JP2010252794A - 細胞培養用コラーゲンコート表面を模倣した合成表面の製造方法とそのような方法によって作製された培養表面 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、細胞培養用コラーゲンコートを模倣した合成表面の製造方法を開示するものである。そして、該方法は重合可能な１以上の有機化合物を含むモノマー源を供給する工程であって、少なくとも一つの有機化合物がプロリノールである工程と；モノマー源のプラズマを作製する工程と；少なくとも表面の一部にプラズマ接触させてプラズマコートした表面を供給する工程を含む。
【解決手段】このような方法は細胞培養用のコラーゲンコート表面を模倣した動物質不含の、合成、既知組成表面を提供するものである。
このような方法はコストおよび／又は動物由来のコラーゲンに関連した問題点を低減するだけではなく、大量生産も可能であるという利点もある。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養用コラーゲンコートを模倣した合成表面の製造方法に加え、そのような方法で調製した表面に関するものである。

コラーゲンコート表面は、肝細胞や角化細胞等のような初代細胞を含め、偏向性のある細胞の接着を促進するために、細胞培養に広く用いられてきた。一般的に、ヒトではない動物に由来するコラーゲン（例えばラットの尾）が細胞培養のコート表面に利用されている。

Dobkin and Zuraw (2003) Principles of Chemical Vapor Deposition.(Kluwer)

しかしながら、このようなコラーゲンの使用は、例えば、ヒトの治療への応用等で問題となることがある。ヒトのコラーゲンをこのような表面コートに使用することができるが、コストはとても高くなる。同様に、コラーゲンコート表面を模倣したペプチド配列でコートされた表面も細胞培養のために作られてきたが、そのような表面を製造するコストは相対的に高く、そして単純に大量生産には適さない。したがって、コラーゲンコート表面を模倣した動物質不含で、合成の現在入手可能なものよりも安価で、大規模製造に適した既知組成の表面を製造する方法に加え、そのような方法で調製した表面が必要とされる。

本発明は、コラーゲンコート表面を模倣した動物質不含で、合成の既知組成の細胞培養用の表面を製造する方法を開示する。有利なことに、そのような方法はコスト及び/または動物由来コラーゲンに関連した問題を低減するだけでなく、大量生産も可能とするものである。

特に、本発明は細胞培養用のコラーゲンコート表面を模倣した合成表面を製造する方法であって、
i）重合可能な１以上の有機化合物を含むモノマー源を供給であって、そのうち少なくとも１つの有機化合物がプロリノールである工程、
ii）モノマー源のプラズマを作製する工程、及び
iii）少なくとも表面の一部をプラズマに接触させ、前記プラズマ重合コート表面がコラーゲンコート表面の機能的特性の一つ以上を模倣するプラズマ重合コート表面を供給する工程からなる方法である。加えて、本発明は前記の方法によって製造された細胞培養に有用な表面を供給するものである。

本発明は、少なくとも表面の一部がプロリノールでコーティングされた細胞培養用の表面をも供給する。

本発明はさらに、少なくとも表面の一部が単一タイプのアミノ酸を含み、前記単一タイプのアミノ酸がプロリンである細胞培養用の表面を供給する。
これら及び他の本発明の特徴は以下の詳細な説明の研究を通してより理解されるであろう。

図１は対象となる発明に基づいた方法を表わしたフローチャートである。

本発明は、細胞培養用コラーゲンコート表面を模倣する合成表面の製造方法を開示する。同様に、本発明は細胞培養に有用な表面を供給する。コラーゲンは三重らせん多重コイル構造をして、それぞれのらせん単位に規則的なアミノ酸配置を有する。配列はしばしば、Gly-Pro-Y 又は Gly-X-Hyp (hydroxyproline)のパターンに伴い、X及びYは種々のアミノ酸であってもよく、Gly-Pro- Hypのモチーフは頻繁に現れる。

