JP2010222330A - Insulin production promoter - Google Patents
Insulin production promoter Download PDFInfo
- Publication number
- JP2010222330A JP2010222330A JP2009073874A JP2009073874A JP2010222330A JP 2010222330 A JP2010222330 A JP 2010222330A JP 2009073874 A JP2009073874 A JP 2009073874A JP 2009073874 A JP2009073874 A JP 2009073874A JP 2010222330 A JP2010222330 A JP 2010222330A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- igfbp
- wnt3a
- cells
- insulin production
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
本発明は、膵臓α細胞が産出する、β細胞からのインシュリン産生を増強する物質およびそれを阻害する物質を特定することにより、膵臓におけるインシュリン産生の制御機構を解明し、糖尿病用治療薬を提供することに関する。 The present invention elucidates the control mechanism of insulin production in the pancreas by identifying a substance that enhances insulin production from β cells produced by pancreatic alpha cells and a substance that inhibits them, and provides a therapeutic agent for diabetes About doing.
今日、我が国では糖尿病患者は１億人近くいるとされており、毎年増加の一途をたどっており、心臓病、癌と共に主要な死亡原因ともなっている。糖尿病のうちで、インシュリン依存型糖尿病は、膵臓β細胞におけるインシュリンの産生能が低下して、インシュリンが欠乏し、血液中の糖が代謝できずに高血糖値が引き起こされることに起因している。糖尿病による異常な高血糖症状を治療しないでいると、例えば非治癒性末梢血管潰瘍、失明に至る網膜損傷、腎不全など、さまざまな病的状態を生じる。機能的な膵臓β細胞の小島移植という治療法もあるが、未だに安全で、再現性の高い方法とまではいえず、免疫拒絶の問題もあって一般的ではない。そのため、ほとんどの糖尿病患者は、日々の血糖値管理とインシュリン投与を余儀なくされているのが実情である。
以上のことから、膵臓β細胞のインシュリン産生を阻害する機構の解明と共に、そのメカニズムを利用した膵臓でのインシュリン産生能の増強を図るための創薬の開発が急務となっていた。
膵臓内分泌系はα細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞の４種の細胞で構成される（図１３）が、本発明者らは近年、内在する成体膵臓幹細胞から、α細胞、β細胞、δ細胞、γ細胞それぞれに分化させることができる方法を発見し、特許出願している（特願２００８−１６８２２２）。このようなβ細胞への分化促進因子を用いて、成体膵臓幹細胞からβ細胞へ分化を促進することは、インシュリンの産生能の増強につながると考えられ、反対に、成体の膵臓の幹細胞からの分化に著しい悪影響を及ぼす阻害物質を同定できれば、糖尿病治療のための創薬開発の標的物質が提供できる。
Today, it is said that there are nearly 100 million diabetic patients in Japan, and it is increasing every year and is a major cause of death along with heart disease and cancer. Among diabetes mellitus, insulin-dependent diabetes mellitus is caused by a decrease in insulin-producing ability in pancreatic β cells, lack of insulin, and glucose in blood cannot be metabolized, resulting in high blood sugar levels. . Failure to treat abnormal hyperglycemic symptoms due to diabetes can result in various pathological conditions such as non-healing peripheral vascular ulcers, retinal damage leading to blindness, and renal failure. There is also a treatment method of islet transplantation of functional pancreatic β cells, but it is still not safe and highly reproducible, and it is not common due to immune rejection. For this reason, most diabetic patients are forced to perform daily blood glucose level management and insulin administration.
In light of the above, it has become an urgent task to elucidate the mechanism that inhibits insulin production of pancreatic β-cells, and to develop a drug discovery for enhancing the insulin-producing ability in the pancreas using this mechanism.
Although the pancreatic endocrine system is composed of four types of cells, α cells, β cells, δ cells, and γ cells (FIG. 13), the present inventors have recently developed an α cell, a β cell, A method capable of differentiating into δ cells and γ cells has been discovered and a patent application has been filed (Japanese Patent Application No. 2008-168222). Promoting differentiation from adult pancreatic stem cells to β cells using these β-cell differentiation promoting factors is thought to lead to an increase in the ability to produce insulin, and conversely from adult pancreatic stem cells. If an inhibitory substance that has a significant adverse effect on differentiation can be identified, a target substance for drug development for the treatment of diabetes can be provided.
本発明の課題は、膵臓β細胞のインシュリン産生を増強する物質及びそれを阻害する物質を特定し、インシュリン産生増強物質、又はその阻害物質を標的とするインヒビターからなる糖尿病治療薬を提供することである。 An object of the present invention is to specify a substance that enhances insulin production of pancreatic β cells and a substance that inhibits the substance, and to provide a therapeutic agent for diabetes comprising an insulin production enhancing substance or an inhibitor that targets the inhibitor. is there.
本発明者らは、以前、膵臓由来の幹細胞から各種膵臓細胞への分化促進機構について研究開発を行い、成体膵臓幹細胞からβ細胞への分化を誘導する物質がWnt3aであることを見出していた（特願２００８−１６８１８７）が、さらに、Wnt3aについての詳細な制御機構を研究し、Wnt3aが成体膵臓幹細胞からβ細胞への分化を促進し、β細胞からのインシュリン産生促進機能も有していることを見出した。そして、Wnt3A自身の発現制御機構を詳細に研究する過程で、IGFBP-4が膵臓のα細胞から分泌されることを発見し、Wnt3Aの働きを測定するレポーター解析から、このα細胞から分泌されたIGFBP-4がWnt3Aの発現阻害物質であることを突き止めた。
IGFBP-4は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）の１種であるが、IGFBPは、インスリン様増殖因子(IGF)に結合してその作用を調節する物質であって、現在IGFBP1〜6が知られており、それぞれが血液系細胞、卵巣系細胞、骨由来細胞など各種の組織特異的に発現されていることが確認されている。IGFGP-4は、最初ヒト骨芽細胞培養液などから単離され（非特許文献１）、IGF-I特異的なIGF抑制作用を示し、副甲状腺ホルモン（PTH）などの骨吸収抑制タンパクにより産生が促進され、骨粗鬆症患者で血中濃度が増加することから骨形成に関する作用が期待されていた（特許文献１）。その後、前立腺癌や結腸癌などある種の腫瘍細胞の増殖を抑制する作用が知られ（特許文献２，非特許文献２）、さらに最近、IGFGP-4が心臓形成に必要な古典的Wntシグナル伝達阻害因子であることが確認されて、心筋細胞への分化を促進する心筋形成増殖因子として注目を集めている（非特許文献３）。しかし、IGFBP-4の主要な組織分布は、肝臓、脳皮質であるとされており（特許文献３）、IGFBP-4遺伝子をDNAアレイの１要素として各種の薬剤などの脳下垂体での作用機序や、漢方薬の効果測定のために用いられた例はある（特許文献４，５）が、膵臓での発現が観察された例はなく、IGFBP-4が膵臓でのインシュリン産生機構に何らかの関わりを有している可能性が検討されたことはなかった。そして、従来、糖尿病やインスリン産生機構にIGF-1と共に主要な役割を担っているIGFBPはIGFBP-1であることが相次いで報告され（特許文献６，非特許文献４，５，www.nougaku.jp/award/takenaka.pdf）、技術常識となっていたことから、むしろIGFBP-4を糖尿病やインスリン産生と関連づける研究を妨げる状況であった。
したがって、IGFBP-4が膵臓α細胞から産生され、Wnt3Aの作用を阻害することでインシュリン産生を阻害していることの知見は驚くべき発見であった。本発明者らは、さらに健康体と糖尿病動物との比較から、IGFBP-4の濃度が糖尿病動物の膵臓において高濃度であることを見出し、IGFBP-4が糖尿病患者のインシュリン産生の阻害に重要な役割を担う物質であることを解明して、本発明を完成した。
The present inventors previously conducted research and development on a mechanism for promoting differentiation from pancreatic stem cells to various pancreatic cells, and found that a substance that induces differentiation from adult pancreatic stem cells to β cells is Wnt3a ( Japanese Patent Application No. 2008-168187) further studies the detailed control mechanism of Wnt3a, and that Wnt3a promotes differentiation of adult pancreatic stem cells into β cells and also has a function of promoting insulin production from β cells. I found. And in the process of studying the expression control mechanism of Wnt3A itself, I discovered that IGFBP-4 was secreted from the α cell of the pancreas, and it was secreted from this α cell from the reporter analysis that measures the function of Wnt3A. IGF-4 was found to be a Wnt3A expression inhibitor.
IGFBP-4 is a kind of insulin-like growth factor binding protein (IGFBP). IGFBP binds to insulin-like growth factor (IGF) and regulates its action. It is known that each is expressed specifically in various tissues such as blood cells, ovarian cells, and bone-derived cells. IGFGP-4 was first isolated from human osteoblast cultures (Non-patent Document 1) and exhibited IGF-I-specific IGF-inhibiting action and produced by bone resorption-inhibiting proteins such as parathyroid hormone (PTH). Has been promoted, and the blood concentration is increased in osteoporotic patients, so that an effect on bone formation has been expected (Patent Document 1). Later, it has been known to suppress the growth of certain tumor cells such as prostate cancer and colon cancer (Patent Document 2, Non-Patent Document 2), and more recently, IGFGP-4 is a classic Wnt signaling required for heart formation. It has been confirmed to be an inhibitory factor, and has attracted attention as a cardiomyogenic growth factor that promotes differentiation into cardiomyocytes (Non-patent Document 3). However, the main tissue distribution of IGFBP-4 is considered to be the liver and brain cortex (Patent Document 3), and the action of various drugs on the pituitary gland using the IGFBP-4 gene as one element of the DNA array. There are examples used to measure the mechanism and effect of Kampo medicine (Patent Documents 4 and 5), but there is no example in which expression in the pancreas has been observed, and IGFBP-4 has some mechanism for insulin production in the pancreas The possibility of having an involvement has never been studied. And conventionally, IGFBP, which plays a major role in diabetes and insulin production mechanisms together with IGF-1, has been reported one after another (Patent Document 6, Non-Patent Documents 4, 5, www.nougaku. jp / award / takenaka.pdf), because it became technical common sense, it was a situation that hindered research that linked IGFBP-4 to diabetes and insulin production.
Therefore, the discovery that IGFBP-4 is produced from pancreatic α cells and inhibits insulin production by inhibiting the action of Wnt3A was a surprising discovery. The present inventors have further found that the concentration of IGFBP-4 is high in the pancreas of diabetic animals by comparing healthy bodies with diabetic animals, and IGFBP-4 is important for inhibiting insulin production in diabetic patients. The present invention was completed by elucidating that the substance plays a role.
すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。
〔１〕 IGFBP-4インヒビター、又はWnt3aもしくはその活性化剤を有効成分とする、膵臓β細胞からのインシュリン産生増強剤。
〔２〕 前記IGFBP-4インヒビターが、IGFBP-4タンパク質の機能を阻害する物質である、前記〔１〕に記載のインシュリン産生増強剤。
〔３〕 前記IGFBP-4タンパク質の機能を阻害する物質が、IGFBP-4中和抗体である前記〔２〕に記載のインシュリン産生増強剤。
〔４〕 前記IGFBP-4インヒビターが、IGFBP-4の遺伝子の発現を阻害する物質である、前記〔１〕に記載のインシュリン産生増強剤。
〔５〕 前記IGFBP-4の遺伝子の発現を阻害する物質が、IGFBP-4遺伝子のsiRNA、shRNA又はアンチセンスRNAである、前記〔４〕に記載のインシュリン産生増強剤。
〔６〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインシュリン産生増強剤からなる、糖尿病の予防又は治療用の医薬組成物。
〔７〕 前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のインシュリン産生増強剤を作用させた膵臓幹細胞又はβ前駆細胞を有効成分として含む、膵臓移植用組成物。
〔８〕 膵臓β細胞からのインシュリン産生を増強させる作用を有するIGFBP-4インヒビターをスクリーニングするための方法であって、以下の（１）〜（４）を含む方法；
（１）レポーター遺伝子を、Wnt3aが活性化することのできるプロモーターに繋いで導入した細胞を用意し、
（２）あらかじめ（１）の細胞培地中に、Wnt3a単独で添加した場合、及びWnt3aと共にIGFBP-4を添加した場合のレポーター活性を測定しておき、
（３）（１）の細胞培地中に、Wnt3a及びIGFBP-4と共に被検物質を添加して、レポーター活性を測定し、
（４）（３）で得られた測定値が、（２）で測定した、Wnt3a及びIGFBP-4を添加した場合の測定値よりも、Wnt3a単独で添加した場合の測定値に近い数値を示す物質を、IGFBP-4インヒビター候補物質と判定する。
〔９〕 膵臓β細胞におけるインシュリン産生能を判定するためのキットであって、被験体の膵臓組織由来の生体試料中のIGFBP-4又はWnt3aの濃度を測定するためのIGFBP-4抗体又はWnt3a抗体を含むＥＬＩＳＡ用キット。
〔１０〕 糖尿病診断用キットである、前記〔９〕に記載のキット。
〔１１〕 ヒト以外の哺乳動物からなる被験体の膵臓β細胞におけるインシュリン産生能を判定する方法であって、IGFBP-4抗体又はWnt3a抗体を用いて、当該被験体膵臓組織由来の生体試料中のIGFBP-4又はWnt3aの濃度を測定することを特徴とする方法。
That is, the present invention includes the following inventions.
