the results show that the amplification level in this amplification system at this copy number was improved in the presence of digested oligonucleotides.

（実施例９）
キャッププライミングオリゴヌクレオチド
この実験では、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系を用いて、副産物形成に対してプライミングオリゴヌクレオチドキャップを含ませることの効果を検討した。「キャップ」は、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端に相補性の短いオリゴヌクレオチドであり、末端の３’−ＯＨ基からの伸長を阻止するための３’末端ブロッキング部分を含む。キャップは、プライミングオリゴヌクレオチドがプロモータオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドダイマー（プライミングオリゴヌクレオチドが、逆転写酵素の存在下において伸長される場合、機能的二本鎖プロモータ配列の形成を生じ得る）を形成することを防ぐために含ませる。図５Ａに示すように、機能的二本鎖プロモータ配列を有するオリゴヌクレオチドダイマーが形成されると、ＲＮＡポリメラーゼの存在下に望ましくない副産物が生成する可能性がある。キャップは、オリゴヌクレオチドダイマー形成を阻害する一方、鋳型配列との特異的なハイブリッド形成によって、プライミングオリゴヌクレオチドから容易に外すことができる。キャップ使用の略図を図６Ａに示した。 Example 9
Cap Priming Oligonucleotide In this experiment, the effect of including a priming oligonucleotide cap on byproduct formation was examined using the Mycobacterium tuberculosis amplification system of Example 2. A “cap” is a short oligonucleotide complementary to the 3 ′ end of a priming oligonucleotide and includes a 3 ′ end blocking moiety to prevent extension from the terminal 3′-OH group. The cap forms an oligonucleotide dimer in which the priming oligonucleotide has a promoter oligonucleotide (which can result in the formation of a functional double stranded promoter sequence when the priming oligonucleotide is extended in the presence of reverse transcriptase) Include to prevent. As shown in FIG. 5A, the formation of an oligonucleotide dimer with a functional double stranded promoter sequence can produce undesirable by-products in the presence of RNA polymerase. While the cap inhibits oligonucleotide dimer formation, it can be easily removed from the priming oligonucleotide by specific hybridization with the template sequence. A schematic diagram of cap use is shown in FIG. 6A.

この実験のために、本発明者らは、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的核酸の存在下または非存在下で２回反復して３つの異なる反応条件を試験した。３つの反応条件の構成要素は、以下のように異なった：（ｉ）第１の組の反応条件には、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及びブロック化停止オリゴヌクレオチドを含めた；（ｉｉ）第２の組の反応条件には、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド、ブロックオリゴヌクレオチドを含めた；（ｉｉｉ）第３の組の反応条件は、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、３’末端でブロック化キャップとハイブリッド形成させたプライミングオリゴヌクレオチド、及びブロック化停止オリゴヌクレオチドを含めた。実施例２のように、プロモータオリゴヌクレオチドは、配列番号２８の塩基配列を有し、プライミングオリゴヌクレオチドは、配列番号２９の塩基配列を有した。キャップは、配列番号４６ For this experiment, we tested three different reaction conditions in duplicate in the presence or absence of the Mycobacterium tuberculosis target nucleic acid of Example 2. The components of the three reaction conditions differed as follows: (i) The first set of reaction conditions included an unblocked promoter oligonucleotide, an uncapped priming oligonucleotide and a blocked stop oligonucleotide. (Ii) the second set of reaction conditions included blocked promoter oligonucleotides, uncapped priming oligonucleotides, block oligonucleotides; (iii) the third set of reaction conditions included blocked promoter oligonucleotides; A priming oligonucleotide hybridized with a blocking cap at the 3 ′ end and a blocking stop oligonucleotide were included. As in Example 2, the promoter oligonucleotide had the base sequence of SEQ ID NO: 28, and the priming oligonucleotide had the base sequence of SEQ ID NO: 29. The cap is SEQ ID NO: 46.

の塩基配列を有した。停止オリゴヌクレオチドは、配列番号４４ The base sequence was The stop oligonucleotide is SEQ ID NO: 44.

の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成された。さらに、ブロックされる場合の停止オリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチド並びにキャップには全て、実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を含ませた。 It consisted of 2'-O-methyl ribonucleotides having the base sequence: In addition, the stop and promoter oligonucleotides and caps when blocked all contained a 3 'end blocking moiety consisting of the 3'-3' linkage described in Example 1.

増幅を開始する前に、プライミングオリゴヌクレオチドおよびキャップを、１：１の比でプライミングオリゴヌクレオチド及びキャップを含む１０ｍＭＮａＣｌ溶液中で予めハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成を促進するために、溶液を含む反応チューブを、９５℃の水浴中で１０分間インキュベートし、次いで、２時間室温で冷却させた。この予めハイブリッド形成させる工程の後、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びキャッププライミングオリゴヌクレオチド、並びに５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチドを用いて実施例２のようにして増幅を行った。この場合、各反応混合物には、１０，０００コピー／μＬの標的核酸を含む１μＬの０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液も供給した。増幅後、５μＬのサンプルを各チューブから取り、１０×ＢｌｕｅＪｕｉｃｅ（商標）ＧｅｌＬｏａｄｉｎｇ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号１０８１６−０１５）で１：１に希釈し、これを、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ）で２倍に希釈し、エチジウムブロマイド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カタログ番号Ｇ５０１８−０４）で予め染色したＥ−Ｇｅｌ（登録商標）ＳｉｎｇｌｅＣｏｍｂＧｅｌ（４％高分解能アガロース）上にロードした。ゲルを、３０分間８０ボルトでＥ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｂａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号Ｇ５１００−０１）上で電気泳動した。次いで、ゲルを、ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ（登録商標）ＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔＴｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒで可視化し、Ｐｏｌａｒｏｉｄ６６７フィルムを用いて携帯用のカメラで撮影した。 Prior to initiating amplification, the priming oligonucleotide and cap were prehybridized in a 10 mM NaCl solution containing the priming oligonucleotide and cap in a 1: 1 ratio. To promote hybridization, the reaction tube containing the solution was incubated in a 95 ° C. water bath for 10 minutes and then allowed to cool at room temperature for 2 hours. After this pre-hybridization step, amplification was performed as in Example 2 using each 30 pmol / reaction promoter oligonucleotide and cap priming oligonucleotide and 5 pmol / reaction stop oligonucleotide. In this case, each reaction mixture was also supplied with 1 μL of 0.1% (w / v) LLS buffer containing 10,000 copies / μL of the target nucleic acid. After amplification, a 5 μL sample is taken from each tube and diluted 1: 1 with 10 × BlueJuice ™ Gel Loading buffer (Invitrogen; catalog number 10816-015), which is added to TBE (Tris-Borate-EDTA). ) And then loaded onto E-Gel® Single Comb Gel (4% high resolution agarose) prestained with ethidium bromide (Invitrogen; catalog number G5018-04). The gel was electrophoresed on E-Gel® Base (Invitrogen; catalog number G5100-01) for 30 minutes at 80 volts. The gel was then visualized with FisherBiotech® Ultraviolet Transilluminator and photographed with a portable camera using Polaroid 667 film.

