JP2010180222A

JP2010180222A - Microfluidic protein crystallography

Info

Publication number: JP2010180222A
Application number: JP2010063373A
Authority: JP
Inventors: Carl L Hansen; エル．ハンセンカール; Emmanuel Skordalakes; スコーダレイクスエマニュエル; Morten Sommer; ソマーモーテン; James M Berger; エム．バーガージェームス; Stephen R Quake; アール．クエイクスティーブン
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; University of California
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; University of California
Priority date: 2002-10-04
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2010-08-19
Also published as: JP2009166041A

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To enable high throughput screening of protein crystallization using microfluidic structures. <P>SOLUTION: The present invention solves the problem by an integrated combinatoric mixing chip in one embodiment. The mixing chip allows for precise metering of reagents to rapidly create a large number of potential crystallization conditions, with possible crystal formations observed on chip. In an alternative embodiment, the microfluidic structures may be utilized to explore phase space conditions of a particular protein crystallizing agent combination, thereby identifying promising conditions and allowing for subsequent focused attempts to obtain crystal growth. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

（関連出願の引用）
本願は、米国非仮特許出願番号１０／１１７，９７８（２００２年４月５日出願）の一部継続出願であり、これは、米国仮特許出願番号６０／３２３，５２４（２００１年９月１７日出願）に基づく非仮特許出願であるとの優先権を主張し、また、米国非仮特許出願０９／８８７，９９７（２００１年６月２２日出願）の一部継続出願であり、この一部継続出願は、さらに、米国非仮特許出願０９／８２６，５８３（２００１年４月６日出願）の一部継続出願である。本特許出願はまた、米国非仮特許出願番号１０／２６５，４７３（２００２年１０月４日出願）の一部継続出願である。本出願は、米国仮出願番号６０／４４７，１５７号（２００３年２月１２日出願）、米国仮特許出願番号６０／４３３，１６０（２００２年１２月１３日出願）に基づく優先権をさらに主張する。これらの特許出願は、本明細書において、全ての目的にために参考として援用され得る。 (Citation of related application)
This application is a continuation-in-part of US Non-Provisional Patent Application No. 10 / 117,978 (filed April 5, 2002), which includes US Provisional Patent Application No. 60 / 323,524 (September 17, 2001). Claiming priority as a non-provisional patent application based on Japanese Patent Application No. 09 / 887,997 (filed on June 22, 2001). The part continuation application is further a continuation-in-part of US non-provisional patent application 09 / 826,583 (filed on April 6, 2001). This patent application is also a continuation-in-part of US non-provisional patent application No. 10 / 265,473 (filed Oct. 4, 2002). This application further claims priority based on US Provisional Application No. 60 / 447,157 (filed February 12, 2003), US Provisional Patent Application No. 60 / 433,160 (filed December 13, 2002). To do. These patent applications may be incorporated herein by reference for all purposes.

（アメリカ合衆国連邦支援による研究および開発の下でなされた発明に対する権利についての陳述）
本明細書中に記載された研究は、ＮＳＦ（チッププログラムにおけるｘｙｚ）；米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）助成金ＣＡ７７３７３；ＮＳＥＲＣ（ＪｕｌｉｅＰａｙｅｔｔｅ研究奨励金）；ＤａｖｉｄＨ．＆ＬｕｃｉｌｌｅＭ．Ｐａｃｋａｒｄ基金；Ｇ．
ＨａｒｏｌｄａｎｄＬｅｉｌａＹ．母親慈善基金によって、部分的に、支援された。本明細書中で記載された研究はまた、部分的に、米国国立科学技術助成金番号ＣＴＳ
００８８６４９、米国国立衛生研究所助成金番号ＣＡ７７３７３およびＨＧ１６４２−０２、ならびにＤＡＲＰＡにより授与された陸軍科学研究局助成金番号ＤＡＡＤ１９−００−１−０３９２に部分的に支援された。したがって、米国合衆国政府は、本発明における一定の権利を有する。 (Statement of rights to inventions made under research and development supported by the United States of America)
The studies described herein include NSF (xyz in the chip program); National Institutes of Health (NIH) grant CA 77373; NSERC (Julie Payette Research Incentive); & Lucille M. Packard Fund;
Harold and Leila Y. Partially supported by the Mother Charity Fund. The work described herein is also partly based on US National Science and Technology Grant No. CTS.
Partially supported by 0088649, US National Institutes of Health grant numbers CA 77373 and HG 1642-02, and DARPA grant number DAAD 19-00-1-0392. Accordingly, the United States government has certain rights in the invention.

（発明の背景）
結晶化は、生物学的分野および化学分野に対する重要な技術である。具体的には、標的化合物の高質結晶は、標的の正確な三次元構造を製造するために、Ｘ線回折技術によって分析され得る。次いで、この三次元構造情報は、標的の機能性および挙動を予測するために利用され得る。 (Background of the Invention)
Crystallization is an important technique for the biological and chemical fields. Specifically, high quality crystals of the target compound can be analyzed by X-ray diffraction techniques to produce an accurate three-dimensional structure of the target. This 3D structural information can then be utilized to predict the functionality and behavior of the target.

理論上、結晶化プロセスは単純である。純粋な形態の標的化合物は、溶媒に溶解される。次いで、溶解した標的物質の化学環境が変更されて、その結果、この標的は不溶性となり、結晶形態にある固相に転じる。化学環境におけるこの変化は、代表的には、標的物質を不溶性にする結晶化剤を導入することによって達成されるが、温度および圧力における変化はまた、標的物質の溶解度に影響を及ぼし得る。 In theory, the crystallization process is simple. The pure form of the target compound is dissolved in a solvent. The chemical environment of the dissolved target substance is then changed so that the target becomes insoluble and turns into a solid phase in crystalline form. This change in the chemical environment is typically achieved by introducing a crystallizing agent that renders the target substance insoluble, but changes in temperature and pressure can also affect the solubility of the target substance.

しかし、実際には、高質結晶の形成は、一般に困難で時折不可能であり、研究者の一部に、多くの試行および誤りおよび忍耐を必要とする。具体的には、単純な生物学的化合物ですら、その高度に複雑な構造は、それらが高度に秩序立った結晶構造を形成するのに敏感ではない。それ故に、研究者は、実際に結晶が多少なりとも得られ得る場合、高質結晶を得るために、結晶化のための多数の条件を用いて実験し、サンプル濃度、溶媒型、対溶媒型、温度、および持続時間のようなパラメーターを変更するよう、忍耐強くかつ几帳面でなければならない。 In practice, however, the formation of high quality crystals is generally difficult and sometimes impossible, requiring some trial and error and patience for some of the researchers. Specifically, even simple biological compounds, their highly complex structures are not sensitive to forming a highly ordered crystal structure. Therefore, researchers have experimented with a number of conditions for crystallization to obtain high quality crystals, if the crystals can actually be obtained in any way, sample concentration, solvent type, solvent type Be patient and careful to change parameters such as, temperature, and duration.

従って、標的物質の結晶化のハイスループットスクリーニングを実施するための方法および構造が、当該分野で必要とされる。 Therefore, there is a need in the art for methods and structures for performing high-throughput screening of target material crystallization.

（発明の要旨）
ミクロ流体構造体の使用は、タンパク質結晶化のハイスループットスクリーニングを可能にする。１つの実施形態において、一体化された組み合わせ混合チップは、可能な結晶形成がチップ上で観察される、多数の潜在的な結晶化条件を迅速に作製するための、試薬の正確な計量供給を可能にする。代替の実施形態において、ミクロ流体構造体は、特定のタンパク質結晶化剤の組み合わせの位相空間条件を調査するために利用され得、これによって、確実な条件を同定し、そして引き続いて、結晶成長を得る集中した試みを可能にする。したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）
一定の数の入口から複数の化学混合物を調製する方法であって、該方法は、以下：
第一の入口からミクロ流体混合構造体までの第一の化学物質の体積を計量供給する工程；
第二の入口から該ミクロ流体混合構造体までの第二の化学物質の体積を計量供給して、該第一の化学物質および第二の化学物質を含有する第一の混合物を生成する工程；
該第一の混合物を、該ミクロ流体混合構造体から流出させる工程；
再度、該第一の入口から該ミクロ流体混合構造体までの該第一の化学物質の体積を計量供給する工程；ならびに
第三の入口から該ミクロ流体混合構造体までの第三の化学物質の体積を計量供給して、該第一の化学物質および第三の化学物質を含有する第二の混合物を生成する工程、
を包含する、方法。
（２）
前記第一の混合物および第二の混合物の特性を観察する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（３）
前記第一の混合物および第二の混合物の特性が、前記ミクロ流体混合構造体内で観察される、項目２に記載の方法。
（４）
前記第一の混合物および第二の混合物を、それぞれの貯蔵位置までし、そして該第一の混合物および第二の混合物の特性を、該それぞれの貯蔵チャンバ内で観察する工程、
をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（５）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の高分子溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の結晶化剤溶液を流す工程を包含し；
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該結晶化剤溶液を流す工程を包含し；そして
前記第一の混合物および第二の混合物の特性を観察する工程が、固体材料の形成を観察する工程を包含する、
項目２に記載の方法。
（６）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の結晶化剤溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の高分子溶液を流す工程を包含し；
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該高分子溶液を流す工程を包含し；そして
前記第一の混合物および第二の混合物の特性を観察する工程が、固体材料の形成を観察する工程を包含する、
項目２に記載の方法。
（７）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の結晶化剤溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の緩衝溶液を流す工程を包含し；そして
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該緩衝溶液を流す工程を包含し；
前記方法が、前記第一の混合物および第二を計量供給する工程、高分子溶液の体積を計量供給する工程、ならびに該第一の混合物および第二の混合物における固体材料の形成を観察する工程をさらに包含する、
項目２に記載の方法。
（８）
前記第一の化学物質を計量供給する工程が、既知の濃度の高分子溶液を流す工程を包含し；
前記第二の化学物質を計量供給する工程が、第一の濃度の緩衝溶液を流す工程を包含し；そして
前記第三の化学物質溶液を計量供給する工程が、第二の濃度の該緩衝溶液を流す工程を包含し；
前記方法が、前記第一の混合物および第二を計量供給する工程、結晶化剤溶液の体積を計量供給する工程、ならびに該第一の混合物および第二の混合物における固体材料の形成を観察する工程をさらに包含する、
項目２に記載の方法。
（９）
前記第一の化学物質および第二の化学物質を計量供給する工程のうちの少なくとも一方が、該第一の化学物質および第二の化学物質のうちの一方を含むミクロ流体チャネル内に偏向されたエラストマー膜の蠕動ポンピング作用によって計量供給する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１０）
前記第二の化学物質および第三の化学物質を計量供給する工程が、マルチプレクサの作動による、エラストマー膜のミクロ流体フローチャネル内への作動を包含する、項目１に記載の方法。
（１１）
前記第一の混合物および第二の混合物の各々の体積が、約２０ｎＬ以下を構成する、項目１に記載の方法。
（１２）
前記混合構造体内でさらなる混合物を繰り返し調製して、化学的応答または生物学的応答を、該混合物の組成の関数として系統的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（１３）
高分子の溶解度が特徴付けられる、項目１２に記載の方法。
（１４）
前記第一の化学物質が、膜タンパク質を含有し、そして前記第二の化学物質が、対応する検出可能なリガンドを含有し、前記混合する工程が、細胞膜において見出されるような形状にフォールディングされた該膜タンパク質の溶解度を決定することを可能にする、項目１３に記載の方法。
（１５）
前記第一の化学物質および第二の化学物質を混合する工程、ならびに前記第一の化学物質および第三の化学物質を混合する工程が、可溶性条件と沈殿条件との間の中間の溶解度限界の検出を可能にし、前記方法が、以下：
該溶解度限界に近い条件を有する、バッチ結晶化実験を実施する工程、
をさらに包含する、項目１３に記載の方法。
（１６）
前記バッチ結晶化実験の条件が、以下：
ＩＳＳ＝（ＰＣ−ＩＭＣ）／ＩＭＣ
によって定義される中間過飽和（ＩＳＳ）条件の約±５０％以内であり、ここで、
ＰＣは、高分子濃度であり；そして
ＩＭＣは、前記高分子を前記結晶化剤に最初に曝露してから１分以内に、固体形成を生じない最大高分子濃度である、
項目１５に記載の方法。
（１７）
前記バッチスクリーニング高分子結晶化実験の条件が、高分子と混合された緩衝剤を含有する第一の混合物と、結晶化剤と混合された緩衝剤を含有する第二の混合物との間でのフリー界面拡散によって達成される、項目１５に記載の方法。
（１８）
前記バッチスクリーニング高分子結晶化実験が、１０μＬ以下の高分子溶液を消費する、５０以上の混合物を含む、項目１５に記載の方法。
（１９）
高分子溶解度の特徴付けおよび前記バッチスクリーニング実験が、単一のミクロ流体デバイスにおいて実施される、項目１５に記載の方法。
（２０）
高分子溶解度の特徴付けおよび前記バッチスクリーニング実験が、異なるミクロ流体デバイスにおいて実施される、項目１５に記載の方法。
（２１）
装置であって、以下：
第一のエラストマー層に形成されたミクロ流体チャネルネットワークであって、該ミクロ流体チャネルネットワークは、接合部および試薬供給源と流体連絡する第一のセットの入口分枝、該接合部および緩衝剤供給源と流体連絡する第二のセットの入口分枝、ならびに該接合部および出口と流体連絡する混合構造体を備える、ミクロ流体フローチャネルネットワーク；
該第一のエラストマー層に隣接する第二のエラストマー層に形成された第一の制御チャネルネットワークであって、該第一の制御チャネルネットワークは、該第一の入口分枝セットに隣接して、選択試薬が該接合部に流れるように構成された第一のマルチプレクサ構造体を規定する、第一の制御チャネルネットワーク；ならびに
該第二のエラストマー層に形成された第二の制御チャネルネットワークであって、該第二の制御チャネルネットワークは、該第二の入口分枝セットに隣接して、選択緩衝剤の流れを該接合部に流すように構成された第二のマルチプレクサ構造体を規定する、第二の制御チャネルネットワーク、
を備える、装置。
（２２）
前記接合部が、ある距離によって分離された第一の地点および第二の地点で第一のフローチャネルと交差する、第二のフローチャネルを備える、項目２１に記載の装置。
（２３）
前記第一のフローチャネルが、該距離に沿って分枝している、項目２２に記載の装置。（２４）
前記混合構造体が、前記接合部および前記出口から隔離されるように構成された閉回路を備える、項目２１に記載の装置。
（２５）
前記混合構造体が、実質的に円形の形状を有する、項目２１に記載の装置。
（２６）
前記フローチャネルネットワークが、前記混合構造体と流体連絡する注入器チャネルをさらに備える、項目２１に記載の装置。
（２７）
前記第二のエラストマー層が、少なくとも３つの制御チャネルを規定し、該少なくとも３つの制御チャネルは、前記フローチャネルネットワークの上に重なって、流体を前記第一の入口分枝セット、第二の入口分枝セット、および前記閉回路のうちの１つに通して流すように構成された蠕動ポンピング構造体を規定する、項目２１に記載の装置。
（２８）
サンプル貯蔵構造体をさらに備え、該サンプル貯蔵構造体は、前記出口と流体連絡しており、そして前記混合構造体からサンプルを保持するように構成されている、項目２１に記載の装置。
（２９）
前記サンプル貯蔵構造体が、細長フローチャネルを備える、項目２８に記載の装置。
（３０）
前記細長フローチャネルが、行き止まりを有する、項目２９に記載の装置。
（３１）
前記細長フローチャネルの、前記入口の反対側の端部が、弁によって開閉される、項目３０に記載の装置。
（３２）
前記細長フローチャネルへの流体アクセスを支配するマルチプレクサ構造体をさらに備える、項目３１に記載の装置。
（３３）
前記貯蔵構造体が、フローチャネルの行および列によって接続される貯蔵容器のアレイを備える、項目２９に記載の装置。
（３４）
前記貯蔵容器のアレイが、弁付き接続チャネルを通して流体連絡する、対になった容器を備える、項目３３に記載の装置。
（３５）
結晶化を導く条件を同定する方法であって、以下：
第一の濃度で溶媒およびサンプルを含有する、第一の溶液を調製する工程；
該第一の溶液と、結晶化剤を含有する第二の溶液とを混合する工程；
該混合物において最初に固相が出現する第一の条件を記録する工程；
さらなる溶媒を該混合物に添加する工程；
該混合物において固相が消失する第二の条件を記録する工程；ならびに
該第一の条件と第二の条件との間のヒステリシスを同定する工程、
を包含する、方法。
（３６）
前記第一の条件および第二の条件が、サンプルおよび結晶化剤の濃度を規定する、項目３５に記載の方法。
（３７）
前記結晶化剤が、前記サンプルを含む閉回路ミクロ流体チャネルに導入され；そして
次いで、前記溶媒が、該閉回路ミクロ流体チャネルに導入される、
項目３５に記載の方法。
（３８）
前記結晶化剤および前記溶媒のうちの少なくとも一方が、エラストマーマクのポンピング作用によって導入される、項目３７に記載の方法。
（３９）
前記第一の条件および第二の条件が、前記サンプルおよび前記結晶化剤を含有するミクロ流体フローチャネルの光学問い合わせによって決定される、項目３５に記載の方法。
（４０）
エラストマーから微細製造される前記ミクロ流体構造体が、光学的に問い合わせられる、項目３５に記載の方法。
（４１）
結晶化を導く条件を同定する方法であって、以下：
結晶化剤がサンプルを含有する溶液と混合される際の光の散乱を検出する工程；
該検出された散乱光を、タンパク質結晶含有溶液に特徴的な既知の範囲の第二のビリアル係数で補正する工程、
を包含する、方法。
（４２）
前記結晶化剤が、サンプルを含有する閉回路ミクロ流体チャネルに流入する際に、前記散乱が決定される、項目４１に記載の方法。
（４３）
前記結晶化剤が、エラストマー膜の作用によって、前記閉回路ミクロ流体チャネル内にポンピングされる、項目４１に記載の方法。
（４４）
ミクロ流体デバイスを通る流れを制御する方法であって、以下：
流体をフローチャネルに入れる工程；
該フローチャネルに隣接し、かつ該フローチャネルから分離されている制御チャネルに、圧力を付与して、介在するエラストマー膜を該フローチャネル内に偏向させる工程；および
該フローチャネル内の流体のベースライン圧力を、５ｐｓｉｇより大きく維持し、一方で、該制御チャネルに扶養される圧力を緩和して、該エラストマー膜を該フローチャネルの外に付勢する工程、
を包含する、方法。
（４５）
前記圧力が、前記制御チャネルに、ある体積の空気のフラックスの形態で付与され、その結果、前記フローチャネル内に維持される上昇した圧力が、該フローチャネル内の気泡の形成を減少させる、項目４４に記載の方法。
（４６）
前記エラストマー膜が、５０Ｈｚ以上の周波数で、前記フローチャネルの内外に作動され得る、項目４４に記載の方法。
（４７）
前記フローチャネルが、閉回路を備え、そして前記エラストマー膜の作用が、約４Ｈｚの周波数で、該閉回路に通して流体を流し得る、項目４４に記載の方法。
（４８）
膜タンパク質の可溶化を導く条件を同定する方法であって、該方法は、以下：
固体膜タンパク質を、ミクロ流体閉回路混合構造体に導入する工程；
両親媒性部分を、該ミクロ流体閉回路混合構造体に導入する工程；
該膜タンパク質および該両親媒性部分の混合物を、検出可能なリガンドに曝露する工程であって、得該検出可能なリガンドは、膜に折り畳まれる場合の該膜タンパク質の形態のみと結合するように構成されている、工程；ならびに
該リガンドを検出して、溶液中での該膜タンパク質の折り畳まれた形態を同定する工程、
を包含する、方法。
（４９）
前記混合物が、ミクロ流体閉回路混合構造体内で、前記検出可能なリガンドに曝露される、項目４８に記載の方法。
（５０）
前記混合物が、前記ミクロ流体閉回路混合構造体から流れを受け取るミクロ流体フローチャネル内で、前記検出可能なリガンドに曝露される、項目４８に記載の方法。
（５１）
前記タンパク質が、前記リガンドへの曝露の前にタグ化され；そして
該可溶性タグか膜タンパク質が、前記ミクロ流体フローチャネル内で、表面に結合する、
項目５０に記載の方法。
（５２）
２つの流体を混合する方法であって、以下：
第一の静止流体を配置する工程；
第二の流体を該第一の静止流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制し、その結果、該界面を横切る該第一の流体と第二の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こる、工程；
を包含する、方法。
（５３）
前記第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程が、前記界面における該第一の流体および第二の流体の一部分を、第一の次元に制限する工程を包含する、項目５２に記載の方法。
（５４）
前記第一の次元が、ミクロ流体チャネルの幅を含む、項目５３に記載の方法。
（５５）
前記対流が、前記チャネルの壁に存在する非スリップ層に起因して制限される、項目５４に記載の方法。
（５６）
前記第二の流体が、前記第一の流体と直接接触して配置される、項目５２に記載の方法。
（５７）
前記第一の流体が、前記フローチャネルの分枝内に配置される、項目５６に記載の方法。
（５８）
前記第一の流体が、対向圧力に起因して、前記分枝チャネル内で静止したままである、項目５７に記載の方法。
（５９）
前記分枝チャネルが、行き止まりを有する、項目５７に記載の方法。
（６０）
前記第一の流体が、閉鎖具の第一の側と接触して配置され；
前記第二の流体が、該閉鎖具の反対側と接触して配置され；そして
該閉鎖具が該チャネルから取り外されて、該流体界面を形成する、
項目５２に記載の方法。
（６１）
前記第一の流体および第二の流体が、ミクロ流体チャネル内に配置され；
前記閉鎖具が、該ミクロ流体チャネル内に存在するエラストマー膜を備え；そして
該エラストマー膜の一部分が、作動力に応答して該チャネルから偏向されることによって取り外される、
項目６０に記載の方法。
（６２）
前記ミクロ流体フローチャネルの幅が、該ミクロ流体フローチャネルをエラストマー材料に製造するために使用される鋳型の隆起特徴の幅によって規定される、項目６１に記載の方法。
（６３）
前記隆起特徴の幅が、フォトリソグラフィー技術を利用して規定される、項目６２に記載の方法。
（６４）
前記隆起特徴の幅が、線が配置されるべき領域の上のマスクをパターン付けすること、次いで、該マスクのいずれかの側の材料を除去することによって規定される、項目６２に記載の方法。
（６５）
前記ミクロ流体フローチャネルの幅が、エラストマー膜の層内に閉じ込められた犠牲材料の線の幅によって規定される、項目６１に記載の方法。
（６６）
前記犠牲材料の幅が、該犠牲材料の層を前記エラストマーの上に形成すること、および該犠牲材料を前記線のいずれかの側から除去することによって規定される、項目６５に記載の方法。
（６７）
前記第一の次元が、親水性経路の幅を含む、項目５３に記載の方法。
（６８）
前記親水性経路の幅が、親水性材料の沈着の間に露出される基板表面の領域の幅によって規定される、項目６７に記載の方法。
（６９）
前記親水性経路の幅が、親水性材料の沈着の間にマスクされる基板表面の領域の幅によって規定される、項目６７に記載の方法。
（７０）
２つの流体を混合する方法であって、以下：
全体積を有する第一の静止流体を提供する工程；
全体積を有する第二の静止流体を提供する工程；
該第一の静止流体の一部分を、該第二の静止流体の一部分と接触させて配置して、流体界面を形成する工程であって、その結果、該第一の流体および第二の流体の最小の体積が、該流体界面にすぐ沿って存在する、最も激しい濃度勾配に曝露される、工程、
を包含する、方法。
（７１）
前記界面に沿った、前記第一の流体および第二の流体の部分が、ミクロ流体フローチャネルの寸法によって制限される、項目７０に記載の方法。
（７２）
前記第一の流体が、第一のチャンバに入れられ、前記第二の流体が、第二のチャンバに入れられ、そして該第一のチャンバの断面積対該ミクロ流体フローチャネルの断面積の比が、５００と２５，０００との間であるように、前記ミクロ流体フローチャネルが、該チャンバを接続している、項目７１に記載の方法。
（７３）
流体系の特性を決定する方法であって、以下：
標的を含有する第一の静止流体を配置する工程；
第二の静止流体を該第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、混合が、該界面を横切って、拡散のみによって起こり、物理的特性を明らかにする、工程、
を包含する、方法。
（７４）
前記第一の流体および第二の流体が同じであり、そして別の流体中の前記標的の拡散係数が既知であり、その結果、該第一の流体および第二の流体の粘度が決定され得る、項目７３に記載の方法。
（７５）
前記第二の流体が、前記標的に結合することが既知である分析物を含有し、その結果、前記標的の濃度が、該標的の非存在下での該分析物の予測される拡散挙動からの該分析物の観察される拡散挙動の偏差から決定され得る、項目７３に記載の方法。
（７６）
前記標的に対する前記分析物の親和性が既知であり、そして該標的の濃度が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、項目７５に記載の方法。
（７７）
前記標的に対する前記分析物の親和性が既知であり、そして該標的の大きさが、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、項目７５に記載の方法。
（７８）
前記分析物および標的の濃度が既知であり、そして該標的に対する該分析物の親和性が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、該分析物の一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、項目７５に記載の方法。
（７９）
前記第二の流体が、微生物を含有し、その結果、該微生物によって示される該標的に対する化学走性が分析され得る、項目７３に記載の方法。
（８０）
標的材料の特性を分析するための構造体であって、以下：
標的を含有する、ある体積の第一の静止流体を含むように構成された、第一の微小製造された領域；
該標的に結合することが既知である分析物を含有する、ある体積の第二の静止流体を含むように構成された、第二の微小製造された領域；
該体積の第一の流体を、フリーミクロ流体界面を横切って該体積の第二の流体と拡散連絡させて配置させるように作動可能な弁；および
該第一の微小さ製造された領域における該分析物の存在を検出するように構成された検出器、
を備える、構造体。
（８１）
前記第一の微小製造された領域が、第一のチャンバを備え、該第一のチャンバは、該第一のチャンバの次元に対して少なくとも１つの次元を制限された第一のチャネル部分と流体連絡しており；
前記第二の微小製造された領域が、第二のチャンバを備え、該第二のチャンバは、該第二のチャンバの次元に対して少なくとも１つの次元を制限された第二のチャネル部分と流体連絡しており；
前記弁が、該第一のチャネル部分と該第二のチャネル部分との間のチャネル内に偏向可能なエラストマー膜を備え；そして
前記検出器が、前記第一のチャンバ内の分析物の濃度の増加の速度を、経時的に検出するように構成されている、
項目８０に記載の構造体。
（８２）
前記第一の微小製造された領域が、少なくとも１つの次元を制限された第一の微小製造されたチャネル部分を備え；
前記第二の微小製造された領域が、少なくとも１つの次元を制限された第二の微小製造されたチャネル部分を備え；
前記弁が、該第一のチャネル部分と該第二のチャネル部分との間に微小製造されたチャネル内に偏向可能なエラストマー膜を備え；そして
前記検出器が、前記弁からの距離にわたって、前記第一のチャンバ内の該分析物の濃度を検出するように構成されている、
項目８０に記載の構造体。
（８３）
前記検出器が、蛍光、屈折率、非色分析、表面プラスモン共鳴、および伝導率のうちの少なくとも１つを検出するように構成されている、項目８０に記載の構造体。
（８４）
タンパク質サンプル中の低分子の濃度を減少させる方法であって、該方法は、以下：
該タンパク質サンプルを含有する第一の静止流体を、ミクロ流体チャネルに入れる工程；
低濃度の該低分子を有する第二の静止流体を、該第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該第一の静止流体からの該低分子が、拡散のみによって、該界面を横切って拡散し、該第一の静止流体中に存在する低分子の濃度を減少させる、工程、
を包含する、方法。
（８５）
リガンドと標的との間の反応を決定する方法であって、以下：
該リガンドを含有する第一の流体を、第一のチャンバに入れる工程；
該標的を含有する第二の流体を、第二のチャンバに入れる工程；
該第一のチャンバと第二のチャンバとを接続しているチャネル内において、該第一の流体と第二の流体との間のミクロ流体フリー界面を確立する工程；
該第一の流体と第二の流体との間の該ミクロ流体フリー界面を横切る拡散によって混合を起こさせる工程であって；その結果、該リガンドが該標的に結合し、そして該リガンドと該標的との間の反応性が、該標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、一時的な拡散プロフィールおよび空間的拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって決定され得る、工程、
を包含する、方法。
（８６）
前記拡散プロフィールの偏差が、前記リガンド単独の拡散に対する、リガンド／標的の組み合わせの減少した拡散を反映する、項目８５に記載の方法。
（８７）
前記標的が、もとのリガンドに結合され；
前記リガンドが、競合物リガンドを表し；そして
前記拡散プロフィールの偏差が、該配置された元のリガンドの増強された拡散を反映し、そして該もとのリガンドの検出可能な物理特性によって明らかにされる、
項目８５に記載の方法。
（８８）
前記拡散プロフィールの偏差が、前記配置された元のリガンドからの蛍光信号の発光によって明らかにされる、項目８５に記載の方法。
（８９）
前記拡散プロフィールの偏差が、前記配置された元のリガンドからの蛍光信号のクエンチによって明らかにされる、項目８５に記載の方法。
（９０）
ある範囲の条件下で化学反応をサンプリングする方法であって、以下：
第一の反応物を含有する第一の流体と、第二の反応物を含有する第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を形成する工程；
該第二の流体内への該第一の反応物の拡散を引き起こして、該第一の反応物の濃度勾配を作製する工程；および
該勾配に沿った種々の濃度での該第一の反応物と、第二の反応物との間の反応を観察する工程、
を包含する、方法。
（９１）
前記第二の反応物が、検出可能な生成物を生成するための反応を触媒する酵素を含有し；そして
前記第一の反応物が、該酵素のインヒビターを含有する、
項目９０に記載の方法。
（９２）
前記生成物が、蛍光、屈折率、比色分析、表面プラスモン共鳴、および導電率のうちの少なくとも１つをモニタリングすることによって検出される、項目９１に記載の方法。
（９３）
化学種の濃度勾配を作製する方法であって、以下：
該化学種を含有する第一の流体を配置する工程；
第二の静止流体を該第一の静止流体の近くに配置して、ミクロ流体フリー界面を形成する工程；
該第一の流体および第二の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該ミクロ流体フリー界面を横切る該第一の流体と第二の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして該化学酒の濃度勾配が作製される、工程、
を包含する、方法。
（９４）
前記第一の化学種が、前記第二の流体と流体連絡する細胞のための栄養を含有する、項目９３に記載の方法。
（９５）
第二の化学種を含有する第三の流体を、前記第二の流体の近くに配置して、第二のミクロ流体フリー界面を形成する工程；
該第二の流体および第三の流体の対流を抑制する工程であって、その結果、該第二のミクロ流体フリー界面を横切る該第二の流体と第三の流体との間の混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして該第二の化学種の第二の濃度勾配が、前記第一の化学種の濃度勾配に重ねられる、工程、
をさらに包含する、項目９３に記載の方法。
（９６）
前記第一の化学種の濃度勾配の方向が、前記第二の化学種の濃度勾配の方向と平行ではない、項目９５に記載の方法。
（９７）
前記第一の化学種の濃度勾配の方向が、前記第二の化学物質の濃度勾配に対しておよそ垂直であり、その結果、該第一の化学種の濃度条件および第二の化学種の濃度条件のアレイが作製される、項目９６に記載の方法。
（９８）
前記第一の化学種および第二の化学種の拡散が、浅いチャンバ内で起こる、項目９７に記載の方法。
（９９）
前記第一の化学種および第二の化学種の拡散が、直交して配向したミクロ流体フローチャネルのセットにおいて起こる、項目９７に記載の方法。
（１００）
薬物を被験体に導入する方法であって、以下：
該薬物を含有する第一の静止流体を、ミクロ流体デバイスに入れる工程；
該第一の静止流体と該被験体との間の該ミクロ流体デバイスに、第二の流体を入れる工程；
該第一の流体と該第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を確立する工程であって、その結果、予め決定された量の該薬物が拡散して、予め決定された時間の後のみに該被験体に達する、工程、
を包含する、方法。
（１０１）
前記被験体への前記薬物の拡散の時間が、該被験体と前記第一の流体との間に配置された前記ミクロ流体デバイス内のチャネルの寸法によって決定される、項目１００に記載の方法。
（１０２）
化学反応の間の反応物の濃度を制御する方法であって、以下：
第一の反応物を含有する第一の静止流体を、ミクロ流体構造体に入れる工程；
該第一の静止流体の近くで、第二の流体を該ミクロ流体構造体に入れる工程であって、該第二の静止流体が、第二の反応物を含有する、工程；
該第一の流体と第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を確立する工程；
該ミクロ流体フリー海面を横切る、該第一の流体と第二の流体との間での拡散を可能にして、該第一の反応物と第二の反応物との相対濃度を決定する工程、
を包含する、方法。 (Summary of the Invention)
The use of microfluidic structures allows for high-throughput screening of protein crystallization. In one embodiment, an integrated combinatorial mixing chip provides accurate metering of reagents to quickly create a large number of potential crystallization conditions where possible crystal formation is observed on the chip. enable. In an alternative embodiment, the microfluidic structure can be utilized to investigate the phase space conditions of a particular protein crystallization agent combination, thereby identifying certain conditions and subsequently crystal growth. Allows concentrated attempts to gain. Accordingly, the present invention provides the following.
(1)
A method of preparing a plurality of chemical mixtures from a fixed number of inlets, the method comprising:
Metering the volume of the first chemical from the first inlet to the microfluidic mixing structure;
Metering a volume of a second chemical from a second inlet to the microfluidic mixing structure to produce a first mixture containing the first chemical and the second chemical;
Allowing the first mixture to flow out of the microfluidic mixing structure;
Again metering the volume of the first chemical from the first inlet to the microfluidic mixing structure; and
Metering a volume of a third chemical from a third inlet to the microfluidic mixing structure to produce a second mixture containing the first chemical and the third chemical;
Including the method.
(2)
Item 2. The method according to Item 1, further comprising observing characteristics of the first mixture and the second mixture.
(3)
Item 3. The method of item 2, wherein the properties of the first mixture and the second mixture are observed in the microfluidic mixing structure.
(4)
Bringing the first mixture and the second mixture to their respective storage positions and observing the properties of the first mixture and the second mixture in the respective storage chambers;
The method according to item 2, further comprising:
(5)
Metering said first chemical comprises flowing a polymer solution of known concentration;
Metering the second chemical comprises flowing a crystallization agent solution of a first concentration;
Metering the third chemical solution comprises flowing a second concentration of the crystallization agent solution; and
Observing the properties of the first mixture and the second mixture includes observing the formation of a solid material;
Item 3. The method according to Item 2.
(6)
Metering the first chemical comprises flowing a crystallization agent solution of known concentration;
Metering said second chemical substance comprises flowing a polymer solution of a first concentration;
Metering the third chemical solution comprises flowing a second concentration of the polymer solution; and
Observing the properties of the first mixture and the second mixture includes observing the formation of a solid material;
Item 3. The method according to Item 2.
(7)
Metering the first chemical comprises flowing a crystallization agent solution of known concentration;
Metering the second chemical comprises flowing a buffer solution of a first concentration; and
Metering the third chemical solution comprises flowing a second concentration of the buffer solution;
Metering said first mixture and second, metering a volume of polymer solution, and observing the formation of solid material in said first mixture and second mixture. Further including,
Item 3. The method according to Item 2.
(8)
Metering said first chemical comprises flowing a polymer solution of known concentration;
Metering the second chemical comprises flowing a buffer solution of a first concentration; and
Metering the third chemical solution comprises flowing a second concentration of the buffer solution;
The method comprises metering the first mixture and the second, metering the volume of the crystallization agent solution, and observing the formation of solid material in the first mixture and the second mixture. Further including,
Item 3. The method according to Item 2.
(9)
At least one of the steps of metering the first chemical and the second chemical is deflected into a microfluidic channel that includes one of the first chemical and the second chemical. A method according to item 1, comprising metering by a peristaltic pumping action of the elastomeric membrane.
(10)
The method of claim 1, wherein metering the second chemical and the third chemical comprises actuation of an elastomeric membrane into a microfluidic flow channel by actuation of a multiplexer.
(11)
The method of item 1, wherein the volume of each of the first mixture and the second mixture comprises no more than about 20 nL.
(12)
2. The method of item 1, further comprising the step of iteratively preparing additional mixtures within the mixed structure to systematically characterize chemical or biological responses as a function of the composition of the mixture.
(13)
13. A method according to item 12, wherein the solubility of the polymer is characterized.
(14)
The first chemical contains a membrane protein and the second chemical contains a corresponding detectable ligand and the mixing step is folded into a shape as found in the cell membrane 14. The method according to item 13, which makes it possible to determine the solubility of the membrane protein.
(15)
The step of mixing the first chemical substance and the second chemical substance and the step of mixing the first chemical substance and the third chemical substance have a solubility limit intermediate between the solubility condition and the precipitation condition. Allowing detection, said method comprising:
Performing a batch crystallization experiment having conditions close to the solubility limit;
14. The method of item 13, further comprising:
(16)
The conditions for the batch crystallization experiment are as follows:
ISS = (PC-IMC) / IMC
Within about ± 50% of the intermediate supersaturation (ISS) condition defined by:
PC is the polymer concentration; and
IMC is the maximum polymer concentration that does not result in solid formation within 1 minute of first exposure of the polymer to the crystallization agent.
Item 16. The method according to Item15.
(17)
The conditions of the batch screening polymer crystallization experiment include a first mixture containing a buffer mixed with a polymer and a second mixture containing a buffer mixed with a crystallization agent. 16. A method according to item 15, which is achieved by free interfacial diffusion.
(18)
16. The method of item 15, wherein the batch screening polymer crystallization experiment comprises 50 or more mixtures that consume 10 μL or less of polymer solution.
(19)
16. The method of item 15, wherein the polymer solubility characterization and the batch screening experiment are performed in a single microfluidic device.
(20)
16. A method according to item 15, wherein the polymer solubility characterization and the batch screening experiment are performed in different microfluidic devices.
(21)
Device, the following:
A microfluidic channel network formed in a first elastomer layer, wherein the microfluidic channel network is a first set of inlet branches in fluid communication with a junction and a reagent source, the junction and buffer supply A microfluidic flow channel network comprising a second set of inlet branches in fluid communication with the source and a mixing structure in fluid communication with the junction and outlet;
A first control channel network formed in a second elastomer layer adjacent to the first elastomer layer, the first control channel network adjacent to the first inlet branch set; A first control channel network defining a first multiplexer structure configured to flow a selection reagent to the junction; and
A second control channel network formed in the second elastomeric layer, the second control channel network adjacent to the second inlet branch set and joining a flow of selective buffer. A second control channel network defining a second multiplexer structure configured to flow through
An apparatus comprising:
(22)
Item 22. The device of item 21, wherein the junction comprises a second flow channel that intersects the first flow channel at a first point and a second point separated by a distance.
(23)
24. The apparatus of item 22, wherein the first flow channel is branched along the distance. (24)
Item 22. The device of item 21, wherein the mixing structure comprises a closed circuit configured to be isolated from the junction and the outlet.
(25)
Item 22. The device of item 21, wherein the mixing structure has a substantially circular shape.
(26)
The apparatus of item 21, wherein the flow channel network further comprises an injector channel in fluid communication with the mixing structure.
(27)
The second elastomer layer defines at least three control channels, the at least three control channels overlying the flow channel network to direct fluid to the first inlet branch set, second inlet. The apparatus of item 21, defining a branch set and a peristaltic pumping structure configured to flow through one of the closed circuits.
(28)
The apparatus of item 21, further comprising a sample storage structure, wherein the sample storage structure is in fluid communication with the outlet and is configured to hold a sample from the mixing structure.
(29)
29. Apparatus according to item 28, wherein the sample storage structure comprises an elongated flow channel.
(30)
30. The apparatus of item 29, wherein the elongate flow channel has a dead end.
(31)
31. Apparatus according to item 30, wherein the end of the elongate flow channel opposite the inlet is opened and closed by a valve.
(32)
32. The apparatus of item 31, further comprising a multiplexer structure that governs fluid access to the elongate flow channel.
(33)
30. The apparatus of item 29, wherein the storage structure comprises an array of storage containers connected by rows and columns of flow channels.
(34)
34. The apparatus of item 33, wherein the array of storage containers comprises a pair of containers in fluid communication through a valved connection channel.
(35)
A method for identifying conditions that lead to crystallization comprising:
Preparing a first solution containing a solvent and a sample at a first concentration;
Mixing the first solution with a second solution containing a crystallization agent;
Recording a first condition at which a solid phase first appears in the mixture;
Adding additional solvent to the mixture;
Recording a second condition for the disappearance of the solid phase in the mixture; and
Identifying a hysteresis between the first condition and the second condition;
Including the method.
(36)
36. The method of item 35, wherein the first condition and the second condition define the concentration of the sample and the crystallization agent.
(37)
The crystallization agent is introduced into a closed circuit microfluidic channel containing the sample; and
The solvent is then introduced into the closed circuit microfluidic channel.
36. The method according to item 35.
(38)
38. A method according to item 37, wherein at least one of the crystallization agent and the solvent is introduced by a pumping action of an elastomeric mac.
(39)
36. The method of item 35, wherein the first condition and the second condition are determined by optical interrogation of a microfluidic flow channel containing the sample and the crystallization agent.
(40)
36. The method of item 35, wherein the microfluidic structure microfabricated from an elastomer is optically interrogated.
(41)
A method for identifying conditions that lead to crystallization comprising:
Detecting light scattering as the crystallizing agent is mixed with the solution containing the sample;
Correcting the detected scattered light with a second virial coefficient in a known range characteristic of a protein crystal-containing solution;
Including the method.
(42)
42. The method of item 41, wherein the scattering is determined as the crystallization agent enters a closed circuit microfluidic channel containing a sample.
(43)
42. The method of item 41, wherein the crystallization agent is pumped into the closed circuit microfluidic channel by the action of an elastomeric membrane.
(44)
A method for controlling flow through a microfluidic device comprising:
Placing fluid into the flow channel;
Applying pressure to a control channel adjacent to and separated from the flow channel to deflect an intervening elastomeric membrane into the flow channel; and
Maintaining a baseline pressure of fluid in the flow channel greater than 5 psig while relaxing the pressure replenished to the control channel to bias the elastomeric membrane out of the flow channel;
Including the method.
(45)
The pressure is applied to the control channel in the form of a volume of air flux so that the elevated pressure maintained in the flow channel reduces bubble formation in the flow channel; 45. The method according to 44.
(46)
45. A method according to item 44, wherein the elastomeric membrane can be activated in and out of the flow channel at a frequency of 50 Hz or more.
(47)
45. The method of item 44, wherein the flow channel comprises a closed circuit and the action of the elastomeric membrane can flow fluid through the closed circuit at a frequency of about 4 Hz.
(48)
A method for identifying conditions that lead to solubilization of membrane proteins, the method comprising:
Introducing a solid membrane protein into a microfluidic closed circuit mixed structure;
Introducing an amphiphilic moiety into the microfluidic closed circuit mixed structure;
Exposing the mixture of the membrane protein and the amphiphilic moiety to a detectable ligand such that the detectable ligand binds only to the form of the membrane protein when folded into a membrane. Comprising a process; and
Detecting the ligand to identify a folded form of the membrane protein in solution;
Including the method.
(49)
49. The method of item 48, wherein the mixture is exposed to the detectable ligand within a microfluidic closed circuit mixing structure.
(50)
49. The method of item 48, wherein the mixture is exposed to the detectable ligand in a microfluidic flow channel that receives flow from the microfluidic closed circuit mixing structure.
(51)
The protein is tagged prior to exposure to the ligand; and
The soluble tag or membrane protein binds to a surface within the microfluidic flow channel;
51. A method according to item 50.
(52)
A method of mixing two fluids, the following:
Disposing a first stationary fluid;
Placing a second fluid proximate to the first stationary fluid to form a fluid interface;
Suppressing convection of the first fluid and the second fluid so that mixing between the first fluid and the second fluid across the interface occurs substantially only by diffusion;
Including the method.
(53)
Item 52. The step of inhibiting convection of the first fluid and the second fluid comprises restricting a portion of the first fluid and the second fluid at the interface to a first dimension. The method described.
(54)
54. The method of item 53, wherein the first dimension includes the width of a microfluidic channel.
(55)
55. A method according to item 54, wherein the convection is limited due to a non-slip layer present in the wall of the channel.
(56)
53. The method of item 52, wherein the second fluid is placed in direct contact with the first fluid.
(57)
58. The method of item 56, wherein the first fluid is disposed within a branch of the flow channel.
(58)
58. The method of item 57, wherein the first fluid remains stationary in the branch channel due to an opposing pressure.
(59)
58. A method according to item 57, wherein the branch channel has a dead end.
(60)
The first fluid is disposed in contact with a first side of the closure;
The second fluid is disposed in contact with the opposite side of the closure; and
The closure is removed from the channel to form the fluid interface;
53. The method according to item 52.
(61)
The first fluid and the second fluid are disposed in a microfluidic channel;
The closure comprises an elastomeric membrane present in the microfluidic channel; and
A portion of the elastomeric membrane is removed by being deflected from the channel in response to an actuation force;
61. The method according to item 60.
(62)
62. The method of item 61, wherein the width of the microfluidic flow channel is defined by the width of the raised features of the mold used to make the microfluidic flow channel into an elastomeric material.
(63)
63. A method according to item 62, wherein the width of the raised features is defined using photolithography technology.
(64)
63. A method according to item 62, wherein the width of the raised features is defined by patterning a mask over the area where a line is to be placed, and then removing the material on either side of the mask. .
(65)
62. A method according to item 61, wherein the width of the microfluidic flow channel is defined by the width of a line of sacrificial material confined within a layer of elastomeric membrane.
(66)
68. A method according to item 65, wherein the width of the sacrificial material is defined by forming a layer of the sacrificial material on the elastomer and removing the sacrificial material from either side of the line.
(67)
54. The method of item 53, wherein the first dimension includes a width of the hydrophilic pathway.
(68)
68. The method of item 67, wherein the width of the hydrophilic pathway is defined by the width of the area of the substrate surface that is exposed during the deposition of the hydrophilic material.
(69)
68. The method of item 67, wherein the width of the hydrophilic pathway is defined by the width of the area of the substrate surface that is masked during the deposition of the hydrophilic material.
(70)
A method of mixing two fluids, the following:
Providing a first stationary fluid having a total volume;
Providing a second stationary fluid having a total volume;
Placing a portion of the first stationary fluid in contact with a portion of the second stationary fluid to form a fluid interface, so that the first fluid and the second fluid A minimum volume is exposed to the most intense concentration gradient present immediately along the fluid interface;
Including the method.
(71)
71. The method of item 70, wherein portions of the first fluid and second fluid along the interface are limited by the dimensions of the microfluidic flow channel.
(72)
The first fluid is placed in a first chamber, the second fluid is placed in a second chamber, and the ratio of the cross-sectional area of the first chamber to the cross-sectional area of the microfluidic flow channel 72. The method of item 71, wherein the microfluidic flow channel connects the chambers such that is between 500 and 25,000.
(73)
A method for determining the characteristics of a fluid system, comprising:
Disposing a first stationary fluid containing the target;
Placing a second stationary fluid proximate to the first fluid to form a fluid interface;
Suppressing the convection of the first fluid and the second fluid so that mixing occurs only by diffusion across the interface and reveals physical properties;
Including the method.
(74)
The first fluid and the second fluid are the same, and the diffusion coefficient of the target in another fluid is known so that the viscosity of the first fluid and the second fluid can be determined 74. The method according to item 73.
(75)
The second fluid contains an analyte that is known to bind to the target, so that the concentration of the target is derived from the expected diffusion behavior of the analyte in the absence of the target. 74. A method according to item 73, which can be determined from deviations in the observed diffusion behavior of the analyte.
(76)
The analyte's affinity for the target is known, and the concentration of the target from the corresponding profile predicted in the absence of the target is a temporary and spatial diffusion profile of the analyte. 76. A method according to item 75, which can be determined by a deviation of at least one of the profiles.
(77)
The analyte's affinity for the target is known, and the size of the target from the corresponding profile predicted in the absence of the target, the temporal diffusion profile and spatial of the analyte 76. The method of item 75, which can be determined by a deviation of at least one of the diffusion profiles.
(78)
A transient diffusion profile of the analyte from a corresponding profile in which the analyte and target concentrations are known, and the affinity of the analyte for the target is predicted in the absence of the target, and 76. The method of item 75, which can be determined by a deviation of at least one of the spatial diffusion profiles.
(79)
74. The method of item 73, wherein the second fluid contains a microorganism so that chemotaxis to the target exhibited by the microorganism can be analyzed.
(80)
A structure for analyzing the properties of a target material, comprising:
A first microfabricated region configured to contain a volume of a first stationary fluid containing a target;
A second microfabricated region configured to contain a volume of a second stationary fluid containing an analyte known to bind to the target;
A valve operable to place the volume of the first fluid in diffusion communication with the volume of the second fluid across the free microfluidic interface; and
A detector configured to detect the presence of the analyte in the first microfabricated region;
A structure comprising:
(81)
The first microfabricated region comprises a first chamber, the first chamber having a first channel portion and a fluid that are limited in at least one dimension relative to the dimension of the first chamber. Contacted;
The second microfabricated region comprises a second chamber, the second chamber having a second channel portion and a fluid restricted at least one dimension relative to the dimension of the second chamber. Contacted;
The valve comprises a deflectable elastomeric membrane in a channel between the first channel portion and the second channel portion; and
The detector is configured to detect a rate of increase in concentration of the analyte in the first chamber over time;
Item 81. The structure according to Item 80.
(82)
The first microfabricated region comprises at least one dimensionally limited first microfabricated channel portion;
The second microfabricated region comprises at least one dimensionally limited second microfabricated channel portion;
The valve comprises an elastomeric membrane deflectable in a microfabricated channel between the first channel portion and the second channel portion; and
The detector is configured to detect the concentration of the analyte in the first chamber over a distance from the valve;
Item 81. The structure according to Item 80.
(83)
81. The structure of item 80, wherein the detector is configured to detect at least one of fluorescence, refractive index, non-color analysis, surface plasmon resonance, and conductivity.
(84)
A method of reducing the concentration of small molecules in a protein sample, the method comprising:
Placing a first stationary fluid containing the protein sample into a microfluidic channel;
Disposing a second stationary fluid having a low concentration of the small molecule close to the first fluid to form a fluid interface;
Suppressing the convection of the first fluid and the second fluid so that the small molecules from the first stationary fluid diffuse across the interface by diffusion only, Reducing the concentration of small molecules present in one static fluid,
Including the method.
(85)
A method for determining a reaction between a ligand and a target, comprising:
Placing a first fluid containing the ligand into a first chamber;
Placing a second fluid containing the target into a second chamber;
Establishing a microfluidic free interface between the first fluid and the second fluid in a channel connecting the first chamber and the second chamber;
Mixing by diffusion across the microfluidic free interface between the first fluid and a second fluid; as a result, the ligand binds to the target and the ligand and the target The reactivity between and a corresponding profile predicted in the absence of the target can be determined by a deviation of at least one of a temporal diffusion profile and a spatial diffusion profile,
Including the method.
(86)
86. The method of item 85, wherein the deviation of the diffusion profile reflects a reduced diffusion of the ligand / target combination relative to the diffusion of the ligand alone.
(87)
The target is bound to the original ligand;
Said ligand represents a competitor ligand; and
Deviations in the diffusion profile reflect the enhanced diffusion of the placed original ligand and are manifested by the detectable physical properties of the original ligand;
86. A method according to item 85.
(88)
86. The method of item 85, wherein the deviation of the diffusion profile is revealed by emission of a fluorescent signal from the placed original ligand.
(89)
86. The method of item 85, wherein the deviation of the diffusion profile is revealed by quenching of a fluorescent signal from the placed original ligand.
(90)
A method for sampling a chemical reaction under a range of conditions, including:
Forming a microfluidic free interface between a first fluid containing a first reactant and a second fluid containing a second reactant;
Causing a diffusion of the first reactant into the second fluid to create a concentration gradient of the first reactant; and
Observing the reaction between the first and second reactants at various concentrations along the gradient;
Including the method.
(91)
The second reactant contains an enzyme that catalyzes the reaction to produce a detectable product; and
The first reactant contains an inhibitor of the enzyme;
91. A method according to item 90.
(92)
92. The method of item 91, wherein the product is detected by monitoring at least one of fluorescence, refractive index, colorimetric analysis, surface plasmon resonance, and conductivity.
(93)
A method for creating a concentration gradient of a chemical species, comprising:
Disposing a first fluid containing the chemical species;
Placing a second stationary fluid proximate to the first stationary fluid to form a microfluidic free interface;
Suppressing convection of the first fluid and the second fluid so that mixing between the first fluid and the second fluid across the microfluidic free interface is substantially A process that occurs only by diffusion and that creates a concentration gradient of the chemical liquor,
Including the method.
(94)
94. The method of item 93, wherein the first chemical species contains nutrients for cells in fluid communication with the second fluid.
(95)
Placing a third fluid containing a second species near the second fluid to form a second microfluidic free interface;
Suppressing the convection of the second fluid and the third fluid, so that mixing between the second fluid and the third fluid across the second microfluidic free interface comprises: Occurring substantially only by diffusion, and a second concentration gradient of the second species is superimposed on the concentration gradient of the first species,
94. The method of item 93, further comprising:
(96)
96. The method of item 95, wherein the direction of the concentration gradient of the first chemical species is not parallel to the direction of the concentration gradient of the second chemical species.
(97)
The direction of the concentration gradient of the first chemical species is approximately perpendicular to the concentration gradient of the second chemical substance, so that the concentration condition of the first chemical species and the concentration of the second chemical species 99. The method of item 96, wherein an array of conditions is produced.
(98)
98. The method of item 97, wherein diffusion of the first species and second species occurs in a shallow chamber.
(99)
98. The method of item 97, wherein the diffusion of the first and second species occurs in a set of orthogonally oriented microfluidic flow channels.
(100)
A method for introducing a drug into a subject comprising:
Placing a first static fluid containing the drug into a microfluidic device;
Placing a second fluid in the microfluidic device between the first stationary fluid and the subject;
Establishing a microfluidic free interface between the first fluid and the second fluid, so that a predetermined amount of the drug diffuses to a predetermined time Reaching the subject only after,
Including the method.
(101)
101. The method of item 100, wherein the time of diffusion of the drug into the subject is determined by the dimensions of a channel in the microfluidic device disposed between the subject and the first fluid.
(102)
A method for controlling the concentration of reactants during a chemical reaction, comprising:
Placing a first stationary fluid containing a first reactant into a microfluidic structure;
Placing a second fluid into the microfluidic structure near the first stationary fluid, wherein the second stationary fluid contains a second reactant;
Establishing a microfluidic free interface between the first fluid and the second fluid;
Allowing diffusion between the first fluid and a second fluid across the microfluidic free sea surface to determine a relative concentration of the first and second reactants;
Including the method.

本発明に従う、複数の化学混合物を一定の数の入口から調製するための方法の実施形態は、第一の入口からミクロ流体混合構造体までのある体積の第一の化学物質を計量供給する工程、ならびに第二の入口からミクロ流体混合構造体までの第二の体積の第二の化学物質を計量供給して、第一の化学物質および第二の化学物質を含有する第一の混合物を生成する工程を包含する。この第一の混合物は、ミクロ流体混合構造体から流出され、そして第一の化学物質の体積が、第一の入口からミクロ流体混合構造体まで、再度計量供給される。第三の入口からミクロ流体混合構造体までの、ある体積の第三の化学物質が計量供給されて、第一の化学物質および第三の化学物質を含有する第二の混合物が生成される。 An embodiment of a method for preparing a plurality of chemical mixtures from a fixed number of inlets in accordance with the present invention comprises metering a volume of a first chemical from a first inlet to a microfluidic mixing structure. , And a second volume of second chemical from the second inlet to the microfluidic mixing structure to produce a first mixture containing the first chemical and the second chemical The process of carrying out is included. This first mixture flows out of the microfluidic mixing structure and the volume of the first chemical is metered again from the first inlet to the microfluidic mixing structure. A volume of a third chemical from the third inlet to the microfluidic mixing structure is metered to produce a second mixture containing the first chemical and the third chemical.

本発明に従う装置の実施形態は、第一のエラストマー層に形成されたミクロ流体フローチャネルネットワークを備え、このミクロ流体フローチャネルネットワークは、接合部および試薬供給源と流体連絡する、第一のセットの入口分枝を備える。第二のセットの入口分枝が、接合部および緩衝剤居急減と流体連絡している。混合構造体が、接合部および出口と流体連絡している。第一の制御チャネルネットワークが、第一のエラストマー層に隣接する第二のエラストマー層に形成され、この第一の制御チャネルネットワークは、第一の入口分枝セットに隣接して、選択試薬を接合部に流すように構成された第一のマルチプレクサ構造体を規定する。第二の制御チャネルネットワークが、第二のエラストマー層に形成され、この第二の制御チャネルネットワークは、第二の入口分枝セットに隣接して、選択緩衝剤を接合部に流すように構成された第二のマルチプレクサ構造体を規定する。 An embodiment of the device according to the invention comprises a microfluidic flow channel network formed in a first elastomer layer, the microfluidic flow channel network being in fluid communication with a junction and a reagent source. Provide an entrance branch. A second set of inlet branches is in fluid communication with the junction and buffer depletion. A mixing structure is in fluid communication with the junction and the outlet. A first control channel network is formed in a second elastomer layer adjacent to the first elastomer layer, the first control channel network adjacent to the first inlet branch set and joining the selection reagent. A first multiplexer structure configured to flow through the portion is defined. A second control channel network is formed in the second elastomer layer, and the second control channel network is configured to flow a selective buffer to the junction adjacent to the second inlet branch set. A second multiplexer structure is defined.

本発明に従う、結晶化を導く条件を同定するための方法の実施形態は、溶媒およびサンプルを第一の濃度で含有する第一の溶液を調製する工程、および第一の溶液と、結晶化剤を含有する第二の溶液とを混合する工程を包含する。この混合物において固相が最初に出現する第一の条件が、記録される。さらなる溶媒がこの混合物に添加され、そしてこの混合物における固相が消失する第二の条件が記録される。第一の条件と第二の条件との間のヒステリシスが同定される。 An embodiment of a method for identifying conditions leading to crystallization according to the present invention comprises the steps of preparing a first solution containing a solvent and a sample at a first concentration, and the first solution and the crystallization agent And a second solution containing The first condition at which the solid phase first appears in this mixture is recorded. Additional solvent is added to the mixture and the second condition at which the solid phase in the mixture disappears is recorded. A hysteresis between the first condition and the second condition is identified.

本発明に従う、結晶化を導く条件を同定する方法の実施形態は、結晶化剤がサンプルを含有する溶液と混合される際の光散乱を検出する工程、および検出された散乱光を、タンパク質結晶含有溶液に特徴的な既知の範囲の第二のビリアル係数で補正する工程を包含する。 An embodiment of a method for identifying conditions leading to crystallization according to the present invention comprises the steps of detecting light scattering when a crystallization agent is mixed with a solution containing a sample, and detecting the scattered light as protein crystals. Correcting with a known range of second virial coefficients characteristic of the containing solution.

本発明に従う、ミクロ流体デバイスを通る流れを制御するための方法の実施形態は、フローチャネルに流体を入れる工程、およびこのフローチャネルに隣接しかつこのフローチャネルから離れた制御チャネルに圧力を付与して、介在するエラストマー膜をフローチャネル内に偏向させる工程を包含する。このフローチャネル中の流体のベースライン圧力は、５ｐｓｉｇより高く維持され、一方で、制御チャネルに付与される圧力は緩和されて、このエラストマー膜を、フローチャネルの外に付勢する。 An embodiment of a method for controlling flow through a microfluidic device in accordance with the present invention includes injecting fluid into a flow channel and applying pressure to a control channel adjacent to and away from the flow channel. And deflecting the intervening elastomeric membrane into the flow channel. The baseline pressure of the fluid in the flow channel is maintained above 5 psig, while the pressure applied to the control channel is relaxed to urge the elastomeric membrane out of the flow channel.

本発明に従う、２つの流体を混合するための方法の実施形態は、第一の静止流体を配置する工程、および第二の流体をこの第一の静止流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程を包含する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、この界面を横切る、第一の流体と第二の流体との間の混合は、実質的に、拡散のみによって起こる。 An embodiment of a method for mixing two fluids in accordance with the present invention comprises placing a first stationary fluid and placing a second fluid proximate to the first stationary fluid so that the fluid interface is Forming. The convection of the first fluid and the second fluid is suppressed, so that mixing between the first fluid and the second fluid across this interface occurs substantially only by diffusion.

本発明に従う、２つの流体を混合するための方法の別の実施形態は、全体積を有する第一の静止流体を提供する工程、および全体積を有する第二の静止流体を提供する工程を包含する。第一の静止流体お一部分が、第二の静止流体の一部分と接触して配置されて、流体界面を形成し、その結果、最良体積の第一の流体および第二の流体が、流体界面にすぐ沿って存在する最も激しい濃度勾配に曝露される。 Another embodiment of a method for mixing two fluids according to the present invention includes providing a first stationary fluid having a total volume and providing a second stationary fluid having a total volume. To do. A portion of the first stationary fluid is placed in contact with a portion of the second stationary fluid to form a fluid interface so that the best volume of the first fluid and the second fluid are at the fluid interface. You are exposed to the most intense concentration gradient that exists along the way.

本発明に従う、流体系の特性を決定するための方法の実施形態は、標的を含有するだいいちのっ性知る謡を配置する工程、および第二の静止流体をこの第一の流体の近くに配置して、流体界面を形成する工程を包含する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、この界面を横切る混合は、拡散のみによって起こり、物理特性を明らかにする。 An embodiment of a method for determining the properties of a fluid system according to the present invention comprises the steps of placing a knowing trap containing a target, and placing a second stationary fluid proximate to the first fluid And forming a fluid interface. Convection of the first fluid and the second fluid is suppressed, so that mixing across this interface occurs only by diffusion and reveals physical properties.

本発明に従う、標的材料の特性を分析するための構造体は、標的を含有するある体積の第一の静止流体を含むように構成された、第一の微小製造された領域を備える。第二の微小製造された領域は、この標的に結合することが公知である分析物を含有する、ある体積の第二の静止流体を含むように構成される。弁が、フリーミクロ流体界面を横切って、第一の流体の体積を第二の流体の体積と拡散連絡させて配置するように作動可能である。検出器は、第一の微小製造された領域における分析物の存在を検出するように構成される。 A structure for analyzing the properties of a target material according to the present invention comprises a first microfabricated region configured to include a volume of a first stationary fluid containing a target. The second microfabricated region is configured to contain a volume of a second stationary fluid containing an analyte known to bind to this target. A valve is operable to position the first fluid volume in diffusive communication with the second fluid volume across the free microfluidic interface. The detector is configured to detect the presence of an analyte in the first microfabricated region.

本発明に従う、タンパク質サンプル中の低分子の濃度を減少させるための方法の実施形態は、タンパク質サンプルを含有する第一の静止流体を、ミクロ流体チャネルに入れる工程を包含する。低濃度の低分子を有する第二の静止流体が、第一の流体の近くに配置されて、流体界面を形成する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、第一の静止流体からの低分子が、拡散のみによって、この界面を横切って拡散し、第一の静止流体中に存在する低分子の濃度を減少させる。 An embodiment of a method for reducing the concentration of small molecules in a protein sample according to the present invention comprises placing a first stationary fluid containing the protein sample into a microfluidic channel. A second stationary fluid having a low concentration of small molecules is placed near the first fluid to form a fluid interface. Convection of the first fluid and the second fluid is suppressed, so that small molecules from the first stationary fluid diffuse across this interface by diffusion only and are present in the first stationary fluid Reduce the concentration of small molecules.

本発明に従う、リガンドと標的との間の反応を決定するための方法は、リガンドを含有する第一の流体を第一のチャンバに入れる工程、および標的を含有する第二の流体を第二のチャンバに入れる工程を包含する。ミクロ流体フリー界面が、第一の流体と第二の流体との間で、第一のチャンバと第二のチャンバとを接続しているチャネル内に確立される。混合が、第一の流体と第二の流体との間のミクロ流体仮面を横切る拡散によって起こり、その結果、リガンドが標的に結合して、リガンドと標的との間の反応性が、標的の非存在下で予測される対応するプロフィールからの、一時的な拡散プロフィールおよび空間拡散プロフィールのうちの少なくとも１つの偏差によって、決定され得る。 According to the present invention, a method for determining a reaction between a ligand and a target comprises: placing a first fluid containing a ligand into a first chamber; and passing a second fluid containing the target into a second fluid. Including the step of entering the chamber. A microfluidic free interface is established in the channel connecting the first and second chambers between the first fluid and the second fluid. Mixing occurs by diffusion across the microfluidic mask between the first fluid and the second fluid so that the ligand binds to the target and the reactivity between the ligand and the target becomes non-targeted. It can be determined by the deviation of at least one of the temporal and spatial diffusion profiles from the corresponding profile expected in the presence.

一連の条件下で化学反応をサンプリングする方法は、第一の反応物を含有する第一の流体と、第二の反応物を含有する第二の流体との間に、ミクロ流体フリー界面を形成する工程、およびこの第一の反応物を第二の流体中に拡散させて、第一の反応物の濃度勾配を生成する工程を包含する。この勾配に沿った種々の濃度の第一の反応物と、第二の反応物との間の反応が観察される。 A method of sampling a chemical reaction under a series of conditions forms a microfluidic free interface between a first fluid containing a first reactant and a second fluid containing a second reactant. And diffusing the first reactant into the second fluid to produce a concentration gradient of the first reactant. Reactions between various concentrations of the first and second reactants along this gradient are observed.

本発明に従う、化学種の濃度勾配を生成する方法の実施形態は、この化学種を含有する第一の流体を配置する工程、および第二の静止流体をこの第一の静止流体の近くに配置して、ミクロ流体フリー界面を形成する工程を包含する。第一の流体および第二の流体の対流が抑制され、その結果、ミクロ流体フリー界面を横切る第一の流体と第二の流体との間での混合が、実質的に拡散のみによって起こり、そして化学種の濃度勾配が生成される。 An embodiment of a method for generating a concentration gradient of a chemical species according to the present invention includes the steps of placing a first fluid containing the chemical species, and placing a second stationary fluid in proximity to the first stationary fluid And forming a microfluidic free interface. Convection of the first fluid and the second fluid is suppressed, so that mixing between the first fluid and the second fluid across the microfluidic free interface occurs substantially only by diffusion, and A concentration gradient of the chemical species is generated.

本発明に従う、薬物を被験体に導入するための方法の実施形態は、この薬物を含有する第一の静止流体をミクロ流体デバイスに入れる工程、およびこの第一の静止流体と被験体との間のミクロ流体デバイスに、第二の流体を配置する工程を包含する。ミクロ流体フリー界面が、第一の流体と第二の流体との間に確立され、その結果、予め決定された量の薬物が拡散して、予め決定された時間の後のみに、被験体に達する。 An embodiment of a method for introducing a drug into a subject according to the present invention includes placing a first stationary fluid containing the drug into a microfluidic device, and between the first stationary fluid and the subject. Placing a second fluid in the microfluidic device. A microfluidic free interface is established between the first fluid and the second fluid so that a predetermined amount of drug diffuses and only after a predetermined time to the subject. Reach.

本発明に従う、化学反応の間の反応物の濃度を制御するための方法の実施形態は、第一の反応物を含有する第一の静止流体をミクロ流体構造体に入れる工程、および第二の流体を、この第一の静止流体の近くで、ミクロ流体構造体に入れる工程を包含し、この第二の静止流体は、第二の反応物を含有する。ミクロ流体フリー界面が、第一の流体と第二の流体との間に確立される；このミクロ流体フリー界面を横切って、第一の流体と第二の流体との間で拡散させて、第一の反応物と第二の反応物との相対濃度を決定する。本発明のこれらおよび他の実施形態、ならびにその利点および特徴は、以下の本文および添付の図面とあわせてより詳細に記載される。 An embodiment of a method for controlling the concentration of a reactant during a chemical reaction according to the present invention includes placing a first stationary fluid containing a first reactant into a microfluidic structure, and a second Including a fluid in the microfluidic structure near the first stationary fluid, the second stationary fluid containing a second reactant. A microfluidic free interface is established between the first fluid and the second fluid; diffusing between the first fluid and the second fluid across the microfluidic free interface, The relative concentration of one reactant and the second reactant is determined. These and other embodiments of the present invention, as well as its advantages and features, are described in more detail in conjunction with the following text and accompanying drawings.