[1] An agent for enhancing insulin production from pancreatic β cells, comprising an IGFBP-4 inhibitor or Wnt3a or an activator thereof as an active ingredient.
[2] The insulin production enhancer according to [1], wherein the IGFBP-4 inhibitor is a substance that inhibits the function of the IGFBP-4 protein.
[3] The insulin production enhancer according to [2], wherein the substance that inhibits the function of the IGFBP-4 protein is an IGFBP-4 neutralizing antibody.
[4] The insulin production enhancer according to [1], wherein the IGFBP-4 inhibitor is a substance that inhibits expression of an IGFBP-4 gene.
[5] The insulin production enhancer according to [4], wherein the substance that inhibits the expression of the IGFBP-4 gene is siRNA, shRNA, or antisense RNA of the IGFBP-4 gene.
[6] A pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, comprising the insulin production enhancer according to any one of [1] to [5].
[7] A composition for pancreas transplantation comprising, as an active ingredient, pancreatic stem cells or β-progenitor cells to which the insulin production enhancer according to any one of [1] to [5] is acted.
[8] A method for screening for an IGFBP-4 inhibitor having an action of enhancing insulin production from pancreatic β cells, the method comprising the following (1) to (4);
(1) Prepare a cell into which a reporter gene has been introduced by linking to a promoter that can be activated by Wnt3a.
(2) The reporter activity is measured in advance when Wnt3a alone is added to the cell culture medium of (1) and when IGFBP-4 is added together with Wnt3a.
(3) In the cell culture medium of (1), a test substance is added together with Wnt3a and IGFBP-4, and the reporter activity is measured.
(4) The measured value obtained in (3) is closer to the measured value in the case of adding Wnt3a alone than the measured value in the case of adding Wnt3a and IGFBP-4 measured in (2). The substance is determined as an IGFBP-4 inhibitor candidate substance.
[9] A kit for determining the ability to produce insulin in pancreatic β cells, wherein the IGFBP-4 antibody or Wnt3a antibody is used to measure the concentration of IGFBP-4 or Wnt3a in a biological sample derived from the pancreatic tissue of a subject. An ELISA kit comprising
[10] The kit according to [9] above, which is a diabetes diagnosis kit.
[11] A method for determining insulin-producing ability in pancreatic β cells of a subject comprising a mammal other than a human, using an IGFBP-4 antibody or a Wnt3a antibody in a biological sample derived from the subject pancreatic tissue A method comprising measuring the concentration of IGFBP-4 or Wnt3a.
本発明により、Wnt3aが、膵臓幹細胞が前駆β細胞を経てインシュリン産生β細胞に分化する機構を制御する促進物質であり、IGFBP-4がその阻害物質であることを解明し、膵臓β細胞での主要なインシュリン産生機構及び阻害機構の全容が解明された。特に、膵臓幹細胞からの分化に著しい悪影響を及ぼし、かつβ細胞からのインシュリン産生を著しく阻害する阻害物質がIGFBP-4であることを見出したことは、今後の糖尿病用医薬製剤を開発する上での標的物質が提供されたことであり、糖尿病患者にとっての大きな福音となり得る。 According to the present invention, Wnt3a is an accelerating substance that controls the mechanism by which pancreatic stem cells differentiate into insulin-producing β cells via progenitor β cells, and IGFBP-4 is an inhibitor of the same. The whole mechanism of major insulin production and inhibition was elucidated. In particular, the discovery that IGFBP-4 is an inhibitor that significantly affects the differentiation from pancreatic stem cells and significantly inhibits insulin production from β-cells is a key factor in the development of future pharmaceutical preparations for diabetes. The target substance is provided, which can be a great gospel for diabetics.
１．本発明の技術的な特徴
以下、本発明の技術的な特徴について、その概要を述べる。
正常な成体の膵臓では、成体膵臓幹細胞が前駆β細胞を経由して成熟β細胞にまで分化して、インシュリンを産生するが、本発明の重要な特徴の１つが、当該インシュリン産生に関わる重要な促進物質が、β細胞及びα細胞が産生するWnt3aであることを見出した点にある。
Wnt3aは、本発明者らの先の出願（特願２００８−１６８２２２）において、成体膵臓幹細胞が前駆β細胞に分化する際の分化促進物質であることを見出していたが、本発明において、前駆β細胞がさらにインシュリン産生能を有する成熟β細胞にまで分化するのを促進すること、及びβ細胞からのインシュリンの産生量を増大させる物質であることを見出した。また、そのWnt3aによる分化促進作用が、Wntシグナル伝達機構を介して核内にβカテニンを移行させ、βカテニンが、NeuroD1遺伝子のプロモーター活性化領域に結合しているTCF及び／又はLEFに作用して、当該プロモーターを活性化させ、β細胞の分化に必須なNeuroD1の発現を促進することにあることを解明した。（図５）
そして、糖尿病など病的状態に陥った膵臓ではα細胞がIGFBP-4を著量産生することを確認し、当該IGFBP-4は、用量依存的にWnt3aの作用を阻害しており、Wnt3aを阻害することでNeuroD1の発現を阻害し、かつインシュリン産生量を大幅に減少させる主要な原因物質であることを解明したものである。（図１３）
糖尿病治療薬として、インシュリン産生増強剤を考えたとき、まずWnt3a 及びその活性化剤が候補となる。
さらに、Wnt3a産生を阻害しているIGFBP-4の作用を阻害する物質又はIGFBP-4の発現を阻害する物質も、インシュリン産生量を増強させるので、有力な候補物質である。
ここで、IGFBP-4の阻害作用はきわめて大きいので、インシュリン産生に十分な量のWnt3a が存在していてもWnt3a本来の促進効果が発揮できない可能性があると考えられるので、インシュリン産生を促進するための医薬としては、Wnt3a自体を添加するよりも、IGFBP-4のWnt3a に対する阻害作用の方を阻害する物質の有効性が期待できる。そして、その際には、IGFBP-4の中和抗体のように、IGFBP-4タンパク質に結合して阻害することも有効であるが、α細胞がIGFBP-4を発現することを阻止するための阻害剤、すなわちIGFBP-4遺伝子又はそのプロモーターに働くIGFBP-4のsiRNA、shRNA、又はアンチセンスRNA、アンチセンスDNAなどのIGFBP-4発現阻害剤を発現ベクターなどにより導入する手法が有効に用いられる。
また、新たなIGFBP-4の作用を阻害する物質をスクリーニングするためには、IGFBP-4の阻害作用がWnt3aの転写を阻害するものであるので、Wnt3aプロモーター活性を回復できるかどうかをWntレポーターアッセイで確認すれば簡単に検出、判定することができる。
そして、糖尿病患者など、膵臓組織が病的な状態にある場合には、膵臓のα細胞から著量のIGFBP-4が発現し、その量の高さは病状の悪化状態に対応していると考えられるので、被験者のIGFBP-4発現量を定量化して観察することで診断でき、また同時にWnt3a発現量が極端に低下していると考えられるから、Wnt3a発現量を定量化して観察することも糖尿病の診断にとって有効であるといえる。
1. Technical features of the present invention The technical features of the present invention will be outlined below.
In normal adult pancreas, adult pancreatic stem cells differentiate into mature β cells via progenitor β cells to produce insulin. One of the important features of the present invention is an important feature related to insulin production. It is the point which discovered that a promoting substance is Wnt3a which (beta) cell and (alpha) cell produce.
In our previous application (Japanese Patent Application No. 2008-168222), Wnt3a was found to be a differentiation promoting substance when adult pancreatic stem cells differentiate into progenitor β cells. The present inventors have found that the cells further promote differentiation into mature β cells having insulin-producing ability, and are substances that increase the amount of insulin produced from β cells. In addition, the differentiation promoting action by Wnt3a moves β-catenin into the nucleus via the Wnt signaling mechanism, and β-catenin acts on TCF and / or LEF bound to the promoter activation region of NeuroD1 gene. Thus, it was elucidated that the promoter is activated to promote the expression of NeuroD1 essential for the differentiation of β cells. (Fig. 5)
In addition, it was confirmed that α cells produced a significant amount of IGFBP-4 in the pancreas that fell into pathological conditions such as diabetes, and the IGFBP-4 inhibited the action of Wnt3a in a dose-dependent manner. Thus, it was clarified that it is a main causative substance that inhibits the expression of NeuroD1 and significantly reduces the amount of insulin production. (Fig. 13)
When an insulin production enhancer is considered as a therapeutic agent for diabetes, Wnt3a and its activator are candidates first.
Furthermore, a substance that inhibits the action of IGFBP-4 that inhibits Wnt3a production or a substance that inhibits the expression of IGFBP-4 also enhances the amount of insulin production, and thus is a promising candidate substance.
Here, the inhibitory effect of IGFBP-4 is so great that even if a sufficient amount of Wnt3a is present for insulin production, it may not be possible to exert the original Wnt3a promoting effect. Therefore, the effectiveness of a substance that inhibits the inhibitory action of IGFBP-4 on Wnt3a can be expected rather than adding Wnt3a itself. And in that case, it is effective to bind and inhibit the IGFBP-4 protein, like the neutralizing antibody of IGFBP-4, but to prevent the α cells from expressing IGFBP-4. Inhibitors, i.e., IGFBP-4 expression inhibitors such as IGFBP-4 siRNA, shRNA, antisense RNA, antisense DNA, etc. that act on the IGFBP-4 gene or its promoter are effectively used. .
In addition, in order to screen for a new substance that inhibits the action of IGFBP-4, the inhibitory action of IGFBP-4 inhibits the transcription of Wnt3a. If it confirms by, it can detect and judge easily.
And if the pancreatic tissue is in a pathological state, such as a diabetic patient, a significant amount of IGFBP-4 is expressed from the α cells of the pancreas, and the high amount corresponds to the worsening state of the disease state. Since it is considered, it can be diagnosed by quantifying and observing the expression level of IGFBP-4 in the subject, and at the same time, the Wnt3a expression level is thought to be extremely reduced, so it is also possible to quantify and observe the Wnt3a expression level It can be said that it is effective for the diagnosis of diabetes.
