JP2010183974A - Secretory cell embedding cell sheet, and method of manufacturing cell sheet - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は分泌細胞異常の症状の治療に用いることのできる細胞シートと該細胞シートの作製方法に関する。 The present invention relates to a cell sheet that can be used for the treatment of symptoms of secretory cell abnormality and a method for producing the cell sheet.
我が国における糖尿病の患者数は推定約７００万人であり、境界型糖尿病を含めると１４００万人にものぼるといわれている。糖尿病は、血糖値を下げる唯一のホルモンであるインスリンの産生能力の低下もしくは欠如または、細胞のインスリン感受性の低下が原因で引き起こされる病気で、糖尿病性昏睡のような急性の合併症や糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症等の慢性の合併症を引き起こす。 The number of diabetes patients in Japan is estimated to be about 7 million, and it is said that when borderline diabetes is included, it reaches 14 million. Diabetes is a disease caused by reduced or lack of ability to produce insulin, which is the only hormone that lowers blood glucose levels, or decreased insulin sensitivity of cells. Causes chronic complications such as diabetes and diabetic nephropathy.
糖尿病が引き起こされるメカニズムとして「インスリン依存型糖尿病」(１型)と「インスリン非依存型糖尿病」(２型)に分類されるが、現在のところ共にインスリン注射により血糖値を下げるという治療法が取られることが多い。しかし、インスリン注射では一時的に血糖値を下げることはできるが、糖尿病を完治させることはできない。 The mechanisms that cause diabetes are classified into “insulin-dependent diabetes” (type 1) and “non-insulin-dependent diabetes” (type 2). At present, there are treatments that lower blood glucose levels by insulin injection. It is often done. However, insulin injection can temporarily lower the blood glucose level but cannot completely cure diabetes.
糖尿病患者のインスリン注射に代わる治療方法として、膵臓移植があるが、患者に適合する臓器が不足しているのが現状である。また、膵臓移植を行うことができたとしても、拒絶反応を抑制するため、生涯免疫抑制剤を服用することが必要となり患者にかかる負担は甚大である。 Pancreatic transplantation is an alternative treatment method for insulin injection in diabetic patients, but the current situation is that there are insufficient organs suitable for the patient. Even if pancreas transplantation can be performed, in order to suppress rejection, it is necessary to take a life-long immunosuppressant, and the burden on the patient is enormous.
また、インスリンを分泌するβ細胞を有する膵島を膵臓から分離する技術が進歩したことにより、膵島のみを移植する治療法も試みられている。しかし、膵臓移植と同じく患者に適合する膵島が不足しておりまた、膵島移植を行うことができたとしても、移植した膵島の拒絶反応を抑制するため、生涯免疫抑制剤の服用が必要である。 In addition, as a technique for separating islets having β-cells that secrete insulin from the pancreas has advanced, treatment methods for transplanting only islets have also been attempted. However, as is the case with pancreas transplantation, there is a lack of islets that fit the patient, and even if it is possible to perform islet transplantation, it is necessary to take a lifelong immunosuppressant to suppress rejection of the transplanted islet. .
このような現状に鑑み、膵島移植の拒絶反応の問題を解決するため、特定の物質で膵島コーティングする技術の構築が試みられてきた。膵島をコーティングすることにより拒絶反応が引き起こされなければ、患者に適合しない膵島も移植することが可能になり、膵島が不足する問題も解決される。 In view of such a current situation, in order to solve the problem of rejection of islet transplantation, an attempt has been made to construct a technique for coating islets with a specific substance. If rejection is not caused by coating the islets, it is possible to transplant islets that are not compatible with the patient, and the problem of lack of islets is solved.
コーティングされた膵島が臨床的に有効なものであるためには、コーティングする物質が（１）非抗原性であり且つ無毒であること（２）細胞に必要な栄養素、インスリン分泌を刺激する物質及びインスリン等を透過し、且つ抗体を透過させない選択的透過性を有すること、（３）移植後長期間膵島の活性を維持させることができること（４）移植に適するようにコーティングされた膵島の形状、大きさ（特に分泌細胞をコーティングするコーティング材料自体の厚み）を調整することができること等が要求される。 In order for the coated islets to be clinically effective, the substance to be coated must be (1) non-antigenic and non-toxic (2) nutrients necessary for the cells, substances that stimulate insulin secretion and (3) the ability to maintain the islet activity for a long period after transplantation; (4) the shape of the islet coated so as to be suitable for transplantation; It is required that the size (particularly the thickness of the coating material itself for coating the secretory cells) can be adjusted.
これまでに、アルギン酸塩で膵島をコーティングして得られたカプセル化膵島が作製されている。しかし、純粋なアルギン酸塩を得ることが困難であることから、アルギン酸塩に含まれる不純物に対して拒絶反応を引き起こすことがあり上記要件（１）を満たさず、また、膵島の表面を均一にコーティングすることが困難であるため、物質の選択的透過性を示さず要件（２）を満たさない。更にアルギン酸塩は水溶性であり体内で溶解してしまうため、長期に膵島の活性を維持できず要件（３）も満たさない。また、膵島が直接アルギン酸塩でコーティングされていることも、長期に膵島の活性を維持できない（要件（３）を満たさない）要因となる。加えて、コーティングされた膵島の形状、大きさを調整することも困難であり要件（４）も満たさない。 So far, encapsulated islets obtained by coating islets with alginate have been produced. However, since it is difficult to obtain pure alginate, it may cause rejection of impurities contained in alginate, which does not satisfy the above requirement (1), and the islet surface is uniformly coated. Since it is difficult to do so, it does not show the selective permeability of the substance and does not satisfy the requirement (2). Furthermore, since alginate is water-soluble and dissolves in the body, the activity of the islets cannot be maintained for a long time and the requirement (3) is not satisfied. In addition, the fact that the islets are directly coated with alginate is also a factor that the activity of the islets cannot be maintained for a long time (the requirement (3) is not satisfied). In addition, it is difficult to adjust the shape and size of the coated islets and the requirement (4) is not satisfied.