図１は、微細機械加工鋳型の上部に形成された第１のエラストマー層の概略図である。FIG. 1 is a schematic view of a first elastomer layer formed on top of a micromachined mold. 図２は、微細機械加工鋳型の上部に形成された第２のエラストマー層の概略図である。FIG. 2 is a schematic view of a second elastomer layer formed on top of a micromachined mold. 図３は、微細機械加工鋳型から取り外され、図１のエラストマー層の上部の上に配置された、図２のエラストマー層の概略図である。3 is a schematic view of the elastomeric layer of FIG. 2 removed from the micromachined mold and placed on top of the elastomeric layer of FIG. 図４は、図３に対応する概略図であるが、第１のエラストマー層の上部の上に配置された第２のエラストマー層を示す。FIG. 4 is a schematic view corresponding to FIG. 3, but showing a second elastomer layer disposed on top of the first elastomer layer. 図５は、図４に対応する概略図であるが、一緒に結合した第１および第２のエラストマー層を示す。FIG. 5 is a schematic view corresponding to FIG. 4, but showing the first and second elastomer layers bonded together. 図６は、図５に対応する概略図であるが、取り外された第１の微細機械加工した鋳型および適切な位置に配置された平面基板を示す。FIG. 6 is a schematic view corresponding to FIG. 5 but showing the removed first micromachined mold and the planar substrate in place. 図７Ａは、図６に対応する概略図であるが、平面基板上に密封されたエラストマー構造体を示す。FIG. 7A is a schematic view corresponding to FIG. 6, but showing the elastomeric structure sealed on a planar substrate. 図７Ｂは、図７Ａに対応する正面断面図であり、開口フローチャネルを示す。FIG. 7B is a front cross-sectional view corresponding to FIG. 7A, showing an open flow channel. 図７Ｃは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。FIG. 7C is a schematic diagram illustrating the steps of a method for forming an elastomeric structure having a membrane formed from separated elastomeric layers. 図７Ｄは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。FIG. 7D is a schematic illustrating the steps of a method for forming an elastomeric structure having a membrane formed from separated elastomeric layers. 図７Ｅは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。FIG. 7E is a schematic showing the steps of a method for forming an elastomeric structure having a membrane formed from separated elastomeric layers. 図７Ｆは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。FIG. 7F is a schematic diagram illustrating the steps of a method for forming an elastomeric structure having a membrane formed from separated elastomeric layers. 図７Ｇは、分離したエラストマー層から形成される膜を有するエラストマー構造体を形成するための方法の工程を示す概略図である。FIG. 7G is a schematic diagram illustrating the steps of a method for forming an elastomeric structure having a membrane formed from separated elastomeric layers. 図７Ｈは、作動した状態の図７Ｂのバルブを示す正面断面図である。FIG. 7H is a front cross-sectional view showing the valve of FIG. 7B in an activated state. 図８Ａは、種々のフローチャネルについての、バルブ開口対加えられた圧力を示す。FIG. 8A shows valve opening versus applied pressure for various flow channels. 図８Ｂは、種々のフローチャネルについての、バルブ開口対加えられた圧力を示す。FIG. 8B shows valve opening versus applied pressure for various flow channels. 図９は、１００μｍ×１００μｍ×１０μｍＲＴＶミクロバルブの時間応答を示す。FIG. 9 shows the time response of a 100 μm × 100 μm × 10 μm RTV microvalve. 図１０は、膜の作動を示す図７Ｂのバルブの正面断面図である。FIG. 10 is a front cross-sectional view of the valve of FIG. 7B showing the operation of the membrane. 図１１は、湾曲した上面を有するフローチャネルを有するバルブの代替の実施形態の正面図である。FIG. 11 is a front view of an alternative embodiment of a valve having a flow channel with a curved top surface. 図１２Ａは、オン／オフバルブの上部概略図である。FIG. 12A is a schematic top view of the on / off valve. 図１２Ｂは、図１２Ａにおける線２３Ｂ−２３Ｂに沿った断面立面図である。12B is a sectional elevation view taken along line 23B-23B in FIG. 12A. 図１３Ａは、蠕動ポンピングシステムの上部概略図である。FIG. 13A is a top schematic view of a peristaltic pumping system. 図１３Ｂは、図１３Ａにおける線２４Ｂ−２４Ｂに沿った断面立面図である。FIG. 13B is a sectional elevation view along line 24B-24B in FIG. 13A. 図１４は、図１３の蠕動ポンピングシステムの１実施形態についての、実験的に達成されたポンピング速度対周波数を示すグラフである。FIG. 14 is a graph showing experimentally achieved pumping speed versus frequency for one embodiment of the peristaltic pumping system of FIG. 図１５Ａは、複数のフローラインを同時に作動する１つの制御ラインの上部概略図である。FIG. 15A is a schematic top view of one control line that operates multiple flow lines simultaneously. 図１５Ｂは、図１５Ａの線２６Ｂ−２６Ｂに沿った断面立面図である。FIG. 15B is a cross-sectional elevation view taken along line 26B-26B of FIG. 15A. 図１６は、種々のチャネルを通って流れ得るように適合された多重システムの概略図である。FIG. 16 is a schematic diagram of a multiplex system adapted to flow through various channels. 図１７Ａは、本発明に従った組合せ混合デバイスの１つの実施形態の平面図を示す。FIG. 17A shows a plan view of one embodiment of a combination mixing device according to the present invention. 図１７Ｂは、図１７Ａの組合せ混合デバイスの一部分の拡大平面図を示す。FIG. 17B shows an enlarged plan view of a portion of the combination mixing device of FIG. 17A. 図１８は、注入スラグの数に対する注入体積をプロットする。FIG. 18 plots the injection volume against the number of injection slugs. 図１９は、注入スラグの数に対する濃度のプロットを示す。FIG. 19 shows a plot of concentration against the number of injected slugs. 図２０Ａは、切替可能なフローアレイのエラストマーの第１の層（すなわち、フローチャネル層）の底面図である。FIG. 20A is a bottom view of a first layer of elastomer (ie, a flow channel layer) of a switchable flow array. 図２０Ｂは、切替可能なフローアレイの制御チャネル層の底面図である。FIG. 20B is a bottom view of the control channel layer of the switchable flow array. 図２０Ｃは、図２０Ｂの第２の層のエラストマー内に一組の制御チャネルを有する、図２０Ａの第１の層のエラストマーの整列を示す。FIG. 20C shows the alignment of the first layer of elastomer of FIG. 20A with a set of control channels within the second layer of elastomer of FIG. 20B. 図２０Ｄは、図２０Ｂの第２の層のエラストマー内に他の組の制御チャネルを有する、図２０Ａの第１の層のエラストマーの整列を示す。FIG. 20D shows the alignment of the first layer of elastomer of FIG. 20A with another set of control channels within the second layer of elastomer of FIG. 20B. 図２１は、本発明に従った回転ミキサ構造体の１つの実施形態の平面図を示す。FIG. 21 shows a plan view of one embodiment of a rotating mixer structure according to the present invention. 図２２は、本発明に従った組合せ混合ミキサ構造体のアレイの平面図を示す。FIG. 22 shows a plan view of an array of combinatorial mixing mixer structures according to the present invention. 図２３は、図２２に記載の組合せ混合構造体のアレイの拡大図を示す。FIG. 23 shows an enlarged view of the array of combinatorial mixed structures described in FIG. 図２４は、タンパク質および沈殿化剤の混合物の位相空間を示す。FIG. 24 shows the phase space of the protein and precipitating agent mixture. 図２５は、タンパク質および沈殿化剤の位相空間におけるヒステリシス効果を示す。FIG. 25 shows the hysteresis effect in the phase space of the protein and the precipitating agent. 図２６Ａは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２６Ｂは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２６Ｃは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２６Ｄは、本発明に従うセルペン構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。FIG. 26A shows a plan view illustrating the operation of one embodiment of a serpen structure according to the present invention. FIG. 26B shows a plan view illustrating the operation of one embodiment of a serpen structure according to the present invention. FIG. 26C shows a plan view illustrating the operation of one embodiment of a serpen structure according to the present invention. FIG. 26D shows a plan view illustrating the operation of one embodiment of a serpen structure according to the present invention. 図２７Ａは、本発明に従うセルケージ構造体の１実施形態の操作を示す平面図を示す。図２７Ｂは、本発明に従うセルケージ構造体の１実施形態の操作を示す断面図を示す。FIG. 27A shows a plan view illustrating the operation of one embodiment of a cell cage structure according to the present invention. FIG. 27B shows a cross-sectional view illustrating the operation of one embodiment of a cell cage structure according to the present invention. 図２８Ａは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。図２８Ｂは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。図２８Ｃは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。図２８Ｄは、本発明の実施形態に従う交差チャネル注入を利用する配線構造体の操作の平面図を示す。FIG. 28A shows a top view of the operation of a wiring structure utilizing cross channel implantation in accordance with an embodiment of the present invention. FIG. 28B shows a plan view of the operation of a wiring structure utilizing cross channel implantation in accordance with an embodiment of the present invention. FIG. 28C shows a top view of the operation of a wiring structure utilizing cross channel implantation in accordance with an embodiment of the present invention. FIG. 28D shows a top view of the operation of a wiring structure utilizing cross channel implantation in accordance with an embodiment of the present invention. 図２９Ａ〜Ｄは、本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面を横切って拡散する際の２つの流体に対する、濃度と距離をプロットする簡略化した概略図である。29A-D are simplified schematic diagrams plotting concentration and distance for two fluids as they diffuse across a microfluidic free interface in accordance with an embodiment of the present invention. 図３０Ａ〜Ｂは、キャピラリーチューブにおけるミクロ流体フリー界面の意図的に形成することの簡略した断面図を示す。30A-B show simplified cross-sectional views of intentional formation of a microfluidic free interface in a capillary tube. 図３１Ａ〜Ｂは、圧力によって駆動されたポアズイユ流の放物線上の速度分布から生じる、キャピラリーチューブ中の第１の溶液と第２の溶液との間の対流による混合の簡略化した断面図を示す。FIGS. 31A-B show simplified cross-sectional views of convective mixing between a first solution and a second solution in a capillary tube resulting from a velocity distribution on a Poiseuille flow parabola driven by pressure. . 図３２Ａ〜Ｃは、第１の溶液と第２の溶液との間のキャプラリーチューブにおける相互作用の簡略化した断面図を示し、ここで、その第１の溶液の密度は、その第２の溶液の密度よりも大きい。FIGS. 32A-C show simplified cross-sectional views of the interaction in the Capraly tube between the first solution and the second solution, where the density of the first solution is the second solution density. Greater than the density of the solution. 図３３Ａは、本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面の簡略化した断面図を示す。図３３Ｂは、従来の非ミクロ流体界面の簡略化した断面図を示す。FIG. 33A shows a simplified cross-sectional view of a microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention. FIG. 33B shows a simplified cross-sectional view of a conventional non-microfluidic interface. 図３４は、フローチャネルの開始および本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面の形成の平面図を示す。FIG. 34 shows a plan view of the initiation of a flow channel and the formation of a microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention. 図３５は、ミクロ流体フリー界面をつくる「ブレイクスルー」バルブの使用の簡略した概略図を示す。FIG. 35 shows a simplified schematic diagram of the use of a “breakthrough” valve to create a microfluidic free interface. 図３６Ａは、タンパク質結晶が、従来型のマクロスコピックフリー界面拡散技術を利用して形成されることの簡略化した概略図を示す。図３６Ｂは、タンパク質結晶が、本発明の実施形態に従ったミクロ流体フリー界面を利用して形成されることの簡略化した概略図を示す。FIG. 36A shows a simplified schematic of protein crystals being formed using conventional macroscopic free interfacial diffusion techniques. FIG. 36B shows a simplified schematic of protein crystals being formed utilizing a microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention. 図３７Ａは、別個に作動される界面バルブのいずれかの側面上に位置づけられたジグザグ型の制御チャネルによって間隔をあけて重ねあわされたフローチャネルが、複数のチャンバ（Ａ〜Ｇ）を規定することの簡略化した平面図を示す。図３７Ｂ〜Ｄは、図３７Ａにおいて示されたフローチャネルについての様々な時間における溶媒濃度をプロットする。図３７Ｂ〜Ｄは、図３７Ａにおいて示されたフローチャネルについての様々な時間における溶媒濃度をプロットする。図３７Ｂ〜Ｄは、図３７Ａにおいて示されたフローチャネルについての様々な時間における溶媒濃度をプロットする。FIG. 37A shows that flow channels spaced apart by zigzag control channels positioned on either side of separately actuated interface valves define a plurality of chambers (A-G). A simplified plan view of this is shown. FIGS. 37B-D plot the solvent concentration at various times for the flow channel shown in FIG. 37A. FIGS. 37B-D plot the solvent concentration at various times for the flow channel shown in FIG. 37A. FIGS. 37B-D plot the solvent concentration at various times for the flow channel shown in FIG. 37A. 図３８Ａは、異なる長さのミクロチャネルによって接続されたチャンバ対の３つのセットを示す。FIG. 38A shows three sets of chamber pairs connected by microchannels of different lengths. 図３８Ｂは、「平衡時間」対「チャネル長」をプロットものである。FIG. 38B is a plot of “equilibrium time” versus “channel length”. 図３９は、４対のチャンバを示し、このチャンバの各々は、ミクロチャネルを接続する様々な配置を有する。FIG. 39 shows four pairs of chambers, each of which has various arrangements connecting the microchannels. 図４０Ａは、本発明に従ったミクロ流体構造体の簡単な実施形態の平面図を示す。FIG. 40A shows a plan view of a simple embodiment of a microfluidic structure according to the present invention. 図４０Ｂは、図４０Ａの構造体についての、「濃度」対「距離」の簡単なプロットである。FIG. 40B is a simple plot of “concentration” versus “distance” for the structure of FIG. 40A. 図４１は、「図４０のレザバのうちの１つにおける濃度が最終平衡濃度である０．６に達するための時間」対「チャネル長」をプロットする。FIG. 41 plots “time to reach a final equilibrium concentration of 0.6 in one of the reservoirs of FIG. 40” versus “channel length”. 図４２は、「図４０のレザバのうちの１つにおける濃度が最終平衡濃度である０．６に達するための時間（Ｔ_０．６）の逆数」対「図４０の流体界面の面積」を示す。FIG. 42 shows “the reciprocal of the time (T _0.6 ) for the concentration in one of the reservoirs of FIG. 40 to reach the final equilibrium concentration of 0.6” versus “the area of the fluid interface of FIG. 40”. Show. 図４３は、流体Ａと流体Ｂとの間の位相空間を示す相図を提示し、そして、その位相空間における経路が、レザバ中を横断し、その流体が図４０に記載のミクロ流体フリー界面を横切って拡散するときに、その位相空間における経路が横切ることを示す挿図を提供する。FIG. 43 presents a phase diagram showing the phase space between fluid A and fluid B, and the path in that phase space traverses through the reservoir and the fluid is a microfluidic free interface as described in FIG. Provides an illustration showing that the path in that phase space traverses when diffusing across. 図４４は、本発明に従ったチップホルダーの１実施形態の拡大図を示す。FIG. 44 shows an enlarged view of one embodiment of a tip holder according to the present invention. 図４５Ａは、実験結果を得るために使用したチップの代替的実施形態のの簡略化した平面図を示す。FIG. 45A shows a simplified plan view of an alternative embodiment of a chip used to obtain experimental results. 図４５Ｂは、図４５Ａにおいてい示されたチップの３化合物ウェルのセットの簡略化した拡大平面図を示す。FIG. 45B shows a simplified enlarged plan view of a set of three compound wells of the chip shown in FIG. 45A. 図４５Ｃは、図４５Ａ〜Ｂの化合物ウェルの簡略化した断面図を示す。FIG. 45C shows a simplified cross-sectional view of the compound well of FIGS. 図４６は、流れる流体と一端が閉じた分岐チャネルとの間にミクロ流体フリー界面の生成の平面図を示す。FIG. 46 shows a plan view of the creation of a microfluidic free interface between the flowing fluid and the branch channel closed at one end. 図４７は、異なる次元で２つの異なる種の拡散勾配を生成するための本発明に従ったミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。FIG. 47 shows a simplified plan view of one embodiment of a microfluidic structure according to the present invention for generating two different species of diffusion gradients in different dimensions. 図４８は、異なる次元で２つの異なる種の拡散勾配を生成するための本発明に従ったミクロ流体構造体の代替的実施形態の簡略化した平面図を示す。FIG. 48 shows a simplified plan view of an alternative embodiment of a microfluidic structure according to the present invention for generating two different species of diffusion gradients in different dimensions. 図４９は、本発明の実施形態に従った貯蔵デバイスの簡略化した平面図を示す。FIG. 49 shows a simplified plan view of a storage device according to an embodiment of the present invention. 図５０は、本発明に従った交差フロー注入システムの１つの実施形態について、「Ｌｏｇ（Ｒ／Ｂ）」対「注入されたスラグの数」をプロットする。FIG. 50 plots “Log (R / B)” vs. “Number of injected slags” for one embodiment of a cross-flow injection system according to the present invention. 図５１は、本発明に従った交差フロー注入構造体の１つの実施形態の、操作の間の、「注入された体積」対「注入サイクル」をプロットする。FIG. 51 plots “injected volume” versus “injection cycle” during operation of one embodiment of a cross-flow injection structure in accordance with the present invention. 図５２は、本発明に従ったミクロ流体チップを利用する結晶化ヒットのプロットを示す。FIG. 52 shows a plot of crystallization hits utilizing a microfluidic chip according to the present invention. 図５３Ａ〜Ｂは、本発明の１実施形に従った結晶成長／回収チップの１実施形態の平面図および断面図を示す。53A-B show top and cross-sectional views of one embodiment of a crystal growth / recovery chip according to one embodiment of the present invention. 図５４Ａは、本発明に従った組合せ混合／貯蔵構造体の１つの実施形態の平面図を示す。FIG. 54A shows a plan view of one embodiment of a combined mixing / storage structure according to the present invention. 図５４Ｂは、図５４Ａの構造体の混合部分の拡大図を示す。FIG. 54B shows an enlarged view of the mixing portion of the structure of FIG. 54A. 図５４Ｃは、図５４Ａの構造体の貯蔵アレイの拡大図を示す。FIG. 54C shows an enlarged view of the storage array of the structure of FIG. 54A. 図５４Ｄは、図５４Ｃの構造体の貯蔵アレイの１つのセルの拡大図を示す。FIG. 54D shows an enlarged view of one cell of the storage array of the structure of FIG. 54C. 図５５は、ある種の高分子溶媒の組合せの位相空間の一部分を規定するための、「高分子濃度」対「溶媒濃度」をプロットする。FIG. 55 plots “polymer concentration” versus “solvent concentration” to define a portion of the phase space of certain polymer solvent combinations. 図５６Ａ〜Ｆは、図５５に示された位相空間の種々の領域におけるギブス自習エネルギー図である。56A-F are Gibbs self-study energy diagrams in various regions of the phase space shown in FIG. 図５７は、多くの結晶化アプローチによって達成された図５５に示される位相空間におけるトラジェクトリーをプロットしたものである。FIG. 57 is a plot of trajectories in the phase space shown in FIG. 55 achieved by many crystallization approaches. 図５８Ａ〜Ｄは、開閉蛇行型貯蔵ラインを利用する貯蔵技術の概略図を例示する。58A-D illustrate schematic diagrams of storage technologies that utilize open and close serpentine storage lines. 図５８Ａ〜Ｄは、開閉蛇行型貯蔵ラインを利用する貯蔵技術の概略図を例示する。58A-D illustrate schematic diagrams of storage technologies that utilize open and close serpentine storage lines. 図５９は、マルチプレクサが並列貯蔵チャネルに実験条件の各々を指向させるために使用される実施形態の概略図を例示する。FIG. 59 illustrates a schematic diagram of an embodiment in which a multiplexer is used to direct each of the experimental conditions to a parallel storage channel. 図６０は、反応条件の各々が、貯蔵ラインの一端に対して満たされた閉じた一端である実施形態の概略図を例示する。FIG. 60 illustrates a schematic diagram of an embodiment where each of the reaction conditions is a closed end filled against one end of the storage line. 図６１Ａ〜図６１Ｆは、膜タンパク質を溶解するための本発明に従った方法の実施形態の概略図を示す。61A-61F show a schematic diagram of an embodiment of a method according to the present invention for dissolving membrane proteins. 図６１Ａ〜図６１Ｆは、膜タンパク質を溶解するための本発明に従った方法の実施形態の概略図を示す。61A-61F show a schematic diagram of an embodiment of a method according to the present invention for dissolving membrane proteins. 図６２Ａは、本発明に従った拡散分析を実施するためのミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。FIG. 62A shows a simplified plan view of one embodiment of a microfluidic structure for performing diffusion analysis according to the present invention. 図６２Ｂは、図４５Ａにおいて示された構造体についての、予測された、「シグナル強度」対「拡散時間」、ならびに観察された、「シグナル強度」対「拡散強度」をプロットする。FIG. 62B plots the predicted “signal intensity” versus “diffusion time” as well as the observed “signal intensity” versus “diffusion intensity” for the structure shown in FIG. 45A. 図６３Ａは、本発明に従った拡散分析を実施するためのミクロ流体構造体の代替的実施形態の簡略化した平面図を示す。FIG. 63A shows a simplified plan view of an alternative embodiment of a microfluidic structure for performing diffusion analysis according to the present invention. 図６３Ｂにおいて、図４６Ａに示された構造体に関する、予測された、「シグナル強度」対「拡散距離」、ならびにその観察された「シグナル強度」対「拡散距離」がプロットされる。In FIG. 63B, the predicted “signal intensity” vs. “diffusion distance” as well as its observed “signal intensity” vs. “diffusion distance” for the structure shown in FIG. 46A are plotted. 図６４は、セルケージへまたセルケージからの栄養および廃物質のミクロ流体フリー界面を横切る拡散の平面図を示す。FIG. 64 shows a top view of diffusion across the microfluidic free interface of nutrients and waste materials into and out of the cell cage. 図６５は、競合結合アッセイを実施するための本発明に従ったミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。FIG. 65 shows a simplified plan view of one embodiment of a microfluidic structure according to the present invention for performing a competitive binding assay. 図６６は、競合結合アッセイを実施するための本発明に従ったミクロ流体構造体の代替的実施形態の簡略化した平面図を示す。FIG. 66 shows a simplified plan view of an alternative embodiment of a microfluidic structure according to the present invention for performing a competitive binding assay. 図６７は、基質代謝回転アッセイを実施するための本発明に従ったミクロ流体構造体の１つの実施形態の簡略化した平面図を示す。FIG. 67 shows a simplified plan view of one embodiment of a microfluidic structure according to the present invention for performing a substrate turnover assay.

（発明の詳細な説明）
（Ｉ．微細製作（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）の概説）
以下の考察は、米国特許出願０９／８２６，５８５号（２００１年４月６日出願）、同第０９／７２４，７８４号（２０００年１１月２８日出願）、および同第０９／６０５，５２０号（２０００年６月２７日出願）に一般的に記載される、エラストマー材料を利用した、微細製作された流体デバイスの形成に関する。これらの特許出願は、本明細書中に参考として援用される。 (Detailed description of the invention)
(I. Overview of microfabrication)
The following considerations are discussed in U.S. Patent Application Nos. 09 / 826,585 (filed April 6, 2001), 09 / 724,784 (filed November 28, 2000), and 09 / 605,520. No. (filed Jun. 27, 2000) relates to the formation of microfabricated fluidic devices utilizing elastomeric materials. These patent applications are hereby incorporated by reference.

（１．製造方法）
本発明の例示的な製造方法を本明細書中に提供する。本発明は、これらの方法のうちの１つまたは他のものによる製造に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、本発明の微細構造の他の適切な製造方法（本発明を改変することを含む）もまた意図される。 (1. Manufacturing method)
Exemplary manufacturing methods of the present invention are provided herein. It should be understood that the present invention is not limited to manufacture by one or other of these methods. Rather, other suitable manufacturing methods of the microstructure of the present invention (including modifications of the present invention) are also contemplated.

図１〜図７Ｂは、本発明の微細構造（これは、ポンプまたはバルブとして用いられ得る）の第一の好ましい製造方法の連続工程を図示する。図８〜図１８は、本発明の微細構造（これもまた、ポンプまたはバルブとして用いられ得る）の第二の好ましい製造方法の連続工程を図示する。 1-7B illustrate the sequential steps of the first preferred method of manufacturing the microstructure of the present invention, which can be used as a pump or valve. FIGS. 8-18 illustrate the successive steps of a second preferred method of manufacturing the microstructure of the present invention (which can also be used as a pump or valve).

説明するように、図１〜図７Ｂの好ましい方法は、集められて結合される事前硬化エラストマー層を用いることを含む。代替方法では、エラストマーの各層は、「適所で」硬化され得る。以下の説明では、「チャネル」とは、エラストマー構造中の、流体または気体の流れを含み得る溝をいう。 As will be described, the preferred method of FIGS. 1-7B involves using a pre-cured elastomer layer that is assembled and bonded. In the alternative, each layer of elastomer may be cured “in place”. In the following description, “channel” refers to a groove in an elastomeric structure that may contain a fluid or gas flow.

図１を参照して、第一の微細加工鋳型１０が提供される。微細加工鋳型１０は、多数の従来のシリコン加工方法（写真平板、イオンミリングおよび電子ビームリソグラフィーを含むがこれらに限定されない）によって製造され得る。 With reference to FIG. 1, a first microfabricated mold 10 is provided. The microfabricated mold 10 can be manufactured by a number of conventional silicon processing methods, including but not limited to photolithography, ion milling and electron beam lithography.

見られ得るように、微細加工鋳型１０は、それに沿って延びる、隆起線または突出部１１を有する。第一エラストマー層２０は、示されるように、第一溝２１（溝２２は、突出部１１に寸法が対応する）が、エラストマー層２０の下表面に形成されるように、鋳型１０の上部に鋳造される。 As can be seen, the microfabricated mold 10 has ridges or protrusions 11 extending along it. As shown, the first elastomer layer 20 is formed on the top of the mold 10 such that a first groove 21 (the groove 22 corresponds in size to the protrusion 11) is formed on the lower surface of the elastomer layer 20. Casted.

図２に見られ得るように、それに沿って延びる隆起した突出部１３を有する第二の微細加工鋳型１２もまた提供される。第二エラストマー層２２は、溝２３が、突出部１３の寸法に対応するその下表面に形成されるように、示されるように、鋳型１２の上部に鋳造される。 As can be seen in FIG. 2, a second microfabricated mold 12 having raised protrusions 13 extending along it is also provided. The second elastomer layer 22 is cast on the top of the mold 12 as shown, such that the groove 23 is formed in its lower surface corresponding to the dimensions of the protrusion 13.

図３および図４に図示した連続工程において見られ得るように、次いで、第二エラストマー層２２は鋳型１２から取り出され、そして第一エラストマー層２０の上部に配置される。見られ得るように、第二エラストマー層２２の下表面に沿って延びる溝２３は、フローチャネル３２を形成する。 As can be seen in the continuous process illustrated in FIGS. 3 and 4, the second elastomer layer 22 is then removed from the mold 12 and placed on top of the first elastomer layer 20. As can be seen, the groove 23 extending along the lower surface of the second elastomer layer 22 forms a flow channel 32.

図５を参照して、次いで、別個の第一エラストマー層２０および第二エラストマー層２２（図４）は、一緒に結合されて、一体型（すなわち、モノリシック）エラストマー構造２４が形成される。 Referring to FIG. 5, the separate first elastomer layer 20 and second elastomer layer 22 (FIG. 4) are then bonded together to form a monolithic (ie, monolithic) elastomer structure 24.

図６および図７Ａの連続工程において見られ得るように、次いで、エラストマー構造２４は、鋳型１０から取り出され、そして平面基板１４の上部に配置される。図７Ａおよび図７Ｂにおいて見られ得るように、エラストマー構造２４がその下表面で平面基板１４に対してシールされた場合、溝２１は、フローチャネル３０を形成する。 As can be seen in the continuous process of FIGS. 6 and 7A, the elastomeric structure 24 is then removed from the mold 10 and placed on top of the planar substrate 14. As can be seen in FIGS. 7A and 7B, the groove 21 forms a flow channel 30 when the elastomeric structure 24 is sealed to the planar substrate 14 at its lower surface.

本発明のエラストマー構造は、ほぼ任意の平滑平面基板と可逆的気密シールを形成する。このようにしてシールを形成することに対する利点は、エラストマー構造が、はがされ得、洗浄され得、そして再使用され得ることである。好ましい局面では、平面基板１４はガラスである。ガラスを使用することのさらなる利点は、ガラスは透明であって、エラストマーチャネルおよびレザバの光学的な取り調べ（ｏｐｔｉｃａｌｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を可能にすることである。あるいは、エラストマー構造は、上記と同じ方法によって平坦なエラストマー層へと結合されて、永続的かつ高強度の結合を形成し得る。これは、より高い背圧が用いられる場合の利点を証明し得る。 The elastomeric structure of the present invention forms a reversible hermetic seal with almost any smooth planar substrate. An advantage to forming a seal in this way is that the elastomeric structure can be peeled off, cleaned and reused. In a preferred aspect, the planar substrate 14 is glass. A further advantage of using glass is that it is transparent and allows optical interrogation of elastomeric channels and reservoirs. Alternatively, the elastomeric structure can be bonded to a flat elastomeric layer by the same method as described above to form a permanent and high strength bond. This may prove an advantage when higher back pressure is used.

図７Ａおよび図７Ｂにおいて見られ得るように、フローチャネル３０およびフローチャネル３２は好ましくは、フローチャネル３０の上部をフローチャネル３２の下部と分離する、基板２４の小さな膜２５と、互いにある角度で配置される。 As can be seen in FIGS. 7A and 7B, flow channel 30 and flow channel 32 are preferably at an angle to a small membrane 25 of substrate 24 that separates the top of flow channel 30 from the bottom of flow channel 32. Be placed.

好ましい局面では、平面基板１４はガラスである。ガラスを用いることの利点は、本発明のエラストマー構造がはがされ得、洗浄され得、そして再使用され得ることである。ガラスを用いることのさらなる利点は、光学検知が用いられ得ることである。あるいは、平面基板１４は、より高い背圧が用いられる場合、有益であると判明し得る、エラストマー自体であり得る。 In a preferred aspect, the planar substrate 14 is glass. The advantage of using glass is that the elastomeric structure of the present invention can be peeled off, cleaned and reused. A further advantage of using glass is that optical sensing can be used. Alternatively, the planar substrate 14 can be the elastomer itself, which can prove beneficial if higher back pressure is used.

ここに記載した製造方法は、デバイスのチャネルの壁を形成する材料とは異なるエラストマー材料から構成される膜を有する構造を形成するように改変され得る。この異なる製造方法を図７Ｃ〜図７Ｇに図示する。 The manufacturing methods described herein can be modified to form a structure having a membrane composed of an elastomeric material that is different from the material that forms the channel walls of the device. This different manufacturing method is illustrated in FIGS. 7C-7G.

図７Ｃを参照して、第一微細加工鋳型１０が提供される。微細加工鋳型１０は、それに沿って延びた、隆起線または突出部１１を有する。図７Ｄでは、第一エラストマー層２０は、第一エラストマー層２０の上部が隆起線または突出部１１の上部で洗い流されるように、第一の微細加工鋳型１０の上部に鋳造される。これは、鋳型１０上に吐出されるエラストマー材料の容積を、隆起線１１の既知の高さに対して、注意深く制御することによって達成され得る。あるいは、所望の形状が、射出成形によって形成され得る。 With reference to FIG. 7C, a first microfabricated mold 10 is provided. The microfabricated mold 10 has ridges or protrusions 11 extending along it. In FIG. 7D, the first elastomer layer 20 is cast on top of the first microfabricated mold 10 such that the top of the first elastomer layer 20 is washed away on top of the ridges or protrusions 11. This can be achieved by carefully controlling the volume of elastomeric material dispensed onto the mold 10 with respect to the known height of the ridge 11. Alternatively, the desired shape can be formed by injection molding.

図７Ｅでは、それに沿って延びた隆起した突出部１３を有する第二の微細加工鋳型１２もまた提供される。第二エラストマー層２２は、溝２３が、突出部１３の寸法に対応するその下表面に形成されるように、示されるように第二鋳型１２の上部に鋳造される。 In FIG. 7E, a second microfabricated mold 12 having raised protrusions 13 extending along it is also provided. The second elastomer layer 22 is cast on top of the second mold 12 as shown so that the grooves 23 are formed in its lower surface corresponding to the dimensions of the protrusions 13.

図７Ｆでは、第二エラストマー層２２は、鋳型１２から取り出され、そして第三エラストマー層２２２の上部に配置される。第二エラストマー層２２は、第三エラストマー層２０に結合されて、以下に詳細に記載される技術を用いて、一体型エラストマーブロック２２４が形成される。このプロセスのこの点では、隆起線１３によって以前は占められていた溝２３が、フローチャネル２３を形成する。 In FIG. 7F, the second elastomer layer 22 is removed from the mold 12 and placed on top of the third elastomer layer 222. The second elastomer layer 22 is bonded to the third elastomer layer 20 to form an integral elastomer block 224 using techniques described in detail below. At this point in the process, the groove 23 previously occupied by the ridge 13 forms the flow channel 23.

図７Ｇでは、エラストマーブロック２２４は、第一微細加工鋳型１０および第一エラストマー層２０の上部に配置される。次いで、エラストマーブロックおよび第一エラストマー層２０は一緒に結合されて、別のエラストマー層２２２から構成される膜を有する一体型（すなわち、モノリシック）エラストマー構造２４を形成する。 In FIG. 7G, the elastomer block 224 is placed on top of the first microfabricated mold 10 and the first elastomer layer 20. The elastomeric block and first elastomeric layer 20 are then bonded together to form a unitary (ie, monolithic) elastomeric structure 24 having a membrane composed of another elastomeric layer 222.

エラストマー構造２４が、その下表面で、図７Ａに関して上記で記載した様式で平面基板にシールされている場合、隆起線１１によって以前占められていた溝は、フローチャネル３０を形成する。 If the elastomeric structure 24 is sealed at its lower surface to a planar substrate in the manner described above with respect to FIG. 7A, the grooves previously occupied by the ridges 11 form the flow channel 30.

図７Ｃ〜図７Ｇに関連して上記で図示した別の製造方法は、膜部分が、その構造の残部のエラストマー材料とは別の材料から構成されるのを可能にするという利点を提供する。これは、重要である。なぜなら、膜の厚さおよび弾性特性は、デバイスの操作において重要な役割を果たすからである。さらに、この方法は、別のエラストマー層が、エラストマー構造に取り込まれる前にコンディショニングに容易に供されるのを可能にする。以下に詳細に考察するように、潜在的に望ましい条件の例としては、膜の作動および／またはその弾性を変更するための膜へのドーパントの導入を可能にする磁気伝導種または電気伝導種の導入が挙げられる。 Another manufacturing method illustrated above in connection with FIGS. 7C-7G provides the advantage of allowing the membrane portion to be composed of a material other than the elastomeric material of the remainder of the structure. This is important. This is because film thickness and elastic properties play an important role in device operation. Furthermore, this method allows another elastomeric layer to be easily subjected to conditioning before being incorporated into the elastomeric structure. As discussed in detail below, examples of potentially desirable conditions include those of magnetic or electrical species that allow the introduction of dopants into the film to alter the film's operation and / or its elasticity. Introduction is mentioned.

上記の方法は、微細加工鋳型の上部での複製成形によって形成される種々の成形エラストマー層を形成することに関して例示されたが、本発明は、この技術に限定されない。他の技術を用いて、一緒に結合されるべき成形エラストマー材料の個々の層を形成し得る。例えば、エラストマー材料の成形層は、レーザー切断もしくは射出成形によって、または第二の例示的な方法に関連して以下に考察されるとおりの化学エッチングおよび／もしくは犠牲材料を利用する方法によって、形成され得る。 While the above method has been illustrated with respect to forming various shaped elastomeric layers formed by replica molding on top of a microfabricated mold, the present invention is not limited to this technique. Other techniques may be used to form individual layers of molded elastomeric material that are to be bonded together. For example, the molded layer of elastomeric material is formed by laser cutting or injection molding, or by a method that utilizes chemical etching and / or sacrificial material as discussed below in connection with the second exemplary method. obtain.

代替的な方法は、エラストマー材料内にカプセル化されたフォトレジストの現像を利用する、パターン形成エラストマー構造を製造する。しかし、本発明による方法は、フォトレジストを利用することに限定されない。他の材料（例えば、金属）もまた、周囲のエラストマー材料に対して選択的に除去されるべき犠牲材料として役立ち得、そしてこの方法は、本発明の範囲内にある。例えば、金金属は、適切な化学混合物を利用してＲＴＶ６１５エラストマーに対して選択的にエッチングされ得る。 An alternative method produces a patterned elastomeric structure that utilizes development of a photoresist encapsulated in an elastomeric material. However, the method according to the present invention is not limited to utilizing a photoresist. Other materials (eg, metals) can also serve as sacrificial materials to be selectively removed with respect to the surrounding elastomeric material, and this method is within the scope of the present invention. For example, gold metal can be selectively etched relative to the RTV 615 elastomer using a suitable chemical mixture.

（２．層およびチャネルの寸法）
微細製作されたとは、本発明の実施形態に従って製造されたエラストマー構造の特徴の大きさをいう。一般に、微細製作された構造の少なくとも１つの寸法におけるバリエーションは、ミクロンレベルまで制御され、少なくとも１つの寸法は、微視的（すなわち、１０００μｍ未満）である。微細製作は代表的に、顕微鏡レベルの特徴寸法を生じるために設計された、半導体またはＭＥＭＳ製造技術（例えば、写真平板および回転被覆（ｓｐｉｎｃｏａｔｉｎｇ））を含み、微細製作された構造の寸法の少なくともいくつかは、この構造を合理的に解明／画像化するために顕微鏡を必要とする。 (2. Layer and channel dimensions)
Microfabricated refers to the feature size of an elastomeric structure manufactured according to an embodiment of the present invention. In general, variations in at least one dimension of a microfabricated structure are controlled to the micron level, and at least one dimension is microscopic (ie, less than 1000 μm). Microfabrication typically includes semiconductor or MEMS manufacturing techniques (eg, photolithographic and spincoating) designed to produce microscopic feature dimensions, including at least some of the dimensions of the microfabricated structure. It requires a microscope to reasonably elucidate / image this structure.

好ましい局面では、フローチャネル３０、３２、６０および６２は好ましくは、約１０：１の幅：深さ比を有する。本発明の実施形態に従った幅：深さ比の他の範囲の非限定的リストは、０．１：１〜１００：１、より好ましくは１：１〜５０：１、より好ましくは２：１〜２０：１、そして最も好ましくは３：１〜１５：１である。例示的な局面では、フローチャネル３０、３２、６０および６２は、約１〜１０００ミクロンの幅を有する。本発明の実施形態に従ったフローチャネルの幅の他の範囲の非限定的リストは、０．０１〜１０００ミクロン、より好ましくは０．０５〜１０００ミクロン、より好ましくは０．２〜５００ミクロン、より好ましくは１〜２５０ミクロン、そして最も好ましくは１０〜２００ミクロンである。例示的なチャネル幅としては、以下が挙げられる：０．１μｍ、１μｍ、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍおよび２５０μｍ。 In a preferred aspect, the flow channels 30, 32, 60 and 62 preferably have a width: depth ratio of about 10: 1. A non-limiting list of other ranges of width: depth ratio according to embodiments of the present invention is 0.1: 1 to 100: 1, more preferably 1: 1 to 50: 1, more preferably 2: 1-20: 1, and most preferably 3: 1-15: 1. In an exemplary aspect, the flow channels 30, 32, 60 and 62 have a width of about 1-1000 microns. A non-limiting list of other ranges of flow channel widths according to embodiments of the present invention is 0.01 to 1000 microns, more preferably 0.05 to 1000 microns, more preferably 0.2 to 500 microns, More preferably from 1 to 250 microns and most preferably from 10 to 200 microns. Exemplary channel widths include: 0.1 μm, 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 60 μm, 70 μm, 80 μm, 90 μm, 100 μm, 110 μm, 120 μm, 130 μm, 140 μm. 150 μm, 160 μm, 170 μm, 180 μm, 190 μm, 200 μm, 210 μm, 220 μm, 230 μm, 240 μm and 250 μm.

フローチャネル３０、３２、６０および６２は、約１〜１００ミクロンの深さを有する。本発明の実施形態に従ったフローチャネルの深さの他の範囲の非限定的リストは、０．０１〜１０００ミクロン、より好ましくは０．０５〜５００ミクロン、より好ましくは０．２〜２５０ミクロン、そしてより好ましくは１〜１００ミクロン、より好ましくは２〜２０ミクロン、そして最も好ましくは５〜１０ミクロンである。例示的なチャネル深さとしては、以下が挙げられる：０．０１μｍ、０．０２μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、７．５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１５μｍ、１７．５μｍ、２０μｍ、２２．５μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、および２５０μｍ。 The flow channels 30, 32, 60 and 62 have a depth of about 1-100 microns. A non-limiting list of other ranges of flow channel depths according to embodiments of the present invention is 0.01 to 1000 microns, more preferably 0.05 to 500 microns, more preferably 0.2 to 250 microns. And more preferably 1 to 100 microns, more preferably 2 to 20 microns, and most preferably 5 to 10 microns. Exemplary channel depths include: 0.01 μm, 0.02 μm, 0.05 μm, 0.1 μm, 0.2 μm, 0.5 μm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 7. 5 μm, 10 μm, 12.5 μm, 15 μm, 17.5 μm, 20 μm, 22.5 μm, 25 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm, and 250 μm.

これらのフローチャネルは、上記で与えたこれらの特定の寸法範囲および例に限定されず、そして、図２７に関連して以下に詳細に考察したとおりに膜を反らせるために必要な大きさの力に影響を与えるために幅が変化し得る。例えば、０．０１μｍの桁の幅を有する極めて狭いフローチャネルは、以下に詳細に考察したとおり、光学的適用および他の適用において有用であり得る。上記よりもさらに大きな幅のチャネルを有する部分を含むエラストマー構造もまた、本発明によって意図され、そしてこのようなより幅の広いフローチャネルを利用する適用の例としては、流体レザバおよびチャネル構造の混合が挙げられる。 These flow channels are not limited to these specific size ranges and examples given above, and the amount of force required to warp the membrane as discussed in detail below in connection with FIG. The width can change to affect For example, a very narrow flow channel with an order of magnitude of 0.01 μm can be useful in optical and other applications, as discussed in detail below. Elastomeric structures that include portions having channels that are wider than the above are also contemplated by the present invention, and examples of applications that utilize such wider flow channels include mixing fluid reservoirs and channel structures. Is mentioned.

これらのエラストマー層は、機械的安定性のために厚く鋳造され得る。例示的な実施形態では、図１のエラストマー層２２は、５０ミクロン〜数センチメートルの厚さであり、そしてより好ましくは約４ｍｍの厚さである。本発明の他の実施形態に従ったエラストマー層の厚さの範囲の非限定的リストは、約０．１ミクロン〜１０ｃｍ、１ミクロン〜５ｃｍ、１０ミクロン〜２ｃｍ、１００ミクロン〜１０ｍｍの間である。 These elastomer layers can be cast thick for mechanical stability. In the exemplary embodiment, elastomer layer 22 of FIG. 1 is between 50 microns and a few centimeters thick, and more preferably is about 4 mm thick. A non-limiting list of elastomer layer thickness ranges according to other embodiments of the present invention is between about 0.1 microns to 10 cm, 1 micron to 5 cm, 10 microns to 2 cm, 100 microns to 10 mm. .

従って、図７Ｂの、フローチャネル３０とフローチャネル３２とを分離する膜２５は、約０．０１ミクロンと約１０００ミクロンとの間、より好ましくは０．０５〜５００ミクロン、より好ましくは０．２〜２５０、より好ましくは１〜１００ミクロン、より好ましくは２〜５０ミクロン、そして最も好ましくは５〜４０ミクロンの間の代表的厚さを有する。その結果、エラストマー層２２の厚さは、エラストマー層２０の厚さの約１００倍である。例示的な膜の厚さとしては、以下が挙げられる：０．０１μｍ、０．０２μｍ、０．０３μｍ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．５μｍ、１μｍ、２μｍ、３μｍ、５μｍ、７．５μｍ、１０μｍ、１２．５μｍ、１５μｍ、１７．５μｍ、２０μｍ、２２．５μｍ、２５μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７５μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、７５０μｍ、および１０００μｍ。 Thus, the membrane 25 of FIG. 7B separating the flow channel 30 and the flow channel 32 is between about 0.01 microns and about 1000 microns, more preferably 0.05 to 500 microns, more preferably 0.2. It has a representative thickness between ˜250, more preferably 1-100 microns, more preferably 2-50 microns, and most preferably 5-40 microns. As a result, the thickness of the elastomer layer 22 is about 100 times the thickness of the elastomer layer 20. Exemplary film thicknesses include: 0.01 μm, 0.02 μm, 0.03 μm, 0.05 μm, 0.1 μm, 0.2 μm, 0.3 μm, 0.5 μm, 1 μm, 2 μm 3 μm, 5 μm, 7.5 μm, 10 μm, 12.5 μm, 15 μm, 17.5 μm, 20 μm, 22.5 μm, 25 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 75 μm, 100 μm, 150 μm, 200 μm, 250 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm , 750 μm, and 1000 μm.

（３．ソフトリソグラフィー結合）
好ましくは、エラストマー層は、パターン形成エラストマー層を含むポリマーに固有である化学を用いて化学的に一緒に結合される。最も好ましくは、結合は、二成分「添加硬化（ａｄｄｉｔｉｏｎｃｕｒｅ）」結合を含む。 (3. Soft lithography bonding)
Preferably, the elastomeric layers are chemically bonded together using chemistry that is inherent in the polymer comprising the patterned elastomeric layer. Most preferably, the bond comprises a two-component “addition cure” bond.

好ましい局面では、エラストマーの種々の層は、層が異なる化学的性質を有する不均一結合で一緒に結合される。あるいは、全ての層が同じ化学的性質のものである均一結合が用いられ得る。第三に、それぞれのエラストマー層は、必要に応じて、その代わりに、接着剤によって一緒に貼り付けられ得る。第四の局面では、エラストマー層は、加熱によって一緒に結合される熱硬化性エラストマーであり得る。 In a preferred aspect, the various layers of elastomer are bonded together with heterogeneous bonds where the layers have different chemistries. Alternatively, uniform bonds can be used where all layers are of the same chemistry. Third, the respective elastomer layers can be applied together with an adhesive instead, if desired. In a fourth aspect, the elastomeric layer can be a thermosetting elastomer that is bonded together by heating.

均一結合の１つの局面では、エラストマー層は、同じエラストマー材料から構成され、１つの層における同じ化学実体は、他の層における同じ化学実体と反応して、これらの層を一緒に結合する。１つの実施形態では、同様のエラストマー層のポリマー鎖の間の結合は、光、熱または別個の化学種との化学反応に起因した架橋剤の活性化から生じ得る。 In one aspect of uniform bonding, the elastomeric layers are composed of the same elastomeric material, and the same chemical entity in one layer reacts with the same chemical entity in the other layer to bond these layers together. In one embodiment, bonding between polymer chains of similar elastomeric layers can result from activation of the crosslinker due to light, heat, or a chemical reaction with a separate chemical species.

あるいは、不均質な局面では、エラストマー層は、異なるエラストマー材料から構成され、１つの層における第一の化学実体は、別の層における第二の化学実体と反応する。１つの例示的な不均一局面では、それぞれのエラストマー層を一緒に結合するために用いられる結合プロセスは、ＲＴＶ６１５シリコーンの２つの層を一緒に結合することを含み得る。ＲＴＶ６１５シリコーンは、二部添加硬化シリコーンゴムである。Ａ部は、ビニル基および触媒を含む；Ｂ部は、水素化ケイ素（Ｓｉ−Ｈ）基を含む。ＲＴＶ６１５についての従来の比は、１０Ａ：１Ｂである。結合に関して、１つの層は、３０Ａ：１Ｂ（すなわち、過剰なビニル基）で作製され得、そして他方は、３Ａ：１Ｂ（すなわち、過剰なＳｉ−Ｈ基）で作製され得る。各層は、別々に硬化される。この２つの層を接触させて、高温で加熱した場合、これらは、不可逆的に結合して、モノリシックエラストマー基板を形成する。 Alternatively, in a heterogeneous aspect, the elastomeric layer is composed of different elastomeric materials, and the first chemical entity in one layer reacts with the second chemical entity in another layer. In one exemplary non-uniform aspect, the bonding process used to bond the respective elastomer layers together can include bonding the two layers of RTV 615 silicone together. RTV 615 silicone is a two-part addition cured silicone rubber. Part A contains vinyl groups and catalyst; Part B contains silicon hydride (Si-H) groups. The conventional ratio for RTV 615 is 10A: 1B. For bonding, one layer can be made with 30A: 1B (ie, excess vinyl groups) and the other can be made with 3A: 1B (ie, excess Si—H groups). Each layer is cured separately. When the two layers are brought into contact and heated at high temperatures, they combine irreversibly to form a monolithic elastomeric substrate.

本発明の例示的な局面では、Ｓｙｌｇａｒｄ１８２、１８４もしくは１８６、または脂肪族ウレタンジアクリレート（例えば、ＵＣＢＣｈｅｍｉｃａｌからのＥｂｅｃｒｙｌ２７０またはＩｒｒ２４５（しかしこれらに限定されない））を利用して、エラストマー構造が形成される。 In exemplary aspects of the invention, Sylgard 182, 184 or 186, or aliphatic urethane diacrylate (eg, but not limited to Ebecryl 270 or Irr 245 from UCB Chemical) is used to provide an elastomeric structure. It is formed.

本発明に従った１つの実施形態では、純粋なアクリレート化ＵｒｅｔｈａｎｅＥｂｅ
２７０から２層エラストマー構造を製造した。薄い下層を、８０００ｒｐｍで１５秒間、１７０℃で回転被覆した。上層および下層を、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｔｅｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されるＭｏｄｅｌＥＬＣ５００デバイスを利用して、紫外光下で窒素下にて１０分間、最初に硬化させた。次いで、組立てられた層を、さらに３０分間かけて硬化させた。反応は、Ｃｉｂａ−ＧｅｉｇｙＣｈｅｍｉｃａｌｓによって製造されたＩｒｇａｃｕｒｅ５００の０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ混合物によって触媒された。得られたエラストマー材料は、中程度の弾性およびガラスへの接着を示した。 In one embodiment according to the present invention, pure acrylated Urethane Ebe
A two-layer elastomeric structure was produced from 270. The thin underlayer was spin coated at 170 ° C. for 15 seconds at 8000 rpm. The upper and lower layers were first cured for 10 minutes under ultraviolet light under nitrogen using a Model ELC 500 device manufactured by Electrolite corporation. The assembled layer was then cured for an additional 30 minutes. The reaction was catalyzed by a 0.5% vol / vol mixture of Irgacure 500 manufactured by Ciba-Geigy Chemicals. The resulting elastomeric material exhibited moderate elasticity and adhesion to glass.

本発明に従った別の実施形態では、２層エラストマー構造は、薄い下層については２５％Ｅｂｅ２７０／５０％Ｉｒｒ２４５／２５％イソプロピルアルコール、そして上層としての純粋なアクリレート化ＵｒｅｔｈａｎｅＥｂｅ２７０の組合せから製造された。薄い下層を、紫外光下で窒素下にて、Ｅｌｅｃｔｒｏｌｉｔｅｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されるＭｏｄｅｌＥＬＣ５００デバイスを利用して、最初に５分間かけて硬化させ、そして上層を最初に１０分間かけて硬化させた。次いで、組立てられた層を、さらに３０分間かけて硬化させた。反応は、Ｃｉｂａ−ＧｅｉｇｙＣｈｅｍｉｃａｌｓによって製造されたＩｒｇａｃｕｒｅ５００の０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌ混合物によって触媒された。得られたエラストマー材料は、中程度の弾性を示し、そしてガラスへ接着した。 In another embodiment according to the present invention, a two-layer elastomeric structure is made from a combination of 25% Ebe 270/50% Irr245 / 25% isopropyl alcohol for the thin lower layer, and pure acrylated Urethane Ebe 270 as the upper layer. It was done. The thin underlayer was first cured for 5 minutes and the top layer was initially cured for 10 minutes utilizing a Model ELC 500 device manufactured by Electrolite corporation under nitrogen under ultraviolet light. The assembled layer was then cured for an additional 30 minutes. The reaction was catalyzed by a 0.5% vol / vol mixture of Irgacure 500 manufactured by Ciba-Geigy Chemicals. The resulting elastomeric material exhibited moderate elasticity and adhered to glass.

あるいは、例えば、接触して配置した場合にエラストマー層／基板が結合するように、プラズマ曝露によってエラストマー表面を活性化することを含め、他の結合方法を用い得る。例えば、同じ材料から構成されるエラストマー層を一緒に結合するための１つの可能なアプローチは、本明細書中に参考として援用される、Ｄｕｆｆｙら，「ＲａｐｉｄＰｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇｏｆＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＳｙｓｔｅｍｓｉｎＰｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）」、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８），７０，４９７４−４９８４によって示される。この論文は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層を酸素プラズマに曝露することが、表面の酸化を引き起こし、２つの酸化層が接触するように配置された場合、不可逆的結合が生じると考察する。 Alternatively, other bonding methods may be used including, for example, activating the elastomeric surface by plasma exposure so that the elastomer layer / substrate bonds when placed in contact. For example, one possible approach for bonding together elastomer layers composed of the same material is Duffy et al., “Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly (dimethylsiloxane)”, incorporated herein by reference. , Analytical Chemistry (1998), 70, 4974-4984. This paper considers that exposing a polydimethylsiloxane (PDMS) layer to an oxygen plasma causes surface oxidation and if the two oxide layers are placed in contact, an irreversible bond occurs.

エラストマーの連続層を一緒に結合するためのなお別のアプローチは、未硬化エラストマーの接着特性を利用することである。特に、未硬化のエラストマー（例えば、ＲＴＶ６１５）の薄層は、第一の硬化エラストマー層の上部に適用される。次に、第二の硬化エラストマー層は、未硬化のエラストマー層の上部に配置される。次いで、未硬化のエラストマーの薄い中間層を硬化させて、モノリシックエラストマー構造が生成される。あるいは、未硬化のエラストマーは、第一の硬化エラストマー層の下に適用され得、第一の硬化エラストマー層は、第二の硬化エラストマー層の上に配置される。ここでも、中間の薄いエラストマー層を硬化させることは、モノリシックエラストマー構造の形成をもたらす。 Yet another approach for bonding together successive layers of elastomers is to take advantage of the adhesive properties of uncured elastomers. In particular, a thin layer of uncured elastomer (eg, RTV 615) is applied on top of the first cured elastomer layer. Next, the second cured elastomer layer is placed on top of the uncured elastomer layer. The thin intermediate layer of uncured elastomer is then cured to produce a monolithic elastomeric structure. Alternatively, uncured elastomer can be applied under the first cured elastomer layer, with the first cured elastomer layer being disposed over the second cured elastomer layer. Again, curing the intermediate thin elastomeric layer results in the formation of a monolithic elastomeric structure.

犠牲層のカプセル化を用いて、エラストマー構造を製造する場合、連続エラストマー層の結合は、予め硬化されたエラストマー層およびその上にパターン形成された任意の犠牲材料上に未硬化のエラストマーを注ぐことによって達成され得る。エラストマー層間の結合は、未硬化のエラストマー層のポリマー鎖と硬化エラストマー層のポリマー鎖との相互浸透および反応に起因して生じる。エラストマー層のその後の硬化は、エラストマー層の間に結合を作製し、そしてモノリシックエラストマー構造を作製する。 When producing an elastomeric structure using sacrificial layer encapsulation, the bonding of the continuous elastomeric layer involves pouring the uncured elastomer over the precured elastomer layer and any sacrificial material patterned thereon. Can be achieved. Bonding between the elastomer layers occurs due to interpenetration and reaction between the polymer chains of the uncured elastomer layer and the polymer chains of the cured elastomer layer. Subsequent curing of the elastomeric layer creates a bond between the elastomeric layers and creates a monolithic elastomeric structure.

図１〜図７Ｂの第一方法を言及して、第一エラストマー層２０は、微細製作された鋳型１２にＲＴＶ混合物を２０００ｒｐｍで３０秒間にわたって回転被覆して、約４０ミクロンの厚みを生じることによって作製され得る。第二エラストマー層２２は、微細製作された鋳型１１上にＲＴＶ混合物を回転被覆することによって作製され得る。層２０および層２２は両方とも、約８０℃で１．５時間かけて別々に焼かれ得るかまたは硬化され得る。第二エラストマー層２２は、第一エラストマー層２０上に約８０℃で約１．５時間かけて結合され得る。 Referring to the first method of FIGS. 1-7B, the first elastomer layer 20 is formed by spin-coating the RTV mixture on a microfabricated mold 12 at 2000 rpm for 30 seconds, resulting in a thickness of about 40 microns. Can be made. The second elastomer layer 22 can be made by spin coating the RTV mixture on the microfabricated mold 11. Both layer 20 and layer 22 can be separately baked or cured at about 80 ° C. for 1.5 hours. The second elastomer layer 22 may be bonded to the first elastomer layer 20 at about 80 ° C. for about 1.5 hours.

微細加工鋳型１０および１２は、シリコンウェーハ上のパターン形成フォトレジストであり得る。例示的な局面では、ＳｈｉｐｌｅｙＳＪＲ５７４０フォトレジストを、２０００ｒｐｍで回転させ、マスクとして高解像度の透明フィルムを用いてパターン形成され、次いで現像されて、約１０ミクロンの高さの逆チャネルが得られた。約２００℃で約３０分間かけて焼かされた場合、フォトレジストは再度流動し、そして逆チャネルが丸くなる。好ましい局面では、鋳型は、シリコーンゴムの接着を防止するために、各使用の前にトリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）蒸気で約１分間かけて処理され得る。 The microfabricated molds 10 and 12 can be patterned photoresist on a silicon wafer. In an exemplary aspect, Shipley SJR 5740 photoresist was rotated at 2000 rpm, patterned using a high resolution transparent film as a mask, and then developed to obtain a reverse channel about 10 microns high. . When baked at about 200 ° C. for about 30 minutes, the photoresist flows again and the reverse channel is rounded. In a preferred aspect, the mold can be treated with trimethylchlorosilane (TMCS) vapor for about 1 minute before each use to prevent silicone rubber adhesion.

（４．適切なエラストマー材料）
Ａｌｌｃｏｃｋら、ＣｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙＰｏｌｙｍｅｒＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版は、エラストマーを、それらのガラス転移温度と液化温度との間の温度で存在するポリマーとして一般的に記載する。エラストマー材料は、弾性特性を示す。なぜなら、ポリマー鎖は、力に応答して骨格鎖のほぐれを可能にするねじれ運動を容易に受け、この力の非存在下では骨格鎖は巻き戻されて以前の形状をとるからである。一般に、エラストマーは、力がかけられた場合に変形するが、次いで、その力が取り除かれたときはその元の形状に戻る。エラストマー材料によって示される弾性は、ヤング率によって特徴付けられ得る。約１Ｐａ〜１ＴＰａの間、より好ましくは約１０Ｐａ〜１００ＧＰａの間、より好ましくは約２０Ｐａ〜１ＧＰａの間、より好ましくは約５０Ｐａ〜１０ＭＰａの間、そしてより好ましくは約１００Ｐａ〜１ＭＰａの間のヤング率を有するエラストマー材料は、本発明に従って有用であるが、これらの範囲外のヤング率を有するエラストマー材料もまた、特定の適用の必要性に依存して利用され得る。 (4. Suitable elastomer material)
Allcock, et al., Temporary Polymer Chemistry, 2nd edition, generally describes elastomers as polymers that exist at temperatures between their glass transition temperature and liquefaction temperature. Elastomeric materials exhibit elastic properties. This is because the polymer chain readily undergoes a torsional motion that allows the backbone chain to loosen in response to force, and in the absence of this force, the backbone chain is unwound and assumes its previous shape. In general, an elastomer deforms when a force is applied, but then returns to its original shape when the force is removed. The elasticity exhibited by the elastomeric material can be characterized by Young's modulus. Young's modulus between about 1 Pa and 1 TPa, more preferably between about 10 Pa and 100 GPa, more preferably between about 20 Pa and 1 GPa, more preferably between about 50 Pa and 10 MPa, and more preferably between about 100 Pa and 1 MPa. Elastomeric materials having are useful in accordance with the present invention, but elastomeric materials having Young's modulus outside these ranges can also be utilized depending on the needs of a particular application.

本発明のシステムは、広範な種々のエラストマーから製造され得る。例示的な局面では、エラストマー層は、好ましくはシリコーンゴムから製造され得る。しかし、他の適切なエラストマーもまた使用され得る。 The system of the present invention can be made from a wide variety of elastomers. In an exemplary aspect, the elastomeric layer can be preferably made from silicone rubber. However, other suitable elastomers can also be used.

本発明の例示的な局面では、本発明のシステムは、エラストマーポリマー（例えば、ＧＥＲＴＶ６１５（調合物）（ビニルシラン架橋（型）シリコーンエラストマー（ファミリー））から製造される。しかし、本発明のシステムは、この１つの処方にも、型にも、このファミリーのポリマーにさえ制限されない；むしろ、ほぼ任意のエラストマーポリマーが適切である。本発明のミクロバルブの製造の好ましい方法についての重要な必要条件は、複数の層のエラストマーを一緒に結合する能力である。複数層ソフトリソグラフィーの場合、エラストマーの層を別々に硬化させ、次いで一緒に結合させる。このスキームは、硬化された層が、一緒に結合するに充分な反応性を有することを必要とする。いずれかの層は、同じ型のものであり得、そしてそれら自体を結合し得るか、または２つの異なる型のものであり得、そして互いに結合し得る。他の可能性としては、層の間での接着剤の使用および熱硬化性エラストマーの使用が挙げられる。 In an exemplary aspect of the invention, the system of the present invention is made from an elastomeric polymer, such as GE RTV 615 (formulation) (vinylsilane cross-linked (type) silicone elastomer (family)), but the system of the present invention. Is not limited to this one formulation, mold, or even this family of polymers; rather, almost any elastomeric polymer is suitable, an important requirement for the preferred method of manufacturing the microvalves of the present invention. Is the ability to bond multiple layers of elastomers together, in the case of multiple layer soft lithography, the layers of elastomer are cured separately and then bonded together. It is necessary to have sufficient reactivity to bind, either layer can be of the same type. And can be bonded together, or can be of two different types, and can be bonded together, other possibilities include the use of adhesives between layers and the use of thermoset elastomers. Is mentioned.

ポリマーの化学的性質、前駆体、合成方法、反応条件および潜在的添加剤の途方もなく大きな多様性を考慮すると、モノリシックエラストマーミクロバルブおよびポンプを作製するために用いられ得る、莫大な数の可能なエラストマーシステムが存在する。用いられる材料におけるバリエーションは、特定の材料の特性（すなわち、溶剤耐性、剛性、気体透過性または温度安定性）についての必要性によって支配される可能性が最も高い。 Given the tremendous variety of polymer chemistry, precursors, synthesis methods, reaction conditions and potential additives, the vast number of possibilities that can be used to make monolithic elastomeric microvalves and pumps Exist elastomeric systems. Variations in the materials used are most likely governed by the need for specific material properties (ie, solvent resistance, stiffness, gas permeability or temperature stability).

非常に多くの種類のエラストマーポリマーが存在する。比較的「標準的な」ポリマーを用いてさえ、結合についての多くの可能性が存在することを示すことを意図して、最も一般的なクラスのエラストマーの簡単な説明を本明細書中に提示する。一般的なエラストマーポリマーとしては、ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン、ポリイソブチレン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポリウレタン、およびシリコーンが挙げられる。 There are numerous types of elastomeric polymers. A brief description of the most common class of elastomers is presented here, intended to show that there are many possibilities for bonding even with relatively “standard” polymers. To do. Common elastomeric polymers include polyisoprene, polybutadiene, polychloroprene, polyisobutylene, poly (styrene-butadiene-styrene), polyurethane, and silicone.

（ポリイソプレン、ポリブタジエン、ポリクロロプレン：）
ポリイソプレン、ポリブタジエン、およびポリクロロプレンは全て、ジエンモノマーから重合され、それゆえ、重合した場合に１つのモノマーあたり１つの二重結合を有する。この二重結合は、このポリマーが、加硫（本質的に、硫黄を用いて、加熱によって二重結合の間に架橋が形成される）によってエラストマーへと変換されるのを可能にする。これは、層の不完全な加硫によって均一な複数層ソフトリソグラフィーが結合されるのを容易
に可能にする；フォトレジストカプセル化は、類似の機構によって可能である。 (Polyisoprene, polybutadiene, polychloroprene :)
Polyisoprene, polybutadiene, and polychloroprene are all polymerized from diene monomers and therefore have one double bond per monomer when polymerized. This double bond allows the polymer to be converted to an elastomer by vulcanization (essentially using sulfur to form crosslinks between the double bonds by heating). This easily allows uniform multi-layer soft lithography to be combined by incomplete vulcanization of the layers; photoresist encapsulation is possible by a similar mechanism.

（ポリイソブチレン：）
純粋なポリイソブチレンは、二重結合を有さないが、エラストマーとして使用するために、少量（約１％）のイソプレンを重合時に含めることによって架橋される。イソプレンモノマーは、ポリイソブチレン骨格にペンダント二重結合を与え、次いで、これは、上記のとおりに加硫され得る。 (Polyisobutylene :)
Pure polyisobutylene does not have double bonds, but is crosslinked by including a small amount (about 1%) of isoprene during polymerization for use as an elastomer. The isoprene monomer provides a pendant double bond to the polyisobutylene backbone, which can then be vulcanized as described above.

（ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）：）
ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）は、活発（ｌｉｖｉｎｇ）アニオン重合（すなわち、反応中に天然の鎖終結工程は存在しない）によって生成され、それゆえ、「活発な」ポリマー末端が、硬化したポリマー中に存在し得る。これにより、このポリマーは、本発明のフォトレジストカプセル化システムについての天然の候補となり、ここで、硬化した層の上に注がれた液体層中に多数の未反応モノマーが存在する。不完全硬化は、均一な複数層ソフトリソグラフィー（ＡとＡとの結合）を可能にする。この化学的性質もまた、（不均質な複数層ソフトリソグラフィーについては）過剰なブタジエンおよびカップリング剤を有する１つの層（「Ａ」）およびブタジエン不足を有する他の層（「Ｂ」）が作製されるのを容易にする。ＳＢＳは、「熱硬化性エラストマー」であり、特定の温度より上では、これが溶けて（弾性とは対照的に）可塑性になり；温度を下げると、このエラストマーが再度得られることを意味する。従って、層は、加熱によって一緒に結合され得る。 (Poly (styrene-butadiene-styrene) :)
Poly (styrene-butadiene-styrene) is produced by living anionic polymerization (ie, there is no natural chain termination step in the reaction), so “active” polymer ends are present in the cured polymer. Can exist. This makes this polymer a natural candidate for the photoresist encapsulation system of the present invention, where there are a number of unreacted monomers in the liquid layer poured over the cured layer. Incomplete curing allows uniform multi-layer soft lithography (bonding of A and A). This chemistry also creates (for heterogeneous multi-layer soft lithography) one layer with excess butadiene and coupling agent ("A") and another layer with butadiene deficiency ("B"). Make it easy to be done. SBS is a “thermoset elastomer” above which it melts and becomes plastic (as opposed to elastic) above a certain temperature; it means that the elastomer is obtained again when the temperature is lowered. Thus, the layers can be bonded together by heating.

（ポリウレタン）
ポリウレタンは、ジ−イソシアネート（ｄｉ−ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ）（Ａ−Ａ）およびジ−アルコール（ｄｉ−ａｌｃｏｈｏｌｓ）またはジ−アミン（ｄｉ−ａｍｉｎｅｓ）（Ｂ−Ｂ）から生成される；非常に種々のジ−イソシアネートおよびジ−アルコール／アミンが存在するため、異なるタイプのポリウレタンの数は膨大である。しかし、ポリマーのＡ対Ｂの性質により、このポリウレタンは、ちょうどＲＴＶ６１５のように、一方の層において過剰のＡ−Ａを、そして他方の層において過剰のＢ−Ｂを使用することにより、不均一多層軟質リゾグラフィーについて有用になる。 (Polyurethane)
Polyurethanes are produced from di-isocyanates (AA) and di-alcohols or di-amines (BB); a wide variety of di- Due to the presence of isocyanate and di-alcohol / amine, the number of different types of polyurethane is enormous. However, due to the A-to-B nature of the polymer, this polyurethane can be made effective by using excess AA in one layer and excess BB in the other layer, just like RTV 615. Useful for uniform multilayer soft lithography.

（シリコーン）
シリコーンポリマーは、おそらく、最も多くの構造多様性を有し、そしてほとんどが必ず、最多数の市販の処方物を有する。ビニル−（Ｓｉ−Ｈ）架橋のＲＴＶ６１５（これは不均一多層軟質リゾグラフィーおよびフォトレジストカプセル化の両方を可能にする）は、すでに議論されているが、これは、シリコーンポリマー化学において使用されるいくつかの架橋方法のうちのわずか１つである。 (silicone)
Silicone polymers probably have the most structural diversity and almost always have the largest number of commercially available formulations. Vinyl- (Si—H) cross-linked RTV 615 (which enables both heterogeneous multilayer soft lithography and photoresist encapsulation) has already been discussed, but it is used in silicone polymer chemistry. Only one of several crosslinking methods.

（５．デバイスの操作）
図７Ｂおよび７Ｈは、共に、第２のフローチャネルを加圧することにより第１のフローチャネルを閉じることを示し、図７Ｂ（対応する図７Ａにおけるフローチャネル３２を通して切られた前断面図）は、開いている第１のフローチャネル３０を示し、図７Ｈは、第２のフローチャネル３２を加圧することにより閉じられた第１のフローチャネル３０を示す。 (5. Device operation)
FIGS. 7B and 7H both show closing the first flow channel by pressurizing the second flow channel, and FIG. 7B (a front cross-sectional view cut through the flow channel 32 in the corresponding FIG. 7A) An open first flow channel 30 is shown, and FIG. 7H shows the first flow channel 30 closed by pressurizing the second flow channel 32.

図７Ｂを参照すると、第１のフローチャネル３０および第２のフローチャネル３２が示される。膜２５は、フローチャネルを分離し、第１のフローチャネル３０の上部および第２のフローチャネル３２の底部を形成する。見られ得るように、フローチャネル３０は、「開いて」いる。 Referring to FIG. 7B, a first flow channel 30 and a second flow channel 32 are shown. A membrane 25 separates the flow channels and forms the top of the first flow channel 30 and the bottom of the second flow channel 32. As can be seen, the flow channel 30 is “open”.

図７Ｈにおいて見られ得るように、フローチャネル３２の加圧（その中に導入された気体または液体のいずれかによって）は、膜２５を下向に反らせ、それによりフローチャネル３０を通過する流れＦを締める。従って、チャネル３２内の圧力を変更することにより、直線的に作動可能なバルブシステムが提供され、その結果、フローチャネル３０は、膜２５を必要に応じて動かすことにより、開閉され得る。（例示目的のみのために、図７Ｇのチャネル３０は、「完全に閉じられた」位置ではなく「ほとんど閉じられた」位置で示される。）
このようなバルブは、チャネル自体のルーフを移動（すなわち、膜２５を移動）させることにより作動されるので、この技術により製造されるバルブおよびポンプは、正確にゼロの死容積を有し、そしてこの技術により作製される切り換えバルブは、バルブの有効容積にほぼ等しい死容積（例えば、約１００×１００×１０μｍ＝１００ｐＬ）を有する。膜を移動することにより消費されるこのような死容積および面積は、公知の従来のマイクロバルブよりも約２オーダー小さい。より小さいバルブおよび切り換えバルブならびにより大きいバルブおよび切り換えバルブが、本発明において意図され、そして死容積の範囲の非限定的な列挙としては、１ａＬ〜１μＬ、１００ａＬ〜１００ｎＬ、１ｆＬ〜１０ｎＬ、１００ｆＬ〜１ｎＬ、および１ｐＬ〜１００ｐＬが挙げられる。 As can be seen in FIG. 7H, pressurization of the flow channel 32 (either by gas or liquid introduced therein) deflects the membrane 25 downward, thereby causing the flow F through the flow channel 30 to flow F. Tighten. Thus, changing the pressure in the channel 32 provides a linearly operable valve system so that the flow channel 30 can be opened and closed by moving the membrane 25 as needed. (For illustrative purposes only, the channel 30 of FIG. 7G is shown in a “mostly closed” position rather than a “fully closed” position.)
Such valves are actuated by moving the roof of the channel itself (i.e. moving the membrane 25) so that valves and pumps manufactured by this technique have exactly zero dead volume, and A switching valve made by this technique has a dead volume (eg, about 100 × 100 × 10 μm = 100 pL) approximately equal to the effective volume of the valve. Such dead volume and area consumed by moving the membrane is about two orders of magnitude less than known conventional microvalves. Smaller valves and switching valves and larger valves and switching valves are contemplated in the present invention, and a non-limiting list of dead volume ranges is 1 aL to 1 μL, 100 aL to 100 nL, 1 fL to 10 nL, 100 fL to 1 nL. , And 1 pL to 100 pL.

本発明に従うポンプおよびバルブにより送達され得る非常に小さい容積は、実質的な利点を示す。詳細には、手動で測定可能な流体の最小の既知の容積は、約０．１μｌである。自動化システムにより測定可能な最小の既知の容積は、約１０倍大きい（１μｌ）。本発明に従うポンプおよびバルブを使用すると、１０ｎｌ以下の液体の容積が、慣用的に測定され得、そして分配され得る。本発明により可能にされる非常に小さい容積の流体の正確な測定は、多数の生物学的用途（診断試験およびアッセイを含む）において非常に価値がある。 The very small volume that can be delivered by the pumps and valves according to the invention represents a substantial advantage. Specifically, the smallest known volume of fluid that can be measured manually is about 0.1 μl. The smallest known volume that can be measured by an automated system is about 10 times larger (1 μl). Using pumps and valves according to the present invention, a volume of liquid of 10 nl or less can be routinely measured and dispensed. The accurate measurement of very small volume fluids enabled by the present invention is very valuable in many biological applications, including diagnostic tests and assays.

式１は、均一な厚みを有する矩形で線形の弾性の等方性のプレートの、適用された圧力による変形の非常に単純化された数学的モデルを表す：
（１）ｗ＝（ＢＰｂ^４）／（Ｅｈ^３）
ここで、
ｗ＝プレートの変形；
Ｂ＝形状係数（長さ対幅、およびプレートの縁部の支持に依存する）；
Ｐ＝適用される圧力；
ｂ＝プレートの幅
Ｅ＝ヤング率；および
ｈ＝プレートの厚み。 Equation 1 represents a very simplified mathematical model of deformation due to applied pressure of a rectangular, linear, elastic isotropic plate with uniform thickness:
(1) w = (BPb ⁴ ) / (Eh ³ )
here,
w = plate deformation;
B = shape factor (depends on length vs. width and support of the edge of the plate);
P = applied pressure;
b = plate width E = Young's modulus; and h = plate thickness.

従って、この非常に単純化された式においてでさえ、圧力に応答するエラストマー膜の変形は、以下の関数である：この膜の長さ、幅および厚み、この膜の可撓性（ヤング率）、ならびに適用される作動力。これらのパラメーターの各々は、本発明に従う特定のエラストマーデバイスの実施の寸法および物理的組成に依存して大きく異なるので、広範な膜の厚みおよび弾性、チャネル幅、および作動力が、本発明によって意図される。 Thus, even in this very simplified equation, deformation of an elastomeric membrane in response to pressure is a function of: length, width and thickness of the membrane, flexibility (Young's modulus) of the membrane As well as the actuation force applied. Since each of these parameters varies greatly depending on the implementation dimensions and physical composition of a particular elastomeric device according to the present invention, a wide range of membrane thicknesses and elasticity, channel widths, and actuation forces are contemplated by the present invention. Is done.

一般的に、膜は均一な厚みを有さず、膜厚は長さおよび幅と比較して小さい必要はなく、そして変形は、この膜の長さ、幅または厚みと比較して小さい必要はないので、すぐ上で示された式は近似に過ぎないことが理解されるべきである。それにもかかわらず、この式は、変形対適用される力の所望の応答を達成するために有用なパラメーターを調整するための有用なガイドとしてはたらく。 In general, the membrane does not have a uniform thickness, the thickness need not be small compared to the length and width, and the deformation need not be small compared to the length, width or thickness of the membrane. It should be understood that the equation shown immediately above is only an approximation, since there is not. Nevertheless, this equation serves as a useful guide for adjusting the parameters useful to achieve the desired response of deformation versus applied force.

図８Ａおよび８Ｂは、１００μｍ幅の第１のフローチャネル３０、および５０μｍ幅の第２のフローチャネル３２についてのバルブ開口対適用される圧力を例示する。このデバイスの膜を、約３０μｍの厚みおよび約７５０ｋＰａのヤング率を有するＧｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃＳｉｌｉｃｏｎｅｓＲＴＶ６１５の層により形成した。図２１ａおよび２１ｂは、バルブの開口の程度が適用される圧力の範囲のほとんどにわたって実質的に直線的であることを示す。 FIGS. 8A and 8B illustrate valve openings versus applied pressure for a first flow channel 30 100 μm wide and a second flow channel 32 50 μm wide. The device membrane was formed by a layer of General Electric Silicones RTV 615 having a thickness of about 30 μm and a Young's modulus of about 750 kPa. Figures 21a and 21b show that the degree of valve opening is substantially linear over most of the range of pressures applied.