２．Wnt3a及びその活性化剤について
Wntは、細胞外に分泌され、細胞間のシグナル伝達を司るタンパク質として複数種類（哺乳類では１９種類）存在し、線虫、ショウジョウバエからヒトに至るまで生物種を超えて保存されている。ノックアウトマウスの解析によりWntは発生初期における体軸形成や器官形成に必須な、生物学的に重要なタンパク質である。Wntにより活性化される細胞内シグナル伝達機構には、（１）βカテニン経路、（２）平面内細胞極性（PCP)経路(細胞骨格制御）、及び（３）Ca2+経路(細胞運動制御）の３種類が存在するが、本発明において「Wntシグナル伝達機構」というときは、βカテニン転写因子（非特許文献８）を介した「βカテニン経路」を指す。
Wnt3aは、典型的なWntであり、幹細胞、特に造血幹細胞の増殖および自己再生を含む多数の発達イベントに関与することが知られており、最近本発明者らにより成体膵臓幹細胞からβ細胞への分化を誘導する物質であることも見出されている（特願２００８−１６８１８７）。
Wnt3aをインシュリン産生増強剤として用いる場合、成体の膵臓組織に対して、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を含む発現ベクターなどを直接導入することも考えられるが、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を常法により作用させた成体膵臓幹細胞、β前駆細胞を膵臓組織に移植する手法が好ましい。
その際に用いるWnt3aタンパク質としては、生体試料から精製されたもの、化学合成されたものや遺伝子組み換えによって製造されたものを用いることができ、市販Wnt3aを用いることもできる。Wnt3aは保存性が高いので、由来の生物種はいずれのものであってもよいが、医薬製剤として用いる場合は対象生物種と同一の生物種由来のものが好ましい。また、Wnt3aタンパク質におけるWntシグナル伝達機構に関与する領域は古くから研究され、ほぼ解明されており（非特許文献８）、当該領域が含まれていれば、Wnt3aタンパク質及びその遺伝子の全長でなく部分配列であってもよい。
Wnt3a遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV) ベクターやレンチウイルスベクター）を用いて導入する。
本発明の実施例でWnt3aタンパク質の発現の際には、Wnt3aの全長遺伝子をレンチウイルスべクター（非特許文献７）に組み込み発現させた。
なお、「Wnt3a遺伝子」というとき、Wnt3aタンパク質をコードするDNA又はmRNAを指し、Wnt3a遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトWnt3a遺伝子は、NM_033131（Gene Bankアクセッションナンバー）、マウスWnt3a遺伝子はNM_009522（Gene Bankアクセッションナンバー）である。
また、公知のWnt3a活性化剤（Wnt3aの活性を増加させるような化合物やWnt3a 転写を活性化するような化合物）、例えば、Wntのシグナル伝達機構を促進することが知られているグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）インヒビターであるAR-A014418（J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 46, p45937-45945, 2003）を用いることができる。
なお、本発明の実施例で用いた、Wnt3aのドミナントネガティブタンパク質（dnWnt）は、Wnt3aの作用領域を改変して機能不全タンパク質をコードする遺伝子をレンチウイルスベクター（非特許文献７）に組み込み発現させたものを用いている。
2. About Wnt3a and its activator
Wnt is secreted extracellularly and exists in multiple types (19 types in mammals) as a protein that controls signal transduction between cells, and is conserved across species from nematodes, Drosophila to humans. Analysis of knockout mice reveals that Wnt is a biologically important protein essential for body axis formation and organ formation in the early stages of development. The intracellular signaling mechanisms activated by Wnt include (1) β-catenin pathway, (2) in-plane cell polarity (PCP) pathway (cytoskeleton control), and (3) Ca2 + pathway (cell motility control). Although there are three types, “Wnt signaling mechanism” in the present invention refers to “β-catenin pathway” via β-catenin transcription factor (Non-patent Document 8).
Wnt3a is a typical Wnt and is known to be involved in numerous developmental events including proliferation and self-renewal of stem cells, especially hematopoietic stem cells, and recently we have developed from adult pancreatic stem cells to β cells. It has also been found that it is a substance that induces differentiation (Japanese Patent Application No. 2008-168187).
When Wnt3a is used as an insulin production enhancer, it may be possible to directly introduce Wnt3a protein or an expression vector containing Wnt3a gene into adult pancreatic tissue, but Wnt3a protein or Wnt3a gene acts in a conventional manner. A method of transplanting the adult pancreatic stem cells and β-progenitor cells thus obtained into pancreatic tissue is preferable.
As the Wnt3a protein used at that time, one purified from a biological sample, one chemically synthesized, one produced by genetic recombination can be used, and commercially available Wnt3a can also be used. Since Wnt3a has high storage stability, any species may be derived from it, but when used as a pharmaceutical preparation, Wnt3a is preferably derived from the same species as the target species. In addition, the region involved in the Wnt signaling mechanism in the Wnt3a protein has been studied for a long time and has been almost elucidated (Non-patent Document 8). If the region is included, it is not the full length of the Wnt3a protein and its gene. It may be an array.
When the Wnt3a gene is introduced into cells or tissues, it may be introduced as it is together with a natural promoter or linked to a strong known promoter (for example, CAG promoter or CMV promoter) and the like with a physiologically acceptable carrier. However, it is introduced using various known viral vectors (for example, adeno-associated virus (AAV) vectors and lentiviral vectors) that are usually used for gene therapy.
In the examples of the present invention, when the Wnt3a protein was expressed, the full-length gene of Wnt3a was incorporated into a lentiviral vector (Non-patent Document 7) and expressed.
The term “Wnt3a gene” refers to a DNA or mRNA encoding a Wnt3a protein, and the Wnt3a gene sequence is available from a known database. For example, the human Wnt3a gene includes NM_033131 (Gene Bank accession number), mouse The Wnt3a gene is NM_009522 (Gene Bank accession number).
In addition, known Wnt3a activators (compounds that increase Wnt3a activity or compounds that activate Wnt3a transcription), for example, glycogen synthase kinase 3β, which is known to promote Wnt signaling AR-A014418 (J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 46, p45937-45945, 2003) which is a (GSK3β) inhibitor can be used.
The Wnt3a dominant negative protein (dnWnt) used in the examples of the present invention is expressed by incorporating a gene encoding a dysfunctional protein into a lentiviral vector (Non-patent Document 7) by modifying the Wnt3a action region. Is used.
３．IGFBP-4について
本発明において、「IGFBP-4」というとき、ヒトIGFBP-4のみならず、マウス、ラットなどの実験動物、ウシ、ウマなどの家畜動物、犬、ネコなどの愛玩動物など哺乳類由来IGFBP-4を指す。また、公知のIGFBP-4変異体、例えばプロテアーゼ耐性変異体（Yu, H. 等, J. Natl. Cancer Inst. 92 (2000) 1472-1489、Conover, C. A. 等, J. Biol. Chem. 270 (1995) 4395-4400）等、各種原核細胞もしくは真核細胞宿主から生産された組換えIGFBP-4も含まれる。さらに、IGFBP-4の部分タンパク質であっても、Wnt3a阻害活性を失わない限り包含され、反対に融合タンパク質、例えば、グルタチオンS−トランスフェラーゼとの融合タンパク質（(Honda, Y. 等, J. Clin. Endocrinol. Metab. 81 (1996) 1389-1396）、ヘキサヒスチジン標識との融合タンパク質（Qin, X. 等, J. Biol. Chem. 273 (1998) 23509-23516）、又はユビキチン融合タンパク質（Kiefer, M. C. 等, J. Biol. Chem. 267 (1992) 12692-12699）であってもよい。
「IGFBP-4遺伝子」とは、これらのタンパク質をコードするDNA又はmRNAを指す。IGFBP-4遺伝子配列は、公知のデータベースから入手可能であり、例えばヒトIGFBP-4遺伝子は、NM_001552（Gene Bankアクセッションナンバー）マウスIGFBP-4遺伝子はNM_010517（Gene Bankアクセッションナンバー）である。
3. About IGFBP-4 In the present invention, the term “IGFBP-4” refers not only to human IGFBP-4 but also to laboratory animals such as mice and rats, domestic animals such as cattle and horses, and pets such as dogs and cats. Refers to IGFBP-4. Further, known IGFBP-4 mutants such as protease resistant mutants (Yu, H. et al., J. Natl. Cancer Inst. 92 (2000) 1472-1489, Conover, CA et al., J. Biol. Chem. 270 ( 1995) 4395-4400) and the like, including recombinant IGFBP-4 produced from various prokaryotic or eukaryotic host cells. Furthermore, even partial proteins of IGFBP-4 are included as long as Wnt3a inhibitory activity is not lost, and conversely, fusion proteins such as fusion proteins with glutathione S-transferase ((Honda, Y. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81 (1996) 1389-1396), fusion protein with hexahistidine tag (Qin, X. et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 23509-23516), or ubiquitin fusion protein (Kiefer, MC) , J. Biol. Chem. 267 (1992) 12692-12699).
“IGFBP-4 gene” refers to DNA or mRNA encoding these proteins. The IGFBP-4 gene sequence can be obtained from a known database. For example, the human IGFBP-4 gene is NM_001552 (Gene Bank accession number), and the mouse IGFBP-4 gene is NM_010517 (Gene Bank accession number).
４．IGFBP-4インヒビター（阻害剤）について
本発明において「IGFBP-4インヒビター」又は「IGFBP-4阻害剤」というとき、Wntシグナル伝達機構に関わるIGFBP-4自体の活性を阻害する物質、及びIGFBP-4遺伝子の転写などIGFBP-4の発現を阻止する阻害物質のいずれをも含む。IGFBP-4自体の活性を阻害する物質としては、例えばIGFBP-4の中和抗体（anti-IGFBP-4、R&D社製など）のように、IGFBP-4タンパク質に結合してタンパク質を分解することで阻害する物質、PAPP-A/IGFBP-4 protease（非特許文献１０）などがある。また、IGFBP-4の発現を阻止する阻害物質としては、IGFBP-4遺伝子又はその3’UTR領域に働くIGFBP-4のsiRNA、shRNA、又はアンチセンスRNA、アンチセンスDNAなどが挙げられる。さらに、下記５．のスクリーニング法で得られたIGFBP-4活性阻害物質、又はIGFBP-4遺伝子の発現阻害物質も、同様に用いることができる。
IGFBP-4阻害剤が、IGFBP-4中和抗体などのタンパク質や低分子化合物などの場合は、薬理学的に許容される担体などと共に膵臓組織に注入するか、in vitroで膵臓幹細胞、又は分化した膵臓α細胞に投与した後、移植する手法も用いられる。IGFBP-4阻害剤がsiRNAなどのポリヌクレオチドの場合は、ウイルスベクターなどにより導入する公知の手法が有効に用いられる。
4). About IGFBP-4 Inhibitor (Inhibitor) In the present invention, the term “IGFBP-4 inhibitor” or “IGFBP-4 inhibitor” refers to a substance that inhibits the activity of IGFBP-4 itself involved in the Wnt signaling mechanism, and IGFBP-4 It includes any inhibitor that blocks IGFBP-4 expression, such as gene transcription. Substances that inhibit the activity of IGFBP-4 itself include binding to IGFBP-4 protein and degrading the protein, such as neutralizing antibody of IGFBP-4 (anti-IGFBP-4, manufactured by R & D, etc.) And PAPP-A / IGFBP-4 protease (Non-patent Document 10). Inhibitors that block the expression of IGFBP-4 include IGFBP-4 gene or IGFBP-4 siRNA, shRNA, antisense RNA, antisense DNA, etc. acting on its 3 ′ UTR region. Furthermore, the following 5. The IGFBP-4 activity-inhibiting substance obtained by the screening method or the expression-inhibiting substance of the IGFBP-4 gene can be used in the same manner.
When the IGFBP-4 inhibitor is a protein or low molecular weight compound such as an IGFBP-4 neutralizing antibody, it is injected into a pancreatic tissue together with a pharmacologically acceptable carrier, or in vitro pancreatic stem cells or differentiation A technique of transplanting after administration to the pancreatic alpha cells is also used. In the case where the IGFBP-4 inhibitor is a polynucleotide such as siRNA, a known technique of introduction using a viral vector or the like is effectively used.