この実験の結果を、図７Ａ（鋳型ネガティブゲル）及び図７Ｂ（鋳型ポジティブゲル）の写真撮影したゲルで示した。写真のゲルの上の数字は、異なるレーンを示し、レーン７はブランク、レーン８は１００塩基対のＲＮＡラダー、レーン９は、２０塩基対のＲＮＡラダーであり、残りのレーンは、以下の反応混合物由来の産物を含む：（ｉ）レーン１及び２は、非ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及びブロック化停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物に対応する；（ｉｉ）レーン３及び４は、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物に対応する；並びに（ｉｉｉ）レーン５及び６は、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチド、キャッププライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドを含む反応混合物に対応する。以上の結果から、プライミングオリゴヌクレオチドをキャッピングすることにより副産物の形成がさらに減少したことが分かる（こうした反応におけるオリゴヌクレオチドダイマーである副産物は、２０マー乃至６０マーの範囲であるのに対し、単位複製配列は、１００塩基長より長い）。
（実施例１０）
ループ状プライミングオリゴヌクレオチド
この実験では、実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増幅系における増幅に対するループ状プライミングオリゴヌクレオチドの効果を調べた。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドは、実施例９において評価した種々のプライミングオリゴヌクレオチドおよびキャップである。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドリンカー（例えば、無塩基ヌクレオチド）によって、プライミングオリゴヌクレオチドの３’末端乃至５’末端に結合しているキャップを含む。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドの１つの利点は、標的鋳型の非存在下でのプライミングオリゴヌクレオチドとキャップとの再結合が、これら２つのオリゴヌクレオチドが互いにごく接近して維持される場合に、より速いことである。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドの別の利点は、別のプライミングオリゴヌクレオチド及びキャップオリゴヌクレオチドの時間を要する合成と対照的に、プライミングオリゴヌクレオチド及びキャップが単一の合成手順で作製することができることである。 The results of this experiment are shown in the photographed gels of FIG. 7A (template negative gel) and FIG. 7B (template positive gel). The numbers on the photographic gel indicate different lanes, lane 7 is blank, lane 8 is a 100 base pair RNA ladder, lane 9 is a 20 base pair RNA ladder, and the remaining lanes are the following reactions: Contains products from the mixture: (i) Lanes 1 and 2 correspond to reaction mixtures containing unblocked promoter oligonucleotides, uncapped priming oligonucleotides and blocked stop oligonucleotides; (ii) Lanes 3 and 4 are Corresponding to a reaction mixture comprising a blocked promoter oligonucleotide, an uncapped priming oligonucleotide and a stop oligonucleotide; and (iii) lanes 5 and 6 represent a blocked promoter oligonucleotide, a cap priming oligonucleotide and a stop oligonucleotide. Corresponding to free the reaction mixture. From the above results, it can be seen that capping the priming oligonucleotide further reduced the formation of by-products (the by-products that are oligonucleotide dimers in these reactions ranged from 20-mer to 60-mer whereas The sequence is longer than 100 bases long).
(Example 10)
Looped Priming Oligonucleotide In this experiment, the effect of looped priming oligonucleotide on amplification in the Mycobacterium tuberculosis amplification system of Example 2 was examined. Looped priming oligonucleotides are the various priming oligonucleotides and caps evaluated in Example 9. The looped priming oligonucleotide comprises a cap attached to the 3 ′ to 5 ′ end of the priming oligonucleotide by a non-nucleotide linker (eg, abasic nucleotide). One advantage of the looped priming oligonucleotide is that the recombination of the priming oligonucleotide and cap in the absence of the target template is faster when the two oligonucleotides are kept in close proximity to each other. It is. Another advantage of looped priming oligonucleotides is that priming oligonucleotides and caps can be made in a single synthetic procedure, as opposed to time consuming synthesis of other priming oligonucleotides and cap oligonucleotides.

非キャッププライミングオリゴヌクレオチドと種々の長さのキャップを有するループ状プライミングオリゴヌクレオチドとの間の比較を行った。プロモータ、プライミングオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドは、実施例９に使用したものと同一であり、検出プローブは、実施例２に使用した検出プローブＩと同じであった。検出プローブを、実施例５に記載した理由のために、「コールド」及び「ホット」の両形態で反応混合物に供給し、各反応混合物のコールド：ホットプローブ比を２５０：１とした。ループ状プライミングオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有し、配列中、各「ｎ」は、無塩基ヌクレオチド（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ；カタログ番号１０−１９２４−ｘｘ）を表す： A comparison was made between uncapped priming oligonucleotides and looped priming oligonucleotides with caps of various lengths. The promoter, priming oligonucleotide and stop oligonucleotide were the same as those used in Example 9, and the detection probe was the same as detection probe I used in Example 2. Detection probes were fed into the reaction mixture in both “cold” and “hot” form for the reasons described in Example 5, with a cold: hot probe ratio of each reaction mixture of 250: 1. The looped priming oligonucleotide has the following sequence, where each “n” represents an abasic nucleotide (Glen Research; catalog number 10-1924-xx):

各プライミングオリゴヌクレオチドについて異なる反応混合物を調製し、これらの反応混合物を、１０００コピー／μＬの実施例２のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ標的核酸を含む０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ緩衝液から得られる１０００コピーのこの標的核酸を用い、３回反復して試験した。増幅および検出工程は、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチド、５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチド、１０ｆｍｏｌ／反応のホットプローブ、並びに２．５ｐｍｏｌ／反応のコールドプローブを用いて、実施例２のようにして行った。チューブからのシグナルを相対発光量（「ＲＬＵ」）として測定し、平均ＲＬＵ値を以下の表７に示した。この結果から、鋳型はループ状プライミングオリゴヌクレオチドを用いて増幅させることができること、４つの無塩基および１つの５塩基キャップを有するループ状プライミングオリゴヌクレオチドはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ増殖系に最適であることが分かる。 Different reaction mixtures are prepared for each priming oligonucleotide, and these reaction mixtures are 1000 copies obtained from 0.1% (w / v) LLS buffer containing 1000 copies / μL of Mycobacterium tuberculosis target nucleic acid of Example 2. This target nucleic acid was tested in triplicate. The amplification and detection steps were carried out in Example 2 using 30 pmol / reaction promoter oligonucleotide and priming oligonucleotide, 5 pmol / reaction stop oligonucleotide, 10 fmol / reaction hot probe, and 2.5 pmol / reaction cold probe. I went as follows. The signal from the tube was measured as relative luminescence (“RLU”) and the average RLU value is shown in Table 7 below. From this result, it can be seen that the template can be amplified using a looped priming oligonucleotide, and that a looped priming oligonucleotide with four abasic and one 5 base caps is optimal for the Mycobacterium tuberculosis growth system.

（実施例１１）
ループ状プライミングオリゴヌクレオチドとキャップとの比較
この実験では、ループ状プライミングオリゴヌクレオチドのプライマー依存性副産物形成に対する阻害能を評価した。この実験として、実施例１０のループ状プライミングオリゴヌクレオチドＬＰＯ及びＶＬＰＯＶＩＩを、非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及び１４塩基のキャップを有するプライミングオリゴヌクレオチドと比較した。非キャッププライミングオリゴヌクレオチド及びキャッププライミングオリゴヌクレオチドは、実施例１０に用いた非キャッププライミングオリゴヌクレオチドと同じであり、キャップは配列番号５４ (Example 11)
Comparison of looped priming oligonucleotide and cap In this experiment, the ability of the looped priming oligonucleotide to inhibit primer-dependent byproduct formation was evaluated. In this experiment, the looped priming oligonucleotides LPO and VLPO VII of Example 10 were compared to an uncapped priming oligonucleotide and a priming oligonucleotide having a 14 base cap. The non-cap priming oligonucleotide and the cap priming oligonucleotide are the same as the non-cap priming oligonucleotide used in Example 10, and the cap is SEQ ID NO: 54.