空気圧を、外径０．０２５インチおよび内径０．０１３インチのステンレス鋼皮下チューブの２５ｍｍの部品に取り付けられた外径０．０２５インチを有するプラスチックチューブの１０ｃｍ長の部品を通して、このデバイスの膜に適用した。このチューブを、制御チャネルに対して垂直な方向で、エラストマーブロックに挿入することによって、この制御チャネルと接触させた。空気圧を、ＬｅｅＣｏ．製の外部ＬＨＤＡ小型ソレノイドバルブから皮下チューブに適用した。 Air pressure is applied to the membrane of the device through a 10 cm long piece of plastic tube having an outer diameter of 0.025 inch attached to a 25 mm piece of stainless steel hypodermic tube having an outer diameter of 0.025 inch and an inner diameter of 0.013 inch. Applied. The tube was brought into contact with the control channel by inserting it into the elastomer block in a direction perpendicular to the control channel. Air pressure was measured by Lee Co. Applied to the hypodermic tube from an external LHDA small solenoid valve made by the manufacturer.

デバイスを通る材料の流れの制御は、従来、適用される気体圧を使用することが記載されているが、他の流体は使用できなかった。 Control of material flow through the device has been described in the past using applied gas pressure, but other fluids could not be used.

例えば、空気は、圧縮可能であり、従って、外部ソレノイドバルブによる圧力の適用の時間とこの圧力が膜により経験される時間との間にある程度の有限の遅れを被る。本発明の代替の実施形態において、圧力は、外部供給源から非圧縮可能流体（例えば、水または水硬性油）に適用され得、その結果、膜に適用された圧力のほぼ即時の伝達が生じる。しかし、バルブの移動流体が大きいかまたは制御チャネルが狭い場合、より高い粘度の制御流体が、作動の遅延に寄与し得る。従って、圧力を伝達するために最適な媒体は、特定の用途およびデバイスの構成に依存し、そして気体媒体および液体媒体の両方が、本発明により意図される。 For example, air is compressible and therefore suffers some finite delay between the time of application of pressure by the external solenoid valve and the time this pressure is experienced by the membrane. In an alternative embodiment of the present invention, pressure can be applied to an incompressible fluid (eg, water or hydraulic oil) from an external source, resulting in an almost immediate transfer of the pressure applied to the membrane. . However, if the valve moving fluid is large or the control channel is narrow, a higher viscosity control fluid may contribute to the delay in operation. Thus, the optimal medium for transmitting pressure depends on the particular application and device configuration, and both gaseous and liquid media are contemplated by the present invention.

上記のような外部適用圧力は、圧力調整器および外部小型バルブを介してポンプ／タンクシステムにより適用されるが、外部圧力を適用する他の方法（ガスタンク、圧縮機、ピストンシステムおよび液体のカラム）もまた本発明において意図される。例えば、生きた生物内に見出されるような天然に存在する圧力供給源（例えば、血圧、胃圧、能脊髄液に存在する圧力、眼内空間に存在する圧力、および通常の湾曲の間の筋肉により及ぼされる圧力）の使用もまた、意図される。外部圧力を調節する他の方法（例えば、小型バルブ、ポンプ、巨視的蠕動ポンプ、ピンチバルブおよび当該分野で公知の他のタイプの流体調節機器）の使用もまた意図される。 Externally applied pressure as described above is applied by the pump / tank system via a pressure regulator and an external small valve, but other methods of applying external pressure (gas tanks, compressors, piston systems and liquid columns) Is also contemplated in the present invention. For example, naturally occurring pressure sources such as those found in living organisms (eg, blood pressure, gastric pressure, pressure in the spinal fluid, pressure in the intraocular space, and muscles during normal curvature The use of pressure exerted by is also contemplated. The use of other methods of adjusting external pressure (eg, small valves, pumps, macroscopic peristaltic pumps, pinch valves, and other types of fluid regulating devices known in the art) is also contemplated.

見られ得るように、本発明の実施形態に従うバルブの応答は、最小のヒステリシスで、その移動範囲の大部分にわたってほとんど完全な線形であることが実験的に示されている。従って、本発明のバルブは、ミクロ流体測定および流体制御のために理想的に適している。バルブ応答の線形性は、個々のバルブが、フックの法則のバネとして十分にモデリングされていることを示す。さらに、フローチャネル内の高圧（すなわち、背圧）は、単に作動圧力を増加することによって打ち勝たれ（ｃｏｕｎｔｅｒｅｄ）得る。実験的に、本発明者らは、７０ｋＰａの背圧でバルブの閉鎖を達成したが、より高い圧力もまた意図される。以下は、本発明により包含される圧力範囲の非排他的な列挙である：１０Ｐａ〜２５ＭＰａ；１００Ｐａ〜１０ＭＰａ、１ｋＰａ〜１ＭＰａ、１ｋＰａ〜３００ｋＰａ、５ｋＰａ〜２００ｋＰａ、および１５ｋＰａ〜１００ｋＰａ。 As can be seen, it has been experimentally shown that the response of a valve according to an embodiment of the invention is almost perfectly linear over most of its travel range with minimal hysteresis. Accordingly, the valve of the present invention is ideally suited for microfluidic measurement and fluid control. The linearity of the valve response indicates that the individual valves are well modeled as hook law springs. Further, the high pressure (ie, back pressure) in the flow channel can be countered by simply increasing the operating pressure. Experimentally, we achieved valve closure with a back pressure of 70 kPa, although higher pressures are also contemplated. The following is a non-exclusive list of pressure ranges encompassed by the present invention: 10 Pa to 25 MPa; 100 Pa to 10 MPa, 1 kPa to 1 MPa, 1 kPa to 300 kPa, 5 kPa to 200 kPa, and 15 kPa to 100 kPa.

バルブおよびポンプは、開閉するために線形作動を必要としないが、線形応答により、バルブは、測定デバイスとしてより容易に使用され得る。本発明の一実施形態において、バルブの開放は、公知の閉鎖の程度まで部分的に作動されることによって、流速を制御するために使用される。線形バルブ作動により、バルブを所望の閉鎖の程度まで閉じるのに必要な作動力の量を決定することが容易になる。線形作動の別の利点は、バルブの作動に必要な力が、フローチャネル内の圧力から容易に決定され得ることである。作動が線形である場合、フローチャネル内の圧力の増加は、同じ圧力（単位面積あたりの力）をバルブの作動部分に加えることにより、打ち勝たれ得る。 Valves and pumps do not require linear actuation to open and close, but due to the linear response, the valves can be used more easily as measurement devices. In one embodiment of the invention, the opening of the valve is used to control the flow rate by being partially actuated to a known degree of closure. Linear valve actuation facilitates determining the amount of actuation force required to close the valve to the desired degree of closure. Another advantage of linear actuation is that the force required to actuate the valve can be easily determined from the pressure in the flow channel. If the actuation is linear, the increase in pressure in the flow channel can be overcome by applying the same pressure (force per unit area) to the actuation portion of the valve.

バルブの線形性は、構造、組成およびバルブ構造の作動方法に依存する。さらに、線形性がバルブにおける所望の特徴であるか否かは、用途に依存する。従って、線形および非線形の作動可能バルブが、本発明において意図され、そしてバルブが線形作動可能である圧力範囲は、特定の実施形態に伴って変化する。 The linearity of the valve depends on the structure, composition and method of operation of the valve structure. Furthermore, whether linearity is a desired feature in the valve depends on the application. Thus, linear and non-linear actuatable valves are contemplated in the present invention, and the pressure range over which the valve is linearly actuable varies with the particular embodiment.

図９は、上記のように、チップから空気圧式バルブに接続された１０ｃｍ長の空気チューブを有する１００μｍ×１００μｍ×１０μｍのＲＴＶマイクロバルブの時間応答（すなわち、適用される圧力の変化に応答する時間の関数としてのバルブの閉鎖）を例示する。 FIG. 9 shows the time response of a 100 μm × 100 μm × 10 μm RTV microvalve with a 10 cm long air tube connected from the tip to a pneumatic valve as described above (ie, the time to respond to changes in applied pressure). The valve closure as a function of

デジタル制御シグナルの２つの期間、チューブの末端における実際の空気圧およびバルブの開口が、図９に示される。制御ラインに適用される圧力は、１００ｋＰａであり、これは、バルブを閉鎖するのに必要な約４０ｋＰａよりも実質的に高い。従って、閉鎖する場合、バルブは、必要な圧力よりも６０ｋＰａ高い圧力で、押し閉じられる。しかし、開く場合、バルブは、そのバネ直（４０ｋＰａ以下）によりその静止位置まで戻される。従って、τ_{ｃｌｏｓｅ}は、τ_ｏｐｅｎよりも小さいことが予想される。圧力を制御するために使用される小型バルブの制限に起因して、制御シグナルと制御圧力応答との間のずれもまた存在する。このようなずれをｔ、１／ｅ時間定数をτと呼ぶと、値は、ｔ_ｏｐｅｎ＝３．６３ｍｓ、τ_ｏｐｅｎ＝１．８８ｍｓ、ｔ_{ｃｌｏｓｅ}＝２．１５ｍｓ、τ_{ｃｌｏｓｅ}＝０．５１ｍｓである。３つのτの各々が、開閉を可能にする場合、このバルブは、水溶液で満たされた場合、７５Ｈｚにおいて最適に作動する。 The actual air pressure and valve opening at the end of the tube during the two periods of the digital control signal are shown in FIG. The pressure applied to the control line is 100 kPa, which is substantially higher than about 40 kPa required to close the valve. Thus, when closing, the valve is pushed closed at a pressure 60 kPa higher than the required pressure. However, when opening, the valve is returned to its rest position by its spring straightness (40 kPa or less). Therefore, τ _close is expected to be smaller than τ _open . There is also a deviation between the control signal and the control pressure response due to the limitations of the small valve used to control the pressure. If such a shift is called t and the 1 / e time constant is called τ, the values are t _open = 3.63 ms, τ _open = 1.88 ms, t _close = 2.15 ms, and τ _close = 0.51 ms. . If each of the three τs allows opening and closing, the valve operates optimally at 75 Hz when filled with an aqueous solution.

開口および閉鎖のずれを受けなかった別の作動方法を使用する場合、このバルブは、約３７５Ｈｚで作動する。膜厚を変えることによってバネ定数が調節され得ることもまた注意のこと。これは、速い開口および速い閉鎖の最適化を可能にする。バネ定数はまた、膜にドーパントを導入することによってまたは膜として働く異なるエラストマー材料を使用することによって（図７Ｃ〜７Ｈと共に上で示される）とおそらく同様に、膜の弾性（ヤング率）を変えることによって調節され得る。 The valve operates at about 375 Hz when using another method of operation that did not suffer from opening and closing deviations. Note also that the spring constant can be adjusted by changing the film thickness. This allows for optimization of fast opening and fast closing. The spring constant also changes the elasticity (Young's modulus) of the membrane, perhaps similar to by introducing a dopant into the membrane or by using a different elastomeric material that acts as a membrane (shown above with FIGS. 7C-7H). Can be adjusted.

図９に例示されるように、バルブ特性を実験的に測定する場合、バルブの開口を蛍光によって測定した。この実験において、フローチャネルを、緩衝液（ｐＨ≧８）中のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の溶液で満たし、そして、チャネルの中心の約３分の１を占めるある平方面積の蛍光を、１０ｋＨｚのバンド幅を有する光電子増倍管を備えるエピ蛍光顕微鏡でモニタリングする。この圧力を、ほとんど同じ空気圧式接続を介する制御ラインと同時に加圧される、Ｗｈｅａｔｓｔｏｎｅ−ｂｒｉｄｇｅ圧力センサ（ＳｅｎＳｙｍＳＣＣ１５ＧＤ２）を用いてモニタリングした。 As illustrated in FIG. 9, when experimentally measuring the valve characteristics, the opening of the valve was measured by fluorescence. In this experiment, the flow channel was filled with a solution of fluorescein isothiocyanate (FITC) in buffer (pH ≧ 8) and a square area of fluorescence occupying about one third of the center of the channel at 10 kHz. Monitor with an epifluorescence microscope equipped with a photomultiplier tube with bandwidth. This pressure was monitored using a Wheatstone-bridge pressure sensor (SenSymSCC15GD2) that was pressurized simultaneously with the control line via almost the same pneumatic connection.

（６．フローチャネルの断面）
本発明のフローチャネルは、必要に応じて、異なる断面サイズおよび形状で設計され得、それらの所望の用途に依存して、異なる利点を与える。例えば、下部フローチャネルの断面形状は、その長さ全体に沿ってかまたは上部交差チャネルの下に配置される領域中に湾曲上部表面を有し得る。このような湾曲上部表面は、以下のように、バルブのシーリングを容易にする。 (6. Cross section of flow channel)
The flow channels of the present invention can be designed with different cross-sectional sizes and shapes as needed, providing different advantages depending on their desired application. For example, the cross-sectional shape of the lower flow channel may have a curved upper surface along its entire length or in a region located below the upper intersecting channel. Such a curved upper surface facilitates valve sealing as follows.

図１０を参照すると、フローチャネル３０および３２を通る断面図（図７Ｂの断面図と類似）が示される。見られ得るように、フローチャネル３０は、矩形の断面形状である。本発明の代替の好ましい局面において、図１０に示されるように、フローチャネル３０の断面は、上部湾曲表面を有する。 Referring to FIG. 10, a cross-sectional view through flow channels 30 and 32 (similar to the cross-sectional view of FIG. 7B) is shown. As can be seen, the flow channel 30 has a rectangular cross-sectional shape. In an alternative preferred aspect of the invention, as shown in FIG. 10, the cross section of the flow channel 30 has an upper curved surface.

最初に図１０を参照すると、フローチャネル３２が加圧される場合、フローチャネル３０および３２を分離しているエラストマーブロック２４の膜部分２５は、破線２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、２５Ｄおよび２５Ｅにより示される連続的な部分に向かって下向きに動く。見られ得るように、おそらく、不完全なシーリングが、平面基材１４に隣接するフローチャネル３０の縁部において生じ得る。 Referring initially to FIG. 10, when the flow channel 32 is pressurized, the membrane portion 25 of the elastomer block 24 separating the flow channels 30 and 32 is indicated by dashed lines 25A, 25B, 25C, 25D and 25E. Move downward toward a continuous part. As can be seen, possibly incomplete sealing may occur at the edge of the flow channel 30 adjacent to the planar substrate 14.

図１１の代替の好ましい実施形態において、フローチャネル３０ａは、湾曲上部壁２５Ａを有する。フローチャネル３２が加圧される場合、膜部分２５は、破線２５Ａ２、２５Ａ３、２５Ａ４および２５Ａ５により示される連続した位置まで下向きに動き、膜の縁部分は、最初にフローチャネルに向かって動き、次いで、上部膜部分に向かって動く。このような湾曲上部表面を膜２５Ａにおいて有することの利点は、より完全なシールが、フローチャネル３２が加圧される場合に提供されることである。詳細には、フローチャネル３０の上部壁は、平面基材１４に対して連続的に接触する縁部を提供し、それにより、壁２５と図１０に示されるフローチャネル３０の底部との間に見られる接触の「島（ｉｓｌａｎｄ）」を回避する。 In the alternative preferred embodiment of FIG. 11, the flow channel 30a has a curved upper wall 25A. When the flow channel 32 is pressurized, the membrane portion 25 moves downward to a continuous position indicated by dashed lines 25A2, 25A3, 25A4 and 25A5, the membrane edge portion first moving towards the flow channel, and then , Move towards the upper membrane part. The advantage of having such a curved upper surface in the membrane 25A is that a more complete seal is provided when the flow channel 32 is pressurized. In particular, the top wall of the flow channel 30 provides an edge that is in continuous contact with the planar substrate 14 so that it is between the wall 25 and the bottom of the flow channel 30 shown in FIG. Avoid the "islands" of contact seen.

湾曲上部フローチャネル表面を膜２５Ａにおいて有することの別の利点は、この膜が、作動に応答して、フローチャネルの形状および容積により容易に適合し得ることである。詳細には、矩形のフローチャネルが用いられる場合、全周囲（２×フローチャネルの高さ＋フローチャネルの幅）が、このフローチャネルに押しつけられなければならない。しかし、アーチ形のフローチャネルが使用される場合、材料のより小さい周囲（半円のアーチ形部分のみ）が、このチャネルに押しつけられなければならない。このように、膜は、作動のために周囲の小さい変化しか必要とせず、従って、フローチャネルをブロックするために適用される作動力により応答性である。 Another advantage of having a curved upper flow channel surface at the membrane 25A is that it can be more easily adapted to the shape and volume of the flow channel in response to actuation. Specifically, if a rectangular flow channel is used, the entire circumference (2 × flow channel height + flow channel width) must be pressed against this flow channel. However, if an arched flow channel is used, the smaller perimeter of the material (only the semicircular arched portion) must be forced against this channel. Thus, the membrane requires only a small change in the surroundings for actuation and is therefore more responsive to the actuation force applied to block the flow channel.

代替の局面（図示せず）、フローチャネル３０の底部は丸く、その結果、この湾曲した表面は、上記の図２０において見られるように、湾曲上部壁２５Ａと一致する。 In an alternative aspect (not shown), the bottom of the flow channel 30 is rounded so that this curved surface coincides with the curved top wall 25A as seen in FIG. 20 above.

まとめると、作動時に膜により受ける実際の構造変化は、特定のエラストマー構造の構成に依存する。詳細には、この構造変化は、膜の長さ、幅および厚みのプロフィール、その残りの構造への付着、フローチャネルおよび制御チャネルの高さ、幅および形状、ならびに使用されるエラストマーの材料特性に依存する。この構造変化はまた、適用される圧力に応答する膜の作動が、磁力または静電力に応答する作動とは幾分か異なる場合に、作動方法に依存する。 In summary, the actual structural changes experienced by the membrane during operation depend on the configuration of the particular elastomeric structure. Specifically, this structural change depends on the length, width and thickness profile of the membrane, its attachment to the remaining structure, the height, width and shape of the flow and control channels, and the material properties of the elastomer used. Dependent. This structural change also depends on the method of operation when the operation of the membrane in response to the applied pressure is somewhat different from the operation in response to magnetic or electrostatic forces.

さらに、膜における所望の構造変化はまた、エラストマー構造についての特定の用途に依存して変わる。上記の最も単純な実施形態において、バルブは、バルブの閉鎖の程度を制御するために、測定しながら開かれるかまたは閉じられるかのいずれかであり得る。しかし、他の実施形態において、より複雑な流れの調節を達成するために、膜および／またはフローチャネルの形状を変更することが望まれ得る。例えば、このフローチャネルに、膜部分の下の隆起した突出部が設けられ得、その結果、作動時において、この膜は、フローチャネルを通る流れのある割合のみを遮断し、適用された作動力に非感受性の流れの割合がブロックされる。 Furthermore, the desired structural changes in the membrane will also vary depending on the particular application for the elastomeric structure. In the simplest embodiment described above, the valve can be either opened or closed while measuring to control the degree of valve closure. However, in other embodiments, it may be desirable to change the shape of the membrane and / or flow channel to achieve more complex flow regulation. For example, the flow channel can be provided with a raised protrusion below the membrane portion so that, in operation, the membrane blocks only a certain percentage of the flow through the flow channel and the applied actuation force The proportion of insensitive flow is blocked.

多くの膜圧プロフィールおよびフローチャネルの断面（矩形、台形、円形、楕円形、放物線形、双曲線形および多角形、ならびに上記の形状の部分を含む）が、本発明によって意図される。より複雑な断面形状（例えば、すぐ上で議論された突出物を有する実施形態またはフローチャネル中に凹部を有する実施形態）もまた、本発明により意図される。 Many membrane pressure profiles and cross-sections of flow channels (including rectangular, trapezoidal, circular, elliptical, parabolic, hyperbolic and polygonal, and portions of the above shapes) are contemplated by the present invention. More complex cross-sectional shapes (e.g., embodiments having protrusions discussed above or embodiments having recesses in the flow channel) are also contemplated by the present invention.

さらに、本発明は、フローチャネルの壁部および天井部がエラストマーから形成され、そしてこのチャネルの床部が下にある基材から形成されている実施形態と共に、主に上で記載されているが、本発明は、この特定の配向に限定されない。チャネルの壁部および床部はまた、下にある基材中に形成され得、フローチャネルの天井部のみがエラストマーから構築される。このエラストマーフローチャネルの天井部は、適用される作動力に応答して、チャネルに向かって下向きに突出し、それにより、このフローチャネルを通る材料の流れを制御する。一般に、本願の他の場所で記載されるようなモノリシックエラストマー構造は、ミクロ流体用途に好ましい。しかし、このような配置が利点を提供する場合、基材中に形成されたチャネルを用いることが有用であり得る。例えば、光導波管を備える基材が構築され、その結果、この光導波管は、光を、特にミクロ流体チャネルの側面に方向付ける。 Further, the present invention has been described primarily above, with embodiments in which the flow channel walls and ceiling are formed from an elastomer and the channel floor is formed from an underlying substrate. The present invention is not limited to this particular orientation. The channel walls and floor may also be formed in the underlying substrate, with only the ceiling of the flow channel being constructed from elastomer. The ceiling of the elastomeric flow channel protrudes downward toward the channel in response to an applied actuation force, thereby controlling the flow of material through the flow channel. In general, monolithic elastomeric structures as described elsewhere in this application are preferred for microfluidic applications. However, if such an arrangement provides advantages, it may be useful to use channels formed in the substrate. For example, a substrate comprising an optical waveguide is constructed so that the optical waveguide directs light, particularly to the sides of the microfluidic channel.

（７．相互接続システム）
図１２Ａおよび１２Ｂは、上記のシステム（例えば、図７Ａにおけるシステム）と同一の、単一オン／オフバルブの図を示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、図１２において見られるように、複数の単一アドレス可能オン／オフバルブから構成されるが、一緒に相互接続された蠕動ポンプシステムを示す。図１４は、図１３の蠕動ポンプシステムについての実験的に達成されるポンプ速度対振動数を示すグラフである。図１５Ａはおよび１５Ｂは、単一制御ラインにより制御可能な複数のフローチャネルの概略図を示す。このシステムはまた、一緒に多重化された図１２の複数の単一アドレス可能オン／オフバルブから構成されるが、図１２のシステムとは異なる配置である。図１６は、選択したチャネルを通る流体の流れを可能にするよう適合された多重化システムの概略図であり、これは、一緒に連結または相互接続された、図１２の複数の単一オン／オフバルブから構成される。 (7. Interconnect system)
12A and 12B show a diagram of a single on / off valve identical to the system described above (eg, the system in FIG. 7A). FIGS. 13A and 13B show a peristaltic pump system composed of a plurality of single addressable on / off valves, as seen in FIG. 12, but interconnected together. FIG. 14 is a graph showing experimentally achieved pump speed versus frequency for the peristaltic pump system of FIG. 15A and 15B show schematic diagrams of multiple flow channels that can be controlled by a single control line. This system also consists of a plurality of single addressable on / off valves of FIG. 12 multiplexed together, but in a different arrangement than the system of FIG. FIG. 16 is a schematic diagram of a multiplexing system adapted to allow fluid flow through selected channels, which includes a plurality of single on / off of FIG. 12 coupled or interconnected together. It consists of an off valve.

図１２Ａおよび１２Ｂを初めに参照すると、フローチャネル３０および３２の概略が示される。フローチャネル３０は、好ましくは、これを通る流体（または気体）の流れＦを有する。フローチャネル３２（これは、本明細書中ですでに説明されたように、フローチャネル３０の上を横切る）は、加圧され、その結果、このフローチャネルを分離する膜２５は、説明されたように、フローチャネル３０の通路に押し下げられ得、そこを通る流れＦの通路を遮断する。このように、「フローチャネル」３２はまた、「制御ライン」とも呼ばれ得、これは、フローチャネル３０中の単一バルブを作動する。図１２〜１５において、複数のこのようなアドレス可能バルブが、種々の配置で一緒に連結または相互接続されて、蠕動ポンピング可能なポンプ、および他の流体理論的適用を生成する。 Referring initially to FIGS. 12A and 12B, a schematic of flow channels 30 and 32 is shown. The flow channel 30 preferably has a fluid (or gas) flow F therethrough. The flow channel 32 (which crosses over the flow channel 30 as previously described herein) is pressurized so that the membrane 25 separating this flow channel has been described. As such, it can be pushed down into the passage of the flow channel 30 to block the passage of the flow F therethrough. Thus, “flow channel” 32 may also be referred to as a “control line”, which operates a single valve in flow channel 30. In FIGS. 12-15, a plurality of such addressable valves are coupled or interconnected together in various arrangements to create a peristaltic pumpable pump, and other fluid theoretical applications.

図１３Ａおよび１３Ｂを参照すると、蠕動ポンピングのためのシステムが、以下のように提供される。フローチャネル３０は、その上を通過する複数のほぼ平行なフローチャネル（すなわち、制御ライン）３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃを有する。制御ライン３２Ａを加圧することによって、フローチャネル３０を通る流れＦは、制御ライン３２Ａおよびフローチャネル３０の交差部において、膜２５Ａの下で遮断される。同様に、（図示しないが）制御ライン３２Ｂを加圧することによって、フローチャネル３０を通る流れＦは、制御ライン３２Ｂおよびフローチャネル３０の交差部において膜２５Ｂの下で遮断される。以下同様である。 Referring to FIGS. 13A and 13B, a system for peristaltic pumping is provided as follows. The flow channel 30 has a plurality of generally parallel flow channels (i.e., control lines) 32A, 32B and 32C passing over it. By pressurizing the control line 32A, the flow F through the flow channel 30 is blocked under the membrane 25A at the intersection of the control line 32A and the flow channel 30. Similarly, by pressurizing control line 32B (not shown), flow F through flow channel 30 is blocked under membrane 25B at the intersection of control line 32B and flow channel 30. The same applies hereinafter.

各制御ライン３２Ａ、３２Ｂおよび３２Ｃは個別にアドレス可能である。従って、蠕動は、３２Ａおよび３２Ｃを一緒に作動させる様式によって作動され得、３２Ａによって作動され、３２Ａおよび３２Ｂによって一緒に作動され、３２Ｂによって作動され、３２ＢおよびＣによって一緒に作動される、などがある。このことは、継続的な「１０１、１００、１１０、０１０、０１１、００１」の様式に一致し、この場合、「０」は「バルブ開」を示し、そして「１」は「バルブ閉」を示す。この蠕動様式はまた、１２０°様式として知られる（３つのバルブ間の作動のフェーズ角度に関連している）。他の蠕動様式は等価的に可能であり、６０°および９０°の様式を含む。 Each control line 32A, 32B and 32C is individually addressable. Thus, peristalsis can be actuated by the mode of actuating 32A and 32C together, actuated by 32A, actuated by 32A and 32B, actuated by 32B, actuated by 32B and C, etc. is there. This is consistent with the continuous “101, 100, 110, 010, 011, 001” format, where “0” indicates “valve open” and “1” indicates “valve closed”. Show. This peristaltic mode is also known as the 120 ° mode (related to the phase angle of operation between the three valves). Other peristaltic modes are equally possible, including 60 ° and 90 ° modes.

本発明者らによって実施された実験において、２．３５ｎＬ／ｓのポンプ速度は、作動圧力４０ｋＰａの下で１００×１００×１０μｍのバルブを有する細管（内径０．５ｍｍ）中の１カラムの水が移動する距離を測定することによって、測定される。このポンプ速度は、約７５Ｈｚまでの作動周波数に伴って増加し、それから約２００Ｈｚ以上までほぼ一定であった。バルブおよびポンプはまた、かなり耐久性があり、そしてエラストマー膜も制御チャンネルもボンドも、全く破損が観察されなかった。本発明者らによって実施された実験において、本明細書中に記載される蠕動ポンプの全てのバルブは、４００万回以上の作動後に摩耗の徴候も消耗の徴候も全く示さない。これらの耐久性に加えて、これらはまた軟質性でもある。チャンネルを通って汲み出され、そして生存率が試験されたＥ．ｃｏｌｉ溶液は、９４％の生存率を示した。 In an experiment conducted by the inventors, a pump speed of 2.35 nL / s was obtained when one column of water in a capillary tube (inner diameter 0.5 mm) with a 100 × 100 × 10 μm valve under an operating pressure of 40 kPa. Measured by measuring the distance traveled. This pump speed increased with operating frequency up to about 75 Hz and then remained nearly constant up to about 200 Hz and above. The valves and pumps were also quite durable and no failure was observed in the elastomeric membrane, the control channel, or the bond. In experiments conducted by the inventors, all valves of the peristaltic pump described herein show no signs of wear or signs of wear after more than 4 million operations. In addition to their durability, they are also flexible. E. pumped through channel and tested for viability. The E. coli solution showed a 94% survival rate.

図１４は、図１３の蠕動ポンプシステムについて、実験的に達成された蠕動速度対蠕動周波数を示すグラフである。 FIG. 14 is a graph showing the peristaltic speed versus peristaltic frequency achieved experimentally for the peristaltic pump system of FIG.

図１５Ａおよび図１５Ｂは、図１２のアドレス可能な複数のバルブの、別の組み立て方法を図示する。具体的には、複数の並行なフローチャンネル３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃが提供される。フローチャンネル（すなわち、制御ライン）３２は、フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃを横断して通じる。制御ライン３２の加圧は、制御ライン３２ならびにフローチャンネル３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃの交差部分に位置する膜２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃを押し下げることによって、フローＦ１、Ｆ２およびＦ３を同時に閉じる。 15A and 15B illustrate another method of assembling the addressable valves of FIG. Specifically, a plurality of parallel flow channels 30A, 30B and 30C are provided. A flow channel (ie, control line) 32 passes across the flow channels 30A, 30B, and 30C. Pressurization of the control line 32 simultaneously closes the flows F1, F2 and F3 by depressing the membrane 25A, 25B and 25C located at the intersection of the control line 32 and the flow channels 30A, 30B and 30C.

図１６は、以下のように、流体が選択されたチャンネルを通って選択的に流れ得るように適合された、多重化システムの模式図である。膜（例えば、図１５Ａおよび図１５Ｂ中の膜２５Ａ、２５Ｂおよび２５Ｃ）上を通過する制御ラインからそれぞれのフローチャンネルを分ける膜の下向きの偏向は、膜の大きさに強く依存する。従って、図１５Ａおよび１５Ｂ中のフローチャンネル制御ライン３２の幅を変化することによって、制御ラインを複数のフローチャンネルを越えて通過させ得、さらに所望のフローチャンネルのみを作動（すなわち、遮断）させ得る。図１６は、以下の通り、このようなシステムの概略図を示す。 FIG. 16 is a schematic diagram of a multiplexing system adapted to allow fluid to selectively flow through selected channels as follows. The downward deflection of the membrane separating each flow channel from the control line passing over the membrane (eg, membranes 25A, 25B and 25C in FIGS. 15A and 15B) is highly dependent on the size of the membrane. Thus, by changing the width of the flow channel control line 32 in FIGS. 15A and 15B, the control line can be passed across multiple flow channels and only the desired flow channel can be activated (ie, blocked). . FIG. 16 shows a schematic diagram of such a system as follows.

複数の並行フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅおよび３０Ｆは、複数の並行制御ライン３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ、３２Ｅおよび３２Ｆの下に配置される。コントロールチャンネル３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ、３２Ｅおよび３２Ｆは、上記の任意のバルブシステムを使用して、以下の変形を備える、並行フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅおよび３０Ｆを通過する流体フローＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６を遮断するように適合される。 The plurality of parallel flow channels 30A, 30B, 30C, 30D, 30E, and 30F are disposed below the plurality of parallel control lines 32A, 32B, 32C, 32D, 32E, and 32F. Control channels 32A, 32B, 32C, 32D, 32E and 32F use any of the valve systems described above and fluids passing through parallel flow channels 30A, 30B, 30C, 30D, 30E and 30F with the following variations: Adapted to block flows F1, F2, F3, F4, F5 and F6.

各制御ライン３２Ａ、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ、３２Ｅおよび３２Ｆは、幅広部分および狭部分の両方を有する。例えば、制御ライン３２Ａは、フローチャンネル３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｅの上方に配置される位置で広がる。同様に、制御ライン３２Ｂは、フローチャンネル３０Ｂ、３０Ｄおよび３０Ｆの上方に配置される位置で広がり、そして制御ライン３２Ｃは、フローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｅおよび３０Ｆの上方に配置される位置で広がる。 Each control line 32A, 32B, 32C, 32D, 32E and 32F has both a wide portion and a narrow portion. For example, the control line 32A extends at a position disposed above the flow channels 30A, 30C, and 30E. Similarly, the control line 32B extends at a position located above the flow channels 30B, 30D, and 30F, and the control line 32C extends at a position positioned above the flow channels 30A, 30B, 30E, and 30F.

それぞれの制御ラインが広がる位置において、その制御ラインの加圧はフローチャンネルと制御ラインとを分ける膜（２５）がフローチャンネル内へと有意に押し下げさせて、これによってその場所を通るフローの通過を妨げる。対照的に、それぞれの制御ラインが狭い位置において、膜（２５）もまた狭い。従って、同程度の加圧では、膜（２５）がフローチャンネル（３０）内へ押し下がることを生じない。従って、流体のその場所の通過は、妨げられない。 In the position where each control line extends, pressurization of that control line causes the membrane (25) separating the flow channel and the control line to be significantly depressed into the flow channel, thereby allowing the passage of flow through that location. Hinder. In contrast, where each control line is narrow, the membrane (25) is also narrow. Therefore, at the same level of pressure, the membrane (25) will not be pushed down into the flow channel (30). Thus, passage of fluid through that location is not hindered.

例えば、制御ライン３２Ａが加圧される場合、これはフローチャンネル３０Ａ、３０Ｃおよび３０Ｅの中のフローＦ１、Ｆ３およびＦ５を妨げる。同様に、制御ライン３２Ｃが加圧される場合、これはフローチャンネル３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｅおよび３０Ｆの中のフローＦ１、Ｆ２、Ｆ５およびＦ６を妨げる。理解され得るように、１本より多い制御ラインは同時に作動され得る。例えば、制御ライン３２Ａおよび３２Ｃは加圧されて、Ｆ４を除く全ての流体フローを同時に妨げる（３２ＡがＦ１、Ｆ３およびＦ５を妨げ、そして３２ＣがＦ１、Ｆ２、Ｆ５およびＦ６を妨げる）。 For example, if the control line 32A is pressurized, this will block the flows F1, F3 and F5 in the flow channels 30A, 30C and 30E. Similarly, if the control line 32C is pressurized, this will block the flows F1, F2, F5 and F6 in the flow channels 30A, 30B, 30E and 30F. As can be appreciated, more than one control line can be activated simultaneously. For example, control lines 32A and 32C are pressurized to simultaneously block all fluid flow except F4 (32A blocks F1, F3 and F5, and 32C blocks F1, F2, F5 and F6).

異なる制御ライン（３２）を、一緒に、そして様々な順序の両方で選択的に加圧することによって、大規模（ｄｅｇｒｅｅ）な流体フローコントロールを達成し得る。さらに、本システムを６より多い並行フローチャンネル（３０）および４より多い並行フローチャンネル（３２）に拡張することによって、そして制御ラインの幅広領域および狭領域の位置を変化させることによって、非常に複雑な流体フローコントロールシステムを組み立て得る。このようなシステムの特徴は、２（ｌｏｇ_２ｎ）本のみの制御ラインを有するｎ本のフローチャンネルのうちの任意の１つのフローチャンネルを作動させることが可能であることである。 By selectively pressurizing the different control lines (32) together and in various orders, a large degree of fluid flow control can be achieved. Furthermore, by extending the system to more than 6 parallel flow channels (30) and more than 4 parallel flow channels (32) and changing the position of the wide and narrow regions of the control line, it is very complex. A simple fluid flow control system. A feature of such a system is that it is possible to activate any one of the n flow channels with only 2 (log ₂ n) control lines.

（８．切り換え可能なフローアレイ）
なお別の新規な実施形態において、流体の通行は２つの直交方向のどちらか一方に流れるように選択的に導かれ得る。このような「切り換え可能なフローアレイ」システムの例を、図２０Ａ〜２０Ｄに提供する。図２０Ａは、固体支柱９２のアレイ（各支柱はその周りにフローチャンネルを通過させる）によって規定されるフローチャンネルグリッドを形成するレセスの様式で底部表面を有する、エラストマー９０（または任意の他の適切な基材）の第１層の底面図を示す。 (8. Switchable flow array)
In yet another novel embodiment, fluid traffic can be selectively directed to flow in either of two orthogonal directions. An example of such a “switchable flow array” system is provided in FIGS. FIG. 20A illustrates an elastomer 90 (or any other suitable) having a bottom surface in the manner of a recess that forms a flow channel grid defined by an array of solid columns 92 (each column passing a flow channel therethrough). The bottom view of the 1st layer of a base material) is shown.

好ましい局面において、エラストマーのさらなる層を、層９０の表面上に結合して、その結果、流体フローが方向Ｆ１または直行方向Ｆ２のどちらかに移動するよう選択的に導かれ得る。図２０は、エラストマー９５の第２層の底部表面の底面図であり、交互性の「垂直」制御ライン９６および「水平」制御ライン９４の形に形成されたレセスを示す。「垂直」制御ライン９６は、エラストマー層に沿って同じ幅を有するが、一方で「水平」制御ライン９４は、示されるように、交互性の幅広部分および狭部分を有する。 In a preferred aspect, an additional layer of elastomer can be bonded onto the surface of layer 90 so that fluid flow can be selectively directed to move in either direction F1 or orthogonal direction F2. FIG. 20 is a bottom view of the bottom surface of the second layer of elastomer 95 showing the recesses formed in alternating “vertical” control lines 96 and “horizontal” control lines 94. The “vertical” control line 96 has the same width along the elastomeric layer, while the “horizontal” control line 94 has alternating wide and narrow portions, as shown.

エラストマー層９５は、エラストマー層９０の上方に位置し、その結果、「垂直」制御ライン９６は図２０Ｃ中に示されるように支柱９２の上方に配置され、そして「水平」制御ライン９４は、図２０Ｄ中に示されるように、支柱９２の間に幅広部分を用いて配置される。 The elastomer layer 95 is located above the elastomer layer 90 so that the “vertical” control line 96 is positioned above the post 92 as shown in FIG. 20C and the “horizontal” control line 94 is shown in FIG. As shown in 20D, they are placed between the struts 92 using wide portions.

図２０Ｃ中に示されるように、「垂直」制御ライン９６が加圧される場合、領域９８において層９０と９５との間に初期配置されるエラストマー層によって形成される統合構造体の膜は、フローチャンネルのアレイの上方で、下方向に歪められ、その結果、示されるように、流入フロー（ｆｌｏｗｉｎ）はフロー方向Ｆ２（すなわち、垂直方向）でのみ通過し得る。 As shown in FIG. 20C, when the “vertical” control line 96 is pressurized, the membrane of the integrated structure formed by the elastomer layer initially placed between the layers 90 and 95 in the region 98 is Above the array of flow channels, it is distorted downward so that, as shown, the flow in can only pass in the flow direction F2 (ie, the vertical direction).

図２０Ｄ中に見られ得るように、「水平」制御ライン９４が加圧される場合、領域９９において層９０と９５との間に初期配置されるエラストマー層によって形成される統合構造体の膜は、フローチャンネルのアレイの上方で（しかし、それらが最も幅広い領域でのみ）、下方向に歪められ、その結果、示されるように、流入フローはフロー方向Ｆ１（すなわち、水平方向）でのみ通過し得る。 As can be seen in FIG. 20D, when the “horizontal” control line 94 is pressurized, the membrane of the integrated structure formed by the elastomer layer initially placed between layers 90 and 95 in region 99 is , Above the array of flow channels (but only in the widest area), distorted downward, so that the inflow flows only in the flow direction F1 (ie, the horizontal direction) as shown. obtain.

図２０Ａ〜Ｄ中に示される設計によって、切り換え可能なフローアレイが、異なるエラストマー層において制御ライン間に通じる垂直の偏向（ｖｉａｓ）を全く必要とせずに、２つのみのエラストマー層から構築され得る。全ての垂直フロー制御ライン９４が接続される場合、これらのラインは１つの入力から加圧され得る。すべての水平フロー制御ライン９６についても、同じことが成立する。 With the design shown in FIGS. 20A-D, a switchable flow array can be constructed from only two elastomer layers without requiring any vertical vias between the control lines in the different elastomer layers. . If all vertical flow control lines 94 are connected, these lines can be pressurized from one input. The same is true for all horizontal flow control lines 96.

（９．セルペン／セルケージ）
本発明のなおさらなる適用において、エラストマー構造体を利用して、生物体または他の生物学的な材料を操作し得る。図２６Ａ〜２６Ｄは、本発明に従うセルペン構造体の１つの実施形態の平面図を示す。 (9. Serpen / Cell cage)
In still further applications of the present invention, elastomeric structures may be utilized to manipulate organisms or other biological materials. 26A-26D show plan views of one embodiment of a serpen structure according to the present invention.

セルペンアレイ（ｃｅｌｌｐｅｎａｒｒａｙ）４４００は、直交に配向されたフローチャネル４４０２のアレイを特徴とし、交互したフローチャネルの交差点にて、細長「ペン」構造４４０４を有する。バルブ４４０６が、各ペン構造４４０４の入口および出口に配置される。蠕動ポンプ構造４４０８が、各水平フローチャネルおよびセルペン構造を欠く垂直フローチャネル上に配置される。 The cell pen array 4400 features an array of orthogonally oriented flow channels 4402 having elongated “pen” structures 4404 at the intersection of alternating flow channels. Valves 4406 are located at the entrance and exit of each pen structure 4404. A peristaltic pump structure 4408 is disposed on the vertical flow channel that lacks each horizontal flow channel and serpen structure.

図２６Ａのセルペンアレイ４４００は、先に区別したセルＡ〜Ｈを装填している。図２６Ｂ〜２６Ｃは、個々に貯蔵されたセルＣの、以下の１）〜３）によるアクセスおよび除去を示す：１）隣接したペン４４０４ａおよび４４０４ｂのいずれかの側へバルブ４４０６を操作する、２）水平フローチャネル４４０２ａをポンピングして、セルＣとＧとを置換する、次いで、３）垂直フローチャネル４４０２ｂをポンピングして、セルＣを除去する。図２６Ｄは、水平フローチャネル４４０２ａを通る液体の流れの方向を反転させることによって、第二セルＧがセルペンアレイ４４００の以前の位置に戻ることを示している。 The cell pen array 4400 of FIG. 26A is loaded with the cells A to H previously distinguished. FIGS. 26B-26C show access and removal of individually stored cell C according to 1) -3) below: 1) Operate valve 4406 to either side of adjacent pens 4404a and 4404b; ) Pump horizontal flow channel 4402a to replace cells C and G; then 3) Pump vertical flow channel 4402b to remove cell C. FIG. 26D shows that the second cell G returns to the previous position of the cell pen array 4400 by reversing the direction of liquid flow through the horizontal flow channel 4402a.

上記のセルペンアレイ４４０４は、アクセスできるような、選択されたアドレス可能な位置内で材料を貯蔵し得る。しかしながら、細胞のような生存生体は、生存可能なままでいるために、食物の連続的な取り込みおよび廃棄物の排出を必要とし得る。従って、図２７Ａおよび２７Ｂは、本発明に従うセルケージ構造の１つの実施形態の、それぞれ平面図および（線４５Ｂ−４５Ｂ’に沿った）断面図を示す。 The cell pen array 4404 described above may store material in selected addressable locations that can be accessed. However, living organisms such as cells may require continuous uptake of food and waste output in order to remain viable. Accordingly, FIGS. 27A and 27B show a plan view and a cross-sectional view (along line 45B-45B '), respectively, of one embodiment of a cell cage structure according to the present invention.

セルケージ４５００は、基材４５０５と接触して、エラストマーブロック４５０３内でフローチャネル４５０１の細長部分４５００ａとして形成される。セルケージ４５００は、セルケージ４５００の端部４５００ｂおよび４５００ｃが内部領域４５００ａを完全には閉鎖していないことを除いては、図２６Ａ〜２６Ｄにおいて上記のような個々のセルペンと類似している。むしろ、ケージ４５００の端部４５００ａおよび４５００ｂは、格納可能な複数のピラー４５０２により形成されている。ピラー４５０２は、図２１Ａ〜２１Ｊとともに広範に上記したように、通常は閉鎖されたバルブ構造の膜構造体の一部であり得る。 The cell cage 4500 is formed as an elongated portion 4500a of the flow channel 4501 within the elastomer block 4503 in contact with the substrate 4505. Cell cage 4500 is similar to the individual cell pens as described above in FIGS. 26A-26D, except that ends 4500b and 4500c of cell cage 4500 do not completely close interior region 4500a. Rather, the ends 4500a and 4500b of the cage 4500 are formed by a plurality of retractable pillars 4502. The pillar 4502 may be part of a normally closed valve structure membrane structure, as broadly described above in conjunction with FIGS.

詳細には、コントロールチャネル４５０４が、ピラー４５０２を覆っている。コントロールチャネル４５０４の圧力が減少された場合、エラストマーピラー４５０２は、コントロールチャネル４５０４内に上向きに引き込まれ、それによって、セルケージ４５００の端４５００ｂが開き、細胞が侵入するのを可能にする。コントロールチャネル４５０４の圧力が上昇した場合、ピラー４５０２は、基材４５０５に対して下向きに緩み、細胞がケージ４５００から出るのを防止する。 Specifically, a control channel 4504 covers the pillar 4502. When the pressure in the control channel 4504 is reduced, the elastomeric pillar 4502 is drawn upwards into the control channel 4504, thereby opening the end 4500b of the cell cage 4500 and allowing cells to enter. When the pressure in the control channel 4504 increases, the pillar 4502 loosens downward relative to the substrate 4505 and prevents cells from exiting the cage 4500.

エラストマーピラー４５０２は、ケージ４５００から細胞が移動するのを防止するのに十分な大きさおよび数のものであるが、貯蔵される細胞を維持するためにケージ内部４５００ａ内への栄養素の流動を可能にするギャップ４５０８もまた備える。対向する端部４５００ｃ上のピラー４５０２は、第二のコーティングチャネル４５０６の下に同様に配置され、ケージの開口および所望の細胞の取り出しを可能にする。 Elastomeric pillar 4502 is of sufficient size and number to prevent migration of cells from cage 4500, but allows nutrients to flow into cage interior 4500a to maintain stored cells A gap 4508 is also provided. Pillars 4502 on opposing ends 4500c are similarly positioned below the second coating channel 4506 to allow for opening of the cage and removal of the desired cells.

図２６Ａ〜２６Ｄに示される、例示される直交流チャネルアーキテクチャを使用して、まさに記載されるセルペン以外の機能を達成し得る。例えば、この直交硫チャネルアーキテクチャは、混合適用の際に利用される。 The illustrated cross-flow channel architecture shown in FIGS. 26A-26D can be used to achieve functions other than the just described serpen. For example, this orthogonal sulfur channel architecture is utilized in mixed applications.

これは、図２８Ａ〜Ｂに示されており、この図は、本発明の別の実施形態に従う微細製作（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）構造によって達成される混合工程の平面図を示す。詳細には、微細製作混合構造の一部７４００は、第二フローチャネル７４０４と直交しかつこのチャネルと交差した、第一フローチャネル７４０２を備える。コントロールチャネル７４０６が、フローチャネル７４０２および７４０４を覆い、そして各交差点７４１２を取り囲むバルブ対７４０８ａ〜ｂおよび７４０８ｃ〜ｄを形成する。 This is illustrated in FIGS. 28A-B, which shows a top view of the mixing process achieved by a microfabricated structure according to another embodiment of the present invention. Specifically, the portion 7400 of the microfabricated mixed structure comprises a first flow channel 7402 that is orthogonal to and intersects the second flow channel 7404. A control channel 7406 covers the flow channels 7402 and 7404 and forms a valve pair 7408a-b and 7408c-d surrounding each intersection 7412.

図２８Ａに示されるように、バルブ対７４０８ｃ〜ｄをはじめに開放し、他方バブル対７４０８ａ〜ｂを閉めると、流体サンプル７４１０は、フローチャネル７４０４を通って交差点７４１２に流れる。次いで、バルブ対７４０８ａ〜ｂを作動させ、交差点７４１２にて流体サンプル７４１０を捕捉する。 As shown in FIG. 28A, when the valve pair 7408c-d is first opened and the bubble pair 7408a-b is closed, the fluid sample 7410 flows through the flow channel 7404 to the intersection 7412. Valve pair 7408a-b is then actuated to capture fluid sample 7410 at intersection 7412.

次に、図２８Ｂに示されるように、バルブ対７４０８ｃ〜ｄを閉じ、７４０８ａ〜ｂおよびを開くと、その結果、流体サンプル７４１０は、交差点７４１２から、流体の直交流を運搬する流体チャネル７４０２内に注入される。図２８Ａ〜Ｂに示されるプロセスは、任意の数の流体サンプルを直交流チャネル７４０２に正確に分配するように繰り返され得る。 Next, as shown in FIG. 28B, valve pairs 7408c-d are closed and 7408a-b and open, resulting in fluid sample 7410 in fluid channel 7402 carrying a cross-flow of fluid from intersection 7412. Injected into. The process shown in FIGS. 28A-B can be repeated to accurately distribute any number of fluid samples into the cross-flow channel 7402.

図２８Ａ〜２８Ｂに示されるプロセスチャネルフロー注入構造体（ｐｒｏｃｅｓｓ−ｃｈａｎｎｅｌｆｌｏｗｉｎｊｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の実施形態には、単一のジャンクションで交差するチャネルを特徴付けるが、これは、本発明によって必須ではない。したがって、図２８Ｃは、本発明に従った注入構造体の別の実施形態の簡略化した平面図を示し、ここで、交差フローチャネル７４５２の間のジャンクション７４５０は、さらなる体積容量を提供することが当然のこととして期待される。図２８Ｄは、本発明に従う注入構造体の更なる実施形態の簡略化した平面図を示し、ここで、交差フローチャネル７４６２の間の細長ジャンクションは、さらに多くの体積容量を提供する。 The embodiment of the process-channel flow injector structure shown in FIGS. 28A-28B characterizes channels that intersect at a single junction, but this is not required by the present invention. Accordingly, FIG. 28C shows a simplified plan view of another embodiment of an injection structure according to the present invention, where the junction 7450 between the cross flow channels 7452 can provide additional volumetric capacity. Expected as a matter of course. FIG. 28D shows a simplified plan view of a further embodiment of an injection structure according to the present invention, wherein the elongated junction between the intersecting flow channels 7462 provides even more volumetric capacity.

図２８Ａ〜２８Ｄに接続した上で示したかまたは記載された実施形態が、そのフローチャネル交差の反対側において連結されたバルブを利用するが、これは、本発明にとって必須ではない。他の配置（交差点の隣接したバルブの連結法、または交差点の周囲のバルブの各々の独立した作動法を含む）が、その所望するフロー特徴を提供するために可能である。しかし、その独立バルブの作動アプローチを用いる場合、別個の制御構造体が、各々のバルブについて用いられるので、デバイスレイアウトが複雑化することが認識されるべきである。 Although the embodiment shown or described above in connection with FIGS. 28A-28D utilizes a valve coupled on the opposite side of its flow channel intersection, this is not essential to the invention. Other arrangements are possible to provide the desired flow characteristics, including the method of connecting adjacent valves at the intersection, or the independent actuation of each of the valves around the intersection. However, it should be appreciated that when using the independent valve actuation approach, a separate control structure is used for each valve, complicating device layout.

図５０は、本発明に従った交差フロー注入システムの１つの実施形態にとって注入されたスラグ数に対するＬｏｇ（Ｒ／Ｂ）をプロットする。流体抵抗のようなプロセスパラメータからの、交差フロー注入による合流の再現性および相対的独立性は、図５１によってさらに明示される。この図５１は、種々の流体条件の下での交差チャネルフロー注入の関する注入周期の数に対して注入体積をプロットする。交差フロー注入技術によって計量供給された体積は、注入周期の連続に亘って線形基底に基づいて増加することを示している。体積と注入周期の数との間の線形関係は、流体粘度の上昇（２５％グリセロールの添加によって与えられる）およびフローチャネルの長さ（１．０〜２．５ｃｍ）のような流体抵抗パラメータから相対的に独立している。 FIG. 50 plots Log (R / B) against injected slag number for one embodiment of a cross flow injection system according to the present invention. The reproducibility and relative independence of merge by cross flow injection from process parameters such as fluid resistance is further demonstrated by FIG. This FIG. 51 plots the injection volume against the number of injection cycles for cross channel flow injection under various fluid conditions. The volume metered by the cross flow injection technique is shown to increase on a linear basis over the duration of the injection cycle. The linear relationship between volume and number of injection cycles is derived from fluid resistance parameters such as fluid viscosity increase (given by the addition of 25% glycerol) and flow channel length (1.0-2.5 cm). Relatively independent.

（１０．回転混合構造体）
本発明の実施形態に従ったミクロ流体制御およびフローチャネルは、閉回路フローチャネルに流体を循環させる回転ポンプデザインに関し得る。本明細書中で使用される場合、用語「閉回路」とは、当該分野で公知である意味を有し、そして、この用語は、円形である配置および長円体および楕円体のようなそれらのバリエーション、ならびに三角形、長方形またはそれらよりも複雑な形状であるような角を有する流体回路をいう。 (10. Rotating mixing structure)
Microfluidic control and flow channels according to embodiments of the present invention may relate to rotary pump designs that circulate fluid through closed circuit flow channels. As used herein, the term “closed circuit” has the meaning known in the art, and the term includes arrangements that are circular and those such as ellipsoids and ellipsoids. As well as triangles, rectangles or fluid circuits with corners that are more complex shapes.

図２１において示されるように、フローチャネル２１００を有する層は、複数のサンプル入口２１０２、混合Ｔジャンクション２１０４、中央循環ループ２１０６（すなわち、実質的に円形のフローチャネル）、および出口チャネル２１０８を有している。制御チャネルとフローチャネルとの重ね合わせによって、マイクロバルブが形成され得る。これは、その制御チャネルとフローチャネルが、薄いエラストマー性膜によって分離され、その膜が、そのフローチャネル方向に偏向しているか、それらから収縮され得るからである。 As shown in FIG. 21, a layer having a flow channel 2100 has a plurality of sample inlets 2102, a mixing T junction 2104, a central circulation loop 2106 (ie, a substantially circular flow channel), and an outlet channel 2108. ing. A microvalve can be formed by superimposing the control channel and the flow channel. This is because the control channel and flow channel are separated by a thin elastomeric membrane that can be deflected toward or contracted from the flow channel.

その実質的に円形の中央ループおよびそれと交差している制御チャネルが、その回転ポンプの中心部分を形成している。その実質的に円形のフローチャネルに液体を流すことが引き起こすポンプは、互いに隣接してその実質的に円形の分岐流体チャネル２１０６（すなわち、中央ループ）に交差する少なくとも３つの制御チャネル２１１０ａ〜ｃのセットからなる。 The substantially circular central loop and the control channel intersecting it form the central part of the rotary pump. The pump that causes the liquid to flow through the substantially circular flow channel of at least three control channels 2110a-c adjacent to each other and intersecting the substantially circular branch fluid channel 2106 (ie, the central loop). It consists of a set.

一連のオン／オフ作動系列（例えば、００１、０１１、０１０、１１０、１００、１０１）が、その制御チャネルに適用されるときに、その中央ロープ内の流体は、時計周りまたは反時計周りのいずれかの選択された方向に蠕動的にポンプで注入され得る。蠕動的ポンプ作動によって、そのフローチャネルの内または外側へと、その制御チャネルとフローチャネルを分離している膜の連続的な偏向を生じる。 When a series of on / off actuation sequences (eg, 001, 011, 010, 110, 100, 101) are applied to the control channel, the fluid in the central rope is either clockwise or counterclockwise. It can be pumped automatically in any selected direction. Peristaltic pump actuation causes a continuous deflection of the membrane separating the control and flow channels into or out of the flow channel.

一般的に、その作動周期が高ければ高いほど、その流体がその中央ループ内で速く回転する。しかし、その周期の上昇が、流速の上昇を生じない飽和点に、ついに、達し得る。これは、主に、その膜が作動不能な位置に戻され得るような速度の限界に起因する。図１７Ａ〜１７Ｂにおいて示されるような連結混合デバイスと合わせて以下に記載されるように、種々の技術が、作動する速度上昇とフロー／混合の周期の上昇との関係を維持するために、種々の技術が採用され得る。 In general, the higher the operating cycle, the faster the fluid rotates in the central loop. However, the increase in period can finally reach a saturation point where no increase in flow rate occurs. This is mainly due to speed limitations that allow the membrane to be returned to an inoperable position. As described below in conjunction with a coupled mixing device as shown in FIGS. 17A-17B, various techniques are used to maintain the relationship between increased speed of operation and increased flow / mixing period. These techniques can be employed.

図２１に示されるシステムは、２つのセットのポンプ（すなわち、実質的に円形のフローチャネルの上に重なる３つの制御チャネルのうちの２つ）を示し、単一のポンプ（すなわち、その実質的に円形のフローチャネルの単一のセット）が使用され得る。さらに、ポンプの各々は３つの制御チャネルを備えるものとして示されるが、様々な数の制御チャネルが、使用され得、交差点を有する単一の蛇行型の制御チャネルが使用され得る。 The system shown in FIG. 21 shows two sets of pumps (ie, two of the three control channels overlying a substantially circular flow channel) and a single pump (ie, its substantial A single set of circular flow channels) can be used. Further, although each of the pumps is shown as comprising three control channels, various numbers of control channels can be used, and a single serpentine control channel with an intersection can be used.

中央ループと流体連絡している種々の異なる付属的なフローチャネルが、その中央ループからサンプルを導入し、そして、反応溶液を引き抜くために使用され得る。同様に、その中央ループと流体連絡している１以上の出口フローチャネルまたは吹き出し口フローチャネルが、その中央ループから溶液を取り出すために使用され得る。例えば、制御バルブが、その引込口および吹出し口で使用され、その中央ループから溶液が流入することまたは流出することを防止し得る。 A variety of different ancillary flow channels in fluid communication with the central loop can be used to introduce the sample from the central loop and withdraw the reaction solution. Similarly, one or more outlet flow channels or outlet flow channels in fluid communication with the central loop can be used to remove the solution from the central loop. For example, control valves may be used at the inlet and outlet to prevent solution from entering or exiting from the central loop.

フローチャネルのサイズおよび形状は、変化し得る。特定のデバイスにおいて、そのチャネルの直径は、約１ｍｍ〜２ｃｍの範囲にある傾向があるが、その直径は、特定のデバイスにおいては著しく大きい（例えば、４ｃｍ、６ｃｍ、８ｃｍ、または１０ｃｍ）である。その円形フローチャネルの直径がどのくらいまで小さいかという制限は、主に、マルチレイヤーソフトリソグラフィーによることろの限界に関係ある。チャネル幅は、（フローチャネルまたは制御チャネルのいずれにおいても）通常は、約３０μｍと２５０μｍとの間で変化する。しかし、いくつかのデバイスにおけるチャネル幅は、１μｍぐらいの狭さである。大きい幅のチャネルも使用され得るが、一般的チャネルは、そのフローチャネル中になんらかの構造的支持体が必要とされる。チャネル高は、一般に、５μｍと５０μｍとの間で変化する。１００μｍ以下の幅を有するフローチャネルにおいて、そのチャネル高は、１μｍ以下であり得る。そのフローチャネルは、代表的には、そのチャネルにその膜が偏向したするとそのチャネルの完全な遮断が可能になるように丸められている。いくつかのデバイスにおいては、それらのチャネルは、八角形または六角形のような形状を有する。あるデバイスにおいては、そのフローチャネルは、丸められ、そして、１００μｍ幅かつ１０μｍ高であり、制御チャネルは、１００μｍ幅かつ１０μｍ高である。特定の研究において使用される１つのシステムは、直径２ｃｍを有する中央ループ、１００μｍ幅で１０μｍの深さを有するフローチャネルを備えている。 The size and shape of the flow channel can vary. In certain devices, the diameter of the channel tends to be in the range of about 1 mm to 2 cm, but the diameter is significantly larger in certain devices (eg, 4 cm, 6 cm, 8 cm, or 10 cm). The limitation on how small the diameter of the circular flow channel is mainly related to the limitations of multi-layer soft lithography. The channel width usually varies between about 30 μm and 250 μm (whether flow channel or control channel). However, the channel width in some devices is as narrow as 1 μm. Larger channels can also be used, but the generic channel requires some structural support in its flow channel. Channel height generally varies between 5 μm and 50 μm. In a flow channel having a width of 100 μm or less, the channel height may be 1 μm or less. The flow channel is typically rounded to allow complete blockage of the channel when the membrane deflects into the channel. In some devices, the channels have shapes such as octagons or hexagons. In some devices, the flow channel is rounded and 100 μm wide and 10 μm high, and the control channel is 100 μm wide and 10 μm high. One system used in a particular study comprises a central loop having a diameter of 2 cm, a flow channel having a width of 100 μm and a depth of 10 μm.

それらのチャネルは、代表的には、上述のサイズおよび形状を有しており、本明細書中で提供されるデバイスが、それらのサイズおよび形状に限定されるないことが認識されるべきである。例えば、閉回路フローチャネルで存在する分枝は、その分散を制御する役割を果たし、したがって、その中で流れる物質を混合し得る。 It should be appreciated that the channels typically have the sizes and shapes described above and the devices provided herein are not limited to those sizes and shapes. . For example, the branches present in the closed circuit flow channel serve to control its dispersion and thus can mix the material flowing in it.

（ＩＩ．組合せ混合）
上述したような種々のミクロ流体エレメントが、組み合わされて、ミクロ流体チップ上の任意の組合せの流入溶液の正確かつ迅速な混合を可能にするミクロ流体でデバイスを作り上げられ、したがって、比較的少ない基礎成分から多くの異なる溶液の製造を可能にし得る。 (II. Combination mixing)
Various microfluidic elements as described above can be combined to make a device with a microfluidic that allows accurate and rapid mixing of any combination of influent solutions on the microfluidic chip, and thus a relatively low basis. It may allow the production of many different solutions from the components.

（１．組合せ混合構造体）
図１７Ａは、本発明に従った組合せ混合デバイスの１実施形態の平面図を示す。図１７Ｂは、図１７Ａの組合せ混合デバイスのある領域の拡大図を示す。 (1. Combination mixed structure)
FIG. 17A shows a plan view of one embodiment of a combination mixing device according to the present invention. FIG. 17B shows an enlarged view of a region of the combination mixing device of FIG. 17A.

組合せ混合デバイス１７００は、フローチャネルネットワーク１７０２を備え、このフローチャネルネットワーク１７０２は、緩衝液取り込みフローライン（ＢＦ_１−ＢＦ_１６）および試薬流入フローライン（ＲＦ_１−ＲＦ_１６）を備え、分岐した交差フロー注入構造体１７０４で交差し、これは、順に、その回転混合構造体１７０６と流体連絡する。 The combination mixing device 1700 comprises a flow channel network 1702, which comprises a buffer uptake flow line (BF ₁ -BF ₁₆ ) and a reagent inflow flow line (RF ₁ -RF ₁₆ ), a branched intersection. Crossed at a flow injection structure 1704, which in turn is in fluid communication with its rotating mixing structure 1706.

制御チャネルネットワーク１７１０は、制御ラインＣ_１−Ｃ_２４を備える。制御ラインＣ１−Ｃ８は、緩衝液流入フローラインＢＦ１−ＢＦ１６と交差して、第１のマルチプレクサ構造体１７２０をつくり、交差注入器１７０４への緩衝液の計量供給を管理し得る。 The control channel network 1710 includes control lines C ₁ -C ₂₄ . Control lines C1-C8 may intersect buffer inflow flow lines BF1-BF16 to create a first multiplexer structure 1720 and manage buffer metering to cross injector 1704.

制御ラインＣ９−Ｃ１１は、マインフローチャネル１７５０と相互作用して、交差フロー注入構造体１７０４へ流し込む役割を担う第１の蠕動ポンプ１７５２をつくりあげる。試薬が、外圧の影響下で、流入フローラインＲＦ_１−ＲＦ_１６を介して流れ込む。 Control lines C9-C11 interact with the main flow channel 1750 to create a first peristaltic pump 1752 that is responsible for flowing into the cross flow infusion structure 1704. Reagents flow through inflow flow lines RF ₁ -RF ₁₆ under the influence of external pressure.

最も右のフローチャネル１７５５は、別の制御ライン（Ｃ_１２）によって制御され、そして、それらのマルチプレクサ流入口を水／緩衝液で流して、そのチャネル内での相互汚染および不溶性の塩形成を避けるために使用される。この洗浄工程の前に、制御ラインＣ１−Ｃ８内の圧力は、そのポンプ作用を提供するために変化され得る。 The rightmost flow channel 1755 is controlled by a separate control line (C ₁₂ ) and its multiplexer inlet is flushed with water / buffer to avoid cross-contamination and insoluble salt formation in that channel. Used for. Prior to this cleaning step, the pressure in the control lines C1-C8 can be changed to provide its pumping action.

具体的には、これらのラインを選択的に作動させることによって、選択したチャネルのみにポンプ作用を与えるか、または全てのチャネルに対して一緒に、同時にポンプ作用を与えることが可能である。さらに、この一連のポンプ作用は、特定の体積の流体を順方向なたは逆方向にポンプで送るように設計され得る。逆方向の流体ポンプ作用は、異なるラインに属する２種の流体の順方向での混合を防ぐように使用され得る。 Specifically, by selectively activating these lines, it is possible to pump only selected channels or to pump all channels together at the same time. Furthermore, this series of pumping actions can be designed to pump a specific volume of fluid in the forward or reverse direction. Reverse fluid pumping can be used to prevent forward mixing of two fluids belonging to different lines.

逆方向流体ポンプ作用が重要であるひとつの例は、隣接するライン中の異なる可溶性塩の順方向に混合して、そのフローチャネルを遮断してしまう不溶性塩の形成を防ぐことである。このような順方向の混合は、以下のような様式で防止され得る。 One example where reverse fluid pumping is important is to prevent forward formation of different soluble salts in adjacent lines to prevent the formation of insoluble salts that would block the flow channel. Such forward mixing can be prevented in the following manner.

実験の最初において、緩衝液は、マルチプレクサの入口から僅かに下流に位置する。 At the beginning of the experiment, the buffer is located slightly downstream from the multiplexer inlet.

第１の塩を含むチャネルは、そのマルチプレクサから選択され、そして、その交差注入ジャンクションは洗浄された後に、制御ライン（例えば、Ｃ_１２）が、水または緩衝液をそのマルチプレクサ出口に通して流すように開放される。流水式洗浄工程は、そのマルチプレクサ出口の付近からその塩の大部分を除去する。しかし、少量の塩が近くの入口から拡散され得る。 A channel containing the first salt is selected from the multiplexer, and after the cross-injection junction has been cleaned, a control line (eg, C ₁₂ ) causes water or buffer to flow through the multiplexer outlet. Released. The flushing process removes most of the salt from near the multiplexer outlet. However, a small amount of salt can be diffused from a nearby inlet.

したがって、ついで、このマルチプレクサが、同時に、その入口ラインへ向けてポンプ作用するように使用されて、その緩衝液／水がそのマルチプレクサ出口を通って動くことによって残留した塩溶液がはき出されるようにする。ついで、このマルチプレクサが使用されて、逆方向にポンプ作用して、その結果、流した緩衝液が、全てのライン向かって戻る。このように、ラインが選択され、そして、所望の試薬がその選択されたラインを通して流れ込むまで、緩衝溶液がそのマルチプレクサの各々のライン中に存在する。このフロープロセスは、それらの試薬の所望しない混合に対抗することを確実にする。まさにここで記載したフラッシュ／バックフロー法を使用して、１週間を超える間に亘る連続した操作が、両立しない塩（例えば、リン酸カリウムおよび塩化マグネシウム）が、望まない混合または不溶性塩の形成のいずれをも伴わずに、隣接したラインで使用され得ること示した。 Thus, the multiplexer is then used to pump toward the inlet line at the same time so that the residual salt solution is expelled by moving the buffer / water through the multiplexer outlet. . This multiplexer is then used to pump in the reverse direction so that the buffer flowed back toward all lines. In this way, a buffer solution is present in each line of the multiplexer until the line is selected and the desired reagent flows through the selected line. This flow process ensures that against undesired mixing of these reagents. Using the flash / backflow method just described, continuous operation for over a week may result in incompatible salts (eg, potassium phosphate and magnesium chloride) forming undesired mixed or insoluble salts. It has been shown that it can be used in adjacent lines without any of the above.

制御ラインＣ１３は、交差フロー注入器１７０４への試薬流入の開閉を担う。制御ラインＣ１４およびＣ１７は、回転ミキサ１７０６の流出入の開閉を担う。制御ラインＣ１５、Ｃ１６およびＣ１８は、回転ミキサ１７０６と相互作用して、そのミキサ内の円形フローをつくり出すための第３の蠕動ポンプをつくりあげる。 The control line C13 is responsible for opening and closing the reagent inflow to the cross flow injector 1704. Control lines C14 and C17 are responsible for opening and closing the inflow and outflow of the rotary mixer 1706. Control lines C15, C16 and C18 interact with the rotating mixer 1706 to create a third peristaltic pump for creating a circular flow within the mixer.

第１の出口チャネル１７７０は、交差注入器１７０４と直接的に流体連絡しており、そして、代表的には、第１の出口１７９０に廃物質を運搬する。第２の出口チャネル１７７２は、交差フロー注入器構造体１７０４と回転ミキサ１７０６を介して流体接続しており、したがって、第２の出口１７９２に廃物質を運搬する。 First outlet channel 1770 is in direct fluid communication with cross-injector 1704 and typically conveys waste material to first outlet 1790. The second outlet channel 1772 is in fluid communication with the cross-flow injector structure 1704 and the rotating mixer 1706 and thus carries waste material to the second outlet 1792.

図１７Ａ〜１７Ｂにおいて示された組合せミキサは、第２の出口フローチャネルに隣接する代替的な蛇行型出口チャネル１７８１をさらに備える。この蛇行型チャネル１７８１の目的は、以下である。その入口、交差ジャンクション。混合リング、および出口は、流体として連続しており、その流体イピーダンスは、その成分のインピーダンスの和である。交差ジャンクションのインピーダンスが、入口または出口のインピーダンスと比較して小さい場合、交差注入器（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｊｅｃｔｉｖｅ）中の流体の粘度を変化することは、その影響は極微であり、それによって、その計測感度の減少が所望されるように生じる。この理由により、チャネル１７８１は、（屈折部分を多く伴って）長いものであり、かつ小さな直径のものである。この組合せミキサの対する出口は、注入サイクルの間に、蛇行型チャネル１７１８へと切り換わる。 The combination mixer shown in FIGS. 17A-17B further comprises an alternative serpentine outlet channel 1781 adjacent to the second outlet flow channel. The purpose of this serpentine channel 1781 is as follows. Its entrance, crossing junction. The mixing ring and the outlet are continuous as a fluid and the fluid impedance is the sum of the impedances of the components. Changing the viscosity of the fluid in the cross-injective is minimal when the cross-junction impedance is small compared to the inlet or outlet impedance, thereby reducing its measurement sensitivity. Reduction occurs as desired. For this reason, the channel 1781 is long (with a lot of refraction) and is of a small diameter. The outlet for this combination mixer switches to a serpentine channel 1718 during the injection cycle.

図１７Ａ〜１７Ｂで示されたデバイスの代表的な操作は、以下の通りである。フローは、交差注入エリア１７０４を介して水平方向に方向付けられる。第１のマルチプレクサ１７２０は、分岐交差注入器１７０４、回転ミキサ１７０６を介し、第２の出口チャネル１７７２をの外で、流れる緩衝液フローチャネル入口（ＢＦ_１−ＢＦ_１６）を選択するように使用される。 A typical operation of the device shown in FIGS. 17A-17B is as follows. The flow is directed horizontally through the cross injection area 1704. The first multiplexer 1720 is used to select the flowing buffer flow channel inlet (BF ₁ -BF ₁₆ ) out of the second outlet channel 1772 via the branch cross injector 1704, the rotary mixer 1706. The

次いで、そのデバイスを介した緩衝液のフローは、蛇行型ポンプ１７５２のバルブを閉めることによって停止され、そして、フローは、その交差注入器１７０４を介して垂直方向に指向される。次いで、試薬が、第２のマルチプレクサを使用してその試薬フローチャネル入口（ＲＦ_１−ＲＦ_１６）から選択される。この試薬は、交差注入領域１７０４を介して流れ込み、ついで、第１の出口チャネル１７７０を介してで流出した。 The buffer flow through the device is then stopped by closing the valve of the serpentine pump 1752 and the flow is directed vertically through the cross-injector 1704. A reagent is then selected from its reagent flow channel inlet (RF ₁ -RF ₁₆ ) using a second multiplexer. This reagent flowed in through cross-injection region 1704 and then out through first outlet channel 1770.

次いで、フローが、再度、交差注入器１７０４を介して水平方向に指向され、そして、その蛇行型ポンプ１７５２が使用されて、正確な量の試薬を回転混合リング１７０６に送り込むように使用される。蛇行型ポンプ１７５２のサイクルの各々は、十分に規定された体積（約８０ｐＬ）を回転ミキサ１７０６に注入して、その結果、そのリングに注入された総体積が、注入サイクルの数によって制御され得る。 The flow is then again directed horizontally through the cross-injector 1704 and its serpentine pump 1752 is used to pump the correct amount of reagent into the rotating mixing ring 1706. Each cycle of the serpentine pump 1752 injects a well-defined volume (approximately 80 pL) into the rotary mixer 1706 so that the total volume injected into the ring can be controlled by the number of injection cycles. .