５．スクリーニング方法
本発明のIGFBP-4インヒビターの阻害作用は、転写活性化因子としてのWnt3a機能を阻害するものであるから、未知のIGFBP-4インヒビターをスクリーニングするためには、Wnt3aによるNeuroD1プロモーターなどの活性化作用がIGFBP-4により阻害されるのを回復するかどうかを観察すればよい。
例えば、以下の（１）〜（４）の工程を経てIGFBP-4インヒビターの候補物質をスクリーニングすることができる。
（１）レポーター遺伝子を、Wnt3aが活性化することのできるプロモーターに繋いで導入した細胞を用意し、
（２）あらかじめ（１）の細胞培地中に、Wnt3a単独で添加した場合、及びWnt3aと共にIGFBP-4を添加した場合のレポーター活性を測定しておき、
（３）（１）の細胞培地中に、Wnt3a及びIGFBP-4と共に被検物質を添加して、レポーター活性を測定し、
（４）（３）で得られた測定値が、（２）で測定した、Wnt3a及びIGFBP-4を添加した場合の測定値よりも、Wnt3a単独で添加した場合の測定値に近い数値を示す物質を、IGFBP-4インヒビター候補物質と判定する。
そのようなスクリーニング法の典型的な手法として、「Wntレポーターアッセイ（TOP-FLASHレポーター；非特許文献１１）」を利用すれば、簡単に検出、判定することができる。具体的には、以下の手順で行う。
（１）TOP-FLASHレポーターを導入した細胞の培地に、Wnt3aおよびIGFBP-4存在下で、候補化合物ライブラリーをそれぞれ添加する。その際、レコンビナントWnt3aとIGFBP-4タンパク質を培地中に添加してもよい。又は、Wnt3a遺伝子とIGFBP-4遺伝子とを細胞に導入する方法を採用してもよい。
（２）ルシフェラーゼー活性をルミノメーターで測定する。
（３）IGFBP-4の作用を阻害する物質のポジティブコントロールとしてWnt3aのみを添加した場合のルシフェラーゼ活性に、できるだけ近い回復を伴う物質がIGFBP-4の作用を阻害する物質であり、IGFBP-4インヒビターの候補物質であるといえる。
また、IGFBP-4遺伝子の発現を阻害する物質をスクリーニングするには、IGFBP-4のプロモーターにルシフェラーゼなどレポーター遺伝子を繋ぎ、被検物質ルシフェラーゼ活性の低下を見ることで、プロモーター活性が阻害されることを確認することができる。
5). Screening method Since the inhibitory action of the IGFBP-4 inhibitor of the present invention inhibits Wnt3a function as a transcriptional activator, in order to screen an unknown IGFBP-4 inhibitor, activity such as NeuroD1 promoter by Wnt3a What is necessary is just to observe whether the oxidative action recovers from being inhibited by IGFBP-4.
For example, a candidate substance for an IGFBP-4 inhibitor can be screened through the following steps (1) to (4).
(1) Prepare a cell into which a reporter gene has been introduced by linking to a promoter that can be activated by Wnt3a.
(2) The reporter activity is measured in advance when Wnt3a alone is added to the cell culture medium of (1) and when IGFBP-4 is added together with Wnt3a.
(3) In the cell culture medium of (1), a test substance is added together with Wnt3a and IGFBP-4, and the reporter activity is measured.
(4) The measured value obtained in (3) is closer to the measured value in the case of adding Wnt3a alone than the measured value in the case of adding Wnt3a and IGFBP-4 measured in (2). The substance is determined as an IGFBP-4 inhibitor candidate substance.
As a typical technique of such a screening method, “Wnt reporter assay (TOP-FLASH reporter; Non-patent Document 11)” can be used for easy detection and determination. Specifically, the following procedure is used.
(1) A candidate compound library is added to the culture medium of cells into which the TOP-FLASH reporter has been introduced in the presence of Wnt3a and IGFBP-4. At that time, recombinant Wnt3a and IGFBP-4 protein may be added to the medium. Alternatively, a method of introducing the Wnt3a gene and the IGFBP-4 gene into the cell may be employed.
(2) The luciferase activity is measured with a luminometer.
(3) A substance with a recovery as close as possible to the luciferase activity when only Wnt3a is added as a positive control of a substance that inhibits the action of IGFBP-4 is a substance that inhibits the action of IGFBP-4, and is an IGFBP-4 inhibitor It can be said that it is a candidate substance.
In addition, in order to screen for substances that inhibit the expression of the IGFBP-4 gene, the promoter activity is inhibited by linking a reporter gene such as luciferase to the IGFBP-4 promoter and observing a decrease in the test substance luciferase activity. Can be confirmed.
６．インシュリン増強用医薬組成物の製剤化、及び投与方法
本発明のWnt3a、もしくはその活性化剤、又はIGFBP-4インヒビターは、膵臓組織におけるインシュリンの産生を増強することができるので、糖尿病用治療薬として有効である。本発明における、Wnt3aによるインシュリン産生増強活性は、本来インシュリン産生能力のあるβ細胞のインシュリン産生能を増強する作用と共に、膵臓幹細胞をインシュリン産生能を有するβ細胞へ分化する作用も有しているため、Ｉ型糖尿病用のみならず、II型糖尿病用にも効果が期待できる。
本発明の医薬組成物は、膵臓組織に直接注入するか、又はin vitroで膵臓幹細胞又はそれを分化させた前駆β細胞などに注入して移植する方法が用いられるため、好ましくは通常の注射製剤などと同様、無菌の水溶液に溶解、又は懸濁し、薬学的に許容される安定化剤、等張化剤、緩衝剤などが配合される。また、遺伝子製剤の場合は、常法に従い、核内に遺伝子を運搬するためのキャリアが併用されることが好ましい。生理学的に受容可能なキャリアとしては、リポフェクタミン（Invitrogen社）などの遺伝子導入用カチオン性脂質などがある。
遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生来のプロモーターと共に、もしくは強力な公知プロモーター（例えばCAGプロモーターやCMVプロモーター）などに繋いで、生理学的に受容可能なキャリアと共にそのまま導入してもよいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各種の公知ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を用いて導入する。
また、公知のインシュリン製剤又はアディポネクチン製剤などの公知インシュリン産生増強剤を併用することもできる。
本発明の医薬有効投与量および投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり1μｇ/kg〜10mg/kgである。
6). Formulation of insulin-enhancing pharmaceutical composition and administration method The Wnt3a of the present invention, or an activator thereof, or an IGFBP-4 inhibitor can enhance the production of insulin in pancreatic tissue. It is valid. The insulin production enhancing activity by Wnt3a in the present invention has the effect of enhancing the insulin production ability of β cells originally having the ability to produce insulin and also the action of differentiating pancreatic stem cells into β cells having the ability to produce insulin. The effect can be expected not only for type I diabetes but also for type II diabetes.
Since the pharmaceutical composition of the present invention can be directly injected into pancreatic tissue or transplanted by in vitro injection into pancreatic stem cells or differentiated precursor β cells, etc., it is preferably a normal injection preparation. Similarly to the above, it is dissolved or suspended in a sterile aqueous solution, and a pharmaceutically acceptable stabilizer, isotonic agent, buffering agent and the like are blended therein. In the case of a gene preparation, it is preferable to use a carrier for transporting the gene into the nucleus in accordance with a conventional method. Examples of physiologically acceptable carriers include cationic lipids for gene transfer such as Lipofectamine (Invitrogen).
When introducing a gene into a cell or tissue, it may be introduced together with a natural promoter or a physiologically acceptable carrier connected to a strong known promoter (for example, CAG promoter or CMV promoter). These are introduced by using various known viral vectors (for example, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, etc.) that are usually used for gene therapy.
Moreover, well-known insulin production enhancers, such as a well-known insulin formulation or an adiponectin formulation, can also be used together.
The effective pharmaceutical dose and frequency of administration of the present invention are usually 1 μg / kg to 10 mg / kg per day for an adult, although it varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight and the like.
７．糖尿病診断方法及びそのためのキット
糖尿病、又はその前段階で膵臓組織が病的な状態にある場合には、膵臓のα細胞から著量のIGFBP-4が発現し、その量の高さは病状の悪化状態に対応していると考えられるので、被験者のIGFBP-4発現量を定量化して観察することは、膵臓組織の状態を判定するのに好適である。また同時に、膵臓組織が病的な状態に陥った場合には、Wnt3a発現量が極端に低下していると考えられるから、Wnt3a発現量を定量化して観察することも有効であるといえる。
具体的には、市販のELISA Kit(Quantikine ELISA Kit ；R&D Systems社など)を用いて定量化できる。「膵臓組織由来の生体試料」すなわち、膵臓組織又は膵臓に近い位置で採取した血液試料など、膵臓中でのIGFBP-4又はWnt3a発現量を反映している生体試料中のIGFBP-4やWnt3aを測定すればよいが、そのためにIGFBP-4又はWnt3aに対して特異的に結合する捕捉用抗体を用意し（anti-IGFBP-4; R&D Systems社,anti-Wnt3a; R&D Systems社やEverest社）、ＥＬＡＩＳＡを行う。例えば以下の手法で行う。
１）Wash buffer Concentrate 20mLをミリQ水で25倍に希釈する。
２）Wnt3a 標準品（R&D Systems社）またはIGFBP-4標準品（R&D Systems社）のバイアルにCalibrator Diluent RD5Kを 5mL加えて溶解する（2ng/mL）。
３）Wnt3a標準品/Calibrator Diluent RD5K 溶液（1mL）を希釈し，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mLの溶液を調製（Calibrator Diluent RD5K で希釈）する。0 pg/mLはCalibrator Diluent RD5K のみとする。同様にIGFBP-4についても希釈液を調製する。
４）ウェルにRD1Xを50μL加える（結晶が析出している場合は，室温で溶かす）。
５）200μLのサンプル（培養上清）、標準溶液（1000pg/mLが最高濃度）をウェルに加える。
６）室温にて放置する（75分）。
７）Wash buffer 400μLで洗浄する（3回）。
８）200μLの Wnt3a conjugate（もしくはIGFBP-4 conjugate）を加える。
９）75分放置する（室温）。
１０）洗浄する（3回）。
１１）200μLのSubstrate Solutionを加え、20分室温放置(遮光)する。
１２）50μLのStop solutionを加え、混合する。
１３）450nm(λ correction 540 or 570nm)で30分以内に測定を行う。
7). Diabetes diagnosis method and kit therefor When diabetes or pancreatic tissue is in a pathological state in the previous stage, a significant amount of IGFBP-4 is expressed from the α cells of the pancreas, and the height of the amount is Since it is thought that it corresponds to a worsening state, quantifying and observing the expression level of IGFBP-4 in a subject is suitable for determining the state of pancreatic tissue. At the same time, when the pancreatic tissue falls into a pathological state, it is considered that the expression level of Wnt3a is extremely reduced. Therefore, it can be said that quantifying and observing the expression level of Wnt3a is also effective.
Specifically, it can be quantified using a commercially available ELISA Kit (Quantikine ELISA Kit; R & D Systems, etc.). “Biological sample derived from pancreatic tissue”, ie, IGFBP-4 or Wnt3a in a biological sample reflecting the expression level of IGFBP-4 or Wnt3a in the pancreas, such as a blood sample collected at a position close to the pancreas tissue or pancreas For this purpose, a capture antibody that specifically binds to IGFBP-4 or Wnt3a is prepared (anti-IGFBP-4; R & D Systems, anti-Wnt3a; R & D Systems and Everest), Perform ELISA. For example, the following method is used.
1) Dilute Wash Buffer Concentrate 20mL with Milli-Q water 25 times.
2) Add 5mL of Calibrator Diluent RD5K to a vial of Wnt3a standard (R & D Systems) or IGFBP-4 standard (R & D Systems) and dissolve (2ng / mL).
3) Dilute Wnt3a standard / Calibrator Diluent RD5K solution (1mL) and add solutions of 1000pg / mL, 500pg / mL, 250pg / mL, 125pg / mL, 62.5pg / mL, 31.2pg / mL, 15.6pg / mL. Prepare (dilute with Calibrator Diluent RD5K). 0 pg / mL is used only for Calibrator Diluent RD5K. Similarly, a diluted solution is prepared for IGFBP-4.
4) Add 50 μL of RD1X to the well (if crystals are precipitated, dissolve at room temperature).
5) Add 200 μL of sample (culture supernatant) and standard solution (1000 pg / mL is the highest concentration) to the well.
6) Leave at room temperature (75 minutes).
7) Wash with 400 μL of Wash buffer (3 times).
8) Add 200 μL of Wnt3a conjugate (or IGFBP-4 conjugate).
9) Leave for 75 minutes (room temperature).
10) Wash (3 times).
11) Add 200 μL Substrate Solution and leave at room temperature for 20 minutes (shield from light).
12) Add 50 μL of Stop solution and mix.
13) Perform measurement at 450 nm (λ correction 540 or 570 nm) within 30 minutes.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本発明の実施例で用いた遺伝子組換え技術、PCR法、その他の手法などの具体的な手順や条件は、特に断らない限り、Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸III（組換えDNA技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed.,"Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, PartB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法により行うことができる。
また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not particularly limited to these examples.
