JP2010239873A - Selex法用のプライマーの設計方法、プライマーの製造方法、アプタマーの製造方法、プライマーの設計装置、プライマー設計用コンピュータプログラムおよび記録媒体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明のプライマー設計方法は、プライマー候補配列を生成する工程(S1)と、予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択する工程(S2)と、前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成する工程(S3)と、前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択する工程(S4)と、前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定する工程(S5)とを、コンピュータを用いて実施することを特徴とする。
【選択図】 図2
Description
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成工程と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択工程と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成工程と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択工程と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定工程とを、コンピュータを用いて実施してSELEX法用のプライマーを設計することを特徴とする。
プライマー設計工程と、
前記設計工程で設計されたプライマーの配列に基づきプライマーを合成する合成工程とを有し、
前記プライマー設計工程が、前記本発明のプライマー設計方法により実施されることを特徴とする。
データ処理装置、記憶装置、入力装置および出力装置を備え、
前記データ処理装置が、
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成手段と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択手段と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成手段と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択手段と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定手段を含むことを特徴とする。
図1に、本発明のプライマー設計装置の一例の構成を示す。図示のように、本例の装置は、入力装置11、記憶装置12、出力装置13およびデータ処理装置14を主要構成要素とする。入力装置11は、データ処理装置14に情報を入力するためのものであり、例えば、キーボード、キーシート、マウス、USB等の端子、CDやCD-R等のドライブ等があげられる。記憶装置12は、プライマー設計条件に関する情報、ランダムプールに関する情報、設計されたプライマー配列に関する情報等の各種情報および各種プログラムを記憶するためのものであり、例えば、フラッシュメモリ、RAMおよびROM等を適宜組み合わせて構成される。出力装置は、設計されたプライマー配列情報およびその他の情報を出力するためのものであり、例えば、ディスプレーおよびプリンターがあげられる。データ処理装置14は、プライマー設計のための一連の処理を行うものであり、例えば、中央演算処理装置(CPU)があげられる。本例のデータ処理装置14は、プライマー候補配列生成手段141、プライマー候補配列選択手段142、ランダムプール生成手段143、ランダムプール選択手段144およびプライマー配列決定手段145を備える。本発明において、プライマー設計装置は、一台のコンピュータで構成してもよいし、複数のコンピュータにより構成してもよい。
まず、プライマー候補配列生成手段により、プライマー候補配列を生成する。プライマー配列は、例えば、A,G,C,T,Uの塩基を組み合わせたものである。配列がDNAの場合は、Tを使用し、RNAの場合は、Uを使用する。プライマー候補配列は、3´末端側および5´末端側の二種類を生成する必要がある。プライマー候補配列の長さ(塩基数)は、特に制限されないが、10〜100塩基数であり、好ましくは、15〜50塩基数であり、より好ましくは、20〜30塩基数である。プライマー候補配列は、例えば、ランダムに配列を生成してもよいし、既知のプライマー配列のデータベースを参照して生成してもよい。また、入力装置11からプライマー候補配列を入力してもよい。