の塩基配列を有した（キャップおよびプライミングオリゴヌクレオチドは、実施例９のように予めハイブリッド形成させた）。停止オリゴヌクレオチドは、実施例１０に用いた停止オリゴヌクレオチドと同じであり、検出プローブは、プライミングオリゴヌクレオチドの相補体を標的とし、配列番号２９ (The cap and priming oligonucleotide were prehybridized as in Example 9). The stop oligonucleotide is the same as the stop oligonucleotide used in Example 10, and the detection probe targets the complement of the priming oligonucleotide and is SEQ ID NO: 29

の塩基配列を有した（配列中、星印は非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させた標準ＡＥ標識の位置を示す）。Ａｒｎｏｌｄほか、米国特許第５，５８５，４８１号を参照されたい。検出プローブに、実施例５に記載した理由のために、「コールド」および「ホット」形態の両方において反応混合物を与え、各反応混合物のコールド：ホットのプローブの比は、４０００：１であった。プロモータ及び停止オリゴヌクレオチドと同様に、キャップは、実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を有した。 (In the sequence, the asterisk indicates the position of the standard AE label attached to the probe by a non-nucleotide linker). See Arnold et al., US Pat. No. 5,585,481. The detection probes were given reaction mixtures in both “cold” and “hot” forms for the reasons described in Example 5, and the cold: hot probe ratio of each reaction mixture was 4000: 1. . Similar to the promoter and stop oligonucleotide, the cap had a 3 'end blocking moiety consisting of the 3'-3' linkage described in Example 1.

反応混合物は、全て鋳型を含まず、各プライミングオリゴヌクレオチドについて調製した異なる組の反応混合物に関して３回反復して試験した。増幅および検出工程は、各３０ｐｍｏｌ／反応のプロモータオリゴヌクレオチド及びプライミングオリゴヌクレオチド、５ｐｍｏｌ／反応の停止オリゴヌクレオチド、２０ｆｍｏｌ／反応のホットプローブ、並びに８０ｐｍｏｌ／反応のコールドプローブを用いて、実施例２のようにして行った。チューブからのシグナルを相対発光量（「ＲＬＵ」）として測定し、平均ＲＬＵ値を以下の表９に示した。以上の結果から、キャッププライミングオリゴヌクレオチドはループ状プライミングオリゴヌクレオチドよりも大きな程度に、プライマー依存性の副産物の形成を抑制したが、ループ状プライミングオリゴヌクレオチドを用いると、この増幅系に非キャッププライミングオリゴヌクレオチドを用いた場合よりも、プライマー依存性の副産物形成が少なかったことが分かる。 All reaction mixtures contained no template and were tested in triplicate on different sets of reaction mixtures prepared for each priming oligonucleotide. The amplification and detection steps were as in Example 2, using 30 pmol / reaction promoter oligonucleotide and priming oligonucleotide, 5 pmol / reaction stop oligonucleotide, 20 fmol / reaction hot probe, and 80 pmol / reaction cold probe. I went there. The signal from the tube was measured as relative luminescence (“RLU”) and the average RLU value is shown in Table 9 below. From the above results, the cap-primed oligonucleotide suppressed the formation of primer-dependent byproducts to a greater extent than the loop-like priming oligonucleotide. It can be seen that primer-dependent byproduct formation was less than when nucleotides were used.

（実施例１２）
エクステンダーオリゴヌクレオチドの存在下及び非存在下でのＲＮＡ転写物生成の比較
この実験では、ブロック化プロモータオリゴヌクレオチドを含む増幅反応混合物における単位複製配列生成に対するエクステンダーオリゴヌクレオチドの効果を調べた。この実験のエクステンダーオリゴヌクレオチドは、ブロック化型又は非ブロック化型とし、配列番号５５ (Example 12)
Comparison of RNA transcript generation in the presence and absence of extender oligonucleotides In this experiment, the effect of extender oligonucleotides on amplicon generation in amplification reaction mixtures containing blocked promoter oligonucleotides was investigated. The extender oligonucleotide for this experiment was either blocked or unblocked, and SEQ ID NO: 55

を有した。配列番号５６ Had. SEQ ID NO: 56

の塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成される３’末端ブロック化停止オリゴヌクレオチドを含めた。標的核酸「標的」、プライミングオリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチドは、実施例１に使用したものと同じであった。この実験に使用した各ブロック化オリゴヌクレオチドのブロッキング部分は、実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分であった。コールドおよびホットプローブを転写産物の検出のために使用し、これは、配列番号７の配列を有した。この実験のホットプローブは、実施例５に使用した第１検出プローブと同一のものであった。 3 'end-blocked stop oligonucleotides composed of 2'-O-methyl ribonucleotides having the nucleotide sequence of: The target nucleic acid “target”, priming oligonucleotide and promoter oligonucleotide were the same as those used in Example 1. The blocking moiety of each blocked oligonucleotide used in this experiment was the 3 'end blocking moiety consisting of the 3'-3' linkage described in Example 1. Cold and hot probes were used for transcript detection and had the sequence of SEQ ID NO: 7. The hot probe for this experiment was the same as the first detection probe used in Example 5.