In addition, specific procedures and conditions such as gene recombination techniques, PCR methods, and other methods used in the examples of the present invention, unless otherwise specified, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); DM Glover et al. Ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1995; Secondary Biochemistry Experiment Course 1, Genetic Research Method II ", Tokyo Chemical Doujin (1986); Edited by Japanese Biochemical Society," New Chemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid III (Recombinant DNA Technology) ", Tokyo Chemical Doujin (1992); R Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. Ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, P artB) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987), etc., or a method described in the literature cited therein or a method substantially similar thereto. it can.
Moreover, the description content of the prior art literature or the patent application specification cited in the present invention is incorporated as the description of this specification.
（実験例）膵臓α細胞によるIGFBP-4の発現の確認
α細胞のマーカー遺伝子となるGlucagonタンパク質に対して、特異的に結合する抗体（Abcam社製）を用いて、マウスの膵臓組織に対する免疫抗体染色解析を行った（図１，図２）。成体のC57/BL6マウス（オス、７-８週齢）を用い、0.9%Saline（Wako）液で血管内洗浄、4%パラホルムアルデヒド (Wako)で還流し、膵臓を抽出した。24時間4%パラホルムアルデヒド液に浸透させ（4℃）、その後30%sucrose（Wako）に置換、4℃で24時間以上浸透させた。この固定化が済んだ膵臓から、Microtome (ROM-380; YAMATO社製)を用いて30μm厚の凍結膵臓切片を作製した。凍結膵臓切片はTCS液（Tissue Collecting Solution; 25% Glycerin, 30% Ethlene Glycol, 50% 0.1MPO4）中に浸し、-25℃で保存した。凍結膵臓切片を、Glucagon抗体（Abcam社製、200倍希釈）、IGFBP-4抗体（SantaCruz社製、100倍希釈）もしくはWnt3抗体（Everest社製、100倍希釈）を使用して一次染色した後、二次蛍光抗体（Jackson laboratory社製、500倍希釈）で染色し、共焦点顕微鏡(LSM 510; Carl Zeiss)で検出した。
Glucagon抗体を用いると、β細胞を取り囲むように存在しているα細胞が染色される（図１中）。本発明者らがβ細胞新生のために必須であることを既に確認していた（特願２００８−１６８１８７）Wnt3産生部位を、Wnt3抗体（Everest社製、100倍希釈）により染色した。その結果、Wnt3がβ細胞内で活発に産生されていることが確認でき（図１左）、α細胞でもWnt3が産生されていることが確認された（図１右）。
そして、本発明者らが、下記の各実施例により、Wnt3の機能阻害物質であることを見出したIGFBP-4が、微量ではあるが、α細胞特異的に発現していることを、IGFBP-4抗体（SantaCruz社製、100倍希釈）を用いた染色解析により観察できた（図２）。
(Experimental example) Confirmation of the expression of IGFBP-4 by pancreatic alpha cells Using an antibody (Abcam) that specifically binds to the Glucagon protein, which is a marker gene of alpha cells, an immunizing antibody against mouse pancreatic tissue Staining analysis was performed (FIGS. 1 and 2). Adult C57 / BL6 mice (male, 7-8 weeks old) were washed with 0.9% Saline (Wako) solution and refluxed with 4% paraformaldehyde (Wako) to extract the pancreas. Penetration into a 4% paraformaldehyde solution (4 ° C.) for 24 hours, followed by substitution with 30% sucrose (Wako), and penetration at 4 ° C. for 24 hours or more. From this immobilized pancreas, a frozen pancreas section 30 μm thick was prepared using Microtome (ROM-380; manufactured by YAMATO). The frozen pancreas slices were immersed in TCS solution (Tissue Collecting Solution; 25% Glycerin, 30% Ethlene Glycol, 50% 0.1MPO 4 ) and stored at -25 ° C. After primary staining of frozen pancreas sections using Glucagon antibody (Abcam, diluted 200-fold), IGFBP-4 antibody (SantaCruz, diluted 100-fold) or Wnt3 antibody (Everest, diluted 100-fold) The sample was stained with a secondary fluorescent antibody (Jackson laboratory, diluted 500 times) and detected with a confocal microscope (LSM 510; Carl Zeiss).
When the Glucagon antibody is used, α cells existing so as to surround the β cells are stained (in FIG. 1). The present inventors have already confirmed that it is essential for β cell neogenesis (Japanese Patent Application No. 2008-168187). The Wnt3 production site was stained with a Wnt3 antibody (Everest, 100-fold dilution). As a result, it was confirmed that Wnt3 was actively produced in β cells (FIG. 1 left), and that Wnt3 was also produced in α cells (FIG. 1 right).
Then, the present inventors found that IGFBP-4, which was found to be a Wnt3 function inhibitory substance, was expressed in an α cell-specific manner in a small amount, according to each of the following examples. It could be observed by staining analysis using 4 antibodies (SantaCruz, diluted 100 times) (FIG. 2).
（実施例１）膵臓β細胞におけるWnt3が関連したインシュリンの発現促進（RT-PCR発現解析）
ラットの成体膵臓幹細胞培養系にWnt3タンパク質、及び細胞内Wntシグナル伝達機構関連物質などの各因子を添加し、膵臓β細胞によるインシュリン及びNeuroD1の発現量変化をRT-PCR発現解析により調べた（図３）。ここで、NeuroD1遺伝子は、β前駆細胞のマーカー遺伝子として知られるβ細胞分化に必須な遺伝子である（非特許文献６）。
成体膵臓幹細胞培養系に添加した物質は以下の通りである。
(1)Wnt3タンパク質、（Wnt３の全長遺伝子をレンチウイルスべクター（非特許文献７）に組み込み発現させた）
(2)dnWnt：Wnt3のドミナントネガティブタンパク質（Wntの作用領域を改変して機能不全にしたタンパク質をレンチウイルスべクター（非特許文献７）に組み込み発現させた）
(3)βカテニン転写因子のshRNA（βカテニン転写因子は、細胞内で機能するWntシグナル伝達機構で重用な役割を果たすとされている。（非特許文献８）
(4) GSK3βのインヒビター（GSK3βinhibitorはWntシグナル伝達機構を促進するとされている。TDZD８、4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione, Calbiochem社製）
ラット成体膵臓幹細胞培養系（特願２００８−１６８２２２）に各因子を加えて４日間培養し、細胞から抽出したTotal RNAから逆転写反応を行い、RT-PCR法によりインシュリン mRNA及びNeuroD1 mRNAの発現量を調べた。具体的には、RNA 抽出試薬Isogen (Nippon gene社製)を用いて、Total RNAを抽出した。エタノール沈殿で洗浄し、定量したTotal RNAを、DNase I (TURBO DNA-free, Ambion社製)で処理し、混在している微量DNAを除いた。調製済みのTotal RNAに対し、SuperScript II First-Strand cDNA synthesis system (Invitrogen社製) を用いて逆転写反応を行いcDNAを作製した。このcDNAを用いてPCRを、[ 94°C for 2 min, and 40 cycles of 94°C for 15 s, 60°C for 20 s, and 72°C for 40 s]という条件の下に行い、インシュリン mRNA及びNeuroD1 mRNAの発現量を調べた。
図３によれば、dnWntを添加すると、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の発現はいずれも減少する。細胞内のβカテニン転写因子を抑制するためのβカテニン転写因子shRNAを添加すると、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の発現は減少する。反対に、GSK3βinhibitorを添加すると、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の発現は上昇する。dnWntおよびβカテニン転写因子のshRNAで、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子の発現が減少し、反対にGSK3βinhibitorおよびWnt3でその発現が上昇すると言うことは、これらの遺伝子が明確にWntシグナル伝達機構で制御されていることの証明である。
上述したように、NeuroD1遺伝子というのは、膵臓の幹細胞培養系に於いて、β細胞に分化したばかりの前駆細胞に特異的に発現する転写因子タンパク質である（特願２００８−１６８２２２）。NeuroD1遺伝子がないと、膵臓はインシュリンを産生できない（非特許文献７）。このNeuroD1遺伝子の発現を制御するプロモーター領域には、Wntシグナルのβカテニン転写因子が結合するDNA結合配列が含まれる（TCF/LEF site; 図４および図５）。
(Example 1) Promotion of Wnt3-related insulin expression in pancreatic β cells (RT-PCR expression analysis)
Factors such as Wnt3 protein and intracellular Wnt signaling mechanism-related substances were added to the rat adult pancreatic stem cell culture system, and changes in the expression levels of insulin and NeuroD1 by pancreatic β cells were examined by RT-PCR expression analysis (Fig. 3). Here, the NeuroD1 gene is a gene essential for β cell differentiation known as a marker gene for β precursor cells (Non-patent Document 6).
The substances added to the adult pancreatic stem cell culture system are as follows.
(1) Wnt3 protein (Wnt3 full-length gene was incorporated and expressed in a lentiviral vector (Non-patent Document 7))
(2) dnWnt: dominant negative protein of Wnt3 (a protein that has been dysfunctional by modifying the Wnt action region was incorporated into a lentiviral vector (Non-patent Document 7) and expressed)
(3) β-catenin transcription factor shRNA (β-catenin transcription factor is said to play an important role in the Wnt signaling mechanism that functions in cells (Non-patent Document 8).
(4) Inhibitor of GSK3β (GSK3βinhibitor is said to promote Wnt signaling mechanism. TDZD8, 4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione, manufactured by Calbiochem)
Each factor is added to a rat adult pancreatic stem cell culture system (Japanese Patent Application No. 2008-168222), cultured for 4 days, a reverse transcription reaction is performed from the total RNA extracted from the cells, and the levels of insulin mRNA and NeuroD1 mRNA are expressed by RT-PCR. I investigated. Specifically, Total RNA was extracted using the RNA extraction reagent Isogen (Nippon gene). Total RNA that had been washed with ethanol precipitation and quantified was treated with DNase I (TURBO DNA-free, manufactured by Ambion) to remove the trace amount of mixed DNA. The prepared total RNA was subjected to reverse transcription using SuperScript II First-Strand cDNA synthesis system (Invitrogen) to prepare cDNA. Using this cDNA, PCR was performed under the conditions of [94 ° C for 2 min, and 40 cycles of 94 ° C for 15 s, 60 ° C for 20 s, and 72 ° C for 40 s]. The expression levels of mRNA and NeuroD1 mRNA were examined.
According to FIG. 3, when dnWnt is added, the expression of the NeuroD1 gene and the insulin gene both decrease. When β-catenin transcription factor shRNA for suppressing intracellular β-catenin transcription factor is added, the expression of NeuroD1 gene and insulin gene decreases. On the contrary, when GSK3β inhibitor is added, the expression of NeuroD1 gene and insulin gene increases. dnWnt and β-catenin transcription factor shRNA decreases the expression of NeuroD1 and insulin genes, while GSK3βinhibitor and Wnt3 increase their expression. These genes are clearly regulated by the Wnt signaling mechanism. It is proof that
As described above, the NeuroD1 gene is a transcription factor protein that is specifically expressed in progenitor cells that have just differentiated into β cells in a pancreatic stem cell culture system (Japanese Patent Application No. 2008-168222). Without the NeuroD1 gene, the pancreas cannot produce insulin (Non-patent Document 7). The promoter region that controls the expression of this NeuroD1 gene contains a DNA binding sequence to which the β-catenin transcription factor of the Wnt signal binds (TCF / LEF site; FIGS. 4 and 5).
