JP2010235492A - Chaperonine-target protein complex and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、シャペロニン−目的タンパク質複合体及びその製造方法に関する。本発明は、エンドセリン受容体等の膜受容体を標的とする医薬品開発等に有用なものである。 The present invention relates to a chaperonin-target protein complex and a method for producing the same. The present invention is useful for drug development targeting membrane receptors such as endothelin receptors.
細胞表面上の膜受容体は、細胞外の情報を細胞内へ伝達するきわめて重要な働きを担っている。膜受容体に結合する物質はアゴニスト型／アンタゴニスト型医薬の候補となり得るため、膜受容体と被験物質との結合性や相互作用を正確かつ迅速に解析する技術が求められている。 Membrane receptors on the cell surface play an extremely important role in transmitting extracellular information into the cell. Since a substance that binds to a membrane receptor can be a candidate for an agonist / antagonist drug, a technique for accurately and rapidly analyzing the binding property and interaction between the membrane receptor and a test substance is required.
膜受容体を単離・精製する方法としては、細胞膜上に所望の膜受容体を発現させ、膜画分を界面活性剤等で可溶化し、その後、クロマトグラフィー等の手法を用いて行うのが一般的である。しかし、膜受容体はそれ自体が構造的に不安定であり、精製の過程でしばしば失活してしまい、取扱いが難しい。精製された膜受容体が不安定となる理由としては、膜受容体は細胞膜上では他のサブユニットや補因子によって安定化されているが、精製の過程で当該のサブユニット等が脱落してしまうことが考えられる。そのため、活性低下をできるだけ抑えるべく、膜受容体の活性保持に必要なサブユニット等を脱落させないような、できるだけ穏やかな条件で短時間に単離・精製を行う必要がある。また精製された膜受容体の保存についても、５℃程度の冷蔵あるいは−８０℃程度の超低温冷凍保存が一般に採用されている。しかし、実際には超低温冷凍保存によっても活性低下を抑えることはできず、長期保存は難しい。このような現状の下、膜受容体を用いる実験、例えば膜受容体の結晶構造解析を行う際には、精製した膜受容体を保存することなく直ちに結晶作製等の次工程に供するのが、膜受容体を取り扱う上での技術常識となっている。なお、大腸菌等のバクテリアを宿主として膜受容体を大量発現させる系が存在するが、この系では、動物細胞の細胞膜上に存在している天然型の膜受容体と構造的に同等のものを得ることが一般に困難である。 As a method for isolating and purifying the membrane receptor, a desired membrane receptor is expressed on the cell membrane, the membrane fraction is solubilized with a surfactant or the like, and then subjected to a method such as chromatography. Is common. However, membrane receptors themselves are structurally unstable and are often deactivated during the purification process, making them difficult to handle. The reason why the purified membrane receptor becomes unstable is that the membrane receptor is stabilized on the cell membrane by other subunits and cofactors. It is possible to end up. Therefore, in order to suppress the decrease in activity as much as possible, it is necessary to carry out isolation and purification in a short time under conditions as gentle as possible so as not to drop out subunits and the like necessary for maintaining the activity of the membrane receptor. In addition, for storage of the purified membrane receptor, refrigeration at about 5 ° C. or ultra-low temperature freezing at about −80 ° C. is generally employed. However, in practice, the decrease in activity cannot be suppressed even by ultra-low temperature freezing storage, and long-term storage is difficult. Under such circumstances, when conducting an experiment using a membrane receptor, for example, a crystal structure analysis of the membrane receptor, the purified membrane receptor is immediately subjected to the next step such as crystal production without storing it. It has become common technical knowledge in handling membrane receptors. In addition, there is a system that expresses a large amount of membrane receptors using bacteria such as E. coli as a host. In this system, a structurally equivalent membrane receptor that is naturally present on the cell membrane of animal cells is used. It is generally difficult to obtain.
一方、目的タンパク質を安定した状態で保持できる技術として、シャペロニンのリング状構造体を利用する技術が知られている。シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質である。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合体を形成している。そしてシャペロニンは、そのリング状構造体の内部に他のタンパク質を格納可能であり、当該タンパク質を正しく折り畳む（リフォールディング）と共に外部環境から隔離することができる。 On the other hand, as a technique that can hold a target protein in a stable state, a technique that uses a ring structure of chaperonin is known. Chaperonin is a kind of molecular chaperone and is a complex protein composed of subunits (chaperonin subunits) having a molecular weight of about 60,000. A typical chaperonin forms a large cylindrical complex having a total molecular weight of about 800,000 to 1,000,000, in which two ring-shaped structures composed of 7 to 9 chaperonin subunits overlap. Chaperonin can store other proteins inside its ring-shaped structure, and can correctly fold (refold) the protein and isolate it from the external environment.