所望する量の第１の試薬が、回転ミキサ１７０６に注入されると、別の試薬が、チャネルライン（ＲＦ_Ｘ）が選択されて、その注入プロセスが、反復される。このように、任意の組合せの試薬が、その回転ミキサ１７０６に導入され得る。この回転ミキサは、総体積５ｎＬを有しており、その結果、その回転ミキサは、約６０注入体積の収容能力を有し得る。 Once the desired amount of the first reagent has been injected into the rotary mixer 1706, another reagent is selected for the channel line (RF _X ) and the injection process is repeated. In this way, any combination of reagents can be introduced into the rotary mixer 1706. The rotary mixer has a total volume of 5 nL, so that the rotary mixer can have a capacity of about 60 injection volumes.

それらの成分が、その回転ミキサ１７０６に注入されると、拡散性混合が、その混合物円形ミキサ１７０６の蛇行型ポンプ作用から生じるポアズイユ流によって生じる。一旦、混合が完全なものとなると、その混合物は、フローチャネル１７１１を介して第２の出口チャネル１７２２へと流れ、それは、貯蔵、分析および／またはさらなる処理のために、そのチップの別の領域または別のチップと完全に流体連絡し得る（これらは、図１７Ａ〜１７Ｂのいずれにも示されていない）。これらの工程は、連続する処理のために反復され得る。 As these components are injected into the rotating mixer 1706, diffusive mixing occurs due to the Poiseuille flow resulting from the serpentine pumping action of the mixture circular mixer 1706. Once the mixing is complete, the mixture flows through the flow channel 1711 to the second outlet channel 1722, which is stored in another area of the chip for storage, analysis and / or further processing. Or it may be in full fluid communication with another chip (these are not shown in any of FIGS. 17A-17B). These steps can be repeated for continuous processing.

図１７Ａ〜Ｂに示された組合せ混合デバイス１７００の特定の実施形態はまた、フローチャネル１７８２を介して回転ミキサ１７０６と流体連絡しているサンプルポート１７８０を備え、そのフローチャネル１７８２は、制御チャネルＣ_１９−_２１の存在によって規定される蠕動ポンプ１７８４と圧力連絡している。所望される場合、サンプルは、サンプル入口ポートを介して導入され得、次いで、蠕動ポンプを使用してそのミキサに注入され得る。以下に詳細に記載されるように、このサンプル注入器を利用する１つの可能な用途は、沈降による位相空間のハイスループットマッピングを実施することである。 The specific embodiment of the combinatorial mixing device 1700 shown in FIGS. 17A-B also includes a sample port 1780 in fluid communication with the rotary mixer 1706 via the flow channel 1782, which flow channel 1782 includes the control channel C ₁₉ - is a peristaltic pump 1784 and a pressure contact that is defined by the presence of _21. If desired, the sample can be introduced through the sample inlet port and then injected into the mixer using a peristaltic pump. As described in detail below, one possible application utilizing this sample injector is to perform high-throughput mapping of phase space by sedimentation.

上で記載されたような混合化チップは、それ自体で使用され得るか、またはより規模の大きいデバイスにおける重要な構成要素として組み込まれ得る。このチップは、任意の組合せの流体を混合または計測するために使用され得、これらの流体は、下流にある測定システムまたは貯蔵システムへと送達され得る。貯蔵エレメントまたは記録エレメントを付加することによって、この混合機能は、サンプルの大規模なスクリーニングまたは処理を
可能にする。例えば、以下に議論されるように、そのリングの出口は、連続的に試薬を混合するために使用され得、次いで、それらを送って、貯蔵目的またはスクリーニング目的のための数千の反応チャンバのアレイを満たす。 A mixing chip as described above can be used by itself or can be incorporated as an important component in a larger device. The tip can be used to mix or measure any combination of fluids that can be delivered to a downstream measurement or storage system. By adding a storage element or recording element, this mixing function allows large scale screening or processing of samples. For example, as discussed below, the outlet of the ring can be used to continuously mix reagents and then send them to thousands of reaction chambers for storage or screening purposes. Fill the array.

上の記載は、組合せ混合の連続的な実施に関するものであるが、基礎的な混合得れ面ｔの並列した実施も可能である。例えば、図１７Ａ〜１７Ｂに示されるような複数の流体構造体のアレイは、単一チップ上に組み込まれ得る。 The above description relates to the continuous implementation of combinatorial mixing, but a parallel implementation of the basic mixing result plane t is also possible. For example, an array of multiple fluid structures as shown in FIGS. 17A-17B can be incorporated on a single chip.

例えば、図２２は、本発明の１つの実施形態に従った組合せミキサのカラムの、全体の平面図を示し、そして図２３は、そのカラムの拡大図を示す。組合せ混合デバイス２２００は、フローネットワークチャネル２２０２を備え、それは、蠕動ポンプ構造体２２０４によって制御される入口フローチャネルＢＦ_１−ＢＦ_１０を備える。この蠕動ポンプ構造体は、制御チャネルＣ_２−Ｃ_４を重ねることによって形成される。緩衝液入口チャネルＢＦ１−ＢＦ１０は、混合構造体２２０８と別個の分岐交差チャネル注入器２２１０を介して流体連絡している。試薬フローラインから選択された試薬は、制御チャネルネットワークＣ１をかせね合わせることによってつくり出されるマルチプレクサ２２１２を利用して選択され得、次いで、交差フロー注入器２２１０へと流入される。 For example, FIG. 22 shows an overall plan view of a column of a combination mixer according to one embodiment of the present invention, and FIG. 23 shows an enlarged view of that column. The combination mixing device 2200 comprises a flow network channel 2202, which comprises the inlet flow channels BF ₁ -BF ₁₀ controlled by a peristaltic pump structure 2204. This peristaltic pump structure is formed by overlapping control channels C ₂ -C ₄ . The buffer inlet channels BF1-BF10 are in fluid communication with the mixing structure 2208 via a separate branched cross channel injector 2210. Reagents selected from the reagent flow line can be selected utilizing a multiplexer 2212 created by nesting the control channel network C1, and then flowed into the cross flow injector 2210.

閉回路混合構造体に亘る、コントロールチャネルＣ_７、Ｃ_８、およびＣ_１０の重ね合わせが、蠕動混合ポンプ２２１４を規定する。制御ラインＣ_６とＣ_９の重ね合わせによって、混合構造体のためのそれぞれのゲートバルブ２２１６が作られる。その混合構造体からの物質出口では、廃棄のための出口ライン２２１８を介して流れ出る。 The superposition of control channels C ₇ , C ₈ , and C ₁₀ across the closed circuit mixing structure defines peristaltic mixing pump 2214. Overlaying control lines C ₆ and C ₉ creates a respective gate valve 2216 for the mixing structure. At the material outlet from the mixing structure, it flows out through an outlet line 2218 for disposal.

高分子サンプルが、サンプルレザバ２２２２で共通の流体で連絡しているサンプル入口ライン２２２０から注入され得、具体的には、制御ラインＣ１１−Ｃ１３の重ね合わせによって規定される蠕動ポンプ作用構造体を利用する。一旦、高分子サンプルがその混合構造体に注入されると、その固相の形成が、光学的検査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）によってモニタされ得、この光学的な検査は、通常の光源およびその混合構造体に近接して適当な位置に位置づけられた一連の検出器を利用する。あるいは、チップ上の複数の混合構造体が、電動化されたステージを利用して単一の検出器上でスキャンされ得る。 A polymer sample can be injected from a sample inlet line 2220 that is in fluid communication with a sample reservoir 2222, specifically utilizing a peristaltic pumping structure defined by superposition of control lines C11-C13. . Once a polymer sample is injected into the mixed structure, the solid phase formation can be monitored by optical inspection, which can be performed on a conventional light source and the mixed structure. A series of detectors are used that are located in close proximity and at appropriate locations. Alternatively, multiple mixing structures on the chip can be scanned on a single detector utilizing a motorized stage.

図２２〜２３において示されるように、混合成分の各々についての制御ラインが、接続されて、混合成分の全体のアレイが、制御することが複雑になることなく、走査され得る。１つの実施形態において、全ての緩衝液が、同じ試薬を用いて同時に使用され得る。あるいは、全てのリングが、同一の様式であるが異なるサンプルを用いて用意され得る。滋賀って、並列化された構造体が、（異なるｐＨを有する）異なる緩衝液を用いて、同じ試薬に対する１つのサンプルの同時スクリーニングを可能するか、または同一条件に対する多くの異なるサンプルのスクリーニングが可能となる。このようにして、このシステムのスループットが、その並列化の程度に比例して増大され得る。 As shown in FIGS. 22-23, control lines for each of the mixed components can be connected so that the entire array of mixed components can be scanned without the complexity of control. In one embodiment, all buffers can be used simultaneously with the same reagents. Alternatively, all rings can be prepared in the same manner but with different samples. Shiga, the paralleled structure allows simultaneous screening of one sample for the same reagent using different buffers (with different pH), or screening of many different samples for the same conditions It becomes possible. In this way, the throughput of this system can be increased in proportion to its degree of parallelism.

例えば、本発明の実施形態従う組合せ混合構造体は、１日当たり約３０００タンパク質の溶解度アッセイを実施することが可能であり、その結果、１０の並列混合構造体を有する、図２２〜２３のデザインによって、１日当たり３０，０００の実験を実施し得る。これらの実験の各々は、１ｎＬのタンパク質サンプルの平均を必要として、その結果、総じて１００，０００の実験が、総体積にして約１００μＬのタンパク質サンプルを使用して３日間あまりの時間で実施され得る。 For example, a combined mixed structure according to an embodiment of the present invention is capable of performing a solubility assay of about 3000 proteins per day, resulting in the design of FIGS. 22-23 having 10 parallel mixed structures. 30,000 experiments per day can be performed. Each of these experiments required an average of 1 nL protein sample, so that a total of 100,000 experiments can be performed in less than 3 days using a total volume of about 100 μL protein sample. .

スループットを増大する別の方法は、その組合せ混合構造体を、一定の混合機能を十知るように設計された別の流体構造体に結合することである。例えば、その組み合わせ混合構造体は、流体混合マトリクスにマルチプレクサを介して結合され得る。その組合せ混合構造体は、特有の溶液を用いてそのＮ行のマトリクスを満たすために使用され、他方、その列は、Ｎ個の様々なサンプルに結合されている。このようにして、Ｎの混合操作が、Ｎ２の独自の反応を作り出すために使用され得る。 Another way to increase throughput is to couple the combinatorial mixing structure to another fluid structure designed to know a certain mixing function. For example, the combination mixing structure can be coupled to the fluid mixing matrix via a multiplexer. The combinatorial mixed structure is used to fill the N-row matrix with a unique solution, while the column is coupled to N different samples. In this way, the N mixing operation can be used to create a unique reaction of N2.

１つのアプローチにおいて、このような組合せ混合チップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するのに適したフローチャネルと流体連絡され得る。あるいは、流体構造体は、広範囲の混合比が、上述された形状計測スキームに基づいて同時に実行することを可能するように設計され得る。 In one approach, such a combinatorial mixing chip can be in fluid communication with a flow channel suitable for performing a polymerase chain reaction (PCR). Alternatively, the fluid structure can be designed to allow a wide range of mixing ratios to be performed simultaneously based on the shape metrology scheme described above.

組合せ混合デザインが、実行され、そして使用されて、異なる物理学的特性（イオン強度、ｐＨ、粘度、表面張力）を有する広範な流体の超精密計測が実施される。この計測および混合のシステムは、非常に正確で、頑強であり、その流体特性に対して反応しないものであることが実証された。流体が、約８０ｐＬの体積増分でそのリングに注入され得るが、誤差は、１％未満である。このシステムは、僅か５％の変化量を注入体積において伴って、１〜４００ｃＰの範囲の粘度を有する流体を計測し得る。 A combinatorial mixed design is implemented and used to perform ultra-precise measurements of a wide range of fluids with different physical properties (ionic strength, pH, viscosity, surface tension). This measurement and mixing system has proven to be very accurate, robust, and insensitive to its fluid properties. Fluid can be injected into the ring in volume increments of about 80 pL, but the error is less than 1%. This system can measure fluids with viscosities in the range of 1 to 400 cP, with only 5% variation in injection volume.

本発明の実施形態に従うミクロ流体構造体の実施形態のチャネルを介して流体を計測する速度は、以下の式（２）：
Ｑ＝（πａ^４ΔＰ）／（８μＬ）
（ここで、
Ｑ＝チャネル内の体積流量（ｖｏｌ／ｓ）
ａ＝チャネルの寸法
Ｌ＝チャネル長
ΔＰ＝チャネル内の圧力変化
μ＝チャネル内の作動流体の粘度
）で十分に近似され、この式は、円形状交差部分を通る体積流量を記述する。 The rate at which fluid is measured through the channel of an embodiment of a microfluidic structure according to an embodiment of the present invention is given by the following equation (2):
Q = (πa ⁴ ΔP) / (8 μL)
(here,
Q = Volume flow in the channel (vol / s)
a = channel dimension L = channel length ΔP = pressure change in channel μ = viscosity of working fluid in channel), this equation describes the volume flow through the circular intersection.

式（２）は、ミクロ流体内の流体の体積変化に影響得を与える能力を記載する。この流体が作動流体であり、かつそのミクロ流体チャネルが制御チャネルであるときに、この体積流量は、物質がその制御チャネルに隣接するフローチャネルを介して流れ得る速度を示す。 Equation (2) describes the ability to influence the volume change of the fluid within the microfluidic. When the fluid is a working fluid and the microfluidic channel is a control channel, the volume flow rate indicates the rate at which material can flow through the flow channel adjacent to the control channel.

式（２）によると、作動／混合の速度増加を達成する１つの方法は、制御チャネルの寸法（ａ）を大きくすることである。図１７Ａ〜Ｂに記載の組合せ混合デバイスの実施形態において、これは、その制御チャネルの寸法を大きくして、それぞれ、その作動／脱作動された制御チャネルの内外に動く作動流体の体積の流れ抵抗を低減することによって達成された。具体的には、その制御チャネルの高さは、３０μｍ〜１０μｍに増大される。 According to equation (2), one way to achieve increased actuation / mixing speed is to increase the size (a) of the control channel. In the combination mixing device embodiment described in FIGS. 17A-B, this increases the size of the control channel and the flow resistance of the volume of working fluid moving in and out of the activated / deactivated control channel, respectively. Was achieved by reducing. Specifically, the height of the control channel is increased to 30 μm to 10 μm.

作動／混合の速度増加を達成する別の方法は、ベースライン（グラウンド）圧力を大気圧よりも大きくすることである。具体的には、作動された膜は、速度限定因子であり得る。なぜならば、その圧力駆動収縮は、代表的には、ただ、ほぼ大気圧であるチャネル圧であり得るからである。したがって、その反発性は、しばしば、その膜の弾性にのみ起因し得る。そのグラウンド圧を上昇させることによって、本発明の実施形態に従うと、その膜はまた、その流れた流体による制御チャネルに戻り得る。特定の実施形態において、この基礎圧は、約６ｐｓｉであるが、そのベースライン圧が高ければ高いほど、そのバルブの応答は、速くなる。 Another way to achieve increased speed of operation / mixing is to make the baseline (ground) pressure greater than atmospheric pressure. In particular, the activated membrane can be a rate limiting factor. This is because the pressure driven contraction can typically be a channel pressure that is approximately atmospheric pressure. Thus, the resilience can often only be attributed to the elasticity of the membrane. By increasing the ground pressure, according to an embodiment of the present invention, the membrane can also return to the flowed fluid control channel. In certain embodiments, this base pressure is about 6 psi, but the higher the baseline pressure, the faster the valve responds.

さらに、式（２）によると、より迅速な作動の達成するためのなお別の方法は、その作動流体の粘度（μ）を低減することである。一般に、０．００１ｋｇ／ｍ・ｓの粘度を有する水、または０．００００１８ｋｇ／ｍ・ｓの粘度を有する空気は、作動流体として使用され得る。空気よりも水が、フローチャネルにおける気泡の形成を避けることが望まれるために、作動流体として使用されてきた。しかし、図１７Ａ〜Ｂにおいて示された組合せ混合デバイスの実施形態は、作動速度を上昇させるために空気で満たされた制御チャネルを利用する。さらに、圧力を挙げることによって、気泡の形成の発生確率が実質的に低減されることが発見された。 Furthermore, according to equation (2), yet another way to achieve faster actuation is to reduce the viscosity (μ) of the working fluid. In general, water having a viscosity of 0.001 kg / m · s or air having a viscosity of 0.000018 kg / m · s can be used as the working fluid. Water rather than air has been used as a working fluid because it is desired to avoid bubble formation in the flow channel. However, the embodiment of the combinatorial mixing device shown in FIGS. 17A-B utilizes a control channel filled with air to increase the operating speed. Furthermore, it has been discovered that raising the pressure substantially reduces the probability of bubble formation.

要約すると、１）より大きな周囲制御チャネル寸法、２）ベースライン圧の上昇、および３）作動流体としての空気の使用の組合せが、図１７Ａ〜１７Ｂの組合せ混合デバイスのバルブの作動の最大振動数を、約１０Ｈｚ〜約１００Ｈｚに増大し、その閉回路ミキサを通して流体を移動する得られた振動数は、約４Ｈｚである。 In summary, the combination of 1) a larger ambient control channel size, 2) an increase in baseline pressure, and 3) the use of air as the working fluid is the maximum frequency of operation of the valves of the combination mixing device of FIGS. Is increased to about 10 Hz to about 100 Hz, and the resulting frequency of moving fluid through the closed circuit mixer is about 4 Hz.

組合せ混合チップによって実施される計測および混合が、非常に高速であることが見出された。単一の混合配置が、１日につき３０００サンプルを処理し得る。単一のチップの上にこのような２０のミキサを並列に統合することによって、１日当たりおよそ６０，０００を処理することが可能であり、このデバイスが、ハイスループットスクリーニング用途のとって適切なものとなる。 It has been found that the metering and mixing performed by the combined mixing chip is very fast. A single mixing arrangement can process 3000 samples per day. By integrating such 20 mixers in parallel on a single chip, it is possible to process approximately 60,000 per day, making this device suitable for high-throughput screening applications. It becomes.

以下の図１８および図１９は、チップ上で実施されるいくつかの計測実験の結果を示す。図１８は、「注入体積」対「２ｍＭブロモフェノールブルー（ｐＨ８．１における０．１ＭＴｕｓ−ＨＣｌ）の滴定に関する注入されたスラグ数」をプロットする。図１８の吸収測定は、その計測の精度および再現性を実証するものである。９つのクラスターのうちの各々は、１０時間の期間に亘って実施された１００の独立した計測実験のからなる。 18 and 19 below show the results of several metrology experiments performed on the chip. FIG. 18 plots “injected volume” vs. “number of slag injected for titration of 2 mM bromophenol blue (0.1 M Tus-HCl at pH 8.1)”. The absorption measurement in FIG. 18 demonstrates the accuracy and reproducibility of the measurement. Each of the nine clusters consists of 100 independent measurement experiments performed over a 10 hour period.

図１９は、以下の表に要約されるように、「濃度」対「４つの異なる粘度を示すサンプルについての注入されたスラグ番号」をプロットする。 FIG. 19 plots “concentration” versus “injected slag number for samples showing four different viscosities”, as summarized in the table below.

（表）
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サンプルグリセロール（％）粘度（ｃＰ）スラグ体積（ｐＬ）Ｒ２
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
Ａ０１９０．７２０．９９９
Ｂ７６４０８８．２０．９９７
Ｃ８４１００８４．８４０．９９８
Ｄ９２４００８６．５２０．９９８
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
図１９において注入された体積によって実証された狭い偏差は、流体の特性に対する計測の非感受性、特に、広範な粘度に対する非感受性を示す吸収測定を実証する。 (table)
------------------------------------
Sample Glycerol (%) Viscosity (cP) Slag volume (pL) R2
------------------------------------
A 0 1 90.72 0.999
B 76 40 88.2 0.997
C 84 100 84.84 0.998
D 92 400 86.52 0.998
------------------------------------
The narrow deviation demonstrated by the injected volume in FIG. 19 demonstrates an absorption measurement that shows the insensitivity of the measurement to the properties of the fluid, especially the insensitivity to a wide range of viscosities.

組合せ混合デバイスが、配合における最適な組合せを見出すことが必要である、生物学、化学、化学工学などの問題を解決するための処方ツールとしての種々の用途を見出し得る。このデバイスチップおよびそのれらの改変体は、これらの配合のパラメータにおける多くのバリーションを同時にスクリーニングするために使用され得、したがって、配合および処方を最適化するための迅速で安価な手段を提供する。使用の可能性ある分野としては、微生物学、化学合成、ハイスループットスクリーニング、薬物発見、医学的診断法、病原体同定、および酵素反応（ポリメラーゼ連鎖反応およびそれらの改変型が挙げられるが、それらに限定されない）が挙げられる。このデバイスはまた、種々のローション、クリーム、食料品、化学合成物などを処方する役割も果たし得る。 A combinatorial mixing device may find various uses as a formulation tool to solve problems such as biology, chemistry, chemical engineering, etc. where it is necessary to find the optimal combination in the formulation. This device chip and their variants can be used to simultaneously screen many variations in these formulation parameters, thus providing a quick and inexpensive means to optimize formulation and formulation To do. Potential areas of use include, but are not limited to, microbiology, chemical synthesis, high-throughput screening, drug discovery, medical diagnostics, pathogen identification, and enzymatic reactions (polymerase chain reactions and their modified forms) Not). The device may also serve to formulate various lotions, creams, foodstuffs, chemical compositions, and the like.

本発明に従うミクロ流体構造体の実施形態は、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳＯ１／４４８６９（２００１年１１月１６日出願）により完全に記載され、そして、「細胞アッセイおよびハイスループットスクリーニング（ＣｅｌｌＡｓｓａｙｓａｎｄＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｃｒｅｅｎｉｎｇ）」と題されるような用途（本明細書中で全ての目的のために参考として援用される）のために、用いられ得る。このような用途を実施するのに適切なミクロ流体構造体の例としては、本明細書中で記載されるような構造体、ならびに米国非仮特許出願場番号１０／１１８，４６６である「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＵｔｉｌｉｚｉｎｇＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃＤｅｖｉｃｅｓ」（代理人管理番号２０１７４Ｃ−００４４３０として、２００２年４月５日に出願）（本明細書中で全ての目的のために参考として援用される）に記載されるような他のものが挙げられる。 Embodiments of microfluidic structures in accordance with the present invention are more fully described by PCT application PCT / USO 1/444869 (filed November 16, 2001) and “Cell Assays and High Throughput Screening” (Cell Assays and High Throughput). Screening), which may be used for applications such as those incorporated herein by reference for all purposes. Examples of microfluidic structures suitable for carrying out such applications include structures as described herein, as well as “Nucleic,” which is US non-provisional patent application Ser. No. 10 / 118,466. Others as described in Acid Amplification Utilities Microfluidics (filed April 5, 2002, as Agent Administration Number 20174C-004430) (incorporated herein by reference for all purposes) Can be mentioned.

図１７Ａ〜Ｂに示されたかつ記載された１つの有望な用途は、膜タンパク質の可溶化である。 One promising application shown and described in FIGS. 17A-B is the solubilization of membrane proteins.

膜タンパク質は、代表的には、真核生物細胞において発現され、ここで、これらのタンパク質は、細胞膜内に組み込まれている。これら膜タンパク質の３次元構造は、結晶の形態でそのＸ線回折法によって決定され得る。 Membrane proteins are typically expressed in eukaryotic cells, where these proteins are incorporated into the cell membrane. The three-dimensional structure of these membrane proteins can be determined by their X-ray diffraction method in crystalline form.

しかし、このような結晶化が実施される前に、タンパク質が細胞に細胞膜に取り込まれているときに保持する３次元的に折り畳まれた形状で溶液中のタンパク質を安定化することがまず、必要である。代表的には、界面活性剤を添加することによって達成され、これによって、両親媒性分子（その界面活性剤）の小さなエンベロープ中に膜タンパク質を包み込み、その細胞膜の環境を模倣して、変性を防止する。このような様式でそれらの膜タンパク質を安定化することは、代表的には、様々なｐＨ値、イオン強度での緩衝液を用いて、そして、様々な界面活性剤を用いて、タンパク質を可溶化することが必要である。したがって、膜タンパク質の可溶化が、本質的に、処方上の問題である。 However, before such crystallization is performed, it is first necessary to stabilize the protein in solution in a three-dimensionally folded shape that is retained when the protein is incorporated into the cell membrane. It is. Typically achieved by adding a surfactant, which encapsulates a membrane protein in a small envelope of an amphiphilic molecule (its surfactant), mimics its cell membrane environment, and denatures it. To prevent. Stabilizing these membrane proteins in this manner typically allows proteins to be used with buffers at various pH values, ionic strength, and with various detergents. It is necessary to solubilize. Thus, solubilization of membrane proteins is essentially a formulation issue.

それらの膜タンパク質は、代表的には、少量でのみ、研究者にとって利用可能であり、少量で、自動化様式で、溶解性研究を実施することが所望される。したがって、ここで記載したこの組合せ混合デバイスは、この問題に対して十分に適したものである。 These membrane proteins are typically available to researchers only in small amounts, and it is desirable to perform solubility studies in small amounts in an automated manner. Therefore, the combination mixing device described here is well suited to this problem.

図６１Ａ〜Ｇは、スクリーニング条件が膜タンパク質を可溶化することにおける成功に首尾がよいとして評価され得るアッセイの概略図である。この技術は、対応するレセプターまたは抗体が既知である膜タンパク質の可溶化のとって適切である。 FIGS. 61A-G are schematics of assays that can be evaluated as successful in screening conditions solubilizing membrane proteins. This technique is appropriate for solubilization of membrane proteins for which the corresponding receptor or antibody is known.

図６１Ａは、その方法の第１の工程を示し、ここで、試験管６１０２中にあるセル６１００が、溶解されて、そして、遠心分離され、その試験管の底でのペレット６１０４中の膜タンパク質を含む膜を濃縮される。ペレットｐ６１０４は、その溶解物として参照される。 FIG. 61A shows the first step of the method, where the cell 6100 in the test tube 6102 is lysed and centrifuged, and the membrane protein in the pellet 6104 at the bottom of the test tube. The membrane containing is concentrated. Pellet p6104 is referred to as its lysate.

図６１Ｂは、その方法の第２の工程を示し、ここで、上記の溶解物中の膜タンパク質６１０６は、ヒスタジン（ＨＩＳ）６１０８でタグ化され、そのＨＩＳタグ化膜タンパク質６１１０は、ミクロ流体入口６１１２、さらに、閉回路混合構造体６１１４に流れ込む。図６１Ｃは、第３工程を示し、ここで、界面活性剤、緩衝液および塩の混合物６１１５が、混合構造体６１１４に注入され、そして、そのＨＩＳタグ化膜タンパク質６１１０と今後されて、その膜タンパク質を可溶化する。この段階において、その可溶化された膜タンパク質は、その細胞膜内で示される折り畳まれた３次元構造を示しても示さなくともよい。 FIG. 61B shows the second step of the method, where membrane protein 6106 in the lysate above is tagged with histazine (HIS) 6108 and the HIS-tagged membrane protein 6110 is at the microfluidic inlet. 6112 and then flows into the closed circuit mixing structure 6114. FIG. 61C shows the third step, where a mixture of detergent, buffer and salt 6115 is injected into the mixing structure 6114 and then forwarded with its HIS-tagged membrane protein 6110, and the membrane Solubilize proteins. At this stage, the solubilized membrane protein may or may not show the folded three-dimensional structure shown in the cell membrane.

図６１Ｄは、第４の工程を示し、ここで、その溶解した膜タンパク質混合物が、マルチプレクサ６１１９を介してその混合構造体６１１５の外に流れて、ニッケル基質６１１８上で第１のフローチャネル６１１６ａへと流れ、そのタンパク質を固定する。図６１Ｅは、第５の工程を示し、ここで、蛍光タグ化されたリガンドまたは抗体６１１８は、その固定化されたＨＩＳタグ化タンパク質サンプル６１１０上に流される。その対応するタグ化リンガンド／抗体は、その細胞膜中で同じように折り畳まれた形状を示す固定化されたタンパク質のみに結合する。 FIG. 61D shows the fourth step, where the dissolved membrane protein mixture flows out of the mixing structure 6115 via the multiplexer 6119 and onto the first flow channel 6116a on the nickel substrate 6118. Flow and fix the protein. FIG. 61E shows the fifth step, where the fluorescently tagged ligand or antibody 6118 is run over the immobilized HIS-tagged protein sample 6110. The corresponding tagged Ringand / antibody binds only to immobilized proteins that show the same folded shape in the cell membrane.

図６１Ｆに示されるように、そのニッケルを含むフローチャネルは、洗浄され、そして、源６１５０からチャネルの内容物に放射線を照射し、そして、検出器６１５２でその得られた放出された蛍光を検出することによって蛍光測定がなされる。その検出された蛍光シグナルの強度によって、所望の天然に存在する折り畳まれ方をする３次元構造の形状を示すタンパク質の数を明らかにした。この形状によって。その相補的な蛍光リガンド／抗体の結合を可能にする。その可溶化条件のその後のバリエーションが、所望の三次元折り畳み形状を伴って溶液に入るタンパク質分子の数を最適化し得る。その可溶化プロセスの最適化は、両親媒性部分または他の溶液成分の様々な濃度／強度を有する混合物から検出されるシグナルの大きさを比較することによって達成され得る。 As shown in FIG. 61F, the nickel-containing flow channel is washed and irradiates the contents of the channel from source 6150 and detects the resulting emitted fluorescence at detector 6152 By doing so, fluorescence measurement is performed. The intensity of the detected fluorescent signal revealed the number of proteins exhibiting the desired three-dimensional shape of the naturally occurring folding. By this shape. Allow its complementary fluorescent ligand / antibody binding. Subsequent variations of the solubilization conditions can optimize the number of protein molecules entering the solution with the desired three-dimensional folded shape. Optimization of the solubilization process can be accomplished by comparing the magnitude of the signal detected from a mixture having various concentrations / intensities of amphiphilic moieties or other solution components.

１つの可溶化プロセスの結論において、その閉回路混合構造（ｃｌｏｓｅｄｃｉｒｃｕｉｔｍｉｘｉｎｇｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、低ｐＨ緩衝液で洗浄されて、結合および標識されたタンパク質が溶出され得、別の可溶化実験が行われ得る。新たなニッケル表面が必要とされる場合、その次の混合物は、その混合構造から別の流動チャネルへと、マルチプレクサーによって方向付けられ得る。 At the conclusion of one solubilization process, the closed circuit mixing structure can be washed with a low pH buffer to elute bound and labeled protein and another solubilization experiment can be performed. obtain. If a new nickel surface is needed, the next mixture can be directed by the multiplexer from the mixing structure to another flow channel.

上記の図６１Ａ〜Ｆと関連して例示されかつ議論された実施形態は、その閉回路ミクロ流体混合構造において混合した後に、その可溶化された膜タンパク質をその相補的な検出可能リガンドに曝すことを包含するが、これは、本発明に必須ではない。代替的実施形態に従って、その相補的リガンド／抗体は、その混合構造中のタグ化タンパク質と直接混合され得る。この代替的実施形態は、より正確な結果を提供し得、ここでニッケル基材へのタグ化タンパク質の結合は、タンパク質とその相補的リガンドとの間の結合を阻害し得る。 The embodiment illustrated and discussed in connection with FIGS. 61A-F above exposes the solubilized membrane protein to its complementary detectable ligand after mixing in the closed circuit microfluidic mixing structure. This is not essential to the invention. According to an alternative embodiment, the complementary ligand / antibody can be mixed directly with the tagged protein in the mixed structure. This alternative embodiment can provide more accurate results, where binding of the tagged protein to the nickel substrate can inhibit binding between the protein and its complementary ligand.

そして上記の図６１Ａ〜Ｆに関連して例示されかつ議論された実施形態は、平坦なニッケル基材上に可溶化タンパク質を固定化することを包含するが、これはまた、本発明に必須ではない。代替的実施形態は、所望の固定化機能を示す表面を有するビーズとともに充填された流動チャネルを利用し得る。 And the embodiment illustrated and discussed in connection with FIGS. 61A-F above includes immobilizing the solubilized protein on a flat nickel substrate, which is also essential to the present invention. Absent. Alternative embodiments may utilize flow channels packed with beads having surfaces that exhibit the desired immobilization function.

そして上記の図６１Ａ〜Ｆに関連して例示されかつ議論された実施形態は、その蛍光特性によって検出可能なリガンドの使用を包含するが、これもまた、本発明に必須ではない。代替的実施形態は、ＰＥＴ検出器を利用して検出可能な放射性型のリガンドを利用し得る。 And the embodiment illustrated and discussed in connection with FIGS. 61A-F above includes the use of a ligand that is detectable by its fluorescence properties, but this is also not essential to the invention. An alternative embodiment may utilize a radioactive type of ligand that can be detected using a PET detector.

図１７Ａ〜Ｂに関連して示されかつ記載された組み合わせデバイスののための別の特定の有望な適用は、高分子（例えば、可溶化がちょうど議論された膜タンパク質）の結晶化である。このような結晶化は、濃縮されかつ精製されたタンパク質または高分子のサンプルに対して多くの異なる試薬をの大規模スクリーニングを要する。タンパク質は、一般に、大量に獲得しかつ精製するのは困難であるので、スクリーニング試験においてサンプル消費を最小にすることは最も重要なことである。従来の手段は、１回のアッセイあたりマイクロリットルのサンプル容積を必要とする一方で、本発明は、ナノリットル未満の反応容積を実現し得る。 Another particular promising application for the combination device shown and described in connection with FIGS. 17A-B is the crystallization of macromolecules (eg, membrane proteins for which solubilization has just been discussed). Such crystallization requires large-scale screening of many different reagents against concentrated and purified protein or macromolecule samples. Since proteins are generally difficult to obtain and purify in large quantities, it is of utmost importance to minimize sample consumption in screening tests. While conventional means require a microliter sample volume per assay, the present invention can achieve reaction volumes of less than nanoliters.

さらに、多くの数千もの特有の溶液がチップ上で直接混合され得るので、本発明は、タンパク質結晶化条件の徹底的なスクリーニングを行うために使用され得る。このスクリーニングは、無作為な様式または体系化された様式で行われ得る。一旦混合されると、結晶化反応は、例えば、以下により詳細に記載されるように、保存および調査のための位置探索デバイス（ｌｏｃａｔｉｏｎｓｄｅｖｉｃｅ）に送られ得る。 Furthermore, since many thousands of unique solutions can be mixed directly on the chip, the present invention can be used to perform a thorough screening of protein crystallization conditions. This screening can be done in a random or systematic manner. Once mixed, the crystallization reaction can be sent to a location device for storage and investigation, for example, as described in more detail below.

（２．保存構造）
組み合わせ混合構造の基本的な測定機能および混合機能を流体保存構造と組み合わせると、完全タンパク質結晶化ワークステーションをチップ上に実装することが可能になる。このようにして、研究者は、種々の化学におけるタンパク質の可溶性を探索し得、どれが最も有望な結晶化条件であるかを決定し得、次いで、結晶成長のための反応を設定し、インキュベートする。このようにして、スクリーニング、位相空間調査、最適化、およびインキュベーションは、単一のミクロ流体ワークステーションで達成され得る。保存のあり得る方法の非網羅的リストは、以下に提供される。 (2. Storage structure)
Combining the basic measurement and mixing functions of a combined mixing structure with a fluid storage structure allows a complete protein crystallization workstation to be implemented on the chip. In this way, researchers can explore the solubility of proteins in various chemistry, determine which are the most promising crystallization conditions, and then set up reactions for crystal growth and incubate To do. In this way, screening, phase space exploration, optimization, and incubation can be accomplished on a single microfluidic workstation. A non-exhaustive list of possible methods of preservation is provided below.

本発明の一実施形態に従って、反応は、予め混合された試薬（結晶化剤、添加剤、低温保護剤（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）．．．、サンプル）を保存チャネルへとポンプ輸送し、非混和性流体（例えば、パラフィン油）により実験を分離することによって保存され得る。図５８Ａ〜Ｃは、この保存技術の１つの実装の模式図である。 In accordance with one embodiment of the present invention, the reaction pumps premixed reagents (crystallizers, additives, cryo-protectants ..., samples) into the storage channel and is immiscible. It can be preserved by separating the experiment by fluid (eg paraffin oil). 58A-C are schematic diagrams of one implementation of this preservation technique.

図５８Ａにおいて、サンプルは、環状混合デバイス５８００へと、直列バルブ５８０２ａ〜ｃの蠕動ポンプ輸送作用を介して流される。次いで、混合物５８０３が作り出され、横断連結（ｃｒｏｓｓ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ）５８０４へと流される。図５８Ｂにおいて、横断連結５８０４内のサンプルは、バルブ５８１０によって制御される端部５８０６ａを有する、蛇行した保存チャネル５８０６に送られる。図５８Ｃにおいて、そのバルブ構成は変更され、不活性分離流体５８０８（例えば、油）は、横断連結５８０４に流される。図５８Ｄにおいて、その分離流体５８０８は、保存チャネル５８０６へ流される。図５８Ａ〜Ｄに例示されるそのサイクルは、次いで、繰り返されて、保存ライン５８０６内に新たなサンプル容積が提供され得る。チャネル５８０６内に保存されたサンプルは、ゲートバルブ５８１０を通る端部５８０６ａを通じて、回収され得る。 In FIG. 58A, the sample is flowed to the annular mixing device 5800 via the peristaltic pumping action of series valves 5802a-c. A mixture 5803 is then created and flowed to a cross-junction 5804. In FIG. 58B, the sample in transverse link 5804 is sent to a serpentine storage channel 5806 having an end 5806a controlled by valve 5810. In FIG. 58C, the valve configuration is changed and an inert separation fluid 5808 (eg, oil) is flowed to the transverse connection 5804. In FIG. 58D, the separation fluid 5808 is flowed to the storage channel 5806. The cycle illustrated in FIGS. 58A-D can then be repeated to provide a new sample volume in storage line 5806. The sample stored in channel 5806 can be collected through end 5806a through gate valve 5810.

その保存チャネルが１００μｍ幅×１００μｍ高の寸法を有するとすると、１ｎＬのサンプルが１００μｍに等しいチャネルの長さを満たす。そのチャネルが蛇行しておりかつ隣接するレッグが１００μｍだけ離れているとすると、１平方ｃｍの保存領域にフィットするチャネルの合計の長さは、約１ｃｍ×１００／２＝０．５ｍである。このことは、０．５ｍ／１００μｍ＝５０００反応の保存を可能にする。 If the storage channel has dimensions of 100 μm wide × 100 μm high, a 1 nL sample fills the length of the channel equal to 100 μm. If the channel is serpentine and adjacent legs are separated by 100 μm, the total length of the channel that fits a 1 cm 2 storage area is about 1 cm × 100/2 = 0.5 m. This allows storage of 0.5 m / 100 μm = 5000 reactions.

流体の全長は、追加される毎に進まなければならないので、この流体の長さをポンプ輸送することは困難であることが分かり得る。この問題を避けるために、図５９は、反応／保存スキームの実施形態５９００の模式図を示し、ここでマルチプレクサー５９０２は、実験サンプルおよび不活性分離流体を、複数の並行保存チャネル５９０４のうちの１つに方向付けるために使用され得る。 It can be seen that it is difficult to pump the length of the fluid because the total length of the fluid must advance with each addition. To avoid this problem, FIG. 59 shows a schematic diagram of an embodiment 5900 of the reaction / storage scheme, where multiplexer 5902 allows the experimental sample and inert separation fluid to flow out of multiple parallel storage channels 5904. Can be used to direct one.

なお別の代替的実施形態に従って、各反応物は、流体の縦列全体が一緒に動かされる必要が決してないように、保存ラインの端部に行き止まりになるまで充填され得る。図６０は、このようなアプローチの簡略化した模式図を示し、ここで保存チャネル６０００は、行き止まりにされている。 In accordance with yet another alternative embodiment, each reactant may be filled until it reaches a dead end at the end of the storage line so that the entire fluid column never needs to be moved together. FIG. 60 shows a simplified schematic diagram of such an approach, where the storage channel 6000 is dead-ended.

空気の流れは、そのサンプルおよび不活性分離流体を保存チャネルへと付勢するために利用され得、その空気は、最終的には、そのエラストマー材料を通ってチャネルから拡散する。このような実施形態において、行き止まりになるまで充填を行うために必要とされる比較的高い圧力は、外部圧力源を使用して達成され得、それによって、油ライン上の別個のポンプに対する必要性が排除される。この行き止まりまで充填する技術は、図５８Ａ〜Ｄに示される実施形態におけるように、単一の保存ライン、または図５９に示される実施形態におけるようにマルチプレクサーを介する多くの並行保存ラインを充填するために使用され得る。 The air flow can be utilized to bias the sample and inert separation fluid into the storage channel, which ultimately diffuses from the channel through the elastomeric material. In such embodiments, the relatively high pressure required to fill until a dead end can be achieved using an external pressure source, thereby necessitating a separate pump on the oil line. Is eliminated. This fill-to-dead technique fills a single storage line, as in the embodiment shown in FIGS. 58A-D, or many parallel storage lines via a multiplexer as in the embodiment shown in FIG. 59. Can be used for.

図５８Ａ〜６０は、そのチップ上のチャネルとして平坦な様式で一体化されるように保存ラインを示すが、これは、本発明に必須ではない。本発明の代替的実施形態に従って、その試薬は、その垂直な方向に、チップから、例えば、ガラスキャピラリーへと除去され得る。 58A-60 show the storage lines to be integrated in a flat manner as channels on the chip, this is not essential to the invention. In accordance with an alternative embodiment of the present invention, the reagent can be removed from the tip, for example, into a glass capillary, in its vertical direction.

化合物を保存するためのなお別のアプローチは、拡散アッセイを利用することである。図５４Ａ〜Ｄは、組み合わせ混合構造５４００とアドレス指定可能保存アレイ５４０２とを組み合わせるデバイスの配置図を示す。アレイ５４０２は、２５６個の個々のバッチ実験または１２８個のフリー界面拡散実験のチップ上でのインキュベーションを可能にする。 Yet another approach to storing compounds is to utilize diffusion assays. 54A-D show a layout of a device that combines a combinatorial mixed structure 5400 and an addressable storage array 5402. FIG. Array 5402 allows incubation on the chip of 256 individual batch experiments or 128 free interface diffusion experiments.

図５４Ｂは、保存アレイ５４０２への入り口の誇張を示す。アレイ５４０２は、上記で議論されるその行き止まりの充填原理に取り組む。一旦その試薬が環５４０６中で混合されると、それらは、一時的保存のために蛇行したチャネル５４０８へとポンプ輸送される。保存アレイ入り口におけるマルチプレクサー５４１０は、次いで、１６個ののあり得る入り口のうちの１つを開放するように作動され、それによって、そのアドレス指定されるべきアレイの横列を選択し得る。 FIG. 54B shows an exaggeration of the entrance to the storage array 5402. Array 5402 addresses that dead-end filling principle discussed above. Once the reagents are mixed in ring 5406, they are pumped to tortuous channel 5408 for temporary storage. Multiplexer 5410 at the storage array entry may then be activated to open one of the 16 possible entries, thereby selecting the array row to be addressed.

図５４Ｃは、図５４Ａの保存アレイの拡大図を示す。図５４Ｄは、図５４Ｄのアレイにおける単一のセルの拡大図を示す。 FIG. 54C shows an enlarged view of the storage array of FIG. 54A. FIG. 54D shows an enlarged view of a single cell in the array of FIG. 54D.

保存アレイの各横列は、保存チャンバ５４５６をチャネル入り口から分離するバルブ５４５４を作動する制御ライン５４５２、およびその保存アレイの縦列を分離する制御ライン５４５８を有する。単一の制御ライン５４６０は、流体により連結されたチャンバ５４６２ａ〜ｂのあらゆる対にさらに送られて、流体界面を作り出すことが望まれるまで、それらを分離する。 Each row of the storage array has a control line 5452 that operates a valve 5454 that separates the storage chamber 5456 from the channel inlet, and a control line 5458 that separates the columns of the storage array. A single control line 5460 is routed further to every pair of chambers 5462a-b connected by fluid to separate them until it is desired to create a fluid interface.

一旦その横列がマルチプレクサーによって選択されると、そのアレイ縦列５４７０は、対応する縦列バルブ５４７２を作動することによって選択される。このようにして、そのアレイの単一のチャンバは、充填するために選択される。 Once the row is selected by the multiplexer, the array column 5470 is selected by actuating the corresponding column valve 5472. In this way, a single chamber of the array is selected for filling.

環の出口付近のバルブは、その蛇行した保存ラインをマルチプレクサー入り口に接続するように作動され、その保存された溶液は、その蛇行した保存ラインを出て圧縮空気によってマルチプレクサー領域へと押し戻される。この加圧は、その流体をその保存アレイの適切な横列に駆動し、保存アレイの前の空気を圧縮し、そのポリマーに拡散させる。 A valve near the ring outlet is activated to connect the serpentine storage line to the multiplexer inlet, and the stored solution exits the serpentine storage line and is pushed back into the multiplexer region by compressed air. . This pressurization drives the fluid into the appropriate row of the storage array, compressing the air in front of the storage array and diffusing into the polymer.

チャンバ入り口バルブは閉じたままである間、その流体は、チャンバに入らないが、むしろマルチプレクサーとその保存アレイとの間のデッドボリュームに（または部分的にこのボリュームにおよび部分的に保存アレイチャネルに）残る。そのマルチプレクサーの新たなラインは、次いで、選択され、その縦列バルブは、一時的に開放されて、相互汚染を避けるための予防措置として、新たな横列が緩衝液で洗い流されることを可能にする。マルチプレクサーのわずか１つのラインが開いているので、その保存アレイの他の横列は、固定されたままである。 While the chamber inlet valve remains closed, the fluid does not enter the chamber, but rather into a dead volume between the multiplexer and its storage array (or partially into this volume and partially into the storage array channel). ) Remain. The new line of the multiplexer is then selected and the column valve is temporarily opened to allow the new row to be flushed with buffer as a precaution to avoid cross-contamination. . Since only one line of the multiplexer is open, the other rows of the storage array remain fixed.

この新たな横列は、次いで、空気をこの横列を通るように吹き込むことによって空にされ、次の溶液のための準備がされる。これらの工程は、全ての横列が固有の溶液で充填されるまで繰り返される。 This new row is then emptied by blowing air through the row and ready for the next solution. These steps are repeated until all rows are filled with a unique solution.

その縦列バルブは、次いで、作動され、その入り口バルブが開放され、全ての横列が同時に加圧される。このことによって、その溶液がそれらそれぞれのチャンバへと駆動される。この全体のプロセスは、そのアレイが溶液で充填されるまで全ての縦列について繰り返され得る（潜在的には、全てのチャンバにおいて異なる溶液）。 The column valve is then activated, the inlet valve is opened, and all rows are pressurized simultaneously. This drives the solution into their respective chambers. This entire process can be repeated for all columns until the array is filled with solutions (potentially different solutions in all chambers).

その界面バルブが閉じたままである場合、図５４Ａ〜Ｄのアレイは、２５６個（８縦列×１６横列）のバッチ反応を収容する。ミクロ流体フリー界面を横断する拡散が望まれるタンパク質結晶学のような適用において、その界面バルブが開放されて、その反応が始められ得る。全ての溶液は、予め、その環において別個に混合されているので、実験者は、溶液に対する制御を有する。 If the interface valve remains closed, the array of FIGS. 54A-D accommodates 256 (8 columns × 16 rows) batch reactions. In applications such as protein crystallography where diffusion across a microfluidic free interface is desired, the interface valve can be opened and the reaction initiated. Since all solutions are premixed separately in the ring, the experimenter has control over the solution.

例えば、結晶化についてのフリー−界面拡散実験が行われ得、その実験において以下のうちの１つ以上が変化される：沈澱剤の正体および／または初期濃度；結晶化された種の正体および／または初期濃度；添加物の正体および／または初期濃度；ならびに低温保護剤の正体および／または初期濃度。フリー界面拡散実験の前に、多くの異なる薬剤を少量のタンパク質溶液へと混合する能力は、従来の結晶化アプローチを超える重要なり点を提供し、ここで代表的には、標準的なタンパク質ストックが、異なる結晶化剤に対して使用される。上記のそのミクロ流体ネットワークは、このようにして、結晶化のための融通性の高いプラットフォームを提供する。 For example, free-interface diffusion experiments on crystallization can be performed, in which one or more of the following are changed: the identity and / or initial concentration of the precipitant; the identity of the crystallized species and / or Or initial concentration; identity and / or initial concentration of additive; and identity and / or initial concentration of cryoprotectant. The ability to mix many different drugs into small protein solutions prior to free interfacial diffusion experiments provides an important point over traditional crystallization approaches, where typical protein stocks are typically Are used for different crystallization agents. The microfluidic network described above thus provides a flexible platform for crystallization.

図５４Ａ〜Ｄのアレイもまた、サンプル回収、アドレス指定可能なウェル洗浄、および反応チャンバの再使用を可能にする。具体的には、サンプルを回収するために、またはウェルを洗浄するために、ウェルを空にする／洗浄する縦列上の適切な入り口バルブが開放される。マルチプレクサーの横列のうちの１つ（これは、洗浄されるべき対のチャンバのうちの１つとつながる）が選択される。 The arrays of FIGS. 54A-D also allow sample collection, addressable well washing, and reaction chamber reuse. Specifically, the appropriate inlet valve on the column that empties / washes wells is opened to collect samples or to wash the wells. One of the multiplexer rows (which leads to one of the pair of chambers to be cleaned) is selected.

そのマルチプレクサーにおいて開放されていない対とつながるそのアレイの横列は、次いで、そのアレイの端部において開放され、マルチプレクサーにおいて開放されたその横列は、そのアレイの端部で閉鎖される。 The row of the array that is connected to the unopened pair in the multiplexer is then opened at the end of the array, and the row that is open in the multiplexer is closed at the end of the array.

この操作は、そのマルチプレクサーの選択された横列を通り、空にされ／洗浄されるべきチャンバ対を通って、その出口にて選択された横列を出る流体経路を生じ、開放する。このようにして、単一のチャンバ対は、アドレス指定され、洗浄され得る。 This operation creates and opens a fluid path through the selected row of the multiplexer, through the chamber pair to be emptied / cleaned, and exiting the selected row at its outlet. In this way, a single chamber pair can be addressed and cleaned.

（ＩＩＩ．結晶化構造および結晶化方法）
標的物質の結晶化の高スループットスクリーニング、または結晶化による標的物質の少量のサンプルの精製は、既知の濃度で、標的物質の溶液を、微細製作流体デバイスの複数のチャンバに同時に導入することによって達成される。次いで、この微細製作流体デバイスは、チャンバ内の溶液条件を変化するように操作され、それによって、多数の結晶化環境が同時に提供される。溶媒条件の変化したコントロールは、種々の技術から生じ得、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：容積排除によってか、微細製作構造の寸法によって決定される液体容積の捕捉によってか、または直交したフローチャネルが交差することによって規定される交差点のマトリクス内への交差チャネル注入によって、チャンバ内での結晶化因子の容積を測定する技術。 (III. Crystallization Structure and Crystallization Method)
High-throughput screening of target material crystallization, or purification of a small sample of target material by crystallization, is achieved by simultaneously introducing a solution of the target material into multiple chambers of a microfabricated fluidic device at a known concentration. Is done. The microfabricated fluidic device is then manipulated to change the solution conditions in the chamber, thereby providing multiple crystallization environments simultaneously. Altered control of solvent conditions can result from various techniques, including but not limited to: by volume exclusion or by capturing liquid volume as determined by the dimensions of the microfabricated structure; Alternatively, a technique for measuring the volume of crystallization factor in a chamber by cross channel injection into a matrix of cross points defined by crossing orthogonal flow channels.

本発明の実施形態によって結晶化を生じる結晶は、Ｘ線結晶学に用いられ、三次元分子構造が決定され得る。あるいは、本発明の実施形態に従う高スループットスクリーニングが直接Ｘ線結晶学に十分なサイズの結晶を生成しない場合、結晶は、さらなる結晶化実験用の核結晶として用いられ得る。見込みのあるスクリーニング結果もまた、標準化された低密度マトリクス技術を使用するのと類似の様式で、狭いスペクトルの結晶化条件に焦点を当てたさらなるスクリーニングのための基準として使用され得る。 Crystals that cause crystallization according to embodiments of the present invention can be used in X-ray crystallography to determine the three-dimensional molecular structure. Alternatively, if high throughput screening according to embodiments of the present invention does not produce crystals of sufficient size for direct X-ray crystallography, the crystals can be used as nuclear crystals for further crystallization experiments. Promising screening results can also be used as a basis for further screening focusing on narrow spectrum crystallization conditions in a manner similar to using standardized low density matrix technology.

本発明の実施形態に従うシステムおよび方法は、より大きい生物学的高分子またはその凝集体（例えば、タンパク質、核酸、ウイルス、およびタンパク質／リガンドの複合体）を結晶化するのに特に適している。しかしながら、本発明に従う結晶化は、任意の特定の型の標的物質に制限されない。 The systems and methods according to embodiments of the present invention are particularly suitable for crystallizing larger biological macromolecules or aggregates thereof (eg, proteins, nucleic acids, viruses, and protein / ligand complexes). However, crystallization according to the present invention is not limited to any particular type of target substance.

以下の考察において用いられるように、用語「結晶化剤」は、標的物質の溶液に導入され、この標的物質の溶解度を低下させ、それによって結晶形成を誘導する、物質を記載する。結晶化剤としては、代表的に、標的が溶解度の減少を示す対溶媒（ｃｏｕｎｔｅｒｓｏｌｖｅｎｔ）が挙げられるが、溶液のｐＨに影響を及ぼす材料、またはポリエチレングリコールのような、標的物質に利用可能な溶媒の容積を効果的に減少させる材料もまた記載し得る。用語「対溶媒」は、「結晶化剤」と相互交換可能に使用される。 As used in the following discussion, the term “crystallization agent” describes a substance that is introduced into a solution of a target substance, thereby reducing the solubility of the target substance and thereby inducing crystal formation. Crystallizing agents typically include countersolvents where the target exhibits a decrease in solubility, but may be a material that affects the pH of the solution, or a solvent that can be used for the target substance, such as polyethylene glycol. Materials that effectively reduce the volume of can also be described. The term “countersolvent” is used interchangeably with “crystallizing agent”.

（１．容積捕捉による結晶化）
図４５Ａは、結晶化システムの一実施形態の簡略化した平面図を示し、ここで対溶媒の異なる容積の計量供給は、流動チャネルの形成の間のフォトリソグラフィーによって決定される。図４５Ｂは、図４５Ａのデバイスの３つの化合物ウェルのセットの簡略化した拡大平面図を示す。図４５Ｃは、図４５Ｂのウェルの線Ｃ−Ｃ’に沿ったウェルの簡略化した断面図を示す。このチップ設計は、容積捕捉技術を利用して、標的溶液および結晶化剤の計量供給を用いた。 (1. Crystallization by volume capture)
FIG. 45A shows a simplified plan view of one embodiment of a crystallization system, where the metering of different volumes of solvent versus solvent is determined by photolithography during the formation of flow channels. FIG. 45B shows a simplified enlarged plan view of a set of three compound wells of the device of FIG. 45A. FIG. 45C shows a simplified cross-sectional view of the well along line CC ′ of the well of FIG. 45B. This chip design utilized volumetric capture technology and metered delivery of the target solution and crystallization agent.

具体的には、各チップ９１００は、４８個の異なるスクリーン条件の各々につき３つの化合物ウェル９１０２（１チップあたり計１４４アッセイ）を含む。化合物ウェル９１０２は、ガラス基板９１０４中にエッチングされ、微小チャネル９１０６を介して流体接続状態にある２つの隣接ウェル９１０２ａおよび９１０２ｂからなる。その化合物ウェル９１０２の各々において、そのタンパク質溶液は、隣接ウェル９１０２ａ〜ｂの相対サイズによって規定される比において、スクリーン溶液と合わせられる。図４５Ａ〜Ｃに示される特定の実施形態において、その３つの比は、（タンパク質：溶液）４：１、１：１、および１：４であった。各アッセイの総容積は、スクリーン溶液を含め、約２５ｎＬであった。しかし、本発明は、いかなる特定の容積にもまたは容積範囲にも限定されない。本発明に従う代替的実施形態は、１０ｎＬ未満、５ｎＬ未満、２．５ｎＬ未満、１．０ｎＬ未満、および０．５ｎＬ未満の総アッセイ容積を利用し得る。 Specifically, each chip 9100 includes three compound wells 9102 (144 total assays per chip) for each of 48 different screen conditions. Compound well 9102 consists of two adjacent wells 9102a and 9102b that are etched into glass substrate 9104 and are in fluid connection via microchannel 9106. In each of the compound wells 9102, the protein solution is combined with the screen solution in a ratio defined by the relative size of adjacent wells 9102a-b. In the particular embodiment shown in FIGS. 45A-C, the three ratios were (protein: solution) 4: 1, 1: 1, and 1: 4. The total volume of each assay was approximately 25 nL, including the screen solution. However, the present invention is not limited to any particular volume or volume range. Alternative embodiments according to the invention may utilize a total assay volume of less than 10 nL, less than 5 nL, less than 2.5 nL, less than 1.0 nL, and less than 0.5 nL.

そのチップ制御層９１０６は、界面制御ライン９１０８、閉じこめ制御ライン９１１０および２つの安全性制御ライン９１１２を含む。制御ライン９１０８、９１１０、および９１１２は、そのチップ内の湿潤な環境を維持し、かつ結晶化が行われるべき流動チャネルおよびチャンバの脱水を防止するために、空気よりむしろ水で充填される。 The chip control layer 9106 includes an interface control line 9108, a confinement control line 9110 and two safety control lines 9112. Control lines 9108, 9110, and 9112 are filled with water rather than air to maintain a moist environment within the chip and to prevent dehydration of the flow channel and chamber in which crystallization is to take place.

界面バルブ９１１４は、その化合物ウェル９１０２を二分し、充填が完了するまで、タンパク質をスクリーンから分離する。閉じこめバルブ９１１６は、各化合物ウェル９１０２のポートをブロックし、その実験の継続のための各条件を分離する。その２つの安全バルブ９１１８は、タンパク質充填の間に作動され、失敗した界面バルブの事象においてタンパク質溶液の漏れを防止する。 The interface valve 9114 bisects the compound well 9102 and separates the protein from the screen until filling is complete. A confinement valve 9116 blocks the port of each compound well 9102 and isolates each condition for the continuation of the experiment. The two safety valves 9118 are activated during protein filling to prevent leakage of protein solution in the event of a failed interface valve.

この実験において利用されるミクロ流体デバイスの製造を、標準的な多層ソフトリソグラフィー技術によって調製し、８０℃において５時間以上ベーキングすることによってエッチングされたスライドガラスにシールされる。そのガラス基材は、５７４０フォトレジストの１６μｍ層でマスクされ、標準的なフォトリソグラフィーによってを使用してパターン形成される。そのガラス基材は、次いで、１：１：１（ＢＯＥ：Ｈ_２Ｏ：２ＮＨＣｌ）の溶液中で６０分間エッチングされ、最大深さ約８０μｍを有するマイクロウェルが作り出される。 The manufacture of the microfluidic device utilized in this experiment is prepared by standard multilayer soft lithography techniques and sealed to an etched glass slide by baking at 80 ° C. for 5 hours or more. The glass substrate is masked with a 16 μm layer of 5740 photoresist and patterned using standard photolithography. The glass substrate is then etched in a solution of 1: 1: 1 (BOE: H ₂ O: 2N HCl) for 60 minutes, creating microwells with a maximum depth of about 80 μm.

ちょうど記載されたチップ製造プロトコルは、本発明の可能な実施形態のほんの一例である。代替の実施形態に従って、結晶化チャンバおよびフローチャネルは、平坦な基板と、エラストマー部分の下部表面に全体に形成された凹部のパターンとの間に、規定され得る。なおさらに代替的に、結晶化チャンバおよびフローチャネルは、エラストマー部分の平坦な、特徴のない下部表面と、基板全体に形成された凹部のパターンとの間に規定され得る。 The chip manufacturing protocol just described is just one example of a possible embodiment of the present invention. According to an alternative embodiment, the crystallization chamber and flow channel may be defined between a flat substrate and a pattern of recesses formed entirely on the lower surface of the elastomer portion. Still further alternatively, the crystallization chamber and flow channel may be defined between a flat, featureless lower surface of the elastomer portion and a pattern of recesses formed in the entire substrate.

チップ上での結晶化は、以下のように設定される。チップ制御層９１０６におけるすべての制御ラインに、１５〜１７ｐｓｉの圧力で水を充填される。一旦、これらの制御ラインが満たされ、そして弁９１１４および９１１６が完全に作動されると、汚染物弁９１１６が解放され、そしてタンパク質が、約５〜７ｐｓｉを使用して、９１２０を介して、中心を通して充填される。このタンパク質溶液は、各化合物ウェル９１０２のタンパク質側を完全に満たす。破損した弁が存在する場合、同定され、そして減圧グリースが、対応するスクリーンバイアを覆って配置されて、引き続く加圧および残りの条件の可能な汚染を防止する。次いで、２．５〜４μＬのまばらなマトリックススクリーン（代表的に、ＨａｍｐｔｏｎＣｒｙｓｔａｌＳｃｒｅｅｎＩ，１−４８）が、スクリーンバイア９１２２内にピペッティングされる。安全弁９１１８が解放され、そして特別に設計されたチップホルダ（以下に記載される）が、加圧された（５〜７ｐｓｉ）シールを、全４８のスクリーンバイア９１２２にわたって作製するために使用される。スクリーン溶液が、行き止まりに充填され、各化合物ウェルのスクリーン側を満たす。タンパク質および結晶のスクリーン試薬が、全てのウェルが充填されるまで、界面弁で別々に維持され、この時点で、汚染物弁が閉じられ、そして界面弁が開かれて、化合物ウェル９１０２の２つの半体に存在する液体の体積の間での拡散を可能にする。 Crystallization on the chip is set as follows. All control lines in the chip control layer 9106 are filled with water at a pressure of 15-17 psi. Once these control lines are filled and valves 9114 and 9116 are fully activated, contaminant valve 9116 is released and the protein is centered through 9120 using approximately 5-7 psi. Filled through. This protein solution completely fills the protein side of each compound well 9102. If a failed valve is present, it is identified and vacuum grease is placed over the corresponding screen via to prevent possible pressurization and possible contamination of the remaining conditions. A 2.5-4 μL sparse matrix screen (typically, Hampton Crystal Screen I, 1-48) is then pipetted into the screen via 9122. Safety valve 9118 is released and a specially designed tip holder (described below) is used to make a pressurized (5-7 psi) seal across all 48 screen vias 9122. A screen solution is filled dead end and fills the screen side of each compound well. Protein and crystal screen reagents are maintained separately at the interfacial valve until all wells are filled, at which point the contaminant valve is closed and the interfacial valve is opened so that the two in compound well 9102 Allows diffusion between the volumes of liquid present in the half.

これらの実験のために、実験を設定する際（制御ラインを充填することを含む）に費やされる平均時間は、約３５分であり、最も速い実験は、設定するために２０分しかかからなかった。この設定時間は、潜在的に、チップへの溶液のロボットピペッティングの使用を介して、または送達された溶液の充填およびプライムするための圧力の使用を介して、またはミクロ流体計量供給デバイス（例えば、先に記載されたコンビナトリアル混合構造体）の使用を介して、なおさらに減少され得る。 For these experiments, the average time spent setting up the experiment (including filling the control line) is about 35 minutes, and the fastest experiment takes only 20 minutes to set up. It was. This set time could potentially be through the use of robotic pipetting of the solution onto the chip, or through the use of pressure to fill and prime the delivered solution, or a microfluidic metering device (e.g. Through the use of the previously described combinatorial mixing structures).

先に示されたように、本発明に従うミクロ流体デバイスの実施形態は、オンチップリザーバーまたはウェルを利用し得る。しかし、多数の溶液の充填を必要とするミクロ流体デバイスにおいては、各ウェルとインターフェースするための別々のピンを用いる、対応する多数の投入管の使用は、その流体デバイスの比較的小さい寸法を考慮して、非実用的であり得る。さらに、小さい体積の液体を分配するためのピペットの自動化された使用が公知であり、従って、チップの面上に存在するウェルに直接溶液をピペッティングするためにこのような技術を利用することは、最も容易であることを示し得る。 As indicated above, embodiments of microfluidic devices according to the present invention may utilize on-chip reservoirs or wells. However, in microfluidic devices that require multiple solution fillings, the use of corresponding multiple input tubes with separate pins to interface with each well allows for the relatively small dimensions of the fluidic device. And can be impractical. In addition, the automated use of pipettes to dispense small volumes of liquid is known, and thus utilizing such techniques to pipette solutions directly into wells present on the surface of the chip is not possible. Can be shown to be the easiest.

毛管作用は、特に、行き止まりチャンバが栄養分でプライムされる場合には、溶液をオンチップウェルからチップの活性領域に引くためには、十分ではないかもしれない。このような実施形態において、材料をチップ内に充填するための１つの様式は、外部加圧の使用を介する。また、しかし、多数の可能な材料供給源を結合されたデバイスの小さい寸法は、ピンまたはチュービングを通してここのウェルへと圧力を付与することを、非実用的にし得る。 Capillary action may not be sufficient to draw the solution from the on-chip well to the active area of the chip, especially if the dead-end chamber is primed with nutrients. In such an embodiment, one mode for filling the material into the chip is through the use of external pressure. Also, however, the small dimensions of the device coupled with a large number of possible material sources can make it impractical to apply pressure to the wells here through pins or tubing.

従って、図４４は、本発明の１つの実施形態に従うチップホルダ１１０００の分解図である。チップホルダ１１０００の底部１１００２は、上昇した周囲の部分１１００４を備え、チップ１１００８の寸法に大きさが対応する凹部領域１１００６を囲み、ミクロ流体チップ１１００８がこの内部に配置されることを可能にする。周囲領域１１００４は、さらに、ねじ穴１１０１０を規定する。 Accordingly, FIG. 44 is an exploded view of a tip holder 11000 according to one embodiment of the present invention. The bottom portion 11002 of the chip holder 11000 includes a raised peripheral portion 11004 that surrounds a recessed area 11006 that corresponds in size to the dimensions of the chip 11008 and allows the microfluidic chip 11008 to be disposed therein. The surrounding area 11004 further defines a screw hole 11010.

ミクロ流体デバイス１１００８は、チップホルダ１１０００の底部１１００２の奥部領域１１００６内に位置決めされる。ミクロ流体デバイス１１００８は、活性領域１１０１１を備え、この領域は、第一の行１１０１２ａおよび第二の行１１０１２ｂ内に構成された、周囲ウェル１１０１２と流体連絡する。ウェル１１０１２は、デバイス１１００８が機能することを可能にするために十分な料の材料を保持する。ウェル１１０１２は、例えば、結晶化剤の溶液、標的材料の溶液、または染料のような他の化学試薬を含み得る。底部１１００２は、チップ１１００８の活性領域１１０１１が観察されることを可能にする、窓１１００３を備える。 The microfluidic device 11008 is positioned in the back region 11006 of the bottom 11002 of the chip holder 11000. The microfluidic device 11008 includes an active region 11011 that is in fluid communication with the surrounding well 11012 configured in the first row 11012a and the second row 11012b. Well 11012 holds enough material to allow device 11008 to function. Well 11012 may contain other chemical reagents such as, for example, a solution of crystallization agent, a solution of target material, or a dye. The bottom 11002 comprises a window 11003 that allows the active area 11011 of the chip 11008 to be observed.

チップホルダ１１０００の頂部１１０１４は、底部チップホルダ部分１１００２、およびその中に配置されるミクロ流体チップ１１００８の上にフィットする。図示を容易にするために、図８０において、チップホルダ部分１１０１４は、アセンブリにおけるその実際の位置に対して、反転されて示されている。頂部チップホルダ部分１１０１４は、下部ホルダ部分１１００２のねじ穴１１０１０と整列したねじ穴１１０１０を備え、その結果、ねじ１１０１６が、穴１１０１０を通して挿入され得、ホルダ１１０００の部分１１００２と１１０１４との間にチップを固定し得る。チップホルダ上部１１０１４は、チップ１１００８の活性領域１１０１１が観察されることを可能にする、窓１１００５を備える。 The top 11014 of the chip holder 11000 fits over the bottom chip holder portion 11002 and the microfluidic chip 11008 disposed therein. For ease of illustration, in FIG. 80, tip holder portion 11014 is shown inverted relative to its actual position in the assembly. The top tip holder part 11014 comprises a screw hole 11010 aligned with the screw hole 11010 of the lower holder part 11002 so that a screw 11016 can be inserted through the hole 11010 and the tip between the parts 11002 and 11014 of the holder 11000. Can be fixed. The tip holder top 11014 includes a window 11005 that allows the active area 11011 of the tip 11008 to be observed.

頂部ホルダ部分１１０１４の下部表面１１０１４ａは、凹部１１０２４および１１０２６をそれぞれ囲む、隆起した環状リング１１０２０および１１０２２を備える。チップホルダ１１０００の頂部１１０１４が、ねじ１１０１６を利用してチップ１１００８と接触されて圧迫される場合に、リング１１０２０および１１０２２は、チップ１１００８の頂部表面上の柔軟な弾性材料内に押し込まれ、その結果、凹部１１０２４が、ウェル１１０１２の頂部行１１０１２ａを覆う第一のチャンバを規定し、そして凹部１１０２６が、ウェル１１０１２の下部行１１０１２ｂを覆う第二のチャンバを規定する。頂部ホルダ部分１１０１４の側部の穴１１０３０および１１０３２は、それぞれ、凹部１１０２４および１１０２６と連絡しており、正圧が、穴１１０３０および１１０３２にそれぞれ挿入されたピン１１０３４を通してチャンバに付与されることを可能にする。従って、正圧は、行内の全てのウェルに同時に付与され得、各ウェルに対して別個の接続デバイスを利用する必要性を除く。 The lower surface 11014a of the top holder portion 11014 comprises raised annular rings 11020 and 11022 that surround the recesses 11024 and 11026, respectively. When the top 11014 of the tip holder 11000 is pressed against the tip 11008 using the screw 11016, the rings 11020 and 11022 are pushed into the flexible elastic material on the top surface of the tip 11008, resulting in , The recess 11024 defines a first chamber that covers the top row 11012a of the well 11012, and the recess 11026 defines a second chamber that covers the bottom row 11012b of the well 11012. The holes 11030 and 11032 on the side of the top holder portion 11014 communicate with the recesses 11024 and 11026, respectively, so that positive pressure can be applied to the chamber through pins 11034 inserted into the holes 11030 and 11032, respectively. To. Thus, positive pressure can be applied simultaneously to all wells in a row, eliminating the need to utilize a separate connection device for each well.

操作の際に、溶液が、ウェル１１０１２内にピペッティングされ、次いで、チップ１１００８が、ホルダ１１０００の底部１１００２に入れられる。頂部ホルダ部分１１０１４は、チップ１１００８を覆って配置され、そしてねじによって、下方に押される。頂部ホルダ部分１１０１４の下部表面の隆起した環状リング１１０２０および１１０２２が、ウェルが位置するチップの上部表面とのシールを作製する。ウェル内の溶液は、チャンバ内の正圧に曝露され、そしてこれによって、ミクロ流体デバイスの活性領域に押し込まれる。 In operation, the solution is pipetted into the well 11012 and then the tip 11008 is placed in the bottom 11002 of the holder 11000. The top holder portion 11014 is placed over the tip 11008 and is pushed downward by a screw. Raised annular rings 11020 and 11022 on the lower surface of the top holder portion 11014 create a seal with the upper surface of the chip where the well is located. The solution in the well is exposed to positive pressure in the chamber and is thereby pushed into the active area of the microfluidic device.

チップホルダによって付与される下向きの圧力はまた、充填の間の、基板からのチップの層間剥離を防止するという利点を提示し得る。この層間剥離の防止は、より高いプライミング圧力の使用を可能にし得る。 The downward pressure applied by the chip holder may also present the advantage of preventing chip delamination from the substrate during filling. This prevention of delamination may allow the use of higher priming pressures.

図４４に示されるチップホルダは、本発明に従う構造体の１つのみの可能な実施形態を代表する。 The tip holder shown in FIG. 44 represents only one possible embodiment of the structure according to the invention.

（２．結晶化に影響を与える他の要因に対する制御）
上記結晶化構造体は、適切な結晶化薬剤の体積の導入を介して、標的材料の実施形態を変更することを記載するが、他の多くの要因が、結晶化に関連する。このようなさらなる要因としては、温度、圧力、溶液中の標的材料の濃度、平衡動力学、およびシード材料の存在が挙げられるが、これらに限定されない。 (2. Control over other factors affecting crystallization)
Although the crystallization structure describes modifying target material embodiments through the introduction of appropriate crystallization agent volumes, many other factors are associated with crystallization. Such additional factors include, but are not limited to, temperature, pressure, concentration of target material in solution, equilibrium kinetics, and presence of seed material.

本発明の特定の実施形態において、結晶化の間の温度に対する制御は、先に記載された、複合エラストマー／シリコン構造体を利用して達成され得る。具体的には、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度制御構造体が、結晶化チャンバがＰｅｌｔｉｅｒデバイスの近くに来るようにエラストマーがシリコンと整列している、下に重なるシリコン基板において製造され得る。適切な極性および規模の電圧の、Ｐｅｌｔｉｅｒデバイスへの印加は、チャンバ内の溶媒および対溶媒（ｃｏｕｎｔｅｒｓｏｌｖｅｎｔ）の温度を制御し得る。 In certain embodiments of the present invention, control over temperature during crystallization can be achieved utilizing the composite elastomer / silicon structure described above. Specifically, the Peltier temperature control structure can be fabricated in an overlying silicon substrate where the elastomer is aligned with the silicon so that the crystallization chamber is near the Peltier device. Application of the appropriate polarity and magnitude of voltage to the Peltier device can control the temperature of the solvent and countersolvent in the chamber.