（実施例２）膵臓β細胞におけるWnt3が関連したインシュリンの発現促進（ChIP解析）
このTCF/LEF領域のクロマチンの状態を調べるために、Wnt3存在下と非存在下でChIP解析を行った。ラット成体膵臓幹細胞培養系（特願２００８−１６８２２２）に、Wnt3a（rmWnt3a リコンビナントタンパク質；50 ng/mL最終濃度, R&D Systems社製）を添加したものと、していないものを用意した。細胞はWnt3aを入れた場合は、リコンビナントタンパク質添加後２日間３７℃５％CO2インキュベーターで培養した。比較として、リコンビナントタンパク質の代わりにDMSO(Wako)を添加したものも２日間培養した。培養したディッシュに16%パラホルムアルデヒド（ElectronMicroscopy Sciences社製）を添加して３７℃で１０分間反応させて迅速な固定化を行った。セルスクレーパーで細胞を集め、エッペンドルフチューブに移したものをChIP Assay Kit (Upstate社製)を用いてサンプルを調製した。発現の活性化状態は、目的遺伝子のプロモーター領域のHistoneH3がアセチル化されているかどうかで示されるため（非特許文献９）、Anti-Acetyl HistoneH3抗体(Upstate社製)を用いて、クロマチンの活性化状態を誘導するしているかどうかを抽出したクロマチンから調べた。nti-Acetyl HistoneH3抗体を用いて免疫沈降したクロマチンDNAに対し、NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位を特異的に検出するPCRプライマーを用いて[ 96°C for 10 min, 96°C for 1 min、and 40 cycles of 96°C for 30 s, 60°C for 30 s, and 72°C for 40 s]という条件の下に行い、ChIP-PCR解析を行った。その結果、図４に示すようにコントロールに比較して、Wnt3aリコンビナントタンパク質を添加した培養系においてのみ、NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンが活性化していることが判明した。
(Example 2) Promotion of Wnt3-related insulin expression in pancreatic β cells (ChIP analysis)
To examine the chromatin state of this TCF / LEF region, ChIP analysis was performed in the presence and absence of Wnt3. A rat adult pancreatic stem cell culture system (Japanese Patent Application No. 2008-168222) with and without Wnt3a (rmWnt3a recombinant protein; 50 ng / mL final concentration, manufactured by R & D Systems) was prepared. When Wnt3a was added, the cells were cultured in a 5% CO2 incubator at 37 ° C. for 2 days after the addition of the recombinant protein. As a comparison, DMSO (Wako) added in place of the recombinant protein was also cultured for 2 days. 16% paraformaldehyde (manufactured by Electron Microscopy Sciences) was added to the cultured dish and reacted at 37 ° C. for 10 minutes for rapid immobilization. Cells were collected with a cell scraper and transferred to an Eppendorf tube, and a sample was prepared using a ChIP Assay Kit (manufactured by Upstate). Since the activation state of expression is indicated by whether or not HistoneH3 in the promoter region of the target gene is acetylated (Non-patent Document 9), activation of chromatin using an Anti-Acetyl HistoneH3 antibody (manufactured by Upstate) It was investigated from the extracted chromatin whether or not the state was induced. For chromatin DNA immunoprecipitated using nti-Acetyl Histone H3 antibody, PCR primers that specifically detect TCF / LEF transcription factor binding sites on the NeuroD1 promoter were used [96 ° C for 10 min, 96 ° C for 1 min, and 40 cycles of 96 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s, and 72 ° C for 40 s], and ChIP-PCR analysis was performed. As a result, as shown in FIG. 4, it was found that the chromatin at the TCF / LEF transcription factor binding site on the NeuroD1 promoter was activated only in the culture system to which the Wnt3a recombinant protein was added, as compared with the control.
図５に膵臓β細胞がインシュリンを産出するまでのWnt3とNeuroD1の役割の模式図を示した。NeuroD1遺伝子は、インシュリン産生にとって必須であるが(非特許文献６)、それはインシュリンプロモーターにNeuroD1が活性化転写因子として結合する領域が保存されているからである。この結合配列領域はE-box(CANNTG)と呼ばれるもので、ここに細胞内に豊富にあるE47転写因子とNeuroD1が結合して初めてインシュリンプロモーターが活性化され、下流のインシュリンmRNAが転写される。NeuroD1がないとインシュリンmRNAが発現されないので、インシュリン（タンパク質）も生成されない。NeuroD1が発現するためには、上述したようにWntシグナリングよってNeuroD1プロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンが活性化される必要が有る。 FIG. 5 shows a schematic diagram of the role of Wnt3 and NeuroD1 until pancreatic β cells produce insulin. The NeuroD1 gene is essential for insulin production (Non-patent Document 6) because the region where NeuroD1 binds as an activated transcription factor is conserved in the insulin promoter. This binding sequence region is called an E-box (CANNTG). The insulin promoter is activated only after the E47 transcription factor and NeuroD1 abundant in the cell bind thereto, and the downstream insulin mRNA is transcribed. Insulin mRNA is not expressed without NeuroD1, so insulin (protein) is not produced. In order to express NeuroD1, it is necessary to activate the chromatin at the TCF / LEF transcription factor binding site on the NeuroD1 promoter by Wnt signaling as described above.
（実施例３）インシュリンプロモーターのWnt3及びNeuroD1による活性化
膵臓幹細胞培養系で、最終産物であるインシュリン遺伝子の発現を導く、インシュリンプロモーターのWntおよびNeuroD1による活性化を実際に調べた（図６）。NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位のクロマチンの活性化(Anti-Acetyl HistoneH3；上述で説明済み)がWnt3で誘導されること（右の中段）、さらにNeuroD1がインシュリン遺伝子の活性化 (インシュリン遺伝子のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位(E-box))部位へ直接結合し、クロマチン(染色体)の活性化(Anti-Acetyl HistoneH3)を誘導する)を導くことを示した（左、中段）。
以上の実験結果から、インシュリンの産生には、NeuroD1遺伝子の活性化が必要であること、及び、そのNeuroD1遺伝子の活性化にはWntによるWntシグナリングの活性化が必要であることが明らかになった
(Example 3) Activation by insulin promoters Wnt3 and NeuroD1 Activation of insulin promoters Wnt and NeuroD1 leading to the expression of the final product, the insulin gene, was actually examined in a pancreatic stem cell culture system (FIG. 6). Chromatin activation at the TCF / LEF transcription factor binding site on the NeuroD1 promoter (Anti-Acetyl HistoneH3; explained above) is induced by Wnt3 (right middle), and NeuroD1 activates the insulin gene ( It was shown that it directly binds to the NeuroD1 recognition binding site (E-box)) on the insulin gene promoter, leading to chromatin (chromosome) activation (inducing Anti-Acetyl HistoneH3) (left, middle). .
From the above experimental results, it was clarified that NeuroD1 gene activation is necessary for insulin production, and that Wnt signaling activation by Wnt is necessary for NeuroD1 gene activation.
（実施例４）糖尿病疾患時の膵臓についての解析
このようにインシュリンの産生に必要な、NeuroD1遺伝子の活性化、そのNeuroD1遺伝子の活性化に必要なWntによるWntシグナリングの活性化に注目し、糖尿病疾患時の膵臓モデルである糖尿病ラットの膵臓（Ｉ型糖尿病の膵島）を用いて、これらの制御機構に注目して解析した。成体の糖尿病ラット（オス、7-8週齢）を用い、0.9%Saline（Wako）液で血管内洗浄、4%パラホルムアルデヒド (Wako)で還流し、膵臓を抽出した。24時間4%パラホルムアルデヒド液に浸透させ（4℃）、その後30%sucrose（Wako）に置換、4℃で24時間以上浸透させた。この固定化が済んだ膵臓から、Microtome (ROM-380; YAMATO社製)を用いて30μm厚の凍結膵臓切片を作製した。凍結膵臓切片はTCS液（Tissue Collecting Solution; 25% Glycerin, 30% Ethlene Glycol, 50% 0.1MPO4）中に浸し、-25℃で保存した。凍結膵臓切片を、NeuroD1抗体（SantaCruz社製、100倍希釈）、インシュリン抗体（SIGMA社製、200倍希釈）を使用して一次染色した後、二次蛍光抗体（Jackson laboratory社製、500倍希釈）で染色し、共焦点顕微鏡(LSM 510; Carl Zeiss)で検出した。
図７の免疫組織染色から分かるように、健常体（wild type）の膵臓ではNeuroD1遺伝子およびNeuroD1遺伝子双方の高い発現が見られるのに対して、糖尿病ラットの膵臓（Ｉ型糖尿病の膵島）では、NeuroD1転写因子が活性化する核の変形及びおよびNeuroD1、インシュリン遺伝子双方に発現の減少が見られた。
(Example 4) Analysis of pancreas during diabetic disease Thus, focusing on the activation of NeuroD1 gene necessary for insulin production and the activation of Wnt signaling by Wnt necessary for the activation of NeuroD1 gene, diabetes Using the pancreas of a diabetic rat (islet of type I diabetes), which is a model of pancreas at the time of disease, analysis was performed with a focus on these control mechanisms. Adult diabetic rats (male, 7-8 weeks old) were washed with 0.9% Saline (Wako) solution and refluxed with 4% paraformaldehyde (Wako) to extract the pancreas. Penetration into a 4% paraformaldehyde solution (4 ° C.) for 24 hours, followed by substitution with 30% sucrose (Wako), and penetration at 4 ° C. for 24 hours or more. From this immobilized pancreas, a frozen pancreas section 30 μm thick was prepared using Microtome (ROM-380; manufactured by YAMATO). The frozen pancreas slices were immersed in TCS solution (Tissue Collecting Solution; 25% Glycerin, 30% Ethlene Glycol, 50% 0.1MPO 4 ) and stored at -25 ° C. Frozen pancreas sections were primary stained using NeuroD1 antibody (SantaCruz, diluted 100-fold) and insulin antibody (SIGMA, diluted 200-fold), then secondary fluorescent antibody (Jackson laboratory, diluted 500-fold) ) And detected with a confocal microscope (LSM 510; Carl Zeiss).
As can be seen from the immunohistochemical staining of FIG. 7, in the pancreas of the healthy body (wild type), both NeuroD1 gene and NeuroD1 gene are highly expressed, whereas in the pancreas of diabetic rats (islet of type I diabetes) Nuclear deformation activated by NeuroD1 transcription factor and decreased expression of both NeuroD1 and insulin genes were observed.
さらに、図８の免疫組織染色から、健常体（wild type）の膵臓ではWnt3およびインシュリン双方の高い発現が見られるのに対して、糖尿病マウスの膵臓（II型糖尿病の膵島）では、Wnt3およびインシュリン遺伝子の発現が減少して膵島が矮小化しているのが観察された。この免疫組織染色は、成体の糖尿病マウス（オス、７-８週齢）を用い、0.9%Saline（Wako）液で血管内洗浄、4%パラホルムアルデヒド (Wako)で還流し、膵臓を抽出した。24時間4%パラホルムアルデヒド液に浸透させ（４℃）、その後30%sucrose（Wako）に置換、４℃で２４時間以上浸透させた。この固定化が済んだ膵臓から、Microtome (ROM-380; YAMATO社製)を用いて30μm厚の凍結膵臓切片を作製した。凍結膵臓切片はTCS液（Tissue Collecting Solution; 25% Glycerin, 30% Ethlene Glycol, 50% 0.1MPO4）中に浸し、-25℃で保存した。凍結膵臓切片を、NeuroD1抗体（SantaCruz社製、100倍希釈）、インシュリン抗体（SIGMA社製、200倍希釈）を使用して一次染色した後、二次蛍光抗体（Jackson laboratory社製、500倍希釈）で染色し、共焦点顕微鏡(LSM 510; Carl Zeiss)で検出した。前述のインシュリン抗体（SIGMA社製、200倍希釈）とWnt3抗体（Everest社製、100倍希釈）を使用して一次染色した後、二次蛍光抗体（Jackson laboratory社製、500倍希釈）で染色し、共焦点顕微鏡(LSM 510; Carl Zeiss)で検出したものである。 Furthermore, from the immunohistochemical staining of FIG. 8, high expression of both Wnt3 and insulin is seen in the wild type pancreas, whereas Wnt3 and insulin are found in the pancreas of diabetic mice (islets of type II diabetes). It was observed that the expression of the gene decreased and the islets were dwarfed. For this immunohistochemical staining, adult diabetic mice (male, 7-8 weeks old) were used, washed with 0.9% Saline (Wako) solution and refluxed with 4% paraformaldehyde (Wako) to extract the pancreas. Penetration into 4% paraformaldehyde solution (4 ° C.) for 24 hours, followed by replacement with 30% sucrose (Wako), and penetration at 4 ° C. for 24 hours or more. From this immobilized pancreas, a frozen pancreas section 30 μm thick was prepared using Microtome (ROM-380; manufactured by YAMATO). The frozen pancreas slices were immersed in TCS solution (Tissue Collecting Solution; 25% Glycerin, 30% Ethlene Glycol, 50% 0.1MPO 4 ) and stored at -25 ° C. Frozen pancreas sections were primary stained using NeuroD1 antibody (SantaCruz, diluted 100-fold) and insulin antibody (SIGMA, diluted 200-fold), then secondary fluorescent antibody (Jackson laboratory, diluted 500-fold) ) And detected with a confocal microscope (LSM 510; Carl Zeiss). Primary staining using the aforementioned insulin antibody (SIGMA, diluted 200-fold) and Wnt3 antibody (Everest, diluted 100-fold) followed by secondary fluorescent antibody (Jackson laboratory, diluted 500-fold) And detected with a confocal microscope (LSM 510; Carl Zeiss).