２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結された人工タンパク質（シャペロニン連結体）が作製されている（特許文献１）。天然型のシャペロニンと同様に、シャペロニン連結体もリング状構造体を形成することができ、その内部に目的タンパク質を格納可能である。また、シャペロニン連結体と目的タンパク質とが非共有結合的に結合した「シャペロニン−目的タンパク質複合体」も知られている（特許文献２）。特許文献２によれば、いくつかの目的タンパク質とシャペロニンの組み合わせについて、シャペロニン−目的タンパク質複合体がリング状構造体を形成することができ、その内部に目的タンパク質を格納可能であることが実証されている。この際、シャペロニン連結体あるいは目的タンパク質を発現させる宿主として、大腸菌が用いられている。 An artificial protein (chaperonin linked body) in which two or more chaperonin subunits are connected in series has been produced (Patent Document 1). Similar to the natural chaperonin, the chaperonin linked body can also form a ring-shaped structure, and the target protein can be stored therein. A “chaperonin-target protein complex” in which a chaperonin conjugate and a target protein are non-covalently bonded is also known (Patent Document 2). According to Patent Document 2, for some combinations of target proteins and chaperonins, it has been demonstrated that the chaperonin-target protein complex can form a ring-like structure and the target protein can be stored therein. ing. At this time, E. coli is used as a host for expressing the chaperonin conjugate or the target protein.
上述のように、膜受容体は取扱いが難しいものであり、膜受容体を活性保持した状態で容易に扱える技術が求められている。本発明の目的は、単離・精製された膜受容体を活性保持した状態で安定化することができ、膜受容体の取扱いを容易にする技術を提供することにある。 As described above, the membrane receptor is difficult to handle, and there is a need for a technique that can easily handle the membrane receptor while maintaining its activity. An object of the present invention is to provide a technique that makes it possible to stabilize an isolated and purified membrane receptor while maintaining its activity and facilitate the handling of the membrane receptor.
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなるシャペロニン連結体と、当該シャペロニン連結体に対して非共有結合的に結合している目的タンパク質とを含み、前記シャペロニンサブユニットがリング状に配置されてなるリング状構造体を形成可能であると共に当該リング状構造体の内部に前記目的タンパク質を格納可能なシャペロニン−目的タンパク質複合体であって、前記目的タンパク質は、動物細胞内で発現させた膜受容体であることを特徴とするシャペロニン−目的タンパク質複合体である。 The invention according to claim 1 for solving the above-described problem is a chaperonin linked body in which two or more chaperonin subunits are linked in series, and a non-covalent bond to the chaperonin linked body. A chaperonin-target protein complex capable of forming a ring-shaped structure in which the chaperonin subunits are arranged in a ring shape and storing the target protein in the ring-shaped structure The chaperonin-target protein complex is characterized in that the target protein is a membrane receptor expressed in an animal cell.
本発明はシャペロニン−目的タンパク質複合体に係るものである。本発明のシャペロニン−目的タンパク質複合体（以下、単に「本発明の複合体」と略記することがある。）は、シャペロニン連結体と目的タンパク質たる膜受容体とを含むものであり、当該膜受容体がシャペロニン連結体に対して非共有結合的に結合することで複合体を構成している。また複合体自体は、シャペロニンサブユニットがリング状に配置されてなるリング状構造体を形成可能であり、かつ当該リング状構造体の内部に膜受容体を格納可能である。そして、本発明の複合体は上記の基本構成を備えるとともに、目的タンパク質たる膜受容体として動物細胞内で発現された膜受容体を有している。本発明の複合体では、含まれる膜受容体が動物細胞内で発現されたものであり、大腸菌等で発現させたものではない。そのため、細胞膜上に存在する天然型の膜受容体に、構造的に極めて近い。さらに、リング状構造体の内部に当該膜受容体を格納可能であるので、膜受容体が活性を保った状態で安定的に保持される。そのため、本発明の複合体によれば、天然型に極めて近い構造の膜受容体を、安心かつ容易に取り扱うことができる。またさらに、本発明の複合体はシャペロニン連結体と膜受容体とが非共有結合的に結合したものであるので、複合体を製造する際に必要となるシャペロニン連結体と膜受容体との結合を容易に行える。 The present invention relates to a chaperonin-target protein complex. The chaperonin-target protein complex of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “complex of the present invention”) includes a chaperonin conjugate and a membrane receptor as a target protein. The body forms a complex by binding non-covalently to the chaperonin conjugate. The complex itself can form a ring-shaped structure in which chaperonin subunits are arranged in a ring shape, and a membrane receptor can be stored in the ring-shaped structure. And the composite_body | complex of this invention has the said basic structure, and has the membrane receptor expressed in the animal cell as a membrane receptor which is a target protein. In the complex of the present invention, the contained membrane receptor is expressed in animal cells, and is not expressed in Escherichia coli or the like. Therefore, it is structurally very close to the natural membrane receptor present on the cell membrane. Further, since the membrane receptor can be stored inside the ring-shaped structure, the membrane receptor is stably held in a state where the activity is maintained. Therefore, according to the complex of the present invention, a membrane receptor having a structure very close to that of a natural type can be handled safely and easily. Furthermore, since the complex of the present invention is a non-covalent bond of a chaperonin conjugate and a membrane receptor, the binding between the chaperonin conjugate and the membrane receptor required for producing the complex is required. Can be easily performed.
ここで「非共有結合的な結合」とは、共有結合以外の結合をいい、具体的には、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、などが例示される。 Here, “non-covalent bond” means a bond other than a covalent bond, and specific examples include ionic bond, hydrogen bond, van der Waals force, hydrophobic interaction, and the like.
請求項２に記載の発明は、シャペロニン連結体と目的タンパク質のいずれか一方にアフィニティタグが連結され、他方に当該アフィニティタグに対する特異的親和性を有するパートナータグが連結され、シャペロニン連結体と目的タンパク質とが前記アフィニティタグと前記パートナータグとを介して非共有結合的に結合していることを特徴とする請求項１に記載のシャペロニン−目的タンパク質複合体である。 The invention according to claim 2 is characterized in that an affinity tag is linked to one of the chaperonin conjugate and the target protein, and a partner tag having specific affinity for the affinity tag is linked to the other, the chaperonin conjugate and the target protein. 2. The chaperonin-target protein complex according to claim 1, wherein non-covalently binding to each other via the affinity tag and the partner tag.
本発明の複合体では、シャペロニン連結体と目的タンパク質のいずれか一方にアフィニティタグ、他方にパートナータグが連結されており、当該アフィニティタグと当該パートナータグとの特異的親和性によってシャペロニン連結体と膜受容体とが非共有結合的に結合している。本発明ではアフィニティタグ／パートナータグの組み合わせを採用しているので、シャペロニンや膜受容体の種類を問わない画一的な構成をもってシャペロニン−目的タンパク質複合体を構築することができる。 In the complex of the present invention, an affinity tag is linked to one of the chaperonin conjugate and the target protein, and a partner tag is linked to the other, and the chaperonin conjugate and the membrane depend on the specific affinity between the affinity tag and the partner tag. It is non-covalently bound to the receptor. Since the affinity tag / partner tag combination is employed in the present invention, a chaperonin-target protein complex can be constructed with a uniform structure regardless of the type of chaperonin or membrane receptor.
ここで「アフィニティタグ／パートナータグ」とは、例えば、抗原／抗体、酵素／基質のような非共有結合的な特異的親和性を有する２種類の物質をタグとして使用するとき、一方をアフィニティタグ、他方をパートナータグと称する。 Here, the “affinity tag / partner tag” means, for example, when two kinds of substances having non-covalent specific affinity such as antigen / antibody and enzyme / substrate are used as a tag, one of them is an affinity tag. The other is called a partner tag.
前記アフィニティタグと前記パートナータグがＳ−タグとＳ−タンパク質との組み合わせからなる構成が好ましい（請求項３）。 The affinity tag and the partner tag are preferably composed of a combination of an S-tag and an S-protein (claim 3).
前記膜受容体がエンドセリン受容体である構成が好ましい（請求項４）。 A configuration in which the membrane receptor is an endothelin receptor is preferred (claim 4).
前記シャペロニンが大腸菌ＧｒｏＥＬである構成が好ましい（請求項５）。 The chaperonin is preferably Escherichia coli GroEL (Claim 5).
請求項６に記載の発明は、請求項１〜５のいずれかに記載のシャペロニン−目的タンパク質複合体を製造する方法であって、所望の膜受容体を発現している動物細胞の破砕物から当該膜受容体を単離する第一工程と、第一工程で単離された膜受容体をシャペロニン連結体に対して非共有結合的に結合させる第二工程とを包含することを特徴とするシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法である。 The invention according to claim 6 is a method for producing the chaperonin-target protein complex according to any one of claims 1 to 5, wherein the chaperonin-target protein complex is obtained from a crushed animal cell expressing a desired membrane receptor. A first step of isolating the membrane receptor; and a second step of non-covalently binding the membrane receptor isolated in the first step to the chaperonin conjugate. This is a method for producing a chaperonin-target protein complex.
本発明はシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法に係るものである。本発明のシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」と略記することがある。）は、上記した本発明の複合体を製造する方法に係り、動物細胞から膜受容体を単離する第一工程と、シャペロニン連結体と膜受容体とを結合させる第二工程を包含する。本発明の製造方法によれば、天然型に極めて近い構造の膜受容体を安定的に保持できる本発明の複合体を、効率的に製造することができる。 The present invention relates to a method for producing a chaperonin-target protein complex. The method for producing the chaperonin-target protein complex of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as “the method of production of the present invention”) relates to the above-described method for producing the complex of the present invention, from animal cells. A first step of isolating the membrane receptor and a second step of binding the chaperonin conjugate and the membrane receptor are included. According to the production method of the present invention, the complex of the present invention capable of stably holding a membrane receptor having a structure very close to that of a natural type can be efficiently produced.
請求項７に記載の発明は、第一工程において、前記動物細胞又はその破砕物を界面活性剤又は脂質で処理することを特徴とする請求項６に記載のシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法である。 The invention according to claim 7 is the method for producing a chaperonin-target protein complex according to claim 6, wherein in the first step, the animal cell or a crushed product thereof is treated with a surfactant or a lipid. It is.
かかる構成により、活性を保った状態の膜受容体を容易に調製することができる。 With such a configuration, a membrane receptor in a state where the activity is maintained can be easily prepared.
請求項８に記載の発明は、前記動物細胞は、膜受容体をコードする遺伝子とアフィニティタグ又はパートナータグをコードする遺伝子とを連結させてなる融合遺伝子を有し、当該融合遺伝子を発現しているものであることを特徴とする請求項６又は７に記載のシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法である。 The invention according to claim 8 is characterized in that the animal cell has a fusion gene obtained by linking a gene encoding a membrane receptor and a gene encoding an affinity tag or partner tag, and expressing the fusion gene. The method for producing a chaperonin-target protein complex according to claim 6 or 7, wherein
本発明の製造方法は、主に、シャペロニン連結体と膜受容体とがアフィニティタグ／パートナータグを介して結合している本発明の複合体を製造する方法に係るものである。本発明では、アフィニティタグ又はパートナータグを連結させた膜受容体を調製するにあたり、膜受容体をコードする遺伝子とアフィニティタグ又はパートナータグをコードする遺伝子とを連結させてなる融合遺伝子を利用し、当該融合遺伝子を発現している動物細胞から膜受容体を調製する。本発明によれば、シャペロニン連結体と膜受容体とがアフィニティタグ／パートナータグを介して結合している本発明の複合体を、より効率的に製造することができる。 The production method of the present invention mainly relates to a method of producing a complex of the present invention in which a chaperonin conjugate and a membrane receptor are bound via an affinity tag / partner tag. In the present invention, in preparing a membrane receptor linked with an affinity tag or partner tag, a fusion gene obtained by linking a gene encoding a membrane receptor and a gene encoding an affinity tag or partner tag is used, A membrane receptor is prepared from an animal cell expressing the fusion gene. According to the present invention, the complex of the present invention in which a chaperonin conjugate and a membrane receptor are bound via an affinity tag / partner tag can be more efficiently produced.