対象となる発明は、いかなる理論に限定されることを意図するものではないが、表面に固定あるいは不動化されたプロリン様のモノマーは１以上のコラーゲンコート表面の機能特性を模倣できるかもしれない。プロリン様のモノマーはプラズマ重合によって固定されていることが好ましい。一般的に、モノマーは重合過程において、減圧された容器に蒸気として容易に導入されるために、相対的に高い蒸気圧を伴うことを要する。例えば、アリルアミンあるいはアクリル酸のように、プラズマ重合に通常使用されるモノマーは、相対的に高い蒸気圧を有する。対照的にアミノ酸のような相対的に低い蒸気圧を有するモノマーは使用可能ではあるが、プラズマ重合の使用には好ましくない。

市販の不斉アミノ−アルコールであるプロリノール[例えば、Ｄ-プロリノールはシグマ−アルドリッチより入手できる（カタログＮＯ．８１７４４）]はプロリンの誘導体である。プロリノールは、アミノ酸であるプロリンよりも高い蒸気圧を有する液体であるため、プロリノールはそれをもってコート表面用のプラズマをつくる原料モノマーとして、より受け入れられ易い。特に、細胞培養用にプロリノールによってプラズマ重合処理した表面は、コラーゲンコート表面を模倣した合成表面を提供する。事実、ヒト肝細胞プロリノールのみコートし、さらに何ら細胞外基質蛋白質にコーティングしていない表面に付着することができる。

プラズマ重合のために、コートする細胞培養容器はプラズマ重合反応器に装填される。それから、容器はポンプによって減圧される。プロリノールを含むモノマー原料の蒸気は容器中に導入される。そして、高周波出力が開始され、容器中の細胞培養用器具の表面へのプロリノールの重合が開始する。

一実施形態では、ＲＦ励起プラズマがプラズマ重合に用いられる。しかしながら、例えば、グロー放電あるいはコロナ放電など気体プラズマを発生するいかなる方法も使用することができる。例えば、マイクロ波周波数をＲＦ励起の代わりに、あるいは加えて利用することができる。

一実施形態では、脈波プラズマである。代表的な脈波プラズマを含めたプラズマ重合条件は、これに限定されないが、１ｍｓ／５０ｍｓの開始／終了脈波とＲＦ出力１００Ｗ、１０ｍｓ／１００ｍｓの開始／終了脈波とＲＦ出力５Ｗ、３０ｍｓ／１００ｍｓの開始／終了脈波とＲＦ出力５Ｗ、及び５ｍｓ／５０ｍｓの開始／終了脈波とＲＦ出力１００Ｗである。

別の実施形態では、プラズマは連続波プラズマである。プラズマは連続波プラズマを含めた代表的なプラズマ重合条件は、これに限定されないが、ＲＦ出力５Ｗである。

典型的にプラズマ処理に用いられ、プラズマ容器に導入される気体はＡｒ、Ｈｅ、Ｎｅ、Ｈｅ、Ｈｅ／Ｈ₂、Ｏ₂、Ｎ₂、ＮＨ₃およびＣＦ₄である。

一実施形態では、プロリノールはプラズマ重合によって表面に沈着される。プロリノールをプラズマ重合して合成表面を生産する方法を示すフローチャートを図１に示す。一実施形態では、表面は１以上のコラーゲンコート表面の特性を模倣する。一実施形態では、ヒト肝細胞はコーティングに接着する。一実施形態では、コーティングは本質的にプロリノールからなる。

プロリノールを表面にコーティングする代替手段は、これに限定されないが、化学蒸着、または１以上のカルボキシル基、１以上のアミノ基、もしくはそれらの組み合わせによる共有結合による不動化を含む。特に化学蒸着について、ドブキン（Ｄｏｂｋｉｎ）とザロー（ Ｚｕｒａｗ）によって考察されている（非特許文献１）。一実施形態では、プロリノールは化学蒸着によって表面に沈着される。

別の実施形態では、プロリノールは、１以上のカルボキシル基、１以上のアミノ基、もしくはそれらの組み合わせによる共有結合によって表面に固定化される。共有結合のため、プロリノールのそれらへの結合が促進されるように、表面は前もって、１以上のカルボキシル基、１以上のアミノ基、もしくはそれらの組み合わせを含むように活性化することを要することが理解される。

プロリノールを表面に共有結合する代表的な手段は、これに限定されないが、カルボジイミド化学（たとえば、ＥＤＣ／ＮＨＳ）を用いたカルボキシル機能化表面の供給（すなわち、カルボキシル基が活性化される）に続き、プロリノールをそのような表面にＮＨＳ基とアミン反応を介して結合させることを含む。あるいは、アルデヒド機能化表面の供給に引き続き、プロリノールをそのような表面にシッフ塩基形成を介したアミン反応によって表面のアルデヒド基と結合させた後、シッフ塩基を水素化ホウ素ナトリウムによって安定させて共有結合の固定化を達成することができる。

同様に、対象とする発明について、理論に限定されることを意図しないが、表面に固定又は不動化された単一タイプのアミノ酸、すなわちプロリンは１以上のコラーゲンコートされた表面の機能的特性を模倣する。特に、プロリンはコラーゲンの約９％を構成する。

一実施形態では、プロリンは１以上のカルボキシル官能基、１以上のアミン官能基又はそれらの２以上の組合せによる共有結合によって固定される。一実施形態では、表面はコラーゲンコートされた表面の１以上の機能的特性を模倣する。一実施形態では、ヒトの肝細胞がコーティングに接着する。実施形態では、コーティングは本質的にプロリンからなる。

代表的なプロリンによる表面のコーティングの手段は、限定されないが、１以上のカルボキシル官能基、１以上のアミン官能基又はそれらの２以上の組合せとの共有結合を含む。共有結合のため、表面はあらかじめ 表面が１以上のカルボキシル官能基、１以上のアミン官能基又はそれらの２以上の組合せにプロリンの結合が促進されるように活性化されることを要すると理解される。

プロリノールの共有結合固定化と同様、プロリンの共有結合の代表的手段は、限定はされないが、カルボジイミド化学（すなわち、ＥＤＣ／ＮＨＳ）を用いたカルボキシル官能化表面の提供と（例えば、カルボキシル基が活性化される。）、それに続く、このような表面へのアミン反応による表面のＮＨＳ基へのプロリンの結合を含む。あるいは、アルデヒド機能化表面を供給し、それに続きこのような表面へのアミン反応によるこのような表面のアルデヒド基へのシッフ塩基形成によるプロリンの結合、引き続き、水素化ホウ素ナトリウムによるシッフ塩基安定化によるプロリンの共有結合が達成される。

一実施形態では、表面はマルチウェルプレート、ディッシュ又はフラスコである。一実施形態では、モノマー源は本質的にプロリノールからなる。

プロリノール又はプロリンによってコーティングされた表面に関して、ここで用いられる「コラーゲンコート表面の１以上の機能を模倣する」の語句は、コラーゲンコートされた表面への細胞の接着を含むコラーゲンの機能的特性には限定されない。例えば、コラーゲンコートされた表面へのヒト肝細胞の接着である。一実施形態では、１以上のコラーゲンコートされた表面の機能的特性はヒト肝細胞による接着を含む。

プロリンコート表面の、１以上のコラーゲンコート表面の機能特性を模倣する性能を調べるため、ヒト肝細胞を播種し、コラーゲンコートとプロリンコートの両表面を同一の培養条件下でモニターした。手短に述べると、冷凍保存された肝細胞を液体窒素貯蔵から取り出し、ただちに、細胞が殆ど凍結融解されるまで３７℃の温浴に置いた。その後、内容物は５０ｍＬのあらかじめ温めたＩＳＯＭの播種培地に移した。チューブは室温にて低速遠心で５０×ｇ、５分間遠心操作した。上清液は吸引して廃棄した。細胞残渣は１〜２ｍＬのＩＳＯＭの播種培地に再懸濁した。細胞数をカウントして、ＩＳＯＭの播種培地にて１０⁶細胞／ｍＬの密度に希釈した。細胞は密度４×１０⁵細胞／ウェル（すなわち、体積４００ｍＬ／ウェル、１０⁶細胞／ｍＬ）で、２４ウェルプレートに播種した。特に、プロリノールコート又はタイプＩコラーゲンコートプレート。プレートは、３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーター内に４時間置いた。その時間経過後、ＩＳＯＭの播種培地は吸引し、細胞は４００μＬ／ウェルのＨｅｐａｔｏＳＴＩＭ（登録商標）培地（ＢＤ、カタログ＃３５５０５６）を与えられた。肝細胞の接着は２４時間後に観察した。

加えて、数日間の細胞培養の後、表面への細胞接着と伸展を解析し、顕微鏡画像を撮影した。特に、ヒト肝細胞のプリノールコート表面への接着はコラーゲンコート表面への観察に似かよっていた。その上、特筆すべきは、ヒト肝細胞は、プロリノールコート表面へ、なんらそれ以上の細胞外マトリックス蛋白質なしで接着した。

Claims (20)

1. 細胞培養用コラーゲンコート表面を模倣した合成表面の製造方法であって、
   i）重合可能な１以上の有機化合物を含むモノマー源を供給する工程であって、そのうち少なくとも１つの有機化合物がプロリノールである工程と、
   ii）モノマー源のプラズマを作製する工程と、
   iii）少なくとも表面の一部をプラズマ接触にさせ、コラーゲンコート表面の１以上の機能的特性を模倣するプラズマ重合コート表面を供給する工程とを含むことを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、プラズマが脈波プラズマであることを特徴とする方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、プラズマが連続波プラズマであることを特徴とする方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、表面がマルチウェルプレート、ディッシュ又はフラスコであることを特徴とする方法。
5. 請求項１に記載の方法であって、モノマー源が本質的にプロリノールであることを特徴とする方法。
6. 請求項１に記載の方法であって、１以上のコラーゲンコート表面の機能的特性は、ヒト肝細胞の接着を含むことを特徴とする方法。
7. 請求項１記載の方法によって製造された表面。
8. 請求項５記載の方法によって製造された表面。
9. 細胞培養用の表面であって、すくなくとも前記表面の一部がプロリノールを含有する表面。
10. 請求項９記載の表面であって、プロリノールがプラズマ重合によって沈着されることを特徴とする表面。
11. 請求項９記載の表面であって、プロリノールが化学蒸着によって沈着されることを特徴とする表面。
12. 請求項９記載の表面であって、プロリノールが１以上のカルボキシル官能基、１以上のアミノ官能基、又はそれらの組み合わせへの共有結合によって表面に固定されることを特徴とする表面。
13. 請求項９記載の表面であって、前記表面がコラーゲンコート表面の１以上の機能的特性を模倣することを特徴とする表面。
14. 請求項９記載の表面であって、前記表面にヒト肝細胞が接着することを特徴とする表面。
15. 請求項９記載の表面であって、前記コーティングが本質的にプロリノールからなること特徴とする表面。
16. 細胞培養用の表面であって、すくなくとも前記表面の一部が単一種類のアミノ酸を含有するコーティングからなり、前記単一種類のアミノ酸がプロリンであることを特徴とする表面。
17. 請求項１６記載の表面であって、プロリンが１以上のカルボキシル官能基、１以上のアミノ官能基、又はそれらの組み合わせへの共有結合によって表面に固定されることを特徴とする表面。
18. 請求項１６記載の表面であって、前記表面がコラーゲンコート表面の１以上の機能的特性を模倣することを特徴とする表面。
19. 請求項１６記載の表面であって、前記コーティングにヒト肝細胞が接着することを特徴とする表面。
20. 請求項１６記載の表面であって、前記コーティングが本質的にプロリノンからなること特徴とする表面。

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