以上のことから、Wnt3機能が低下すると、インシュリン遺伝子の発現に必須なNeuroD1が減少するためインシュリンが分泌されず、糖尿病状態を引き起こすメカニズムが解明された。 From the above, when Wnt3 function declines, NeuroD1 essential for insulin gene expression decreases, and insulin is not secreted, thus elucidating the mechanism that causes a diabetic state.
（実施例５）糖尿病状態で発現するｍＲＮＡの定量比較解析
インシュリン遺伝子の発現に必須なNeuroD1の減少を引き起こすWnt3機能の低下はどのようにして起きるのかを以下のように解析した。
Ｉ型糖尿病ラットおよび健常体ラットから膵臓を取り出し、コラゲナーゼ分解によって膵島を調製した。この調製方法は、コラゲナーゼ酵素液；[1mg/mLコラゲナーゼ(Wako)、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)medium、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加]にマイクロダイセクションした膵臓を浸し、37℃で15分間撹拌しながら浸透培養した後、遠心・洗浄する。さらにコラゲナーゼ酵素液で37℃、15分間撹拌しながら浸透培養したものを、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)mediumで３回遠心・洗浄して集めた細胞塊を氷上ファルコンチューブに集積したものである。調製した膵島から、RNA 抽出試薬Isogen (Nippon gene社製)を用いて、Total RNAを抽出した。エタノール沈殿で洗浄し、定量したTotal RNAを、DNase I (TURBO DNA-free, Ambion社製)で処理し、混在している微量DNAを除いた。調製済みのTotal RNAに対し、SuperScript II First-Strand cDNA synthesis system (Invitrogen社製) を用いて42℃で逆転写反応を行いcDNAを作製した。このcDNAを用いてPCRを、[94°C for 2 min, and 40 cycles of 94°C for 1 min, 60°C for 30 s, and 72°C for 30 s]という条件の下にEx Taq酵素（Takara社製）を用いて行い、発現するmRNAの定量比較解析を行った（図９）。
(Example 5) Quantitative comparative analysis of mRNA expressed in diabetic state The following was analyzed how Wnt3 function decrease that causes the decrease of NeuroD1 essential for the expression of insulin gene occurs.
Pancreas was removed from type I diabetic rats and healthy rats, and islets were prepared by collagenase degradation. This preparation method involves immersing the microdissected pancreas in collagenase enzyme solution; [1 mg / mL collagenase (Wako), DME / F12, high glucose (1 mM L-glutamine) medium, N2 supplement added, Antibiotic-Antimicotic added] Incubate with stirring at 37 ° C for 15 minutes, then centrifuge and wash. The cell mass collected by osmotic culture with collagenase enzyme solution at 37 ° C for 15 minutes with agitation was centrifuged and washed 3 times with DME / F12, high glucose (1 mM L-glutamine) medium, and collected in a falcon tube on ice. It is a thing. Total RNA was extracted from the prepared islets using an RNA extraction reagent Isogen (Nippon gene). Total RNA that had been washed with ethanol precipitation and quantified was treated with DNase I (TURBO DNA-free, manufactured by Ambion) to remove the trace amount of mixed DNA. The prepared total RNA was subjected to reverse transcription reaction at 42 ° C. using SuperScript II First-Strand cDNA synthesis system (Invitrogen) to prepare cDNA. Using this cDNA, PCR was performed under the conditions of [94 ° C for 2 min, and 40 cycles of 94 ° C for 1 min, 60 ° C for 30 s, and 72 ° C for 30 s]. (Takara) was used to perform quantitative comparative analysis of the expressed mRNA (FIG. 9).
この実験結果によると、健常体（WT）と糖尿病(DB)での比較において、糖尿病ではWnt3、インシュリンを含め、インシュリンと同様のシグナル伝達作用を持つIGF-1, IGF-II遺伝子の発現低下が認められた。ここで興味深いことに、糖尿病状態でより発現が上昇している関連遺伝子が、IGFBP-4であることを我々は発見した。
なお、IGFBP-4はIGF-1, IGF-Iに結合して競合作用することが一般に知られており、近年では胎児発生段階やES細胞から心筋細胞の分化にWntレセプターに競合阻害することにより、その分化を促進するという報告がなされている（特許文献３）。しかし、膵臓や成体幹細胞の分化制御においての機能は全く報告されておらず、インシュリン産生に必須であるWntの働きに対する影響も全く調べられていない。このように、IGFBP-4が糖尿病状態で高い発現上昇が観察されたことは驚くべきことであった。
According to the results of this experiment, in comparison between healthy body (WT) and diabetes (DB), IGF-1 and IGF-II genes, including Wnt3 and insulin, have the same signal transduction effect as diabetes. Admitted. Interestingly, we found that a related gene that is more expressed in diabetic conditions is IGFBP-4.
In addition, it is generally known that IGFBP-4 binds to IGF-1 and IGF-I and has a competitive action. In recent years, IGFBP-4 is competitively inhibited by the Wnt receptor during embryonic development and differentiation of ES cells to cardiomyocytes. There is a report that the differentiation is promoted (Patent Document 3). However, no function in pancreatic or adult stem cell differentiation control has been reported, and no influence on the Wnt function essential for insulin production has been investigated. Thus, it was surprising that high expression increase of IGFBP-4 was observed in the diabetic state.
（実施例６）IGFBP-4によるWnt機能の阻害効果
そこで、我々は膵臓幹細胞培養系に於いて、糖尿病状態で発現が上昇していたIGFBP-4の機能を、図５模式図に示した制御機構に注目して解析した。まず、Wntの働きを調べるため、TCF/LEFルシフェラーゼレポーターを用意した（TCF/LEF結合配列が５個連結されて、CMV最小単位プロモーターにつながったプロモーターが下流のルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入されているプラスミド）。膵臓幹細胞培養系にTCF/LEFルシフェラーゼレポーター1μgを、FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche Diagnosticsy社製）を用いて導入し、トランスフェクションから48時間後に細胞抽出液をDual luciferaseレポーターシステム(Promega社製)のLysate Bufferを用いて調製した。Wntが機能し、Wnt/beta-catenin細胞内シグナリングが活性化されるとTCF、LEF、beta-catenin転写因子がプロモーター上のTCF/LEF結合部位に結合して、下流ルシフェラーゼ遺伝子の発現を誘導する。そのルシフェラーゼ遺伝子の発現を、上述promega社のDual luciferaseレポーターシステムを用い、ルミノメーター解析装置(Lumant LB 9501)で解析した。図１０に示すように、TCF/LEF luciferaseレポーター活性が、IGFBP-4（レコンビナントタンパク質、R&D社製）の添加量が増えるに従って、減少していく相関関係が見られることが明らかとなった。このTCF/LEF luciferaseレポーター活性の減少は、IGFBP-4の作用を打ち消す中和抗体（anti-IGFBP-4、R&D社製）を加えると無くなることから、Wntの機能阻害がIGFBP-4特異的に作用していることを確認した（図１０、一番右のバー）。
(Example 6) Inhibitory effect of Wnt function by IGFBP-4 Therefore, in the pancreatic stem cell culture system, we controlled the function of IGFBP-4 whose expression was increased in a diabetic state as shown in the schematic diagram of FIG. The analysis was focused on the mechanism. First, TCF / LEF luciferase reporter was prepared to examine the function of Wnt (5 TCF / LEF binding sequences were linked and a promoter connected to the CMV minimal unit promoter was inserted upstream of the downstream luciferase gene. Plasmid). 1 μg of TCF / LEF luciferase reporter was introduced into the pancreatic stem cell culture system using FuGENE 6 transfection reagent (Roche Diagnosticsy), and the cell extract was 48 hours after transfection using Dual luciferase reporter system (Promega). Prepared using Lysate Buffer. When Wnt functions and Wnt / beta-catenin intracellular signaling is activated, TCF, LEF, and beta-catenin transcription factors bind to the TCF / LEF binding site on the promoter and induce expression of the downstream luciferase gene . The expression of the luciferase gene was analyzed with a luminometer analyzer (Lumant LB 9501) using the above-mentioned Proluc Dual luciferase reporter system. As shown in FIG. 10, it was clarified that TCF / LEF luciferase reporter activity has a decreasing correlation with increasing amount of IGFBP-4 (recombinant protein, manufactured by R & D). . This decrease in TCF / LEF luciferase reporter activity disappears when a neutralizing antibody (anti-IGFBP-4, manufactured by R & D) that counteracts the action of IGFBP-4 is added, so Wnt function inhibition is specific to IGFBP-4. It was confirmed that it was working (FIG. 10, rightmost bar).
（実施例７）IGFBP-4によるNeuroD1プロモーターの活性化の阻害効果
次に、IGFBP-4がNeuroD1遺伝子の発現に与える影響を調べた。NeuroD1遺伝子はインシュリン産生に取って必須であるが(非特許文献６)、上述したようにWntシグナリングよってNeuroD1プロモーター上のTCF/LEF転写因子結合部位が活性化される必要が有る。そこで、NeuroD1プロモーターにルシフェラーゼレポーターを連結したレポータープラスミドを用意した。膵臓幹細胞培養系にNeuroD1プロモーター連結型ルシフェラーゼレポーター1μgを、FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche Diagnosticsy社製）を用いて導入し、トランスフェクションから48時間後に細胞抽出液をDual luciferaseレポーターシステム(Promega社製)のLysate Bufferを用いて調製した。図１１に示すように、NeuroD1プロモーター-luciferaseレポーター活性が、Wntを添加すると大きく上昇するのが分かる。しかし、IGFBP-4（レコンビナントタンパク質、R&D社製）の添加された状態では、Wntによって促進されるはずのNeuroD1プロモーター-luciferaseレポーター活性の上昇が著しく阻害されることが判明した。この阻害作用は、IGFBP-4の作用を打ち消す中和抗体（anti-IGFBP-4、R&D社製）を加えると減少することから、WntのNeuroD1プロモーター活性に与える機能をIGFBP-4が特異的に阻害していることを確認した（図１１、一番右のバー）。
(Example 7) Inhibitory effect of activation of NeuroD1 promoter by IGFBP-4 Next, the influence of IGFBP-4 on the expression of the NeuroD1 gene was examined. The NeuroD1 gene is essential for insulin production (Non-patent Document 6), but as described above, the TCF / LEF transcription factor binding site on the NeuroD1 promoter needs to be activated by Wnt signaling. Therefore, a reporter plasmid was prepared in which a luciferase reporter was linked to the NeuroD1 promoter. 1 μg of NeuroD1 promoter-linked luciferase reporter was introduced into the pancreatic stem cell culture system using FuGENE 6 transfection reagent (Roche Diagnosticsy), and the cell extract was dual luciferase reporter system (Promega) 48 hours after transfection. Of Lysate Buffer. As shown in FIG. 11, it can be seen that the NeuroD1 promoter-luciferase reporter activity greatly increases when Wnt is added. However, it was found that in the state where IGFBP-4 (recombinant protein, manufactured by R & D) was added, the increase in NeuroD1 promoter-luciferase reporter activity that should be promoted by Wnt was significantly inhibited. This inhibitory effect decreases when a neutralizing antibody (anti-IGFBP-4, manufactured by R & D) that counteracts the action of IGFBP-4 is added, so that IGFBP-4 has a specific function that contributes to the NeuroD1 promoter activity of Wnt. The inhibition was confirmed (FIG. 11, rightmost bar).