以下のように６つの群の増幅反応混合物を４回反復して試験した：（ｉ）エクステンダーオリゴヌクレオチドを含まず、標的を含まない（Ｉ群）；（ｉｉ）エクステンダーオリゴヌクレオチドを含まず、１００コピーの標的を含む（ＩＩ群）；（ｉｉｉ）ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、標的を含まない（ＩＩＩ群）；（ｉｖ）ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、１００コピーの標的を含む（ＩＶ群）；（ｖ）非ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、標的を含まない（Ｖ群）；（ｉｖ）非ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを含み、１００コピーの標的を含む（ＶＩ群）。６群からの反応チューブには、６ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチド、４ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド及び０．８ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドを含む３０μＬの増幅試薬を充填した。ＩＩＩ群及びＩＶ群の反応チューブには、４ｐｍｏｌのブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを添加し、Ｖ群及びＶＩ群の反応チューブには、４ｐｍｏｌの非ブロック化エクステンダーオリゴヌクレオチドを添加した。上記のように、ＩＩ群、ＩＶ群及びＶＩ群の反応チューブにはさらに、１００コピーの標的を添加したのに対し、Ｉ群、ＩＩＩ群及びＶ群の反応チューブには、標的を添加しなかった。反応混合物に、２００μＬのオイル試薬を重畳し、次いで、チューブを密閉して１０秒間ボルテックスした後、６０℃の水浴中に１０分間インキュベートした。次いで、チューブを４１．５℃の水浴に移し、１５分間インキュベートした後、１０μＬの酵素試薬を添加した。酵素試薬を添加した後、チューブを再び密閉して、５乃至１０秒間水平に手で振盪して、反応混合物の成分を十分に混合した。チューブを４１．５℃の水浴に戻し、さらに６０分間インキュベートして、標的配列の増幅を可能にした。増幅後、チューブを４１．５℃の水浴から取り出し、２分間、氷水浴中に置いた。 Six groups of amplification reaction mixtures were tested in quadruplicate as follows: (i) no extender oligonucleotide, no target (group I); (ii) no extender oligonucleotide, 100 (Iii) containing a copy target (Group II); (iii) containing a blocked extender oligonucleotide and no target (Group III); (iv) containing a blocked extender oligonucleotide and containing 100 copies of a target (Group IV) ); (V) with unblocked extender oligonucleotides and no target (Group V); (iv) with unblocked extender oligonucleotides and 100 copies of target (Group VI). Reaction tubes from group 6 were filled with 30 μL of amplification reagent containing 6 pmol priming oligonucleotide, 4 pmol promoter oligonucleotide and 0.8 pmol stop oligonucleotide. 4 pmol of blocked extender oligonucleotide was added to group III and group IV reaction tubes, and 4 pmol of unblocked extender oligonucleotide was added to group V and group VI reaction tubes. As mentioned above, 100 copies of the target were added to the reaction tubes of Group II, IV and VI, whereas no target was added to the reaction tubes of Group I, III and V. It was. The reaction mixture was overlaid with 200 μL of oil reagent, then the tube was sealed and vortexed for 10 seconds before incubating in a 60 ° C. water bath for 10 minutes. The tube was then transferred to a 41.5 ° C. water bath and incubated for 15 minutes before 10 μL of enzyme reagent was added. After adding the enzyme reagent, the tube was resealed and shaken horizontally by hand for 5-10 seconds to thoroughly mix the components of the reaction mixture. The tube was returned to the 41.5 ° C. water bath and incubated for an additional 60 minutes to allow amplification of the target sequence. After amplification, the tubes were removed from the 41.5 ° C. water bath and placed in an ice water bath for 2 minutes.

ＲＮＡ転写産物の検出は、１００ｆｍｏｌ／反応のホットプローブ及び３００ｐｍｏｌ／反応のコールドプローブを用い、基本的に、実施例２に記載したのと同様にして実施した（反応チューブは手で振盪するのではなくボルテックスした）。平均化した結果を、相対発光量（「ＲＬＵ」）で表９に示したが、これにより、この実験のエクステンダーオリゴヌクレオチドが増幅速度の上昇に寄与したことが分かる。試験した異なる反応条件について表９に示される変動係数値（「％ＣＶ」）は、パーセンテージとしての複製の平均に対するする複製の標準偏差を構成する。 RNA transcripts were detected using 100 fmol / reaction hot probe and 300 pmol / reaction cold probe, basically as described in Example 2 (reaction tube should not be shaken by hand). Vortexed without). The averaged results are shown in Table 9 in terms of relative luminescence (“RLU”), which shows that the extender oligonucleotides in this experiment contributed to the increase in amplification rate. The coefficient of variation value (“% CV”) shown in Table 9 for the different reaction conditions tested constitutes the standard deviation of replication relative to the average of replication as a percentage.

（実施例１３）
ＤＮＡ標的配列の増幅
この実験は、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）内に含まれる標的領域に対する本発明による増幅系の感度を明らかにするために実施した。この実験に用いた例示的なｄｓＤＮＡはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株のｏｒｆＸ遺伝子に由来するクローン化転写物であった。増幅のために、プライミングオリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド、停止オリゴヌクレオチド及びプロモータオリゴヌクレオチドを含ませた。このプライミングオリゴヌクレオチドは標的配列の３’末端内に含まれる配列を標的として配列番号３５の塩基配列を有し、ディスプレーサオリゴヌクレオチドは標的配列に対して５’側の標的配列を含む標的核酸中に存在する配列を標的として配列番号５７の塩基配列 (Example 13)
Amplification of DNA Target Sequence This experiment was performed to demonstrate the sensitivity of the amplification system according to the present invention to a target region contained within double stranded DNA (“dsDNA”). An exemplary dsDNA used in this experiment was a cloned transcript derived from the orfX gene of a methicillin resistant strain of Staphylococcus aureus. For amplification, a priming oligonucleotide, a displacer oligonucleotide, a stop oligonucleotide and a promoter oligonucleotide were included. This priming oligonucleotide has the base sequence of SEQ ID NO: 35 targeting the sequence contained within the 3 ′ end of the target sequence, and the displacer oligonucleotide is contained in the target nucleic acid containing the target sequence 5 ′ to the target sequence. Base sequence of SEQ ID NO: 57 targeting an existing sequence

を有し（配列中、下線を付けた塩基はＬＮＡである）、停止オリゴヌクレオチドは標的領域に対して３’側の標的核酸中に存在する配列を標的として配列番号５８の塩基配列 (The underlined base in the sequence is LNA), and the stop oligonucleotide is a base sequence of SEQ ID NO: 58 targeting a sequence present in the target nucleic acid 3 'to the target region.

を有し（配列中、下線を付けた塩基はＬＮＡである（停止オリゴヌクレオチドは折り畳みを制限するために完全にはＬＮＡで構成されるものではない））、並びに、プロモータオリゴヌクレオチドは配列番号３４ (In the sequence, the underlined base is LNA (stop oligonucleotide is not composed entirely of LNA to limit folding)), and the promoter oligonucleotide is SEQ ID NO: 34

の塩基配列を有した（配列中、下線部分はＴ７プロモータ配列（配列番号３））であり、残りの部分は標的領域の５’末端内に含まれる配列の相補体を標的とするハイブリッド形成配列（配列番号３３）である）。上記のプロモータオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドのいずれにも実施例１に記載した３’−３’結合からなる３’末端ブロッキング部分を含ませた。検出は配列番号５９ (In the sequence, the underlined portion is a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 3)), and the remaining portion is a hybridization sequence that targets the complement of the sequence contained in the 5 ′ end of the target region (SEQ ID NO: 33)). Both the promoter oligonucleotide and stop oligonucleotide described above contained a 3 'end blocking moiety consisting of the 3'-3' linkage described in Example 1. Detection is SEQ ID NO: 59

の塩基配列を有する分子トーチ検出プローブを用いてリアルタイムで実施した。このプローブの塩基配列は２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成され、５’−３’を示す１７番目及び１８番目のヌクレオチドを９−炭素リンカーによって互いに結合させた。この検出プローブは、３’−ＤＡＢＣＹＬＣＰＧ（ＰｒｉｍｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ社、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ；カタログ番号Ｎ−９７５６−１０）及び５’末端に結合させた６−ＦＡＭホスホラミダイト（ＢｉｏＧｅｎｅｘ社、ＳａｎＲａｍｏｎ、ＣＡ；カタログ番号ＢＧＸ−３００８−０１）を用いてＤＡＢＣＹＬ及びＦＡＭの相互作用標識を含むように合成した。また、このプローブは、５^ｐ−３’を示す１７番目と１８番目のヌクレオチドの間に配置した９−炭素リンカー（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；カタログ番号１０−１９０９−９０）をも含むように合成した。合成したプローブはポリアクリルアミドゲル電気泳動及び逆相ＨＰＬＣにより精製した。このプローブの標的結合部分は配列番号３７からなった。 This was carried out in real time using a molecular torch detection probe having the following nucleotide sequence. The base sequence of this probe was composed of 2′-O-methyl ribonucleotide, and the 17th and 18th nucleotides representing 5′-3 ′ were bound to each other by a 9-carbon linker. The detection probe is 3'-DABCYL CPG (Prime Synthesis, Aston, PA; catalog number N-9756-10) and 6-FAM phosphoramidite (BioGenex, San Ramon, CA; coupled to the 5 'end; catalog number BGX-3008-01) was synthesized to include DABCYL and FAM interaction labels. Further, the ^{probe, 5} p -3 17 th showing a 'and 18 th 9 carbon linker disposed between nucleotide (Glen Research Corporation, Sterling, VA; Cat. No. 10-1909-90) include also the Was synthesized. The synthesized probe was purified by polyacrylamide gel electrophoresis and reverse phase HPLC. The target binding portion of this probe consisted of SEQ ID NO: 37.

この実験の増幅反応はコピー数毎に６回反復して実施し、このために、マイクロタイタープレートの１２箇所の試験ウェルの各々に、４４．１ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．８２％（ｗ／ｖ）のトレハロース、３０．６ｍＭのＭｇＣｌ_２、３３ｍＭのＫＣｌ、０．３％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０２％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、９．４１ｍＭのｒＡＴＰ、１．８ｍＭのｒＣＴＰ、１．１８ｒＧＴＰ、１．８ｍＭのＵＴＰ、０．４７ｍＭのｄＡＴＰ、０．４７ｍＭのｄＣＴＰ、０．４７ｍＭのｄＧＴＰ、０．４７ｍＭのｄＴＴＰ、１５ｐｍｏｌのプライミングオリゴヌクレオチド、８ｐｍｏｌのディスプレーサオリゴヌクレオチド及び０．５ｐｍｏｌの停止オリゴヌクレオチドをｐＨ７．７で含む３０μＬの増幅試薬を供給した。また、各ウェルには０、１０、１００、１，０００又は１０，０００コピーの上記転写物も添加した。プレートはシーリングカードで覆い、ＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯｐｔｉｃｏｎ（登録商標）２Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ；カタログ番号ＣＦＤ３２２０）相当品中で９５℃で１０分間インキュベートして二本鎖転写物を変性させ、次いで４２℃で５分間インキュベートして標的核酸と、プライミングオリゴヌクレオチド、ディスプレーサオリゴヌクレオチド及び停止オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を促進させた。インキュベーション後、プレートを上記検出系から取り出し、各試験ウェルに１０μＬの酵素試薬を添加して増幅を開始させた。この酵素試薬は、５８ｍＭのＨＥＰＥＳ、３．０３％（ｗ／ｖ）のトレハロース、５０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、１．０４ｍＭのＥＤＴＡ、１２０ｍＭのＫＣｌ、１０％（ｗ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１５ｐｍｏｌのプロモータオリゴヌクレオチド、８ｐｍｏｌの検出プローブ、３６０ＲＴＵ／μＬのＭＭＬＶ逆転写酵素（「ＲＴ」）及び８０Ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼをｐＨ７．０で含み、１ＲＴＵのＲＴ活性は３７℃２０分間で基質中に１ｎｍｏｌのｄＴを組込み、１ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ活性は３７℃２０分間で５ｆｍｏｌのＲＮＡ転写物を精製させる。酵素添加後、上記ブレートを予め４４℃に加温したＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒＲ（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ；カタログ番号５３５５２９７１６）上に置き、シーリングカードで覆って１，４００ｒｐｍで３０秒間攪拌した。このプレートを４２℃検出系に戻し、そこでリアルタイムで１００分間、増幅反応を観察し、２４秒毎に蛍光値を測定した。検出は、増幅産物とハイブリッド形成したプローブの構造変化に依存し、これにより検出可能な蛍光シグナルの発生がもたらされる。 The amplification reaction of this experiment was performed 6 times per copy number, for this reason, 44.1 mM HEPES, 2.82% (w / v) in each of the 12 test wells of the microtiter plate. trehalose, MgCl _2, 33 mM of KCl, 30.6 mm, ethanol 0.3% (v / v), methyl paraben 0.1% (w / v), 0.02% (w / v) propyl paraben, 9.41 mM rATP, 1.8 mM rCTP, 1.18 rGTP, 1.8 mM UTP, 0.47 mM dATP, 0.47 mM dCTP, 0.47 mM dGTP, 0.47 mM dTTP, 15 pmol priming oligo 3 containing nucleotide, 8 pmol displacer oligonucleotide and 0.5 pmol stop oligonucleotide at pH 7.7 It was fed amplification reagent [mu] L. Each well also received 0, 10, 100, 1,000 or 10,000 copies of the transcript. Cover the plate with a sealing card and incubate at 95 ° C. for 10 minutes in a DNA Engine Opticon® 2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA; catalog number CFD3220). The strand transcript was denatured and then incubated at 42 ° C. for 5 minutes to promote hybridization of the target nucleic acid with the priming, displacer and stop oligonucleotides. After incubation, the plate was removed from the detection system and 10 μL of enzyme reagent was added to each test well to initiate amplification. This enzyme reagent consists of 58 mM HEPES, 3.03% (w / v) trehalose, 50 mM N-acetyl-L-cysteine, 1.04 mM EDTA, 120 mM KCl, 10% (w / v) TRITON. ® X-100, 20% (v / v) glycerol, 15 pmol promoter oligonucleotide, 8 pmol detection probe, 360 RTU / μL MMLV reverse transcriptase (“RT”) and 80 U / μL T7 RNA polymerase 1 RTU RT activity incorporates 1 nmol of dT into the substrate at 37 ° C. for 20 minutes, and 1 U T7 RNA polymerase activity purifies 5 fmol RNA transcript at 37 ° C. for 20 minutes. After the addition of the enzyme, the plate was placed on a Thermomixer R (Eppendorf North America, Westbury, NY; catalog number 5355 29716) preheated to 44 ° C., covered with a sealing card, and stirred at 1,400 rpm for 30 seconds. The plate was returned to the 42 ° C. detection system, where the amplification reaction was observed for 100 minutes in real time, and the fluorescence value was measured every 24 seconds. Detection relies on structural changes in the probe hybridized with the amplification product, which results in the generation of a detectable fluorescent signal.

この実験の結果を図８のグラフに示した。図では、分単位の時間をｘ軸にプロットし、相対蛍光シグナルをｙ軸にプロットした。これらのデータから、この増幅系は少なくとも１０００コピーの転写物の感度を有したことが分かる。対照サンプルでは検出可能な増幅が全く認められなかった（転写物０）。
（実施例１４）
ＤＮＡ標的配列を増幅させるための系の比較
二本鎖ＤＮＡ内に含まれる標的領域に対する本発明の各種関連増幅系の感度を比較するために一連の実験を実施した。実施例１３と同様に、この実験に用いた例示的標的核酸はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性株のｏｒｆＸ遺伝子に由来するクローン化転写物であった。この実験に用いたプライミングオリゴヌクレオチドは配列番号３６の塩基配列を有した。残りのオリゴヌクレオチドは実施例１３のものと同じであった。最初の実験を除き、各実験では、実施例１３の以下の構成要素のうちの１種を除外した：（ｉ）停止オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）ディスプレーサオリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）プライミングオリゴヌクレオチド；及び（ｉｖ）二本鎖標的を変性させるための加熱。これらの実験は、実施例１３の一般プロトコルに従い、１２回反復して実施した。
各組の複製物は０又は１０００コピーの転写物を含んだ。 The results of this experiment are shown in the graph of FIG. In the figure, time in minutes is plotted on the x-axis and relative fluorescence signal is plotted on the y-axis. From these data it can be seen that this amplification system had a sensitivity of transcripts of at least 1000 copies. There was no detectable amplification in the control sample (transcript 0).
(Example 14)
Comparison of systems for amplifying DNA target sequences A series of experiments were performed to compare the sensitivity of the various related amplification systems of the present invention to target regions contained within double stranded DNA. Similar to Example 13, the exemplary target nucleic acid used in this experiment was a cloned transcript derived from the orfX gene of a methicillin resistant strain of Staphylococcus aureus. The priming oligonucleotide used in this experiment had the base sequence of SEQ ID NO: 36. The remaining oligonucleotides were the same as in Example 13. Except for the first experiment, each experiment excluded one of the following components of Example 13: (i) a stop oligonucleotide; (ii) a displacer oligonucleotide; (iii) a priming oligonucleotide; iv) Heat to denature the double stranded target. These experiments were performed 12 times according to the general protocol of Example 13.
Each set of replicates contained 0 or 1000 copies of the transcript.

この実験の結果は図９Ａ乃至図９Ｅにグラフで示した。この場合も図中、分単位の時間をｘ軸にプロットし、相対蛍光シグナルをｙ軸にプロットした。 The results of this experiment are shown graphically in FIGS. 9A-9E. Again, in the figure, the time in minutes was plotted on the x-axis and the relative fluorescence signal was plotted on the y-axis.

これらの実験の結果から以下のことが分かる：（ｉ）標的を含む複製物は全て、増幅系が改変されなかった場合、ポジティブであった（図９Ａ参照）；（ｉｉ）標的を含む複製物は全て、反応混合物から停止オリゴヌクレオチドが除外された場合、ポジティブであった（図９Ｂ参照）；（ｉｉｉ）標的を含む１２の複製物のうちの４つは、反応混合物からディスプレーサオリゴヌクレオチドが除外された場合、ポジティブであった（図９Ｃ参照）；（ｉｖ）標的を含む１２の複製物のうち３つは、反応混合物からプライミングオリゴヌクレオチドが除外された場合、ポジティブであった（図９Ｄ参照）；及び（ｖ）標的を含む１２の複製物のうち４つは、二本鎖標的が、酵素添加の前に熱変性条件（即ち、９５℃加熱工程）に曝されない場合、ポジティブであった（図９Ｅ参照）。対照サンプルでは検出可能な増幅が全く認められなかった（転写物０）。 The results of these experiments show that: (i) all replicas containing the target were positive when the amplification system was not modified (see FIG. 9A); (ii) the replica containing the target. Were all positive when the stop oligonucleotide was excluded from the reaction mixture (see FIG. 9B); (iii) 4 of the 12 replicates containing the target excluded the displacer oligonucleotide from the reaction mixture Was positive (see FIG. 9C); (iv) 3 of the 12 replicates containing the target were positive when the priming oligonucleotide was excluded from the reaction mixture (see FIG. 9D). ); And (v) 4 out of 12 replicas containing the target when the double-stranded target is not exposed to heat denaturing conditions (ie, 95 ° C. heating step) prior to enzyme addition. Were positive (see Fig. 9E). There was no detectable amplification in the control sample (transcript 0).

本発明を特定の好ましい実施態様に関してかなり詳細に説明し、明らかにしてきたが、その他の実施態様についても当業者であれば容易に理解されよう。従って、本発明は、下記に添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる全ての変更態様を含むと判断される。 Although the present invention has been described and elucidated in considerable detail with reference to certain preferred embodiments, other embodiments will be readily apparent to those skilled in the art. Accordingly, the present invention is deemed to include all modifications encompassed within the spirit and scope of the following appended claims.

Claims

A method of synthesizing multiple copies of a target sequence, the method comprising:
Treating a target nucleic acid comprising a DNA target sequence with a priming oligonucleotide that hybridizes to the 3 ′ end of the target sequence such that a primer extension reaction can be initiated therefrom;
A step of obtaining a first DNA primer extension product by extending the priming oligonucleotide in a primer extension reaction using a DNA polymerase, wherein at least a part of the first primer extension product is complementary to the target sequence; A process;
Treating the first primer extension product with a promoter oligonucleotide comprising first and second regions, wherein the first region corresponds to a region at the 5 ′ end of the target sequence, and The base region comprising a base sequence that hybridizes with the first primer extension product to form a promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid, and the second region comprises the first sequence for RNA polymerase; A promoter that is 5 ′ to the region of the promoter, wherein the promoter oligonucleotide is modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom;
A plurality of complements to at least a portion of the first primer extension product from the promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid using RNA polymerase that recognizes the promoter and initiates transcription therefrom; Transcribing a first RNA product, wherein the base sequence of the first RNA product is such that when the first primer extension product has a defined 3 ′ end, the method comprises the target Further comprising treating the target nucleic acid with a binding molecule that binds to the target nucleic acid adjacent to or near the 5 ′ end of the sequence, and wherein the priming oligonucleotide hybridizes with the target nucleic acid. It does not contain RNA regions that are formed and selectively degraded by enzymatic activity when hybridized with the target nucleic acid. As a condition, it is assumed that the base sequence substantially identical to the target sequence, the method comprising the steps.

2. The method of claim 1 wherein any oligonucleotide subjected to the method comprising a promoter for RNA polymerase is modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom.

The method of claim 1 or 2, wherein the activity of the DNA polymerase in the method is substantially limited to the formation of the first primer extension product.

The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the priming oligonucleotide comprises deoxynucleotides and / or analogs thereof.

5. A method according to any one of claims 1 to 4 wherein the promoter oligonucleotide is modified to include a blocking moiety located at its 3 'end.

The blocking portion of the promoter oligonucleotide is a modified nucleotide, a nucleotide or nucleotide sequence having a 3 ′ to 5 ′ orientation, a 3 ′ alkyl group, a 3′2′-dideoxynucleotide, a 3 ′ cordycepin, a 3 ′ alkane-diol residue 6. The method of claim 5, comprising a substituent selected from the group consisting of a group, a 3 'non-nucleotide moiety, a nucleotide sequence that is non-complementary to the target sequence, a nucleic acid binding protein, and mixtures thereof.

The promoter oligonucleotide further comprises an insert sequence disposed between or adjacent to the first and second regions, and the presence of the insert sequence in the promoter oligonucleotide results in The method according to claim 1, wherein the formation rate is increased.

8. The method of claim 1, further comprising exposing the double-stranded complex containing the target nucleic acid to conditions sufficient to denature the complex before extending the priming oligonucleotide in a primer extension reaction. 2. The method according to item 1.

The method of claim 8, wherein the conditions comprise heating.

Before the target nucleic acid takes the form of a double-stranded complex and the method extends the priming oligonucleotide in a primer extension reaction, the complex is subjected to conditions sufficient to denature the complex. 8. A method according to any one of claims 1 to 7 which does not include exposure.

Treating the first RNA product with the priming oligonucleotide to form a priming oligonucleotide: first RNA product hybrid such that a primer extension reaction can be initiated from the priming oligonucleotide;
In the primer extension reaction using the DNA polymerase, the priming oligonucleotide is extended to obtain a second DNA primer extension product that is complementary to the first RNA product, and the second primer extension product is the first primer extension product. Having a 3 ′ end complementary to the 5 ′ end of one RNA product;
Separating the second primer extension product from the first RNA product using an enzyme that selectively degrades the first RNA product;
Treating the second primer extension product with the promoter oligonucleotide to form a promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid;
Adding a sequence complementary to the second region of the promoter oligonucleotide by extending the 3 ′ end of the second primer extension product in the promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid. ;as well as,
From the promoter oligonucleotide: second primer extension product hybrid, the RNA polymerase is used to transcribe a plurality of second RNA products complementary to the second primer extension product, and the second RNA product The base sequence is substantially the same as the base sequence of the target sequence,
The method according to claim 1, further comprising:

12. The method of claim 11, wherein the priming oligonucleotide is extended using a reverse transcriptase having RNAse H activity.

The method according to claim 11, wherein the enzyme has RNAse H activity and the enzyme is an enzyme other than reverse transcriptase.

Treating the target nucleic acid with a displacer oligonucleotide that allows a primer extension reaction to be initiated therefrom by forming a hybrid with the target nucleic acid upstream from the priming oligonucleotide, and a primer using the DNA polymerase 14. The method according to any one of claims 1 to 13, further comprising a step of obtaining a third DNA primer extension product that displaces the first primer extension product from a target nucleic acid by extending the displacer oligonucleotide in an extension reaction. The method described.

15. The method of claim 14, wherein the activity of the DNA polymerase in the method is substantially limited to the formation of the first, second and / or third primer extension products.

The 5 ′ region of the displacer oligonucleotide comprises one or more modifications to increase the binding affinity of the displacer oligonucleotide to the target nucleic acid, and the modification prevents extension in the primer extension reaction of the displacer oligonucleotide 16. A method according to claim 14 or 15 wherein there is no.

17. The method of claim 16, wherein the modification is spaced at least 15 bases from the 3 'end of the displacer oligonucleotide.

The method according to claim 16 or 17, wherein the modification is LNA.

19. The displacer oligonucleotide hybridizes with the target nucleic acid such that the 3 'terminal base of the displacer oligonucleotide is adjacent to the 5' terminal base of the priming oligonucleotide. the method of.

19. The displacer oligonucleotide hybridizes with the target nucleic acid such that the 3 ′ terminal base of the displacer oligonucleotide is 5 to 35 bases away from the 5 ′ terminal base of the priming oligonucleotide. The method according to item.

21. The method of any one of claims 14 to 20, wherein the target nucleic acid is treated with the priming oligonucleotide prior to treating the target nucleic acid with the displacer oligonucleotide.

22. A method according to any one of claims 14 to 21, wherein the first primer extension product is formed prior to treating the target nucleic acid with the displacer oligonucleotide.

The method according to any one of claims 14 to 21, wherein the target nucleic acid is treated with the priming oligonucleotide and the displacer oligonucleotide before allowing a DNA polymerase to act on the target nucleic acid.

Treating at least one 3 ′ end of the priming oligonucleotide and the displacer oligonucleotide with one or more caps, wherein each cap is at least 3 bases at the 3 ′ end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide; Complementary base regions shall be included, the 5 ′ terminal base of each cap shall be complementary to the 3 ′ terminal base of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide, and each cap shall 24. The method according to any one of claims 14 to 23, further comprising the step of being modified such that initiation of DNA synthesis from is blocked.

25. The method of claim 24, wherein each cap is complementary to no more than 8 bases at the 3 'end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide.

Non-specific hybridization between the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide and the promoter oligonucleotide when each of the caps hybridizes with the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide 26. A method according to claim 24 or 25, wherein

27. A method according to any one of claims 24 to 26, wherein each cap is a capping oligonucleotide modified to include a blocking moiety located at its 3 'end.

At least one 3 ′ end of the cap is covalently linked to the 5 ′ end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide, and the at least one cap is connected to the 3 ′ end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide; 28. A method according to any one of claims 24 to 27, wherein a loop is formed to form a hybrid.

30. The method of claim 28, wherein the at least one cap is attached to the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide via a linker region.

30. The method of claim 29, wherein the linker region comprises at least 5 nucleotides.

30. The method of claim 29, wherein the linker region comprises at least 5 abasic nucleotides.

Treating the target nucleic acid with the binding molecule and the second of the promoter oligonucleotide by extending the 3 ′ end of the first primer extension product in the promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid. 32. The method according to any one of claims 1 to 31, further comprising the step of adding a sequence complementary to the region.

35. The method of claim 32, wherein the binding molecule comprises an oligonucleotide having a blocking moiety located at its 3 'end to prevent initiation of DNA synthesis therefrom.

34. The method of claim 32 or 33, wherein the binding molecule comprises LNA.

35. A method according to any one of claims 32 to 34, wherein the binding molecule is a stop oligonucleotide.

36. The method of any one of claims 32 to 35, wherein the 5 'end of the stop oligonucleotide is complementary to at least two bases of the 5' end of the first region of the promoter oligonucleotide.

36. The stop oligonucleotide according to any one of claims 32 to 35, wherein the 5 ′ end of the stop oligonucleotide is complementary to at least 3 of the 5 ′ end of the first region of the promoter oligonucleotide and no more than 10 bases. The method described in 1.

35. A method according to any one of claims 32 to 34, wherein the binding molecule is a modified oligonucleotide.

40. The method of claim 38, wherein the modified oligonucleotide is a digested oligonucleotide.

Treating the first primer extension product with an extender oligonucleotide, wherein the extender oligonucleotide is 3 ′ to the first primer extension relative to the promoter oligonucleotide of the promoter oligonucleotide: first primer extension product hybrid; 40. The method of any one of claims 1-39, further comprising the step of forming a hybrid with a region of the product, resulting in an extender oligonucleotide: first primer extension product hybrid.

41. The method of claim 40, wherein the extender oligonucleotide further comprises a blocking moiety located at its 3 'end to prevent initiation of DNA synthesis therefrom.

The extender oligonucleotide hybridizes with the first primer extension product such that the 5 'end of the extender oligonucleotide is spaced within 3 nucleotides of the 3' terminal base of the promoter oligonucleotide. 40. The method according to 40 or 41.

42. The method of claim 40 or 41, wherein the extender oligonucleotide hybridizes with the first primer extension product adjacent to the promoter oligonucleotide.

44. The method of any one of claims 1-43, further comprising measuring the presence or amount of the multiple copies of the target sequence.

45. The method of claim 44, wherein the presence or amount of the multiple copies of the target sequence is measured using a detection probe having a detectable label.

46. The method of claim 45, wherein the presence or amount of the multiple copies of the target sequence is measured after transcription of the first RNA product.

46. The method of claim 45, wherein the presence or amount of the multiple copies of the target sequence is measured when the first RNA product is being transcribed.

48. The method of claim 47, wherein the probe is a self-hybridizing probe and comprises a pair of interacting labels.

49. A method according to any one of claims 1 to 48, wherein the method is carried out at a substantially constant temperature.

A kit for use in amplifying a DNA target sequence, the priming oligonucleotide hybridizing so that a primer extension reaction can be initiated therefrom to the 3 ′ end of the DNA target sequence; A promoter oligonucleotide comprising a second region, wherein the first region corresponds to the region at the 5 ′ end of the target sequence and hybridizes with the 3 ′ region of the DNA primer extension product comprising the priming oligonucleotide. The second region is a promoter for RNA polymerase, is located 5 'to the first region, and the promoter oligonucleotide is Any oligonucleotides included in the kit, including a promoter for RNA polymerase The tide is also modified to prevent initiation of DNA synthesis therefrom, provided that the kit does not contain a restriction endonuclease, and the priming oligonucleotide is hybridized to the target nucleic acid. Modified to prevent the initiation of DNA synthesis on the condition that it does not contain an RNA region that is selectively degraded by enzyme activity when it is hybridized with the target nucleic acid Kit to be done.

51. The kit of claim 50, wherein the priming oligonucleotide consists of deoxynucleotides and / or analogs thereof.

52. The kit of claim 50 or 51, wherein the promoter oligonucleotide is modified to include a blocking moiety located at its 3 'end.

The blocking portion of the promoter oligonucleotide is a modified nucleotide, a nucleotide or nucleotide sequence having a 3 ′ to 5 ′ orientation, a 3 ′ alkyl group, a 3′2′-dideoxynucleotide, a 3 ′ cordycepin, a 3 ′ alkane-diol residue 53. The kit of claim 52, comprising a substituent selected from the group consisting of a group, a 3 ′ non-nucleotide portion, a nucleotide sequence non-complementary to the target sequence, a nucleic acid binding protein, and mixtures thereof.

The promoter oligonucleotide further comprises an insert sequence disposed between or adjacent to the first and second regions, and the presence of the insert sequence in the promoter oligonucleotide results in 54. Kit according to any one of claims 50 to 53, wherein the formation rate is increased.

55. The kit according to any one of claims 50 to 54, further comprising a chemical denaturant for making the double-stranded DNA complex into a single strand.

56. The kit according to any one of claims 50 to 55, further comprising a reverse transcriptase having RNAse H activity, wherein the kit does not contain an enzyme other than the reverse transcriptase having RNAse H activity.

56. The kit according to any one of claims 50 to 55, further comprising an enzyme other than reverse transcriptase having RNAse H activity.

58. The displacer oligonucleotide according to any one of claims 50 to 57, further comprising a displacer oligonucleotide from which a primer extension reaction can be initiated by hybridizing with a target nucleic acid comprising the target sequence upstream from the priming oligonucleotide. kit.

The 5 ′ region of the displacer oligonucleotide comprises one or more modifications to increase the binding affinity of the displacer oligonucleotide to the target nucleic acid, and the modification comprises an extension in the primer extension reaction of the displacer oligonucleotide. 59. The kit of claim 58, wherein the kit is not hindered.

60. The kit of claim 59, wherein the modification is spaced at least 15 bases from the 3 'end of the displacer oligonucleotide.

The kit according to claim 59 or 60, wherein the modification is LNA.

62. The displacer oligonucleotide hybridizes to the target nucleic acid such that the 3 ′ terminal base of the displacer oligonucleotide is adjacent to the 5 ′ terminal base of the priming oligonucleotide. Kit.

62. The displacer oligonucleotide hybridizes with the target nucleic acid such that the 3 ′ terminal base of the displacer oligonucleotide is 5 to 35 bases away from the 5 ′ terminal base of the priming oligonucleotide. Kit according to item.

At least one of the priming oligonucleotide and the displacer oligonucleotide comprises a cap hybridized with its 3 ′ end, the cap being at least 3 bases at the 3 ′ end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide A base region complementary to the cap, the 5 ′ terminal base of the cap being complementary to the 3 ′ terminal base of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide, and the cap therefrom 64. The kit according to any one of claims 58 to 63, which is modified so as to prevent initiation of DNA synthesis.

65. The kit of claim 64, wherein the cap is complementary to no more than 8 bases at the 3 'end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide.

The cap provides non-specific hybridization between the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide and the promoter oligonucleotide when each cap hybridizes with the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide. 66. A kit according to claim 64 or 65, which inhibits.

67. A kit according to any one of claims 64 to 66, wherein the cap is a capping oligonucleotide modified to include a blocking moiety located at its 3 'end.

The 3 ′ end of the cap is covalently bonded to the 5 ′ end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide, and the cap forms a loop with the 3 ′ end of the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide. 68. The kit according to any one of claims 64 to 67, wherein the kit is formed.

69. The kit of claim 68, wherein the cap is attached to the priming oligonucleotide or the displacer oligonucleotide via a linker region.

70. The kit of claim 69, wherein the linker region comprises at least 5 nucleotides.

70. The kit of claim 69, wherein the linker region comprises at least 5 abasic nucleotides.

72. The kit according to any one of claims 50 to 71, further comprising a binding molecule that binds to a target nucleic acid comprising the target sequence adjacent to or near the 5 'end of the target sequence.

75. The kit of claim 72, wherein the binding molecule comprises an oligonucleotide having a blocking moiety located at its 3 'end to prevent initiation of DNA synthesis therefrom.

74. A kit according to claim 72 or 73, wherein the binding molecule comprises LNA.

The kit according to any one of claims 72 to 74, wherein the binding molecule is a stop oligonucleotide.

76. The kit of claim 75, wherein the 5 'end of the stop oligonucleotide is complementary to at least 2 bases of the 5' end of the first region of the promoter oligonucleotide.

76. The kit of claim 75, wherein the 5 'end of the stop oligonucleotide is complementary to at least 3 of the 5' end of the first region of the promoter oligonucleotide and no more than 10 bases.

75. The kit according to any one of claims 72 to 74, wherein the binding molecule is a modified oligonucleotide.

79. The kit of claim 78, wherein the modified oligonucleotide is a digested oligonucleotide.

Extender oligonucleotide that hybridizes with the region of the primer extension product 3 'to the promoter oligonucleotide of the promoter oligonucleotide: primer extension product hybrid so that an extender oligonucleotide: primer extension product hybrid is formed 80. The kit according to any one of claims 50 to 79, further comprising:

81. The kit of claim 80, wherein the extender oligonucleotide further comprises a blocking moiety located at its 3 'end to prevent initiation of DNA synthesis therefrom.

81. The extender oligonucleotide hybridizes with the primer extension product such that the 5 ′ terminal base of the extender oligonucleotide is spaced within 3 nucleotides of the 3 ′ terminal base of the promoter oligonucleotide. 81. The kit according to 81.

82. The kit of claim 80 or 81, wherein the extender oligonucleotide hybridizes with the primer extension product adjacent to the promoter oligonucleotide.

84. The kit according to any one of claims 50 to 83, further comprising a detection probe that forms a hybrid with the target sequence.

The kit of claim 84, wherein the detection probe comprises a detectable label.

85. The kit of claim 84, wherein the probe is a self-hybridizing probe having a pair of interaction labels.