本発明のシャペロニン−目的タンパク質複合体によれば、天然型に極めて近い構造の膜受容体を、安心かつ容易に取り扱うことができる。その結果、膜受容体を標的とした被験物質のスクリーニング等を簡単かつ正確に行うことが可能となる。 According to the chaperonin-target protein complex of the present invention, a membrane receptor having a structure very close to that of a natural type can be handled safely and easily. As a result, it becomes possible to easily and accurately perform screening of a test substance targeting the membrane receptor.
本発明のシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法によれば、本発明の複合体を効率的に製造することができる。 According to the method for producing a chaperonin-target protein complex of the present invention, the complex of the present invention can be efficiently produced.
本発明のシャペロニン−目的タンパク質複合体は、２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなるシャペロニン連結体と、当該シャペロニン連結体に対して非共有結合的に結合している目的タンパク質とを含み、前記シャペロニンサブユニットがリング状に配置されてなるリング状構造体を形成可能であると共に当該リング状構造体の内部に前記目的タンパク質を格納可能なシャペロニン−目的タンパク質複合体であって、前記目的タンパク質は、動物細胞内で発現させた膜受容体であることを特徴とするものである。 The chaperonin-target protein complex of the present invention comprises a chaperonin conjugate formed by connecting two or more chaperonin subunits in series, and a target protein that is non-covalently bound to the chaperonin conjugate. A chaperonin-target protein complex capable of forming a ring-shaped structure in which the chaperonin subunits are arranged in a ring shape and capable of storing the target protein in the ring-shaped structure, The target protein is a membrane receptor expressed in animal cells.
本発明の複合体に含まれる目的タンパク質は、「動物細胞内で発現させた膜受容体」である。動物細胞の由来としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、カエル、ウシ、ブタ、サル、ニワトリなどが挙げられる。動物細胞としては、組織から単離した細胞でもよいし、膜受容体遺伝子が導入された組換え体でもよい。膜受容体の例としては、エンドセリン受容体が挙げられる。ここで、ヒトエンドセリン受容体タイプＡ（ｈＥＴＡＲ）の遺伝子（ｃＤＮＡ）塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列のみを配列番号２に示す。 The target protein contained in the complex of the present invention is “a membrane receptor expressed in an animal cell”. Examples of animal cell origin include humans, mice, rats, hamsters, frogs, cows, pigs, monkeys, chickens and the like. The animal cell may be a cell isolated from a tissue or a recombinant into which a membrane receptor gene has been introduced. An example of a membrane receptor is an endothelin receptor. Here, the gene (cDNA) base sequence and amino acid sequence of human endothelin receptor type A (hETAR) are shown in SEQ ID NO: 1, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
本発明の複合体は、２個以上のシャペロニンサブユニットが直列に連結されてなるシャペロニン連結体を含む。ここで一般に、シャペロニンはグループ１型とグループ２型とに大別されている。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング状構造体を形成し、さらに２つのリング状構造体が重なった２層構造を有する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。グループ１型シャペロニンの具体例としては、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリング状構造体が重なった２層構造を有する、１６〜１８量体のホモ又はヘテロオリゴマーを形成する。本発明の複合体に含まれるシャペロニン連結体を構成するシャペロニンサブユニットは、グループ１型及びグループ２型のいずれに属するものでもよい。ここで、大腸菌ＧｒｏＥＬ（グループ１型シャペロニン）のサブユニットの遺伝子塩基配列とアミノ酸配列を配列番号３に、アミノ酸配列のみを配列番号４に示す。さらに、古細菌Thermococcus sp.由来のシャペロニン（グループ２型シャペロニン）のβサブユニットの遺伝子塩基配列とアミノ酸配列を配列番号５に、アミノ酸配列のみを配列番号６に示す。 The complex of the present invention includes a chaperonin conjugate obtained by linking two or more chaperonin subunits in series. In general, chaperonins are roughly classified into group 1 type and group 2 type. Chaperonins present in bacteria and eukaryotic organelles are classified as group 1 type, all of which form a ring structure in which seven chaperonin subunits having a molecular weight of 60 kDa are linked in a ring, and two ring structures overlap. A 14-mer homo-oligomer having a two-layer structure. These cofactors are cyclic heptamers of a protein with a molecular weight of about 10 kDa called co-chaperonin. A specific example of the group 1 chaperonin is GroEL, which is a chaperonin derived from E. coli. On the other hand, group 2 type chaperonins are found in eukaryotic cytoplasm and archaea, and have a bilayer structure in which ring-shaped structures composed of 8 to 9 chaperonin subunits are usually overlapped. Homo or hetero oligomers are formed. The chaperonin subunit constituting the chaperonin linked body contained in the complex of the present invention may belong to either group 1 type or group 2 type. Here, the gene base sequence and amino acid sequence of the subunits of Escherichia coli GroEL (group 1 type chaperonin) are shown in SEQ ID NO: 3, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4. Further, the gene base sequence and amino acid sequence of the β subunit of the chaperonin (group 2 type chaperonin) derived from the archaeon Thermococcus sp. Are shown in SEQ ID NO: 5, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
シャペロニン連結体を構成するシャペロニンサブユニットの数としては、複合体がリング状構造体を形成可能な数であればよい。好ましくは、グループ１型シャペロニンの場合には７個、グループ２型シャペロニンの場合には８〜９個である。 The number of chaperonin subunits constituting the chaperonin linked body may be any number as long as the complex can form a ring-shaped structure. Preferably, the number is 7 for group 1 type chaperonins and 8 to 9 for group 2 type chaperonins.
本発明の複合体においては、シャペロニン連結体と目的タンパク質とが非共有結合的に結合している。前述のとおり、非共有結合的な結合とは共有結合（ペプチド結合等）以外の結合をいい、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、などが具体例として挙げられる。 In the complex of the present invention, the chaperonin conjugate and the target protein are non-covalently bound. As described above, non-covalent bonds refer to bonds other than covalent bonds (such as peptide bonds), and specific examples include ionic bonds, hydrogen bonds, van der Waals forces, and hydrophobic interactions.
好ましい実施形態では、シャペロニン連結体と目的タンパク質のいずれか一方にアフィニティタグが連結され、他方に当該アフィニティタグに対する特異的親和性を有するパートナータグが連結され、シャペロニン連結体と目的タンパク質とが前記アフィニティタグと前記パートナータグとを介して非共有結合的に結合している。前述のとおり、非共有結合的な特異的親和性を有する２種類の物質をタグとして使用するとき、一方をアフィニティタグ、他方をパートナータグと称している。アフィニティタグ／パートナータグの例としては、Ｓ−タグとＳ−タンパク質；ＩｇＧ（Ｆｃ部分）とプロテインＡ又はプロテインＧ；ＦＬＡＧペプチドと抗ＦＬＡＧ抗体；プロテインＬとイムノグロブリンκ軽鎖；アビジンとビオチン；ヒスチジンと金属キレート体（例えば、ニッケルイオンなど）、等の各組み合わせが挙げられる。特に、Ｓ−タグ／Ｓ−タンパク質のようなペプチド・タンパク質からなるタグであれば、シャペロニン連結体又は目的タンパク質との融合タンパク質として発現させることで、シャペロニン連結体又は目的タンパク質に対して容易に連結することができる。ここで、Ｓ−タグの遺伝子塩基配列とアミノ酸配列を配列番号７に、アミノ酸配列のみを配列番号８に示す。さらに、Ｓ−タンパク質の遺伝子塩基配列とアミノ酸配列を配列番号９に、アミノ酸配列のみを配列番号１０に示す。 In a preferred embodiment, an affinity tag is linked to one of the chaperonin conjugate and the target protein, a partner tag having specific affinity for the affinity tag is linked to the other, and the chaperonin conjugate and the target protein are linked to the affinity. Non-covalently bound via a tag and the partner tag. As described above, when two kinds of substances having non-covalent specific affinity are used as tags, one is called an affinity tag and the other is called a partner tag. Examples of affinity tags / partner tags include: S-tag and S-protein; IgG (Fc portion) and protein A or protein G; FLAG peptide and anti-FLAG antibody; protein L and immunoglobulin kappa light chain; avidin and biotin; Each combination of histidine and a metal chelate (for example, nickel ion etc.) is mentioned. In particular, if the tag is composed of a peptide / protein such as S-tag / S-protein, it is easily linked to the chaperonin conjugate or the target protein by expressing it as a chaperonin conjugate or a fusion protein with the target protein. can do. Here, the gene base sequence and amino acid sequence of the S-tag are shown in SEQ ID NO: 7, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8. Furthermore, the gene base sequence and amino acid sequence of S-protein are shown in SEQ ID NO: 9, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 10.
本発明のシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法は、所望の膜受容体を発現している動物細胞の破砕物から当該膜受容体を単離する第一工程と、第一工程で単離された膜受容体をシャペロニン連結体に対して非共有結合的に結合させる第二工程とを包含する。 The method for producing the chaperonin-target protein complex of the present invention comprises a first step of isolating the membrane receptor from a crushed animal cell expressing the desired membrane receptor, and the first step. A second step of non-covalently binding the membrane receptor to the chaperonin conjugate.
第一工程で用いる動物細胞としては、所望の膜受容体を発現しているものであれば、組織から単離した細胞でもよいし、膜受容体遺伝子が導入された組換え体でもよいが、生産効率の点で組換え体が好ましく用いられる。好ましい実施形態では、第一工程において、動物細胞又はその破砕物を界面活性剤又は脂質で処理する。本実施形態によれば、膜受容体をより温和な条件で可溶化することができる。界面活性剤の種類としては、陰イオン性、陽イオン性、両イオン性、非イオン性のいずれでもよく、膜受容体の性質によって適宜選択すればよい。脂質としては、リン脂質、糖脂質、コレステロール、またそれらの合成化合物類のいずれでもよく、膜受容体の性質によって適宜選択すればよい。第一工程で界面活性剤又は脂質で処理する際には、氷上等の低温でできるだけ短時間に行うことが好ましい。 The animal cell used in the first step may be a cell isolated from a tissue or a recombinant into which a membrane receptor gene has been introduced, as long as it expresses the desired membrane receptor. A recombinant is preferably used in terms of production efficiency. In a preferred embodiment, in the first step, animal cells or their debris are treated with a surfactant or lipid. According to this embodiment, the membrane receptor can be solubilized under milder conditions. The type of the surfactant may be any of anionic, cationic, amphoteric, and nonionic, and may be appropriately selected depending on the properties of the membrane receptor. The lipid may be any of phospholipids, glycolipids, cholesterol, and synthetic compounds thereof, and may be appropriately selected depending on the properties of the membrane receptor. When treating with a surfactant or lipid in the first step, it is preferable to carry out the treatment at a low temperature such as on ice for as short a time as possible.
第二工程では、第一工程で単離された膜受容体をシャペロニン連結体に対して非共有結合的に結合させる。例えば、第一工程で単離された膜受容体と、別途調製したシャペロニン連結体とを接触させることにより、両者を非共有結合的に結合させることができる。特に、アフィニティタグ／パートナータグを用いる実施形態によれば、両者の結合を容易に行うことができる。なお上述したように、ペプチド・タンパク質のタグ（例えば、Ｓ−タグとＳ−タンパク質）を採用する場合には、膜受容体遺伝子とタグ遺伝子との融合遺伝子を動物細胞内で発現させることで、タグが連結した膜受容体を調製することができる。 In the second step, the membrane receptor isolated in the first step is non-covalently bound to the chaperonin conjugate. For example, by bringing the membrane receptor isolated in the first step into contact with a separately prepared chaperonin conjugate, both can be bound non-covalently. In particular, according to the embodiment using an affinity tag / partner tag, both can be easily combined. As described above, when a peptide / protein tag (for example, S-tag and S-protein) is employed, by expressing a fusion gene of a membrane receptor gene and a tag gene in an animal cell, Membrane receptors with linked tags can be prepared.
本発明の複合体は、様々な用途に利用できる。１つの用途は、膜受容体を標的としたアゴニスト／アンタゴニスト候補のスクリーニングである。すなわち、従来は界面活性剤等で可溶化して得た膜画分をそのまま用いていたが、膜画分の代わりに本発明の複合体を用いることで安定化された膜受容体を標的とすることができ、取扱いが容易となる。他の用途としては、膜受容体の結晶構造解析が挙げられる。すなわち、本発明の複合体を用いた二次元結晶化後の電子顕微鏡観察や、三次元結晶化後のＸ線回折像解析によって、より天然に近い状態の膜受容体の構造を解析することが可能となる。 The composite of the present invention can be used for various applications. One application is the screening of agonist / antagonist candidates targeted to membrane receptors. That is, in the past, the membrane fraction obtained by solubilization with a surfactant or the like was used as it was, but the membrane receptor stabilized by using the complex of the present invention instead of the membrane fraction was targeted. Can be handled easily. Other applications include crystal structure analysis of membrane receptors. That is, the structure of the membrane receptor in a more natural state can be analyzed by electron microscope observation after two-dimensional crystallization using the complex of the present invention and X-ray diffraction image analysis after three-dimensional crystallization. It becomes possible.
本発明の複合体を担体に固定化することにより、対応するリガンドの精製に利用することもできる。例えばポリスチレンやアガロースからなる担体（ビーズ、プレート、基板、繊維など）に本発明の複合体を固定化すればよい。その他、本発明の複合体を含有する試薬や、本発明の複合体を備えたキットも有用である。 By immobilizing the complex of the present invention on a carrier, it can also be used for purification of the corresponding ligand. For example, the complex of the present invention may be immobilized on a carrier (bead, plate, substrate, fiber, etc.) made of polystyrene or agarose. In addition, a reagent containing the complex of the present invention and a kit provided with the complex of the present invention are also useful.
以下に実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（１）Ｓ−タンパク質が連結されたＧｒｏＥＬ７回連結体を発現するベクターの構築
大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＣＰＮ−Ｆ１プライマー（配列番号１１）とＣＰＮ−Ｒ１プライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬ遺伝子（配列番号３）を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＳｐｅＩサイトとＸｂａＩサイトが導入された。このＤＮＡ断片７個を直列に連結し、ＧｒｏＥＬ７回連結体遺伝子（（ＧｒｏＥＬ）７遺伝子）を作製した。一方、Ｓ−タンパク質遺伝子（配列番号９）を含むＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｓ−Ｆ１プライマー（配列番号１３）とＳ−Ｒ１プライマー（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、Ｓ−タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＸｂaＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。
(1) Construction of a vector that expresses GroEL 7-ligation linked to S-protein Using genomic DNA of E. coli K12 strain as a template, CPN-F1 primer (SEQ ID NO: 11) and CPN-R1 primer (SEQ ID NO: 12) PCR was performed to amplify a DNA fragment containing the GroEL gene (SEQ ID NO: 3). A SpeI site and an XbaI site derived from the primer were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of this DNA fragment, respectively. Seven of these DNA fragments were ligated in series to produce a GroEL 7-fold linked body gene ((GroEL) 7 gene). On the other hand, a DNA fragment containing the S-protein gene (SEQ ID NO: 9) was used as a template, PCR was performed using the S-F1 primer (SEQ ID NO: 13) and the S-R1 primer (SEQ ID NO: 14), and the S-protein gene was The containing DNA fragment was amplified. An XbaI site and a HindIII site derived from the primer were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of this DNA fragment, respectively.
（ＧｒｏＥＬ）７遺伝子を含むＤＮＡ断片とＳ−タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ断片とを連結し、（ＧｒｏＥＬ）７遺伝子とＳ−タンパク質遺伝子との融合遺伝子を含むＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片をｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入し、ＧｒｏＥＬ７回連結体（（ＧｒｏＥＬ）７）とＳ−タンパク質との融合タンパク質を発現できるベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７Ｓを構築した。さらに、このベクターにＨｉｓタグ配列を付加するため、５'末端をリン酸化した合成ＤＮＡ−１（配列番号１７）と合成ＤＮＡ−２（配列番号１８）のアニーリング産物を、ＮｃｏＩ処理したｐＴｒｃ（ＧＶ）７Ｓに挿入した。得られたベクターをｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７Ｓと命名した。 A DNA fragment containing the (GroEL) 7 gene and a DNA fragment containing the S-protein gene were linked to prepare a DNA fragment containing a fusion gene of the (GroEL) 7 gene and the S-protein gene. This DNA fragment is introduced into the SpeI / HindIII site of the pTrc99A expression vector (Amersham Pharmacia) to construct a vector pTrc (GV) 7S that can express a fusion protein of GroEL7 ligation ((GroEL) 7) and S-protein. did. Further, in order to add a His tag sequence to this vector, the annealing product of synthetic DNA-1 (SEQ ID NO: 17) phosphorylated at the 5 ′ end and synthetic DNA-2 (SEQ ID NO: 18) was treated with NcoI and treated with pTrc (GV ) Inserted into 7S. The resulting vector was named pTrcH (GV) 7S.
（２）Ｓ−タグが連結されたヒトエンドセリン受容体を発現する動物細胞の作製
ヒト由来エンドセリン受容体のクローン（Missouri S&T cDNA Resource Center, Clone ID EDNRA00000）を鋳型とし、ｈＥＴＡＲ-Ｆ１プライマー（配列番号１５）とｈＥＴＡＲ-Ｒ１プライマー（配列番号１６）を用いてＰＣＲを行い、ｈＥＴＡＲ遺伝子（配列番号１）を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｈｅＩサイトとＮｏｔＩサイトが導入された。また、ｈＥＴＡＲ-Ｒ１プライマーに由来するＳ−タグをコードする配列も導入された。
(2) Production of animal cells expressing human endothelin receptor linked to S-tag hETAR-F1 primer (SEQ ID NO :) using human endothelin receptor clone (Missouri S & T cDNA Resource Center, Clone ID EDNRA00000) as a template PCR was performed using 15) and hETAR-R1 primer (SEQ ID NO: 16) to amplify a DNA fragment containing the hETAR gene (SEQ ID NO: 1). The NheI site and NotI site derived from the primer were introduced into the 5 ′ end and 3 ′ end of this DNA fragment, respectively. A sequence encoding an S-tag derived from the hETAR-R1 primer was also introduced.
得られた増幅ＤＮＡ断片を動物細胞用の発現ベクターであるｐＣＩベクター（プロメガ社）に導入し、Ｓ−タグが連結されたヒトエンドセリン受容体を発現できるベクターを構築した。このベクターをＣＨＯ細胞に導入し、Ｓ−タグが連結されたヒトエンドセリン受容体を発現する組換えＣＨＯ細胞を作製した。 The obtained amplified DNA fragment was introduced into a pCI vector (Promega), which is an expression vector for animal cells, and a vector capable of expressing a human endothelin receptor linked with an S-tag was constructed. This vector was introduced into CHO cells to produce recombinant CHO cells expressing the human endothelin receptor linked with an S-tag.
（３）シャペロニン−目的タンパク質複合体の製造
上記（１）で構築したベクターｐＴｒｃＨ（ＧＶ）７Ｓで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換え体を作製した。この組換え体を培養し、菌体を得た。菌体懸濁液を融解して、超音波破砕後、超遠心分離に供し、その上清画分を回収した。さらに上清をニッケルキレートカラム（５ｍＬ）にロードした。５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳによる直線グラジエントにより溶出し、ＧｒｏＥＬ７回連結体を含む画分を回収および濃縮した。
(3) Production of chaperonin-target protein complex E. coli BL21 (DE3) was transformed with the vector pTrcH (GV) 7S constructed in (1) above to produce a recombinant. This recombinant was cultured to obtain bacterial cells. The cell suspension was thawed, subjected to ultrasonic disruption and then subjected to ultracentrifugation, and the supernatant fraction was recovered. Furthermore, the supernatant was loaded onto a nickel chelate column (5 mL). Elution was performed with a linear gradient of 500 mM imidazole / PBS, and fractions containing 7 GroEL conjugates were collected and concentrated.
一方、上記（２）で作製した組換えＣＨＯ細胞を培養し、細胞を回収した。回収した細胞を破砕し、膜画分を得た。得られた膜画分を１％オクチルグルコシドと０．５％ Ｃｈａｐｓｏとを含むＰＢＳで処理し、可溶化した。この可溶化物と先に精製したＧｒｏＥＬ７回連結体とを２：１のモル比で混合した。 On the other hand, the recombinant CHO cells prepared in (2) above were cultured, and the cells were collected. The collected cells were disrupted to obtain a membrane fraction. The obtained membrane fraction was solubilized by treatment with PBS containing 1% octyl glucoside and 0.5% Chapso. This solubilized product and the previously purified GroEL 7-fold conjugate were mixed at a molar ratio of 2: 1.
プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社）と抗シャペロニン抗体（ストレスジェン社）を混合した。遠心分離を行った後に上澄みを捨て、プロテインＧビーズに未結合の抗シャペロニン抗体を除いた。この操作を３回繰り返し、抗シャペロニン抗体固定化ビーズを調製した。このビーズを、膜画分可溶化物とＧｒｏＥＬ７回連結体との混合物に添加した。そのまま６０分間静置した後、遠心分離を行い、上澄みを捨てた。ＰＢＳ（オクチルグルコシド等を含まない）を加えてビーズを洗浄し、遠心分離の後、上澄みを捨てた。この操作を３回繰り返した。これにより、ＧｒｏＥＬ７回連結体とｈＥＴＡＲとがＳ−タグ／Ｓ−タンパク質を介して結合した「シャペロニン−目的タンパク質複合体」が、ビーズに固定化された状態で得られた。 Protein G beads (GE Healthcare) and anti-chaperonin antibody (Stressgen) were mixed. After centrifugation, the supernatant was discarded, and the anti-chaperonin antibody not bound to the protein G beads was removed. This operation was repeated three times to prepare anti-chaperonin antibody-immobilized beads. This bead was added to the mixture of the membrane fraction lysate and the GroEL 7-fold conjugate. After leaving still for 60 minutes, it was centrifuged and the supernatant was discarded. PBS (without octyl glucoside or the like) was added to wash the beads, and after centrifugation, the supernatant was discarded. This operation was repeated three times. As a result, a “chaperonin-target protein complex” in which the GroEL 7-fold conjugate and hETAR were bound via the S-tag / S-protein was obtained in a state of being immobilized on the beads.
（４）得られたシャペロニン−目的タンパク質複合体のリガンド結合評価
１ｍＭ ＣａＣｌ2と５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ７．４）に、約５０μｇのヒトエンドセリン受容体相当分の試料を添加し、エンドセリン受容体に対するアゴニスト[125I]-ET-1（Perkinelmer, Inc）をホットトレーサー、エンドセリン受容体に対するアゴニストであるコールドのエンドセリンを置換体とするリガンド結合特異性評価を行った。反応条件は２５℃、６０分間とした。反応終了後、複合体固定化担体を遠心分離し、上澄みを捨てた。再度１ｍＭ ＣａＣｌ2と５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ(ｐＨ７．４）を添加し、未反応のエンドセリンを除去した。この操作を３回繰り返した。再分散させた後、γ線測定用バイアルに移し、γ線カウンターにて放射活性を測定（２分間）した。その結果、４７６３ｄｐｍの計数値を示した。これにより、得られたシャペロニン−目的タンパク質複合体がエンドセリン受容体に特異的なリガンド結合活性を有していることが示された。
(4) Ligand binding evaluation of the obtained chaperonin-target protein complex To 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) containing 1 mM CaCl 2 and 5 mM MgCl 2 , a sample corresponding to about 50 μg of human endothelin receptor was added. The ligand binding specificity was evaluated using the agonist [ 125 I] -ET-1 (Perkinelmer, Inc) for the endothelin receptor as a hot tracer and cold endothelin as an agonist for the endothelin receptor as a substitute. The reaction conditions were 25 ° C. and 60 minutes. After completion of the reaction, the complex-immobilized carrier was centrifuged, and the supernatant was discarded. Again, 50 mM HEPES-NaOH (pH 7.4) containing 1 mM CaCl 2 and 5 mM MgCl 2 was added to remove unreacted endothelin. This operation was repeated three times. After redispersion, the sample was transferred to a γ-ray measurement vial, and the radioactivity was measured with a γ-ray counter (2 minutes). As a result, a count value of 4863 dpm was shown. Thereby, it was shown that the obtained chaperonin-target protein complex has a ligand binding activity specific to the endothelin receptor.
Claims (8)
前記目的タンパク質は、動物細胞内で発現させた膜受容体であることを特徴とするシャペロニン−目的タンパク質複合体。 A chaperonin linked body in which two or more chaperonin subunits are connected in series, and a target protein non-covalently bound to the chaperonin linked body, wherein the chaperonin subunits are arranged in a ring shape A chaperonin-target protein complex capable of forming a ring-shaped structure formed and capable of storing the target protein in the ring-shaped structure,
A chaperonin-target protein complex, wherein the target protein is a membrane receptor expressed in an animal cell.
所望の膜受容体を発現している動物細胞の破砕物から当該膜受容体を単離する第一工程と、第一工程で単離された膜受容体をシャペロニン連結体に対して非共有結合的に結合させる第二工程とを包含することを特徴とするシャペロニン−目的タンパク質複合体の製造方法。 A method for producing the chaperonin-target protein complex according to any one of claims 1 to 5,
The first step of isolating the membrane receptor from a crushed animal cell expressing the desired membrane receptor, and the membrane receptor isolated in the first step non-covalently bound to the chaperonin conjugate And a second step of linking them, a method for producing a chaperonin-target protein complex.
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