また、アガロースとコラーゲンで膵島をコーティングして得られたカプセル化膵島も作製されている（特許文献１）。しかし、当該カプセル化膵島は、膵島を懸濁したアガロースとコラーゲン溶液をミネラルオイル等に滴下して作製されるため、カプセル化膵島の形状、大きさを精密に調整できず要件（４）を満たさない。また、アガロースとコラーゲンは水溶性であり且つ、膵島が直接コーティングされているため、長期に膵島の活性を維持できず要件（３）を満たさない。加えて、膵島を含まない空のカプセルも多くできる可能性がある。 In addition, an encapsulated islet obtained by coating the islet with agarose and collagen has also been produced (Patent Document 1). However, since the encapsulated islets are produced by dripping agarose and collagen solution in which the islets are suspended in mineral oil or the like, the shape and size of the encapsulated islets cannot be precisely adjusted and the requirement (4) is satisfied. Absent. Moreover, since agarose and collagen are water-soluble and the islets are directly coated, the activity of the islets cannot be maintained for a long time and the requirement (3) is not satisfied. In addition, there may be many empty capsules that do not contain islets.
更に、光重合性の化合物でコーティングしたカプセル化細胞も作製されている（特許文献２）。しかし、膵島の表面を均一にコーティングすることが困難であるため、物質の選択的透過性を示さず要件（２）を満たさない。また、当該カプセル化細胞は膵島が直接光重合性の化合物にコーティングされているため、長期に膵島の活性を維持できず要件（３）を満たさない。加えてカプセル化細胞の形状、大きさを調整することは困難であり、要件（４）を満たさない。 Furthermore, an encapsulated cell coated with a photopolymerizable compound has also been produced (Patent Document 2). However, since it is difficult to uniformly coat the surface of the islet, the selective permeability of the substance is not exhibited and the requirement (2) is not satisfied. In addition, since the islets are directly coated with a photopolymerizable compound, the encapsulated cells cannot maintain the activity of the islets for a long time and do not satisfy the requirement (3). In addition, it is difficult to adjust the shape and size of the encapsulated cells, and the requirement (4) is not satisfied.
上記のように移植後の拒絶反応を避けるため、様々な物質によってコーティングされた膵島が種々提案されているが、いずれも（１）〜（４）の全ての要件を備えておらず、臨床において有用なコーティングされた膵島とその作製方法の樹立が望まれている。
また、膵島以外の他の分泌細胞においても同様の問題があり、解決が望まれている。
In order to avoid rejection after transplantation as described above, various islets coated with various substances have been proposed, but none of them satisfy all the requirements (1) to (4), It would be desirable to establish useful coated islets and methods for making them.
In addition, there are similar problems in secretory cells other than islets, and a solution is desired.
本発明は上記観点からなされたものであり、非抗原性で無毒であり、選択的透過性を有し、分泌細胞の活性を長期間維持することができ、さらに形状、大きさ等を精密に調整できる細胞シートとその作製方法を提供することを課題とする。 The present invention has been made from the above viewpoint, is non-antigenic and non-toxic, has selective permeability, can maintain secretory cell activity for a long period of time, and has a precise shape, size, etc. It is an object to provide a cell sheet that can be adjusted and a method for manufacturing the cell sheet.
請求項１に係る発明は、生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体、光重合性化合物、及び光重合開始剤を含有する光重合性組成物が光重合されてなり、分泌細胞を内部に含む液相が包埋された細胞シートに関する。 The invention according to claim 1 is a secretory cell obtained by photopolymerizing a photopolymerizable composition containing a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer, a photopolymerizable compound, and a photopolymerization initiator. The present invention relates to a cell sheet in which a liquid phase containing is embedded.
請求項２に係る発明は、前記疎水性（メタ）アクリレート共重合体が、前記液相との混合により、前記液相の周囲に界面を形成する性質を有する共重合体であることを特徴とする請求項1に記載の細胞シートに関する。
The invention according to
請求項３に係る発明は、前記疎水性（メタ）アクリレート共重合体がアルキル（メタ）アクリレート単位及びメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート単位を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞シートに関する。 The invention according to claim 3 is characterized in that the hydrophobic (meth) acrylate copolymer has an alkyl (meth) acrylate unit and a methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate unit. Regarding the sheet.
請求項４に係る発明は、前記光重合性化合物が、少なくとも一つの不飽和二重結合を持つ光重合性モノマーであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の細胞シートに関する。 The invention according to claim 4 relates to the cell sheet according to any one of claims 1 to 3, wherein the photopolymerizable compound is a photopolymerizable monomer having at least one unsaturated double bond. .
請求項５に記載の発明は、前記分泌細胞が、膵島である請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞シートに関する。 The invention according to claim 5 relates to the cell sheet according to any one of claims 1 to 4, wherein the secretory cell is an islet.
請求項６に係る発明は、前記膵島が、ヒト膵島である請求項５に記載の細胞シートに関する。 The invention according to claim 6 relates to the cell sheet according to claim 5, wherein the islet is a human islet.
請求項７に係る発明は、以下の（a）〜(c)を順に行うことを特徴とする細胞シートの作製方法に関する。
(a) 生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体、光重合性化合物及び光重合開始剤からなる光重合性組成物に、分泌細胞を内部に含む液相を分散させる工程
(b) 前記液相を分散した液を用いて膜を形成する工程
(c) 前記膜に光を照射し重合させる工程
The invention according to claim 7 relates to a method for producing a cell sheet, characterized by sequentially performing the following (a) to (c).
(a) A step of dispersing a liquid phase containing secretory cells in a photopolymerizable composition comprising a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer, a photopolymerizable compound, and a photopolymerization initiator.
(b) forming a film using a liquid in which the liquid phase is dispersed
(c) irradiating the film with light to polymerize
請求項８に係る発明は、前記（ｂ）の工程が以下の(１)〜（２）を順に行うことを特徴とする請求項７に記載の細胞シートの作製方法に関する。
（１）基盤の上に二本の細線状の物質を一定の間隔を有して配置し、該細線状物質の間に前記液相を分散した液を滴下する工程
（２)前記二本の細線状物質の間隔を広げるように前記細線状物質をスライドさせることにより、二本の細線状物質の間に膜を形成する工程
The invention according to claim 8 relates to the method for producing a cell sheet according to claim 7, wherein the step (b) performs the following steps (1) to (2) in order.
(1) A step of placing two fine wire substances on a substrate with a predetermined interval and dropping a liquid in which the liquid phase is dispersed between the fine wire substances (2) A step of forming a film between two thin linear substances by sliding the fine linear substances so as to widen the interval between the fine linear substances.
請求項９に係る発明は、前記細線状物質への前記光重合性組成物の濡れ性が良好で且つ、５ｍｍ以下の線径を有することを特徴とする請求項８に記載の細胞シートの作製方法に関する。 The invention according to claim 9 is the preparation of the cell sheet according to claim 8, wherein the photopolymerizable composition has good wettability to the fine linear substance and has a wire diameter of 5 mm or less. Regarding the method.
請求項１０に係る発明は、前記（メタ）アクリレート共重合体がアルキル（メタ）アクリレート単位及びメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート単位を有することを特徴とする共重合体である請求項７乃至９のいずれかに記載の細胞シートの作製方法に関する。 The invention according to claim 10 is the copolymer according to claim 7, wherein the (meth) acrylate copolymer has an alkyl (meth) acrylate unit and a methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate unit. The present invention relates to a method for producing a cell sheet according to any one of the above.
請求項１に係る発明によれば、分泌細胞を包埋(コーティング)する物質が生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体を有する光重合性組成物であるため、非抗原性で無毒であり、選択的透過性を有する。また、該光重合性組成物は水に不溶であるため、体内で溶解せずに長期間存在するので、分泌細胞の活性を長期に維持することができる。
更に、分泌細胞を含んだ液相をシートに包埋するため、分泌細胞を自然な状態のまま保持できる。このことも、分泌細胞の活性を長期に維持する要因となる。
また、該光重合性組成物は（メタ）アクリレート共重合体に加えて、光重合性化合物と光重合開始剤を有するため、光を照射し重合させることで細胞シートの形状・大きさを決定することができ、細胞シートの形状、大きさを精密に調整できる。
According to the invention of claim 1, since the substance that embeds (coats) secretory cells is a photopolymerizable composition having a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer, it is non-antigenic. It is non-toxic and has selective permeability. In addition, since the photopolymerizable composition is insoluble in water, it exists for a long period of time without dissolving in the body, so that the activity of secretory cells can be maintained for a long period of time.
Furthermore, since the liquid phase containing secretory cells is embedded in the sheet, the secretory cells can be maintained in a natural state. This is also a factor for maintaining the activity of secretory cells for a long time.
In addition to the (meth) acrylate copolymer, the photopolymerizable composition has a photopolymerizable compound and a photopolymerization initiator, so the shape and size of the cell sheet are determined by irradiating with light and polymerizing. The shape and size of the cell sheet can be precisely adjusted.
請求項２に係る発明によれば、疎水性（メタ）アクリレート共重合体が、分泌細胞を内部に含む液相と混合させることによって、分泌細胞を多数含む液相の周囲に界面を形成し、Ｗ/Ｏエマルションを形成するため、確実に分泌細胞を内部に含む液相を細胞シートに包埋することができる。
According to the invention of
請求項３に係る発明によれば、（メタ）アクリレート共重合体がアルキル（メタ）アクリレート単位及びメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート単位を有するため、特に生体適合性に優れ、非抗原性で無毒であり、また、選択的透過性にも優れているため、より安全に移植に用いることができる。更に水に不溶であるため、移植後も分泌細胞の活性を長期に渡って維持することができる。 According to the invention of claim 3, since the (meth) acrylate copolymer has an alkyl (meth) acrylate unit and a methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate unit, it is particularly excellent in biocompatibility, non-antigenic and non-toxic. In addition, since it has excellent selective permeability, it can be used for transplantation more safely. Furthermore, since it is insoluble in water, the activity of secretory cells can be maintained for a long time after transplantation.
請求項４に係る発明によれば、前記光重合性化合物が、少なくとも一つの不飽和二重結合を持つ重合性モノマーであることにより、光重合を好適に行うことができる。 According to the invention which concerns on Claim 4, when the said photopolymerizable compound is a polymerizable monomer which has an at least 1 unsaturated double bond, photopolymerization can be performed suitably.
請求項５に係る発明によれば、分泌細胞が膵島であることにより、糖尿病患者に拒絶反応を引き起こすことなく膵島を移植することができるようになり、長期に渡ってインスリンを体内で供給することができる。 According to the invention according to claim 5, since the secretory cell is an islet, the islet can be transplanted without causing rejection in a diabetic patient, and insulin is supplied in the body for a long period of time. Can do.
請求項６に係る発明によれば、膵島がヒト膵島であることにより、糖尿病患者に拒絶反応を引き起こすことなくヒト膵島を移植することができるようになり、動物インスリンに比べて、抗体を作りにくい安全なヒトインスリンを長期に渡って体内で供給できる。 According to the invention according to claim 6, since the islet is a human islet, it becomes possible to transplant the human islet without causing rejection in a diabetic patient, and it is difficult to produce an antibody compared to animal insulin. Safe human insulin can be supplied in the body for a long time.
請求項７に係る発明によれば、生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体、光重合性化合物及び、光重合開始剤を含有する光重合性組成物を光重合させてシートを得るため、大きさ、形状を精密に調整することができ且つ、分泌細胞を内部に含む液相を包埋した細胞シートを作製することができる。 According to the invention according to claim 7, a sheet is obtained by photopolymerizing a photopolymerizable composition containing a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer, a photopolymerizable compound, and a photopolymerization initiator. Therefore, the size and shape can be adjusted precisely, and a cell sheet in which a liquid phase containing secretory cells is embedded can be produced.
請求項８に係る発明によれば、細線状の物質をスライドさせる距離や方向により、細胞シートの形状、大きさを精密に調整することができる。 According to the invention which concerns on Claim 8, the shape and magnitude | size of a cell sheet can be precisely adjusted with the distance and direction which slide a thin wire | line-like substance.
請求項９に係る発明によれば、光重合性組成物との濡れ性が良好で且つ、５ｍｍ以下の線径を有する細線状物質を用いることによって、薄い細胞シートを作製することができる。 According to the invention which concerns on Claim 9, a thin cell sheet | seat can be produced by using the fine linear substance which has good wettability with a photopolymerizable composition and has a wire diameter of 5 mm or less.
請求項１０に係る発明によれば、アルキル（メタ）アクリレート単位及びメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート単位を有することにより、特に生体適合性に優れ、非抗原性で無毒であり、また、選択的透過性にも優れているため、より安全に移植に用いることができる細胞シートを作製することができる。加えて、水に不溶であるため、移植後も分泌細胞の活性を長期に渡って維持することができる。 According to the invention of claim 10, by having an alkyl (meth) acrylate unit and a methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate unit, it is particularly excellent in biocompatibility, non-antigenic and non-toxic, and selectively permeable. Therefore, a cell sheet that can be used for transplantation more safely can be produced. In addition, since it is insoluble in water, the activity of secretory cells can be maintained for a long time after transplantation.
以下、本発明に係る細胞シートについて詳細に説明する。
本発明に係る細胞シートは、生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体を有する光重合性組成物からなり、分泌細胞を内部に含む液相（例えば培養液）を包埋することで、液相ごと分泌細胞をコーティングした細胞シートである。
本発明の細胞シートは、人体に移植することにより分泌細胞異常の病気の治療に用いることができる。
以下、本発明に係る細胞シートを構成する光重合性組成物、分泌細胞について夫々説明する。
Hereinafter, the cell sheet according to the present invention will be described in detail.
The cell sheet according to the present invention comprises a photopolymerizable composition having a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer, and embeds a liquid phase (for example, a culture solution) containing secretory cells therein. In the cell sheet, the secretory cells are coated together with the liquid phase.
The cell sheet of the present invention can be used for treatment of diseases of abnormal secretory cells by transplanting it into the human body.
Hereinafter, the photopolymerizable composition and secretory cells constituting the cell sheet according to the present invention will be described.
（光重合性組成物）
本発明に用いる光重合性組成物は光の照射で重合し、生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体を有するものである。該光重合性組成物は、生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体を含むので、非抗原性で無毒であり、選択的透過性を有する。従って、安全に生体内への移植に用いることができる。更に、水に不溶であるため、生体内で溶解せずに長期に渡って維持される。加えて光重合させたシートの形状、大きさを精密に調整することができるため、移植する場所等に応じて形を変化させることができる。故に分泌細胞を内部に含む液相を包埋する物質としては優れた特性を有しており、また拒絶反応を引き起こさず安全に移植に用いることができる。
(Photopolymerizable composition)
The photopolymerizable composition used in the present invention is polymerized by irradiation with light, and has a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer. Since the photopolymerizable composition includes a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer, it is non-antigenic, non-toxic, and has selective permeability. Therefore, it can be safely used for transplantation into a living body. Furthermore, since it is insoluble in water, it is maintained for a long period of time without dissolving in vivo. In addition, since the shape and size of the photopolymerized sheet can be precisely adjusted, the shape can be changed according to the place to be transplanted. Therefore, it has excellent characteristics as a substance embedding a liquid phase containing secretory cells, and can be safely used for transplantation without causing rejection.
（疎水性（メタ）アクリレート共重合体）
本発明に用いる疎水性（メタ）アクリレート共重合体は生体適合性を有するものであれば特に限定されず、分泌細胞を内部に含む液相との混合により、分泌細胞を内部に含む液相の周囲に界面を形成して、 W/Oエマルションを形成するものであればよい。確実に分泌細胞を内部に含む液相を細胞シートに包埋することができるからである。
疎水性（メタ）アクリレート共重合体としては、例えば下記一般式１（化１)で示されるアルキル（メタ）アクリレート、下記一般式２（化２）で示されるシリコーン(メタ)アクリレート、下記一般式３（化３）メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
(Hydrophobic (meth) acrylate copolymer)
The hydrophobic (meth) acrylate copolymer used in the present invention is not particularly limited as long as it has biocompatibility. By mixing with a liquid phase containing secretory cells, a liquid phase containing secretory cells inside is used. Any material can be used as long as it forms an interface around it and forms a W / O emulsion. This is because the liquid phase containing secretory cells can be surely embedded in the cell sheet.
Examples of the hydrophobic (meth) acrylate copolymer include an alkyl (meth) acrylate represented by the following general formula 1 (chemical formula 1), a silicone (meth) acrylate represented by the following general formula 2 (chemical formula 2), and the following general formula. 3 (chemical formula 3) methoxypolyethyleneglycol (meth) acrylate and the like.
また、生体適合性のある疎水性の（メタ）アクリレート共重合体を軸としたポリロタキサンを用いてもよい。強靭性や伸長性に優れているためである。
軸となる（メタ）アクリレート共重合体はアルキル（メタ）アクリレート単位及びメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート単位を有する共重合体が好ましい。疎水性・生体適合性の観点でより優れているからである。
尚、ポリエチレンジアクリレートを軸としたポリロタキサンの場合は、ポリエチレンジアクリレートを架橋するためのリングやストッパーも生体適合性のある物質であることが好ましく、例えば、リングはシクロデキストリンが好ましく、ストッパーはアダマンタンが好ましい。また、リングのシクロデキストリンは、光架橋反応により結合し、材料が該光架橋反応により生じる結合基を有する必要がある。感光性基は、シンナモイル基、シンナミリデン基、カルコン残基、イソクマリン残基、２，５−ジメトキシスチルベン残基、チミン残基、スチルピリジニウム残基、α−フェニルマレイミド残基、アントラセン残基及び２−ピロン残基からなる群から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。（ＷＯ2006/088200参照）
A polyrotaxane having a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer as an axis may also be used. It is because it is excellent in toughness and extensibility.
The (meth) acrylate copolymer to be the axis is preferably a copolymer having an alkyl (meth) acrylate unit and a methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate unit. This is because it is superior in terms of hydrophobicity and biocompatibility.
In the case of a polyrotaxane having polyethylene diacrylate as a shaft, it is preferable that a ring and a stopper for crosslinking polyethylene diacrylate are also biocompatible materials. For example, the ring is preferably a cyclodextrin and the stopper is an adamantane. Is preferred. Further, the cyclodextrin of the ring must be bonded by a photocrosslinking reaction, and the material must have a bonding group generated by the photocrosslinking reaction. Photosensitive groups include cinnamoyl group, cinnamylidene group, chalcone residue, isocoumarin residue, 2,5-dimethoxystilbene residue, thymine residue, stilpyridinium residue, α-phenylmaleimide residue, anthracene residue and 2- It is preferably at least one selected from the group consisting of pyrone residues. (Refer to WO2006 / 088200)
（光重合性化合物）
本発明の光重合性化合物は、少なくとも一つの不飽和二重結合を有する(メタ)アクリレートモノマーである。光重合を好適に行うことができるからである。例えば１,６−ヘキサンジオールジメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート等が挙げられる。また芳香環を含む(メタ)アクリレートモノマーを使用することが好ましい。芳香環を含む（メタ）アクリレートを使用することにより、強伸度や耐久性の向上が実現されるからである。
(Photopolymerizable compound)
The photopolymerizable compound of the present invention is a (meth) acrylate monomer having at least one unsaturated double bond. It is because photopolymerization can be performed suitably. Examples thereof include 1,6-hexanediol dimethacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, and the like. It is also preferable to use a (meth) acrylate monomer containing an aromatic ring. This is because the use of (meth) acrylate containing an aromatic ring realizes improvement in strength and durability.
（光重合開始剤）
本発明に用いる光重合開始剤は、光重合性組成物の光重合を開始する目的で使用されるものである。光重合開始剤を有することにより、光重合性組成物を光で重合させ、細胞シートの形状、大きさを調整することができる。
光重合開始剤としては、光によって重合性の炭素−炭素不飽和基を重合させることができるものであれば良い。中でも、光吸収によって、自己分解や水素の引き抜きによってラジカルを生成する機能を有するものが好ましい。例えば、ベンゾインアルキルエーテル類、ベンゾフェノン類、アントラキノン類、ベンジル類、アセトフェノン類、ジアセチル類、アルキルフェノン類等が挙げられる。
(Photopolymerization initiator)
The photopolymerization initiator used in the present invention is used for the purpose of initiating photopolymerization of the photopolymerizable composition. By having a photopolymerization initiator, the photopolymerizable composition can be polymerized with light to adjust the shape and size of the cell sheet.
Any photopolymerization initiator may be used as long as it can polymerize a polymerizable carbon-carbon unsaturated group by light. Especially, what has the function to produce | generate a radical by self-decomposition and extraction of hydrogen by light absorption is preferable. Examples include benzoin alkyl ethers, benzophenones, anthraquinones, benzyls, acetophenones, diacetyls, alkylphenones.
（分泌細胞）
本発明の細胞シートでは、分泌細胞を液相内に分散させ、液相ごと細胞シート内に包埋する。従って、分泌細胞を直接コーティングするのとは異なり、より自然な状態に分泌細胞を保つことができ、長期間細胞の活性を維持することができる。分泌細胞を分散させる液相は培養液が好ましい。
(Secretory cells)
In the cell sheet of the present invention, secretory cells are dispersed in the liquid phase, and the entire liquid phase is embedded in the cell sheet. Therefore, unlike direct coating of secretory cells, the secretory cells can be kept in a more natural state, and the activity of the cells can be maintained for a long time. The liquid phase for dispersing secretory cells is preferably a culture solution.
細胞シートに包埋される分泌細胞としては、分泌細胞が包埋される光重合性組成物を透過する物質を分泌する細胞であれば特に限定されないが、例えばインスリンを分泌するβ細胞や甲状腺ホルモンを分泌する甲状腺濾胞細胞等が挙げられる。
特に、分泌細胞が膵島である場合、糖尿病患者に有効である。
つまり、膵島を内部に含む液相を包埋した細胞シートを糖尿病患者に移植すると、血液中にインスリン分泌のための刺激物質が放出され、移植された細胞シートの表面から当該刺激物質が浸透し、細胞シート中の膵島がそれを感知して、インスリンを分泌する。そのため、糖尿病患者は体内でインスリンが供給されることになり、外部から注射によってインスリンを供給しなくても、血糖値を下げることができるようになるからである。
また、ヒト膵島を内部に含む液相を包埋した細胞シートを移植すればインスリンに対する抗体を形成しにくいヒトインスリンを長期に渡って供給することができる。
The secretory cell embedded in the cell sheet is not particularly limited as long as it is a cell that secretes a substance that permeates the photopolymerizable composition in which the secretory cell is embedded. For example, β cells and thyroid hormones that secrete insulin And the like.
In particular, when the secretory cell is an islet, it is effective for diabetic patients.
In other words, when a cell sheet embedded with a liquid phase containing islets is transplanted into a diabetic patient, a stimulating substance for insulin secretion is released into the blood, and the stimulating substance penetrates from the surface of the transplanted cell sheet. The islets in the cell sheet sense it and secrete insulin. Therefore, a diabetic patient is supplied with insulin in the body, and the blood sugar level can be lowered without supplying insulin by injection from the outside.
Moreover, if a cell sheet embedded with a liquid phase containing human pancreatic islets is transplanted, it is possible to supply human insulin that is difficult to form antibodies against insulin over a long period of time.
（細胞シートの作製方法）
以下、細胞シートの作製方法について説明する。
（分泌細胞の分離）
まず、本発明に係る細胞シートに包埋される分泌細胞の分離方法について説明する。
分泌細胞の分離方法は分泌細胞により異なり、分泌細胞に応じて一般的に用いられる方法を採用すればよい。例えば、膵島の場合はコラゲナーゼ消化法により膵臓より分離することができる。分離した膵島同士が接着している場合は、剥離するためトリプシン処理を行った後、１×１０５〜１×１０７ cells/mlになるように液相に分散させる。
(Method for producing cell sheet)
Hereinafter, a method for producing a cell sheet will be described.
(Separation of secretory cells)
First, a method for separating secretory cells embedded in the cell sheet according to the present invention will be described.
The method for separating the secretory cells differs depending on the secretory cells, and a method generally used according to the secretory cells may be adopted. For example, pancreatic islets can be separated from the pancreas by collagenase digestion. If the isolated islets are adhered, they are treated with trypsin to separate them, and then dispersed in a liquid phase so as to be 1 × 10 5 to 1 × 10 7 cells / ml.
（細胞シートの形成）
次いで、分泌細胞を用いて本発明の細胞シートを作製する方法について説明する。
本発明の細胞シートの作製は、まず（メタ）アクリレート共重合体、光重合性化合物及び光重合開始剤を混合し、混合した混合液(光重合性組成物)に、分泌細胞を内部に含む液相を分散させる。そして、分泌細胞を内部に含む液相が光重合性組成物中に分散するＷ/Ｏエマルションを形成させる。
(Formation of cell sheet)
Next, a method for producing the cell sheet of the present invention using secretory cells will be described.
In the production of the cell sheet of the present invention, a (meth) acrylate copolymer, a photopolymerizable compound and a photopolymerization initiator are first mixed, and a secreted cell is contained in the mixed liquid (photopolymerizable composition). Disperse the liquid phase. Then, a W / O emulsion in which a liquid phase containing secretory cells is dispersed in the photopolymerizable composition is formed.
Ｗ/Ｏエマルションを形成させた後、Ｗ/Ｏエマルションからなる膜を形成する。
膜を形成する方法としては、図１のように二本の細線状物質（１）（２）を用意し、光を透過する基盤上に細線状物質（１）を固定し、細線状物質（２）を細線状物質（１）と一定の間隔を有するように設置する。該細線状物質（１）（２）の間に前記Ｗ/Ｏエマルションを細線状物質(１)(２)の両方に接触するように滴下する。滴下する量は0.1ml〜10mlが好ましい。その後、二本の細線状物質の間隔が広がるように、基盤より斜め上方(図１の矢印(a)参照)もしくは基盤表面と平行に、細線状物質（２）をスライドさせて膜を形成する。
細線状物質は二本の細線状物質の間に光重合性組成物の膜を形成できるものであれば特に限定されないが、光重合性組成物と良い濡れ性を有し、線経は５mm以下が好ましい。薄い細胞シートを作製することができるからである。
膜の形状、大きさ(特に膜の厚み)は細線状物質を移動させる方向や距離により調整することができる。また、細線状物質を二本とも固定せず、二本の細線状物質の間隔が広がるようにスライドさせて膜を形成することもできる。
そして、前記細線状物質（１）（２）間の薄い膜の全体に光を照射して光重合性組成物を重合させる。図１は下から基盤を透過して光を照射しているが、他の方向から光を照射してもよい。
光を照射した部分のみ重合するので細胞シートの形状、大きさを調整することができる。
また、重合させる個所にだけ光を照射することもでき、例えば分泌細胞を内部に含む液相が存在する部分だけに光を照射すれば、当該液相のみをコーティングすることもできる。
光照射後、重合が完了するまで二酸化炭素インキュベーター中に放置する。これにより膵島を内部に含む液相が包埋された細胞シートを作製することができる。
After forming the W / O emulsion, a film made of the W / O emulsion is formed.
As a method for forming a film, two fine wire substances (1) and (2) are prepared as shown in FIG. 1, the fine wire substance (1) is fixed on a substrate that transmits light, and the fine wire substance ( 2) is installed so as to have a certain distance from the fine wire substance (1). The W / O emulsion is dropped between the fine linear substances (1) and (2) so as to come into contact with both of the fine linear substances (1) and (2). The amount to be dropped is preferably 0.1 ml to 10 ml. Thereafter, the thin linear substance (2) is slid to form a film obliquely above the base (see arrow (a) in FIG. 1) or parallel to the base surface so that the distance between the two thin linear substances is widened. .
The fine linear substance is not particularly limited as long as it can form a film of the photopolymerizable composition between the two fine linear substances. However, the fine linear substance has good wettability with the photopolymerizable composition, and the line diameter is 5 mm or less. Is preferred. This is because a thin cell sheet can be produced.
The shape and size of the membrane (especially the thickness of the membrane) can be adjusted by the direction and distance of movement of the fine linear substance. Moreover, it is also possible to form a film by not sliding both the thin linear substances and sliding them so that the distance between the two thin linear substances is widened.
Then, the entire thin film between the thin wire substances (1) and (2) is irradiated with light to polymerize the photopolymerizable composition. In FIG. 1, light is transmitted through the substrate from below, but light may be irradiated from other directions.
Since only the portion irradiated with light is polymerized, the shape and size of the cell sheet can be adjusted.
Moreover, light can be irradiated only to the part to superpose | polymerize, for example, if light is irradiated only to the part in which the liquid phase which contains a secretory cell exists, only the said liquid phase can also be coated.
After light irradiation, leave in a carbon dioxide incubator until polymerization is complete. This makes it possible to produce a cell sheet in which a liquid phase containing islets is embedded.
照射する光は可視または長波長の紫外線の形の放射線を利用する。光重合に使用し得る光線の波長は、光重合性の組成物の種類等に応じで異なるが、一般には２５０nm〜６００nmの範囲の光が使われる。光照射における光源は、たとえばLED照射器、あるいはハロゲンランプ、キセノンランプ、白熱ランプあるいは水銀ランプ、あるいはエキシマレーザー、アルゴンイオンレーザー等が挙げられる。
照射時間は光源の光の強さ、光源からの距離等に応じて変える必要があるが、0.1秒〜10秒の範囲内とすることができる。
The irradiation light uses radiation in the form of visible or long wavelength ultraviolet rays. The wavelength of light that can be used for photopolymerization varies depending on the type of the photopolymerizable composition and the like, but generally light in the range of 250 nm to 600 nm is used. Examples of the light source in the light irradiation include an LED irradiator, a halogen lamp, a xenon lamp, an incandescent lamp, a mercury lamp, an excimer laser, and an argon ion laser.
The irradiation time needs to be changed according to the light intensity of the light source, the distance from the light source, and the like, but can be within a range of 0.1 to 10 seconds.
以下、分泌細胞として膵島を用いた場合の実施例を示すことにより、本発明を更に具体的に説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically by showing examples in which islets are used as secretory cells, but the present invention is not limited to the following examples.
（光重合性組成物の調整）
平均分子量200のポリエチレングリコールとモノアクリレートとの共重合体であるポリエチレングリコールジアクリレート（アロニックスM）に対して光重合開始剤であるDAROCUR1173(チバケミカルズ株式会社)を３０ｗｔ％の割合で混合して光重合性組成物を得る。
(Preparation of photopolymerizable composition)
A photopolymerization initiator DAROCUR1173 (Ciba Chemicals Co., Ltd.) is mixed with polyethylene glycol diacrylate (Aronix M), which is a copolymer of polyethylene glycol and monoacrylate with an average molecular weight of 200, at a ratio of 30 wt%. A polymerizable composition is obtained.
（膵島の調整）
マウスの膵島（TGP52（DSファーマバイオメディカル））を0.1〜0.25％
トリプシンンで処理し、接着した膵島を剥離し、D-MEM培地、F-12培地、グルタミン酸、血清を含む培養液（液相）に分散させる。
(Adjustment of pancreatic islets)
0.1 to 0.25% of mouse islets (TGP52 (DS Pharma Biomedical))
After treatment with trypsin, the adhered islets are detached and dispersed in a culture solution (liquid phase) containing D-MEM medium, F-12 medium, glutamic acid, and serum.
（Ｗ/Ｏエマルションの形成）
上記光重合性組成物にマウスの膵島を内部に含む培養液を５：１の割合で分散させＷ/Ｏエマルションを形成させる。図２は光重合性組成物の中に膵島を内部に含む液相が分散してＷ/Ｏエマルションを形成している写真であり、（A）で示したものが分泌細胞を含有する培養液の液相の一つである。
(Formation of W / O emulsion)
A culture solution containing mouse pancreatic islets is dispersed in the photopolymerizable composition at a ratio of 5: 1 to form a W / O emulsion. FIG. 2 is a photograph in which a liquid phase containing pancreatic islets is dispersed in the photopolymerizable composition to form a W / O emulsion, and (A) shows a culture solution containing secretory cells. It is one of the liquid phases.
（細胞シートの形成）
図１で示すように、顕微鏡のステージ上にスライドグラスを設置する。二本のポリフッ化ビニリデン製の細線（１）、（２）（東レ BAWO）を用意して、１本（１）をスライドグラスに固定する。もう一本（２）は固定せず、固定した細線と一定の間隔を有して配置する。二本の細線（１）、（２）の間にＷ/Ｏエマルションを滴下する。
固定していない細線（２）を二本の細線の間隔を広げるように図１中の矢印(a)の方向へスライドさせて膜を形成する。前記スライド時に形状、大きさを調整する。
薄く引き延ばした膜の全体に紫外線ＬＥＤ照射装置にて365nmの紫外線を１秒間、４Wで照射する。
紫外線照射後、D-MEM培地、F-12培地、グルタミン酸、血清を含む培養液に浸したシートを二酸化炭素インキュベーター中で１０分間放置し、重合を完了させる（図３のBは作製された細胞シートを示している。）
(Formation of cell sheet)
As shown in FIG. 1, a slide glass is placed on a microscope stage. Two thin wires (1) and (2) (Toray BAWO) made of polyvinylidene fluoride are prepared, and one (1) is fixed to a slide glass. The other (2) is not fixed, and is arranged with a fixed distance from the fixed thin line. A W / O emulsion is dropped between the two thin wires (1) and (2).
A thin film (2) which is not fixed is slid in the direction of the arrow (a) in FIG. 1 so as to widen the distance between the two thin lines to form a film. The shape and size are adjusted during the slide.
The entire thinly stretched film is irradiated with ultraviolet light of 365 nm for 1 second at 4 W by an ultraviolet LED irradiation device.
After UV irradiation, the sheet immersed in a culture solution containing D-MEM medium, F-12 medium, glutamic acid, and serum is left in a carbon dioxide incubator for 10 minutes to complete the polymerization (B in FIG. 3 shows the prepared cells). (Shows the sheet.)
このような方法で細胞シートを作製することにより、非抗原性で無毒であり、選択的透過性を有し、水に不溶性で膵島を内部に含む培養液の液相を包埋する細胞シートが得られ、これを糖尿病患者の移植に用いると、拒絶反応が起こらず、長期に渡って膵島の活性を維持できるため、糖尿病の治療に有効であると同時に頻繁に移植を繰り返す必要がなくなり、患者の負担を軽減することができる。 By producing a cell sheet by such a method, a cell sheet that is non-antigenic, non-toxic, has selective permeability, is insoluble in water, and embeds the liquid phase of a culture solution containing islets inside. When this is used for transplantation of diabetic patients, rejection does not occur and the activity of the islets can be maintained over a long period of time, so that it is effective for the treatment of diabetes and at the same time it is not necessary to repeat transplantation frequently. Can be reduced.
Claims (10)
(a) 生体適合性のある疎水性（メタ）アクリレート共重合体、光重合性化合物及び光重合開始剤からなる光重合性組成物に、分泌細胞を内部に含む液相を分散させる工程
(b) 前記液相を分散した液を用いて膜を形成する工程
(c) 前記膜に光を照射し重合させる工程 A method for producing a cell sheet, comprising sequentially performing the following (a) to (c):
(a) A step of dispersing a liquid phase containing secretory cells in a photopolymerizable composition comprising a biocompatible hydrophobic (meth) acrylate copolymer, a photopolymerizable compound, and a photopolymerization initiator.
(b) forming a film using a liquid in which the liquid phase is dispersed
(c) irradiating the film with light to polymerize
（１）基盤の上に二本の細線状の物質を一定の間隔を有して配置し、該細線状物質の間に前記液相を分散した液を滴下する工程
（２)前記二本の細線状物質の間隔を広げるように前記細線状物質をスライドさせることにより、二本の細線状物質の間に膜を形成する工程 The method for producing a cell sheet according to claim 7, wherein the step (b) performs the following (1) to (2) in order.
(1) A step of placing two fine wire substances on a substrate with a predetermined interval and dropping a liquid in which the liquid phase is dispersed between the fine wire substances (2) A step of forming a film between two thin linear substances by sliding the fine linear substances so as to widen the interval between the fine linear substances.
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|---|---|---|---|---|
| WO2015159821A1 (en) * | 2014-04-18 | 2015-10-22 | 東京応化工業株式会社 | Photosensitive resin composition for forming cell culture substrate |
| JP5889283B2 (en) * | 2011-04-08 | 2016-03-22 | 株式会社大塚製薬工場 | Method for producing sheet islets |
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