（実施例８）IGFBP-4によるインシュリンプロモーターの活性化の阻害効果
さらに、IGFBP-4がインシュリン遺伝子の発現に与える影響を調べた。NeuroD1遺伝子はインシュリン産生に取って必須であるが、上述したようにWntシグナリングよって発現が活性化されたNeuroD1転写因子が、インシュリン遺伝子のプロモーター上のE-box転写因子結合部位に結合して、下流のmRNAの発現を活性化する必要が有る。そこで、インシュリンプロモーターにルシフェラーゼレポーターを連結したレポータープラスミドを用意した。膵臓幹細胞培養系にインシュリンプロモーター連結型ルシフェラーゼレポーター１μgを、FuGENE 6トランスフェクション試薬（Roche Diagnosticsy社製）を用いて導入し、トランスフェクションから48時間後に細胞抽出液をDual luciferaseレポーターシステム(Promega社製)のLysate Bufferを用いて調製した。図１２に示すように、インシュリンプロモーター-luciferaseレポーター活性が、Wntを添加すると大きく上昇するのが分かる。IGF-1の添加ではこのような著しい上昇が見られないことから、Wntの作用がより特異的であることが分かる。また、IGF-1（レコンビナントタンパク質、R&D社製）の添加された状態にIGFBP-4（レコンビナントタンパク質、R&D社製）を添加してもその作用はほとんど変わらないことから、IGFBP-4のインシュリンプロモーターに与える阻害作用はIGF-1によるものではないことも分かる。しかし、Wntを添加すると大きく上昇するのが観察されたインシュリンプロモーター活性は、IGFBP-4を同時に添加された状態では、全く上昇しないこと、またこの阻害作用は、IGFBP-4の中和抗体（anti-IGFBP-4、R&D社製）を加えると減少することから、Wntのインシュリンプロモーター活性に与える機能をIGFBP-4が特異的に阻害していることを確認した（図１２、一番右のバー）。
以上の制御機構をまとめたのが図１３である。インンシュリンを産生するβ細胞の生成効率が高まれば、インンシュリン産生度が上昇するため糖尿病の病態改善に役立つ。この効率を上昇させるのは、成体においてβ細胞新生を高めるWnt3であり、そのWntによって活性化される重要遺伝子が、NeuroD１である。この必須となる制御機構に於いてインシュリン産生を阻害する物質が、膵臓α細胞が産出するIGFBP-4であることが分かった。また、健康体と糖尿病動物との比較からも、IGFBP-4の濃度が糖尿病動物の膵臓において高濃度であることが分かった。Wnt3Aの働きを測定するレポーター解析から、IGFBP-4がWnt3の作用を阻害することによって、悪影響を及ぼしていることが判明した。
(Example 8) Inhibitory effect of insulin promoter activation by IGFBP-4 Furthermore, the influence of IGFBP-4 on the expression of the insulin gene was examined. The NeuroD1 gene is essential for insulin production. As described above, the NeuroD1 transcription factor whose expression is activated by Wnt signaling binds to the E-box transcription factor binding site on the insulin gene promoter, and is downstream. It is necessary to activate the expression of mRNA. Therefore, a reporter plasmid in which a luciferase reporter is linked to an insulin promoter was prepared. 1 μg of insulin promoter-linked luciferase reporter was introduced into the pancreatic stem cell culture system using FuGENE 6 transfection reagent (Roche Diagnosticsy), and the cell extract was dual luciferase reporter system (Promega) 48 hours after transfection. Of Lysate Buffer. As shown in FIG. 12, it can be seen that the insulin promoter-luciferase reporter activity greatly increases when Wnt is added. This remarkable increase is not observed with the addition of IGF-1, indicating that the action of Wnt is more specific. In addition, adding IGFBP-4 (recombinant protein, manufactured by R & D) to the state where IGF-1 (recombinant protein, manufactured by R & D) is added, the effect is almost unchanged. It can also be seen that the inhibitory action of 4 on the insulin promoter is not due to IGF-1. However, the insulin promoter activity that was observed to increase significantly when Wnt was added did not increase at all when IGFBP-4 was added at the same time. -IGFBP-4 (manufactured by R & D) decreased, and it was confirmed that IGFBP-4 specifically inhibited the function of Wnt on the insulin promoter activity (Fig. 12, rightmost bar). ).
FIG. 13 summarizes the above control mechanism. Increasing the production efficiency of β-cells that produce insulin increases the degree of insulin production, which helps improve the pathology of diabetes. It is Wnt3 that enhances β-cell neogenesis in adults, and the important gene activated by Wnt is NeuroD1 that increases this efficiency. It was found that the substance that inhibits insulin production in this essential regulatory mechanism is IGFBP-4 produced by pancreatic α cells. In addition, a comparison between healthy and diabetic animals also revealed that IGFBP-4 concentration was high in the pancreas of diabetic animals. Reporter analysis that measures the function of Wnt3A revealed that IGFBP-4 had an adverse effect by inhibiting the action of Wnt3.
Claims (11)
（１）レポーター遺伝子を、Wnt3aが活性化することのできるプロモーターに繋いで導入した細胞を用意し、
（２）あらかじめ（１）の細胞培地中に、Wnt3a単独で添加した場合、及びWnt3aと共にIGFBP-4を添加した場合のレポーター活性を測定しておき、
（３）（１）の細胞培地中に、Wnt3a及びIGFBP-4と共に被検物質を添加して、レポーター活性を測定し、
（４）（３）で得られた測定値が、（２）で測定した、Wnt3a及びIGFBP-4を添加した場合の測定値よりも、Wnt3a単独で添加した場合の測定値に近い数値を示す物質を、IGFBP-4インヒビター候補物質と判定する。 A method for screening an IGFBP-4 inhibitor having an action of enhancing insulin production from pancreatic β cells, comprising the following (1) to (4);
(1) Prepare a cell into which a reporter gene has been introduced by linking to a promoter that can be activated by Wnt3a.
(2) The reporter activity is measured in advance when Wnt3a alone is added to the cell culture medium of (1) and when IGFBP-4 is added together with Wnt3a.
(3) In the cell culture medium of (1), a test substance is added together with Wnt3a and IGFBP-4, and the reporter activity is measured.
(4) The measured value obtained in (3) is closer to the measured value in the case of adding Wnt3a alone than the measured value in the case of adding Wnt3a and IGFBP-4 measured in (2). The substance is determined as an IGFBP-4 inhibitor candidate substance.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009073874A JP5246870B2 (en) | 2009-03-25 | 2009-03-25 | Insulin production enhancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009073874A JP5246870B2 (en) | 2009-03-25 | 2009-03-25 | Insulin production enhancer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010222330A true JP2010222330A (en) | 2010-10-07 |
| JP5246870B2 JP5246870B2 (en) | 2013-07-24 |
Family
ID=43039910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009073874A Expired - Fee Related JP5246870B2 (en) | 2009-03-25 | 2009-03-25 | Insulin production enhancer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5246870B2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016135702A1 (en) * | 2015-02-26 | 2016-09-01 | Instytut Biologii Doświadczalnej Im. M. Nenckiego, Polskiej Akademii Nauk | A method for the early diagnosis of a pre-diabetic state and type 2 |
| JP2017516457A (en) * | 2014-03-26 | 2017-06-22 | ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） | Flattop (Fltp) is a novel biomarker for beta cell maturation |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003523323A (en) * | 1999-12-06 | 2003-08-05 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Pancreatic stem cells and their use in transplantation |
-
2009
- 2009-03-25 JP JP2009073874A patent/JP5246870B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003523323A (en) * | 1999-12-06 | 2003-08-05 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション | Pancreatic stem cells and their use in transplantation |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JPN6012062437; ＲＵＬＩＦＳＯＮ，Ｉ．Ｃ． ｅｔ ａｌ: 'Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ' Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｖｏｌ．１０４， Ｎｏ．１５, 2007, ｐ．６２４７-６２５２ * |
| JPN6012062438; ＦＵＪＩＮＯ，Ｔ． ｅｔ ａｌ: 'Ｌｏｗ-ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ-ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５ （ＬＲＰ５） ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍｅｔａｂｏ' Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ Ｖｏｌ．１００， Ｎｏ．１, 2003, ｐ．２２９-２３４ * |
| JPN6012062439; Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．４５４, 2008, ｐ．３４５-３５０ * |
| JPN6012062440; ＭＡＳＳＡ，Ｌ． ｅｔ ａｌ: 'Ｉｎｓｕｌｉｎ-ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ-ｈａｍｓｔｅｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔｓ： ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏ' Ｄｉａｂｅｔｅｓ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｖｏｌ．２３， Ｎｏ．５, 1997, ｐ．４１７-４２３ * |
| JPN6012062442; ＮＩＮＧ，Ｙ． ｅｔ ａｌ: 'Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ' Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２０， Ｎｏ．９, 2006, ｐ．２１７３-２１８６ * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017516457A (en) * | 2014-03-26 | 2017-06-22 | ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ Ｍｕｅｎｃｈｅｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） | Flattop (Fltp) is a novel biomarker for beta cell maturation |
| US10520494B2 (en) | 2014-03-26 | 2019-12-31 | Helmholtz Zentrum München-Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Flattop (FLTP) is a novel biomarker for beta cell maturation |
| US11733236B2 (en) | 2014-03-26 | 2023-08-22 | Helmholtz Zentrum München—Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Flattop (fltp) is a novel biomarker for beta cell maturation |
| WO2016135702A1 (en) * | 2015-02-26 | 2016-09-01 | Instytut Biologii Doświadczalnej Im. M. Nenckiego, Polskiej Akademii Nauk | A method for the early diagnosis of a pre-diabetic state and type 2 |
| US10222384B2 (en) | 2015-02-26 | 2019-03-05 | Instytut Biologii Doswiadczalnej Im. M. Nenckiego, Polskiej Akademii Nauk | Method for the early diagnosis of a pre-diabetic state and type 2 diabetes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5246870B2 (en) | 2013-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Agrawal et al. | The Drosophila TNF Eiger is an adipokine that acts on insulin-producing cells to mediate nutrient response | |
| Aguayo-Mazzucato et al. | Mafa expression enhances glucose-responsive insulin secretion in neonatal rat beta cells | |
| JP6680759B2 (en) | Medical use of artemisinin compounds and gephyrin agonists | |
| US20160067212A1 (en) | Use of insulin signaling antagonists, optionally in combination of transfection of non-beta cells, for inducing insulin production | |
| Yang et al. | Knock-down of apoptosis inducing factor gene protects endoplasmic reticulum stress-mediated goat granulosa cell apoptosis | |
| Yuan et al. | Calcium‑sensing receptor promotes high glucose‑induced myocardial fibrosis via upregulation of the TGF‑β1/Smads pathway in cardiac fibroblasts | |
| Reid et al. | Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation | |
| US20170157110A1 (en) | Methods for inducing insulin production and uses thereof | |
| Malenczyk et al. | Secretagogin protects Pdx1 from proteasomal degradation to control a transcriptional program required for β cell specification | |
| Liang et al. | HIF-1α/FOXO1 axis regulated autophagy is protective for β cell survival under hypoxia in human islets | |
| JP5246870B2 (en) | Insulin production enhancer | |
| Ren et al. | Autophagy stimulated proliferation of porcine PSCs might be regulated by the canonical Wnt signaling pathway | |
| US20140030234A1 (en) | Methods and compositions for modulating islet beta cell development | |
| Zhang et al. | Uncoupling protein 2 negatively regulates glucose-induced glucagon-like peptide 1 secretion | |
| EP3896080A1 (en) | Novel igfr-like receptor and uses thereof | |
| EP2619330B1 (en) | Method for identifying compounds to increase the expression or activity of aspartyl aminopeptidase | |
| Yang et al. | ATP6V1H deficiency impairs glucose tolerance by augmenting endoplasmic reticulum stress in high fat diet fed mice | |
| WO2013049375A2 (en) | Methods and compositions for modulating beta cell proliferation | |
| Liu et al. | The metalloproteinase Papp-aa functions as a molecular switch linking IGF signaling to adaptive epithelial growth | |
| Far | Physiological and biochemical characterization of a novel insulin-inhibitory receptor in pancreatic β-cells | |
| Fathi Far | Physiological and biochemical characterization of a novel insulin-inhibitory receptor in pancreatic β-cells | |
| Lu et al. | Sorting nexin 3 induces myocardial injury via promoting retromer-dependent nuclear trafficking of STAT3 | |
| Xu et al. | Bone controls browning of white adipose tissue and protects from diet-induced obesity through Schnurri-3-regulated SLIT2 secretion | |
| Mochizuki et al. | Rat β-Cells Lose Their Proliferative Ability After Birth Through P53 Upregulation | |
| Liu et al. | Insulin-like growth factor-1 protects ischemic myocardial cells via PI3K/AKT pathway |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110124 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121204 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130131 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130402 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130405 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5246870 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160419 Year of fee payment: 3 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |