JP2010510252A - キレート剤を用いるイメージング法 - Google Patents

Abstract

放射性同位体を含むキレート剤とカップリングした、標的脂質／界面活性剤でコーティングされたナノ粒子のエマルションを用いて、腫瘍と関連する新生血管系を撮像するための方法を記載する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２００６年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８６０，５４６号からの優先権を主張する。この文書の内容は参照により全体が本明細書に援用される。

連邦政府により支援を受けた研究のもとでなされた発明に対する権利の明示
この研究は米国政府からの助成金により一部援助を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。

本発明は、脂質／界面活性剤でコーティングされたナノ粒子またはリポソームを用いる組成物において放射性同位体または常磁性イオンを送達するためのキレート剤に関する。特に、本発明は脂質または疎水性部分とスペーサーを介してカップリングした窒素含有環系に基づくキレートリガンド、および腫瘍新生血管系を撮像するための方法を提供する。

血管新生はそれ自体、正常な組織成長、発生、および創傷治癒において広範囲にみられるプロセスであり、また糖尿病性網膜症、炎症性疾患および癌をはじめとする多くの病状の中心的な特徴でもある。ヘテロ二量体膜貫通糖タンパク質であるα_ｖβ_３−インテグリンは、特異的なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）結合部位を介して、ビトロネクチン、オステオポンチン、フィブリノゲン、フォン・ヴィレブランド因子、および変性コラーゲンを含むいくつかの細胞外マトリックスタンパク質リガンドへの細胞の接着を仲介する。α_ｖβ_３−インテグリンは内皮細胞、マクロファージ、血小板、リンパ球、平滑筋細胞、および腫瘍細胞を含む広範囲の細胞型により発現される。血管新生に必須ではないが、増殖内皮細胞と静止内皮細胞におけるα_ｖβ_３−インテグリンの発現上昇の差は、新生血管バイオマーカーとして、ならびに分子イメージングおよび腫瘍の抗血管新生療法の魅力的な標的として使用されることが多い。

血管新生は浸潤性原発性腫瘍および転移の顕著な特徴であり、その理由はおそらく腫瘍の宿主の免疫学的監視からの回避が、増殖する新生血管系と相関し、ＩＣＡＭ−１などの炎症マーカーの内皮発現の減少に起因するためである。内皮アネルギーが認知されたことにより腫瘍新生血管系と宿主免疫応答性との間の関連についてさらなる研究が促され、血管形成を抑制し、他の免疫機構促進剤またはワクチンと組み合わせて宿主免疫反応を再構成する治療法の模索が進められてきた。インテグリン自体ではなく、血管形成の微小解剖学的構造を特異的に検出することにより、浸潤性腫瘍と関連するマーカーおよび減少した宿主免疫応答性が得られ、これらは戦略的な医学的判断の考慮に入れられるべきものである。

したがって、腫瘍新生血管系または血管新生を特異的に撮像できることは、治療の特性を決定する上で重要である。

キレートリガンドは、通常、診断および治療用途において、磁気共鳴映像法における造影剤としての常磁性イオンまたはイメージングおよび治療のための放射性同位体の送達に用いられる。有機分子と複合したキレート剤を、診断または治療対象の組織または臓器と特異的に結合する粒子送達系および／または標的化部分とさらに結合させることができる。多くのキレートリガンドが知られており、複数のこのようなリガンドは、例えば国際公開第２００３／０６２１９８号に記載されており、この特許にはキレート剤一般についての極めて包括的な式が記載されている。この公報は、α_ｖβ_３標的化ペプチド模倣物についても記載している。例示的実施形態において、１つのこのようなペプチド模倣物はスペーサーを介してリン脂質とカップリングし、脂質／界面活性剤でコーティングされたパーフルオロカーボンナノ粒子と結合している。上記公報に例示されているものを含むさらに一般的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；およびテトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）ならびにこれらの誘導体が挙げられる。これらのキレート剤は、米国特許第５，６５２，３５１号；同第５，７５６，６０５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，３５８，７０４号；同第４，８８５，３６３号；およびいくつか他のものに記載されているような架橋基を用いてさらなる部分と結合している。加えて、リンカーを介してキレート剤を特定のリン脂質と結合させることは、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２２５７号およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１９，９６６号に記載されている。これらの出願においても、リン脂質と脂質／界面活性剤でコーティングされたナノ粒子との結合が記載されている。

α_ｖβ_３−常磁性ナノ粒子を用いた、新生血管に富んだ病変の特異的な高分解能イメージングが多くのインビボの研究で説明されてきたが、磁気共鳴分子イメージング技術には、コイル配置のため、イメージング視野の位置決めのため、ならびに適切なパルスシーケンスおよびゲーティングパラメータを選択するために、病変の場所の情報が必要とされる。したがって、本発明はこの情報をもたらす、腫瘍新生血管系の位置を特定するための高感度・低分解能法を想定している。

本発明は、放射性同位体または常磁性金属イオンを、脂質／界面活性剤により囲まれた粒子状担体と結合させることにより標的組織に送達するために特に有用なキレート剤に関する。ビスピリジルリシンおよびヒスチジルリシンを含むいくつかのキレート剤そのものが知られている。これらの薬剤を含む組成物は、下記のように、診断および治療用途に特に有用である。

本発明のキレート系は、脂質／界面活性剤コーティングを含むナノ粒子エマルションと結合した際インビボで送達可能であるように設計され、これに関連して配合される場合に放射性同位体または常磁性イオンをキレート化する点で特に有効である。以下でさらに詳細に記載するように、本発明の分子のキレート部分は、これに関連して提示される場合、放射性同位体または常磁性イオンの封鎖において、別のキレート剤よりも優れている。これらの薬剤を利用することで、正常な組織と関連する新生血管系に対して腫瘍と関連する新生血管系を特に効果的にイメージングすることが可能になり、腫瘍の高解像度・低感度画像と組み合わせることができる。本発明のキレート剤を含む粒子を含有する放射性・高感度・低分解能製剤は、送達系の粒子特性のために、腫瘍新生血管系に対して比較的特異的である。製剤自体によりもたらされた生体内分布は、腫瘍中への侵入、および非内皮細胞、即ち新生血管系の特徴をもたない細胞上に発現したインテグリンとの相互作用を回避させ、さらに血管が本質的に正常である筋肉における粒子の蓄積も回避させる。蓄積により、腫瘍新生血管系の領域を特定することができ、これによりＳＰＥＣＴ−ＣＴなどの高分解能システムを用いてさらに撮像することができる。

したがって、一態様において、本発明は、腫瘍と関連する血管形成の位置を正常組織における血管形成と異なるものとして同定する方法における、α_ｖβ_３を標的とし、キレート化放射性同位体を含むナノ粒子のエマルションの使用に関し、この方法は、
α_ｖβ_３を標的とする、キレート化放射性同位体を含むナノ粒子のエマルションを、腫瘍を有する対象に投与し、新生血管系の高感度・低分解能画像を得ることと；
任意で、その後、前記腫瘍における新生血管系の高分解能・低感度画像を得ること、を含む。

別の態様において、本発明は、本発明の方法において特に有用なキレート剤であって、式（１）で表わされるものに関する。

（式中、各Ｘは、独立してＣＲ^１またはＮであり；
各Ｒ^１は、独立してＨまたは低級アルキルであり；
各Ｒ^２は、独立してハロゲン、アルキル（１〜６Ｃ）、アルケニル（２〜６Ｃ）、またはアルキニル（２〜６Ｃ）であり；
ｎは、０、１、または２であり；
スペーサー^１は、４個以上の炭素を有するアルキレンまたはアルケニレン鎖であり；
スペーサー^２は、存在する場合、スペーサー^１を脂質部分に結合させ、親水性の必要に応じて置換されていてもよいアルキレン鎖であり、ここで、１つ以上のＣがＮまたはＯで置換されていてもよく、前記鎖はＯＲ、ＮＲ_２、＝Ｏ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、および／またはＮＲＣＯＲのうちの１つ以上で置換されていてもよい、ここで各Ｒは独立してＨまたは低級アルキルである；
ｍは、０または１であり；
脂質は、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質またはステロイドを表す）

本発明の方法および他の状況において用いられる場合、式（１）の化合物は金属イオン、特に放射性同位体、例えば^１１１Ｉｎまたは^９９ｍＴｃをキレート化する。

他の態様において、本発明はインビボ投与に適した粒子状キャリアを含む組成物に関し、ここで、粒子状キャリアは、その層中に埋め込まれた式（１）の化合物を各粒子上に複数含む外側脂質／界面活性剤層でコーティングされているか、または他の方法で外側脂質／界面活性剤層が支持されている。この粒子は標的リガンドとさらに結合することができる。

他の態様において、本発明は磁気共鳴画像、放射性同位体により得られる画像を得、本発明の組成物を用いて放射性同位体が介在する治療を施す方法に関する。

図１Ａ−図１Ｄは、放射性同位体を本発明の組成物として投与した場合の腫瘍の対筋肉カウント比を表すグラフである。図１Ａおよび図１Ｂは、標的化ナノ粒子を含む組成物の用量を比較したものである。図１Ｃは、標的化および非標的化ナノ粒子エマルションを用い、等しい用量で得られた結果を比較したものである。図１Ｄは、放射性同位体を含む標的化粒子の、放射性同位体を含まない標的化ナノ粒子との競合を示す。 図２Ａ−図２Ｆは、ウサギの後四半部の様々なトモグラフィーＣＴ画像を示し、ここで、動物は本発明の組成物をあらかじめ投与され、または投与されていない。図２Ａ−図２Ｃは、それぞれウサギの後四半部のトモグラフィーＣＴ画像から軸方向、矢状および冠状に再構成したものを示し、本発明の組成物が投与されていない膝窩内の脚、骨、および結節腫瘤が明らかである。膝窩内の組織は、この領域に常に比較的顕著なリンパ節が付随しているため、腫瘍とリンパ節のいずれであるのか識別できない。図２Ｄ−図２Ｆは、２Ａ〜２Ｃの画像に相当する画像を示し、減衰補正されたＳＰＥＣＴ画像と組み合わせて、正常なリンパ節よりも上方に位置する約１ｃｍの組織塊と関連する^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３標的化ナノ粒子シグナルからの新生血管シグナルの存在を、容易に識別することができる。増加した核シグナルを示す他の領域は成長する骨および睾丸と関連し、これらはすべて左右対称に認められる。骨盤のシグナルは、^９９ｍＴｃの膀胱中への排出を反映している。高解像度ＣＴ画像と合わせた高感度分子イメージングの組み合わせは、生理的血管新生または血管系として予想される発生源と、新生血管系の病的な発生源の識別を容易に促進する。 図３Ａおよび図３Ｂは、図１Ａ−１Ｄと類似した結果を示しているが、^１１１Ｉｎをテクニシウムと置換したものである。

本発明は、脂質／界面活性剤コーティングを有し、平均粒径が約１００〜５００ナノメートル、好ましくは３００ナノメートル前後の粒度範囲であるナノ粒子とキレート部分を結合した時に、放射性同位体を捕捉することができる特定の粒子状キレート部分の能力を利用する。これにより、腫瘍新生血管系への選択的送達が可能になり、腫瘍に特異的に関連する微小血管系の高解像度イメージングの局限化が可能になる。粒子状システムを用いた送達により付与される特異性により、正常組織におけるあらゆる血管新生、および新生血管系自体に関連しない腫瘍組織内のα_３β_ｖインテグリンの他の位置と関連するバックグラウンドが最小な状態で、この新生血管系の選択的イメージングが可能である。このインテグリンを標的とするナノ粒子はしたがって腫瘍新生血管系と特異的に関連するので、高感度・低分解能画像を得ることができ、新生血管系の高解像度画像へと導くことができる。

本発明のキレート剤に含まれる実際のキレート部分の一実施形態は、当該技術分野において公知の、ビスピリジルリシンである。しかし、このキレート部分はそれ自体、初期イメージングを成功させるためにナノ粒子と結合していなければならない。

本発明の方法におけるイメージングを行うためのキレート化された金属イオンは、放射性同位体である。特に好ましいのは、^１１１Ｉｎおよび^９９ｍＴｃである。これらはいずれも、予備知識無しに初期の新生血管リッチな腫瘍を検出し、位置を特定するために用いられる。

本出願において、「血管新生」および「新生血管系」は場合によっては同義的に使用される。いずれの場合にも、インテグリンα_ｖβ_３の発現は上昇し、本発明の標的化ナノ粒子はこの標的に集中する。別の標的を用いることもできるが、これが特に有効であると考えられる。

放射性同位体を含む本発明のキレート剤は、典型的には複数がナノ粒子と結合しており、１つのナノ粒子は４〜２０個、好ましくは６〜１０個の本発明のキレート剤を含む。ナノ粒子はまた、前述のように、新生血管系を特異的に標的とする。

Ｖｘ−２ウサギ腫瘍モデルにおける^１１１Ｉｎ α_ｖβ_３−ナノ粒子の有用性が、その標的特異性の詳細とともに試験されている。蛍光および免疫組織化学的顕微鏡検査により、^１１１Ｉｎ α_ｖβ_３−ナノ粒子は、新生血管リッチな領域中の腫瘍被膜内で濃縮され、血管内皮マーカーのＦＩＴＣ−レクチンと共局在化することが示されている。腫瘍内α_ｖβ_３−ナノ粒子についてはほとんど言及されておらず、どれも壊死性コア、マクロファージまたは腫瘍細胞と関係がなかった。この研究は、フー，Ｇ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００７）１２０：１９５１−１９５７で報告されている。

^１１１Ｉｎ α_ｖβ_３−ナノ粒子は、腫瘍新生血管系からの高感度・低分解能シグナルを提供し、このシグナルは迅速に認識され、数時間持続した。網内皮クリアランス臓器における放射能の蓄積にもかかわらず、放射標識されたナノ粒子は、脳、頭頚部、胸部、ならびに前立腺をはじめとする身体の多くの重要な領域で生じる早期癌を評価できることが期待される。^１１１Ｉｎ α_ｖβ_３−ナノ粒子を用いて、ハイリスク患者における血管新生リッチな潜在的腫瘍または転移についてスクリーニングし、ＣＴまたはＭＲＩによる高分解能イメージングへと導くことができる。しかし、より低価格で、崩壊半減期がより短く、エネルギーγ線放射が好適で、かつ放射線安全域がより広いため、^９９ｍＴｃ 放射性同位体が好ましい。

本発明のキレート系は医薬組成物または獣医用組成物、あるいは診断、イメージング、治療または可能な診断法もしくは治療法を評価するための研究に用いられる組成物の形態で投与されるよう設計される。本発明のキレート系は、典型的にはエマルションとして、組成物中に含まれる粒子状担体と結合またはカップリングするように設計される。

本明細書において、「粒子状担体」は、所望のドラッグデリバリーまたはイメージング機能を果たすナノ粒子またはミクロ粒子、あるいは一般に脂質／界面活性剤コーティングまたは層により封入された粒子を意味する。粒子状担体は、例えばリポソーム、ナノ粒子、ミセル、リポタンパク質、または他の脂質ベースの担体であり得る。これらは、気体および／または気体前駆体を含む気泡、炭化水素および／または含ハロゲン炭素化合物を含む粒子、中空または多孔質粒子もしくは固体であってもよい。一般に、粒子状担体は、追加の物質でコーティングされている固体粒子であるか、固体もしくは液体外層により囲まれている液体コアであるか、または固体もしくは液体外層により囲まれている気体もしくは気体前駆体を含み得る固体粒子であってよい。粒子状担体はエマルションの形態で供給することができる。活性組成物中の粒子状担体は、対象中の所望の組織または位置と選択的に結合する標的化部分と結合する。標的化部分は標的組織上に自然に存在する関連物質に特異的なリガンドであるか、または人工的に供給された部分の関連物質、例えばビオチン標識された標的組織と結合するアビジンであり得る。

これらの標的化部分は、抗体またはそれらのフラグメント、ペプチド模倣物、小分子リガンド、アプタマーなどであってもよい。前述のように、これらは典型的にはα_ｖβ_３を標的とする。これらは活性組成物中のビヒクルと共有的または非共有的に結合する。

したがって、粒子状担体はそれ自体、固体粒子、液体でコーティングされた固体粒子、液体でコーティングされた液体粒子、および固体または液体でコーティングされた気体粒子をはじめとする様々な物理的状態のものであってもよい。本発明において有用な様々な担体は、標的化成分を活性組成物中のビヒクルと結合させるための手段と同様に当該技術分野において開示されている。このようなビヒクルは、例えば米国特許第６，５４８，０４６号；同第６，８２１，５０６号；同第５，１４９，３１９号；同第５，５４２，９３５号；同第５，５８５，１１２号；同第５，１４９，３１９号；同第５，９２２，３０４号；および欧州特許出願公開第７２７，２２５号に記載されており、これらの文献はすべて担体の構造に関して参照により本明細書に援用される。これらの文献は単に例示するものであり、本発明において有用な様々な種類の粒子状担体の全てを含むものではない。

いくつかの実施形態の不活性コアは、植物性油、動物性油もしくは鉱油、またはフルオロカーボン化合物（過フッ素化または他の方法でさらに不活性にされたもの）であってよい。鉱油としては、石油由来の油、例えばパラフィン油などが挙げられる。植物性油としては、例えばアマニ油、紅花油、大豆油、ヒマシ油、綿実油、パーム油およびココナツ油が挙げられる。動物性油としては、牛脂、豚脂、魚油などが挙げられる。多くの油はトリグリセリドである。

フッ素化液体もコアとして用いられる。これらは、直鎖、分岐鎖、および環状炭化水素を含み、好ましくは過フッ素化を含む。いくつかの十分にフッ素化、好ましくは過フッ素化された本発明の粒子において有用な有機化合物は、それ自体官能基を含む。過フッ素化炭化水素が好ましい。ナノ粒子コアは、このようなフッ素化物質の混合物を含み得る。典型的には、これらの不活性支持体においては少なくとも５０％がフッ素化されていることが望ましい。好ましくは、不活性コアは２０℃より高く、より好ましくは３０℃より高く、さらにより好ましくは５０℃より高く、さらにより好ましくは約９０℃より高い沸点を有する。

したがって、本発明の上記ナノ粒子において特に有用なパーフルオロ化合物は、部分的または実質的または完全にフッ素化された化合物を含む。塩素化、臭素化またはヨウ素化形態も使用することができる。

ナノ粒子上の任意のコーティングに関して、比較的不活性なコアは、ナノ粒子自体に本発明のキレート系を固定する働きをする脂質／界面活性剤コーティングを備えている。エマルションが形成されるならば、コーティングは典型的には界面活性剤を含む。典型的には、コーティングは極性部分および非極性部分の両方を含むレシチン型化合物ならびに追加の物質、例えばコレステロールを含む。コーティング中に含められる典型的な物質としては、脂質界面活性剤、例えば天然または合成リン脂質だけでなく、脂肪酸、コレステロール、リソ脂質、スフィンゴミエリン、トコフェロール、糖脂質、ステアリルアミン、カルジオリピン、エーテルまたはエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合脂質、および脂質結合ポリエチレングリコールが挙げられる。その他の界面活性剤が市販により入手可能である。

前記物質をアニオン性およびカチオン性界面活性剤と混合することができる。

フルオロケミカル界面活性剤もまた使用することができる。これらは、過フッ素化アルコールリン酸エステルおよびそれらの塩；過フッ素化スルホンアミドアルコールリン酸エステルおよびそれらの塩；過フッ素化アルキルスルホンアミドアルキレン第四アンモニウム塩；Ｎ，Ｎ−（カルボキシル置換低級アルキル）過フッ素化アルキルスルホンアミド；ならびにこれらの混合物が挙げられる。かかる界面活性剤に関して用いられる場合、「過フッ素化」という用語は、界面活性剤が少なくとも１個の過フッ素化アルキル基を含むことを意味する。

典型的には、脂質／界面活性剤はナノ粒子の０．０１〜５重量％、好ましくは０．１〜２重量％の合計量で使用される。一実施形態において、脂質／界面活性剤カプセル化エマルションは核酸物質の粒子表面への付着を促進する界面活性剤中のカチオン性脂質と共に配合できる。カチオン性脂質としては、ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド；ＤＯＴＡＰ、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン；およびＤＯＴＢ、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロールを使用できる。一般に、脂質／界面活性剤単層中のカチオン性脂質の非カチオン性脂質に対するモル比は、例えば１：１０００〜２：１、好ましくは２：１から１：１０の間、さらに好ましくは１：１から１：２．５の間の範囲、最も好ましくは１：１（カチオン性脂質のモル量の非カチオン性脂質、例えばＤＰＰＣのモル量に対する比）である。様々な脂質は、すでに記載したものに加えて、エマルションエマルション界面活性剤の非カチオン性脂質成分、特にジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジル−エタノールアミンまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを含み得る。前述のカチオン性脂質の代わりに、ポリアミンなどのカチオン性ポリマーを有する脂質、例えばスペルミンまたはポリリシンまたはポリアルギニンも脂質界面活性剤中に含めることができ、負に荷電した治療物質、例えば遺伝物質またはその類似体をエマルション粒子の外側と結合させることができる。

他の粒子状ビヒクルも本発明の方法の実施に使用することができる。例えば、粒子はリポソーム粒子、またはリポタンパク質、例えばＨＤＬ、ＬＤＬおよびＶＬＤＬであってもよい。様々な種類のリポソームを記載する文献が膨大にあり、当業者には周知である。一般に、リポソームは１つ以上の両親媒性部分およびステロイド、例えばコレステロールを備える。これらは単層、多層であってよく、様々なサイズであり得る。これらの親油特性を、不活性コアを有するナノ粒子上のコーティングに関して前述したのと類似した方法でキレート剤に結合させるために使用することができ；またはリポソームの成分への共有結合を使用することができる。ミセルは類似の物質からなり、所望の物質、特にキレート剤を結合するための前記手法をこれに同様に適用することができる。脂質の固体形態も使用することができる。

加えて、タンパク質または他のポリマーを使用して粒子状担体を形成することができる。これらの物質は、親油性コーティングを適用した不活性コアを形成できるか、または例えば親和性試薬を粒子状固体支持体に結合させる際に用いられる技術等の技術を用いることにより、キレート剤をポリマー物質に直接結合させることができる。したがって、例えばタンパク質から形成された粒子を、例えばカルボジイミドが介在する脱水反応により、カルボン酸および／またはアミノ基を含む連結鎖分子と結合させることができる。硫黄含有タンパク質を、マレイミド結合を介して、キレート剤が結合した連結鎖を含む他の有機分子と結合させることができる。粒子状担体の性質に応じて、キレート剤の歯状部分と粒子の表面との間を結合して、オフセットを得る方法は当業者に周知である。

さらに、粒子状担体として使用される粒子は、気泡または使用時に気泡を形成する前駆体を含み得る。これらの場合、液体または固体ベースのコーティング中に気体が含まれる。

いくつかの実施形態において、粒子状担体は、フィブリン塊、肝臓、膵臓、ニューロン、腫瘍組織、即ち特定の細胞表面または他のリガンド結合部分を特徴とする任意の組織などの別の標的についての標的化剤を含み得る。この標的化を行うために、好適なリガンドを粒子に直接的または間接的に結合させる。間接的な方法は、参照により本明細書に援用される米国特許第５，６９０，９０７号に記載されている。本方法においては、ナノ粒子の脂質／界面活性剤層をビオチニル化し、標的組織を、標的と特異的に結合するリガンドのビオチニル化形態と結合させる。ビオチニル化ナノ粒子は次いで、２つのビオチニル化成分と結合するアビジンの介在によりその標的に到達する。

別法として、特異的リガンド自体を粒子に直接、好ましくは、しかし必ずしもその必要はないが、共有結合的に結合させる。したがって、このような「直接的」結合において、所望の位置に含まれる標的の特異的結合パートナーであるリガンドは、ビオチニル化リガンドが意図される標的にある場合の間接的カップリングと対照的に、それ自体が粒子の成分と結合する。このような直接的結合は、結合分子を介して、または表面成分との直接的相互作用により、行うことができる。ホモ二官能性およびへテロ二官能性結合分子は市販されており、リガンド上に含まれる官能基は、共有結合を行うために使用できる。標的化リガンド上に存在し得る典型的な官能基としては、アミノ基、カルボキシル基およびスルフヒドリル基が挙げられる。加えて、架橋法、例えばグルタルアルデヒドが介在する方法を使用できる。例えば、スルフヒドリル基を結合分子または表面成分の不飽和部分を介して結合させることができ；カルボジイミド等の脱水剤で処理することにより、リガンド上のアミノ基と表面に含まれるカルボキシル基、またはその逆との間にアミドを形成することができる。リガンドを、一般的な粒子成分および一実施形態においては脂質／界面活性剤コーティングで用いられるものなどの成分と直接結合させるための様々な方法が当該技術分野で公知である。

さらに詳細には、標的化リガンドを外層の成分と共有結合させることにより結合させるため、様々な種類の結合剤および連結剤を用いることができる。このような結合を形成するための典型的な方法としては、カルボジイミドを使用したアミドの形成、またはマレイミド等の不飽和成分を使用したスルフィド結合の形成が挙げられる。他の結合剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、プロパンジアールまたはブタンジアール、２−イミノチオランヒドロクロリド、ジスクシンイミジルスベレート等の二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジスクシンイミジルタルトレート、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン、例えばＮ−（５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシ）スクシンイミド、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、およびスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート等のヘテロ二官能性試薬、例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロジフェニルスルホン、４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン、ｐ−フェニレンジイソチオシアネート、カルボニルビス（Ｌ−メチオニンｐ−ニトロフェニルエステル）、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、エリスリトールビスカーボネート等のホモ二官能性試薬および、例えばジメチルアジピミデートヒドロクロリド、ジメチルスベルイミデート、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデートヒドロクロリド等の二官能性イミドエステルなどが挙げられる。結合は、アシル化、スルホン化、還元的アミノ化などによっても達成できる。市販の結合系としては、ＡｎｏｒＭＥＤ（ブリティッシュコロンビア州、ラングレー）から販売されているＨＹＮＩＣリンカー技術が挙げられる。所望のリガンドを外層の１つ以上の成分と共有結合により結合させる多くの方法は当該技術分野において周知である。

例えば、直接的な結合を行う方法は、米国特許第６，６７６，９６３号に詳細に記載されており、これらの方法に関して参照により本明細書に援用する。

前述の論議は包括的なものではない。アプタマーを用いる特定の場合において、カチオン性界面活性剤を粒子のコーティングとして使用することにより、アプタマーをナノ粒子とカップリングさせることが有利であり得る。

標的化剤自体は意図される標的部位に特異的な任意のリガンドであり得る。標的部位は標的剤またはリガンドの「同系」、即ち標的化剤またはリガンドと特異的に結合する部分を含む。よく知られている同系対としては、抗原／抗体、レセプター／リガンド、ビオチン／アビジンなどが挙げられる。一般に、このようなリガンドは、抗体またはその部分、目的の標的と結合するように設計されたアプタマー、オピオイドレセプター結合リガンドなどの特異的レセプターの公知のリガンド、特定のレセプターを標的とすることが知られているホルモン、ペプチド模倣物などを含み得る。いくつかの臓器では、公知のリガンドと結合する表面分子を含むことが知られ；好適なリガンドが未知である場合でさえも、標準的技術を用いて抗体を作製および修飾することができ、アプタマーをかかる結合のために設計することができる。

抗体またはそれらのフラグメントを標的化剤として用いることができ、自然にまたは設計によって結合する公知のリガンドを標的が有するかどうかにかかわらず、実質的に任意の標的について作製することができる。モノクローナル抗体の作製をはじめとする抗体作製の標準的な方法は当該技術分野において周知であり、ここで繰り返す必要はない。抗体の結合部分がその可変領域にあることは周知であり、したがってＦ_ａｂ、Ｆ_ｖ、およびｓｃＦ_ｖ部分などの可変領域のみを含む抗体のフラグメントは「抗体」の定義に含まれる。抗体およびその定義に含まれるこれらのフラグメントの組み換え体産生方法も十分に確立されている。イメージングがヒト対象について行われる場合、標的化リガンドとして働く任意の抗体をヒト化することが好ましい。このようなヒト化の技術も周知である。

イメージングに使用される好適な常磁性金属としては、原子番号５８〜７０のランタニド元素または原子番号２１〜２９、４２もしくは４４の遷移金属、即ち、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、モリブデン、ルテニウム、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、およびイッテルビウムなどが挙げられ、最も好ましくはＧｄ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）、鉄、ユーロピウム、および／またはジスプロシウムである。

放射性核種イメージングおよび治療のために、前述のＭＲＩで使用するために錯体形成された金属イオンと同様の方法で放射性核種をキレート化システム中に含めるか、または別の結合を使用することができる。放射性核種は、治療用または診断用のいずれであってもよく；かかる核種を用いた診断用イメージングは周知であり、放射性核種を望ましくない組織に標的化させることにより治療上の効果を達成することもできる。典型的な診断用放射性核種としては、^９９ｍＴｃ、^９５Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｇａ、および^６８Ｇａが挙げられ、治療用核種としては、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１４９Ｐｍ、^９０Ｙ、^２１２Ｂｉ、^１０３Ｐｄ、^１０９Ｐｄ、^１５９Ｇｄ、^１４０Ｌａ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１６５Ｄｙ、^１６６Ｄｙ、^６７Ｃｕ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ａｇ、および^１９２Ｉｒが挙げられる。

様々な方法であらかじめ形成されたエマルションに核種を備えつけることができる。例えば、^９９Ｔｃ−過テクネチウム酸塩を過剰の塩化第１スズと混合し、ナノ粒子のあらかじめ形成されたエマルション中に組み入れることができる。スズオキシネートは塩化第１スズと置換することができる。加えて、市販のキット、例えばＮｙｃｏｍｅｄ Ａｍｅｒｓｈａｍにより提供されているＣｅｒｅｔｅｋ（登録商標）として販売されているＨＭ−ＰＡＯ（エキサメタジム）キットを使用できる。様々な放射性リガンドを本発明のナノ粒子と結合させるための手段は当該技術分野において理解されている。前述のように、放射性核種は補助材料ではなく、組成物が放射性核種に基づく診断または治療目的で単独で使用される場合に、常時性イオンの代わりにキレート剤を占有する。

本発明のキレート化系に加えて、粒子状担体は治療剤を含み得る。これらの生理活性物質は、例えばタンパク質、核酸、医薬品、放射性核種など様々であってよい。したがって、好適な医薬品は、抗腫瘍薬、ホルモン、鎮痛剤、麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤または駆虫剤、抗ウイルス薬、インターフェロン、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン剤、鎮咳薬、抗凝固剤などを含む。

本発明のキレート系は式（１）で表わされる化合物である。

（式中、各Ｘは、独立してＣＲ^１またはＮであり；
各Ｒ^１は、独立してＨまたは低級アルキルであり；
各Ｒ^２は、独立してハロゲン、アルキル（１〜６Ｃ）、アルケニル（２〜６Ｃ）、またはアルキニル（２〜６Ｃ）であり；
ｎは、０、１、または２であり；
スペーサー^１は、４個以上の炭素を有するアルキレンまたはアルケニレン鎖であり；
スペーサー^２は、存在する場合、スペーサー^１を脂質部分と結合させ、親水性の必要に応じて置換されていてもよいアルキレン鎖であり、ここで１つ以上のＣがＮまたはＯで置換されていてもよく、前記鎖は１つ以上のＯＲ、ＮＲ_２、＝Ｏ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、および／またはＮＲＣＯＲで置換されていてもよい、ここで各Ｒは独立してＨまたは低級アルキルである；
ｍは、０または１であり；
脂質は、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質またはステロイドを表す）

いくつかの実施形態において、窒素含有環の一つまたは両方が置換されている。このような置換基は、キレート作用を持つよう電子供与対を供給しないように選択される。いくつかの実施形態において、いずれかまたは両方の環の一つのＸは窒素であり、他方はＣＲ^１である。他の実施形態において、両方のＸは窒素であり、さらに他の実施形態においては、両方のＸはＣＲ^１である。Ｒ^１の好ましい実施形態はそれぞれ水素およびメチルまたはエチルである。

ビスピリジル部分によりもたらされる分子のキレート化機能は、所望の正に帯電した金属イオンを捕捉する。組成物をＭＲＩに使用する場合、常磁性金属がキレート化され；低分解能・高感度イメージングの本発明の方法において使用するため、放射性同位体が用いられる。本発明の方法において特に有益なのは^９９ｍＴｃの使用であり、これはリュー，Ｓ．らによるＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９７）８：６２１−６３６の総説に記載されている。この総説は、医薬において特に有用であるこの同位体（半減期６時間）の様々な形態の調製法を記載している。しばしば用いられる別の実施形態は^１１１Ｉｎであり、これは２．８日の半減期を有する。

スペーサー^１は、４個以上の炭素、場合によっては６個以下の炭素または８個以下の炭素を有するアルキレンまたはアルケニレン鎖と定義される。スペーサー^２は必要に応じて切断部位を提供し、前述のような官能基をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、水性媒体中での溶解度を高めるポリエチレングリコール部分を導入することができる。スペーサー^２中に含まれる好ましい官能基はとしては、アミド基およびアミノ基が挙げられる。

スペーサー^２を疎水性部分、典型的にはリン脂質またはスフィンゴ脂質と結合させる。好ましいリン脂質は、スペーサー^２と結合するための官能基を含むもの、例えばホスファチジルエタノールアミンである。

スペーサー^１の一の特定の実施形態において、アルキレン鎖はリシン残基により与えられる。式１の化合物のこの部分は、典型的には当該技術分野において記載されているように、２モルのアルデヒド置換ピリジルを、αアミノ基が保護されたリシン残基と反応させることにより合成することができる。その後のリシン残基のカルボキシル基と、アルコールまたはアミンとの反応の結果、スペーサー^２が付加される。一つの適切なアルコールはポリエチレングリコールであり、典型的には４０〜６０モノマー、好ましくは４５〜５０モノマーを含む。アルコールでない場合はω−アミノカルボン酸などのアミンまたはヒドロキシルカルボン酸である。

前述のように、脂質部分の好ましい実施形態はホスファチジルエタノールアミンである。スペーサー^２残基の任意のカルボキシル基はホスファチジルエタノールアミンと反応することを容易にしている。ホスファチジルエタノールアミンと結合したアシル基は様々な鎖長を有するものであり得るが、疎水性アンカーを提供するために十分な長さでなければならない。典型的には、アシル基は少なくとも１２個の炭素原子を含み、１２〜２４個の炭素原子の範囲のアシル基が想定される。アシル基は飽和であっても不飽和であってもよいが、好ましくは飽和である。

次の調製および例は説明のために示すものであり、本発明を限定するものではない。

調製Ａ
α_ｖβ_３に対する標的化剤の調製
Ａ．ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド−メルカプト酢酸付加物

をまず次のように調製する：

１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）２０００］をＤＭＦ中に溶解させ、窒素またはアルゴンを注入することにより脱気する。ＤＩＥＡを用いて酸素非含有溶液をｐＨ７〜８に調節し、メルカプト酢酸で処理する。出発物質が完全に消費されたことが分析で示されるまで、撹拌を周囲温度で続ける。溶液を次の反応で直接使用する。

次に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド−メルカプト酢酸付加物を２−［（｛４−［３−（Ｎ−｛２−［（２Ｒ）−２−（（２Ｒ）−２−アミノ−３−スルホプロピル）−３−スルホプロピル］エチル｝カルバモイル）プロポキシ］−２，６−ジメチルフェニル｝スルホニル）アミノ］（２Ｓ）−３−（｛７−［（イミダゾール−２−イルアミノ）メチル］−１−メチル−４−オキソ（３−ヒドロキノリル）｝カルボニルアミノ）プロパン酸と結合させて、以下の化合物（２）を次のように得る。

ＨＢＴＵおよび十分なＤＩＥＡを添加することにより上記の付加物溶液を予備活性化し、ｐＨ８〜９を維持する。この溶液に、２−［（｛４−［３−（Ｎ−｛２−［（２Ｒ）−２−（（２Ｒ）−２−アミノ−３−スルホプロピル）−３−スルホプロピル］エチル｝カルバモイル）プロポキシ］−２，６−ジメチルフェニル｝スルホニル）アミノ］（２Ｓ）−３−（｛７−［（イミダゾール−２−イルアミノ）メチル］−１−メチル−４−オキソ（３−ヒドロキノリル）｝カルボニルアミノ）プロパン酸を添加し、溶液を室温、窒素下で、１８時間撹拌する。ＤＭＦを真空中で除去し、粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製して、複合体を得る。

Ｂ．類似の手順を用いて、式（２Ａ）の誘導化標的剤を得た。

調製Ｂ
ナノ粒子の調製
Ａ．一実施形態において、ナノ粒子はフラック，Ｓ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００１）１０４：１２８０−１２８５に記載されているようにして製造する。簡単に説明すると、ナノ粒子エマルションは、４０％（ｖ／ｖ）のパーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）、２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤共混合物、１．７％（ｗ／ｖ）のグリセリンと、残りは水から構成される。

コントロールの界面活性剤、即ち非標的化エマルションは、６０モル％のレシチン（
Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州アラバスター）、８モル％のコレステロール（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）および２モル％のジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．、アラバマ州アラバスター）を含む。

α_ｖβ_３標的化常磁性ナノ粒子は、前述の方法に従い、６０モル％のレシチン、α_ｖβ_３−インテグリンペプチド模倣物アンタゴニストと共有結合した０．０５モル％のＮ−［｛ｗ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブタノイル］アミノ｝ポリ（エチレングリコール）２０００］１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＰＢ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ノースビレリカ）、８モル％のコレステロール、３０モル％のＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡおよび１．９５モル％のＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物を用いて調製する。

各ナノ粒子配合物の成分をＭ１１０Ｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ乳化機（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州ニュートン）中、２０，０００ＰＳＩで４分間乳化させる。完成したエマルションをクリンプで密封したバイアル中に入れ、窒素を充填した。

レーザー光散乱サブミクロン粒度アナライザー（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国マルベルン、ウースターシャー）を用いて３７℃で粒度を測定し、ナノ粒子の濃度を公称粒度（即ち、球の粒子体積）から計算する。ほとんどの粒子は４００ｎｍ未満の直径を有する。

パーフルオロカーボン濃度を、炎イオン化検出を用いたガスクロマトグラフィー（Ｍｏｄｅｌ ６８９０、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、デラウェア州ウィルミントン）で測定する。エタノール中１０％水酸化カリウムおよび２．０ｍｌの内部標準（Ｆｒｅｏｎ（登録商標）中０．１％オクタン）と合わせた１ｍｌのパーフルオロカーボンエマルションを激しくボルテックスし、次いでシェーカーで３０分間連続して撹拌する。下側の抽出層を、シリカゲルカラムを通して濾過し、分析まで４〜６℃で保存する。初期カラム温度は３０℃であり、１０℃／分の勾配で１４５℃まで上昇させる。

Ｂ．別の実施形態において、乳化パーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）ナノ粒子は、ウィンター，Ｐ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００３）６３：５８３８−５８４３；シュミーダー，Ａ．ら、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．（２００５）５３：６２１−６２７；およびフー，Ｇ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００７）１２０：１９５１−１９５７によりすでに報告されているようにして調製した。これらは２０％（ｖ／ｖ）のＰＦＯＢ（Ｅｘｆｌｕｏｒ Ｃｏｒｐ．、テキサス州ラウンドロック）、２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、および残りの脱イオン水を含んでいた。インテグリン標的化粒子の界面活性剤共混合物は、３〜５モル％のビスピリジル−リシン−カプロイル−ホスファチジルエタノールアミン、０．１モル％の、式（２）のＰＥＧ２０００−ホスファチジルエタノールアミンと複合体形成したビトロネクチンアンタゴニスト、および残りの精製卵ＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を含んでいた。界面活性剤共混合物をクロロホルム中に溶解させ、減圧下で蒸発させ、５０℃真空中で一夜乾燥して、脂質フィルムにした。界面活性剤をパーフルオロオクチルブロミド（ＰＦＯＢ）および蒸留脱イオン水と粗ブレンドし、次いでＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０Ｓフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を用いて２０，０００ｐｓｉで４分間乳化させた。α_ｖβ_３標的化粒子を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ４ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．）を用いて３７℃で測定し、典型的には多分散指数０．２で直径２７０ｎｍであった。α_ｖβ_３標的化ナノ粒子の生物活性を、インビトロでビトロネクチン細胞接着検定により確認および観察した。

調製Ｃ
α_ｖβ_３標的化粒子の^９９ｍＴｃ放射性同位体による標識（比較例）
比較のために、いくつかの親油性キレートを合成し、放射標識パーフルオロカーボンナノ粒子について評価した。簡単に説明すると、これらの脂質−キレートは、６−ヒドラジノニコチン酸−ホスファチジルエタノールアミン（ＨＹＮＩＣ−ＰＥ）、ジエチレントリアミンペンタアセテート−カプロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰＡ−ｃａｐ−ＰＥ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−カプロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（トリＧｌｙ−ｃａｐ−ＰＥ）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−カプロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（トリＧｌｙ−Ａｓｐ−ｃａｐ−ＰＥ）、Ｎ２Ｓ２−ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ２Ｓ２−ＰＥ）、およびＮ２Ｓ２−ＮＨ_２−ホスファチジルエタノールアミン（Ｎ２Ｓ２−ＮＨ２−ＰＥ）を含んでいた。トリシン中間体シャトルステップを用いた^９９ｍＴｃの酒石酸スズ還元を利用してメタル化の間の^９９ｍＴｃＯ_２形成を最小限に抑えた。^９９ｍＴｃを下記のようにトリカルボニル前駆体を介してビスピリジル−リシンと結合させた。

１個のナノ粒子あたり６〜１０個の^９９ｍＴｃ同位体を高効率（＞９０％）で結合させるため、いくつかの候補親油性キレートの合成、スクリーニングおよび試験を必要とした。表１はナノ粒子への^９９ｍＴｃの結合の結果および両者を実験するよう選択したものについて遊離キレートに対する結合の結果を簡単にまとめたものである。

式（３）および式（４）のトリデンテートビスピリジル−リシン−ホスファチジルエタノールアミン複合体に続いてビデンテートヒスチジン−ホスファチジルエタノールアミンおよび脂質修飾ＨＹＮＩＣキレートを用いた場合最良の結果が得られた。ＤＴＰＡ−ＰＥは機能が不十分であり、２つのトリＧｌｙ親油性化合物は有効ではなかった。一般に用いられるテトラデンテートＮ２Ｓ２キレートのリン脂質誘導体は、溶液中で^９９ｍＴｃと結合したが、インプロセス条件の様々なｐＨ調節にもかかわらず、ナノ粒子脂質界面活性剤中に組み入れられた場合は機能が不十分であった。

調製Ｄ
^９９ｍＴｃ−トリカルボニル前駆体および^９９ｍＴｃナノ粒子の調製
６６０μｌの脱イオン水中水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ４（０．５３Ｍ）、炭酸ナトリウム（０．１４Ｍ）、および酒石酸ナトリウム（０．２４Ｍ）をガラスセラムバイアル中で混合した。バイアルを一酸化炭素で２０分間パージし、次いで２３６８ＭＢｑの過テクネチウム酸ナトリウム^９９ｍＴｃＯ_４を添加し、内容物を１００℃で２０分間加熱した。大気圧に平衡化した後、反応混合物を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）：１Ｍ ＨＣｌの１：３混合物でｐＨ７に調節し、下記のようにしてＨＰＬＣにより純度を測定した。反応混合物を水浴中４０℃で、３０分間、６〜１０分子の式（３）または式（４）のキレート部分を含む５０〜１００μＬのナノ粒子と結合させた。ナノ粒子放射標識収率は、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．１８：メタノール：水（２０：１００：２００）で展開させたＴＬＣで測定すると９０％を超え、これはナノ粒子１個あたり約６原子の^９９ｍＴｃであった。

ビス−Ｐｙ−Ｌｙｓｏｃａｐ−ＰＥ

式（３）の化合物に加えて、式（４）の化合物、ビス−Ｐｙ−Ｌｙｓｏ−ＰＥＧ−ｃａｐ−ＰＥを使用した。この化合物において、（ＰＥＧ）_４５はリシンのカルボキシルおよびω−アミノカプロン酸のアミノ基と結合している。

ｆａｃ−［^９９ｍＴｃ（ＯＨ_２）_３（ＣＯ）_３］^＋の形成は、逆相ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および検出用ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）により確認した。ＨＰＬＣ条件は次のとおりである：Ｗａｔｅｒｓ ＳｙｍｍｅｔｒｙＳｈｉｅｌｄ（商標）ＲＰ８ ３．５μｍ、４．６×２５０ｍｍ、逆相カラムならびに０．０５Ｍリン酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＰ）ｐＨ２．６８およびメタノール（ＭｅＯＨ）の移動相勾配。適用された勾配は次のとおりであった：Ａ、０から３分 １００％ＴＥＡＰ；３から６分、１００％から７５％ＴＥＡＰ；６から９分 ７５％から６６％ＴＥＡＰ；Ｂ、３４％から１００％ＭｅＯＨ ９から２０分、１００％ＭｅＯＨ ２０から２７分、１００％ＭｅＯＨから１００％ＴＥＡＰ ２７から３０分。流速は周囲温度で１ｍＬ／分であった。

実施例１
ＶＸ−２−ウサギ腫瘍モデル：オスのニュージーランドシロウサギ（約２ｋｇ）を筋肉内ケタミンおよびキシラジン投与で麻酔した。各動物の左後肢の毛を剃り、無菌調製し、Ｍａｒｃａｉｎｅ（商標）を染みこませた。２〜３ｍｍ^３のＶｘ−２腫瘍（ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、マサチューセッツ州フレデリック）を膝窩中に小切開を通して約０．５ｃｍの深さで移植した。解剖面を閉じ、１本の吸収性縫合糸で固定した。皮膚をＤｅｒｍａｂｏｎｄ（商標）皮膚用接着剤で閉じた。ケタミンおよびキシラジンの効果をヨヒンビンで無効にすることにより動物を回復させた。

Ｖｘ−２腫瘍移植の１２〜１６日後に、ウサギを１〜２％のＩｓｏｆｌｕｒａｎｅ（商標）で麻酔し、挿管し、通気した。放射標識されたナノ粒子を注入するために、静脈内カテーテルを各ウサギの辺縁耳静脈中に留置した。ワシントン大学医学部での動物実験委員会により承認されたプロトコルにしたがって麻酔しながら動物を生理学的にモニターした。

二次元イメージング実験：ＶＸ−２腫瘍を移植した２１匹のウサギを無作為に５つの治療群に分けて、腫瘍対筋肉比（ＴＭＲ）対比反応を評価した。選択された治療群（ｇｒｐｓ）を用いて^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子（ｇｒｐｓ１〜３）の最適用量を決定し、α_ｖβ_３標的化対非標的化^９９ｍＴｃナノ粒子（ｇｒｐｓ２対４）を比較し、非標識α_ｖβ_３−ナノ粒子により競合的に阻害された^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子のホーミング特異性を証明した（ｇｒｐｓ２対５）。
１）１１ＭＢｑ／ｋｇ ^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子（ｎ＝５）
２）２２ＭＢｑ／ｋｇ ^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子（ｎ＝４）
３）４４ＭＢｑ／ｋｇ ^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子（ｎ＝４）
４）２２ＭＢｑ／ｋｇ 非標的化^９９ｍＴｃ ナノ粒子（ｎ＝４）
５）２２ＭＢｑ／ｋｇ ^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子、２０倍過剰の非標識α_ｖβ_３−ナノ粒子（ｎ＝４）と同時投与。

全注入体積（０．３ｍｌ／ｋｇ）を、コントロールナノ粒子（即ち、非標的化、非標識）を含めて群１〜４について維持した。

二次元イメージング実験のために、ウサギを高エネルギーピンホールコリメータ（開口度３ｍｍ）の直ぐ下３ｃｍに配置し、臨床用Ｇｅｎｅｓｙｓシングルヘッドガンマカメラ（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で撮像した。２０％ウィンドウカメラを１４０ｋｅＶ、１２８×１２８×１６の解像度で用いて、注入後７．５分から始めて２時間にわたって１５分間画像を取得した。画像スタックをＤＩＣＯＭフォーマットでＬｉｎｕｘワークステーションにエクスポートし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／のワールドワイドウェブにある）で処理した。匹敵するサイズの関心領域（ＲＯＩ）を手作業で腫瘍シグナル、筋肉およびバックグラウンド領域周辺に配置して、平均ピクセル活性を決定した。

^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子注入後の最初の２時間で腫瘍新生血管系から動的に得られた^９９ｍＴｃシグナルは腫瘍−筋肉比として表示する。

１１ＭＢｑ／ｋｇで投与された^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子は、１５分後に早期コントラスト促進（ＴＭＲ）（７．０８±０．９７）を有し、これは２２ＭＢｑ／ｋｇ用量（７．７１±１．１５）で認められる初期シグナルに匹敵するが、その後、残りの２時間の実験間隔にわたってさらに低い（ｐ＜０．０５）ままであった（１１ＭＢｑ／ｋｇ、７．３２±０．１２対２２ＭＢｑ／ｋｇ、８．５６±０．１３）（図１Ａ）。

４４ＭＢｑ／ｋｇの^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子を投与されたウサギにおけるＴＭＲは１５分での２２ＭＢｑ／ｋｇ反応（６．３８±０．４８）よりも低く（ｐ＜０．０５）、残りの２時間にわたって低いまま（ｐ＜０．０５）であった（６．５５±０．０７、図１Ｂ）。これらの結果から、２２ＭＢｑ／ｋｇを超えて投与された^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子は利用可能なα_ｖβ_３−インテグリン結合部位を飽和させ、過剰の循環活性は高度の血管筋肉対照において測定されるバックグラウンドを増加させたことが示唆される。

２２ＭＢｑ／ｋｇで投与された非標的化^９９ｍＴｃナノ粒子は、注入後１５分で、２２ＭＢｑ／ｋｇ（８．５６±０．１３、ｐ＜０．０５）（図１Ｃ）または１１ＭＢｑ／ｋｇ（７．３２±０．１２）で投与された^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子よりも低い（ｐ＜０．０５）新生血管シグナル（ＴＭＲ）（５．５４±０．４７）を示していた。この差は２時間の実験間隔中持続した（ｐ＜０．０５）。

^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−標的化ナノ粒子（２２ＭＢｑ／ｋｇ）の非標識α_ｖβ_３−ナノ粒子によるインビボにおける競合的阻害は、１５分（５．１６±０．３１）および２時間の実験全体にわたって（５．３１±０．０６、図１Ｄ）、非標的化ナノ粒子と等しいレベルまで腫瘍シグナルを減少させた（ｐ＜０．０５）。

ＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージング：臨床用Ｐｒｅｃｅｄｅｎｃｅ ＳＰＥＣＴ／ＣＴ １６スライススキャナー（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。オスニュージーランドシロウサギ（約２ｋｇ）を１〜２％のＩｓｏｆｌｕｒａｎｅ（商標）で麻酔し、挿管し、通気した。静脈投与を右耳静脈で行い、動物を伏臥位で脚を前にして机の上に載せた。動物に１１ＭＢｑ／ｋｇの^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子を投与した。注射の３０分後、２つの重複する長方形のＣＴおよびＳＰＥＣＴ領域を選択して、ＳＰＥＣＴ画像を減衰補正した（ＦＯＶ ３５０ｍｍ、マトリックス５１２×５１２、ＣＴスライス厚さ３．３ｍｍ）。マルチスライスＣＴセッティングは、１２０ｋＶで２５０ｍＡｓ／スライスであった。ＳＰＥＣＴ画像取得は、２．１９ズームおよび２７．３ｃｍ×２７．３ｃｍマスクの低エネルギー・高分解能コリメータを用いた６４、３０秒投射（マトリックス１２８×１２８ピクセル）により行った。

トモグラフィー射影からのＳＰＥＣＴ体積の再構成を、３次元サブセット期待値最大化再構成アルゴリズム、Ａｓｔｏｎｉｓｈ（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＡｕｔｏＳＰＥＣＴ Ｐｌｕｓ３．０ソフトウェアパッケージを有するＪＥＴＳｔｒｅａｍ Ｗｏｒｋｓｐａｃｅ２．５．１ワークステーション（Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。このアルゴリズムはＣＴ減衰マップ、散乱および放射性同位体崩壊補正を含んでいた。ＣＴおよびＳＰＥＣＴ再構成画像セットのコレジストレーションを、ＪＥＴＳｔｒｅａｍ Ｗｏｒｋｓｐａｃｅ上のＳｙｎｔｅｇｒａ（バージョン２．３．１）パッケージを用いて行った。

図２Ａ〜２Ｆは、ウサギ後四半部の二次元トモグラフィーＣＴ画像を表し、脚、骨、および膝窩内の結節腫瘤を明らかにしている。膝窩内で左右相称に観察される軟組織塊（図２Ａ）を腫瘍またはリンパ節として識別できなかった。その理由は、常にこの領域は顕著なリンパ節を伴うからである。減衰補正および崩壊補正されたＳＰＥＣＴ画像の組み合わせにおいて、上右窩中に位置する約１ｃｍの組織塊と関連する^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子由来の新生血管シグナルの存在は、容易に認識され、隣接するリンパ節と区別できる。増加した核シグナルの他の領域は骨および思春期前の睾丸と関連する。これらのコントラストシグナルは左右相称に観察され、血管形成および血流が多い臓器中にみられる。高感度分子イメージングと高分解能ＣＴイメージングとの組み合わせは、新生血管系の病理学的発生源を、生理学的血管形成の予想される発生源と識別することを容易にした。

組織学：イメージング後、動物を安楽死させ、腫瘍を切除し、秤量し、慣用の組織病理学のためのＯＣＴ中で急速に凍結した。２匹の動物で、精索内の新生血管を確認するための陽性コントロールとして精巣を摘出した。アセトン固定し、凍結された組織を切断（５μｍ）し、通常どおりヘマトキシリンおよびエオジンで染色するか、またはＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてα_ｖβ_３−インテグリン（ＬＭ−６０９，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）について免疫染色し、Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）ＶＩＰキットで現像した。Ｎｉｋｏｎ Ｅ８００研究用顕微鏡を用いて顕微鏡画像を得て、Ｎｉｋｏｎ ＤＸＭ１２００カメラでデジタル化した。

この実験において、Ｖｘ−２腫瘍を膝窩から摘出して、その病状および血管形成の特徴を確認し、これらは従来の公開された画像と一致することが証明された。一般に、Ｖｘ−２腫瘍は典型的には円形であり、それらの最大寸法は０．６ｃｍ〜１．５ｃｍ以下であった。新生血管系は末梢腫瘍カプセル内で非対称に分布し、最大密度は筋肉腫瘍界面に沿って認められた。ＳＰＥＣＴ−ＣＴにより強力な^９９ｍＴｃ α_ｖβ_３−ナノ粒子コントラストシグナルを示す睾丸組織を２匹の動物から摘出し、抗α_ｖβ_３−インテグリン抗体（ＬＭ６０９）を用いて血管形成について調べた。α_ｖβ_３−インテグリンによる顕著な免疫染色は、観察されたインビボ核シグナルを明らかに裏付け、独立した陽性コントロール部位を提供した。

統計的分析：分散分析（ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇでワールドワイドウェブにある）およびスチューデントｔ検定（ｇｎｕ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｓｌでワールドワイドウェブにある、ＧＳＬパッケージ）を含む、一般的線型モデルを用いてデータを分析した。ＬＳＤ法（ｐ＜０．０５）により平均分離を得た。平均化したデータは特に記載しない限り平均±平均の標準偏差として表す。

実施例２
^１１１Ｉｎを用いたイメージング
実施例１において前述したものと類似した手順で、本発明の組成物をウサギＶｘ−２腫瘍モデルにおいて用い、実施例１と同様に放射能の腫瘍対筋肉比を比較した。結果を図３Ａ〜３Ｂにおける様々な用量および組み合わせについて示す。図３Ａは用量として１０倍増加させた場合の前期比に対する効果を比較し、図３Ｂは同じ投与レベルでの標的化ナノ粒子対非標的化ナノ粒子を比較する。

Claims (22)

1. 正常組織における血管新生と異なるものとして腫瘍と関連した新生血管の位置を特定する方法における、キレート化放射性同位元素を含みα_ｖβ_３を標的とするナノ粒子エマルションの使用であって、前記方法が、
   腫瘍を有する対象に、キレート化放射性同位元素を含みα_ｖβ_３を標的とする前記ナノ粒子エマルションを投与し、新生血管系の高感度・低分解能画像を得ることと；
   任意に、次に、前記腫瘍の新生血管系の高分解能・低感度画像を得ることを含む使用。
2. 腫瘍における新生血管系の高感度・低分解能画像を筋肉中の類似した画像と比較することを含む、請求項１に記載の使用。
3. キレート剤が式（１）で表される化合物である、請求項１に記載の使用
   

   

   （式中、各Ｘは、独立してＣＲ^１またはＮであり；
   各Ｒ^１は、独立してＨまたは低級アルキルであり；
   各Ｒ^２は、独立して、ハロゲン、アルキル（１〜６Ｃ）、アルケニル（２〜６Ｃ）、またはアルキニル（２〜６Ｃ）であり；
   ｎは、０、１、または２であり；
   スペーサー^１は、４個以上の炭素を有するアルキレンまたはアルケニレン鎖であり；
   スペーサー^２は、存在する場合、スペーサー^１を脂質部分に結合させ、親水性の必要に応じて置換されていてもよいアルキレン鎖であり、ここで、１個以上のＣがＮまたはＯで置換されていてもよく、前記鎖はＯＲ、ＮＲ_２、＝Ｏ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、および／またはＮＲＣＯＲのうちの１つ以上で置換されていてもよい、ここで、各Ｒは独立してＨまたは低級アルキルである；
   ｍは、０または１であり；
   脂質は、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質またはステロイドを表す）
4. 放射性同位体が^９９ｍＴｃまたは^１１１Ｉｎである、請求項１に記載の使用。
5. 対象における腫瘍に関連する新生血管系の画像を得る方法であって、前記対象における新生血管系の高感度・低分解能画像を得ることを、前記対象の腫瘍における新生血管系の高分解能画像を得ることと組み合わせて含む方法。
6. 前記高感度・低分解能画像がキレート化放射性同位体を用いて得られ、前記キレート剤が式（１）で表される化合物である、請求項５に記載の方法。
   

   

   （式中、各Ｘは、独立してＣＲ^１またはＮであり；
   各Ｒ^１は、独立してＨまたは低級アルキルであり；
   各Ｒ^２は、独立してハロゲン、アルキル（１〜６Ｃ）、アルケニル（２〜６Ｃ）、またはアルキニル（２〜６Ｃ）であり；
   ｎは、０、１、または２であり；
   スペーサー^１は、４個以上の炭素を有するアルキレンまたはアルケニレン鎖であり；
   スペーサー^２は、存在する場合、スペーサー^１を脂質部分に結合させ、親水性の必要に応じて置換されていてもよいアルキレン鎖であり、ここで、１個以上のＣがＮまたはＯで置換されていてもよく、前記鎖はＯＲ、ＮＲ_２、＝Ｏ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、および／またはＮＲＣＯＲのうちの１つ以上で置換されていてもよい、ここで、各Ｒは独立してＨまたは低級アルキルである；
   ｍは、０または１であり；
   脂質は、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質またはステロイドを表す）
7. 前記放射性同位体が^９９ｍＴｃまたは^１１１Ｉｎである、請求項６に記載の方法。
8. 式（１）で表される化合物。
   

   

   （式中、各Ｘは、独立してＣＲ^１またはＮであり；
   各Ｒ^１は、独立してＨまたは低級アルキルであり；
   各Ｒ^２は、独立してハロゲン、アルキル（１〜６Ｃ）、アルケニル（２〜６Ｃ）、またはアルキニル（２〜６Ｃ）であり；
   ｎは、０、１、または２であり；
   スペーサー^１は、４個以上の炭素を有するアルキレンまたはアルケニレン鎖であり；
   スペーサー^２は、存在する場合、スペーサー^１を脂質部分に結合させ、親水性の必要に応じて置換されていてもよいアルキレン鎖であり、ここで、１個以上のＣがＮまたはＯで置換されていてもよく、前記鎖はＯＲ、ＮＲ_２、＝Ｏ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、および／またはＮＲＣＯＲのうちの１つ以上で置換されていてもよい、ここで、各Ｒは独立してＨまたは低級アルキルである；
   ｍは、０または１であり；
   脂質は、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質またはステロイドを表す）
9. ^９９ｍＴ3ｃまたは^１１１Ｉｎを含む部分をキレート化する、請求項８に記載の化合物。
10. 各Ｒ^２がＨである、請求項８に記載の化合物。
11. 各ＸがＣＨを表す、請求項１０に記載の化合物。
12. スペーサー^１がリシン残基である、請求項８に記載の化合物。
13. スペーサー^２が存在し、ポリエチレングリコールを含む、請求項８に記載の化合物。
14. スペーサー^２が１つ以上のアミド結合を含む、請求項８に記載の化合物。
15. 前記脂質がホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリシン、ホスファチジルグリセロール、またはコレステロールである、請求項８に記載の化合物。
16. ビス−Ｐｙ−Ｌｙｓ−Ｃａｐ−ＰＥまたはビス−Ｐｙ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−ｃａｐ−ＰＥである、請求項８に記載の化合物。
17. ナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子が脂質／界面活性剤外層を有し、前記層中に、式（１）の複数の分子またはビス−Ｐｙ−Ｌｙｓ−Ｃａｐ−ＰＥもしくはビス−Ｐｙ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−ｃａｐ−ＰＥが埋め込まれている、組成物。
18. 式（１）の分子、ビス−Ｐｙ−Ｌｙｓ−Ｃａｐ−ＰＥまたはビス−Ｐｙ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−ｃａｐ−ＰＥが、^９９ｍＴｃまたは^１１１Ｉｎを含む部分をキレート化する、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記ナノ粒子が標的化リガンドとさらに結合している、請求項１７に記載の組成物。
20. 前記ナノ粒子が標的化リガンドとさらに結合している、請求項１８に記載の組成物。
21. 前記標的化リガンドが、α_ｖβ_３またはフィブリンと特異的に結合するペプチド模倣物を含む、請求項１９に記載の組成物。
22. 前記標的化リガンドが親水性リンカーを介して、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質またはステロイドである脂質部分と結合し、前記脂質部分が前記ナノ粒子の脂質／界面活性剤層中に埋め込まれている、請求項１９に記載の組成物。

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