つぎに、生成されたプライマー候補配列を、予め設定された基準に従い評価し、前記基準を満たすプライマー候補配列を選択する。この場合、前記基準を満たすプライマー候補配列でない場合(No)は、再度、プライマー候補配列を生成し、前記基準を満たすプライマー候補配列の場合(Yes)は、次のステップに進む。前記基準は、例えば、プライマーの二次構造形成能、Tm値、ナトリウム濃度、GC含量、GC含量のぶれ幅、核酸濃度、GCにおけるGとCの偏り、ATにおけるAとTの偏り等があげられる。前記プライマーの二次構造形成能は、例えば、Max free energy(プライマーの構造として許容する自由エネルギーの閾値)があげられる。プライマー候補配列の評価は、例えば、遺伝子増幅のプライマーを設計するためのソフトウエアを使用することができる。このようなソフトウエアは、市販品を用いてもよいし、インターネットで公開されているサイトにあるものを使用してもよい。また、これらの遺伝子増幅のプライマー設計ソフトウエアは、プライマー配列を生成することもできるものも多く、このようなソフトウエアを使用した場合は、プライマー候補配列の生成(S1)および選択(S2)を同時に実施することも可能である。
前記ランダムプールは、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を、複数含む核酸配列混合物(ライブラリー)である。前記ランダム配列は、アプタマー候補となる配列であり、例えば、A,G,C,およびUまたはTの塩基をランダムに連結した配列である。前記ランダム配列の長さ(塩基数)は、例えば、20〜120塩基数であり、好ましくは、30〜80塩基数であり、より好ましくは、30〜40塩基数である。前記ランダムプールに含まれる前記核酸配列の種類は、例えば、420〜4120種類(約1012〜1072種類)であり、好ましくは、430〜460種類(約1018〜1036種類)である。
次に、生成したランダムプールについて、各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択する。前記構造の予測には、例えば、DNAおよびRNA等の構造を予測する既知のソフトウエアを使用することができる。前記基準としては、二次構造の多様性を使用することができる。二次構造の多様性としては、グラフ構造によるクラス分類を使用することができる(GEVERTZ J. et.al. RNA 2005;11;853-863)。二次構造の前記グラフ構造によるクラス分類を、図5に示す。同図に示すように、前記クラス分類は、ステムを辺(−)として表し、ループを点(・)として表すものである。同図では、点の数が7以下のグラフ構造を示すものである。そして、前記基準を満たさない場合(No)は、再度、ランダムプールの生成ステップに戻り、前記基準を満たす場合(Yes)は、次のステップに進む。
次に、前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列に採用し、前記配列をプライマー配列として決定する。決定されたプライマー配列情報は、ディスプレー等の出力装置から出力される(S6)。その他、決定されたプライマー配列情報は、記憶装置に記憶されてもよい。
次に、通信インターフェース(通信装置)を備えたプライマー設計装置の例について説明する。本例の装置の構成を図3に示す。図3において、図1と同一部分には同一符号を付している。図示のように、本例の装置は、前記実施形態1の装置と、通信インターフェースを備えてインターネット等の通信回線網に接続可能な他は、主要構成は同様である。図4に示すように、本例の装置1は、インターネット等の通信回線網2を介して、装置外に設置されたサーバー3に接続可能である。したがって、例えば、プライマー候補配列の生成、プライマー候補配列の評価、ランダムプールの生成、およびランダムプールの各核酸配列の構造予測等の各種の工程を、装置外のサーバーにあるサイトのプログラムにより、実施可能である。したがって、本例の装置は、プライマー候補配列生成手段、プライマー候補配列選択手段、ランダムプール生成手段、ランダムプール選択手段およびプライマー配列決定手段の少なくとも一つを、装置外のサーバーのサイトにあるプログラムで実行することが可能であり、その場合は、本例の装置のデータ処理装置は、装置外のサーバーのプログラムで実行する各前記手段については含まなくてもよい。
本実施形態は、前記本発明のプライマー設計方法で設計されたプライマー配列に基づき、プライマーを製造する方法である。プライマーの設計方法は、前述のとおりである。また、プライマーの合成方法は、既知の方法を使用でき、例えば、DNA合成装置やRNA合成装置により、dNTP等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。前記合成装置としては、市販品を使用してもよい。
本実施形態は、前記本発明のプライマー製造方法で製造したプライマーを用い、SELEX法によりアプタマーを製造する方法の一例である。プライマーの製造は、前述のとおりである。下記において、SELEX法について、説明する。
本発明において、前記アプタマーとは、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子であり、例えば、一本鎖RNAおよび一本鎖DNA等の一本鎖核酸や、二本鎖RNAおよび二本鎖DNA等の二本鎖核酸があげられる。前記核酸アプタマーが、後者の二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。前記核酸アプタマーは、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよく、前記二次構造としては、例えば、ステムループ構造があげられる。
プライマー候補配列の生成および選択は、例えば、Oligo Calculator(http://www.genosys.jp/whatsnew/active/active_manual.html、シグマジェノシス社製)等を使用して行った。主要な評価基準として、二次構造の形成能を採用した。二次構造を形成し易いプライマーセットと形成し難いプライマーセットの差異として、Max free energy(プライマーの構造として許容するエネルギーの閾値)のパラメーターを用い、形成し易いものは、-10kcal/molに設定し、形成し難いものは-1kcal/molに設定した。その他の共通のパラメーターは、前記ソフトウエアのデフォルト値に従って以下の通りにした。
FwTm limit=75.0(Fwプライマーのt7配列込みのTm値が75程度)
RvTm limit=65.0(RvプライマーのTm値が65程度)
Ct concentration=1.0(PCR時の核酸濃度が1.0μmol/L(μM))
Na+ concentration=50.0(PCR時のNa+濃度が50.0mmol/L(mM))
GC%=0.6(t7配列を除くFwとRvのプライマーのGC%がそれぞれ60%程度)
GC% range=0.1(上記GC%のぶれ幅を±10%まで許容。50%〜70%)
Minimum Na%=0.4(t7配列を除くFwとRvに含まれるGCにおけるGとC、ATにおけるAとTの偏りを4:6まで許容)
前述のようにして生成したプライマー候補配列を、二次構造を形成し易いセットと形成し難いセットのそれぞれに10000セットずつ用意し、それぞれのプライマーセットに対して100本の塩基数40のランダム配列を付加し、ランダムプールを生成した。また、生成したプライマーセットのFw側の末端にGGGGを、Rv側の先端にCCCCを付加したプライマーセットを別途生成し、前述と同様にしてランダム配列を付加し、ランダムプールを生成した。
二次構造予測には、ViennaPackageのRNAfold(例えば、文献Hofacker, I. L., Nucl. Acids Res. 2003 31:3429-3431、http://www.tbi.univie.ac.at/RNA/)を用いた。RNAfoldの実行には-noLPオプションを付加し、一つの塩基対のみで形成されるステムを許容しないこととした。また、ランダム配列のみの二次構造を予測するために、RNAfoldの実行により二次構造を得た後、かつ後述の多様性の評価の前に、得られた二次構造のうち、プライマー候補配列で形成されるステムについてはループに置換した。
二次構造の多様性の評価は、例えば、論文"GEVERTZ J. et.al. RNA 2005;11:853-863"に基づいて行った。この論文では、二次構造予測結果を入力として、二次構造の構造クラスを判定することが提案されている。二次構造の構造クラスについては、前記論文で採用されているグラフ構造によるクラス分類を採用した。
図6および図7のグラフに、ランダムプールの二次構造の頂点の数の分布を示す。前記両図において、strは、二次構造を形成しやすいプライマーセットのランダムプールを示し、nstrは、二次構造を形成し難いプライマーセットのランダムプールを示し、str_GCは、二次構造を形成しやすいプライマーセットにGGGG+CCCCを付加したランダムプールを示し、nstr_GCは、二次構造を形成し難いプライマーセットにGGGG+CCCCを付加したランダムプールを示し、これらは、下記の図8および図9も同じである。
前述のように、GGGGおよびCCCCを付加した場合に、直線型の二次構造が出現する確率が高くなった。このため、取得されるランダムプールの核酸配列の小型化を目的とする場合は、GGGGおよびCCCCを付加したプライマー配列を採用すればよく、逆に、取得されるランダムプールの核酸配列の小型化を目的せず、二次構造の多様化を目的とする場合は、GGGGおよびCCCCを付加しないプライマー配列を採用すればよい。
前述のように、str_GC、nstr_GC、strおよびnstrの順序で二次構造の多様性が低くなっているので、二次構造の多様性を目的とする場合は、二次構造を形成し難く、かつGGGG+CCCCを付加しないプライマー配列を採用すればよい。これとは逆に、アプタマー取得後の後加工を容易にするためには、二次構造の多様性は低い方がよいので、この目的のためには、二次構造を形成し易く、かつGGGG+CCCCが付加されたプライマー配列を採用すればよい。
2 通信回線網
3 サーバー
11 入力装置
12 記憶装置
13 出力装置
14 データ処理装置
15 通信インターフェース
141 プライマー候補配列生成手段
142 プライマー候補配列選択手段
143 ランダムプール生成手段
144 ランダムプール選択手段
145 プライマー配列決定手段
Claims (14)
- プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成工程と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択工程と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成工程と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択工程と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定工程とを、コンピュータを用いて実施してSELEX法用のプライマーを設計することを特徴とするプライマーの設計方法。 - 前記プライマー候補配列選択工程の前記基準が、プライマーの二次構造形成能に関する基準であることを特徴とする請求項1記載のプライマー設計方法。
- 前記ランダムプール選択工程の前記基準が、前記核酸配列の前記ランダム配列が取り得る二次構造の多様性に関する基準であることを特徴とする請求項1または2記載のプライマー設計方法。
- 前記核酸配列が、さらに、ランダム配列に対する固定配列を含むことを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載のプライマー設計方法。
- プライマー設計工程と、
前記設計工程で設計されたプライマーの配列に基づきプライマーを合成する合成工程とを有し、
前記プライマー設計工程が、請求項1から4のいずれか一項に記載のプライマー設計方法により実施されることを特徴とするSELEX法用のプライマーの製造方法。 - 請求項5記載の製造方法により製造されたプライマーを用いたSELEX法によりアプタマーを製造することを特徴とするアプタマーの製造方法。
- データ処理装置、記憶装置、入力装置および出力装置を備え、
前記データ処理装置が、
プライマー候補配列を生成するプライマー候補配列生成手段と、
予め設定した基準に基づき、前記プライマー候補配列を評価してプライマー候補配列を選択するプライマー候補配列選択手段と、
前記選択されたプライマー候補配列に基づき、ランダム配列およびプライマー候補配列を含む核酸配列を複数含むランダムプールを生成するランダムプール生成手段と、
前記ランダムプールの各核酸配列の構造を予測し、予め設定された基準に基づき、前記予測構造を評価してランダムプールを選択するランダムプール選択手段と、
前記選択されたランダムプールに使用されたプライマー候補配列を、プライマー配列として採用することを決定するプライマー配列決定手段を含むことを特徴とするSELEX法用のプライマー設計装置。 - 前記プライマー候補配列選択工程の前記基準が、プライマーの二次構造形成能に関する基準であることを特徴とする請求項7記載のプライマー設計装置。
- 前記ランダムプール選択工程の前記基準が、前記核酸配列の前記ランダム配列が取り得る二次構造の多様性に関する基準であることを特徴とする請求項7または8記載のプライマー設計装置。
- 前記核酸配列が、さらに、ランダム配列に対する固定配列を含むことを特徴とする請求項7から9のいずれか一項に記載のプライマー設計装置。
- さらに、通信装置を備え、前記通信装置により、装置外の通信回線網を介してサーバーに接続可能であり、前記サーバー内のプログラムにより、前記プライマー候補配列生成手段、前記プライマー候補配列選択手段、前記ランダムプール生成手段、前記ランダムプール選択手段および前記プライマー配列決定手段からなる群の少なくとも一つの手段を実行可能であることを特徴とする請求項7から10のいずれか一項に記載のプライマー設計装置。
- 前記データ処理装置が、前記サーバー内のプログラムにより実行される手段を含まないことを特徴とする請求項11記載のプライマー設計装置。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のプライマー設計方法をコンピュータ上で実行可能なことを特徴とするSELEX法用のプライマー設計用コンピュータプログラム。
- 請求項13記載のSELEX法用のプライマー設計用コンピュータプログラムが格納されたことを特徴とする記録媒体。
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