あるいは、Ｗｕらによって「ＭＥＭＳＦｌｏｗＳｅｎｓｏｒｓｆｏｒＮａｎｏ−ｆｌｕｉｄｉｃＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓＡ８９１５２−１５９（２００１）に記載されるように、結晶化チャンバは、オーム熱を生じる微小機械加工されたレジスタ構造体に電流を選択的に印加することによって、加熱および冷却され得る。さらに、結晶化の温度は、ヒータの抵抗を経時的にモニタリングすることによって、検出され得る。Ｗｕらの論文は、全ての目的で、本明細書中に参考として援用される。 Alternatively, as described by Wu et al. In "MEMS Flow Sensors for Nano-fluidic Applications" Sensors and Actuators A 89 152-159 (2001), the crystallization chamber is a micromachined resistor structure that produces ohmic heat. Can be heated and cooled by selectively applying a current to them. Furthermore, the temperature of crystallization can be detected by monitoring the resistance of the heater over time. The Wu et al paper is incorporated herein by reference for all purposes.

本発明に従う微小作製されたエラストマー結晶化構造体にわたって、温度勾配を確立することもまた、有用であり得る。このような温度勾配は、標的材料を、結晶化の間、広範な温度に曝露し、結晶化のための最適な温度の非常に正確な決定を可能にする。 It may also be useful to establish a temperature gradient across the microfabricated elastomer crystallized structure according to the present invention. Such a temperature gradient exposes the target material to a wide range of temperatures during crystallization, allowing a very accurate determination of the optimum temperature for crystallization.

結晶化の間に圧力を制御することに関して、体積排除による対溶媒の計量供給を使用する本発明の実施形態は、特に有用である。具体的には、一旦、チャンバが適切な体積の溶媒および対溶媒を充填されると、チャンバ入口弁が閉じて維持され、一方で、このチャンバの上に重なる膜が作動され、これによって、このチャンバ内の圧力を上昇させる。体積排除以外の技術を使用する、本発明に従う構造体は、フローチャネルおよび付随する膜を結晶化チャンバに隣接して備えることによって、圧力制御を付与し得、そして具体的には、チャネル内の圧力を制御するように格下げされる。 For controlling the pressure during crystallization, embodiments of the present invention that use solvent-to-solvent metering by volume exclusion are particularly useful. Specifically, once the chamber is filled with the appropriate volume of solvent and antisolvent, the chamber inlet valve is maintained closed while the membrane overlying the chamber is activated, thereby Increase the pressure in the chamber. A structure according to the present invention using techniques other than volume exclusion can provide pressure control by providing a flow channel and associated membrane adjacent to the crystallization chamber, and specifically in the channel. Downgraded to control pressure.

結晶化に影響を与える別の要因は、溶液中で利用可能な標的材料の量である。結晶形態の場合、この材料は、溶液中に残っている標的材料の量が連続した結晶成長を維持するために授受得分であり得るまで、溶液中で利用可能な標的材料のシンクとして働く。従って、十分に大きい結晶を成長させるためには、結晶化プロセスの間に、さらなる標的材料を提供することが必要であり得る。 Another factor that affects crystallization is the amount of target material available in solution. In the crystalline form, this material acts as a sink for the target material available in the solution until the amount of target material remaining in the solution can be transferred to maintain continuous crystal growth. Thus, in order to grow sufficiently large crystals, it may be necessary to provide additional target material during the crystallization process.

従って、図２７Ａ〜２７Ｂに関して先に記載されたセルペン（ｃｅｌｌｐｅｎ）構造体は、本発明の実施形態に従う結晶化構造体において有利に使用されて、成長中の結晶をチャンバ内に閉じ込め得る。このことは、成長中の結晶を、さらなる標的材料を提供しているフローチャネルから洗い流して、成長中の結晶が廃液内に失われる危険性を除く。 Accordingly, the cell pen structure described above with respect to FIGS. 27A-27B can be advantageously used in a crystallization structure in accordance with an embodiment of the present invention to confine growing crystals within the chamber. This eliminates the risk that the growing crystals are washed away from the flow channel providing additional target material and that the growing crystals are lost in the effluent.

さらに、図２７Ａ〜２７Ｂのセルペン構造体はまた、結晶道程のプロセスの間に有用であり得る。具体的には、塩が、しばしば、サンプルまたは対溶媒中に存在し、そしてこれらの塩は、結晶化の試みの間に、結晶を形成し得る。塩結晶の成長を目的の標的結晶から区別するための１つの一般的な方法は、ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＬａｇｕｎａＮｉｇｕｅｌ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによって製造されるＩＺＩＴ^ＴＭのような染色色素に曝露することによる。ＩＺＩＴ^ＴＭ色素は、タンパク質結晶を青色に染色するが、塩結晶を染色しない。 In addition, the serpen structure of FIGS. 27A-27B may also be useful during the crystallographic process. In particular, salts are often present in the sample or antisolvent, and these salts can form crystals during crystallization attempts. One common method for distinguishing salt crystal growth from the target crystal of interest is by exposure to a staining dye such as IZIT ^™ manufactured by Hampton Research of Laguna Niguel, California. IZIT ^™ dye stains protein crystals blue, but not salt crystals.

しかし、ＩＺＩＴ^ＴＭ色素を、結晶を保持している結晶化チャンバに流すプロセスにおいて、これらの結晶は、移動され得、一掃され得、そして失われ得る。従って、セルペン構造体が、本発明に従う結晶化構造体および方法においてさらに使用されて、染色プロセスの間、結晶を適所に固定し得る。 However, in the process of flowing IZIT ^™ dye into the crystallization chamber holding the crystals, these crystals can be moved, swept away, and lost. Accordingly, serpen structures can be further used in the crystallization structures and methods according to the present invention to fix the crystals in place during the dyeing process.

図４９は、セルペン概念に基づく、結晶のための選別デバイスの実施形態を示す。具体的には、種々の大きさの結晶８５０１が、選別デバイス８５００の上流のフローチャネル８５０２において形成され得る。選別デバイス８５００は、異なる距離で間隔を空けたピラー８５０６の連続的な行８５０４を備える。分枝チャネル８５１０の入口８５０８が、行８５０４の前方に位置決めされる。結晶８５０１がチャネル８５０２に沿って流れるにつれて、これらの結晶は、ピラー８５０６の行８５０４に遭遇する。最も大きい結晶は、第一の行８５０４ａのピラー８５０６の間のギャップＹの間を通過し得ず、そして行８５０４ａの前に蓄積する。より小さいサイズの結晶は、ピラーの間で連続的により小さくなる間隔を有する連続的な行の前に集められる。一旦、上記の様式で選別されると、先に記載されたような蠕動ポンプ８５１４を利用して、分枝チャネル８５１０を通して流体をポンピングすることによって、種々の大きさの結晶が、チャンバ８５１２内に収集され得る。この選別構造体によって収集される、より大きい結晶は、ｘ線結晶学分析に供され得る。この選別構造体によって収集される、より小さい結晶は、さらなる結晶化の試みにおいて、シード結晶として利用され得る。 FIG. 49 shows an embodiment of a sorting device for crystals based on the serpen concept. Specifically, various sized crystals 8501 can be formed in the flow channel 8502 upstream of the sorting device 8500. The sorting device 8500 comprises continuous rows 8504 of pillars 8506 spaced at different distances. The inlet 8508 of the branch channel 8510 is positioned in front of the row 8504. As crystals 8501 flow along channel 8502, they encounter a row 8504 of pillars 8506. The largest crystals cannot pass through the gap Y between the pillars 8506 in the first row 8504a and accumulate before the row 8504a. Smaller size crystals are collected before successive rows with successively smaller spacing between the pillars. Once sorted in the manner described above, crystals of various sizes are placed in the chamber 8512 by pumping fluid through the branch channel 8510 utilizing a peristaltic pump 8514 as previously described. Can be collected. Larger crystals collected by this sorted structure can be subjected to x-ray crystallography analysis. Smaller crystals collected by this sorted structure can be utilized as seed crystals in further crystallization attempts.

結晶の成長に影響を与える別の要因は、シードを入れることである。シード結晶を標的溶液に導入することによって、溶液中の分子が整列し得る温度を提供することによって、結晶の形成が大いに増強され得る。シード結晶が利用可能ではない場合、本発明に従うミクロ流体結晶化方法およびシステムの実施形態は、類似の機能を実施するために、他の構造体を利用し得る。 Another factor that affects crystal growth is seeding. By introducing seed crystals into the target solution, crystal formation can be greatly enhanced by providing a temperature at which molecules in the solution can align. If seed crystals are not available, embodiments of microfluidic crystallization methods and systems according to the present invention may utilize other structures to perform similar functions.

例えば、上で議論されたように、本発明に従う構造体のチャネルおよびチャンバは、代表的に、微小製造された特徴を含むエラストマー層を、ガラスのような下に重なる基板と接触させては位置することによって、規定される。この基板は、平坦である必要がなく、むしろ、結晶形成を誘導するために計算された大きさおよび／または形状の突出部または奥部を備え得る。本発明の１つの実施形態に従って、下に重なる基板は、規則的な所望の形態を示す好物マトリックスであり得る。あるいは、下に重なる基板は、結晶形成を誘導するように計算された所望の形態または一連の形態を示すために、パターン付けされ得る（すなわち、従来の半導体リソグラフィー技術によって）。このような構造体の表面形態の最適な形態は、標的結晶についての以前の知識によって、決定され得る。 For example, as discussed above, the channels and chambers of the structure according to the present invention are typically located in contact with an underlying layer of elastomer, including microfabricated features, such as glass. It is prescribed by doing. The substrate need not be flat, but rather may have protrusions or backs of a calculated size and / or shape to induce crystal formation. According to one embodiment of the present invention, the underlying substrate can be a favorite matrix that exhibits a regular desired morphology. Alternatively, the underlying substrate can be patterned (ie, by conventional semiconductor lithographic techniques) to exhibit a desired form or series of forms that are calculated to induce crystal formation. The optimal morphology of the surface morphology of such a structure can be determined by previous knowledge about the target crystal.

本発明に従う結晶化構造体および方法の実施形態は、従来のアプローチより優れた多数の利点を与える。１つの利点は、極度に小さい体積（ナノリットル／ナノリットル未満）のサンプルおよび結晶化剤が、比較的少量のサンプルを利用して、広範な種々の再結晶条件が使用されることを可能にすることである。 Crystallized structure and method embodiments according to the present invention provide numerous advantages over conventional approaches. One advantage is that extremely small volume (nanoliter / nanoliter) samples and crystallization agents can be utilized with a relatively small amount of sample and a wide variety of recrystallization conditions can be used. It is to be.

本発明の実施形態に従う結晶化構造体および方法の別の利点は、小さいサイズの結晶化チャンバが、何百、または何千さえもの異なるセットの条件下で、結晶化の試みが同時に実施されることを可能にすることである。再結晶の際に使用される小さい体積のサンプルおよび結晶化剤はまた、価値のある精製された標的材料の最小の廃棄を生じる。 Another advantage of the crystallization structure and method according to embodiments of the present invention is that a small size crystallization chamber is used to simultaneously perform crystallization attempts under hundreds or even thousands of different sets of conditions. Is to make it possible. Small volume samples and crystallization agents used during recrystallization also result in minimal disposal of valuable purified target material.

本発明の実施形態に従う結晶化の更なる利点は、操作が比較的単純であることである。具体的には、平行な作動を利用する、流れに対する制御は、少数のみの制御ラインの存在を必要とし、サンプルおよび結晶化剤の導入は、微小加工されたデバイスの操作によって自動的に実施され、多数のサンプルについて、非常に迅速な調製時間を可能にし、サンプル溶液の少ない使用、設定の容易さ、十分に規定された流体界面の作製、平衡動力学に対する制御、およびハイスループットの平行実験を実施する能力というさらなる利点を伴う。これらの利点は、本発明の多数の特徴によって、可能にされる。 A further advantage of crystallization according to embodiments of the present invention is that the operation is relatively simple. Specifically, control over flow utilizing parallel actuation requires the presence of only a few control lines, and the introduction of sample and crystallizing agent is performed automatically by manipulation of microfabricated devices. Enables very fast preparation times for large numbers of samples, low sample solution usage, ease of setup, creation of well-defined fluid interfaces, control over equilibrium kinetics, and high-throughput parallel experiments With the additional advantage of ability to implement. These advantages are made possible by a number of features of the present invention.

ミクロ流体力学は、ナノリットル未満の規模での流体の取り扱いを可能にする。その結果、大きい収容チャンバを使用する必要性がなく、従って、アッセイは、ナノリットルまたはナノリットル未満の規模で実施され得る。極端に小さい体積の利用は、１つの巨視的なフリー界面拡散実験のために必要とされるものと同じサンプル体積を消費して、何千ものアッセイが実施されることを可能にする。このことは、費用のかかる、時間を浪費する増幅工程および精製工程を減少させ、そして容易には発現されない、従って、多量のサンプルから精製されなければならないタンパク質のスクリーニングを可能にする。 Microfluidic mechanics allows the handling of fluids on a sub-nanoliter scale. As a result, there is no need to use a large containment chamber and therefore the assay can be performed on a nanoliter or sub-nanoliter scale. The use of extremely small volumes allows thousands of assays to be performed, consuming the same sample volume required for a single macroscopic free interface diffusion experiment. This reduces costly and time consuming amplification and purification steps and allows screening of proteins that are not easily expressed and therefore must be purified from large amounts of sample.

ミクロ流体力学は、さらに、調製時間の節約を与える。なぜなら、何百、または何千ものアッセイが、同時に実施され得るからである。先に記載されたような、秤量可能な計量供給技術の使用は、並行実験が、制御機構の複雑さを増加させることなく実施されることを可能にする。 Microfluidics further provides a preparation time savings. This is because hundreds or thousands of assays can be performed simultaneously. The use of a weighable metering technique, as described above, allows parallel experiments to be performed without increasing the complexity of the control mechanism.

本発明の実施形態に従う結晶化システムのなお別の利点は、溶液並行速度を制御する能力である。結晶成長は、しばしば、非常にゆっくりであり、そしてこの溶液が、平衡化の途中で最適濃度を通過する場合、結晶が形成されない。従って、平衡化の速度を制御し、これによって、中間の濃度で結晶成長を促進することは、有利であり得る。従来の結晶化のアプローチにおいて、ゆっくりにされた平衡化は、蒸気拡散、ゆっくりした透析、および非常に小さい物理的界面のような技術を使用して、達成される。 Yet another advantage of a crystallization system according to embodiments of the present invention is the ability to control solution parallel velocity. Crystal growth is often very slow and no crystals are formed if this solution passes the optimal concentration during equilibration. Therefore, it may be advantageous to control the rate of equilibration, thereby promoting crystal growth at intermediate concentrations. In conventional crystallization approaches, slowed equilibration is achieved using techniques such as vapor diffusion, slow dialysis, and very small physical interfaces.

しかし、本発明の実施形態に従う結晶化は、溶液平行の速度に対する制御を可能にする。体積排除によって結晶化剤を計量供給するシステムにおいて、上に重なる膜は、繰り返し変形し得、各寸法が、さらなる結晶化剤の導入を生じる。体積捕捉によって結晶化剤を計量供給するシステムにおいてサンプルを結晶化剤から分離する弁は、短時間にわたって開かれて、部分的な拡散混合を可能にし得、次いで、閉じられて、中間の濃度でのチャンバ平衡化を可能にする。このプロセスは、最終濃度が達成されるまで繰り返される。体積排除アプローチまたは体積捕捉アプローチのいずれも、中間濃度の全範囲が、単一の反応チャンバを利用して、１回の実験でスクリーニングされることを可能にする。以下に詳細に議論されるように、結晶化プロセスの速度論に対する制御は、サンプルおよび結晶化剤をそれぞれ含むリザーバー内の毛管接続の長さまたは断面積を変化させることによって、制御され得る。 However, crystallization according to embodiments of the present invention allows control over solution parallel velocity. In a system that dispenses the crystallization agent by volume exclusion, the overlying membrane can be repeatedly deformed, each dimension resulting in the introduction of additional crystallization agent. The valve that separates the sample from the crystallization agent in a system that dispenses the crystallization agent by volume capture can be opened for a short time to allow partial diffusive mixing and then closed to an intermediate concentration. Enables chamber equilibration. This process is repeated until the final concentration is achieved. Either the volume exclusion approach or the volume capture approach allows the entire range of intermediate concentrations to be screened in a single experiment utilizing a single reaction chamber. As discussed in detail below, control over the kinetics of the crystallization process can be controlled by changing the length or cross-sectional area of the capillary connection in the reservoir containing the sample and the crystallization agent, respectively.

溶液平衡の経時的な操作はまた、より小さい結晶化剤（例えば、塩）に対する高分子（例えば、タンパク質対）の拡散の差示的速度を利用する。大きいタンパク質分子は、塩よりずっとゆっくりと拡散し、界面の弁を迅速に開閉して、結晶化剤の濃度を優位に変化させ、同時に、非常に小さいサンプルは、拡散によって、より大きい体積の結晶化剤中に失われる。さらに、上記のように、すでに記載された多くの結晶化構造体は、異なる時点で
同じ反応チャンバ内に異なる結晶化剤を導入することを可能にする。このことは、経時的に変化する溶媒条件を規定する結晶化プロトコルを可能にする。平衡に対する温度制御が、以下で詳細に議論される。 Solution equilibration over time also takes advantage of the differential rate of diffusion of macromolecules (eg, protein pairs) to smaller crystallization agents (eg, salts). Large protein molecules diffuse much more slowly than salts, opening and closing the interfacial valve quickly, and predominately changing the concentration of the crystallization agent, while at the same time very small samples can be Lost in the agent. Moreover, as described above, many of the crystallization structures already described allow different crystallization agents to be introduced into the same reaction chamber at different times. This allows for a crystallization protocol that defines solvent conditions that change over time. Temperature control for equilibrium is discussed in detail below.

（３．チップ上のタンパク質からの結晶構造の分析）
そのチップの有用性は、低下したコストで高品質回折パターンを迅速に生成するその能力に最終的に依存する。チップ−対−タンパク質構造からの透明な経路は、それゆえに、非常に価値がある。チップ中の結晶から回折データまでのいくつからの経路は、以下で議論される。 (3. Analysis of crystal structure from protein on chip)
The usefulness of the tip ultimately depends on its ability to quickly generate high quality diffraction patterns at a reduced cost. The transparent pathway from the chip-to-protein structure is therefore very valuable. Several paths from the crystals in the chip to the diffraction data are discussed below.

チップについての１つのあり得る適用は、従来の技術を使用してその後に再現され得る都合のよい結晶化条件の決定である。そのチップと２つの従来技術（マイクロバッチおよび垂下小滴（ｈａｎｇｉｎｇｄｒｏｐ）との間の対応は、様々である（４５％と８０％との間）ことが示された。しかし、この変動は、そのチップに特有の特徴ではない。これらの広く使用される結晶化技術は、周辺の対応のみを示し（例えば、リゾチームについての１６個の垂下小滴のヒットのうちの１４個は、マイクロバッチ中で存在しない）、しばしば、それらの技術自体の中で変動を示す。最初の結晶化条件をスクリーニングするためのツールとして、そのチップは、多くの有望な条件として同定され得る。 One possible application for the chip is the determination of convenient crystallization conditions that can subsequently be reproduced using conventional techniques. The correspondence between the chip and the two prior art (microbatch and hanging drop) has been shown to vary (between 45% and 80%), but this variation is These widely used crystallization techniques show only marginal correspondence (eg, 14 of the 16 dripping droplet hits for lysozyme are in a microbatch). Often presents variability within the technology itself, and as a tool for screening initial crystallization conditions, the chip can be identified as a number of promising conditions.

図５２は、３つの異なる技術を使用する、６つの異なるタンパク質サンプル（リゾチーム、グルコースイソメラーゼ、プロテイナーゼＫ、トポイソメラーゼＩＶのＢサブユニット、キシラナーゼ、およびウシ膵臓トリプシン）に対して生成されるヒット数の比較を示す。図５２において、結晶、微結晶、ロッドおよび針のみがヒットとして計数される一方で、球粒（ｓｐｈｅｒｕｌｉｔｅ）および沈澱は、計数されない。プロテイナーゼＫに関するデータは、ＰＭＳＦありまたはＰＭＳＦなしでの実験の合計であり、トポイソメラーゼＶＩのＢサブユニットに関するデータは、垂下小滴データがないので含めなかった（そのチップ（Ｃｈｉｐ）は、この場合においてマイクロバッチを遙かにしのぐにも拘わらず）。図５２を調べると、６つの場合のうちの４つにおいて、そのチップは、いずれの従来の方法よりもより多くのヒットをもたらしたことを示す。 FIG. 52 compares the number of hits generated for six different protein samples (lysozyme, glucose isomerase, proteinase K, topoisomerase IV B subunit, xylanase, and bovine pancreatic trypsin) using three different techniques. Indicates. In FIG. 52, only crystals, microcrystals, rods and needles are counted as hits, while spherulites and precipitates are not counted. Data for proteinase K is the sum of experiments with or without PMSF, and data for the B subunit of topoisomerase VI was not included because there was no drooping droplet data (the chip in this case Despite surpassing micro batches). Examining FIG. 52 shows that in four of the six cases, the chip resulted in more hits than any conventional method.

そのチップの生産性のあり得る理由を同定するために、結晶化方法の間の差異を理解するために、本発明者らは、その３つの方法は、短時間スケールおよび長時間スケールの両方に対して異なる熱力学的条件をもたらすことを認識しなければならない。タンパク質結晶化を誘導するために、その結晶化をエネルギー的に好都合にされなければならず（過飽和条件）、これらの条件を結晶の成長が生じるに十分長く維持されなければならない。 In order to identify the possible reasons for the productivity of the chip, in order to understand the differences between the crystallization methods, we have determined that the three methods can It must be recognized that this leads to different thermodynamic conditions. In order to induce protein crystallization, the crystallization must be energetically favored (supersaturated conditions) and these conditions must be maintained long enough for crystal growth to occur.

過飽和の異なる程度もまた存在する。低い過飽和において、結晶の成長は、支持される傾向がある一方で、新たな結晶の核形成は、起こる可能性が比較的低い。高い過飽和において、核形成は迅速であり、多くの小さな低品質の結晶がしばしば形成され得る。ここで考慮されるその３つの方法において、その過飽和条件は、タンパク質および対溶媒（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｏｌｖｅｎｔ）の相対濃度および絶対濃度の操作を通じて達成される。 There are also different degrees of supersaturation. At low supersaturation, crystal growth tends to be supported, while nucleation of new crystals is relatively unlikely to occur. At high supersaturation, nucleation is rapid and many small, low quality crystals can often be formed. In the three methods considered here, the supersaturation condition is achieved through manipulation of relative and absolute concentrations of protein and counter-solvent.

その３つの方法の位相空間の進展／平衡化の比較は、図５７に示される。そのマイクロバッチ技術に関して、２つの溶液の混合は、迅速であり、非透過性油層下で維持される場合、有意な濃縮は、時間がたってもほとんど起こらない。従って、マイクロバッチは、位相空間において単一の点のみをサンプリングする傾向があり、経時的にほぼ同じ条件を維持する。 A comparison of the phase space evolution / equilibrium of the three methods is shown in FIG. With respect to the microbatch technique, the mixing of the two solutions is rapid and, if maintained under an impermeable oil layer, significant enrichment hardly occurs over time. Thus, microbatch tends to sample only a single point in phase space and maintains approximately the same conditions over time.

垂下小滴は、２つの溶媒を迅速に混合して、マイクロバッチのように始まるが、次いで、より多くの濃縮された塩／沈澱物レザバを有する蒸気平衡化に起因して、より長い時間スケール（数時間から数日）で濃縮を受ける。その小滴の蒸発脱水の間に、タンパク質対沈殿剤の比は、一定のままである。 A dripping droplet begins with a rapid mixing of two solvents, like a microbatch, but then a longer time scale due to vapor equilibration with more concentrated salt / precipitate reservoir Concentrate in (hours to days). During the evaporation of the droplets, the ratio of protein to precipitating agent remains constant.

ミクロ流体フリー界面拡散（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｆｒｅｅｉｎｔｅｒｆａｃｅｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）の記載において以下に詳細に記載されるように、短時間スケールにおいて、そのチップの動力学は、フリー界面拡散実験に最もよく似ている。混合は緩慢であり、種平衡化（タンパク質／沈澱剤／タンパク質／塩）の速度は、種の拡散定数に依存する。塩のような低分子は、より大きな拡散定数を有し、従って、迅速に平衡化する。高分子（例えば、タンパク質）は、小さな拡散定数を有し、よりゆっくりと平衡化する。 As described in detail below in the description of microfluidic free interface diffusion, on a short time scale, the dynamics of the chip most closely resembles free interface diffusion experiments. Mixing is slow and the rate of species equilibration (protein / precipitant / protein / salt) depends on the diffusion constant of the species. Small molecules such as salts have a larger diffusion constant and therefore equilibrate quickly. Macromolecules (eg proteins) have a small diffusion constant and equilibrate more slowly.

キャピラリー中のフリー界面拡散の結晶化技術は、そのチップ結果により近く匹敵し得る。伝統的に、この方法は、十分に規定された界面を信頼性高く設定する困難性に起因して、それほどの頻度では使用されない。しかし、ミクロ流体環境において、信頼性の高いフリー界面拡散実験を確立することは比較的容易である。ミクロ流体フリー界面の形成のさらなる議論は、以下に提示される。結晶化チップの別の適用において、結晶は、従来の方法を使用して回収するために成長させ得る。 The crystallization technique of free interfacial diffusion in capillaries can be more comparable to the tip result. Traditionally, this method is not used very often due to the difficulty of setting a well-defined interface reliably. However, it is relatively easy to establish a reliable free interface diffusion experiment in a microfluidic environment. Further discussion of the formation of a microfluidic free interface is presented below. In another application of the crystallization chip, the crystals can be grown for recovery using conventional methods.

高品質結晶がチップで成長され得、そのチップから抽出され得る場合、結晶化方法は、エクスポートされる必要はない。そのチップは、ガラス基材から除去され得るので、タンパク質結晶を抽出することは可能である。 If high quality crystals can be grown and extracted from the chip, the crystallization method need not be exported. Since the chip can be removed from the glass substrate, it is possible to extract protein crystals.

上記で記載されるように、いったんタンパク質結晶が形成されると、その三次元構造についての情報は、その結晶によるｘ線の回折から得られ得る。しかし、非常にエネルギーが高い放射線をそのタンパク質に適用することによって、熱を発する傾向がある。Ｘ線はまたイオン化して、フリーラジカルおよび破壊された結合の生成を生じ得る。熱またはイオン化のいずれかが、結晶が入射ｘ線を回折する能力を破壊または分解し得る。 As described above, once a protein crystal is formed, information about its three-dimensional structure can be obtained from x-ray diffraction by the crystal. However, applying very high energy radiation to the protein tends to generate heat. X-rays can also ionize, resulting in the formation of free radicals and broken bonds. Either heat or ionization can destroy or degrade the ability of the crystal to diffract incident x-rays.

従って、結晶の形成に際して、低温物質は、代表的には、その結晶性物質をその変化した状態で保つために添加される。しかし、低温液体（ｃｒｙｏｇｅｎ）を突然添加すると、結晶を傷つけることもある。従って、本発明に従う結晶化チップの実施形態にとって、いったん結晶性物質がそこで形成された後に結晶化チャンバに低温液体を直接添加することを可能にすることは有利である。 Thus, during crystal formation, the low temperature material is typically added to keep the crystalline material in its altered state. However, sudden addition of cryogen may damage the crystals. Therefore, it is advantageous for the embodiment of the crystallization chip according to the present invention to allow the cryogenic liquid to be added directly to the crystallization chamber once the crystalline material has been formed there.

さらに、タンパク質結晶は、非常に繊細であり、物理的外傷に応じて急激に砕け得るかまたは崩壊し得る。従って、チップの小さなチャンバから無傷の結晶を採取することによって、潜在的障害がその結晶性材料についての価値ある情報の獲得を引き起こす。 In addition, protein crystals are very delicate and can break up or collapse rapidly in response to physical trauma. Thus, by collecting intact crystals from a small chamber of the chip, a potential obstacle causes gaining valuable information about the crystalline material.

従って、本発明に従う結晶化チップの代替的実施形態にとって、チップ中に形成される結晶性材料のｘ線照射による直接的質問を可能にし、それによって、別個の結晶採取手順の必要性を完全に不要にすることもまた有利である。 Thus, an alternative embodiment of a crystallization chip according to the present invention allows direct interrogation of the crystalline material formed in the chip by x-ray irradiation, thereby completely eliminating the need for a separate crystallization procedure. It is also advantageous to make it unnecessary.

従って、図５３Ａは、本発明に従う結晶成長チップの簡略化した実施形態の平面図を示す。図５３Ｂは、図５３Ａに示された結晶成長チップの実施形態の線Ｂ−Ｂ’に沿った簡略化した断面図を示す。 Accordingly, FIG. 53A shows a plan view of a simplified embodiment of a crystal growth chip according to the present invention. FIG. 53B shows a simplified cross-sectional view along line B-B ′ of the embodiment of the crystal growth chip shown in FIG. 53A.

採取／成長チップ９２００は、ガラス基材９２０４を覆うエラストマー部分９２０２を含む。ガラス基材９２０４は、３つのエッチングされたウェル９２０６ａ、９２０６ｂおよび９２０６ｃを計算する。エラストマー部分９２０２をガラス基材９２０４の上に配置することによって、フローチャネル９２０８を通って違いと流体連絡状態にある３つの対応するチャンバが規定される。フローチャネル９２０８を通る物質の流れは、制御チャネル９２０８に制御ライン９２１２が重なり合うことによって規定されるバルブ９２１０によって制御される。 The harvest / growth chip 9200 includes an elastomer portion 9202 that covers a glass substrate 9204. The glass substrate 9204 calculates three etched wells 9206a, 9206b and 9206c. By disposing the elastomeric portion 9202 over the glass substrate 9204, three corresponding chambers are defined that are in differential fluid communication through the flow channel 9208. The flow of material through the flow channel 9208 is controlled by a valve 9210 defined by the control line 9212 overlapping the control channel 9208.

成長／採取チップ９２００の操作の間に、バルブ９２１０は、チャンバ９２０６ａ、９２０６ｂおよび９２０６ｃの内容間の接触を防止するように、最初に作動される。チャンバ９２０６ａ、９２０６ｂおよび９２０６ｃは、次いで、結晶化をもたらすために異なる物質で、ウェル９２１４を通って別個に充填される。例えば、チャンバ９２０６ａは、タンパク質溶液で充填され得、チャンバ９２０６ｂは、結晶化剤で充填され得、チャンバ９２０６ｃは、低温液体で充填され得る。 During operation of the growth / collection tip 9200, the valve 9210 is initially actuated to prevent contact between the contents of the chambers 9206a, 9206b and 9206c. Chambers 9206a, 9206b and 9206c are then separately filled through well 9214 with different materials to effect crystallization. For example, chamber 9206a can be filled with a protein solution, chamber 9206b can be filled with a crystallization agent, and chamber 9206c can be filled with a cryogenic liquid.

その第１の制御ライン９２１２は、次いで、バルブ９２１０ａを開放するように作動停止（ｄｅａｃｔｉｖａｔｅ）され得、それによって、タンパク質溶液および結晶化剤の拡散を可能にする。結晶９２１６の形成に際して、残りの制御ライン９２１２は、作動停止されて、チャンバ９２０６ｃからの低温液体の拡散が可能になり、結晶９２１６が保たれ得る。 That first control line 9212 can then be deactivated to open valve 9210a, thereby allowing diffusion of the protein solution and crystallization agent. Upon formation of the crystal 9216, the remaining control line 9212 is deactivated, allowing the cryogenic liquid to diffuse out of the chamber 9206c, and the crystal 9216 can be retained.

次に、チップ全体９２００は、ｘ線回折装置に取り付けられ得、ｘ線ビーム９２１８が、供給源９２２０から結晶９２１６に対して適用され、検出器９２２２によって回折が検知される。図５３Ｂに示されるように、ウェル９２０６の普通の位置は、エラストマー部分９２０２および下にあるガラス部分９２０４の両方の厚みが減少した領域に対応する。このようにして、放射線ビーム９２１８は、結晶９２１６に遭遇する前およびその後に、最小量のエラストマーおよびガラス材料を横断することが必要であり、それによって、受容される回折シグナルに対するノイズの悪影響を低下させる。 The entire chip 9200 can then be attached to an x-ray diffractometer, where an x-ray beam 9218 is applied from the source 9220 to the crystal 9216 and the diffraction is detected by the detector 9222. As shown in FIG. 53B, the normal location of the well 9206 corresponds to a region where the thickness of both the elastomer portion 9202 and the underlying glass portion 9204 has been reduced. In this way, the radiation beam 9218 needs to traverse a minimum amount of elastomer and glass material before and after encountering the crystal 9216, thereby reducing the negative effects of noise on the received diffraction signal. Let

タンパク質成長／採取チップの一例は、図５３Ａ〜Ｂに関連して上記で記載されているが、本発明に従う実施形態は、この特定の構造に限定されない。例えば、記載されているこの実施形態は、マイクロチャンバがエッチングされているガラス基材を利用するが、本発明に従うミクロ流体構造の製造は、ガラス基材の利用に限定されない。基材において外形を製造するためのあり得る選択肢としては、プラスチックの射出成形、プラスチック（例えば、ＰＭＭＡ）の熱エンボス加工または光硬化性ポリマー（例えば、ＳＵ８フォトレジスト）を利用するウェルの製作が挙げられる。 An example of a protein growth / harvest chip is described above in connection with FIGS. 53A-B, but embodiments according to the present invention are not limited to this particular structure. For example, although the described embodiment utilizes a glass substrate in which the microchamber is etched, the manufacture of the microfluidic structure according to the present invention is not limited to the utilization of a glass substrate. Possible options for manufacturing the outline on the substrate include injection molding of plastic, hot embossing of plastic (eg PMMA) or fabrication of wells utilizing a photocurable polymer (eg SU8 photoresist). It is done.

さらに、外形は、レーザー切除を利用して基材（例えば、ガラス）上に形成され得るか、または外形は、ガラス以外の基材（例えば、シリコン）の等方性（ｉｓｏｔｒｏｐｉｃ）エッチングもしくは異方性（ａｎｉｏｓｏｔｒｏｐｉｃ）エッチングによって形成され得る。 Further, the contour can be formed on a substrate (eg, glass) using laser ablation, or the contour can be an isotropic etching or anisotropic of a substrate (eg, silicon) other than glass. It can be formed by an anisotropic etching.

代替の製造方法によって付与される潜在的な利点としては、より密な一体化を可能にする外形のより正確な規定、および製造（例えば、エンボス加工）が容易であることが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、特定の材料（例えば、炭素ベースのプラスチック）は、ｘ線の散乱の発生が少なく、それによって、チップから直接回折データを収集することが容易になる。 Potential advantages afforded by alternative manufacturing methods include more precise definition of outlines that allow closer integration and ease of manufacturing (eg, embossing), but these It is not limited to. In addition, certain materials (eg, carbon-based plastics) are less prone to x-ray scattering, which makes it easier to collect diffraction data directly from the chip.

結晶採取についてのさらなる可能性は、チップから除去する（ｏｆｆ−ｌｏａｄ）方法を有することである。一旦結晶が形成された後に、または代わりにインキュベーションの前に、除去が行われ得る。これらの除去された結晶は、次いで、巨視的反応を導入するために使用され得るか、または抽出および低温ループに置かれ得る。テイオン流体の添加のための方法もまた開発されれば、その結晶は、急速凍結され得、ｘ線ビームに直接取り付けられ得る。 A further possibility for crystal harvesting is to have an off-load method. Removal can take place once crystals have formed, or alternatively prior to incubation. These removed crystals can then be used to introduce a macroscopic reaction or placed in an extraction and cold loop. If a method for the addition of the theionic fluid is also developed, the crystals can be snap frozen and attached directly to the x-ray beam.

（４．平衡化に対する一時的制御）
結晶の成長および品質は、平衡化の間に調査される熱力学的条件のみならず、平衡化が起こる速度によっても決定される。従って、平行の動力学を制御することは潜在的に価値がある。 (4. Temporary control for equilibration)
Crystal growth and quality are determined not only by the thermodynamic conditions investigated during equilibration, but also by the rate at which equilibration occurs. Therefore, controlling parallel dynamics is potentially valuable.

従来の結晶化方法の過程において、平衡化の動力学に対する制御のみが、最初の条件の操作を通じて利用可能であり得る。巨視的なフリー界面拡散について、一旦拡散が開始すると、実験者は、その後の平行加速度に対する制御を有さない。垂下小滴実験について、その平衡化速度は、最初の小滴の大きさ、レザバの全体のサイズ、またはインキュベーションの温度を変えることによって変更され得る。マイクロバッチ実験において、そのサンプルが濃縮される速度は、その小滴の大きさ、ならびに周辺の油の正体および量によって変化され得る。その平衡化速度は、これらのパラメーターに複雑な様式で依存するので、その平衡化の動力学は、精密でない様式で変化され得るに過ぎない。さらに、一旦その実験が開始してしまうと、その平衡化の動力学に対するさらなる制御は、不能である。 In the course of conventional crystallization methods, only control over the kinetics of equilibration may be available through operation of the initial conditions. For macroscopic free interface diffusion, once the diffusion begins, the experimenter has no control over the subsequent parallel acceleration. For drooping drop experiments, the equilibration rate can be altered by changing the initial drop size, the overall size of the reservoir, or the temperature of the incubation. In microbatch experiments, the rate at which the sample is concentrated can vary depending on the size of the droplets and the identity and amount of the surrounding oil. Since the equilibration rate depends on these parameters in a complex manner, the equilibration kinetics can only be changed in an inexact manner. Furthermore, once the experiment has started, no further control over the equilibration dynamics is possible.

対照的に、ゲートが設けられた（ｇａｔｅｄ）４−Ｆｉｂ実験におけるその流体界面は、反応チャンバの寸法および接続チャネルの寸法の操作によって制御され得る。より良好な近似値になるまで、平衡化に要する時間は、必要とされる拡散の長さとして変化する。平衡化速度はまた、その接続チャネルの断面積に依存する。平衡化に必要とされる時間は、従って、その長さ、および接続チャネルの断面積の両方を変化させることによって制御され得る。 In contrast, the fluid interface in a gated 4-Fib experiment can be controlled by manipulating the dimensions of the reaction chamber and the dimensions of the connecting channel. Until a better approximation, the time required for equilibration varies as the length of diffusion required. The equilibration speed also depends on the cross-sectional area of the connecting channel. The time required for equilibration can therefore be controlled by changing both its length and the cross-sectional area of the connecting channel.

図３８Ａは、３セットの化合物チャンバ９８００、９８０２、および９８０４の対を示し、各対は、異なる長さΔｘのマイクロチャネル９８０６によって接続される。図３８Ｂは、平衡化時間対平衡化距離をプロットする。図３８Ｂは、図３８Ａのチャンバの平衡化に要する時間が、接続チャネルの長さに従って変化することを示す。 FIG. 38A shows three pairs of compound chambers 9800, 9802, and 9804, each pair connected by a microchannel 9806 of different length Δx. FIG. 38B plots equilibration time versus equilibration distance. FIG. 38B shows that the time required to equilibrate the chamber of FIG. 38A varies according to the length of the connecting channel.

図３９は、４つの化合物チャンバ９９００、９９０２、９９０４、および９９０６を示し、各々、接続マイクロチャネル９９０８の異なる配置を有する。マイクロチャネル９９０８は、同じ長さを有するが、断面積および／または接続チャネルの数が異なる。平衡化の速度は、そのようにして、断面積を減少／増大させることによって（例えば、接続チャネルの数またはそれらのチャネルの寸法を減少／増大させることによって）、増大／減少され得る。 FIG. 39 shows four compound chambers 9900, 9902, 9904, and 9906, each having a different arrangement of connecting microchannels 9908. The microchannels 9908 have the same length but differ in cross-sectional area and / or number of connecting channels. The speed of equilibration can thus be increased / decreased by decreasing / increasing the cross-sectional area (eg by decreasing / increasing the number of connecting channels or the dimensions of those channels).

接続チャネルの外形を減価させることによって、平衡化の速度の変化は、結晶成長に対する平衡化動力学の効果を調査するために単一のデバイスで使用され得る。図３７Ａ〜Ｄは、微小自由化胃面からの２つの溶液の部分的拡散平衡により最初に確立された濃度勾配が、封じ込めバルブの作動によって維持され得る実施形態を示す。 By reducing the geometry of the connecting channel, changes in the speed of equilibration can be used in a single device to investigate the effect of equilibration kinetics on crystal growth. FIGS. 37A-D show an embodiment in which the concentration gradient initially established by partial diffusion equilibrium of two solutions from a micro-freedomized gastric surface can be maintained by actuation of a containment valve.

図３７Ａは、別個に作動される界面バルブ１０００４のいずれかの側面に配置される複数のチャンバ（Ａ〜Ｇ）を規定するために、フォーク状制御チャネル１０００２によって間隔を空けて重なり合うフローチャネル１００００を示す。図３７Ｂは、界面バルブ１０００４が作動され、フローチャネルの最初の半分１００００ａが第２の溶液と混合され、そのフローチャネルの第２の半分１００００ｂに第２の溶液が入れられた場合の初期時間における溶媒濃度をプロットする。図３７Ｃは、制御チャネル１０００２が、その特定の時点での濃度勾配を捕捉するその７つのチャンバ（Ａ〜Ｇ）を規定するように作動される場合、その後の時間Ｔ_１での溶媒濃度をプロットする。図３７Ｄは、時間Ｔ_１でのでのチャンバ（Ａ〜Ｇ）の相対濃度をプロットする。 FIG. 37A shows flow channels 10000 that are spaced apart by a forked control channel 10002 to define a plurality of chambers (AG) that are located on either side of the separately actuated interface valve 10004. Show. FIG. 37B shows the initial time when the interface valve 10004 is activated, the first half 10000a of the flow channel is mixed with the second solution, and the second solution is placed in the second half 10000b of the flow channel. Plot the solvent concentration. FIG. 37C plots the solvent concentration at the subsequent time T ₁ when the control channel 10002 is activated to define its seven chambers (AG) that capture the concentration gradient at that particular time. To do. Figure 37D plots the relative concentration of the chamber (A-G) at the time _{T 1.}

図３７Ａに示される実施形態において、フォーク状制御チャネルの作動は、その複数のチャンバＡ〜Ｇを同時に作り出す。しかし、これは必須ではなく、本発明の代替的実施形態において、複数の制御チャネルは、異なる時間間隔でチャンバＡ〜Ｇを独立して作り出し、それによって、最初のチャンバセットがフリー界面にすぐ隣接してつく理恵出された後にさらなる拡散を起こすことを可能にするように利用され得る。 In the embodiment shown in FIG. 37A, actuation of the forked control channel creates its multiple chambers AG at the same time. However, this is not essential, and in an alternative embodiment of the invention, multiple control channels independently create chambers AG at different time intervals so that the first chamber set is immediately adjacent to the free interface. It can then be used to allow further diffusion after being reasoned.

２つの流体間の濃度勾配を捕捉する方法の一実施形態は、ミクロ流体チャネル内に存在するエラストマー膜の第１の側面に第１の流体を提供すること、およびそのエラストマー膜の第２の側面に第２の流体を提供することを包含する。そのエラストマー膜は、その第１の流体と第２の流体との間のミクロ流体フリー界面を規定するために、ミクロ流体チャネルから置き換えられる。その第１の流体およびその第２の流体は、ミクロ流体フリー界面を横断して拡散するようにされる。そのミクロ流体フリー界面からの増大する距離において流動チャネルに沿って配置されるエラストマーバルブの群は、その第１の流体および第２の流体の相対濃度が、ミクロ流体フリー界面を横断して拡散する時間を反映するチャンバの連続を規定するように作動される。 One embodiment of a method for capturing a concentration gradient between two fluids provides a first fluid to a first side of an elastomeric membrane present in a microfluidic channel, and a second side of the elastomeric membrane Providing a second fluid. The elastomeric membrane is replaced from the microfluidic channel to define a microfluidic free interface between the first fluid and the second fluid. The first fluid and the second fluid are allowed to diffuse across the microfluidic free interface. A group of elastomeric valves disposed along the flow channel at increasing distances from the microfluidic free interface allows the relative concentrations of the first and second fluids to diffuse across the microfluidic free interface. Operated to define a chamber sequence reflecting time.

（５．標的物質）
結晶化のための標的は多様である。結晶化のための標的は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）成体高分子（サイトゾルタンパク質、細胞外タンパク質、膜タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの複雑な組み合わせ）、２）翻訳前に修飾された生体分子および翻訳後に修飾された生体分子（リン酸化、スルホン化、グルコシル化、ユビキチン化などのタンパク質、およびハロゲン化、脱塩基化（ａｂａｓｉｃ）、アルキル化などの核酸、が挙げられるが、これらに限定されない）；３）意図的に誘導した高分子（例えば、重原子で標識したＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質（およびそれらの複合体）、セレノメチオニンで標識したタンパク質および核酸（およびそれらの複合体）、ハロゲン化したＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質（およびそれらの複合体）、４）ウイルス全体または巨大な細胞粒子（例えば、リボソーム、レプリソーム、スプライセオソーム、チューブリンフィラメント、アクチンフィラメント、染色体など）、５）低分子化合物（例えば、薬物、リード化合物、リガンド、塩および有機化合物または金属有機化合物、ならびに６）低分子／生体高分子複合体（例えば、薬物／タンパク質複合体、酵素／基質複合体、酵素／産物複合体、酵素／レギュレーター複合体、酵素／インヒビター複合体およびそれらの組み合わせ）。このような標的は、生物学、生化学、物質科学、薬学、化学および物理学を含む広範な科学分野について研究の目標である。 (5. Target substance)
The targets for crystallization are diverse. Targets for crystallization include, but are not limited to: 1) adult macromolecules (cytosolic proteins, extracellular proteins, membrane proteins, DNA, RNA and complex combinations thereof), 2) translation Pre-modified and post-translationally modified biomolecules (proteins such as phosphorylation, sulfonation, glucosylation, ubiquitination, and nucleic acids such as halogenation, abasic, alkylation, etc.) 3) Intentionally derived macromolecules (eg, heavy atom labeled DNA, RNA and proteins (and their complexes), selenomethionine labeled proteins and nucleic acids (and their) Complex), halogenated DNA, RNA and protein (and their complexes) 4) Whole virus or large cell particles (eg ribosome, replisome, spliceosome, tubulin filament, actin filament, chromosome, etc.) 5) small molecule compounds (eg drugs, lead compounds, ligands, salts and organic compounds) Or metal organic compounds, and 6) small molecule / biopolymer complexes (eg, drug / protein complexes, enzyme / substrate complexes, enzyme / product complexes, enzyme / regulator complexes, enzyme / inhibitor complexes and the like) Combination). Such targets are the goal of research in a wide range of scientific fields including biology, biochemistry, material science, pharmacy, chemistry and physics.

可能なタンパク質修飾の非排他的な列挙は、以下の通りである：５’脱リン酸；デスモシン（リジンから）；分解されたカルボキシメチル化メチオニン；オルニチン（アルギニンから）；リシノアラニン（システインから）；ランチオニン（システインから）；デヒドロアラニン（システインから）；ＣＮＢｒ処理によってＭｅｔから形成されたホモセリン；脱水（−Ｈ２Ｏ）；Ｓ−γ−グルタミル（システインに架橋）；Ｏ−γ−グルタミル−（セリンに架橋）；セリンからデヒドロアラニン；アラニノヒスチジン（ヒスチジンのθ炭素またはπ炭素に架橋したセリン）；Ｇｌｎから形成されたピログルタミン酸；Ｎ−ピロリドンカルボニル（Ｎ末端）；Ｎα−（γ−グルタミル）−リジン；Ｎ−（β−アスパルチル）−リジン（架橋）；３，３’，５，５’−ＴｅｒＴｙｒ（架橋）；ジスルフィド結合形成（シスチン）；Ｓ−（２−ヒスチジル）−（システインに架橋）；Ｓ−（３−Ｔｙｒ）（システインに架橋）；３，３’−ＢｉＴｙｒ（架橋）；イソジＴｙｒ（架橋）；アリシン（リジンから）；アミド形成（Ｃ末端）；アスパラギンおよびグルタミンの、アスパラギン酸およびグルタミン酸への脱アミド化；シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）（アルギニンから）；シンデシン（ｓｙｎｄｅｓｉｎｅ）（リジンから）；メチル化（Ｎ末端、リジンのＮε、セリンのＯ、スレオニンまたはＣ末端、アスパラギンのＮ）；δ−ヒドロキシ−アリシン（リジンから）；ヒドロキシル化（リジンのδＣ、トリプトファンのβＣ、プロリンのＣ３またはＣ４、アスパラギン酸のβＣ）；メチオニンの酸化（スルホキシドに）；スルフェン酸（システインから）；ピルボイル−（セリン）；３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン（チロシンから）（ＤＯＰＡ）；ナトリウム；エチル；Ｎ，Ｎジメチル化（アルギニンまたはリジン）；２，４−ビスＴｒｐ−６，７−ジオン（トリプトファンから）；ホルミル化（ＣＨＯ）；６，７ジオン（トリプトファンから）；３，４，６−トリヒドロキシ−フェニルアラニン（チロシンから）（ＴＯＰＡ）；３，４−ジヒドロキシル化（プロリン）；メチオニンの酸化（スルホンに）；３−塩素化（３５Ｃｌを用いてチロシン）；３−塩素化（３７Ｃｌを用いてチロシン）；カリウム；カルバミル化；アセチル化（Ｎ末端、リジンのＮε、セリンのＯ）（Ａｃ）；Ｎ−トリメチル化（リジン）；グルタミン酸のγカルボキシル化またはアスパラギン酸のβカルボキシル化；二ナトリウム；ニトロ（ＮＯ２）；ｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）およびｔ−ブチル（ｔＢｕ）；グリシル（−Ｇ−、−Ｇｌｙ−）；カルボキシメチル（システイン上）；ナトリウム＋カリウム；セレノシステイン（セリンから）；３，５−ジクロロ化（３５Ｃｌを用いてチロシン）；デヒドロアラニン（Ｄｈａ）；３，５−ジクロロ化（３５Ｃｌと３７Ｃｌとの混合物を用いてチロシン）；ピルビン酸；アクリルアミジルまたはアクリルアミド付加体；サルコシル；アラニル（−Ａ−、−Ａｌａ−）；アセトアミドメチル（Ａｃｍ）；３，５−ジクロロ化（３７Ｃｌを用いてチロシン）；Ｓ−ｓｎ−１−グリセリル）（システイン上）；グリセロールエステル（グルタミン酸側鎖上）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；βメルカプトエタノール付加体；フェニルエステル（ＯＰｈ）（酸性）；３−ブロモ化（７９Ｂｒを用いてチロシン）；リン酸化（セリン、スレオニン、チロシンおよびアスパラギン酸のＯ、リジンのＮε）；３−ブロモ化（８１Ｂｒを用いてチロシン）；スルホン化（ＳＯ３Ｈ）（ＰＭＣ基）；硫酸化（チロシンのＯ）；シクロヘキシルエステル（ＯｃＨｅｘ）；ホモセリルラクトン；デヒドロアミノ酪酸（Ｄｈｂ）；γアミノブチリル；２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）；２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ジアミノプロピオニル；ｔ−ブチルオキシメチル（Ｂｕｍ）；Ｎ−（４−ＮＨ２−２−ＯＨ−ブチル）−（リジン）（ハイプシン）；セリル（−Ｓ−、−Ｓｅｒ−）；ｔ−ブチルスルフェニル（ＳｔＢｕ）；アラニン（Ａ、Ａｌａ）；サルコシン（Ｓａｒ）；アニシル；ベンジル（Ｂｚｌ）およびベンジルエステル（ＯＢｚｌ）；１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）；デヒドロプロリル；トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＮＳｕ、ＯＳｕ）；プロリル（−Ｐ−、−Ｐｒｏ−）；バリル（−Ｖ−、−Ｖａｌ−）；イソバリル（−Ｉ−、−Ｉｖａ−）；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）；スレオイル（−Ｔ−、−Ｔｈｒ−）；ホモセリル（−Ｈｓｅ−）；シスチル（−Ｃ−、−Ｃｙｓ−）；ベンゾイル（Ｂｚ）；４−メチルベンジル（Ｍｅｂ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；ＨＭＰ（ヒドロキシメチルフェニル）リンカー；チオアニシル；チオクレシル；ジフタミド（ｄｉｐｈｔｈａｍｉｄｅ）（ヒスチジンから）；ピログルタミル；２−ピペリジンカルボン酸（Ｐｉｐ）；ヒドロキシプロリル（−Ｈｙｐ−）；ノルロイシル（−Ｎｌｅ−）；イソロイシル（−Ｉ−、−Ｉｌｅ−）；ロイシル（−Ｌ−、−Ｌｅｕ−）；オルニチル（−Ｏｒｎ−）；アスパラギル（−Ｎ−、−Ａｓｎ−）；ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；アスパルチル（−Ｄ−、−Ａｓｐ−）；スクシニル；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）；ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（ＨＯＢｔ）；ジメチルベンジル（ｄｉＭｅＢｚｌ）；トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；システイニル化；ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）；ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ、Ｍｂｚｌ）；４−ニトロフェニル、ｐ−ニトロフェニル（ＯＮｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；クロロベンジル（ＣｌＢｚｌ）；ヨウ素化（ヒスチジン［Ｃ４］またはチロシン［Ｃ３］）；グルタミル（−Ｑ−、−Ｇｌｎ−）；Ｎ−メチルリジル；リジル（−Ｋ−、−Ｌｙｓ−）；Ｏ−メチルアスパルタミル；グルタミル（−Ｅ−、−Ｇｌｕ−）；Ｎα−（γ−グルタミル）−Ｇｌｕ；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ヒドロキシアスパルタミル；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）；ｂｂ−ジメチルシステニル；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；メチオニル（−Ｍ−、−Ｍｅｔ−）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；ペントース（Ａｒａ、Ｒｉｂ、Ｘｙｌ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；Ｄｍｏｂ（ジメトキシベンジル）；ベンジル
オキシカルボニル（Ｚ）；アダマンチル（Ａｄａ）；ｐ−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）；ヒスチジル（−Ｈ−、−Ｈｉｓ−）；Ｎ−メチルグルタミル；Ｏ−メチルグルタミル；ヒドロキシリジル（−Ｈｙｌ−）；メチルメチオニル；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；アミノエチルシステニル；ペントシル；デオキシヘキソース（Ｆｕｃ、Ｒｈａ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；アミノエチルシステニル（−ＡＥＣｙｓ−）；４−グリコシルオキシ−（ペントシル、Ｃ５）（プロリン）；メチオニルスルホキシド；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；フェニルアラニル−（−Ｆ−、−Ｐｈｅ−）；ピリジルアラニル；フルオロフェニルアラニル；２−ニトロベンゾイル（ＮＢｚ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；３−メチルヒスチジル；２−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）；４−トルエンスルホニル（トシル、Ｔｏｓ）；３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；３，５−ジブロモ化（７９Ｂｒを用いてチロシン）；アルギニル（−Ｒ−、−Ａｒｇ−）；シトルリン；３，５−ジブロモ化（７９Ｂｒおよび８１Ｂｒの混合物を用いてチロシン）；ジクロロベンジル（Ｄｃｂ）；３，５−ジブロモ化（８１Ｂｒを用いてチロシン）；カルボキシアミドメチルシステニル；カルボキシメチルシステニル；メチルフェニルアラニル；ヘキソースアミン（ＧａｌＮ、ＧｌｃＮ）；カルボキシメチルシステイン（Ｃｍｃ）；Ｎ−グルコシル（リジンのＮ末端またはＮε）（アミノケトース）；Ｏ−グリコシル−（セリンまたはスレオニン）；ヘキソース（Ｆｒｕ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、Ｍａｎ）；イノシトール；メチオニルスルホン；チロシニル（−Ｙ−、−Ｔｙｒ−）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；２，４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）；ペンタフルオロフェニル（Ｐｆｐ）；ジフェニルメチル（Ｄｐｍ）；ホスホセリル；２−クロロベンジルオキシカルボニル（ＣＩＺ）；ナフチルアセチル（ｎａｐｔｈｙｌａｃｅｔｙｌ）；イソプロピルリジル；Ｎ−メチルアルギニル、エタンジチオール（ｅｔｈａｎｅｄｉｔｏｈｉｏｌ）／ＴＦＡ環式付加体；カルボキシグルタミル（Ｇｌａ）；アセトアミドメチルシステニル；アクリルアミジルシステニル；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；Ｎ−グルクロニル（Ｎ末端）；デルタ−グリコシルオキシ−（リジン）またはβ−グリコシルオキシ−（フェニルアラニンおよびチロシン）；４−グリコシルオキシ−（ヘキソシル、Ｃ６）（プロリン）；ベンジルセリル；Ｎ−メチルチロシニル；ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（４Ｎｚ）；２，４，５−トリクロロフェニル；２，４，６−トリメチルオキシベンジル（Ｔｍｏｂ）；キサンチル（Ｘａｎ）；ホスホスレオニル；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；クロロフェニルアラニル；メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）；カルボキシメチルリジル；トリプトファニル（−Ｗ−、−Ｔｒｐ−）；Ｎ−リポイル−（リジン上）；マトリックスαシアノＭＨ＋；ベンジルスレオニル；ベンジルシステニル；ナフチルアラニル；スクシニルアスパルタミル；スクシンイミドフェニルカルボ・・・；ＨＭＰ（ヒドロキシメチルフェニル）／ＴＦＡ付加体；Ｎ−アセチルヘキソースアミン（ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；シスチン（（Ｃｙｓ）２）；ファルネシル化；Ｓ−ファルネシル−；ミリストレイル化（１つの二重結合を有するミリストイル）；ピリジルエチルシステニル；ミリストイル化；４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）；２−ブロモベンジルオキシカルボニル（ＢｒＺ）；ホルミルトリプトファニル；ベンジルグルタミル；アニソール付加グルタミル；Ｓ−システニルシステニル；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）；リポ酸（リジンへのアミド結合）；ビオチニル化（リジンへのアミド結合）；ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）；Ｎ−ピリドキシル（リジン上）；ピリドキサルリン酸（リジンから形成されるシッフ塩基）；ニコチニルリジル；ダンシル（Ｄｎｓ）；２−（ｐ−ビフェニル）イソプロピル−オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）；パルミトイル化；「トリフェニルメチル（トリチル、Ｔｒｔ）」；チロシニルスルフェート；ホスホチロシニル；Ｐｂｆ（ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニル）；３，５−ジヨード化（チロシン）；「３，５−ジ−Ｉ」；Ｎα−（γ−グルタミル）−Ｇｌｕ２；Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ−１−ホスホリル化（セリン）；「２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）」；ステアロイル化；ゲラニルゲラニル化；Ｓ−ゲラニルゲラニル；５’ｐｈｏｓｄシチジニル；ヨードチロシニル；アルドヘキソシルリジル；シアリル；Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸、ＮｅｕＡｃ、ＮＡＮＡ、ＳＡ）；５’ｐｈｏｓｄチミジニル；５’ｐｈｏｓシチジニル；グルタチオン化；Ｏ−ウリジニル化（チロシン）；５’ｐｈｏｓウリジニル；Ｓ−ファルネシルシステニル；Ｎ−グリコールノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ）；５’ｐｈｏｓｄアデノシル；Ｏ−パンテテインリン酸化（セリン）；ＳｕｃＰｈｅｎｃａｒｂリジル；５’ｐｈｏｓｄグアノシル；５’ｐｈｏｓアデノシニル；Ｏ−５’−アデノシル化（チロシン）；４’−ホスホパンテテイン；ＧＬ２；Ｓ−パルミチルシステニル；５’ｐｈｏｓグアノシル；ビオチニルリジル；Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ；Ｎα−（γ−グルタミル）−Ｇｌｕ３；ジオクチルフタレート；ＰＭＣリジル；アエダンス（Ａｅｄａｎｓ）システニル；ジオクチルフタレートナトリウム付加体；ジヨードチロシニル；ＰＭＣアルギニル；Ｓ−補酵素Ａ；ＡＭＰリジル；３，５，３’−トリヨードサイロニン；（チロシンから）；Ｓ−（ｓｎ−１−ジパルミトイル−グリセリル）−（システイン上）；Ｓ−（ＡＤＰ−リボシル）−（システイン上）；Ｎ−（ＡＤＰ−リボシル）−（アルギニン上）；Ｏ

−ＡＤＰ−リボシル化（グルタミン酸またはＣ末端上）；ＡＤＰ−リボシル化（ＮＡＤから）；Ｓ−フィコシアノビリン（システイン上）；Ｓ−ヘム（システイン上）；Ｎθ−（ＡＤＰ−リボシル）ジフタミド（ヒスチジン）；ＮｅｕＡｃ−Ｈｅｘ−ＨｅｘＮＡｃ；ＭＧＤＧ；Ｏ−８α−フラビン（［ＦＡＤ］）−（チロシン）；Ｓ−（６−フラビン［ＦＡＤ］）−（システイン上）；ＮθおよびＮπ−（８α−フラビン）（ヒスチジン上）；（Ｈｅｘ）３−ＨｅｘＮＡｃ−ＨｅｘＮＡｃ；（Ｈｅｘ）３−ＨｅｘＮＡｃ−（ｄＨｅｘ）ＨｅｘＮＡｃ。 A non-exclusive list of possible protein modifications is as follows: 5 'dephosphorylation; desmosine (from lysine); degraded carboxymethylated methionine; ornithine (from arginine); ricinoalanine (from cysteine); Lanthionine (from cysteine); dehydroalanine (from cysteine); homoserine formed from Met by CNBr treatment; dehydration (-H2O); S-γ-glutamyl (cross-linked to cysteine); O-γ-glutamyl- (cross-linked to serine) ); Serine to dehydroalanine; alaninohistidine (serine crosslinked to the θ or π carbon of histidine); pyroglutamic acid formed from Gln; N-pyrrolidonecarbonyl (N-terminal); Nα- (γ-glutamyl) -lysine N- (β-aspartyl) -lysine (crosslinked); 3,3 ′ , 5,5′-TerTyr (crosslinking); disulfide bond formation (cystine); S- (2-histidyl)-(crosslinking to cysteine); S- (3-Tyr) (crosslinking to cysteine); BiTyr (cross-linked); isodi-Tyr (cross-linked); allicin (from lysine); amide formation (C-terminal); deamidation of asparagine and glutamine to aspartic acid and glutamic acid; citrulline (from arginine); syndesine (from lysine); methylation (N-terminal, lysine Nε, serine O, threonine or C-terminal, asparagine N); δ-hydroxy-allysine (from lysine); hydroxylation (lysine δC, tryptophan βC, proline C3 or C4, aspartic acid βC); methioni Oxidation (to sulfoxide); sulfenic acid (from cysteine); pyrvoyl- (serine); 3,4-dihydroxy-phenylalanine (from tyrosine) (DOPA); sodium; ethyl; N, N dimethylation (arginine or lysine); 2,4-bis Trp-6,7-dione (from tryptophan); formylation (CHO); 6,7 dione (from tryptophan); 3,4,6-trihydroxy-phenylalanine (from tyrosine) (TOPA); 3,4-dihydroxylation (proline); oxidation of methionine (to sulfone); 3-chlorination (tyrosine using 35Cl); 3-chlorination (tyrosine using 37Cl); potassium; carbamylation; acetylation (N-terminal, Nε of lysine, O of serine) (Ac); N-trimethylation (lysine); Gamma carboxylation of tamic acid or beta carboxylation of aspartic acid; disodium; nitro (NO2); t-butyl ester (OtBu) and t-butyl (tBu); glycyl (-G-, -Gly-); carboxymethyl (On cysteine); sodium + potassium; selenocysteine (from serine); 3,5-dichloroation (tyrosine using 35Cl); dehydroalanine (Dha); 3,5-dichlorolation (mixture of 35Cl and 37Cl) Pyruvate; acrylamidyl or acrylamide adducts; sarcosyl; alanyl (-A-, -Ala-); acetamidomethyl (Acm); 3,5-dichloroation (tyrosine using 37Cl); S -Sn-1-glyceryl) (on cysteine); glycerol ester (glu Glycine (G, Gly); β-mercaptoethanol adduct; phenyl ester (OPh) (acidic); 3-brominated (79 Br using tyrosine); phosphorylation (serine, threonine, tyrosine and Aspartic acid O, Lysine Nε); 3-Brominated (tyrosine with 81Br); Sulfonated (SO3H) (PMC group); Sulfated (tyrosine O); Cyclohexyl ester (OcHex); Homoceryl lactone; Dehydroaminobutyric acid (Dhb); γ-aminobutyryl; 2-aminobutyric acid (Abu); 2-aminoisobutyric acid (Aib); diaminopropionyl; t-butyloxymethyl (Bum); N- (4-NH2-2-OH-butyl )-(Lysine) (hypusine); seryl (-S-, -Ser-); t-butylsulfenyl ( tBu); alanine (A, Ala); sarcosine (Sar); anisyl; benzyl (Bzl) and benzyl ester (OBzl); 1,2-ethanedithiol (EDT); dehydroprolyl; trifluoroacetyl (TFA); -Hydroxysuccinimide (ONSu, OSu); prolyl (-P-, -Pro-); valyl (-V-, -Val-); isovalyl (-I-, -Iva-); t-butyloxycarbonyl (tBoc) Thread oil (-T-, -Thr-); homoceryl (-Hse-); cystyl (-C-, -Cys-); benzoyl (Bz); 4-methylbenzyl (Meb); serine (S, Ser); HMP (hydroxymethylphenyl) linker; thioanisyl; thiocresyl; diphthamide From histidine); pyroglutamyl; 2-piperidinecarboxylic acid (Pip); hydroxyprolyl (-Hyp-); norleusyl (-Nle-); isoleucyl (-I-, -Ile-); leucyl (-L-,- Leu-); ornithyl (-Orn-); asparagyl (-N-, -Asn-); t-amyloxycarbonyl (Aoc); proline (P, Pro); aspartyl (-D-, -Asp-); Succinyl; valine (V, Val); hydroxybenzotriazole ester (HOBt); dimethylbenzyl (diMeBzl); threonine (T, Thr); cysteinylation; benzyloxymethyl (Bom); p-methoxybenzyl (Mob, Mbzl); 4-nitrophenyl, p-nitrophenyl (ONp); cysteine (C, Cy chloro) (ClBzl); iodination (histidine [C4] or tyrosine [C3]); glutamyl (-Q-, -Gln-); N-methyl lysyl; lysyl (-K-, -Lys-); -Methyl aspartamyl; glutamyl (-E-, -Glu-); Nα- (γ-glutamyl) -Glu; norleucine (Nle); hydroxyaspartamyl; hydroxyproline (Hyp); bb-dimethylcystenyl; isoleucine (I Leucine (L, Leu); methionyl (-M-, -Met-); asparagine (N, Asn); pentose (Ara, Rib, Xyl); aspartic acid (D, Asp); Dmob (dimethoxybenzyl) ); Benzyloxycarbonyl (Z); adamantyl (Ada); p-nitrobenzyl ester (ONb); histidyl (-H-, -His-); N-methylglutamyl; O-methylglutamyl; hydroxylysyl (-Hyl-); methylmethionyl; glutamine (Q, Gln); aminoethylcystenyl; Deoxyhexose (Fuc, Rha); lysine (K, Lys); aminoethylcystenyl (-AECys-); 4-glycosyloxy- (pentosyl, C5) (proline); methionyl sulfoxide; glutamic acid (E, Glu); Phenylalanyl-(-F-, -Phe-); pyridylalanyl; fluorophenylalanyl; 2-nitrobenzoyl (NBz); methionine (M, Met); 3-methylhistidyl; 2-nitrophenylsulfenyl ( Nps); 4-toluenesulfonyl (tosyl, Tos); 3- Tro-2-pyridinesulfenyl (Npys); histidine (H, His); 3,5-dibrominated (tyrosine using 79Br); arginyl (-R-, -Arg-); citrulline; 3,5-dibromo (Tyrosine using a mixture of 79Br and 81Br); dichlorobenzyl (Dcb); 3,5-dibrominated (tyrosine using 81Br); carboxyamidomethylcystenyl; carboxymethylcystenyl; methylphenylalanyl; hexose Amine (GalN, GlcN); Carboxymethylcysteine (Cmc); N-Glucosyl (N-terminal or Nε of lysine) (aminoketose); O-glycosyl- (serine or threonine); Hexose (Fru, Gal, Glc, Man) Inositol; methionyl sulfone; tyros Nyl (-Y-, -Tyr-); phenylalanine (F, Phe); 2,4-dinitrophenyl (Dnp); pentafluorophenyl (Pfp); diphenylmethyl (Dpm); phosphoseryl; 2-chlorobenzyloxycarbonyl ( CIZ); naphthyl acetyl; isopropyl lysyl; N-methyl arginyl, ethanedithiol / TFA cycloadduct; carboxyglutamyl (Gla); acetamidomethyl cystenyl; acrylamidyl cystenyl; arginine (CIZ); R, Arg); N-glucuronyl (N-terminal); delta-glycosyloxy- (lysine) or β-glycosyloxy- (phenylalanine and tyrosine); 4-glycosyloxy- (hexosyl, C6) Phosphorus); benzyl seryl; N-methyltyrosinyl; p-nitrobenzyloxycarbonyl (4Nz); 2,4,5-trichlorophenyl; 2,4,6-trimethyloxybenzyl (Tmob); xanthyl (Xan); phosphothreonyl; (Y, Tyr); chlorophenylalanyl; mesitylene-2-sulfonyl (Mts); carboxymethyl lysyl; tryptophanyl (-W-, -Trp-); N-lipoyl- (on lysine); matrix α cyano MH +; Onyl; benzylcystenyl; naphthylalanyl; succinyl aspartamyl; succinimide phenylcarbo ...; HMP (hydroxymethylphenyl) / TFA adduct; N-acetylhexoseamine (GalNAc, GlcNAc); tryptophan ( W, Trp); cystine ((Cys) 2); farnesylation; S-farnesyl-; myristoylation (myristoyl with one double bond); pyridylethylcystenyl; myristoylation; 4-methoxy-2,3 2,6-trimethylbenzenesulfonyl (Mtr); 2-bromobenzyloxycarbonyl (BrZ); formyltryptophanyl; benzylglutamyl; anisole-added glutamyl; S-cystenylcysteinyl; 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Lipoic acid (amide bond to lysine); biotinylation (amide bond to lysine); dimethoxybenzhydryl (Mbh); N-pyridoxyl (on lysine); pyridoxal phosphate (Schiff base formed from lysine); nicotinyl lysyl ; Dansil (Dns); 2 (P-biphenyl) isopropyl-oxycarbonyl (Bpoc); palmitoylation; “triphenylmethyl (trityl, Trt)”; tyrosinyl sulfate; phosphotyrosinyl; Pbf (pentamethyldihydrobenzofuransulfonyl); 3,5-diiodination ( Tyrosine); “3,5-di-I”; Nα- (γ-glutamyl) -Glu2; O-GlcNAc-1-phosphorylated (serine); “2,2,5,7,8-pentamethylchroman- 6-sulfonyl (Pmc) ";stearoylation;geranylgeranylation;S-geranylgeranyl;5'phos d cytidinyl; iodotyrosinyl; aldohexosylridyl; sialyl; N-acetylneuraminic acid (sialic acid, NeuAc, NANA, SA) 5 'phos d thimidinyl; 5' phos citi Glutathione; O-uridinylation (tyrosine); 5'phos uridinyl; S-farnesyl cysteinyl; N-glycol neuraminic acid (NeuGc); 5 'phos d adenosyl; O-pantethein phosphorylation (serine); SucPhencarb lysyl; 5 'phos d guanosyl; 5' phos adenosinyl; O-5'-adenosylated (tyrosine); 4'-phosphopantethein;GL2; S-palmityl cystenyl; 5 'phos guanosyl; -HexNAc; Nα- (γ-glutamyl) -Glu3; dioctyl phthalate; PMC lysyl; Aedans cystenyl; dioctyl phthalate sodium adduct; diiodotyrosinyl; PMC arginyl; S-coenzyme A; AMP lysyl; 5,3 'Triiodothyronine; (from tyrosine); S- (sn-1-dipalmitoyl-glyceryl)-(on cysteine); S- (ADP-ribosyl)-(on cysteine); N- (ADP-ribosyl)-( On arginine); O

ADP-ribosylation (on glutamic acid or C-terminus); ADP-ribosylation (from NAD); S-phycocyanobilin (on cysteine); S-heme (on cysteine); Nθ- (ADP-ribosyl) diphtamide (histidine) ); NeuAc-Hex-HexNAc; MGDG; O-8α-flavin ([FAD])-(tyrosine); S- (6-flavin [FAD])-(on cysteine); Nθ and Nπ- (8α-flavin) (On histidine); (Hex) 3-HexNAc-HexNAc; (Hex) 3-HexNAc- (dHex) HexNAc.

可能な核酸改変（例えば、塩基特異的改変、糖特異的改変、またはリン特異的改変）の非排他的な一覧は、以下の通りである：ハロゲン化（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）：無塩基部位；アルキル化；架橋可能な付加物（例えば、チオールまたはアジド）；チオール化；脱アミド；蛍光基標識、およびグリコシル化。 A non-exclusive list of possible nucleic acid modifications (eg, base specific modifications, sugar specific modifications, or phosphorus specific modifications) is as follows: Halogenation (F, Cl, Br, I): None Alkylation; crosslinkable adducts (eg, thiols or azides); thiolation; deamidation; fluorescent group labeling and glycosylation.

可能な重原子誘導体化剤の非排他的な一覧は、以下の通りである：ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＩＩ）カリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＶ）ナトリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＩＩ）ナトリウム；ヘキサニトリトイリジウム酸（ＩＩＩ）カリウム；ヘキサクロロイリジウム酸（ＩＩＩ）アンモニウム；塩化イリジウム（ＩＩＩ）；ヘキサニトラトイリジウム酸（ＩＩＩ）カリウム；臭化イリジウム（ＩＩＩ）；塩化バリウム（ＩＩ）；酢酸バリウム（ＩＩ）；硝酸カドミウム（ＩＩ）；ヨウ化カドミウム（ＩＩ）；硝酸鉛（ＩＩ）；酢酸鉛（ＩＩ）；塩化トリメチル鉛（ＩＶ）；酢酸トリメチル鉛（ＩＶ）；ヘキサクロロ鉛酸（ＩＶ）アンモニウム；塩化鉛（ＩＩ）；ヘキサクロロロジウム酸（ＩＩＩ）ナトリウム；酢酸ストロンチウム（ＩＩ）；チオマロナト金酸（Ｉ）二ナトリウム；ジシアノ金酸（Ｉ）カリウム；ジシアノ金酸（Ｉ）ナトリウム；チオスルファト金酸（ＩＩＩ）ナトリウム；テトラシアノ金酸（ＩＩＩ）カリウム；テトラクロロ金酸（ＩＩＩ）カリウム；テトラクロロ金酸（ＩＩＩ）水素；テトラクロロ金酸（ＩＩＩ）ナトリウム；テトラヨード金酸（ＩＩＩ）カリウム；テトラブロモ金酸（ＩＩＩ）カリウム；（アセタト−ｏ）メチル水銀；メチル（ニトラト−ｏ）水銀；クロロメチル水銀；ヨードメチル水銀；クロロエチル水銀；メチル水銀カチオン；トリエチル（ｍ３−ホスファト（３−）−Ｏ，Ｏ’，Ｏ’’）トリ水銀ｅｔｈ；［３［（アミノカルボニル）アミノ］−２−メトキシプロピル］クロム；１，４ジアセトキシ水銀２−３ジメトキシブタン；メトキシル（ｍｅｒｏｘｙｌ）マーキュヒドリン；テトラキス（アセトキシ水銀）−メタン；１，４ビス（クロロ水銀）−２，３−ブタンジオール；ジアセトキシ水銀クロロ酢酸エチル（ｄａｍｅ）；酸化水銀（ＩＩ）；メチル水銀−２−メルカプトエタノール；３，６ビス（水銀メチルジオキサン酢酸）；エチル水銀カチオン；Ｂｉｌｌｍａｎ’ｓｄｉｍｅｒｃｕｒｉａｌ；パラクロロ水銀フェニルアセテート（ｐｃｍａ）；水銀フェニルグリオキサル（ｍｐｇ）；Ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ、チオサリチル酸エチル水銀［ｅｍｔｓ］；４−クロロマーキュリベンゼンスルホン酸（４−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）；２，６ジクロロ水銀−４−ニトロフェノール（ｄｃｍｎｐ）；［３−［［２（カルボキシメトキシ）ベンゾイル］アミノ（ｍｉｎｏ）−２メトキシｐｒｏｐ；パラクロロ水銀ベンゾエート（ｐｃｍｂ），４−クロロ水銀；（アセタト−ｏ）フェニル水銀；安息香酸フェニル水銀（ｐｍｂ）；パラヒドロキシ水銀ベンゾエート（ｐｈｍｂ）；イミドコハク酸水銀／水銀スクシンイミド；３−ヒドロキシ水銀ベンズアルデヒド；２−アセトキシ水銀スルファニルアミド（ｓｕｌｈｐａｎｉｌａｍｉｄｅ）；３−アセトキシ水銀−４アミノベンゼンスルホンアミド；メチル水銀チオグリコール酸（ｔｈｉｏｃｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）（ｍｍｔｇａ）；２−ヒドロキシ水銀−トルエン−４−スルホン酸（ｈｍｔｓ）；アセトアミノフェニル水銀アセテート（ａｐｍａ）；［３−［（アミノカルボニル）アミノ］−３−メトキシプロピル２−クロロ；パラ−ヒドロキシ水銀ベンゼンスルホネート（ｐｈｍｂｓ）；オルト−クロロ水銀フェノール（ｏｃｍｐ）；ジアセトキシ水銀ジプロピレンジオキシド（ｄｍｄｘ）；パラ−アセトキシ水銀アニリン（ｐａｍａ）；（４−アミノフェニル）クロロ水銀；アニリン水銀カチオン；３−ヒドロキシ−水銀−ｓスルホサリチル酸（ｍｓｓｓ）；３または５ヒドロキシ水銀サリチル酸（ｈｍｓａ）；ジフェニル水銀；２，６ジアセトキシ水銀メチル１−４チオキサン（ｄｍｍｔ）；２，５−ビス（ｂｌｓ）（クロロ水銀）フラン；オルトクロロ水銀ニトロフェノール（ｏｃｍｎｐ）；５−水銀デオキシウリジンモノ硫酸；サリチル酸水銀；［３−［［２−（カルボキシメトキシ）ベンゾイル］アミノ−２−メトキシｐｒｏ；３，３ビス（ヒドロキシ水銀）−３−ニトラト水銀ピルビン酸（ｐｙｒｕｖｉｃ）；３−クロロ水銀ピリジン；３，５ビスアセトキシ水銀メチルモルホリン；オルト−水銀フェノールカチオン；パラ−カルボキシメチルメルカプト水銀ベンゼンスルホニル；パラ−水銀ベンゾイルグルコサミン；３アセトオシ水銀（ａｃｅｔｅｔｏｘｙｍｅｒｃｕｒｉ）−５−ニトロサリチルアルデヒド（ｍｓａ）；テトラクロロ水銀（ＩＩ）アンモニウム；テトラチオシアナト水銀（ＩＩ）カリウム；テトラチオシアナト水銀（ＩＩ）ナトリウム；テトライソチオシアナト水銀（ＩＩ）カリウム；テトラヨード（ｔｅｔｒａｉｄｏ）水銀（ＩＩ）カリウム；テトラチオシアナト水銀（ＩＩ）アンモニウム；テトラブロモ水銀（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ水銀（ＩＩ）カリウム；臭化水銀（ＩＩ）；チオシアン酸水銀（ＩＩ）；シアン化水銀（ＩＩ）；ヨウ化水銀（ＩＩ）；塩化水銀（ＩＩ）；酢酸水銀（ＩＩ）；酢酸水銀（Ｉ）；ジクロロジアミノ水銀（ＩＩ）；β水銀−メルカプトエチルアミン塩酸；硫酸水銀（ＩＩ）；水銀（ＩＩ）クロロａｎｉｌａｔｅ；酢酸二水銀；クロロ（２−オキソエチル）水銀；硝酸フェノール水銀；メルカプトエタノール水銀；塩化水銀メルカプトエチルアミン；チオグリコール酸水銀（ナトリウム塩）；ｏ−ヒドロキシ水銀−ｐ−ニトロフェノール／２−ヒドロキシ水銀−４−；パラクロロ水銀フェノール（ｐｃｍｐ）；チオサリチル酸アセチル水銀（ａｍｔｓ）；ヨウ素；ヨウ化カリウム（ヨウ素）；４−ヨードピラゾール；Ｏ−ヨードベンゾイルグルコサミン（Ｏ−ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｙｌｇｌｕｃａｓａｍｉｎｅ）；Ｐ−ヨードベンゾイルグルコサミン（Ｐ−ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｙｌｇｌｕｃａｓａｍｉｎｅ）；ヨウ化カリウム／クロラミンｔ；ヨウ化アンモニウム；３−イソチオシアナト−４−ヨードベンゼンスルホンネート；ヨウ化カリウム；３’−ヨードフェニルトリアジン（３’−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌｔｒａｚｉｎｅ）；４’−ヨードフェニルトリアジン（４’−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌｔｒａｚｉｎｅ）；ヨウ化ナトリウム／ヨウ素；硝酸銀；トリニトリドスルホキシル酸銀（）；Ｔｏｂｅｎａｍｅｄ；塩化サマリウム（ＩＩＩ）；塩化ツリウム（ＩＩＩ）；塩化ルテチウム（ＩＩＩ）；塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）；塩化テルビウム（ＩＩＩ）；塩化ガドリニウム（ＩＩＩ）；塩化エルビウム（ＩＩＩ）；塩化ランタン（ＩＩＩ）；硝酸サマリウム（ＩＩＩ）；酢酸サマリウム（ＩＩＩ）；サマリウム（ＩＩＩ）カチオン；塩化プラセオジミウム（ＩＩＩ）；塩化ネオジミウム（ＩＩＩ）；塩化イッテルビウム（ＩＩＩ）；硫酸ツリウム（ＩＩＩ）；硫酸イッテルビウム（ＩＩＩ）；硫酸ガドリニウム（ＩＩＩ）；酢酸ガドリニウム（ＩＩＩ）；塩化ジスプロシウム（ＩＩＩ）；硝酸エルビウム（ＩＩＩ）；塩化ホルミウム（ＩＩＩ）；塩化ペンタアミノルテニウム（ＩＩＩ）；セシウムニトリドトリオキソ（ｎｉｔｒｉｄｏｔｉｒｏｘｏ）オスミウム（ｖｉｉｉ）；テトラオキソオスミウム酸カリウム；ヨウ化ヘキサアミノオスミウム（ＩＩＩ）；ヘキサクロロオスミウム酸（ＩＶ）アンモニウム；塩化オスミウム（ＩＩＩ）；ヘキサクロロオスミウム酸（ＩＶ）カリウム；トリクロロトリスカルボニルオスミウム酸（？）セシウム；ジニトリドジアミン白金（ＩＩ）；シスジクロロジメチルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｄｏ）白金（ＩＩ）；ジクロロジアンミン白金（ＩＩ）；ジブロモジアンミン白金（ＩＩ）；ジクロロエチレンジアミン白金（ＩＩ）；ジクロロジニトリト白金酸（ＩＩ）カリウム；ジエチレンジアミン（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｅｎｅ）白金（ＩＩ）；ジオキシラト白金酸（ＩＩ）カリウム；ジクロロビス（ピリジン）白金（ＩＩ）；カリウム（トリメチルジベンジルアミン）白金（？）；テトラブロモ白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラクロロ白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラニトリト白金（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ白金酸（ＩＩ）ナトリウム；テトラチオシアナト白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラニトリト白金酸（ＩＩ）アンモニウム；テトライソシアナト白金酸（ＩＩ）カリウム；テトラシアノ白金（ＩＩ）アンモニウム；テトラクロロ白金酸（ＩＩ）アンモニウム；ジニトリトジオキサラト白金酸（ＩＶ）カリウム；ジクロロテトラアミノ（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｅｔｒａａｍｍｉｎｏ）白金（ＩＶ）；ジブロモジニトリトジアンミン白金（ＩＶ）；ヘキサニトリト白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサクロロ白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサブロモ白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサクロロ白金酸（ＩＶ）ナトリウム；ヘキサヨード白金酸（ＩＶ）カリウム；ヘキサチオシアナト白金酸（ＩＶ）カリウム；テトラクロロビス（ピリジン）白金（ＩＶ）；ヘキサクロロ白金酸（ＩＶ）アンモニウム；ジ−μ−ヨードビス（エチレンジアミン）二白金（ＩＩ）ｎ；ヘキサイソチオシアナト白金酸（ＩＶ）カリウム；テトラヨード白金酸（ＩＩ）カリウム；２，２’，２’’ターピリジル白金（ＩＩ）；２ヒドロキシエタンチオレート（２，２’，２’’ターピリジン（ｔｅｒｐｙｅｉｄｉｎｅ））ｐｌａ；テトラニトロ白金酸（ＩＩ）カリウム；硝酸トリメチル白金（ＩＩ）；テトラオキソレニウム酸（ＶＩＩ）ナトリウム；テトラオキソレニウム酸（ＶＩ）カリウム；テトラオキソレニウム酸（ＶＩＩ）カリウム；ヘキサクロロレニウム（ＩＶ）カリウム；塩化レニウム（ＩＩＩ）；ヘキサクロロレニウム酸（ＩＶ）アンモニウム；二塩化ジメチルすず（ＩＩ）；硝酸トリウム（ＩＶ）；オキシ塩化ウラン（ＶＩ）；オキシ硝酸ウラン（ＶＩ）；オキシ酢酸ウラン（ＶＩ）；オキシピロリン酸ウラン（ＶＩ）；ペンタフルオロオキシウラン酸（ＶＩ）カリウム；ペンタフルオロオキシウラン酸（ＶＩ）ナトリウム；ナノフルオロジオキシウラン酸（ＶＩ）カリウム；トリ酢酸オキシウラン酸（ＶＩ）ナトリウム；オキシシュウ酸ウラン（ＶＩ）；セレノシアン酸アニオン；タングステン酸ナトリウム；１２−タングストリン酸ナトリウム；酢酸タリウム（Ｉ）；フッ化タリウム（Ｉ）；硝酸タリウム（Ｉ）；テトラクロロパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；テトラブロモパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；テトラシアノパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；テトラヨードパラジウム酸（ＩＩ）カリウム；塩化コバルト（ＩＩ）。 A non-exclusive list of possible heavy atom derivatizing agents is as follows: potassium hexachloroiridate (III); potassium hexachloroiridate (IV); sodium hexachloroiridate (IV); hexachloroiridate (III ) Sodium; potassium hexanitritoiridate (III); ammonium hexachloroiridate (III); iridium (III) chloride; potassium hexanitratoiridate (III); iridium (III) bromide; barium (II) chloride; Barium (II) acetate; Cadmium nitrate (II); Cadmium iodide (II); Lead nitrate (II); Lead acetate (II); Trimethyl lead (IV) chloride; Trimethyl lead (IV) acetate; ) Ammonium; lead (II) chloride; hexa Sodium lorrodate (III); strontium (II) acetate; disodium thiomalonate gold acid (I); potassium dicyanoaurate (I); sodium dicyanoaurate (I); sodium thiosulfatoaurate (III); tetracyanoaurate ( (III) potassium; potassium tetrachloroaurate (III); tetrachloroaurate (III) hydrogen; sodium tetrachloroaurate (III); potassium tetraiodoaurate (III); potassium tetrabromoaurate (III); (acetato- o) methylmercury; methyl (nitrato-o) mercury; chloromethylmercury; iodomethylmercury; chloroethylmercury; methylmercury cation; triethyl (m3-phosphato (3-)-O, O ′, O ″) trimercury eth; [3 [(Aminocarbonyl) amino] -2-methoxyl Pyr] chromium; 1,4 diacetoxymercury 2-3 dimethoxybutane; methoxyl merchydrin; tetrakis (acetoxymercury) -methane; 1,4 bis (chloromercury) -2,3-butanediol; diacetoxymercury chloro Mercury (II); methylmercury-2-mercaptoethanol; 3,6bis (mercurymethyldioxaneacetic acid); ethylmercury cation; Billman's dimercurial; parachloromercury phenylacetate (pcma); Glyoxal (mpg); Thiomersal, ethylmercury thiosalicylate [emts]; 4-chloromercuribenzenesulfonic acid; 2,6 dichloro Silver-4-nitrophenol (dcmnp); [3-[[2 (carboxymethoxy) benzoyl] amino (mino) -2 methoxy prop; parachloromercury benzoate (pcmb), 4-chloromercury; (acetato-o) phenylmercury Phenylmercury benzoate (pmb); parahydroxymercury benzoate (phmb); mercury imidosuccinate / mercury succinimide; 3-hydroxymercury benzaldehyde; 2-acetoxymercury sulfanilamide; 3-acetoxymercury-4 aminobenzenesulfonamide Methyl mercury thioglycolic acid (mmtga); 2-hydroxymercury-toluene-4-sulfonic acid (hmts); acetaminophenylmercury acetate (apm); ); [3-[(aminocarbonyl) amino] -3-methoxypropyl 2-chloro; para-hydroxymercury benzene sulfonate (phmbs); ortho-chloromercury phenol (ocmp); diacetoxymercury dipropylene dioxide (dmdx); Para-acetoxymercury aniline (pama); (4-aminophenyl) chloromercury; aniline mercury cation; 3-hydroxy-mercury-ssulfosalicylic acid (msss); 3 or 5 hydroxymercury salicylic acid (hmsa); diphenylmercury; 6-diacetoxymercurymethyl 1-4 thioxan (dmmt); 2,5-bis (bls) (chloromercury) furan; orthochloromercury nitrophenol (ocmnp); 5-mercury deoxyuridine monosulfate; mercuric salicylate; 2- (Carboki Methoxy) benzoyl] amino-2-methoxy pro; 3,3 bis (hydroxymercury) -3-nitratomercury pyruvic acid; 3-chloromercury pyridine; 3,5 bisacetoxymercury methylmorpholine; ortho-mercury phenol cation Para-carboxymethylmercaptomercurybenzenesulfonyl; para-mercury benzoylglucosamine; 3 acetoxymercuri-5-nitrosalicylaldehyde (msa); tetrachloromercury (II) ammonium; tetrathiocyanatomercury (II) potassium; Tetrathiocyanatomercury (II) sodium; tetraisothiocyanatomercury (II) potassium; tetraiodo (mercury) potassium (II); tetrathiocyanatomercury (II) ammonium Tetrabromomercury (II) potassium; Tetracyanomercury (II) potassium; Mercury bromide (II); Mercury thiocyanate (II); Mercury cyanide (II); Mercury iodide (II); Mercury chloride (II); Mercury acetate (II); Mercury acetate (I); Dichlorodiaminomercury (II); βmercury-mercaptoethylamine hydrochloride; Mercury sulfate (II); Mercury (II) chloroanilate; Dimercuric acetate; Chloro (2-oxoethyl) mercury Phenol mercuric nitrate; mercaptoethanol mercury; mercuric mercatoethylamine chloride; mercuric thioglycolate (sodium salt); o-hydroxymercury-p-nitrophenol / 2-hydroxymercury-4-; parachloromercuryphenol (pccmp); thiosalicylic acid Acetylmercury (amts); iodine; potassium iodide (iodine) 4-iodopyrazole; O-iodobenzoylglucosamine; P-iodobenzoylglucosamine; potassium iodide / chloramine t; ammonium iodide; 3-isothiocyanato-4-iodobenzenesulfonate; Potassium iodide; 3'-iodophenyltriazine; 4'-iodophenyltriazine; sodium iodide / iodine; silver nitrate; silver trinitridesulfoxylate (); Tobenamed Samarium (III) chloride; thulium (III) chloride; lutetium chloride (III); europium (III) chloride; salt Terbium (III); gadolinium chloride (III); erbium chloride (III); lanthanum chloride (III); samarium (III) nitrate; samarium (III) acetate; samarium (III) cation; praseodymium chloride (III); neodymium chloride ( Ytterbium chloride (III); thulium sulfate (III); ytterbium sulfate (III); gadolinium sulfate (III); gadolinium (III) acetate; dysprosium chloride (III); erbium nitrate (III); holmium chloride (III) Pentaaminoruthenium chloride (III); cesium nitridotrioxo osmium (viii); potassium tetraoxoosmate; hexaaminoosmium iodide (III); Roosmic acid (IV) ammonium; osmium chloride (III); hexachloroosmic acid (IV) potassium; trichlorotriscarbonylosmic acid (? ) Cesium; dinitridodiamineplatinum (II); cisdichlorodimethylamineplatinum (II); dichlorodiammineplatinum (II); dibromodiammineplatinum (II); dichloroethylenediamineplatinum (II); dichlorodinitritoplatinic acid (II) potassium; Diethylenediamine platinum (II); potassium dioxylatoplatinate (II); dichlorobis (pyridine) platinum (II); potassium (trimethyldibenzylamine) platinum (?); Tetrabromoplatinic acid (II) Potassium; tetrachloroplatinate (II) potassium; tetranitritoplatinum (II) potassium; tetracyanoplatinate (II) potassium; tetracyanoplatinate (II) sodium; Potassium natoplatinate (II); ammonium tetranitritoplatinate (II); potassium tetraisocyanatoplatinate (II); tetracyanoplatinum (II) ammonium; tetrachloroplatinate (II) ammonium; dinitritodioxalate platinum acid ( IV) Potassium; Dichlorotetraaminoplatinum (IV); Dibromodinitritodiammine platinum (IV); Potassium hexanitritoplatinate (IV); Potassium hexachloroplatinate (IV); Potassium hexabromoplatinate (IV); Hexachloroplatinum Sodium acid (IV); Potassium hexaiodoplatinate (IV); Potassium hexathiocyanatoplatinate (IV); Tetrachlorobis (pyridine) platinum (IV); Ammonium hexachloroplatinate (IV); Di- μ-iodobis (ethylenediamine) diplatinum (II) n; potassium hexaisothiocyanatoplatinate (IV); potassium tetraiodoplatinate (II); 2,2 ′, 2 ″ terpyridylplatinum (II); 2hydroxyethanethio Rate (2,2 ′, 2 ″ terpyidine) pla; potassium tetranitroplatinate (II); trimethylplatinum (II) nitrate; sodium tetraoxorhenate (VII); potassium tetraoxorhenate (VI); Potassium tetraoxorhenate (VII); potassium hexachlororhenium (IV); rhenium (III) chloride; ammonium hexachlororhenate (IV); dimethyltin chloride (II); thorium (IV) nitrate; uranium oxychloride (VI) Uranium oxynitrate (VI) Uranium oxyacetate (VI); Uranium oxypyrophosphate (VI); Potassium pentafluorooxyuranate (VI); Sodium pentafluorooxyuranate (VI); Potassium nanofluorodioxyuranate (VI); Oxyuranium triacetate Sodium (VI) acid; Uranium oxyoxalate (VI); Selenocyanate anion; Sodium tungstate; 12-Tungstophosphate; Thallium acetate (I); Thallium fluoride (I); Thallium nitrate (I); Palladium acid (II) potassium; tetrabromopalladate (II) potassium; tetracyanopalladate (II) potassium; tetraiodopalladate (II) potassium; cobalt (II) chloride.

チップを形成し得るＰＤＭＳ材料は、これらの標的の多く（特に、生物学的サンプル）に十分に適している。ＰＤＭＳは、そのような分子が可溶化状態でそれらの適切な形状、折り畳み、および活性を維持することを可能にする、非反応性で生物学的に不活性な化合物である。このマトリクスおよび系は、数百ダルトンからメガダルトンのレジーム（ｒｅｇｉｍｅ）の範囲の標的サイズおよび分子量に適応し得る。小タンパク質およびペプチドからウイルスおよび高分子複合体にわたる生物学的標的がこの範囲に含まれ、そして、一般的に、３〜１０ｋＤａから＞１〜２ＭＤａのいずれかの大きさである。 PDMS materials that can form chips are well suited for many of these targets, particularly biological samples. PDMS is a non-reactive and biologically inert compound that allows such molecules to maintain their proper shape, folding, and activity in a solubilized state. This matrix and system can accommodate target sizes and molecular weights ranging from hundreds of daltons to mega dalton regimes. Biological targets ranging from small proteins and peptides to viruses and macromolecular complexes are included in this range and are generally anywhere from 3-10 kDa to> 1-2 MDa.

（６．溶質／試薬の型）
結晶化スクリーニングの間に、多くの化学化合物が使用され得る。これらの化合物としては、塩、低分子量有機化合物および高分子量有機化合物、緩衝液、リガンド、低分子薬剤、界面活性剤、ペプチド、架橋剤、ならびに誘導体化剤が挙げられる。合わせて、これらの化学物質は、液滴中のイオン強度、ｐＨ、溶質濃度、および標的濃度を変化させるために使用され得、そして標的を改変するためにさえも使用され得る。結晶化を達成するためのこれらの化学物質の所望の濃度は変化し得、そしてナノモル濃度からモル濃度の範囲であり得る。代表的な結晶化混合物は、固定されているが、経験的に決定された型および濃度の「沈殿剤」、緩衝液、塩、および他の化学添加物（例えば、金属イオン、塩、低分子化学添加物、凍結防止剤、など）のセットを含む。水は、多くの生物学的標的の結晶化試験において重要な溶媒である。なぜならば、これらの分子の多くは、活性および折り畳みを維持するために水和する必要があり得るからである。 (6. Solute / reagent type)
Many chemical compounds can be used during crystallization screening. These compounds include salts, low and high molecular weight organic compounds, buffers, ligands, low molecular drugs, surfactants, peptides, crosslinkers, and derivatizing agents. Together, these chemicals can be used to change ionic strength, pH, solute concentration, and target concentration in the droplets, and can even be used to modify the target. The desired concentration of these chemicals to achieve crystallization can vary and can range from nanomolar to molar. Typical crystallization mixtures are fixed, but empirically determined types and concentrations of “precipitants”, buffers, salts, and other chemical additives (eg, metal ions, salts, small molecules A set of chemical additives, cryoprotectants, etc.). Water is an important solvent in crystallization tests for many biological targets. This is because many of these molecules may need to be hydrated to maintain activity and folding.

加圧化ガスプライミング（ＰＯＰ）技術と結び付けて上述したように、気体に対するＰＤＭＳの浸透性、およびＰＤＭＳと溶媒との適合性は、使用する沈殿剤を決定する上で重要な因子であり得る。 As described above in connection with the pressurized gas priming (POP) technique, the permeability of PDMS to gases and the compatibility of PDMS and solvents can be important factors in determining the precipitant used.

「沈殿」剤は、標的を可溶状態から不溶状態への押し進めるよう作用し、そして容積の排除、溶媒の誘電率の変更、電荷遮蔽、および分子の集中化をもって作用し得る。このチップの特定の実施形態のＰＤＭＳ材料と適合性の沈殿剤としては、不揮発性塩、高分子量ポリマー、極性溶媒、水溶液、高分子量アルコール、二価金属が挙げられるがこれらに限定されない。 “Precipitating” agents act to push the target from a soluble state to an insoluble state and can act with volume exclusion, solvent permittivity changes, charge shielding, and molecular concentration. Precipitants that are compatible with the PDMS material of certain embodiments of the chip include, but are not limited to, non-volatile salts, high molecular weight polymers, polar solvents, aqueous solutions, high molecular weight alcohols, divalent metals.

沈殿化合物（高分子量有機物質および低分子量有機物質、ならびに特定の塩が挙げられる）は、１％未満〜４０％より高い濃度、または＜０．５Ｍ〜４Ｍより高い濃度で使用され得る。水自体は、可溶性を維持するために特定レベルのイオン強度を必要とするサンプルに対して、沈殿様式で作用し得る。多くの沈殿剤はまた、結晶化スクリーニングの化学的多様性を増加させるために、互いに混合され得る。本明細書に記載されるミクロ流体デバイスは、広範囲のこのような化合物に容易に適合され得る。さらに、多くの沈殿剤（例えば、長鎖有機物質および短鎖有機物質）は、高濃度で非常に粘稠性であり、ほとんどの流体操作デバイス（例えば、ピペットまたはロボットシステム）に対して問題を引き起こす。本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスのポンプおよびバルブの作用により、粘稠性因子の操作が可能となる。 Precipitated compounds (including high and low molecular weight organic materials, and certain salts) can be used at concentrations below 1% to above 40%, or concentrations above <0.5M to 4M. The water itself can act in a precipitation manner on samples that require a certain level of ionic strength to remain soluble. Many precipitating agents can also be mixed with each other to increase the chemical diversity of the crystallization screen. The microfluidic devices described herein can be readily adapted to a wide range of such compounds. In addition, many precipitating agents (eg, long chain organic materials and short chain organic materials) are very viscous at high concentrations, which presents problems for most fluid handling devices (eg, pipettes or robotic systems). cause. The action of the viscosity factor is enabled by the action of the pump and valve of the microfluidic device according to an embodiment of the present invention.

特定のエラストマー材料と適合性の溶媒／沈殿剤の調査は、最適な結晶化剤を同定するために実施され得、最適な結晶化剤は、標準的なスクリーニングよりも効率的な、チップ用に仕立てられた結晶化スクリーニング反応を開発するのに使用され得る。 A search for solvents / precipitating agents that are compatible with a particular elastomeric material can be performed to identify the optimal crystallization agent, which is more efficient for chips, more efficient than standard screening. It can be used to develop tailored crystallization screening reactions.

沈殿剤として使用され得る塩の非排他的な一覧は、以下の通りである：酒石酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；リン酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；酢酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、ＮＨ４）；蟻酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、Ｍｇ、ＮＨ４）；クエン酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；塩化物塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｓ、Ｒｂ、ＮＨ４）；硫酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；リンゴ酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）；グルタミン酸塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｎａ／Ｋ、ＮＨ４）。 A non-exclusive list of salts that can be used as precipitating agents is as follows: tartrate (Li, Na, K, Na / K, NH4); phosphate (Li, Na, K, Na / K) , NH4); acetate (Li, Na, K, Na / K, Mg, Ca, Zn, NH4); formate (Li, Na, K, Na / K, Mg, NH4); citrate (Li, Na, K, Na / K, NH4); Chloride salts (Li, Na, K, Na / K, Mg, Ca, Zn, Mn, Cs, Rb, NH4); Sulfates (Li, Na, K, Na / K, NH4); malate (Li, Na, K, Na / K, NH4); glutamate (Li, Na, K, Na / K, NH4).

沈殿剤として使用され得る有機性材料の非排他的な一覧は、以下の通りである：ＰＥＧ４００；ＰＥＧ１０００；ＰＥＧ１５００；ＰＥＧ２ｋ；ＰＥＧ３３５０；ＰＥＧ４ｋ；ＰＥＧ６ｋ；ＰＥＧ８ｋ；ＰＥＧ１０ｋ；ＰＥＧ２０ｋ；ＰＥＧ−ＭＭＥ５５０；ＰＥＧ−ＭＭＥ７５０；ＰＥＧ−ＭＭＥ２ｋ；ＰＥＧ−ＭＭＥ５ｋ；ＰＥＧ−ＤＭＥ２ｋ；ジオキサン；メタノール；エタノール；２−ブタノール；ｎ−ブタノール；ｔ−ブタノール；ＪｅｆｆａｍｉｎｅＭ−６００；イソプロパノール；２−メチル−２，４−ペンタンジオール；１，６ヘキサンジオール。 A non-exclusive list of organic materials that can be used as precipitating agents is as follows: PEG400; PEG1000; PEG1500; PEG2k; PEG3350; PEG4k; PEG6k; PEG8k; PEG10k; PEG20k: PEG-MME550; PEG-MME2k; PEG-MME5k; PEG-DME2k; Dioxane; Methanol; Ethanol; 2-Butanol; n-Butanol; t-Butanol; Jeffamine M-600; Isopropanol; 2-Methyl-2,4-pentanediol; , 6 hexanediol.

溶液のｐＨは、緩衝化剤の含有により変更され得る；生物学的材料の代表的なｐＨ範囲は、３．５〜１０．５の値の間のいずれかであり、そして緩衝液の濃度は、一般的に、０．０１Ｍと０．２５Ｍとの間である。本明細書中に記載されるミクロ流体デバイスは、広範囲のｐＨ値（特に、生物学的標的に適したｐＨ値）に容易に適合され得る。 The pH of the solution can be altered by the inclusion of a buffering agent; the typical pH range of the biological material is anywhere between 3.5 and 10.5, and the concentration of the buffer is Generally between 0.01M and 0.25M. The microfluidic devices described herein can be readily adapted to a wide range of pH values, particularly those suitable for biological targets.

可能な緩衝剤の非排他的な一覧は、以下の通りである：酢酸ナトリウム；ＨＥＰＥＳ；カコジル酸ナトリウム；クエン酸ナトリウム；コハク酸ナトリウム；リン酸ナトリウムカリウム；ＴＲＩＳ；マレイン酸ＴＲＩＳ；マレイン酸イミダゾール；ビストリスプロパン；ＣＡＰＳＯ、ＣＨＡＰＳ、ＭＥＳ、およびイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）。 A non-exclusive list of possible buffers is as follows: sodium acetate; HEPES; sodium cacodylate; sodium citrate; sodium succinate; sodium potassium phosphate; TRIS; maleic acid TRIS; Bistris propane; CAPSO, CHAPS, MES, and imidazole.

添加物は、標的の溶解度および／または活性の挙動に影響を及ぼす低分子である。このような化合物は、結晶化スクリーニングを迅速化し得るか、または標的の代替の結晶形態を生成し得る。添加物は、化学物質のほぼ全ての考えられ得る形態を取り得るが、代表的には、一価塩または多価塩（無機または有機）、酵素リガンド（基質、生成物、アロステリックエフェクター）、化学架橋剤、界面活性剤および／または脂質、重金属、有機金属化合物、微量の沈殿剤、ならびに低分子量有機物質である。 Additives are small molecules that affect the solubility and / or activity behavior of the target. Such compounds can speed up crystallization screening or produce alternative crystalline forms of the target. Additives can take almost all possible forms of chemicals, but are typically monovalent or polyvalent salts (inorganic or organic), enzyme ligands (substrates, products, allosteric effectors), chemicals Crosslinkers, surfactants and / or lipids, heavy metals, organometallic compounds, trace amounts of precipitants, and low molecular weight organic materials.

以下は、可能な添加物の非排他的な一覧である：２−ブタノール；ＤＭＳＯ；ヘキサンジオール；エタノール；メタノール；イソプロパノール；フッ化ナトリウム；フッ化カリウム；フッ化アンモニウム；無水塩化リチウム；塩化マグネシウム六水和物；塩化ナトリウム；塩化カルシウム二水和物；塩化カリウム；塩化アンモニウム；ヨウ化ナトリウム；ヨウ化カリウム；ヨウ化アンモニウム；チオシアン酸ナトリウム；チオシアン酸カリウム；硝酸リチウム；硝酸マグネシウム六水和物；硝酸ナトリウム；硝酸カリウム；硝酸アンモニウム；蟻酸マグネシウム；蟻酸ナトリウム；蟻酸カリウム；蟻酸アンモニウム；酢酸リチウム二水和物；酢酸マグネシウム四水和物；酢酸亜鉛二水和物；酢酸ナトリウム三水和物；酢酸カルシウム水和物；酢酸カリウム；酢酸アンモニウム；硫酸リチウム一水和物；硫酸マグネシウム七水和物；硫酸ナトリウム十水和物；硫酸カリウム；硫酸アンモニウム；酒石酸二ナトリウム二水和物；酒石酸カリウムナトリウム四水和物；酒石酸二アンモニウム；リン酸二水素ナトリウム一水和物；リン酸水素二ナトリウム二水和物；リン酸二水素カリウム；リン酸水素二カリウム；リン酸二水素アンモニウム；リン酸水素二アンモニウム；クエン酸三リチウム四水和物；クエン酸三ナトリウム二水和物；クエン酸三カリウム一水和物；クエン酸水素二アンモニウム；塩化バリウム；塩化カドミウム二水和物；塩化コバルト二水和物；塩化銅二水和物；塩化ストロンチウム六水和物；塩化イットリウム六水和物；エチレングリコール；グリセロール無水物；１，６ヘキサンジオール；ＭＰＤ；ポリエチレングリコール４００；トリメチルアミンＨＣｌ；グアニジンＨＣｌ；尿素；１，２，３−ヘプタントリオール；ベンズアミジンＨＣｌ；ジオキサン；エタノール；イソ−プロパノール；メタノール；ヨウ化ナトリウム；Ｌ−システイン；ＥＤＴＡナトリウム塩；ＮＡＤ；ＡＴＰ二ナトリウム塩；Ｄ（＋）−グルコース一水和物；Ｄ（＋）−スクロース；キシリトール；スペルミジン；スペルミンテトラ−ＨＣｌ；６−アミノカプロン酸；１，５−ジアミノペンタンジＨＣｌ；１，６−ジアミノヘキサン；１，８−ジアミノオクタン；グリシン；グリシル−グリシル−グリシン；三塩化ヘキサミンコバルト；タウリン；ベタイン一水和物；ポリビニルピロリドンＫ１５；非界面活性剤スルホ−ベタイン１９５；非界面活性剤スルホ−ベタイン２０１；フェノール；ＤＭＳＯ；硫酸デキストランナトリウム塩；ｊｅｆｆａｍｉｎｅＭ−６００；２，５ヘキサンジオール；（＋／−）−１，３ブタンジオール；ポリプロピレングリコールＰ４００；１，４ブタンジオール；ｔｅｒｔ−ブタノール；１，３プロパンジオール；アセトニトリル；γブチロラクトン；プロパノール；酢酸エチル；アセトン；ジクロロメタン；ｎ−ブタノール；２，２，２トリフルオロエタノール；ＤＴＴ；ＴＣＥＰ；ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、ノナエチレングリコールモノラウリルエーテル；ポリオキシエチレン（９）エーテル；オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノラウリルエーテル；ポリオキシエチレン（８）ラウリルエーテル；ドデシルβ−Ｄ−マルトピラノシド；ラウリル酸スクロースエステル；シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド；ノナエチレングリコールオクチルフェノールエーテル；臭化セチルトリメチルアンモニウム；Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミン；デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ラウリルジメチルアミンオキシド；シクロヘキシル−ペンチル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−ドデシルスルホベタイン、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート；ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド；オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド，ＯＳＧ；Ｎ，Ｎ−ジメチルデシルアミン−β−オキシド；メチル−６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−ａ−Ｄ−グルコピラノシド；スクロースモノカプロイル酸；ｎ−オクタノイル−β−Ｄフルクトフラノシル−ａ−Ｄ−グルコピラノシド；ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ＯＧ；シクロヘキシル−プロピル−β−Ｄ−マルトシド；シクロヘキシルブタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；ｎ−デシルスルホベタイン、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパン−１−スルホネート；オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＯＭＥＧＡ；ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；Ｂｒｉｊ３５；Ｂｒｉｊ５８；ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４；ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５；ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５；Ｔｗｅｅｎ２０；Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレン（６）デシルエーテル；ポリオキシエチレン（９）デシルエーテル；ポリオキシエチレン（１０）ドデシルエーテル；ポリオキシエチレン（８）トリデシルエーテル；イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド；デカノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル；３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−ｌ−プロパンスルホネート；３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート；シクロヘキシルペンタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；ノナノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；シクロヘキシルプロパノール−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；オクタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；シクロヘキシルエタノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド；臭化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム；ｎ−ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ドデシルポリ（エチレングリコエーテル）ｎ；ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート；ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド；ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド；ｎ−ドデシルホスホコリン；ａ−Ｄ−グルコピラノシド、β−Ｄ−フルクトフラノシルモノデカン酸、スクロースモノカプリン酸；１−ｓ−ノニル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド（ｔｈｉｏｍａｌｔｏｙｒａｎｏｓｉｄｅ）；Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ（ｄｉｍｅｔｈｌａｍｍｏｎｉｏ））酪酸；ｎ−ノニル−β−Ｄ−マルトピラノシド；シクロヘキシル−ブチル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオマルトピラノシド；ｎ−デシルホスホコリン；ｎ−ノニルホスホコリン；ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド；１−ｓ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；ｎ−オクチルホスホコリン；シクロヘキシル−エチル−β−Ｄ−マルトシド；ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート；シクロヘキシル−メチル−β−Ｄ−マルトシド。 The following is a non-exclusive list of possible additives: 2-butanol; DMSO; hexanediol; ethanol; methanol; isopropanol; sodium fluoride; potassium fluoride; ammonium fluoride; Sodium chloride; Calcium chloride dihydrate; Potassium chloride; Ammonium chloride; Sodium iodide; Potassium iodide; Ammonium iodide; Sodium thiocyanate; Potassium thiocyanate; Lithium nitrate; Magnesium nitrate hexahydrate; Sodium nitrate; Potassium nitrate; Ammonium nitrate; Magnesium formate; Sodium formate; Potassium formate; Ammonium formate; Lithium acetate dihydrate; Magnesium acetate tetrahydrate; Zinc acetate dihydrate; Sodium acetate trihydrate; Japanese products; Potassium acetate; ammonium acetate; lithium sulfate monohydrate; magnesium sulfate heptahydrate; sodium sulfate decahydrate; potassium sulfate; ammonium sulfate; disodium tartrate dihydrate; potassium sodium tartrate tetrahydrate; Ammonium; Sodium dihydrogen phosphate monohydrate; Disodium hydrogen phosphate dihydrate; Potassium dihydrogen phosphate; Dipotassium hydrogen phosphate; Ammonium dihydrogen phosphate; Diammonium hydrogen phosphate; Trilithium citrate Tetrahydrate; trisodium citrate dihydrate; tripotassium citrate monohydrate; diammonium hydrogen citrate; barium chloride; cadmium chloride dihydrate; cobalt chloride dihydrate; copper chloride diwater Strontium chloride hexahydrate; yttrium chloride hexahydrate; ethylene glycol; glycerol anhydride; 1 MPD; polyethylene glycol 400; trimethylamine HCl; guanidine HCl; urea; 1,2,3-heptanetriol; benzamidine HCl; dioxane; ethanol; iso-propanol; methanol; sodium iodide; NAD; ATP disodium salt; D (+)-glucose monohydrate; D (+)-sucrose; xylitol; spermidine; spermine tetra-HCl; 6-aminocaproic acid; 1,5-diaminopentanediHCl; 1,6-diaminohexane; 1,8-diaminooctane; glycine; glycyl-glycyl-glycine; hexaminecobalt trichloride; taurine; betaine monohydrate; polyvinylpyrrolidone K15; non-surfactant sulfo-betaine 195; non-surfactant sulfo-betaine 201; phenol; DMSO; dextran sulfate sodium salt; Jeffamine M-600; 2,5 hexanediol; (+/-)-1,3 butanediol; polypropylene glycol P400; 1,3-propanediol; acetonitrile; gamma butyrolactone; propanol; ethyl acetate; acetone; dichloromethane; n-butanol; 2,2,2 trifluoroethanol; DTT; TCEP; nonaethylene glycol monododecyl ether , Nonaethylene glycol monolauryl ether; polyoxyethylene (9) ether; octaethylene glycol monododecyl ether, octaethylene glycol monolauryl ether; Tylene (8) lauryl ether; dodecyl β-D-maltopyranoside; lauric acid sucrose ester; cyclohexyl-pentyl-β-D-maltoside; nonaethylene glycol octylphenol ether; cetyltrimethylammonium bromide; N, N-bis (3-D Glycylamidopropyl) -deoxycholamine; decyl-β-D-maltopyranoside; lauryldimethylamine oxide; cyclohexyl-pentyl-β-D-maltoside; n-dodecylsulfobetaine, 3- (dodecyldimethylammonio) propane-1 Nonyl-β-D-glucopyranoside; Octyl-β-D-thioglucopyranoside, OSG; N, N-dimethyldecylamine-β-oxide; Methyl-6-O- (N-heptylcarbamoyl) -a D-glucopyranoside; sucrose monocaproyl acid; n-octanoyl-β-D fructofuranosyl-a-D-glucopyranoside; heptyl-β-D-thioglucopyranoside; octyl-β-D-glucopyranoside, OG; cyclohexyl-propyl -Β-D-maltoside; cyclohexylbutanoyl-N-hydroxyethylglucamide; n-decylsulfobetaine, 3- (decyldimethylammonio) propane-1-sulfonate; octanoyl-N-methylglucamide, OMEGA; hexyl- Brij35; Brij58; TritonX-114; TritonX-305; TritonX-405; Tween20; Tween80; polyoxyethylene (6) decyl ether; polyoxyethylene (β-D-glucopyranoside; ) Decyl ether; polyoxyethylene (10) dodecyl ether; polyoxyethylene (8) tridecyl ether; isopropyl-β-D-thiogalactoside; decanoyl-N-hydroxyethylglucamide; pentaethylene glycol monooctyl ether; [(3-Colamidopropyl) -dimethylammonio] -1-propanesulfonate; 3-[(3-Colamidopropyl) -dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate; cyclohexylpentanoyl-N- Nonanoyl-N-hydroxyethyl glucamide; Cyclohexylpropanol-N-hydroxyethyl glucamide; Octanoyl-N-hydroxyethyl glucamide; Cyclohexyl ethanoyl-N-hydroxyeth Glucamide; benzyldimethyldodecylammonium bromide; n-hexadecyl-β-D-maltopyranoside; n-tetradecyl-β-D-maltopyranoside; n-tridecyl-β-D-maltopyranoside; dodecyl poly (ethylene glycoether) n; n-tetradecyl -N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate; n-undecyl-β-D-maltopyranoside; n-decyl-β-D-thiomaltopyranoside; n-dodecylphosphocholine; Glucopyranoside, β-D-fructofuranosyl monodecanoic acid, sucrose monocapric acid; 1-s-nonyl-β-D-thioglucopyranoside; n-nonyl-β-D-thiomaltopyranoside; N -Dodecyl-N, N- (dimethylan N-nonyl-β-D-maltopyranoside; cyclohexyl-butyl-β-D-maltoside; n-octyl-β-D-thiomaltopyranoside; n-decylphosphocholine; n-nonyl Nonanoyl-N-methylglucamide; 1-s-heptyl-β-D-thioglucopyranoside; n-octylphosphocholine; cyclohexyl-ethyl-β-D-maltoside; n-octyl-N, N-dimethyl- 3-ammonio-1-propanesulfonate; cyclohexyl-methyl-β-D-maltoside.

凍結溶媒は、寒剤（例えば、液体窒素、液体プロパン、液体エタン、または窒素ガスもしくはヘリウムガス）中での急速冷却（全て、約１００〜１２０°Ｋ）に対して標的結晶を安定化し、結晶が氷ではなくガラス質のガラス中に包埋されるようにする薬剤である。任意の数の塩または低分子量有機化合物が、凍結防止剤として使用され得、代表的な凍結防止剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＭＰＤ、ＰＥＧ−４００（ならびにＰＥＧ誘導体および高分子量ＰＥＧ化合物の両方）、グリセロール、糖（キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、スクロース、グルコースなど）、エチレングリコール、アルコール（短鎖および長鎖の両方、揮発性および不揮発性の両方）、ＬｉＯＡｃ、ＬｉＣｌ、ＬｉＣＨＯ_２、ＬｉＮＯ_３、Ｌｉ_２ＳＯ_４、Ｍｇ（ＯＡｃ）_２、ＮａＣｌ、ＮａＣＨＯ_２、ＮａＮＯ_３など。繰り返すが、本発明に従うミクロ流体デバイスを構築する材料は、一定範囲のこのような化合物と適合性であり得る。 The freezing solvent stabilizes the target crystal against rapid cooling (all about 100-120 ° K) in a cryogen (eg, liquid nitrogen, liquid propane, liquid ethane, or nitrogen gas or helium gas). A drug that allows it to be embedded in glassy glass rather than ice. Any number of salts or low molecular weight organic compounds may be used as the cryoprotectant, and representative cryoprotectants include, but are not limited to: MPD, PEG-400 (and PEG derivatives and high (Both molecular weight PEG compounds), glycerol, sugar (xylitol, sorbitol, erythritol, sucrose, glucose, etc.), ethylene glycol, alcohol (both short and long chain, both volatile and non-volatile), LiOAc, LiCl, LiCHO ₂ , LiNO ₃ , Li ₂ SO ₄ , Mg (OAc) ₂ , NaCl, NaCHO ₂ , NaNO _{3 and the} like. Again, the materials that make up the microfluidic device according to the present invention may be compatible with a range of such compounds.

これらの化学物質の多くは、研究者が「疎行列（ｓｐａｒｓｅｍａｔｒｉｘ）」スクリーニング実験および「グリッド」スクリーニング実験の両方を実施するのを可能にする、種々の販売元（ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＬａｇｕｎａＮｉｇｕｅｌ、ＣＡ、ＥｍｅｒａｌｄＢｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＢａｉｎｂｒｉｄｇｅ
Ｉｓｌａｎｄ、ＷＡ、およびＪｅｎａＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｏｆＪｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙが挙げられるがこれらに限定されない）からの予め規定されたスクリーニングキットにおいて獲得され得る。疎行列スクリーニングは、可能な限り少ない条件で可能な限り多くの沈殿剤、緩衝液、および添加剤化学物質の空間（ａｄｄｉｔｉｖｅｃｈｅｍｉｃａｌｓｐａｃｅ）を無作為にサンプリングすることを試みる。グリッドスクリーニングは、代表的に、互いに対する２つまたは３つのパラメータ（例えば、沈殿剤濃度対
ｐＨ）の体系的な変動で構成される。両方の型のスクリーニングの使用が、結晶化試験において成功しており、そしてこれらのスクリーニングにおいて使用される化学物質および化学的物質の組み合わせの大部分が、本発明の実施形態に従うチップ設計およびマトリクスと適合性である。 Many of these chemicals are available from various vendors (Hampton Research of Laguna Niguel, CA) that allow researchers to conduct both “sparse matrix” screening experiments and “grid” screening experiments. , Emerald Biostructures of Bainbridge
Can be obtained in pre-defined screening kits from, including, but not limited to, Island, WA, and Jena BioScience of Jena, Germany. Sparse matrix screening attempts to randomly sample as much precipitant, buffer, and additive chemical space as possible in as few conditions as possible. Grid screening typically consists of a systematic variation of two or three parameters relative to each other (eg, precipitant concentration versus pH). The use of both types of screening has been successful in crystallization tests, and most of the chemicals and chemical combinations used in these screens are based on chip designs and matrices according to embodiments of the present invention. Be compatible.

さらに、ミクロ流体デバイスの現在および将来の設計は、特定の標的または標的のセットに対する異なる化学物質のアレイの柔軟なコンビナトリアルスクリーニングを可能にし得る。これは、ロボットスクリーニングまたは手作業のスクリーニングのいずれによっても困難なプロセスである。この後者の局面は、初回スクリーニングによりなされる最初の成功を最適化するために特に重要である。 Furthermore, current and future designs of microfluidic devices may allow flexible combinatorial screening of different chemical arrays for specific targets or sets of targets. This is a difficult process by either robot screening or manual screening. This latter aspect is particularly important for optimizing the initial success made by the initial screening.

（７．結晶化のためのさらなるスクリーニングの変数）
化学的可変性に加えて、多数の他のパラメータは、結晶化スクリーニングの間に変更され得る。このようなパラメータとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１）結晶化試験の容量、２）結晶化溶液に対する標的溶液の比率、３）標的濃度、４）二次的な低分子または高分子との標的の共結晶化、５）水和、６）インキュベーション時間、７）温度、８）圧力、９）接触表面、１０）標的分子に対する改変、および１１）重力。 (7. Further screening variables for crystallization)
In addition to chemical variability, a number of other parameters can be altered during crystallization screening. Such parameters include, but are not limited to: 1) volume of crystallization test, 2) ratio of target solution to crystallization solution, 3) target concentration, 4) secondary small molecule or Co-crystallization of target with polymer, 5) hydration, 6) incubation time, 7) temperature, 8) pressure, 9) contact surface, 10) modification to target molecule, and 11) gravity.

結晶化試験の容量は、ピコリットルからミリリットルの範囲の全ての考えられ得る値の容量であり得る。代表的な値としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：０．１、０．２、０．２５、０．４、０．５、０．７５、１、２、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、７５０、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１２５０、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２５０、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、７５００、８０００、９０００、および１００００ｎＬ。先に記載されたミクロ流体デバイスは、これらの値を使用し得る。 The volume of the crystallization test can be a volume of all possible values in the picoliter to milliliter range. Representative values include but are not limited to: 0.1, 0.2, 0.25, 0.4, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 5, 10 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 450, 500 550, 600, 700, 750, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1250, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2250, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 7500, 8000, 9000, and 10000 nL. The microfluidic devices described above can use these values.

特に、結晶化試験についての低容量範囲（＜１００ｎＬ）の使用は、本発明の実施形態に従うミクロ流体チップの実施形態の明確な利点である。なぜならば、このような低容量の結晶化チャンバが容易に設計および構築され得、多量の貴重な標的分子に対する必要性を最小限に抑えるからである。本発明に従う実施形態の標的物質の低消費は、十分でない生物学的サンプル（例えば、膜タンパク質、タンパク質／タンパク質複合体、およびタンパク質／核酸複合体）を結晶化する試み、および目的の標的に対する結合についてのリードライブラリーの低分子薬物スクリーニングにおいて特に有用である。 In particular, the use of a low volume range (<100 nL) for crystallization testing is a distinct advantage of embodiments of microfluidic chips according to embodiments of the present invention. This is because such a low volume crystallization chamber can be easily designed and constructed, minimizing the need for large quantities of valuable target molecules. Low consumption of target substances in embodiments according to the present invention may result in attempts to crystallize inadequate biological samples (eg, membrane proteins, protein / protein complexes, and protein / nucleic acid complexes) and binding to the target of interest. Is particularly useful in small molecule drug screening of lead libraries.

結晶化混合物に対する標的溶液の比率はまた、結晶化スクリーニングおよび最適化における重要な変数を構成し得る。これらの比率は、全ての考えられ得る値の比率であり得るが、代表的には、１：１００〜１００：１の範囲の標的：結晶化溶液である。代表的な標的：結晶化溶液または結晶化溶液：標的の比率としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２５、１：２０、１：１５、１：１０、１：９、１：８、１：７．５、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２．５、１：２、１：１、２：３、３：４、３：５、４：５、５：６、５：７、５：９、６：７、７：８、８：９、および９：１０。先に記載されたように、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、単一のチップにおいて複数の比率を同時に使用するよう設計され得る。 The ratio of target solution to crystallization mixture can also constitute an important variable in crystallization screening and optimization. These ratios can be ratios of all possible values, but are typically target: crystallization solutions ranging from 1: 100 to 100: 1. Exemplary target: crystallization solution or crystallization solution: target ratios include, but are not limited to: 1: 100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1 : 50, 1:40, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15, 1:10, 1: 9, 1: 8, 1: 7.5, 1: 7, 1: 6, 1 : 5, 1: 4, 1: 3, 1: 2.5, 1: 2, 1: 1, 2: 3, 3: 4, 3: 5, 4: 5, 5: 6, 5: 7, 5 : 9, 6: 7, 7: 8, 8: 9, and 9:10. As previously described, microfluidic devices according to embodiments of the present invention can be designed to use multiple ratios simultaneously on a single chip.

結晶化化学物質濃度と同様に、標的濃度は、一定範囲の値であり得、そして結晶化スクリーニングにおいて重要な変数である。代表的な濃度範囲は、＜０．５ｍｇ／ｍｌ〜＞１００ｍｇ／ｍｌのいずれかであり得、５〜３０ｍｇ／ｍｌの間の値が最も一般的に使用され得る。本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、この範囲の値と容易に適合され得る。 Similar to the crystallization chemical concentration, the target concentration can be a range of values and is an important variable in crystallization screening. A typical concentration range can be anywhere from <0.5 mg / ml to> 100 mg / ml, with values between 5-30 mg / ml being most commonly used. Microfluidic devices according to embodiments of the present invention can be easily adapted with values in this range.

共結晶化は、一般的に、天然または非天然の結合パートナーである二次的因子との標的の結晶化を示す。このような二次的因子は、小さくあり得る（約１０〜１０００Ｄａのオーダー）か、または大きな高分子であり得る。共結晶化分子としては、低分子酵素リガンド（基質、生成物、アロステリックエフェクターなど）、低分子薬物リード物質、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、補体タンパク質（例えば、パートナーまたは標的タンパク質またはサブユニット）、モノクローナル抗体、および融合タンパク質（例えば、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、プロテイン−Ｇ、または発現、溶解度、および標的の挙動を補助し得る他のタグ）が挙げられ得るがこれらに限定されない。これらの化合物の多くは、生物学的化合物または合理的な分子量の化合物のいずれかであるので、共結晶化分子は、ミクロ流体チップにおけるスクリーニングに慣用的に含まれ得る。実際、これらの試薬の多くが高価であり、そして／または限られた量なので、本発明の実施形態に従うミクロ流体チップによりもたらされる低容量さは、これらを共結晶化スクリーニングに理想的に適するようにする。 Co-crystallization generally refers to crystallization of a target with a secondary factor that is a natural or non-natural binding partner. Such secondary factors can be small (on the order of about 10-1000 Da) or large macromolecules. Co-crystallizing molecules include small enzyme ligands (substrates, products, allosteric effectors, etc.), small drug lead substances, single or double stranded DNA or RNA, complement proteins (eg partner or target protein or Subunits), monoclonal antibodies, and fusion proteins such as maltose binding protein, glutathione S-transferase, protein-G, or other tags that can aid in expression, solubility, and target behavior. It is not limited. Since many of these compounds are either biological compounds or reasonably molecular weight compounds, co-crystallized molecules can be routinely included for screening in microfluidic chips. In fact, because many of these reagents are expensive and / or in limited quantities, the low volume provided by the microfluidic chip according to embodiments of the present invention makes them ideally suited for co-crystallization screening. To.

標的の水和は、重要な問題であり得る。特に、水は、生物学的標的およびサンプルに極めて有力な溶媒であり得る。本明細書中に記載されるミクロ流体デバイスは、比較的疎水性であり、そして水ベースの溶液と適合性である。 Target hydration can be an important issue. In particular, water can be a very powerful solvent for biological targets and samples. The microfluidic devices described herein are relatively hydrophobic and compatible with water-based solutions.

結晶化実験の時間の長さは、分または時間から週または月の範囲であり得る。生物学的系におけるほとんどの実験は、代表的に、２４時間〜２週間で結果を示す。このインキュベーション時間のレジームは、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスにより適応され得る。 The length of time for the crystallization experiment can range from minutes or hours to weeks or months. Most experiments in biological systems typically show results in 24 hours to 2 weeks. This incubation time regime can be accommodated by microfluidic devices according to embodiments of the present invention.

結晶化実験の温度は、成功または失敗の割合に大きな影響を有し得る。このことは特に、結晶化実験の温度が０〜４２℃の範囲であり得る生物学的サンプルに当てはまる。最も一般的な結晶化温度のうちのいくつかは、以下の通りである：０、１、２、４、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、３７、および４２。本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、列挙される温度で保存され得るか、または代替的に、小さな温度制御構造（例えば、抵抗加熱器またはＰｅｌｔｉｅｒ冷却構造）との熱接触下に置かれ得る。 The temperature of the crystallization experiment can have a significant effect on the success or failure rate. This is especially true for biological samples where the temperature of the crystallization experiment can be in the range of 0-42 ° C. Some of the most common crystallization temperatures are as follows: 0, 1, 2, 4, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 22, 25, 30, 35, 37 and 42. Microfluidic devices according to embodiments of the invention can be stored at the temperatures listed, or alternatively can be placed in thermal contact with a small temperature control structure (eg, resistance heater or Peltier cooling structure) .

さらに、本発明に従う実施形態の小さなフットプリントおよび迅速な準備時間は、所望の標的温度へのより迅速な平衡化および一定範囲の温度のより小さいインキュベーターにおける保存を可能にする。さらに、本発明の実施形態に従うミクロ流体系は、蒸気相との接触下で結晶化実験を行わないので、従来の巨視的な蒸気拡散技術に伴う問題である温度変化に伴う蒸気相から液滴への水の凝縮が回避される。この特徴は、多くの従来の手動またはロボット操作の系（この系は、所望の温度で維持されなければならいか、またはこの実験は、新しい温度に移される前に一定期間室温で維持されなければならないかのいずれかである）を上回る利点を示す。 Furthermore, the small footprint and rapid preparation time of embodiments according to the present invention allow for faster equilibration to the desired target temperature and storage in a smaller incubator of a range of temperatures. In addition, the microfluidic system according to embodiments of the present invention does not perform crystallization experiments in contact with the vapor phase, so the droplets from the vapor phase are associated with temperature changes, which is a problem with conventional macroscopic vapor diffusion techniques. Condensation of water into the water is avoided. This feature is useful for many conventional manual or robotic systems (which must be maintained at the desired temperature or the experiment must be maintained at room temperature for a period of time before being transferred to a new temperature. It is one of the advantages).

圧力の変動は、今なお研究中である結晶化パラメーターである。これは、部分的には、従来の拡散蒸着プロトコルおよびマイクロバッチプロトコルが、代表的には大気圧以外のすべて圧力におけるスクリーニングを容易には可能にしないからである。ＰＤＭＳマトリックスの剛性により、チップ上での標的結晶化に対する圧力の効果を探索する実験が可能である。 Pressure fluctuation is a crystallization parameter that is still under study. This is partly because conventional diffusion deposition protocols and microbatch protocols typically do not readily allow screening at all pressures other than atmospheric pressure. The stiffness of the PDMS matrix allows experiments to explore the effect of pressure on target crystallization on the chip.

結晶化「滴下物」が存在する表面は、実験の成功および結晶の品質に影響し得る。拡散蒸着プロトコルおよびマイクロバッチプロトコルにおいて使用される固体支持体接触表面の例としては、ポリスチレンまたはシラン化ガラスのいずれかが挙げられる。両方の型の支持体が、標的に依存して、結晶成長を促進または阻害する異なる性向を示し得る。さらに、その結晶化「滴下物」は、空気または何らかの型のポリ炭素油のいずれかと接触しており、このことは、この実験が、それぞれ、拡散蒸着の設定またはマイクロバッチの設定であるか否かに依存する。空気の接触は、遊離酸素が生物学的標的と容易に反応し、これによりタンパク質変性をもたらし得そして結晶化の成功を阻害または低下し得るという点で、不利を有する。油は、微量炭化水素が結晶化実験中に浸出するのを可能にし、そして同様に、結晶化の成功を阻害または低下し得る。 The surface where the crystallization “drops” are present can affect the success of the experiment and the quality of the crystals. Examples of solid support contact surfaces used in diffusion deposition protocols and microbatch protocols include either polystyrene or silanized glass. Both types of supports can exhibit different propensities to promote or inhibit crystal growth, depending on the target. Furthermore, the crystallized “drops” are in contact with either air or some type of polycarbon oil, which indicates whether this experiment is a diffusion deposition setting or a microbatch setting, respectively. Depends on. Air contact has disadvantages in that free oxygen can readily react with biological targets, thereby leading to protein denaturation and inhibiting or reducing crystallization success. The oil allows trace hydrocarbons to leach out during crystallization experiments and can also inhibit or reduce crystallization success.

本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスの設計は、結晶化反応を完全に取り囲む非反応性の生体適合性環境を提供することによって、これらの制限を克服し得る。さらに、ミクロ流体チップにおける結晶化チャンバの組成は、結晶化反応と接触するための新しい表面を提供するように多分変化され得る。このことは、結晶化を促進する異なる表面および表面特性の慣用的スクリーニングを可能にする。 Microfluidic device designs according to embodiments of the present invention can overcome these limitations by providing a non-reactive biocompatible environment that completely surrounds the crystallization reaction. Furthermore, the composition of the crystallization chamber in the microfluidic chip can possibly be varied to provide a new surface for contacting the crystallization reaction. This allows for conventional screening of different surfaces and surface properties that promote crystallization.

結晶化標的（特に、生物学的起源の標的）は、しばしば、結晶化を可能にするように改変され得る。そのような改変としては、短縮、限定的タンパク質分解性消化物、部位特異的変異体、阻害状態または活性化状態、化学的改変または誘導体化などが挙げられるが、これらに限定されない。標的改変は、時間およびコストがかかり得る。改変標的は、非改変標的が必要とするのと同じ徹底的スクリーニングを必要とする。本発明のミクロ流体デバイスは、もとの標的を用いるのと同じ程度容易に、そのような改変標的を用いて作動し、そして同じ利益を提供する。 Crystallization targets (especially targets of biological origin) can often be modified to allow crystallization. Such modifications include, but are not limited to, shortening, limited proteolytic digests, site-specific mutants, inhibition or activation states, chemical modifications or derivatizations. Target modification can be time consuming and costly. Modified targets require the same thorough screening that non-modified targets require. The microfluidic devices of the present invention operate with such modified targets as easily as using the original target and provide the same benefits.

結晶化についてのパラメーターとしての重力の効果は、なお研究中である別の結晶化パラメーターである。これは、そのような物理的特性を変化させることが困難であることが原因である。それにもかかわらず、無重力環境における生物学的サンプルの結晶化実験は、重力の影響下にて地球上で得られる結晶よりも優れた品質の結晶の成長を生じた。 The effect of gravity as a parameter for crystallization is another crystallization parameter that is still under study. This is due to the difficulty in changing such physical properties. Nevertheless, crystallization experiments of biological samples in a weightless environment resulted in growth of crystals of better quality than crystals obtained on Earth under the influence of gravity.

重力が無いことは、従来の拡散蒸着設定およびマイクロバッチ設定に関して問題を提示する。なぜなら、すべての流体は、表面張力によって適所に保持されなければならないからである。しばしばそのような実験を手で設定する必要性もまた、困難を引き起こす。この困難は、空間に作業者を維持する費用が原因である。しかし、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスは、結晶化条件としての微小重力のさらなる調査を可能にする。小型の自動計測および結晶成長系は、以下の１）〜４）を可能にする：１）冷却されているが液体の状態で標的分子を含む衛星工場の打ち上げ、２）標的の分配および結晶の成長、３）生じた結晶の収集および低温凍結、および４）低温貯蔵された結晶を分析のために陸上ステーションに戻すこと。 The lack of gravity presents problems with conventional diffusion deposition and microbatch settings. This is because all fluids must be held in place by surface tension. Often the need to manually set up such experiments also creates difficulties. This difficulty is due to the cost of keeping workers in space. However, microfluidic devices according to embodiments of the present invention allow further investigation of microgravity as crystallization conditions. A small automated metrology and crystal growth system enables 1) to 4): 1) Launch of a satellite factory containing target molecules in a cooled but liquid state, 2) Target distribution and crystal growth Growth, 3) collection and cryo-freezing of the resulting crystals, and 4) returning the cryo-stored crystals to the land station for analysis.

（８．インサイチュ結晶化スクリーニング）
顕微鏡を用いて結晶の成長を観察する能力は、結晶化試験の成功または失敗を決定する段階である。従来の結晶化プロトコルは、可視化を可能にする透明物質（例えば、ポリスチレンまたはシラン化ガラス）を使用し得る。本発明に従う実験のＰＤＭＳマトリックスの透明性は、結晶化試験が伝統的に得られる以下の２つの主要な方法に特に適する：１）光学顕微鏡により可視光体制での直接観察、および２）偏光の複屈折。 (8. In situ crystallization screening)
The ability to observe crystal growth using a microscope is a step in determining the success or failure of a crystallization test. Conventional crystallization protocols may use transparent materials that allow visualization (eg, polystyrene or silanized glass). The transparency of the experimental PDMS matrix according to the present invention is particularly suitable for the following two main methods for which crystallization tests are traditionally obtained: 1) direct observation in the visible light regime with an optical microscope, and 2) polarization of light Birefringence.

複屈折は、従来の実験において判断するのが困難であり得る。なぜなら、多くのプラスチックは、それ自体が複屈折性であり、サンプルの評価を妨害するからである。しかし、本明細書中に記載されるミクロ流体デバイスは、そのような光学的干渉特性を伴うことなく作製され得、偏光特徴および非偏光特徴の両方を用いて直接の可視化を慣用的に可能にする自動スキャニングシステムの設計を可能にする。 Birefringence can be difficult to determine in conventional experiments. This is because many plastics are themselves birefringent and interfere with sample evaluation. However, the microfluidic devices described herein can be made without such optical interference properties, allowing for direct visualization with both polarized and unpolarized features conventionally Allows the design of automatic scanning systems.

さらに、ロボットを利用する（特に手動で設定する）結晶化実験は、表面上の結晶化滴下物の配置を数１０〜数１００ミクロン変動させ得る。この変動性は、自動スキャニングシステムについての問題を提示する。なぜなら、安定な基準を伴わずにそのような柔軟な位置決めの必要性をプログラムすることは困難であるからである。しかし、本発明の実施形態のミクロ流体チップにおける結晶化チャンバの固定配置は、そのような問題を克服する。なぜなら、どのウェルも、ミクロン未満の精度で特定の位置に位置決めされ得るからである。さらに、そのようなシステムは、異なるサイズおよび位置の結晶化チャンバの設計のために容易に拡張可能である。なぜなら、本発明の実施形態に従うミクロ流体デバイスを設計するために使用されるマスクおよび他のテンプレートは、簡単にデジタル化され得、そして可視化のためのスキャニングソフトウェア中に移植され得るからである。 Furthermore, crystallization experiments utilizing robots (especially set manually) can vary the placement of crystallization drops on the surface by tens to hundreds of microns. This variability presents a problem for automatic scanning systems. This is because it is difficult to program the need for such flexible positioning without a stable reference. However, the fixed placement of the crystallization chamber in the microfluidic chip of embodiments of the present invention overcomes such problems. This is because any well can be positioned at a specific location with submicron accuracy. Furthermore, such a system is easily expandable for the design of crystallization chambers of different sizes and locations. This is because masks and other templates used to design microfluidic devices according to embodiments of the present invention can be easily digitized and ported into scanning software for visualization.

一旦結晶が視覚的観察により得られると、チップ自体を直接通る回折についてスクリーニングすることが可能であり得る。例えば、チップ内の結晶化チャンバは、ガラス、石英、または弾性材料自体の薄化部分を含む透明な「窓」が、そのチャンバの対向する壁に装備され得る。その後、結晶は、回折キャピラリーについてアッセイするためにチップを通るＸ線に直接曝され得、結晶サンプルを除去することにより結晶サンプルを多分損傷させる必要性が排除される。そのようなアプローチは、追跡調査のための最良の開始条件候補を決定するために最初の結晶化試験から成功をスクリーニングするために使用され得る。同様に、特定の条件の組の下で成長した結晶が、新しい溶液（例えば、低温安定化剤、低分子薬物リード化合物またはリガンドなど）で「再平衡化」され得、そしてそのような環境変化に対するその結晶の安定性が、Ｘ線回折により直接モニターされ得る。 Once the crystals are obtained by visual observation, it may be possible to screen for diffraction directly through the chip itself. For example, the crystallization chamber in the chip can be equipped with transparent “windows” on the opposing walls of the chamber, including thinned portions of glass, quartz, or the elastic material itself. The crystals can then be directly exposed to x-rays through the chip to assay for diffractive capillaries, eliminating the need to possibly damage the crystal sample by removing the crystal sample. Such an approach can be used to screen for success from an initial crystallization test to determine the best starting condition candidate for follow-up. Similarly, crystals grown under a particular set of conditions can be “re-equilibrated” with a new solution (eg, low temperature stabilizer, small drug lead compound or ligand, etc.) and such environmental changes The stability of the crystal against can be directly monitored by X-ray diffraction.

（９．精製／結晶化のためのミクロ流体デバイスの利用）
標的生物学的サンプル（例えば、タンパク質）の結晶化は、実際には、事前の多数の複雑かつ困難な工程の頂点であり、そのような工程としては、タンパク質の発現、精製、誘導体化、および標識が挙げられるが、これらに限定されない。結晶化の前のそのような工程は、１組の溶液特性を備えるチャンバから異なる組の特性を備える別の領域へ液体を往復させる工程を包含する。ミクロ流体技術は、そのような作業を実施するために適切であり、それにより、単一チップの範囲内において必要なすべての工程の組み合わせが可能になる。 (9. Use of microfluidic devices for purification / crystallization)
Crystallization of a target biological sample (eg, protein) is actually the apex of a number of complex and difficult steps in advance, such as protein expression, purification, derivatization, and Examples include, but are not limited to, labels. Such a step prior to crystallization involves reciprocating liquid from a chamber with one set of solution properties to another region with a different set of properties. Microfluidic technology is suitable for performing such operations, which allows for the combination of all necessary steps within a single chip.

プレ結晶化工程の実施を可能にするミクロ流体取扱い構造の例が、上記の第Ｉ節に記載されている。例えば、ミクロ流体チップは、調節されたバイオリアクターとして作用し得、それにより、セルペン（ｃｅｌｌｐｅｎ）構造中に含まれる増殖中の細胞中へと栄養素を流すことを可能にすると同時に、老廃物を除去し、そして組換え改変生物が細胞増殖の所望の段階で標的分子（例えば、タンパク質）を生成するのを誘導する。誘導後に、これらの細胞は、セルペン（ｃｅｌｌｐｅｎ）からチップの異なる領域へと、酵素的手段または機械的手段による溶解のために押しやられ得る。その後、可溶化した標的分子は、チップ上に直接組み込まれた分子濾過ユニットによって細胞破片から分離され得る。 An example of a microfluidic handling structure that allows the pre-crystallization process to be performed is described in Section I above. For example, a microfluidic chip can act as a regulated bioreactor, thereby allowing nutrients to flow into proliferating cells contained in a cell pen structure, while at the same time removing waste. Removing and inducing the recombinant engineered organism to produce the target molecule (eg, protein) at the desired stage of cell growth. After induction, these cells can be pushed from the cell pen to different areas of the chip for lysis by enzymatic or mechanical means. The solubilized target molecule can then be separated from the cell debris by a molecular filtration unit incorporated directly on the chip.

その後、標的分子と混入する細胞タンパク質および細胞核酸との粗混合物は、種々の化学特性の多孔性マトリックス（例えば、カチオン交換、アニオン交換、アフィニティ、サイズ排除）を通して分離を達成するために流され得る。標的分子が、可溶性を促進する特定の型の融合タンパク質でタグ化された場合、その標的分子はアフィニティ精製され得、同様にタグ化された部位特異的プロテアーゼを用いてその融合産物を分離するように短時間処理され得、その後、清浄化工程としてアフィニティマトリックスに再び通される。 Thereafter, a crude mixture of cellular proteins and cellular nucleic acids contaminating the target molecule can be flowed to achieve separation through a porous matrix of various chemical properties (eg, cation exchange, anion exchange, affinity, size exclusion). . If a target molecule is tagged with a specific type of fusion protein that promotes solubility, the target molecule can be affinity purified, as well as using a tagged site-specific protease to separate the fusion product. Can be processed for a short time and then re-passed through the affinity matrix as a cleaning step.

一旦純粋になると、その標的は、異なる安定化剤と混合され得、活性についてアッセイされ得、その後、結晶化実施領域へと輸送される。チップまたはチップホルダー上の種々の点に位置する局所的加熱ユニット（例えば、電極）および冷蔵ユニット（例えば、Ｐｅｌｔｉｅｒ冷却器）は、処理および結晶化全体にわたるすべての段階で差次的な温度調節を可能にする。従って、タンパク質の産生、精製、および結晶化は、本発明に従う単一ミクロ流体デバイスの実施形態にて達成され得る。 Once pure, the target can be mixed with different stabilizers, assayed for activity, and then transported to the crystallization area. Local heating units (eg electrodes) and refrigeration units (eg Peltier coolers) located at various points on the chip or chip holder provide differential temperature control at all stages throughout processing and crystallization. enable. Thus, protein production, purification, and crystallization can be achieved in a single microfluidic device embodiment according to the present invention.

（ＩＶ．微小フリー界面拡散）
従来の結晶化へのアプローチは、結晶化剤をゆっくりとした拡散を介して導入することによって、標的溶液王権の次第の変化を生じている。広範な種々の条件のサンプリングの際に特に有用な１つの方法は、巨視的なフリー界面拡散である。この技術は、２つ以上の溶液（代表的に、タンパク質ストック）と沈殿剤との間での十分に規定された流体界面の作製、および引き続く、拡散プロセスを介するこれらの２つの溶液の平衡化を必要とする。これらの溶液が互いに拡散するにつれて、その拡散経路に沿って勾配が確立され、そして条件の連続物が、同時にサンプリングされる。これらの条件における、空間と時間との両方での変動が存在するので、結晶形成の一および時間に関する情報が、さらなる最適化に置いて使用され得る。図２９Ａ〜２９Ｄは、フリー界面に沿って接触した溶液Ａおよび溶液Ｂについての距離に対して、濃度をプロットする、単純化された概略図である。図２９Ａ〜Ｄは、これらの２つの溶液の、経時的な、連続的な、かつ広範な濃度プロフィールが、最終的に作製されることを示す。 (IV. Micro free interface diffusion)
Traditional approaches to crystallization have caused a gradual change in target solution kingdom by introducing a crystallizing agent through slow diffusion. One method that is particularly useful when sampling a wide variety of conditions is macroscopic free interface diffusion. This technique creates a well-defined fluid interface between two or more solutions (typically protein stocks) and a precipitating agent and subsequently equilibrates these two solutions via a diffusion process. Need. As these solutions diffuse together, a gradient is established along their diffusion path, and a series of conditions are sampled simultaneously. Because there are variations in both space and time in these conditions, information about the crystal formation time and time can be used in further optimization. 29A-29D are simplified schematic diagrams plotting concentration against distance for solution A and solution B in contact along the free interface. Figures 29A-D show that a continuous, broad and broad concentration profile over time of these two solutions is finally created.

巨視的なフリー界面拡散技術の効率にもかかわらず、技術的困難が、この技術を、ハイスループットのスクリーニング用途のために適切ではなくし、そしてこの技術は、いくつかの理由により、結晶学会において広範には使用されない。第一に、流体界面が、代表的に、溶液を狭い容器内（例えば、毛細管または培養プレートの深いウェル）に分配することによって、確立される。図３０Ａ〜Ｂは、巨視的なフリー界面の、毛細管９３００への試みられた形成の、単純化された断面図を示す。第二の溶液９３０２を第一の溶液９３０４内に拡散させる作用は、対流混合を引き起こし、そして乏しく規定された流体界面９３０６を生じる。 Despite the efficiency of macroscopic free interface diffusion technology, technical difficulties have made this technology unsuitable for high-throughput screening applications, and this technology has been widely used in crystallographic societies for several reasons. Not used for. First, a fluid interface is typically established by distributing the solution into a narrow container (eg, a capillary or a deep well of a culture plate). FIGS. 30A-B show simplified cross-sectional views of the attempted formation of a macroscopic free interface into a capillary 9300. FIG. The action of diffusing the second solution 9302 into the first solution 9304 causes convective mixing and produces a poorly defined fluid interface 9306.

さらに、これらの溶液は、この問題を排除するために、毛細管内に連続的に吸引されないかもしれない。図３１Ａ〜Ｂは、第一の溶液９４００と第二の溶液９４０２との間での、毛細管９４０４内での混合を示し、これは、圧力駆動式のＰｏｉｓｅｕｌｌｅ流れの放物線状の速度分布に起因して生じ、乏しく規定された流体界面９４０６を生じる。さらに、巨視的なフリー界面結晶化レジメのための容器は、この容器を、ピペットチップまたは分配ツールに対して接近可能にする寸法を有さなければならず、そして大きい（１０〜１００μｌ）の体積のタンパク質および沈殿剤溶液の使用を必須にする。 Furthermore, these solutions may not be continuously aspirated into the capillaries to eliminate this problem. FIGS. 31A-B show the mixing in the capillary 9404 between the first solution 9400 and the second solution 9402, which is due to the parabolic velocity distribution of the pressure-driven Poiseule flow. Resulting in a poorly defined fluid interface 9406. In addition, the container for the macroscopic free interface crystallization regime must have dimensions that make it accessible to the pipette tip or dispensing tool and has a large (10-100 μl) volume. Use of protein and precipitant solutions.

所望でない対流混合を回避するために、分配の間と結晶インキュベーションの間との両方において、注意を払わなければならない。この理由により、厄介なプロトコルは、しばしば、巨視的フリー界面を規定するために使用される。例えば、第二の溶液の添加前に、１つの溶液を凍結させる。さらに、２つの溶液が適切な配向で貯蔵されない場合、これらの異なる密度の２つの溶液を、重力によって誘導される対流によって混合して、反応の保存をさらに複雑にする。このことは、図３２Ａ〜Ｃに示されており、これらの図において、経時的に、第二の溶液９５０２の密度より大きい密度を有する第一の溶液９５００は、単に沈降して、静的底部層９５０４を形成し、この層は、毛細管の長さに沿った拡散勾配の形成を導かない。 Care must be taken both during dispensing and during crystal incubation to avoid undesired convective mixing. For this reason, cumbersome protocols are often used to define a macroscopic free interface. For example, one solution is frozen before the second solution is added. In addition, if the two solutions are not stored in the proper orientation, these two solutions of different densities are mixed by gravity induced convection, further complicating the preservation of the reaction. This is illustrated in FIGS. 32A-C, in which, over time, the first solution 9500 having a density greater than that of the second solution 9502 simply settles, and the static bottom Layer 9504 is formed, which does not lead to the formation of a diffusion gradient along the length of the capillary.

本発明の実施形態に従って、従来の巨視的フリー界面拡散と類似の結晶化技術（ゲーティングされた微小フリー界面拡散（ゲーティングされたμ−ＦＩＤ））が開発された。ゲーティングされたμ−ＦＩＤは、巨視的なフリー界面拡散技術によって達成される、相間間隔の効率的なサンプリングを保持する。 In accordance with embodiments of the present invention, a crystallization technique similar to conventional macroscopic free interface diffusion (gated micro free interface diffusion (gated μ-FID)) has been developed. Gated μ-FID maintains an efficient sampling of the interphase spacing achieved by a macroscopic free interface diffusion technique.

本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面（μＦＩ）は、少なくとも１つの静止流体と別の流体との間に局在した界面であり、ここで、これらの流体の間での混合は、対流によってではなく、拡散の方が優勢である。この適用の目的で、用語「流体」とは、特定の極大未満の粘度を有する材料をいう。このような極大粘度の例としては、１０００ＣＰｏｉｓｅ、９００ＣＰｏｉｓｅ、８００ＣＰｏｉｓｅ、７００ＣＰｏｉｓｅ、６００ＣＰｏｉｓｅ、５００ＣＰｏｉｓｅ、４００ＣＰｏｉｓｅ、３００ＣＰｏｉｓｅ、２５０ＣＰｏｉｓｅ、および１００ＣＰｏｉｓｅが挙げられるが、これらに限定されず、従って、排除ゲルまたはポリマー含有材料が、内部に捕捉される。 A microfluidic free interface (μFI) according to an embodiment of the present invention is an interface localized between at least one stationary fluid and another fluid, where mixing between these fluids is by convection. Rather, diffusion is dominant. For the purposes of this application, the term “fluid” refers to a material having a viscosity below a certain maximum. Examples of such maximal viscosities include, but are not limited to, 1000 CPoise, 900 CPoise, 800 CPoise, 700 CPoise, 600 CPoise, 500 CPoise, 400 CPoise, 300 CPoise, 250 CPoise, and 100 CPoise, and therefore exclude gels or polymer-containing materials. , Captured inside.

本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面において、この界面の少なくとも１つの寸法は、粘性力が他の力より優れるような大きさに制限される。例えば、本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面において、流体に作用する優勢な力は、浮力よりむしろ粘性であり、従って、このミクロ流体フリー界面は、極度に低いＧｒａｓｈｏｆ数（以下の議論を参照のこと）によって特徴付けられ得る。このミクロ流体フリー界面はまた、流体の全体積に対して局在した性質によって特徴付けられ得、その結果、純粋な流体の間の界面の形成後に最初に存在する、急な移行濃度勾配に曝露される流体の体積が、制限される。 In a microfluidic free interface according to an embodiment of the invention, at least one dimension of this interface is limited to a size such that the viscous force is superior to other forces. For example, in a microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention, the prevailing force acting on the fluid is viscous rather than buoyancy, so this microfluidic free interface is extremely low in the Grashof number (see discussion below) )). This microfluidic free interface can also be characterized by a localized property to the total volume of the fluid, so that it is exposed to the steep transition concentration gradient that initially exists after the formation of the interface between pure fluids. The volume of fluid that is played is limited.

本発明の実施形態に従って作製される、ミクロ流体フリー界面の特性は、図３３Ａおよび３３Ｂに図示されるように、フリーでないミクロ流体界面と対照的であり得る。具体的には、図３３Ａは、本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面の、単純化された断面図を示す。図３３Ａのミクロ流体フリー界面７５００は、チャネル７５０２内に存在する、第一の流体Ａと第二の流体Ｂとの間に形成される。フリーミクロ流体界面７５００は、実質的に線状であり、その結果、流体ＡとＢとの間に生じる急激な濃度勾配は、このチャネル内に高度に局在化される。 The characteristics of a microfluidic free interface made in accordance with embodiments of the present invention can be contrasted with a non-free microfluidic interface, as illustrated in FIGS. 33A and 33B. Specifically, FIG. 33A shows a simplified cross-sectional view of a microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention. The microfluidic free interface 7500 of FIG. 33A is formed between the first fluid A and the second fluid B present in the channel 7502. The free microfluidic interface 7500 is substantially linear so that the sharp concentration gradient that occurs between fluids A and B is highly localized in this channel.

上記のように、チャネル７５０２の寸法は、極度に小さく、その結果、チャネルの壁にすぐ隣接したスリップしない層が、実際に、このチャネルの体積の大部分を占める。その結果、粘性力は、浮力よりずっと大きく、そして流体Ａと流体Ｂとの間での、界面７５００に沿った混合は、対流混合がほとんどまたは全くなしで、ほぼ全体として拡散の結果として起こる。 As noted above, the dimensions of the channel 7502 are extremely small so that the non-slip layer immediately adjacent to the channel wall actually occupies the majority of the channel volume. As a result, the viscous force is much greater than the buoyancy, and the mixing between fluid A and fluid B along interface 7500 occurs almost entirely as a result of diffusion with little or no convective mixing.

本発明の実施形態のミクロ流体フリー界面に付随する条件は、以下の式（３）に従って、Ｇｒａｓｈｏｆ数（Ｇｒ）の項で現され得、浮力と粘性力との相対的な大きさの表現は、以下である：
（３）Ｇｒ＝Ｂ／Ｖ＝αΔｃｇＬ^３／ｖ^２
ここで：
Ｇｒ＝Ｇｒａｓｈｏｆ数；
Ｂ＝浮力；
Ｖ＝粘性力；
α＝溶質の拡大性；
ｃ＝濃度；
ｇ＝重力加速度；
Ｌ＝チャンバの臨界寸法；および
ｖ＝速度論粘度。 The conditions associated with the microfluidic free interface of embodiments of the present invention can be expressed in terms of the Grashof number (Gr) according to the following equation (3), and the expression of the relative magnitude of buoyancy and viscous force Is the following:
(3) Gr = B / V = αΔcgL ³ / v ²
here:
Gr = Grashof number;
B = buoyancy;
V = viscous force;
α = solute expandability;
c = concentration;
g = gravity acceleration;
L = critical dimension of the chamber; and v = kinetic viscosity.

式（３）に従って、Ｇｒａｓｈｏｆ数、および従って、所望でない補正流れの存在を減少させるための、多数のアプローチがなされ得る。１つのこのようなアプローチは、ｇを減少させることであり、そしてこれは、空間において実施される微量重量結晶化実験によって採用される戦術である。別のアプローチは、ｖを増加させることであり、そしてこれは、Ｇａｒｃｉａ−Ｒｕｉｚら、「ＡｇａｒｏｓｅａｓＣｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎＭｅｄｉａｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎｓＩ：ＴｒａｎｓｐｏｒｔＰｒｏｃｃｅｓｓｅｓ」Ｊ．ＣｒｙｓｔａｌＧｌｏｗｔｈ２３２，１６５−１７２（２００１）（全ての目的で、本明細書中に参考として援用される）によって記載されるような、ゲル針療法技術を用いて働く調査者によって採用される戦術である。 In accordance with equation (3), a number of approaches can be taken to reduce the Grashof number and thus the presence of unwanted correction flow. One such approach is to reduce g, which is a tactic adopted by microgravimetric crystallization experiments performed in space. Another approach is to increase v, which is described in Garcia-Ruiz et al., “Agarose as Crystallization Media for Proteins I: Transport Processes” J. Am. In tactics employed by investigators working with gel acupuncture techniques, as described by Crystal Growth 232, 165-172 (2001), incorporated by reference herein for all purposes). is there.

本発明に従う実施形態は、Ｌを減少させ、そして極端に小さい寸法を有するミクロ流体フローチャネルおよび容器の使用を介することを目的とする。このアプローチの効果は、式（３）における変数（Ｌ）の３乗だけ増幅される。 Embodiments according to the present invention are aimed at reducing L and through the use of microfluidic flow channels and containers having extremely small dimensions. The effect of this approach is amplified by the cube of the variable (L) in equation (3).

本発明の実施形態に従うミクロ流体フリー界面は、１以下のＧｒａｓｈｏｆ数を示すと予測される。同じ密度を有する２つの流体において予測されるＧｒａｓｈｏｆ数は、０であり、従って、０に非常に近いＧｒａｓｈｏｆ数は、達成されると予測される。 A microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention is expected to exhibit a Grashof number of 1 or less. The Grashof number predicted for two fluids with the same density is 0, and therefore a Grashof number very close to 0 is expected to be achieved.

図３３Ａにおいて上に図示されるミクロ流体フリー界面の実施形態は、図３３Ｂに示される従来の非ミクロ流体フリー界面と対比され得る。具体的には、第一の流体Ａおよび第二の流体Ｂは、界面７５０４によって分離され、この界面は、均一ではないか、またはチャネル７０５２の断面幅によって制限される。この界面に生じる急激な濃度勾配は、局在せず、その代わりに、このチャネルの長さに沿った種々の地点に存在し、それに対応して大きい体積の流体を、この急激な勾配に曝露する。さらに、粘性力は、浮力に必ずしも勝らず、その結果、流体ＡおよびＢの、界面７５０４を横切る混合は、拡散と対流との両方の結果として起こり得る。従来の非ミクロ流体界面によって示されるＧｒａｓｈｏｆ数は、１を超えると予測される。 The embodiment of the microfluidic free interface illustrated above in FIG. 33A can be contrasted with the conventional non-microfluidic free interface shown in FIG. 33B. Specifically, first fluid A and second fluid B are separated by interface 7504, which is not uniform or limited by the cross-sectional width of channel 7052. The steep concentration gradient that occurs at this interface is not localized, but instead exists at various points along the length of the channel, exposing a correspondingly large volume of fluid to this steep gradient. To do. Furthermore, viscous forces do not necessarily outperform buoyancy, so that mixing of fluids A and B across interface 7504 can occur as a result of both diffusion and convection. The Grashof number exhibited by a conventional non-microfluidic interface is expected to exceed 1.

（１．ミクロ流体フリー界面の生成）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面は、種々の方法により生成され得る。１つのアプローチは、先に記載のミクロ製作されたエラストマー構造物を利用することである。詳細には、特定の実施形態では、これらミクロ流体構造物が形成されるエラストマー材料は、特定のガスに比較的透過可能である。このガスの透過可能性性質は、良好に規定された再現可能な流体界面を形成するために、加圧化ガスプライミング（ＰＯＰ）の技法を利用して開発され得る。 (1. Generation of microfluidic free interface)
The microfluidic free interface according to embodiments of the present invention can be generated by various methods. One approach is to utilize the microfabricated elastomeric structure described above. Specifically, in certain embodiments, the elastomeric material from which these microfluidic structures are formed is relatively permeable to certain gases. This gas permeable property can be developed utilizing pressurized gas priming (POP) techniques to form a well-defined and reproducible fluid interface.

図３４Ａは、本発明の実施形態によるミクロ流体デバイスのフローチャネル９６００の平面図を示す。フローチャネル９６００は、作動されたバルブ９６０２によって二等分される。材料の導入の前に、フローチャネル９６００はガス９６０４を含む。 FIG. 34A shows a plan view of a flow channel 9600 of a microfluidic device according to an embodiment of the present invention. Flow channel 9600 is bisected by actuated valve 9602. Prior to the introduction of material, the flow channel 9600 contains a gas 9604.

図３４Ｂは、圧力下での第１のフローチャネル部分９６００ａへの第１の溶液９６０６の導入、および圧力下での第２のフローチャネル部分９６００ｂへの第２の溶液９６０８の導入を示す。周辺のエラストマー材料９６０７のガス透過可能性のため、ガス９６０４は、入来する溶液９６０８および９６１０によって置換され、そしてエラストマー９６０７を通ってガスが除かれる。 FIG. 34B shows the introduction of the first solution 9606 into the first flow channel portion 9600a under pressure and the introduction of the second solution 9608 into the second flow channel portion 9600b under pressure. Due to the gas permeability of the surrounding elastomeric material 9607, the gas 9604 is replaced by incoming solutions 9608 and 9610 and the gas is removed through the elastomer 9607.

図３４Ｃに示されるように、フローチャネル部分９６００ａおよび９６００ｂの加圧されたガスが出るプライミングは、気泡なしに、これらの行き詰まりのフローチャネル部分の均一な充填を可能にする。図３４Ｄに示されるようなバルブ９６０２の非作動化に際し、ミクロ流体フリー界面９６１２が形成され、流体間の拡散勾配の形成を可能にする。 Priming out of the pressurized gas in flow channel portions 9600a and 9600b, as shown in FIG. 34C, allows for uniform filling of these deadly flow channel portions without bubbles. Upon deactivation of the valve 9602 as shown in FIG. 34D, a microfluidic free interface 9612 is formed, allowing the formation of a diffusion gradient between the fluids.

ゲート型μ−ＦＩＤを利用するタンパク質結晶の形成は、多くの付加された利点とともに、巨視的フリー界面拡散技法によって達成される位相空間の効率的なサンプリングを保持し、これには、サンプル溶液の倹約使用、セットアップの容易さ、ウェルで規定される流体界面の生成、平衡動力学に対する制御、および高スループット平行実験を実施する能力が含まれる。 The formation of protein crystals utilizing gated μ-FID, with many added advantages, retains the efficient sampling of the phase space achieved by the macroscopic free interface diffusion technique, including the sample solution. Includes thrifty use, ease of setup, creation of well-defined fluid interfaces, control over equilibrium dynamics, and the ability to perform high-throughput parallel experiments.

ゲート型μ−ＦＩＤを利用するタンパク質結晶の形成の別の可能な利点は、図３６Ａおよび３６Ｂと組み合わせて示されるような、高品質結晶の形成である。図３６Ａは、従来の巨視的フリー界面拡散技法を利用して形成されるタンパク質結晶の単純化した略図を示す。詳細には、初期のタンパク質結晶９２００は、浮力の作用の結果として、サンプルの正味の伝達フローを経験している溶液９２０２からのサンプルに曝される。この伝達フローの方向性の結果として、タンパク質結晶９２００の成長もまた方向性がある。しかし、Ｎｅｒａｄら、「溶液からの結晶の成長の間の対流の最小化に関する地上実験」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｒｙｓｔａｌＧｒｏｗｔｈ７５、５９１〜６０８（１９８６）に記載のように、タンパク質結晶の非対照的成長が、成長する結晶の格子中に所望されないひずみを生じ得、格子内に不純物の転位および／または取り込みを促進し、そしてその他に結晶の質に悪影響を及ぼす。 Another possible advantage of forming protein crystals utilizing gated μ-FID is the formation of high quality crystals, as shown in combination with FIGS. 36A and 36B. FIG. 36A shows a simplified schematic diagram of a protein crystal formed using conventional macroscopic free interface diffusion techniques. Specifically, the initial protein crystal 9200 is exposed to a sample from solution 9202 experiencing the net transfer flow of the sample as a result of buoyancy effects. As a result of this directional flow, the growth of protein crystals 9200 is also directional. However, as described in Nerad et al., “Ground Experiment on Minimizing Convection During Crystal Growth from Solution”, Journal of Crystal Growth 75, 591-608 (1986), asymmetric growth of protein crystals is Undesirable strains can occur in the growing crystal lattice, promote dislocation and / or incorporation of impurities into the lattice, and otherwise adversely affect the quality of the crystal.

対照的に、図３６Ｂは、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散を利用して形成されるタンパク質結晶の単純化した略図を示す。初期のタンパク質結晶９２０４は、結晶化剤内で拡散しているサンプル溶液９２０６に曝される。この拡散は、方向性がなく、そしてタンパク質結晶９２０４の成長もまた対応して方向性がない。従って、この成長する結晶は、図３６Ａに示される成長する結晶により経験される、格子上のひずみおよび不純物の付随する取り込みおよび転位を避ける。従って、図３６Ｂ中の結晶の質は高品質である。 In contrast, FIG. 36B shows a simplified schematic of a protein crystal formed utilizing diffusion across a microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention. The initial protein crystals 9204 are exposed to the sample solution 9206 that is diffusing in the crystallization agent. This diffusion is not directional, and the growth of protein crystal 9204 is also correspondingly non-directional. Thus, this growing crystal avoids strain on the lattice and concomitant uptake and dislocation of impurities as experienced by the growing crystal shown in FIG. 36A. Therefore, the quality of the crystal in FIG. 36B is high.

まさに記載された詳細な実施形態は、閉鎖されたバルブによって分離された行き詰まり充填の２つ以上のチャンバまたはチャネルへのバルク材料の透過可能性を開発し、そしてこのバルブの引き続く開放によって静止流体間のミクロ流体フリー界面を生成するけれども、ミクロ流体フリー界面を実現するためのその他の機構が可能である。 The detailed embodiment just described has developed the permeability of bulk material to two or more chambers or channels of dead-filling separated by a closed valve, and the subsequent opening of this valve allows a static fluid between Although other microfluidic free interfaces are produced, other mechanisms for realizing microfluidic free interfaces are possible.

例えば、図４６は、本発明によるミクロ流体フリー界面を確立するための１つの可能な代替方法を示す。ミクロ流体チャネル８１００は、矢印によって示される方向の対流を、静止非スリップ層８１０２がフローチャネル８１００の壁に沿って生成されるように経験する流体Ａを運搬する。分岐チャネル８１０４および行き詰まりのチャンバ８１０６は、静止流体Ｂを含む。行き詰まりのチャネルおよびチャンバを取り囲む材料は逆圧を提供す
るので、流体Ｂは静止したままであり、そしてミクロ流体フリー界面８１１０が、流れる流体Ａと静止流体Ｂとの間の分岐チャネル８１０８の口８１１２で生成される。以下に記載されるように、ミクロ流体フリー界面を横切る流体Ａまたはその成分の拡散が、有用な結果を得るために開発され得る。図４６に示される実施形態は、行き詰まりの分岐チャネルおよびチャンバを含むが、これは、本発明では必要ではなく、そしてこの分岐チャネルは、このチャネルを通る流体の任意の正味の流れを防ぐために十分な逆圧が維持される限り、デバイスの別の部分と連結され得る。 For example, FIG. 46 illustrates one possible alternative method for establishing a microfluidic free interface according to the present invention. The microfluidic channel 8100 carries fluid A that experiences convection in the direction indicated by the arrows such that a stationary non-slip layer 8102 is created along the walls of the flow channel 8100. Branch channel 8104 and deadlock chamber 8106 contain stationary fluid B. The material surrounding the deadlock channel and chamber provides back pressure so that fluid B remains stationary and the microfluidic free interface 8110 is the mouth 8112 of branch channel 8108 between flowing fluid A and stationary fluid B. Is generated. As described below, diffusion of fluid A or its components across the microfluidic free interface can be developed to obtain useful results. The embodiment shown in FIG. 46 includes a dead-end branch channel and chamber, but this is not necessary with the present invention, and the branch channel is sufficient to prevent any net flow of fluid through the channel. As long as the correct back pressure is maintained, it can be coupled to another part of the device.

ミクロ流体フリー界面拡散アッセイを確立するための別の可能な代替の方法は、ブレークスルー（ｂｒｅａｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）バルブおよびチャンバの使用である。ブレークスルーバルブは、真の閉鎖バルブではなく、むしろ流体の進行を停止するための作動流体の表面張力を用いる構造である。これらバルブは、流体の表面張力に依存するので、それらは、バルブにおいて、流体がバルブ構造の両側面および内部を連続的に充填するときではなく、フリー表面が存在する間でのみ作用し得る。 Another possible alternative method for establishing a microfluidic free interfacial diffusion assay is the use of break-through valves and chambers. Breakthrough valves are not true closing valves, but rather are structures that use the surface tension of the working fluid to stop fluid progression. Since these valves are dependent on the surface tension of the fluid, they can only act during the presence of a free surface in the valve, not when the fluid continuously fills both sides and the interior of the valve structure.

このようなバルブを達成するための方法の非排他的なリストは、制限されないで、疎水性材料のパッチ、特定領域の疎水性処理、チャネルの幾何学的圧縮（高さおよび幅の両方）、幾何学的膨張（チャネルの高さおよび幅の両方）、チャネルの壁の表面粗さの変化、および壁上に付与される電位を含む。 A non-exclusive list of methods to achieve such a valve is not limited, but is a patch of hydrophobic material, hydrophobic treatment of a specific area, geometric compression of the channel (both height and width), Includes geometric expansion (both channel height and width), changes in channel wall surface roughness, and potential applied on the wall.

これらの「ブレークスルー」バルブは、それらが「ブレークスルー」され、そして流体をほぼ妨害されないで通過させる前に、固定かつ良好に規定された圧力に耐えるように設計され得る。チャネル中の圧力は制御され得、そしてそれ故、この流体は、所望されるとき進行させられ得る。この圧力を制御する異なる方法は、制限されないで、入力または出力ポートで外から付与される圧力、遠心分離力由来の圧力（すなわち、デバイスをスピンすることによる）、直線状加速由来の圧力（すなわち、チャネルに平行なコンポーネントでデバイスに加速を付与する）、動電学的圧力、泡形成からの内部に生成される圧力（化学反応によるか、または加水分解による）、機械的ポンプ輸送に由来する圧力、または浸透圧を含む。 These “breakthrough” valves can be designed to withstand a fixed and well defined pressure before they are “breakthrough” and allow the fluid to pass almost unobstructed. The pressure in the channel can be controlled and therefore the fluid can be allowed to proceed when desired. The different ways of controlling this pressure are not limited and include pressure applied externally at the input or output port, pressure from centrifugal force (ie, by spinning the device), pressure from linear acceleration (ie, , Giving acceleration to the device with components parallel to the channel), electrokinetic pressure, pressure generated internally from foam formation (either by chemical reaction or by hydrolysis), derived from mechanical pumping Includes pressure, or osmotic pressure.

「ブレークスルー」バルブは、図３５Ａ〜Ｅと組み合わせて示されかつ説明されるように、ミクロ流体フリー界面を生成するために用いられ得る。図３５Ａは、ブレークスルーバルブを利用してミクロ流体フリー界面を生成するためのデバイスの単純化した平面図を示す。第１のチャンバ９１００は、それぞれ、Ｔ形状チャネル９１０４の分岐９１０４ａおよび９１０４ｂを通じて第２のチャンバ９１０２と液体連絡している。 A “breakthrough” valve can be used to create a microfluidic free interface, as shown and described in combination with FIGS. FIG. 35A shows a simplified plan view of a device for creating a microfluidic free interface utilizing a breakthrough valve. The first chamber 9100 is in fluid communication with the second chamber 9102 through the branches 9104a and 9104b of the T-shaped channel 9104, respectively.

第１のブレークスルーバルブ９１０６は、第１のチャンバ９１００の出口９１０８に位置している。第２のブレークスルーバルブ９１１０は、第２のチャンバ９１０２の入口９１０５の上流の分岐９１０４ｂ中に位置する。第３のブレークスルーバルブ９１１２は、第２のチャンバ９１０２の出口９１１４に位置する。ブレークスルーバルブ９１０６、９１１０、および９１１２は、上記で一般的に説明されるような、疎水性パッチ、フローチャネルの幅の圧縮、または特定のその他の方法から形成され得る。図３５Ａ〜Ｅでは、開放ブレークスルーバルブが、斜線のない丸として描写され、そして閉鎖ブレークスルーバルブが斜線の丸として描写されている。 The first breakthrough valve 9106 is located at the outlet 9108 of the first chamber 9100. The second breakthrough valve 9110 is located in the branch 9104 b upstream of the inlet 9105 of the second chamber 9102. The third breakthrough valve 9112 is located at the outlet 9114 of the second chamber 9102. Breakthrough valves 9106, 9110, and 9112 may be formed from hydrophobic patches, flow channel width compression, or certain other methods, as generally described above. In FIGS. 35A-E, the open breakthrough valve is depicted as a circle without a hatched line and the closed breakthrough valve is depicted as a hatched circle.

図３５Ｂ中に示される初期ステージでは、第１のチャンバ９１００は、任意のバルブ９１０６、９１１０、および９１１２のブレークスルー圧力未満の圧力で、Ｔ形状チャネル９１０４およびチャンバ入口９１０７のステム９１０４ｃおよび分岐９１０４ａを通って導入された第１の流体９１１６で充填される。図３５Ｃに示される第２のステージでは、第２のチャンバ９１０２は、バルブ９１０６のブレークスルー圧力未満であるが、バルブ
９１１０および９１１２のブレークスルー圧力より大きい圧力で、Ｔ形状チャネル９１０４のステム９１０４ｃおよび入口９１０５を通って導入された緩衝液またはその他の媒介流体９１１８で充填される。 In the initial stage shown in FIG. 35B, the first chamber 9100 causes the stem 9104c and branch 9104a of the T-shaped channel 9104 and the chamber inlet 9107 to be at a pressure less than the breakthrough pressure of any of the valves 9106, 9110, and 9112. Filled with the first fluid 9116 introduced through. In the second stage shown in FIG. 35C, the second chamber 9102 is less than the breakthrough pressure of valve 9106 but greater than the breakthrough pressure of valves 9110 and 9112, and stem 9104c of T-shaped channel 9104 and Filled with buffer or other mediator fluid 9118 introduced through inlet 9105.

図３５Ｄで示される第３のステージでは、媒介流体９１１８は、第２のチャンバ９１０２中で、バルブ９１０６のブレークスルー圧力未満であるが、バルブ９１１０および９１１２のブレークスルー圧力より大きい圧力で、Ｔ形状チャネル９１０４のステム９１０４ｃおよび入口９１０５を通って導入された第２の流体９１２０で置換される。図３５Ｅに描写される最後のステージでは、第２の流体９１２０は、媒介流体を置換し、第１および第２の流体９１１６および９１２０を、別個ではあるが、Ｔ接合部９１０４を通じて連結されるチャンバ内の残し、ミクロ流体フリー界面９１２２を生成する。 In the third stage shown in FIG. 35D, the mediator fluid 9118 is T-shaped in the second chamber 9102 at a pressure that is less than the breakthrough pressure of valve 9106 but greater than the breakthrough pressure of valves 9110 and 9112. The second fluid 9120 introduced through the stem 9104c and the inlet 9105 of the channel 9104 is replaced. In the final stage depicted in FIG. 35E, the second fluid 9120 replaces the mediator fluid and the first and second fluids 9116 and 9120 are separate but connected through a T-junction 9104. A microfluidic free interface 9122 is created, leaving inside.

本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を生成するためのブレークスルーバルブの使用は、上記で与えられる特定の例に制限されない。例えば、代替の実施形態では、緩衝液または媒介溶液でフラッシュする工程は要求されず、そして第１の溶液は、第２の溶液で直接フラッシュすることにより除去され得、混合の所望されない可能な副産物は、上記チャネルおよびチャンバを通る第２の溶液の初期フローによって除去される。 The use of a breakthrough valve to create a microfluidic free interface according to embodiments of the present invention is not limited to the specific example given above. For example, in an alternative embodiment, a step of flushing with a buffer or mediator solution is not required, and the first solution can be removed by flushing directly with the second solution, an undesired possible byproduct of mixing Are removed by the initial flow of the second solution through the channel and chamber.

まさに記載された実施形態は、閉鎖ミクロ流体デバイス中にミクロ流体フリー界面を生成するが、これは、本発明による実施形態では必要ではない。例えば、本発明による代替の実施形態は、流体の２つのリザバを連結するためにキャピラリー力を利用し得る。１つのアプローチでは、マイクロタイタープレートの開放ウェルがガラスキャピラリーのセグメントによって連結され得る。第１の溶液は、１つのウェルに、それがウェルを満たし、そしてガラスキャピラリーと接触するように分与され得る。キャピラリー力は、第１の溶液をキャピラリーの端部に侵入かつ流す。一旦、端部達すると、流体の運動は止まる。次に、第２の溶液が第２のウェルに添加される。この溶液は、キャピラリー入口で第１の溶液と接触し、そしてキャピラリーの端部で２つのウェル間のミクロ流体界面を生成する。 Although the just described embodiment creates a microfluidic free interface in a closed microfluidic device, this is not necessary in embodiments according to the invention. For example, an alternative embodiment according to the present invention may utilize capillary forces to connect two reservoirs of fluid. In one approach, the open wells of a microtiter plate can be connected by segments of glass capillaries. The first solution can be dispensed into one well so that it fills the well and contacts the glass capillary. Capillary force causes the first solution to enter and flow through the end of the capillary. Once the end is reached, the fluid motion stops. Next, a second solution is added to the second well. This solution contacts the first solution at the capillary inlet and creates a microfluidic interface between the two wells at the end of the capillary.

２つのウェル間の連結経路はガラスキャピラリーである必要はなく、そして代替の実施形態では、それに代わって、例えば、ガラスのストリップである親水性ストリップ、または従来のＣＶＤもしくはＰＶＤ技法により堆積されたリシカのラインを備え得る。あるいは、この連結経路は、高度に疎水性材料のパターン化された領域間の疎水性のより少ない材料の経路によって確立され得る。さらに、ウェル、または種々の形態にある複数の相互連結チャンバ間のこのような複数の連結が存在し得る。このような相互連結は、デバイスの使用の前にユーザーによって確立され得、流体状態における迅速かつ効率的な変形を可能にする。 The connection path between the two wells need not be a glass capillary, and in alternative embodiments, instead, for example, a hydrophilic strip that is a strip of glass or a lysica deposited by conventional CVD or PVD techniques. You can have a line of Alternatively, this linking pathway can be established by a pathway of less hydrophobic material between patterned regions of highly hydrophobic material. In addition, there may be multiple such connections between wells or multiple interconnected chambers in various configurations. Such interconnection can be established by the user prior to use of the device, allowing for quick and efficient deformation in the fluid state.

先の例におけるように、２つのリザバがミクロ流体デバイスによって囲われていないが、その代わりにミクロ流体経路を通じて連結されている場合、代替の実施形態は、囲われた、および囲われていない、両方のリザバを有し得る。例えば、サンプルは、ミクロ流体デバイス中に装填され得、そして出口キャピラリーまたはオリフィスの端部に（上記のいずれかの圧力方法により）押される。一旦、出口キャピラリーの端部にあると、このキャピラリーは、試薬のリザバ中に浸漬され得る。このようにして、ミクロ流体フリー界面が、外部リザバとチップ中の試薬のリザバとの間に生成される。この方法は、単一の試薬を、ミクロ流体フリー界面拡散を用いて複数の異なる試薬に対してスクリーニングするために、多くの異なる出力キャピラリーまたはオリフィスを用いてパラレルに用いられ得る。 As in the previous example, if the two reservoirs are not surrounded by a microfluidic device, but instead are connected through a microfluidic pathway, an alternative embodiment is enclosed and unenclosed. You can have both reservoirs. For example, the sample can be loaded into a microfluidic device and pushed (by any of the pressure methods described above) to the end of the exit capillary or orifice. Once at the end of the outlet capillary, the capillary can be immersed in a reagent reservoir. In this way, a microfluidic free interface is created between the external reservoir and the reagent reservoir in the chip. This method can be used in parallel with many different output capillaries or orifices to screen a single reagent against multiple different reagents using microfluidic free interfacial diffusion.

まさに記載された例では、試薬は、１つまたは多くの入口から、ミクロ流体デバイスを「通って」、１つまたは多くの異なる出口に送達される。あるいは、この試薬は、ミクロ流体界面を生成するために用いられるべき同じオリフィスを通って導入され得る。サンプル含有溶液は、キャピラリー中に吸引され（吸引を付与するか、キャピラリー力によるか、または溶液に圧力を付与することによるかのいずれかで）、そして次に、キャピラリーは、対比試薬中に浸漬され得、キャピラリーの端部とリザバとの間にミクロ流体界面を生成する。これは、多くの異なる試薬のパラレルスクリーニングのためのキャピラリーの大アレイで行われ得る。ごく小容量のサンプルが用いられ得る。なぜなら、これらキャピラリーは、それを超えてサンプルが進行する固定長さを有し得るからである。結晶化適用には（以下を参照のこと）、これらキャピラリーは取外され、そして結晶に触れる必要なくして、回折研究のためにＸ線ビーム中にマウントされ得る。 In the example just described, reagents are delivered from one or many inlets “through” the microfluidic device to one or many different outlets. Alternatively, the reagent can be introduced through the same orifice to be used to create the microfluidic interface. The sample-containing solution is aspirated into the capillary (either by applying suction, by capillary force, or by applying pressure to the solution), and then the capillary is immersed in the contrasting reagent Can create a microfluidic interface between the end of the capillary and the reservoir. This can be done with a large array of capillaries for parallel screening of many different reagents. A very small sample volume can be used. This is because these capillaries can have a fixed length beyond which the sample travels. For crystallization applications (see below), these capillaries can be removed and mounted in an X-ray beam for diffraction studies without having to touch the crystals.

（２．平衡パラメータに対する再現性あるコントロール）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散の使用の１つの利点は、広範な状態を再現性よくサンプリングする均一および連続的な濃度勾配を生成する能力である。界面のいずれかの側の流体は互いの中に拡散するので、勾配が拡散経路に沿って確立され、そして状態の連続体が同時にサンプリングされ得る。状態には変動があるので、空間および時間の両方において、陽性の結果（すなわち結晶形成）の位置および時間に関する情報が、さらなる最適化で用いられ得る。 (2. Reproducible control over equilibrium parameters)
One advantage of using microfluidic free interfacial diffusion according to embodiments of the present invention is the ability to generate uniform and continuous concentration gradients that reproducibly sample a wide range of conditions. As fluid on either side of the interface diffuses into each other, a gradient is established along the diffusion path and a continuum of states can be sampled simultaneously. Because the state varies, information about the location and time of positive results (ie, crystal formation) in both space and time can be used in further optimization.

多くの適用において、ｐＨ、濃度、または温度のような状態の勾配を生成することが所望される。このような勾配は、適用をスクリーニングすること、反応状態の最適化、動力学研究、結合親和性の決定、解離定数、酵素−速度プロファイリング、高分子の分離、およびその他の多くの適用のために用いられ得る。主に対流フローの抑制に起因して、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散は、信頼性があり、かつ良好に形成された勾配を確立するために用いられ得る。 In many applications, it is desirable to generate a gradient of conditions such as pH, concentration, or temperature. Such gradients are useful for screening applications, reaction state optimization, kinetic studies, binding affinity determination, dissociation constants, enzyme-velocity profiling, macromolecular separation, and many other applications. Can be used. Diffusion across the microfluidic free interface according to embodiments of the present invention, primarily due to convective flow suppression, can be used to establish a reliable and well-formed gradient.

次元のＥｉｎｓｔｅｉｎ等式（４）が、ミクロ流体フリー界面を横切る拡散時間の粗い推定を得るために採用され得る。
（４）ｔ＝ｘ^２／４Ｄ；ここで：
ｔ＝拡散時間；
ｘ＝最長の拡散長さ；および
Ｄ＝拡散係数である。 The dimensional Einstein equation (4) can be employed to obtain a rough estimate of the diffusion time across the microfluidic free interface.
(4) t = x ² / 4D; where:
t = diffusion time;
x = longest diffusion length; and D = diffusion coefficient.

一般に、以下の等式（５）に示されるように、拡散係数は、回転運動の半径とは逆に、そしてそれ故、１／分子量の立方根、として変動する。
（５）Ｄ∝１／ｒ∝／１／ｍ^１／３；ここで：
Ｄ＝拡散係数；
ｒ＝回転運動の半径；および
ｍ＝分子量である。 In general, as shown in equation (5) below, the diffusion coefficient varies inversely with the radius of rotational motion and hence as 1 / molecular weight cube root.
(5) D∝1 / r∝ / 1 / m ^1/3 ; where:
D = diffusion coefficient;
r = radius of rotational motion; and m = molecular weight.

等式（５）を再考する際に、回転運動の半径（ｒ）と分子量（ｍ）との間の相関は近似に過ぎないことを認識することが重要である。粘性力が慣性力に対して優位であるため、拡散係数は、実際、分子量とは独立しており、そしてそれに代わってサイズに依存し、そしてそれ故、拡散粒子によって引かれることが経験される。 In reconsidering equation (5), it is important to recognize that the correlation between the radius of rotation (r) and the molecular weight (m) is only an approximation. Because the viscous force is superior to the inertial force, the diffusion coefficient is actually independent of molecular weight and instead depends on size and is therefore experienced to be attracted by diffusing particles. .

色素に対する粗い１．５時間の平衡時間と比較して、同じ距離に対する２０ＫＤａのタンパク質の近似平衡時間は、約４５時間であると推定される。同じ距離に対する１００Ｄａの分子量の小さな塩の平衡時間は約４５分である。 Compared to the coarse 1.5 hour equilibration time for the dye, the approximate equilibration time for the 20 KDa protein for the same distance is estimated to be about 45 hours. The equilibration time for a small salt with a molecular weight of 100 Da for the same distance is about 45 minutes.

流体界面を横切る拡散から生じる相対濃度は、平衡の間に探索された熱力学状態のみならず、平衡が生じる速度によって決定される。従って、平衡の動力学を制御することが、潜在的に価値がある。 The relative concentration resulting from diffusion across the fluid interface is determined by the rate at which the equilibrium occurs, as well as the thermodynamic state sought during the equilibrium. Thus, controlling the equilibrium dynamics is potentially valuable.

従来の巨視的拡散方法では、平衡の動力学に対する粗い制御のみが、初期状態の操作を通じて利用可能であり得る。巨視的フリー界面拡散では、一旦、拡散が始まると、実験者は、引き続く平衡速度に対する制御はもたない。ドロップ実験を行うために、平衡速度は、初期ドロップのサイズ、リザバの合計サイズ、またはインキュベーションの温度を改変することにより変更され得る。微小バッチの実験では、サンプルが濃縮される速度は、ドロップのサイズ、および周辺オイルの同一性および量を操作することにより変更され得る。平衡速度は、錯綜した様式でこれらのパラメータに依存するので、平衡の動力学は、粗い様式でのみ変更され得る。さらに、一旦、実験が開始されると、平衡動力学に対するさらなる制御は利用可能ではない。 In conventional macroscopic diffusion methods, only coarse control over equilibrium dynamics may be available through initial state operations. In macroscopic free interface diffusion, once the diffusion begins, the experimenter has no control over the subsequent equilibrium rate. In order to perform drop experiments, the equilibrium rate can be altered by modifying the initial drop size, the total reservoir size, or the incubation temperature. In microbatch experiments, the rate at which the sample is concentrated can be altered by manipulating the size of the drop and the identity and amount of the surrounding oil. Since the equilibrium rate depends on these parameters in a complex manner, the equilibrium kinetics can only be changed in a coarse manner. Furthermore, once the experiment is started, no further control over equilibrium dynamics is available.

対照的に、本発明の実施形態による流体フリー界面実験では、拡散の平衡速度のパラメータもまた、チャンバの寸法を操作すること、およびミクロ流体構造物のチャネルを連結することにより制御され得る。例えば、圧縮チャネルを通じて流体連絡しているリザバを備えるミクロ流体構造物では、物質の高濃度または補充に起因して感知し得る勾配は存在せず、平衡のために必要な時間の良好な近似は、必要な拡散長さと直線的に変化する。平衡速度はまた、連結チャネルの断面積に依存する。平衡に必要な時間は、従って、連結チャネルの長さ、および断面積の両方を変更することにより制御され得る。 In contrast, in fluid-free interface experiments according to embodiments of the present invention, the diffusion equilibrium rate parameter can also be controlled by manipulating the chamber dimensions and coupling the channels of the microfluidic structure. For example, in a microfluidic structure with a reservoir in fluid communication through a compression channel, there is no appreciable gradient due to high concentration or replenishment of the substance, and a good approximation of the time required for equilibration is Varies linearly with the required diffusion length. The equilibrium speed also depends on the cross-sectional area of the connecting channel. The time required for equilibration can therefore be controlled by changing both the length of the connecting channel and the cross-sectional area.

例えば、図４０Ａは、本発明によるミクロ流体構造物の簡単な実施形態の平面図を示す。ミクロ流体構造物９７０１は、第１の流体Ａおよび第２の流体Ｂを含むリザバ９７００および９７０２をそれぞれ備える。リザバ９７００および９７０２は、チャネル９７０４によって連結される。バルブ９７０６は、リザバ９７００と９７０２との間の連結チャネル上に配置される。 For example, FIG. 40A shows a plan view of a simple embodiment of a microfluidic structure according to the present invention. The microfluidic structure 9701 includes reservoirs 9700 and 9702 that include a first fluid A and a second fluid B, respectively. The reservoirs 9700 and 9702 are connected by a channel 9704. Valve 9706 is disposed on the connecting channel between reservoirs 9700 and 9702.

連結チャネル９７０４は、いずれのリザバよりもかなり小さな断面積を有する。例えば、本発明によるミクロ流体構造物の特定の実施形態では、リザバ／チャネル断面積の比、そしてそれ故、２つの流体を分離する断面積の比の最大比は、５００と２５，０００との間に入り得る。この範囲の最小は、５０×１０μｍチャネルに連結された５０×５０×５０μｍチャンバを記載し、そしてこの範囲の最大は、１０×１μｍチャネルに連結された５００×５００×５００μｍチャンバを記載する。 The connecting channel 9704 has a much smaller cross-sectional area than either reservoir. For example, in a particular embodiment of a microfluidic structure according to the present invention, the ratio of the reservoir / channel cross-sectional area, and hence the maximum ratio of the cross-sectional areas separating two fluids, is between 500 and 25,000. Get in between. The minimum of this range describes a 50 × 50 × 50 μm chamber connected to a 50 × 10 μm channel, and the maximum of this range describes a 500 × 500 × 500 μm chamber connected to a 10 × 1 μm channel.

最初に、リザバ９７００および９７０２は個々の流体で満たされ、そしてバルブ９７０６は閉鎖される。バルブ９７０６の開放に際し、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面が生成され、そして流体ＡおよびＢは、この界面を横切り、チャネルを通って個々のリザバ中に拡散する。さらに、１つのリザバ中に存在する拡散物質の量が大きく、そして有意な濃度変化を受けることなく材料を受ける他方のリザバの容量もまた大きい場合、これらリザバ中の物質の濃度は、経時的に感知し得るほど変化せず、そして拡散の定常状態が確立される。 Initially, reservoirs 9700 and 9702 are filled with individual fluids and valve 9706 is closed. Upon opening of valve 9706, a microfluidic free interface according to an embodiment of the present invention is created, and fluids A and B cross this interface and diffuse through the channels into individual reservoirs. Furthermore, if the amount of diffusing material present in one reservoir is large and the volume of the other reservoir that receives material without undergoing a significant concentration change is also large, the concentration of the substance in these reservoirs over time It does not change appreciably and a steady state of diffusion is established.

図４０に示される単純なミクロ流体構造物における流体の拡散は、比較的簡単な等式によって記載され得る。例えば、１つのチャンバから他方への化学種の正味のフラックスは、等式（６）によって単純に記載され得る：
（６）Ｊ＝Ｄ＊Ａ＊ΔＣ／Ｌ；ここで：
Ｊ＝化学種の正味のフラックス
Ｄ＝化学種の拡散定数；
Ａ＝連結チャネルの断面積；
ΔＣ＝２つのチャネル間の濃度差；および
Ｌ＝連結チャネルの長さである。 Fluid diffusion in the simple microfluidic structure shown in FIG. 40 can be described by a relatively simple equation. For example, the net flux of a chemical species from one chamber to the other can be described simply by equation (6):
(6) J = D * A * ΔC / L; where:
J = Net flux of species D = Diffusion constant of species;
A = cross-sectional area of the connecting channel;
ΔC = concentration difference between the two channels; and L = length of the connected channel.

式（６）の項の積分および広範な操作の後、１つの容量Ｖ_１が当初濃度Ｃであり、そして他方の容量Ｖ_２が当初濃度０である２つのチャンバの平衡のための特徴時間τは、従って以下の式（７）に示されるように得られ得る：
（７）τ＝（１／（Ｖ_１／Ｖ_２＋１））＊（１／Ｄ）＊（Ｌ／（Ａ／Ｖ_１））；ここで：τ＝平衡時間；
Ｖ_１＝初期に化学種を含むチャンバの容量；
Ｖ_２＝化学種が拡散して入るチャンバの容量；
Ｄ＝化学種の拡散定数；
Ａ＝連結チャネルの断面積；および
Ｌ＝連結チャネルの長さ、である。 After integration and extensive manipulation of the term in equation (6), the characteristic time τ for the equilibrium of two chambers where one volume V ₁ is the initial concentration C and the other volume V ₂ is the initial concentration 0 Can thus be obtained as shown in equation (7) below:
(7) τ = (1 / (V ₁ / V ₂ +1)) * (1 / D) * (L / (A / V ₁ )); where: τ = equilibrium time;
V ₁ = volume of the chamber initially containing the chemical species;
V ₂ = volume of the chamber into which the chemical species diffuses;
D = species diffusion constant;
A = cross-sectional area of the connecting channel; and L = length of the connecting channel.

従って、規定された容量のチャンバ中のある化学種の所定の初期濃度について、特徴的平衡時間は、拡散長さＬ、および容積に対する断面積の比（以後、単に「面積」という）に依存し、用語「領域」は、関係あるチャンバの容量によって規準化された面積をいうという理解である。２つのチャンバが図４０Ａの構造物中のような、圧縮チャネルによって連結される場合、１つのチャネルから他方への濃度ドロップは、主にこの連結チャネルに沿って起こり、そしてチャンバ中には感知し得る勾配は存在しない。これは、図４０Ｂに示され、図４０Ａの構造物について、濃度対距離の単純化したプロットである。 Thus, for a given initial concentration of a chemical species in a defined volume chamber, the characteristic equilibration time depends on the diffusion length L and the ratio of cross-sectional area to volume (hereinafter simply referred to as “area”). The term “region” is understood to refer to the area normalized by the volume of the chamber concerned. When two chambers are connected by a compression channel, such as in the structure of FIG. 40A, concentration drops from one channel to the other mainly occur along this connection channel and are not sensed in the chamber. There is no gradient to get. This is shown in FIG. 40B and is a simplified plot of concentration versus distance for the structure of FIG. 40A.

図４０Ａのミクロ流体構造物のチャンバ間の拡散の挙動は、例えば、Ｎａｔｉｃｋ，ＭａｓｓのＴｈｅＭａｔｈＷｏｒｋｓＩｎｃ．によって販売されるＭＡＴＬＡＢ（登録商標）ソフトウェアプログラムのＰＤＥツールボックスを利用してモデル化され得る。従って、図４１および４２は、１０００ｕｍの断面積をもつ３００ｕｍ長チャネルを通る、３００ｕｍ×３００ｕｍ×１００ｕｍチャンバから等しい寸法の別のチャンバへの塩化ナトリウムの拡散をシミュレートした結果を示す。これらチャンバの初期濃度は、それぞれ、１Ｍおよび０Ｍである。 The diffusion behavior between the chambers of the microfluidic structure of FIG. 40A is described, for example, by The MathWorks Inc. of Natick, Mass. Can be modeled using the PLAB toolbox of the MATLAB® software program sold by. Thus, FIGS. 41 and 42 show the results of simulating the diffusion of sodium chloride from a 300 um × 300 um × 100 um chamber into another chamber of equal dimensions through a 300 um long channel with a 1000 um cross-sectional area. The initial concentrations of these chambers are 1M and 0M, respectively.

図４１は、１つのリサバ中の濃度が最終平衡濃度の０．６に到達するために必要な時間を、チャネル長さに対してプロットする。図４１は、この単純なミクロ流体システムについて、拡散時間とチャネル長さとの間の直線的関係を示す。 FIG. 41 plots the time required for the concentration in one reservoir to reach a final equilibrium concentration of 0.6 versus channel length. FIG. 41 shows the linear relationship between diffusion time and channel length for this simple microfluidic system.

図４２は、１つのリサバ中の濃度が最終平衡濃度の０．６に到達するために必要な時間（Ｔ_０．６）逆数を、バルブの開放に際し生成される流体界面の面積に対してプロットする。図４２は、これらパラメータ間の直線的関係を示す。平衡時間定数とチャネル長さおよび１／チャネル面積のパラメータととの間の単純な関係は、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散混合の速度を制御するための信頼性があり、かつ直感的方法を可能にする。 FIG. 42 plots the reciprocal time (T _0.6 ) required for the concentration in one reservoir to reach a final equilibrium concentration of 0.6 versus the area of the fluid interface created upon valve opening. To do. FIG. 42 shows a linear relationship between these parameters. The simple relationship between the equilibrium time constant and the channel length and 1 / channel area parameters is reliable for controlling the rate of diffusive mixing across the microfluidic free interface according to embodiments of the present invention, And an intuitive way.

この関係は、１つの試薬が、連結チャネル幾何学によって制御され得る拡散速度で、複数の試薬と拡散により混合されることを可能にする。例えば、図３８Ａは、各々ペアが異なる長さΔｘのミクロチャネル９８０６により連結される配合チャンバ９８００、９８０２、および９８０４のペアの３つのセットを示す。図３８Ｂは、平衡時間対平衡距離をプロットする。図３８Ｂは、図３８Ａのチャンバの平衡のために必要な時間が、連結チャネルの長さによって変化することを示す。 This relationship allows one reagent to be mixed by diffusion with multiple reagents at a diffusion rate that can be controlled by the connecting channel geometry. For example, FIG. 38A shows three sets of blending chamber 9800, 9802, and 9804 pairs, each pair connected by a microchannel 9806 of different length Δx. FIG. 38B plots equilibration time versus equilibration distance. FIG. 38B shows that the time required for equilibration of the chamber of FIG. 38A varies with the length of the connecting channel.

図３９は、各々が異なる配列の連結ミクロチャネル（単数または複数）９９０８を有する４つの配合チャンバ９９００、９９０２、９９０４、および９９０６を示す。ミクロチャネル９９０８は同じ長さを有するが、断面積および／または連結チャネルの数が異なる。平衡の速度は、従って、例えば、連結チャネルの数またはこれらチャネルの寸法を減少／増加することによって、その断面積を減少／増加することにより増加／減少され得る。 FIG. 39 shows four compounding chambers 9900, 9902, 9904, and 9906, each having a different arrangement of connected microchannel (s) 9908. The microchannels 9908 have the same length but differ in cross-sectional area and / or number of connecting channels. The rate of equilibration can thus be increased / decreased by decreasing / increasing its cross-sectional area, for example by decreasing / increasing the number of connecting channels or the dimensions of these channels.

本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散研究の別の望ましい局面は、広範な範囲の位相空間を再現性よく探索する能力である。例えば、推測的に、どの熱力学状態が特定の適用（すなわち、タンパク質結晶の核形成／成長）のために好ましいかを決定することは困難であり得、そしてそれ故、スクリーニング方法が可能な限り多くの位相空間（多くの状態）をサンプリングすることが所望される。これは、複数のアッセイを実施すること、そしてまた、各アッセイの展開の間に間に合ってサンプリングされる位相空間により達成され得る。 Another desirable aspect of microfluidic free interface diffusion studies according to embodiments of the invention is the ability to reproducibly search a wide range of phase spaces. For example, speculatively it can be difficult to determine which thermodynamic state is preferred for a particular application (ie protein crystal nucleation / growth), and therefore screening methods as much as possible It is desirable to sample a lot of phase space (many states). This can be accomplished by performing multiple assays and also by a phase space sampled in time during the development of each assay.

図４３は、異なる相対容量の２つのリザバをもち、そして１に規準化された初期濃度をもつ、図４０に示されるミクロ流体構造物を利用するリゾチームと塩化ナトリウムの対向拡散をシミュレートする結果を示す。図４３は、流体ＡとＢとの間の位相空間を描写する相のダイアグラム、および、流体が図４０中のバルブの開放により生成されるミクロ流体フリー界面を横切って拡散するときのリザバ中で横切られる位相空間中の経路を提示する。ず４３は、サプリングされた位相空間が、２つのリザバ中に含まれる流体の初期相対容量に依存することを示す。異なるサンプル容量をもつチャンバのアレイを利用すること、そして次にチャネルを横切る拡散が所望の結果（すなわち、結晶形成）を生じた事例を識別することにより、有望なさらなる実験の開始点が決定され得る。 FIG. 43 shows the results of simulating counter diffusion of lysozyme and sodium chloride using the microfluidic structure shown in FIG. 40 with two reservoirs of different relative volumes and with an initial concentration normalized to one. Indicates. FIG. 43 is a phase diagram depicting the phase space between fluids A and B, and in the reservoir as the fluid diffuses across the microfluidic free interface created by the opening of the valve in FIG. Present the path in the phase space to be traversed. Z 43 indicates that the sampled phase space depends on the initial relative volume of the fluid contained in the two reservoirs. By utilizing an array of chambers with different sample volumes, and then identifying cases where diffusion across the channel produced the desired result (i.e. crystal formation), a promising starting point for further experiments was determined. obtain.

上記のように、２つのリザバを連結するチャネルの長さまたは断面積を変更することは、複数種が混合される速度を変更する。しかし、チャネル容量が、総反応容量と比較したとき小さいままである限り、位相空間を通るチャンバ中の濃度の展開に対する影響はほとんどないか、または全くない。混合の動力学は、従って、反応の位相空間展開から脱共役され、拡散の動力学的および熱力学的挙動に対して影響が独立の制御を可能にする。 As described above, changing the length or cross-sectional area of the channel connecting the two reservoirs changes the speed at which multiple species are mixed. However, as long as the channel volume remains small when compared to the total reaction volume, there is little or no effect on concentration evolution in the chamber through the phase space. The kinetics of mixing is therefore uncoupled from the phase space evolution of the reaction, allowing independent control over the influence on the kinetic and thermodynamic behavior of diffusion.

例えば、結晶学では、より遅い成長、およびより高い品質の結晶を可能にするように、平衡化を遅延することがしばしば所望される。従来技法では、これは、しばしば、グリセロールのような新たな化学的成分を添加することによるか、または微小バッチを用いることによって試みられている。しかし、成分のこの添加は良好に特徴付けられておらず、常に有効であるとは限らず、そして結晶の形成を阻害し得る。微小バッチ方法もまた、結晶を取り囲む溶液中のタンパク質が枯渇するとき、継続する結晶成長を促進する駆動力を欠く欠点を引き起こし得る。本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散の使用により、結晶形成は、連結チャネルの幅または断面積を単に変更することにより、位相空間展開を改変することなく良好に規定された量によって遅延され得る。 For example, in crystallography, it is often desirable to delay equilibration to allow for slower growth and higher quality crystals. In conventional techniques, this is often attempted by adding a new chemical component such as glycerol or by using a microbatch. However, this addition of ingredients has not been well characterized, is not always effective, and can inhibit crystal formation. Microbatch methods can also cause drawbacks that lack the driving force to promote continued crystal growth when the protein in the solution surrounding the crystal is depleted. Through the use of diffusion across the microfluidic free interface according to embodiments of the present invention, crystal formation is achieved by a well-defined amount without altering the phase space expansion by simply changing the width or cross-sectional area of the connecting channel. Can be delayed.

平衡が進行する速度を制御する能力は、熱力学およびミクロ流体フリー界面拡散混合の両方を保存しながら、反応の合計容量を増加することを望む場合、さらなる重要性を有する。１つのこのような事例は、再び、タンパク質結晶学の文脈で生じ、そこでは、初期の小容量結晶化アッセイが、回折研究のためには不十分なサイズの結晶を生じる。このような場合、反応容量を増加すること、そしてそれによって、同時に同じ拡散混合および位相空間を通る経路を維持しながら、結晶成長のために利用可能なより多くのタンパク質を提供することが所望される。チャンバ容量を比例して増加すること、およびチャネルの面積を減少することにより、総アッセイ容量に対する界面の面積が低減され、そしてより大きな容量が、当初の小容量状態中と同じ位相空間を通過し得る。 The ability to control the rate at which equilibration proceeds has further importance if it is desired to increase the total volume of the reaction while preserving both thermodynamic and microfluidic free interfacial diffusion mixing. One such case again occurs in the context of protein crystallography, where early small volume crystallization assays yield crystals that are insufficiently sized for diffraction studies. In such cases, it is desirable to increase the reaction volume and thereby provide more protein available for crystal growth while simultaneously maintaining a path through the same diffusive mixing and phase space. The By proportionally increasing the chamber volume and decreasing the channel area, the area of the interface relative to the total assay volume is reduced, and the larger volume passes through the same phase space as in the original small volume state. obtain.

上記の説明は単一種の拡散に焦点を当ててきたが、互いに相互作用しない２つ以上の種の勾配が同時に生成され得、そして重ね合わされて濃度状態のアレイを生成する。図４７は、このような重ね合わせ勾配を生成するためのミクロ流体構造物の１つの例の平面図を示す。垂直方向に圧縮された平坦な浅いチャンバ８６００が、その周縁で、化学種ＡおよびＢのそれぞれ固定濃度を有するリザバ８６０２および８６０４に連結されている。リザ
バの形態のシンク８６０６は、種ＡおよびＢが実質的により低い濃度で維持される。初期の一時的な平衡の後、種ＡおよびＢの安定かつ良好に形成された勾配８６０８および８６１０がそれぞれ、二次元で確立される。 Although the above description has focused on single species diffusion, gradients of two or more species that do not interact with each other can be generated simultaneously and superimposed to produce an array of concentration states. FIG. 47 shows a plan view of one example of a microfluidic structure for generating such a superposition gradient. A vertically compressed flat shallow chamber 8600 is connected at its periphery to reservoirs 8602 and 8604 having fixed concentrations of species A and B, respectively. The reservoir form of the sink 8606 maintains species A and B at substantially lower concentrations. After an initial temporary equilibrium, stable and well-formed gradients 8608 and 8610 of species A and B, respectively, are established in two dimensions.

図４７の検査から明らかなように、この濃度勾配の正確な形態およびプロフィールは、これもまたその中に含まれていない化学種に対する濃度シンクとして作用し得る（すなわち、リザバ８６０４は化学種Ａに対するシンクとして作用し得る）、相対位置およびチャンバへの入口の数を含むがこれらに制限されないホストの因子に従って変動する。しかし、チャンバ内の各化学種の空間的濃度プロフィールは、二次元の良好に形成され、かつ連続的な空間的勾配を記載するための先に記載のＭＡＴＬＡＢプログラムを用いて容易にモデル化され得る。 As is apparent from the examination of FIG. 47, the exact form and profile of this concentration gradient can act as a concentration sink for species that are also not contained therein (ie, reservoir 8604 is for species A). Which may act as a sink), and will vary according to host factors including but not limited to relative position and number of inlets to the chamber. However, the spatial concentration profile of each chemical species in the chamber can be easily modeled using the MATLAB program described above to describe two-dimensional well-formed and continuous spatial gradients. .

図４７に示される特定の実施形態は、物質の連続的拡散の不利益を提供する。それ故、拡散種間の反応の産物の拡散を識別することが求められる場合、これら産物は、連続勾配中でそれら自身が拡散し、それによって分析を複雑にする。 The particular embodiment shown in FIG. 47 provides the disadvantage of continuous diffusion of material. Therefore, if it is desired to identify the product diffusion of the reaction between the diffusing species, these products diffuse themselves in a continuous gradient, thereby complicating the analysis.

従って、図４８は、二次元の拡散を達成するためのミクロ流体構造物の代替の実施形態の単純化された平面図を示す。直交するチャネル８７０２を横切るグリッド８７００は、空間的濃度勾配を確立する。固定濃度の化学種ＡおよびＢのリザバ８７０４および８７０８は、グリッド８７００の隣接するエッジ上に配置される。グリッド上のこれらリザバに対向して、より低い濃度の化学薬品の２つのシンク８７０３が対向するリザバ中に存在する。 Accordingly, FIG. 48 shows a simplified plan view of an alternative embodiment of a microfluidic structure to achieve two-dimensional diffusion. A grid 8700 across orthogonal channels 8702 establishes a spatial concentration gradient. Fixed concentrations of species A and B reservoirs 8704 and 8708 are placed on adjacent edges of grid 8700. Opposing these reservoirs on the grid, two sinks 8703 of lower concentration chemicals are present in the opposing reservoirs.

各チャネル連結部８７１０を取り囲んで、グリッドを垂直方向および水平方向に通る拡散を制御する２対のバルブ８７１２および８７１４がそれぞれある。最初、バルブペア８７１４のみが開かれ、水平方向に第１の化学薬品の良好に形成された拡散勾配を生成する。次に、バルブペア８７１４が閉鎖され、そしてバルブペア８７１２が開放されて垂直方向に第２の化学薬品の良好に形成された拡散勾配を生成する。隣接する水平方向バルブにより単離されて、第１の化学種の勾配は、これら連結部の間の領域中に存在して残る。 Surrounding each channel connection 8710 are two pairs of valves 8712 and 8714, respectively, that control diffusion through the grid in the vertical and horizontal directions. Initially, only valve pair 8714 is opened, producing a well-formed diffusion gradient of the first chemical in the horizontal direction. Next, valve pair 8714 is closed and valve pair 8712 is opened to produce a well-formed diffusion gradient of the second chemical in the vertical direction. Isolated by adjacent horizontal valves, the gradient of the first species remains present in the region between these junctions.

一旦、第２（垂直）勾配が確立されると、これら２つの勾配は組み合わせられ、そしてすべてのバルブペアを短時間開放することにより、部分的拡散平衡を可能にする。拡散の期間が通過した後、重ね合わせた勾配を含むためにすべてのバルブペアが閉鎖される。あるいは、バルブペア８７１２および８７１４は、別個の単離されたチャンバを生成するためにすべての第２の水平方向バルブを開放し、垂直方向の拡散を停止するために閉鎖され得る。 Once the second (vertical) gradient is established, these two gradients are combined and allow partial diffusion equilibrium by opening all valve pairs for a short time. After the diffusion period has passed, all valve pairs are closed to include the superimposed gradient. Alternatively, valve pairs 8712 and 8714 can be closed to open all second horizontal valves to create separate isolated chambers and to stop vertical diffusion.

要約すれば、従来の巨視的ミクロ流体フリー界面技法は、ｍｍのオーダーの寸法を有するキャピラリーチューブまたはその他のコンテナを採用する。対照的に、本発明の実施形態による流体界面は、μｍのオーダーの寸法を有するミクロチャネル中で形成される。このように小さな寸法では、所望されない対流は、粘度の影響に起因して抑制され、そして混合は拡散によって支配される。良好に形成された流体界面は、それ故、有意な所望されない対流混合なくして確立され得る。 In summary, conventional macroscopic microfluidic free interface techniques employ capillary tubes or other containers having dimensions on the order of mm. In contrast, fluid interfaces according to embodiments of the present invention are formed in microchannels having dimensions on the order of μm. At such small dimensions, undesired convection is suppressed due to viscosity effects and mixing is dominated by diffusion. A well-formed fluid interface can therefore be established without significant undesired convective mixing.

（３．溶解度研究（プロテオミクス））
上記の論議は、タンパク質結晶化のためのフリー界面拡散の適用に焦点を当てており、ここでは、タンパク質サンプルを含む溶媒の環境は、ミクロ流体フリー界面を横切る結晶化剤の拡散によって改変され、タンパク質の相および結晶の形成における変化を生じた。しかし、このような結晶化研究への重要な前駆体は、このタンパク質が十分に可溶性かつ単一分散で、結晶化剤への曝露に際し結晶を形成する溶液を識別かつ得ていることである
。 (3. Solubility Research (Proteomics))
The above discussion focuses on the application of free interface diffusion for protein crystallization, where the solvent environment containing the protein sample is modified by diffusion of the crystallizing agent across the microfluidic free interface, Changes in protein phase and crystal formation occurred. However, an important precursor to such crystallization studies is that the protein is sufficiently soluble and monodisperse to identify and obtain a solution that forms crystals upon exposure to a crystallizing agent.

従って、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散のための代替の適用は、種々の溶媒中のタンパク質の溶解度を決定することである。詳細には、フリーのミクロ流体界面は、タンパク質サンプルへの溶媒の流れを計測するため、そしてそれ故、タンパク質の溶解度特徴を識別するために利用され得る。詳細には、フリーのミクロ流体界面の存在は、既知容量のチャネルに沿った均一かつ正確な濃度勾配を生成し得、それによって、研究者が、溶液中に入るタンパク質サンプルの既知量の能力を正確に識別することを可能にする。この情報は、次に、結晶を次に形成し易い濃縮されたタンパク質溶液の生成を可能にするために利用され得る。 Thus, an alternative application for microfluidic free interface diffusion according to embodiments of the present invention is to determine the solubility of proteins in various solvents. In particular, a free microfluidic interface can be utilized to measure the flow of solvent to a protein sample and therefore to identify the solubility characteristics of the protein. Specifically, the presence of a free microfluidic interface can generate a uniform and accurate concentration gradient along a known volume of the channel, thereby enabling researchers to know the ability of a known amount of protein sample to enter solution. Enables accurate identification. This information can then be utilized to enable the production of a concentrated protein solution that is then likely to form crystals.

（４．準透析によるサンプル精製）
上記の論議は、サンプルおよび溶媒の相対量が正確に制御され、溶液中のサンプルの濃度を、そしてそれ故、サンプルが溶液から固体である結晶形態に出現する性向を支配する、タンパク質結晶化およびプロテオミクス溶解度適用に関して焦点を当ててきた。しかし、サンプル濃度以外の多くの因子もまた、サンプル挙動において重要な役割を演じ得る。 (4. Sample purification by semi-dialysis)
The above discussion suggests that the relative amounts of sample and solvent are precisely controlled, governing the concentration of the sample in solution, and hence the propensity for the sample to appear in a crystalline form that is solid from solution. There has been a focus on proteomic solubility applications. However, many factors other than sample concentration can also play an important role in sample behavior.

１つのこのような因子はサンプル純度である。タンパク質単離および／または精製のための多くの一般的プロセスの１つのアーチファクトは、サンプルとの小塩の濃度である。これらの塩は、溶液中でタンパク質を安定化し得、そしてそうでなければ、結晶の核形成および成長を妨害する。これらの塩を除去するための１つの従来のアプローチは、膜を横切る透析による。しかし、このアプローチは、代表的には、巨視的スケールで起こり、比較的大きなサンプル容量の使用を含み、かつ、塩のバルク量の粗い除去を含む。 One such factor is sample purity. One artifact of many common processes for protein isolation and / or purification is the concentration of small salts with the sample. These salts can stabilize proteins in solution and otherwise interfere with crystal nucleation and growth. One conventional approach to remove these salts is by dialysis across the membrane. However, this approach typically occurs on a macroscopic scale, involves the use of a relatively large sample volume, and involves the rough removal of bulk amounts of salt.

従って、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散のなお別の代替の適用は、サンプル溶液からの所望されない成分の除去にある。例えば、小塩の有意な濃度を含む単離および／または精製されたタンパク質を含む溶液が、バルブの１つの側にあるミクロ流体チャネル中に位置決めされ得る。バルブの作動を止めるに際し、タンパク質溶液と希釈剤との間のミクロ流体フリー界面が、より少ない塩が希釈剤中に迅速に拡散し、そしてそれによってサンプル中で枯渇されるように生成され得る。勿論、サンプル中に存在する特定量のタンパク質はまた、ミクロ流体フリー界面を横切って拡散することが予期され、そしてそれによって、このプロセスの間に希釈剤に失われ得る。しかし、小塩と大きなタンパク質分子との間のサイズにおける相違は、相対的拡散を束縛し、サンプル中のタンパク質の損失を制限することが期待され得る。 Thus, yet another alternative application of microfluidic free interface diffusion according to embodiments of the present invention is in the removal of unwanted components from the sample solution. For example, a solution containing isolated and / or purified protein containing a significant concentration of small salt can be positioned in a microfluidic channel on one side of the valve. Upon shutting off the valve, a microfluidic free interface between the protein solution and the diluent can be created so that less salt diffuses rapidly into the diluent and is thereby depleted in the sample. Of course, the specific amount of protein present in the sample is also expected to diffuse across the microfluidic free interface and thereby be lost to the diluent during this process. However, differences in size between small salts and large protein molecules can be expected to constrain relative diffusion and limit protein loss in the sample.

（５．タンパク質以外の結晶の成長）
本発明による実施形態は、これまでは、タンパク質のような生物学的高分子の結晶の成長に焦点を当ててきた。しかし、その三次元構造が研究され得る他のタイプの分子もまた、結晶を形成し得る。１つのこのような結晶形成のための有望な候補は、単一原子を包括するために利用され得る無機ナノ結晶である。 (5. Growth of crystals other than proteins)
Embodiments according to the present invention have so far focused on the growth of crystals of biological macromolecules such as proteins. However, other types of molecules whose three-dimensional structure can be studied can also form crystals. One promising candidate for such crystal formation is inorganic nanocrystals that can be utilized to encompass single atoms.

最近、科学コミュニティは、無機物質からナノ結晶を成長することに興味を示している。このような結晶は、ナノメートルスケールの寸法を有し、そしていくつかの例は、個々の原子を囲み得る。これらの結晶は、量子機械的影響によって支配される光の吸収および発光のような光学的性質を示す。これらの光学的性質は、結晶のサイズおよび質のような因子、およびそれによって囲まれる原子種の同一性に従って制御または変化され得る。 Recently, the scientific community has shown interest in growing nanocrystals from inorganic materials. Such crystals have dimensions on the nanometer scale, and some examples can surround individual atoms. These crystals exhibit optical properties such as light absorption and emission that are dominated by quantum mechanical effects. These optical properties can be controlled or varied according to factors such as crystal size and quality, and the identity of the atomic species surrounded thereby.

タンパク質結晶でのように、このようなナノ結晶のサイズおよび質は、大きな程度でそれが成長される状態に依存する。従って、相空間展開、およびナノ結晶の成長の間のこの展開の速度の両方を制御することが重要であることが証明され得る。このような制御は、タンパク質結晶化と組み合わせて先に記載されたように、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散を利用して達成され得る。 As with protein crystals, the size and quality of such a nanocrystal depends to a large extent on the state in which it is grown. Therefore, it can prove important to control both the phase space evolution and the rate of this evolution during nanocrystal growth. Such control can be achieved utilizing microfluidic free interfacial diffusion according to embodiments of the present invention, as previously described in combination with protein crystallization.

さらに、特定の場合には、結晶化の１つの要素の濃度を変化する結晶性質に対する影響を決定する重要性が証明され得る。これは、いずれかの端部における大きなリサバとともに（または、単に２つの大きなリザバを連結するチャネルに沿って）、連結チャンバの列による勾配をセットアップすることにより、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散を用いて達成され得る。次いで、結晶が各状態で（または状態の連続体に沿って）成長され、そして次にそれらの吸収／発光性質が尋問される。このようにして、単一の結晶化パラメータ（サンプルの濃度、結晶化剤、沈殿剤、またはいくつかのその他の種）を独立に変化させることが可能である。 Furthermore, in certain cases, the importance of determining the effect on crystal properties of changing the concentration of one element of crystallization can be demonstrated. This can be done with a large reservoir at either end (or simply along the channel connecting two large reservoirs), by setting up a gradient with a row of connected chambers, free of microfluidics according to embodiments of the present invention. It can be achieved using interfacial diffusion. Crystals are then grown in each state (or along a continuum of states) and then their absorption / emission properties are interrogated. In this way, a single crystallization parameter (sample concentration, crystallization agent, precipitating agent, or some other species) can be varied independently.

チップ上に異なる光学的性質をもつナノ結晶の空間的分布を成長することもまた可能である。 It is also possible to grow a spatial distribution of nanocrystals with different optical properties on the chip.

（６．拡散免疫アッセイ）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面の可能な価値ある別の適用は、標的への分析物の結合の分析である。従来は、分析物の標的への結合は、対流流れにおける分析物または標的単独のいずれかに対する分析物／標的組み合わせの変化した速度が、結合された組み合わせの存在を識別するために採用されるクロマトグラフィーのような技法により決定されている。 (6. Diffusion immunoassay)
Another possible and valuable application of microfluidic free interfaces according to embodiments of the present invention is the analysis of analyte binding to a target. Traditionally, binding of an analyte to a target is a chromatograph in which the altered rate of the analyte / target combination for either the analyte in the convection flow or the target alone is employed to identify the presence of the combined combination. It is determined by techniques such as graphy.

本発明による実施形態は、標的への分析物の結合がまた、分析物または標的単独のいずれかに対する分析物／標的組み合わせの変化したサイズ、そしてそれ故拡散の係数を生じるという事実を開拓する。この変化した拡散係数は、結合した組み合わせを識別するために利用され得る。 Embodiments according to the present invention pioneer the fact that the binding of an analyte to a target also results in an altered size of the analyte / target combination for either the analyte or the target alone, and hence the coefficient of diffusion. This altered diffusion coefficient can be utilized to identify the combined combination.

図６２Ａは、本発明よるミクロ流体フリー界面を横切る拡散を検出し得るデバイスの１つの実施形態の単純化した平面図を示す。流体ＡおよびＢを含むチャンバ８０００および８００２は、それぞれ、少なくとも１つの寸法が制限されている幅を有するチャネル８００４によって連結されている。最初は閉じているバルブ８００６が、チャネル８００４内に位置決めされ、流体ＡおよびＢを分離して維持する。チャンバ８００３は、連結チャネル８００５を通じてチャンバ８００２と流体連絡しており、そしてまた流体Ｂを含む。 FIG. 62A shows a simplified plan view of one embodiment of a device capable of detecting diffusion across a microfluidic free interface according to the present invention. Chambers 8000 and 8002 containing fluids A and B are each connected by a channel 8004 having a width that is limited in at least one dimension. Initially closed valve 8006 is positioned in channel 8004 to keep fluids A and B separate. Chamber 8003 is in fluid communication with chamber 8002 through connection channel 8005 and also contains fluid B.

第１の流体Ａは、制限されないで、蛍光、屈折率、電導度、光散乱、および比色センサの使用での変化を検出することを含む、分析技法により検出可能な分析物８００８を含む。第２の流体Ｂは、分析物８００８に結合することが知られる標的８０１０を含む。分析物８００８の標的８０１０への結合に際し、分析物／標的組み合わせは、分析物単独のそれに対して実質的に減少した拡散の係数を示す。 The first fluid A includes an analyte 8008 that is detectable by analytical techniques, including but not limited to detecting changes in fluorescence, refractive index, conductivity, light scattering, and use of colorimetric sensors. Second fluid B includes a target 8010 that is known to bind to analyte 8008. Upon binding of analyte 8008 to target 8010, the analyte / target combination exhibits a substantially reduced diffusion coefficient relative to that of analyte alone.

最初の時間Ｔ_０において、バルブ８００６は開かれ、流体ＡとＢとの間にミクロ流体フリー界面８０１２を生成する。時間Ｔ_１で始まり、分析物８００８は、チャネル８００４、チャンバ８００２、およびチャネル８００５を通り、チャンバ８００３中に拡散し始める。分析物８００８と標的８０１０との間に結合反応がないと、分析物は、経時的に、所定の速度で末端チャンバ８００３中に出現し始めることが予期され得る。これは、図６２Ｂに示され、これは、拡散の時間に対する末端チャンバ８００３中で検出されることが予期される信号の強度をプロットする。 At the first time T ₀ , valve 8006 is opened, creating a microfluidic free interface 8012 between fluids A and B. Beginning at time T ₁ , analyte 8008 begins to diffuse through channel 8004, chamber 8002, and channel 8005 into chamber 8003. Without a binding reaction between the analyte 8008 and the target 8010, it can be expected that the analyte will begin to appear in the end chamber 8003 at a predetermined rate over time. This is shown in FIG. 62B, which plots the intensity of the signal expected to be detected in the end chamber 8003 against the time of diffusion.

しかし、チャネル中で、ある程度の反応が分析物８００８と標的８０１０との間で生じるので、ある％の分析物８００８が標的８０１０に結合し、この％の分析物の拡散の速度を効率的に遅延する。結果として、末端チャンバ中の信号の観察された強度は、経時的に減少し、結合した分析物／標的組み合わせのより遅い拡散の速度を反映する。これはまた図６２Ｂ中に示され、これは、拡散の時間に対する第２のチャンバ中で観察された信号の強度をプロットする。 However, since some reaction occurs between the analyte 8008 and the target 8010 in the channel, some% analyte 8008 binds to the target 8010 and effectively slows the rate of diffusion of this% analyte. To do. As a result, the observed intensity of the signal in the end chamber decreases over time, reflecting the slower rate of diffusion of the bound analyte / target combination. This is also shown in FIG. 62B, which plots the intensity of the signal observed in the second chamber against the time of diffusion.

予期される信号と観察された信号との間の差異は、経時的に分析され、流体システムに関する潜在的に価値ある情報を示す。例えば、個々の溶液中の標的および分析物の濃度が既知である場合、強度信号の経時的な展開の分析は、標的と分析物との間の反応性、すなわち、分析物が標的に結合し、そして結果としてその拡散が遅延される速度を示し得る。あるいは、標的と分析物との間の反応性が既知である場合、強度信号の時間展開の分析は、標的の初期濃度を示し得る。さらに、それに代わって、初期濃度および反応性が既知である場合、強度信号の時間展開は、標的のサイズを示し得、これは分析物単独に対する分析物／標的組み合わせの減少した拡散速度によって表される。 The difference between the expected signal and the observed signal is analyzed over time and indicates potentially valuable information about the fluid system. For example, if the concentration of target and analyte in an individual solution is known, analysis of the evolution of the intensity signal over time is the reactivity between the target and the analyte, i.e. the analyte binds to the target. , And as a result may indicate the rate at which the diffusion is delayed. Alternatively, if the reactivity between the target and the analyte is known, the analysis of the time evolution of the intensity signal can indicate the initial concentration of the target. Further, alternatively, if the initial concentration and reactivity are known, the time evolution of the intensity signal may indicate the size of the target, which is represented by the reduced diffusion rate of the analyte / target combination relative to the analyte alone. The

まさに提供された例は、拡散する分析物からの信号の強度の時間展開の分析を利用した。しかし、本発明による実施形態は、この特定のアプローチに制限されない。 The example just provided utilized an analysis of the time evolution of the intensity of the signal from the diffusing analyte. However, embodiments according to the present invention are not limited to this particular approach.

例えば、図６３Ａは、拡散アッセイにおける使用のための構造の代替実施形態を示す。構造物８１００は、バルブ８１０４によって二分される一定幅および深さのミクロ流体８１０２を備える。検出可能な分析物８１０６を含む流体Ａは、バルブ８１０４の１つの側に位置決めされる。標的８１０８をも含む流体Ｂは、バルブ８１０４の他方の側に位置決めされる。 For example, FIG. 63A shows an alternative embodiment of a structure for use in a diffusion assay. The structure 8100 comprises a constant width and depth microfluid 8102 that is bisected by a valve 8104. Fluid A containing detectable analyte 8106 is positioned on one side of valve 8104. Fluid B, which also includes target 8108, is positioned on the other side of valve 8104.

開始時間Ｔ_０において、バルブ８１０４は開放され、流体ＡとＢとの間にミクロ流体フリー界面８１１０を生成する。時間Ｔ_１で始まり、分析物８１０６は、界面８１１０を横切って拡散し始める。分析物８１０６と標的８１０８との間に結合反応がないと、特定の時間の後、チャネルの距離に対する信号の強度のプロフィールは、特徴的な形状を示すことが予期され得る。これは、図６３Ｂに示され、これは、拡散の時間に対する第２のチャンバ中で検出されることが予期される信号の強度をプロットする。 At start time T ₀ , valve 8104 is opened, creating a microfluidic free interface 8110 between fluids A and B. Beginning at time T ₁ , analyte 8106 begins to diffuse across interface 8110. Without a binding reaction between the analyte 8106 and the target 8108, after a certain time, the signal intensity profile versus channel distance can be expected to exhibit a characteristic shape. This is shown in FIG. 63B, which plots the intensity of the signal expected to be detected in the second chamber against the time of diffusion.

しかし、ある程度の反応が分析物８１０６と標的８１０８との間で生じるので、ある％の分析物が標的に結合し、この％の分析物の拡散の速度を効率的に遅延する。結果として、チャンバ中の後期における信号の観察された強度は変化し得、結合した分析物／標的組み合わせのより遅い拡散の速度を反映する。これはまた図６３Ｂに示され、これは、拡散の距離に対する第２のチャンバ中で観察された信号の強度をプロットする。 However, since some reaction occurs between the analyte 8106 and the target 8108, some% analyte binds to the target, effectively slowing the rate of diffusion of this% analyte. As a result, the observed intensity of the signal late in the chamber can vary, reflecting the slower rate of diffusion of the bound analyte / target combination. This is also shown in FIG. 63B, which plots the intensity of the signal observed in the second chamber against the distance of diffusion.

図６３Ａ〜Ｂ中に示される実施形態でのように、距離に対する予期される信号と観察された信号との間の差異は、潜在的に価値ある情報を示すために分析され得る。例えば、個々の溶液中の標的および分析物の濃度が既知である場合、強度信号の空間的展開の分析は、標的と分析物との間の反応性、すなわち、分析物が標的に結合し、そして結果としてその拡散が遅延される速度を示し得る。あるいは、標的と分析物との間の反応性が既知である場合、強度信号の空間的展開の分析は、標的の初期濃度を示し得る。さらに、それに代わって、初期濃度および反応性が既知である場合、強度信号の空間的展開は、標的の質量を示し得、これは分析物単独に対する分析物／標的組み合わせの減少した拡散速度によって表される。 As in the embodiment shown in FIGS. 63A-B, the difference between the expected and observed signals for distance can be analyzed to show potentially valuable information. For example, if the concentration of the target and analyte in an individual solution is known, analysis of the spatial evolution of the intensity signal can be performed by measuring the reactivity between the target and the analyte, i.e. And as a result, it can indicate the rate at which the diffusion is delayed. Alternatively, if the reactivity between the target and the analyte is known, analysis of the spatial evolution of the intensity signal can indicate the initial concentration of the target. Further, instead, if the initial concentration and reactivity are known, the spatial evolution of the intensity signal may indicate the target mass, which is represented by the reduced diffusion rate of the analyte / target combination relative to the analyte alone. Is done.

（７．粘度測定）
上記の論議は、既知の状態下でミクロ流体フリー界面を横切るサンプルの拡散に基づく濃度または反応性のような化学的サンプルの性質を識別することに焦点を当てた。本発明の代替の実施形態によれば、しかし、流体内で拡散するサンプルよりむしろ、拡散が生じている流体の性質が、フリーミクロ流体界面を横切る拡散の性質を観察することによって決定され得る。 (7. Viscosity measurement)
The above discussion has focused on identifying chemical sample properties such as concentration or reactivity based on diffusion of the sample across the microfluidic free interface under known conditions. According to an alternative embodiment of the present invention, however, the nature of the fluid in which diffusion occurs rather than the sample diffusing in the fluid can be determined by observing the nature of the diffusion across the free microfluidic interface.

例えば、粘度を測定することへの１つの従来のアプローチは、サンプル流体をも含む閉鎖ベッセル中へのピストンの挿入すること、および次に、このベッセル中でピストンを回転するために必要なトルクを測定することを必要とする。このアプローチは、より大きな流体サンプルの粘度を測定するためには適切であるが、それは、比較的大きな容量のサンプル流体を必要かつ消費するという不利益を提供する。このような容量は、特に、生物学的分析の文脈では、分析のために入手可能ではないかも知れない。 For example, one conventional approach to measuring viscosity is to insert the piston into a closed vessel that also contains the sample fluid, and then to provide the torque required to rotate the piston in this vessel. Need to measure. While this approach is suitable for measuring the viscosity of larger fluid samples, it provides the disadvantage of requiring and consuming a relatively large volume of sample fluid. Such a volume may not be available for analysis, particularly in the context of biological analysis.

本発明の代替の実施形態によれば、流体内で生成されるミクロ流体フリー界面を横切る既知のサイズおよび拡散係数のマーカー（すなわち、蛍光標識されたビーズまたは高分子）の拡散が、その粘度を決定するために利用され得る。このような技法は、生物学的または生理学的サンプルの粘度の分析に特に適用かのうである。なぜなら、拡散が生じるミクロ流体チャネルの寸法が比較的小容量を占めるからである。 According to an alternative embodiment of the present invention, diffusion of a marker of known size and diffusion coefficient (ie, a fluorescently labeled bead or polymer) across a microfluidic free interface created in the fluid reduces its viscosity. Can be used to determine. Such techniques are particularly applicable to the analysis of the viscosity of biological or physiological samples. This is because the dimensions of the microfluidic channel where diffusion occurs occupies a relatively small volume.

（８．競合結合アッセイ）
上記で論議された拡散免疫アッセイとは異なるタイプのアッセイは、競合結合アッセイである。競合結合アッセイは、タンパク質のような標的分子に結合される現存するリガンドを置換する競合リガンドの性向を決定する。この置換傾向は、元のリガンド／標的分子組み合わせを、競合リガンドと、種々の濃度で混合することにより決定され得る。従来は、このような結合アッセイは、適切な濃度範囲を十分な分解度でカバーするために多数の別個の実験を必要としている。 (8. Competitive binding assay)
A different type of assay than the diffusion immunoassay discussed above is a competitive binding assay. Competitive binding assays determine the propensity of a competitive ligand to replace an existing ligand that is bound to a target molecule, such as a protein. This displacement tendency can be determined by mixing the original ligand / target molecule combination with competing ligands at various concentrations. Traditionally, such binding assays require a large number of separate experiments to cover the appropriate concentration range with sufficient resolution.

しかし、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散は、多数のアッセイ状態が一度にサンプリングされ得るように、連続的または別個の勾配を確立することを可能にする。例えば、本発明の１つの実施形態によれば、競合結合アッセイが、チャネルによって連結されるチャンバの列で生成される競合リガンド濃度の個別の勾配を利用して実施され得る。 However, diffusion across a microfluidic free interface according to embodiments of the present invention allows to establish a continuous or discrete gradient so that multiple assay states can be sampled at once. For example, according to one embodiment of the present invention, a competitive binding assay can be performed utilizing a separate gradient of competing ligand concentration generated in a row of chambers connected by a channel.

このアプローチは図６５に示され、これは、狭いチャネル８３０２によって連結され、そしてリザバ８３０４と８３０６との間に位置決めされたチャンバ８３００ａ〜ｃの列を示す。リザバ８３０４は高濃度の競合リガンド８３０８を含み、そしてリザバ８３０６は、競合リガンドを含まない。リザバからまたは互いからのチャンバ８３００ａ〜ｃの各々中への流れは、連結チャネル８３０２中に位置決めされたバルブ８３０５によって独立に制御され得る。チャンバの列のいずれかの末端における濃度は、チャンバに対するリザバの大容量によって、またはリザバへの物質の連続的流れによって固定され得る。 This approach is illustrated in FIG. 65, which shows a row of chambers 8300a-c connected by a narrow channel 8302 and positioned between reservoirs 8304 and 8306. The reservoir 8304 contains a high concentration of competing ligand 8308, and the reservoir 8306 does not contain competing ligand. The flow into each of the chambers 8300a-c from the reservoir or from each other can be independently controlled by a valve 8305 positioned in the connecting channel 8302. The concentration at either end of the chamber row can be fixed by the large volume of reservoir to the chamber or by the continuous flow of material to the reservoir.

最初は、列中のチャンバは、標的８３１２に結合した元のリガンド８３１０の特定濃度を含む第１の流体で充填される。次に、チャンバ８３００ａ〜ｃが、界面バルブ８３０５を開くことにより、リザバおよび互いとの流体連絡に置かれる。一旦、これらの界面バルブが開放されると、チャンバ間にミクロ流体フリー界面が確立され、そして溶液は拡散により平衡化する。列に沿った各チャンバの位置は、その特定のチャンバ内の競合リガンドの濃度を決定する。 Initially, the chambers in the row are filled with a first fluid containing a specific concentration of the original ligand 8310 bound to the target 8312. The chambers 8300a-c are then placed in fluid communication with the reservoir and each other by opening the interface valve 8305. Once these interface valves are opened, a microfluidic free interface is established between the chambers and the solution equilibrates by diffusion. The position of each chamber along the row determines the concentration of competing ligand within that particular chamber.

競合リガンドは、代表的には、標的分子よりかなり小さく、そしてそれ故、迅速に平衡化する。競合リガンドによって標的から置換された元のリガンドは遊離し、標的チャンバから別のチャンバに拡散する。リガンド／標的組み合わせに対して元のリガンドの減少したサイズのために、置換された元のリガンドは、より大きな拡散係数を示し、そしてそれ故、より速い速度で拡散することが予期され得る。図６２Ａ〜Ｂおよび６３Ａ〜Ｂと組み
合わせて上記で記載されたのと類似の様式で、元のリガンドが蛍光を発すれば、その存在、そしてそれ故、標的からの置換の速度は、予期される時間的または空間的プロフィールからの偏差について蛍光信号を分析することにより示され得る。 Competing ligands are typically much smaller than the target molecule and therefore equilibrate rapidly. The original ligand displaced from the target by the competing ligand is released and diffuses from the target chamber to another chamber. Due to the reduced size of the original ligand relative to the ligand / target combination, the displaced original ligand exhibits a larger diffusion coefficient and can therefore be expected to diffuse at a faster rate. If the original ligand fluoresces in a manner similar to that described above in combination with FIGS. 62A-B and 63A-B, its presence, and hence the rate of displacement from the target, is expected. It can be shown by analyzing the fluorescence signal for deviations from the temporal or spatial profile.

まさに記載された実施形態は、蛍光信号の位置における変化を経時的にモニターし、競合的結合を識別するが、本発明の代替の実施形態によれば、蛍光信号の強度における減少がまた、競合結合アッセイを実施するために検出され得る。詳細には、蛍光リガンドが、消光分子の存在下で利用され得る。蛍光分子は、それが別の分子と相互作用し、蛍光発光を抑制するとき消光される。 Although the just described embodiment monitors changes in the position of the fluorescent signal over time and identifies competitive binding, according to an alternative embodiment of the invention, a decrease in the intensity of the fluorescent signal is also Can be detected to perform a binding assay. In particular, fluorescent ligands can be utilized in the presence of quenching molecules. A fluorescent molecule is quenched when it interacts with another molecule and suppresses fluorescence emission.

図６６は、消光物質を利用する競合結合アッセイを実施するためのミクロ流体システムの単純化した実施形態の平面図である。第１のチャンバ８４００は、標的分子８４０２、第１の蛍光リガンド８４０４、および消光分子８４０６を含む。第１のチャンバ８４００は、ミクロ製作チャネル８４０８を経由して、競合リガンド８４１２、および同じ濃度の標的分子８４０２、第１の蛍光リガンド８４０４、および第１のチャンバ８４００中に存在するような消光分子８４０６を含む第２のチャンバ８４１０に連結される。 FIG. 66 is a plan view of a simplified embodiment of a microfluidic system for performing a competitive binding assay utilizing a quencher. First chamber 8400 includes target molecule 8402, first fluorescent ligand 8404, and quencher molecule 8406. The first chamber 8400 passes through the microfabrication channel 8408 through the competitive ligand 8412 and the quenching molecule 8406 as present in the same concentration of the target molecule 8402, the first fluorescent ligand 8404, and the first chamber 8400. Is coupled to a second chamber 8410 including:

第１の蛍光リガンド８４０４が標的８４０２に結合されるとき、それは、消光分子と相互作用することができず、そしてそれ故、蛍光発光が観察され得る。しかし、第１の蛍光リガンドが標的に結合しないとき、それは消光されて、そしてそれ故、蛍光発光は観察されない。このようにして、蛍光信号強度における減少は、競合結合挙動を示し得る。 When the first fluorescent ligand 8404 is bound to the target 8402, it cannot interact with the quenching molecule and therefore fluorescence emission can be observed. However, when the first fluorescent ligand does not bind to the target, it is quenched and therefore no fluorescence emission is observed. In this way, a decrease in fluorescence signal intensity can indicate a competitive binding behavior.

当初はチャンバ８４００および８４１０の内容物を分離するバルブ８４１４は開放され、ミクロ流体フリー界面８４１４を生成し、そして拡散により２つの流体を混合する。これら流体は、第２のチャンバ中の競合リガンドの存在を除いて同一であるので、競合リガンドのみが、チャンバ間の正味の拡散輸送を経験し、そしてチャンバ間に直線状勾配を確立する。チャネルの異なる部分に沿った蛍光強度を観察することにより、第１の蛍光リガンドを置換するために必要な競合リガンドの濃度が決定され得る。あるいは、経時的な末端チャンバ中の蛍光のレベルがモニターされ、標的から第１の蛍光リガンドを置換するために必要な競合リガンドの濃度を決定し得る。いずれかの方法を用い、単一の実験が採用されて、状態の連続体下の競合結合アッセイの結果を決定し得る。 Initially, the valve 8414 that separates the contents of the chambers 8400 and 8410 is opened, creating a microfluidic free interface 8414 and mixing the two fluids by diffusion. Since these fluids are identical except for the presence of competing ligands in the second chamber, only competing ligands experience net diffusive transport between the chambers and establish a linear gradient between the chambers. By observing the fluorescence intensity along different parts of the channel, the concentration of competing ligand required to displace the first fluorescent ligand can be determined. Alternatively, the level of fluorescence in the end chamber over time can be monitored to determine the concentration of competing ligand required to displace the first fluorescent ligand from the target. Using either method, a single experiment can be employed to determine the results of a competitive binding assay under a continuum of states.

（９．基質／インヒビターアッセイ）
酵素の活性は、異なる濃度のリガンドの存在に応答して測定され得る。例えば、反応を触媒するタンパク質は、タンパク質の活性部位に強く結合する小分子によって損なわれ得る。基質代謝回転アッセイは、酵素活性に対するこのようなリガンドの影響を決定するために用いられ得る。 (9. Substrate / inhibitor assay)
The activity of the enzyme can be measured in response to the presence of different concentrations of ligand. For example, proteins that catalyze reactions can be compromised by small molecules that bind strongly to the active site of the protein. Substrate turnover assays can be used to determine the effect of such ligands on enzyme activity.

酵素が蛍光産物を生成する反応を触媒する場合、この酵素の活性は、蛍光をモニターすることにより決定され得る。蛍光を生成する反応の触媒の１つの例は、酵素β−ガラクトシダーゼによるβ−Ｄ−ガラクトピラノシドのレゾルフィンへの加水分解である。レゾルフィンは、経時的にモニターされ得る蛍光産物である。Ｒａｍｓｅｙら、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍ．６９、３４０７〜３４１２（１９９７）。阻害分子の濃度の関数として酵素の活性を決定することにより、反応のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ速度定数が決定され得る。本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面を横切る拡散勾配の生成は、単一の実験におけるこの濃度依存性の決定を可能にし得る。 If the enzyme catalyzes a reaction that produces a fluorescent product, the activity of the enzyme can be determined by monitoring fluorescence. One example of a catalyst for a reaction that produces fluorescence is the hydrolysis of β-D-galactopyranoside to resorufin by the enzyme β-galactosidase. Resorufin is a fluorescent product that can be monitored over time. Ramsey et al., Analytical Chem. 69, 3407-3412 (1997). By determining the activity of the enzyme as a function of the concentration of the inhibitor molecule, the Michaelis-Menten rate constant of the reaction can be determined. Generation of a diffusion gradient across a microfluidic free interface according to embodiments of the present invention may allow determination of this concentration dependence in a single experiment.

図６７は、このような基質代謝回転アッセイを実施するためのミクロ流体構造物の実施形態の単純化した平面図を示す。ここで再び、リザバ８５００および８５０２は、チャンバの寸法よりかなり小さな幅を有するチャネル８５０４によって連結される。リザバ８５００および８５０２は、基質８５０９を同じ濃度で含み、そしてリザバ８５０２はまた、インヒビター分子８５０８を含む。インヒビター分子濃度の勾配は、チャネルに対するそれらの大容量、または外部供給源からの材料の補充のいずれかに起因して、リザバ８５００および８５０２中の物質の固定された濃度を維持することにより達成される。チャンバは、チャネル８５０４の長さに沿って含めてもよく、または含めなくてもよく、特定の濃度で反応部位のより大きな容量を提供する。 FIG. 67 shows a simplified plan view of an embodiment of a microfluidic structure for performing such a substrate turnover assay. Here again, the reservoirs 8500 and 8502 are connected by a channel 8504 having a width that is significantly smaller than the dimensions of the chamber. The reservoirs 8500 and 8502 contain the substrate 8509 at the same concentration, and the reservoir 8502 also contains the inhibitor molecule 8508. Inhibitor molecule concentration gradients are achieved by maintaining a fixed concentration of substance in reservoirs 8500 and 8502, either due to their large volume to the channel, or the replenishment of material from an external source. The The chamber may or may not be included along the length of the channel 8504, providing a greater volume of reaction sites at a particular concentration.

一旦、インヒビター分子の濃度勾配が確立されると、バルブ８５１０が作動されて、チャネルのセクション（またはチャネルによって連結される個々のチャンバ）を隔離し、これらは、次に、酵素８５１４を含む別個のウェル８５１２と混合される。各ウェルの蛍光を経時的にモニターすることにより、各チャンバにおける酵素の活性を決定することが可能である。 Once the concentration gradient of the inhibitor molecule is established, valve 8510 is actuated to isolate the sections of the channel (or individual chambers connected by the channel), which in turn contain a separate enzyme 8514 containing enzyme 8514. Mixed with well 8512. By monitoring the fluorescence of each well over time, the activity of the enzyme in each chamber can be determined.

本発明の実施形態による活性の検出は、蛍光によることを要求されない。識別されるべき基質に依存して、酵素活性および得られる触媒は、ほんのわずか指名して、比色法、屈折率、表面プラスモン共鳴、または電導度の分析により決定され得る。 Detection of activity according to embodiments of the present invention is not required to be by fluorescence. Depending on the substrate to be identified, the enzyme activity and the resulting catalyst can be determined by colorimetry, refractive index, surface plasmon resonance, or conductivity analysis, only a few nominations.

（１０．バイオセンサ）
ほんの少数％の既知の微生物が、実験室設定で培養および増殖され得る。この比較的低い成功率は、代表的には、細胞増殖を誘導するために要求される実質的な数の因子に大部分は起因する。細胞増殖を促進するための構造の成功は、増殖する細胞に栄養物を連続的に供給し、そして細胞代謝によって生成される廃棄産物を除去する能力に基本的に依存している。 (10. Biosensor)
Only a small percentage of known microorganisms can be cultured and grown in a laboratory setting. This relatively low success rate is typically due largely to the substantial number of factors required to induce cell proliferation. The success of structures to promote cell growth is fundamentally dependent on the ability to continuously supply nutrients to the growing cells and remove waste products produced by cellular metabolism.

本発明の実施形態によれば、ミクロ流体フリー界面拡散は、必要な食物を細胞に連続的に供給し、そして廃棄産物を除くために採用され得る。細胞は、食物、増殖因子、緩衝液、および細胞増殖を支持するその他の材料を含む種々のリザバに、細胞が通過するには、小さすぎるチャネルを経由して連結されるチャンバ中に導入され、かつ含まれ得る。フリー界面拡散を次に用いて、食物、増殖因子、または廃棄物のチャンバへのおよびそれからのフラックスを制御する。 According to embodiments of the invention, microfluidic free interfacial diffusion can be employed to continuously supply the necessary food to the cells and to remove waste products. The cells are introduced into various reservoirs, including food, growth factors, buffers, and other materials that support cell growth, into chambers that are connected via channels that are too small for the cells to pass through, And can be included. Free interfacial diffusion is then used to control the flux of food, growth factors, or waste into and out of the chamber.

例えば、図２７Ａおよび２７Ｂは、本発明によるセルペン構造物の１つの実施形態の平面図および（線４５Ｂ−４５Ｂ’に沿った）断面図をそれぞれ示す。セルペン４５００は、基板４５０５と接触するエラストマーブロック４５０３中のフローチャネル４５０１の拡大部分４５００ａとして形成される。セルペン４５００は、セルペン４５００の端部４５００ｂおよび４５００ｃは内部領域４５００ａを完全に囲わないことを除いて、図２６Ａ〜２６Ｄで上記に記載されたような個々のセルペンに類似している。むしろ、ケージ４５００の端部４５００ａおよび４５００ｂは、複数の退避可能な支柱４５０２によって形成される。支柱４５０２は、図２１Ａ〜２１Ｊと組み合わせて上記で詳細に記載されたような通常は閉鎖されるバルブ構造物のメンブレン構造物の一部分であり得る。 For example, FIGS. 27A and 27B show a plan view and a cross-sectional view (along line 45B-45B '), respectively, of one embodiment of a serpen structure according to the present invention. The cell pen 4500 is formed as an enlarged portion 4500 a of the flow channel 4501 in the elastomer block 4503 that contacts the substrate 4505. The cell pen 4500 is similar to the individual cell pens as described above in FIGS. 26A-26D, except that the ends 4500b and 4500c of the cell pen 4500 do not completely enclose the interior region 4500a. Rather, the ends 4500a and 4500b of the cage 4500 are formed by a plurality of retractable struts 4502. The strut 4502 can be part of a normally closed valve structure membrane structure as described in detail above in combination with FIGS.

詳細には、制御チャネル４５０４は支柱４５０２の上に横たわる。制御チャネル４５０４中の圧力が減少するとき、エラストマー支柱４５０２は上方に制御チャネル４５０４中に引かれ、それによってセルペン４５００の端部４５００ｂを開き、そして細胞が入ることを許容する。制御チャネル４５０４中の圧力の上昇の際、支柱４５０２は基板４５０５に対して下方に弛緩し、そして細胞がケージ４５００が出るのを防ぐ。 Specifically, control channel 4504 overlies post 4502. As the pressure in the control channel 4504 decreases, the elastomeric strut 4502 is pulled upward into the control channel 4504, thereby opening the end 4500b of the cell pen 4500 and allowing cells to enter. As pressure increases in the control channel 4504, the strut 4502 relaxes downward relative to the substrate 4505 and prevents cells from exiting the cage 4500.

エラストマー支柱４５０２は、ケージ４５００からの細胞の移動を防ぐために十分なサイズおよび数であるが、また、その中に貯蔵された細胞（単数または複数）を維持するためにケージ内部４５００ａ中への栄養物の流れまたは拡散を可能にするギャップ４５０８を含む。対向する端部４５００ｃ上の支柱４５０２は、第２の制御チャネル４５０６の下に同様な形態とされ、所望によりケージの開放および細胞の除去を許容する。 Elastomeric struts 4502 are of sufficient size and number to prevent migration of cells from cage 4500, but also provide nutrients into cage interior 4500a to maintain the cell (s) stored therein. It includes a gap 4508 that allows for the flow or diffusion of objects. The struts 4502 on the opposite end 4500c are similarly configured under the second control channel 4506 to allow cage opening and cell removal if desired.

本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散は、セルペン内で増殖する細胞への栄養物および増殖因子の定常的供給を提供するため、およびセルペンからの低分子量塩類のような廃棄産物を除去するために利用され得る。１つの実施形態が図６４中に示され、ここでは、セルペン８２００は、ミクロ流体フリー界面８２０６を横切る拡散により栄養分８２０５を供給するフローチャネル８２０４の行き詰まり分岐チャネル８２０２と流体連絡している。セルペン８２００からの廃棄産物８２０７もまた、次いで、ミクロ流体フリー界面８２０６を横切って拡散し、そして除去のためにフローチャネル８２０４中に入る。 Microfluidic free interfacial diffusion according to embodiments of the present invention provides a steady supply of nutrients and growth factors to cells growing in the serpen and removes waste products such as low molecular weight salts from the serpen Can be used for. One embodiment is shown in FIG. 64, where the serpen 8200 is in fluid communication with the dead end branch channel 8202 of the flow channel 8204 that supplies nutrient 8205 by diffusion across the microfluidic free interface 8206. Waste product 8207 from serpen 8200 then also diffuses across microfluidic free interface 8206 and enters flow channel 8204 for removal.

セルペンへの、およびそれからの物質の拡散の速度に対する制御は、幅、高さ、および長さ、連結チャネルの数、リザバのサイズ、チャンバのサイズのようなミクロ流体チャネルの寸法、ならびに栄養物供給およびまたは廃棄産物の濃度を変化することにより達成され得る。上記で列挙した因子を変化することにより、とりわけ、細胞増殖および分裂の速度、そしてそれ故、細胞の最大密度を調節することが可能である。そしてミクロ流体寸法では、狭いチャネルによって連結されるより大きな容量のチャンバ内に感知し得る濃度勾配はないので、このようなチャンバ内の全細胞集団は、類似の状態に同時に曝され得る。 Control over the rate of diffusion of materials into and out of the serpen is controlled by microfluidic channel dimensions such as width, height, and length, number of connecting channels, reservoir size, chamber size, and nutrient supply And / or by changing the concentration of waste products. By varying the factors listed above, it is possible to regulate, among other things, the rate of cell growth and division, and hence the maximum density of cells. And at microfluidic dimensions, there is no appreciable concentration gradient in larger volume chambers connected by narrow channels, so the entire cell population in such chambers can be exposed to similar conditions simultaneously.

本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散を利用して、隣接するチャンバ中に位置決めされた、２つ以上の異なる株の細胞を、チャンバ間を移動する栄養分、廃棄物、および細胞増殖のその他の産物の拡散を可能にしながら培養することもまた可能であり得る。このタイプのミクロ流体構造物および方法は、近接する細胞間の、制限されないで、細胞信号伝達、細胞／細胞毒性、および細胞／細胞共生を含む相互作用を研究することで特に価値があり得る。 Utilizing microfluidic free interfacial diffusion according to embodiments of the present invention, two or more different strains of cells positioned in adjacent chambers, nutrients moving between chambers, waste, and other cell growth It may also be possible to incubate while allowing the product to diffuse. This type of microfluidic structure and method may be particularly valuable by studying interactions between adjacent cells, including but not limited to cell signaling, cell / cytotoxicity, and cell / cell symbiosis.

最後に、本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面拡散は、所望の細胞増殖状態をスクリーニングするために栄養分／廃棄物状態の勾配を確立するためにさらに用いられ得る。細胞培養を増殖するための拡散の使用は、これらの小寸法で現実的であり、ここでは、拡散長さが短く、そして容量は、短時間に亘り状態を有意に変化させる拡散輸送を可能にするに十分小さい。 Finally, microfluidic free interfacial diffusion according to embodiments of the present invention can be further used to establish a nutrient / waste state gradient to screen for a desired cell growth state. The use of diffusion to grow cell cultures is practical at these small dimensions, where the diffusion length is short, and the volume allows diffusive transport to change state significantly over a short period of time. Small enough to do.

（１１．化学走化性）
本発明による実施形態のなお別の可能な適用は、化学走化性の研究である。化学走化性は、特定の化学薬品の濃度勾配に応答する運動性細胞の移動の方向の変化である。方向のこの変化は、特有の速度で感知された化学薬品に向かうか、またはそれから離れて動く細胞を生じ得る。化学走化性は、免疫応答で鍵となる役割を演じ、ここで、免疫系の成分は、外来因子の存在に起因する化学的環境における感知した変化に応答して外来因子に移動し、かつそれを破壊する。 (11. Chemical chemotaxis)
Yet another possible application of embodiments according to the present invention is chemical chemotaxis studies. Chemotaxis is a change in the direction of movement of motile cells in response to a concentration gradient of a particular chemical. This change in direction can result in cells moving toward or away from the sensed chemical at a particular rate. Chemotaxis plays a key role in the immune response, where components of the immune system move to the foreign factor in response to a perceived change in the chemical environment due to the presence of the foreign factor, and Destroy it.

本発明の実施形態によって生成されたミクロ流体フリー界面は、化学物質濃度勾配を正確に再現するための価値ある方法を提供し得る。これらの濃度勾配への曝露に応答する運動性細胞の活性は、研究者が化学走化性の現象を研究および理解することを可能にする。 The microfluidic free interface created by embodiments of the present invention can provide a valuable method for accurately reproducing chemical concentration gradients. The activity of motile cells in response to exposure to these concentration gradients allows researchers to study and understand the chemotaxis phenomenon.

（１２．架橋／多孔性勾配をもつポリマーを作成すること）
多くの生物学的適用では、重合ゲルが、代表的には均一組成であるこのゲルを通る分子の拡散する移動度に基づいてこれらを分離するために用いられている。しかし、分子を効率的に分離するゲルの能力は、ゲルの形成の間のｐＨ、密度、または重合架橋のような性質に関して勾配を課すことにより改善され得る。 (12. Create polymer with cross-linking / porosity gradient)
In many biological applications, polymerized gels are used to separate them based on the diffusive mobility of molecules through the gel, which is typically of uniform composition. However, the ability of a gel to efficiently separate molecules can be improved by imposing a gradient on properties such as pH, density, or polymer crosslinking during gel formation.

本発明の実施形態によれば、ミクロ流体フリー界面拡散が、特定の性質の良好に形成された勾配を有する重合化ゲルを製作するために用いられ得る。例えば、１つの例では、濃縮された、重合されていない、光硬化可能なゲル（アガロースなど）が、緩衝溶液を含む第２のミクロ流体チャンバとミクロ流体チャネルを経由して流体連絡しているミクロ流体チャンバ中に導入され得る。個々のチャンバの内容物は、チャネルを通じて互い中に拡散するので、ゲル濃度勾配が確立される。一旦、この勾配が形成されると、ゲルは、ＵＶ照射に曝され得、固形ゲルを生成する架橋を生じる。このゲル濃度勾配は、そしてそれ故、ゲルの多孔性は、この重合の結果としてゲル中に固定される。 According to embodiments of the present invention, microfluidic free interfacial diffusion can be used to fabricate polymerized gels with well-formed gradients of specific properties. For example, in one example, a concentrated, unpolymerized, photocurable gel (such as agarose) is in fluid communication via a microfluidic channel with a second microfluidic chamber containing a buffer solution. It can be introduced into the microfluidic chamber. As the contents of the individual chambers diffuse into each other through the channel, a gel concentration gradient is established. Once this gradient is formed, the gel can be exposed to UV radiation, resulting in cross-linking that produces a solid gel. This gel concentration gradient, and hence the porosity of the gel, is fixed in the gel as a result of this polymerization.

まさに記載されたような勾配を示すゲルは、電位を付与すること、および分子を最大の多孔度および最低のゲル濃度の領域から最小の多孔度および最高のゲル濃度の領域までゲルを通じて移動させることにより高分子のサイズを決定するために用いられ得る。一旦、ゲルの平均ポアサイズが、この分子を通過させるには小さ過ぎるようになると、この分子は、ゲル中に捕獲されて残り、そして標準的な蛍光または銀染色方法によって検出可能である。従って、ゲル中の分子の位置は、この分子のサイズの直接的反映である。 A gel that exhibits a gradient as just described applies an electric potential and moves molecules through the gel from a region of maximum porosity and minimum gel concentration to a region of minimum porosity and maximum gel concentration. Can be used to determine the size of the polymer. Once the average pore size of the gel becomes too small to pass through the molecule, the molecule remains trapped in the gel and can be detected by standard fluorescent or silver staining methods. Thus, the position of the molecule in the gel is a direct reflection of the size of this molecule.

本発明によるミクロ流体フリー界面拡散を用いる重ね合わせ勾配でゲルを形成する代替の実施形態では、重合したゲルは、インプリントされたｐＨ勾配で形成され得る。このような代替の実施形態では、第１のチャンバは、１つのｐＨの１つの緩衝液で非重合ゲルで充填され、そして第２のチャンバは、第２のｐＨの第２の緩衝液で同じ濃度の非重合ゲルの組み合わせで充填される。次いで、分子は、チャンバを連結するミクロ流体チャネルを横切って拡散され、ｐＨ勾配を確立する。ゲルは、次に、重合されて均一多孔度の固形ゲルを生成する。拡散する分子が、ゲルマトリックスに永久的に結合され得る場合、均一なｐＨ勾配が、連結チャネルの長さに沿って永久的に確立され得る。このようなｐＨ勾配は、付与された電場との組み合わせで採用され得、ゲルを通って移動する分子をそれらの異なる等電位点に基づいて分離する。 In an alternative embodiment of forming the gel with a superposition gradient using microfluidic free interfacial diffusion according to the present invention, the polymerized gel can be formed with an imprinted pH gradient. In such an alternative embodiment, the first chamber is filled with a non-polymerized gel with one buffer at one pH, and the second chamber is the same with a second buffer at a second pH. Filled with a combination of non-polymerized gels of concentration. The molecules are then diffused across the microfluidic channels connecting the chambers, establishing a pH gradient. The gel is then polymerized to produce a uniform porosity solid gel. If the diffusing molecules can be permanently bound to the gel matrix, a uniform pH gradient can be permanently established along the length of the connecting channel. Such a pH gradient can be employed in combination with an applied electric field to separate molecules that move through the gel based on their different equipotential points.

（１３．薬物送達システム）
ミクロ流体チャンバからまたはその中へのフラックスの速度を制御する能力は、時計のような能動的制御戦略なくして、化学薬品または薬物の時限放出を可能にする。例えば、移植されたミクロ流体薬物送達デバイスは、変化する幾何学的形状のミクロ流体チャネルを通じて出口オリフィスに連結された複数のチャネルを含み得る。このようにして、チャネル中の化学薬品の各々の輸送の速度が、別個および組み合わせて制御され得る。このような構造を利用し、いくつかの異なる薬物が、異なりかつ良好に規定された速度で身体中に導入され得る。 (13. Drug delivery system)
The ability to control the rate of flux from or into the microfluidic chamber allows for the timed release of chemicals or drugs without an active control strategy such as a clock. For example, an implanted microfluidic drug delivery device can include a plurality of channels connected to an exit orifice through microfluidic channels of varying geometry. In this way, the rate of transport of each chemical in the channel can be controlled separately and in combination. Using such a structure, several different drugs can be introduced into the body at different and well defined rates.

例えば、ミクロ流体フリー界面拡散を利用する薬物送達の実施形態では、複数のチャンバが、最初、緩衝溶液で満たされたチャンバに変動する寸法のチャネルを経由して連結され得る。これらの緩衝液で満たされたチャンバは、次いで、順に、種々の寸法のチャネルを経由して出口オリフィスに連結され得る。ミクロ流体チャンバおよび連結チャネルの寸法は、チャンバから身体中への薬物の放出の速度およびタイミングの両方に対する制御を可能にする。幅および長さ、ならびにチャンバ容量および形状のようなチャネル寸法、ならびに薬物濃度の思慮深い選択により、経時的に薬物送達の合計速度に対する非常に正確な制御を達成することが可能である。 For example, in drug delivery embodiments that utilize microfluidic free interfacial diffusion, multiple chambers may be connected via channels of varying dimensions to a chamber that is initially filled with a buffer solution. Chambers filled with these buffers can then in turn be connected to the exit orifice via channels of various dimensions. The dimensions of the microfluidic chamber and the connecting channel allow control over both the rate and timing of drug release from the chamber into the body. With judicious selection of channel dimensions such as width and length, and chamber volume and shape, and drug concentration, it is possible to achieve very precise control over the total rate of drug delivery over time.

（１４．高度に反応性の化学薬品種の混合）
本発明の実施形態によるミクロ流体フリー界面にとって可能な適用のなお別の例は、高度に反応性の種の制御された混合にある。例えば、特定の状況下では、２つ以上の化学種間で遅いかまたは段階的なペースで反応を生じさせることが所望され得る。しかし、対流流れを含む従来の状態では、これらの種は、突然および／または激しく反応し得、反応産物の有用性を和らげる。 (14. Mixing of highly reactive chemical species)
Yet another example of a possible application for microfluidic free interfaces according to embodiments of the present invention is in the controlled mixing of highly reactive species. For example, under certain circumstances, it may be desirable to cause a reaction between two or more chemical species at a slow or gradual pace. However, in conventional conditions involving convective flow, these species can react suddenly and / or vigorously, reducing the usefulness of the reaction product.

しかし、本発明の実施形態によれば、これら化学種間の接触および反応は、対流流れはなく、専ら拡散により支配される。従って、これら化学種間の反応を遅延しかつ支配可能なペースで行うことが可能であり得る。本発明による実施形態がかなりの利点を提供し得る１つの分野は、爆発性であるか、またはその他の潜在的に不安定な産物の調製にあり、そこでは、迅速に変化する反応体濃度が、危険またはそうでなければ所望されない状態を生じ得る。本発明による実施形態はまた、最終または中間産物が不安定、高度に反応性、および／または揮発性である組み合わせ合成適用のために潜在的に有用であり得る。 However, according to embodiments of the present invention, the contact and reaction between these species is not convective flow and is governed exclusively by diffusion. Thus, it may be possible to delay and control the reaction between these chemical species. One area in which embodiments according to the present invention may provide significant advantages is in the preparation of explosive or other potentially unstable products, where rapidly changing reactant concentrations are Can cause dangerous or otherwise undesired conditions. Embodiments according to the present invention may also be potentially useful for combinatorial synthetic applications where the final or intermediate product is unstable, highly reactive, and / or volatile.

（１５．生物学的アッセイ）
本発明によるミクロ流体フリー界面の実施形態は、種々の適用のために採用され得る。このような適用の例は以下に要約される。可能な適用のより完全な記載は、すべての目的のために参考として本明細書によって援用される、２００１年１１月１６日に出願され、そして「細胞アッセイおよび高スループットスクリーニング」と題するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４８６９中に見出され得る。このような適用を実施するために適切なミクロ流体構造物の例は、本明細書に記載のものを含み、ならびにその他は、すべての目的のために参考として本明細書によって援用される、代理人事件番号第２０１７４Ｃ−００４４３０号として２００２年４月５日に出願された、米国非仮特許出願第／号、「ミクロ流体デバイスを利用する核酸増幅」中に記載されている。 (15. Biological assays)
Embodiments of the microfluidic free interface according to the present invention can be employed for various applications. Examples of such applications are summarized below. A more complete description of possible applications is PCT application PCT filed November 16, 2001 and entitled “Cellular Assay and High Throughput Screening”, which is hereby incorporated by reference for all purposes. / US01 / 44869. Examples of suitable microfluidic structures for carrying out such applications include those described herein, as well as others that are incorporated herein by reference for all purposes. It is described in US Non-provisional Patent Application No./No. “Nucleic Acid Amplification Utilizing Microfluidic Device” filed April 5, 2002 as human case number 20174C-004430.

広範な種々の結合アッセイが本明細書に開示のミクロ流体デバイスを利用して実施され得る。本質的に任意のリガンドおよび抗リガンド間の相互作用が検出され得る。調査され得るリガンド／抗リガンド相互作用の例は、制限されないで、酵素／リガンド相互作用（例えば、基質、コファクター、インヒビター）；レセプター／リガンド；抗原／抗体；タンパク質／タンパク質（同種親和性／異種親和性相互作用）；タンパク質／核酸；ＤＮＡ／ＤＮＡ；およびＤＮＡ／ＲＮＡを含む。従って、これらのアッセイは、例えば、目的のレセプターに対するアゴニストおよびアンタゴニストを同定するため、レセプターに結合し、かつ細胞内信号カスケードを誘引し得るリガンドを同定するため、および相補的核酸を同定するために用いられ得る。アッセイは、当業者の周知の、リガンドおよび推定の抗リガンドが互いに接触される直接結合フォーマットか、または競合結合フォーマットで実施され得る。 A wide variety of binding assays can be performed utilizing the microfluidic devices disclosed herein. Interactions between essentially any ligand and anti-ligand can be detected. Examples of ligand / anti-ligand interactions that can be investigated include, but are not limited to, enzyme / ligand interactions (eg, substrates, cofactors, inhibitors); receptors / ligands; antigens / antibodies; proteins / proteins (homophilic / heterologous) Affinity interactions); protein / nucleic acid; DNA / DNA; and DNA / RNA. Thus, these assays, for example, to identify agonists and antagonists for the receptor of interest, to identify ligands that can bind to the receptor and trigger an intracellular signal cascade, and to identify complementary nucleic acids. Can be used. The assay can be performed in a direct binding format where the ligand and the putative anti-ligand are contacted with each other, or in a competitive binding format, well known to those skilled in the art.

異種結合アッセイは、複合体が、非反応因子から、標識された複合体が非複合体化標識反応体から区別され得るように分離されるステップを含む。しばしば、これは、リガンドまたは抗リガンドのいずれかを支持体に付着することによって達成される。リガンドおよび抗リガンドが接触された後、非複合体化反応体は洗浄され、そして残存する複合体が次いで検出される。 Heterogeneous binding assays include the step where the complex is separated from unreacted factors such that the labeled complex can be distinguished from the uncomplexed labeled reactant. Often this is accomplished by attaching either a ligand or an anti-ligand to the support. After the ligand and anti-ligand are contacted, the uncomplexed reactant is washed and the remaining complex is then detected.

本明細書中に提供されるミクロ流体デバイスで実施される結合アッセイはまた、均一フォーマットで実施され得る。この均一フォーマットでは、リガンドおよび抗リガンドが溶液中で互いと接触され、そして結合複合体は、非複合体化リガンドおよび抗リガンドを除去しなければならないことはなく検出される。均一アッセイを実施するためにしばしば利用される２つのアプローチは、蛍光偏光（ＦＰ）およびＦＲＥＴアッセイである。 Binding assays performed with the microfluidic devices provided herein can also be performed in a homogeneous format. In this homogeneous format, the ligand and anti-ligand are contacted with each other in solution, and the bound complex is detected without having to remove uncomplexed ligand and anti-ligand. Two approaches that are often utilized to perform homogeneous assays are fluorescence polarization (FP) and FRET assays.

ミクロ流体デバイスはまた、競合フォーマットで利用され得、既知の結合パートナー間の相互作用を阻害する薬剤を同定する。このような方法は、一般に、結合パートナーが相互作用し、そして複合体を形成することを可能にするに十分な状態下および時間の間、結合パートナーを含む反応混合物を調製することを含む。阻害活性について化合物を試験するために、この反応混合物は、試験化合物の存在下（試験反応混合物）および非存在下（コントロール反応混合物）で調製される。結合パートナー間の複合体の形成が、次いで、検出され、代表的には、結合パートナーの１つまたは両方による保持される標識を検出することによる。コントロール反応におけるより多くの複合体、次いで、試験反応混合物中の統計学的に有意な差異を構成するレベルの形成は、この試験化合物が結合パートナー間の相互作用を妨害することを示す。 Microfluidic devices can also be utilized in a competitive format to identify agents that inhibit interactions between known binding partners. Such methods generally involve preparing a reaction mixture containing the binding partner under conditions and for a time sufficient to allow the binding partner to interact and form a complex. In order to test a compound for inhibitory activity, the reaction mixture is prepared in the presence (test reaction mixture) and absence (control reaction mixture) of the test compound. Complex formation between the binding partners is then detected, typically by detecting the label retained by one or both of the binding partners. The formation of more complex in the control reaction and then a level that constitutes a statistically significant difference in the test reaction mixture indicates that the test compound interferes with the interaction between the binding partners.

免疫学的アッセイは、本発明の実施形態によるミクロ流体デバイスで実施され得るアッセイの１つの一般的カテゴリーである。特定のアッセイが、目的の特定の抗原に特異的に結合し得る抗体について、抗体の集団をスクリーニングするために実施される。このようなアッセイでは、試験抗体または抗体の集団が抗原と接触される。代表的には、抗原は固体支持体に付着される。免疫学的アッセイの例は、当該分野で公知のような酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および競合アッセイを含む。 Immunological assays are one general category of assays that can be performed on microfluidic devices according to embodiments of the present invention. A specific assay is performed to screen a population of antibodies for antibodies that can specifically bind to a particular antigen of interest. In such an assay, a test antibody or population of antibodies is contacted with an antigen. Typically, the antigen is attached to a solid support. Examples of immunological assays include enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) and competition assays as are known in the art.

本明細書で提供されるミクロ流体デバイスを利用して、種々の酵素アッセイが実施され得る。このような酵素アッセイは、一般に、アッセイを実施するために必要な成分を含むアッセイ混合物を、種々の分岐フローチャネル中に導入することを含む。このアッセイ混合物は、代表的には、例えば、酵素のための基質（単数または複数）、必要なコファクター類（例えば、金属イオン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）、および緩衝液を含む。カップルしたアッセイが実施されるべき場合、アッセイ溶液はまた、一般に、酵素、基質（単数または複数）および酵素カップルのために必要なコファクターを含む。 Various enzyme assays can be performed utilizing the microfluidic devices provided herein. Such enzymatic assays generally involve introducing an assay mixture containing the components necessary to perform the assay into various branched flow channels. This assay mixture typically includes, for example, the substrate (s) for the enzyme, the necessary cofactors (eg, metal ions, NADH, NADPH), and buffer. Where a coupled assay is to be performed, the assay solution generally also includes the enzyme, substrate (s) and cofactors required for the enzyme couple.

本発明の実施形態によるミクロ流体デバイスは、産生される酵素産物に選択的に結合する物質を含むために配列され得る。いくつかの事例では、この材料は、この反応産物自体に対して特異的な結合親和性を有する。幾分より複雑なシステムは、転移反応を触媒する酵素のために開発され得る。このタイプの特定のアッセイは、例えば、ドナー基質から、検出部分および親和性標識の両方を保持する産物を産生するために親和性標識を保持するアクセプター基質への検出可能部分の転移を触媒する酵素をインキュベートすることを含む。この産物は、この親和性標識に特異的に結合する相補的試薬を含む物質によって捕獲され得る。この物質は、代表的には、捕獲された産物が容易に検出され得るような検出領域中に位置決めされる。特定のアッセイでは、この物質は、検出セクションの内部チャネル壁にコートされ；あるいは、この物質は、試薬でコートされる検出領域中に位置決めされた支持体であり得る。 Microfluidic devices according to embodiments of the present invention can be arranged to contain substances that selectively bind to the enzyme product produced. In some cases, this material has a specific binding affinity for the reaction product itself. Somewhat more complex systems can be developed for enzymes that catalyze transfer reactions. A specific assay of this type is, for example, an enzyme that catalyzes the transfer of a detectable moiety from a donor substrate to an acceptor substrate that retains an affinity label to produce a product that retains both the detection moiety and the affinity label. Incubating. The product can be captured by a substance that contains a complementary reagent that specifically binds to the affinity label. This material is typically positioned in a detection region where the captured product can be easily detected. In certain assays, the material is coated on the inner channel wall of the detection section; alternatively, the material can be a support positioned in a detection region that is coated with a reagent.

本発明のデバイスを利用する特定のアッセイは、細胞よりもむしろベシクルで実施される。このようなアッセイの１つの例は、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を利用するＧプロテインカップルレセプターアッセイである。目的のレセプターを過剰発現する細胞から構築された膜ベシクルが、主フローチャネル中に導入される。ベシクルは、これもまた主フローチャネルによって導入される蛍光天然リガンドと混合される前に、インヒビターと予備混合され、そして分岐フローチャネルを経由するか、または主フローチャネルの１つを経由するかのいずれかである。成分は所望の時間の間インキュベートされ、そして蛍光信号が、Ｅｖｏｔｅｃ／ＺｉｅｓｓＣｏｎｆｏｃｏｒ（シングルまたはダブル光子計数デバイス）のようなＦＣＳリーダーを用いてフローチャンバー中で直接分析され得る。 Certain assays utilizing the devices of the present invention are performed on vesicles rather than cells. One example of such an assay is the G protein couple receptor assay that utilizes fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Membrane vesicles constructed from cells overexpressing the receptor of interest are introduced into the main flow channel. The vesicle is premixed with the inhibitor before it is also mixed with the fluorescent natural ligand introduced by the main flow channel and either via a branched flow channel or one of the main flow channels Either. The components are incubated for the desired time and the fluorescent signal can be analyzed directly in the flow chamber using an FCS reader such as Evotec / Ziess Concor (single or double photon counting device).

ＦＲＥＴアッセイはまた、本明細書に開示されるデバイスを用い、多くのリガンド−レセプター相互作用を行うために利用され得る。例えば、ＦＲＥＴペプチドレポーターは、青−および赤−シフトＧＦＰ改変体から構成される蛍光タンパク質をコードするベクター中にリンカー配列（リン酸化部位のようなタンパク質の誘導可能なドメインに対応する）を導入することにより構築され得る。このベクターは細菌発現ベクター（生化学的研究のため）また哺乳動物発現ベクター（インビボ研究のため）であり得る。 The FRET assay can also be utilized to perform a number of ligand-receptor interactions using the devices disclosed herein. For example, the FRET peptide reporter introduces a linker sequence (corresponding to a protein inducible domain such as a phosphorylation site) into a vector encoding a fluorescent protein composed of blue- and red-shifted GFP variants. Can be constructed. This vector can be a bacterial expression vector (for biochemical studies) or a mammalian expression vector (for in vivo studies).

核レセプターのアッセイもまた、本発明のミクロ流体デバイスで実施され得る。例えば、コアクチベーター／核レセプター相互作用のためのＦＲＥＴ−ベースのアッセイが実施され得る。詳細な例として、このようなアッセイは：（ａ）ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質、ＧＦＰ誘導体）でタグ化されたレセプターのリガンド結合性ドメイン、および（ｂ）Ｙｅｌｌｏｗ蛍光タンパク質（ＹＦＰ）でタグ化されたレセプター結合性タンパク質（コアクチベーター）間のＦＲＥＴ相互作用を検出するために実施され得る。 Nuclear receptor assays can also be performed with the microfluidic devices of the present invention. For example, FRET-based assays for coactivator / nuclear receptor interactions can be performed. As a detailed example, such an assay is: (a) the ligand binding domain of a receptor tagged with CFP (cyan fluorescent protein, GFP derivative), and (b) tagged with Yellow fluorescent protein (YFP). It can be performed to detect FRET interactions between receptor binding proteins (coactivators).

蛍光偏光（ＦＰ）は、核レセプター−リガンド置換およびキナーゼ阻害のための高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を開発するために利用され得る。ＦＰは溶液−ベースの均一技法であるので、反応成分の固定化または分離は要求されない。一般に、これらの方法は、レセプターのための蛍光標識されたリガンドと関連する試験化合物との間の競合を用いることを含む。 Fluorescence polarization (FP) can be utilized to develop high throughput screening (HTS) for nuclear receptor-ligand displacement and kinase inhibition. Since FP is a solution-based homogeneous technique, no immobilization or separation of reaction components is required. In general, these methods involve using competition between a fluorescently labeled ligand for the receptor and the associated test compound.

多くの異なる細胞レポーターアッセイが、提供されたミクロ流体デバイスで実施され得る。実施され得る１つの一般的タイプのレポーターアッセイは、細胞レセプターに結合し、そしてレポーター構築物の転写を活性化する細胞内信号または信号カスケードの活性化を誘引し得る試薬を同定するために設計されたアッセイを含む。このようなアッセイは、目的の遺伝子の発現を活性化し得る化合物を同定するために有用である。以下に論議されるツーハイブリッドアッセイは、本発明のデバイスで実施され得る細胞レポーターアッセイの別の主要なグループである。このツーハイブリッドアッセイは、タンパク質間の結合相互作用を調査するために有用である。 Many different cell reporter assays can be performed with the provided microfluidic devices. One general type of reporter assay that can be performed was designed to identify reagents that bind to cellular receptors and can trigger the activation of intracellular signals or signal cascades that activate transcription of the reporter construct. Includes assays. Such assays are useful for identifying compounds that can activate expression of a gene of interest. The two-hybrid assays discussed below are another major group of cell reporter assays that can be performed with the devices of the present invention. This two-hybrid assay is useful for investigating binding interactions between proteins.

しばしば、細胞レポーターアッセイは、化合物のライブラリーをスクリーニングするために利用される。一般に、このような方法は、細胞を主フローチャネル中に導入することを含み、その結果、細胞は、主フローチャネルと分岐チャネルとの間の交差点に位置決めされるチャンバ中に保持される。異なる試験試薬（例えば、ライブラリーから）が、次いで、異なる分岐チャネル中に導入され得、そこで、それらは、チャンバ中の細胞と混合されるようになる。あるいは、細胞は主フローチャネルを経由して導入され得、そして次に分岐チャネル中に移され、そこで、細胞は、保持領域中に貯蔵される。一方では、異なる試験化合物が、異なる分岐フローチャネル中に導入され、通常は主フローチャネルと分岐フローチャネルとの交差点に位置決めされるチャンバを少なくとも部分的に満たす。保持領域中に保持された細胞は、適切なバルブを開放することにより放出され得、そしてこれら細胞は、異なる試験化合物との相互作用のためのチャンバに移される。一旦、細胞と試験化合物とが混合されると、得られる溶液は、保持スペースに戻されるか、またはレポーター発現の検出のための検出セクションに輸送される。この細胞および試験試薬は、必要に応じてさらに混合され、そして上記で提示された設計の混合器を用いてインキュベートされる。 Often cellular reporter assays are utilized to screen libraries of compounds. In general, such methods include introducing cells into the main flow channel so that the cells are held in a chamber positioned at the intersection between the main flow channel and the branch channel. Different test reagents (eg, from the library) can then be introduced into the different branch channels, where they become mixed with the cells in the chamber. Alternatively, the cells can be introduced via the main flow channel and then transferred into the branch channel where the cells are stored in the holding area. On the one hand, different test compounds are introduced into different branch flow channels and at least partially fill the chamber, which is usually positioned at the intersection of the main flow channel and the branch flow channel. Cells held in the holding area can be released by opening the appropriate valve and these cells are transferred to a chamber for interaction with different test compounds. Once the cells and test compound are mixed, the resulting solution is returned to the holding space or transported to a detection section for detection of reporter expression. The cells and test reagents are further mixed as needed and incubated using a mixer of the design presented above.

遺伝子発現を誘引し得るような化合物をスクリーニングすることで利用される細胞は、代表的には目的のレセプターを発現し、そして異種レポーター構築物を宿す。このレセプターは、リガンドのレセプターへの結合に際し、遺伝子の転写を活性化するものである。このレポーター構築物は、通常は、転写制御要素およびそれに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むベクターである。この転写制御要素は、調査下にあるレセプターへのリガンドの結合に際して生成される細胞内信号（例えば、転写因子）に応答する遺伝子要素である。このレポーター遺伝子は、検出可能な転写または翻訳産物をコードする。しばしば、レポーター（例えば、酵素）は、ミクロ流体デバイスと関連する検出器によって検出され得る光学的信号を生成し得る。 Cells utilized by screening for compounds that can induce gene expression typically express the receptor of interest and harbor a heterologous reporter construct. This receptor activates gene transcription upon binding of a ligand to the receptor. This reporter construct is usually a vector comprising a transcriptional control element and a reporter gene operably linked thereto. This transcriptional control element is a genetic element that responds to intracellular signals (eg, transcription factors) that are generated upon binding of the ligand to the receptor under investigation. This reporter gene encodes a detectable transcription or translation product. Often, a reporter (eg, an enzyme) can generate an optical signal that can be detected by a detector associated with the microfluidic device.

広範な種々のレセプタータイプがスクリーニングされ得る。これらレセプターは、しばしば細胞表面レセプターであるが、細胞内レセプターもまた、スクリーニングされる試験化合物が細胞中に侵入し得ることを前提に調査され得る。調査され得るレセプターの例は、制限されないで、イオンチャネル（例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムチャネル）、電圧−ゲートイオンチャネル、リガンド−ゲートイオンチャネル（例えば、アセチルコリンレセプター、およびＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）レセプター）、成長因子レセプター、ムスカリンレセプター、グルタメートレセプター、アドレナリン作動性レセプター、ドーパミンレセプターを含む。 A wide variety of receptor types can be screened. These receptors are often cell surface receptors, but intracellular receptors can also be investigated assuming that the test compound being screened can enter the cell. Examples of receptors that can be investigated include, but are not limited to, ion channels (eg, calcium, sodium, potassium channels), voltage-gated ion channels, ligand-gated ion channels (eg, acetylcholine receptor, and GABA (γ-aminobutyric acid) Receptor), growth factor receptor, muscarinic receptor, glutamate receptor, adrenergic receptor, dopamine receptor.

実施され得る細胞アッセイの別の一般的カテゴリーは、ツーハイブリッドアッセイである。一般に、このツーハイブリッドアッセイは、多くの真核生物転写因子は、２つの異なるハイブリッドまたは融合タンパク質間の相互作用を検出するための別個のＤＮＡ結合ドメインおよび別個の転写活性化ドメインを含むという事実を開拓する。従って、ツーハイブリッドアッセイで利用される細胞は、２つの融合タンパク質をコードする構築物（単数または複数）を含む。これら２つのドメインは、特定条件下で互いと潜在的に相互作用し得る別個の結合性タンパク質に融合される。ツーハイブリッドアッセイを実施することで利用される細胞は、その発現が２つの融合タンパク質間の相互作用、または相互作用の欠如のいずれかに依存するレポーター遺伝子を含む。 Another general category of cellular assays that can be performed are two-hybrid assays. In general, this two-hybrid assay takes advantage of the fact that many eukaryotic transcription factors contain a separate DNA binding domain and a separate transcription activation domain to detect interactions between two different hybrids or fusion proteins. Pioneer. Thus, the cells utilized in the two-hybrid assay contain the construct (s) encoding the two fusion proteins. These two domains are fused to separate binding proteins that can potentially interact with each other under specific conditions. The cells utilized in performing the two-hybrid assay contain a reporter gene whose expression depends on either the interaction between the two fusion proteins or the lack of interaction.

まさに記載したアッセイに加えて、細胞膜電位をアッセイするための種々の方法が、本明細書に開示のミクロ流体デバイスで実施され得る。一般に、膜電位およびイオンチャネル活性をモニターするための方法は、２つの代替方法を用いて測定され得る。１つの一般的アプローチは、細胞内側のイオン濃度におけるバルク変化を測定するために蛍光イオンシェルターを用いることである。第２の一般的アプローチは、膜電位に感受性のＦＲＥＴ色素を用いることである。 In addition to the assays just described, various methods for assaying cell membrane potential can be performed with the microfluidic devices disclosed herein. In general, methods for monitoring membrane potential and ion channel activity can be measured using two alternative methods. One common approach is to use a fluorescent ion shelter to measure bulk changes in ion concentration inside the cell. The second general approach is to use FRET dyes that are sensitive to membrane potential.

本明細書に開示のミクロ流体デバイスは、細胞増殖をモニターするための種々の異なるアッセイを実施するために利用され得る。このようなアッセイは、種々の異なる研究で利用され得る。例えば、これら細胞増殖アッセイは、例えば、中毒学分析で利用され得る。細胞増殖アッセイはまた、腫瘍を含む種々の細胞増殖障害の処置のための化合物をスクリーニングすることで価値を有する。 The microfluidic devices disclosed herein can be utilized to perform a variety of different assays for monitoring cell proliferation. Such assays can be utilized in a variety of different studies. For example, these cell proliferation assays can be utilized, for example, in toxicology analysis. Cell proliferation assays also have value in screening compounds for the treatment of various cell proliferation disorders, including tumors.

本明細書に開示のミクロ流体デバイスは、毒性状態を同定するため、可能な毒性について試薬をスクリーニングするため、毒性侵襲に対する細胞応答を調査するため、および細胞死をアッセイするために設計された種々の異なるアッセイを実施するために利用され得る。種々の異なるパラメータが、毒性を評価するためにモニターされ得る。このようなパラメータの例は、制限されないで、細胞増殖、遺伝子またはタンパク質発現分析による中毒学応答の細胞経路の活性化をモニターすること、ＤＮＡ断片化；細胞膜の組成における変化、膜透過性、死滅レセプターまたは下流信号伝達経路の成分（例えば、カスパーゼ）の活性化、遺伝子ストレス応答、ＮＦ−κＢ活性化および有糸分裂促進剤に対する応答を含む。関連するアッセイは、アポトーシス（細胞死のプログラムされたプロセス）および壊死をアッセイするために用いられる。 The microfluidic devices disclosed herein are various designed to identify toxic states, to screen reagents for possible toxicity, to investigate cellular responses to toxic insults, and to assay cell death Can be utilized to perform a number of different assays. A variety of different parameters can be monitored to assess toxicity. Examples of such parameters include, but are not limited to, monitoring cell proliferation, activation of cellular pathways of toxicological responses by gene or protein expression analysis, DNA fragmentation; changes in cell membrane composition, membrane permeability, death Includes activation of receptors or components of downstream signaling pathways (eg, caspases), gene stress responses, NF-κB activation and responses to mitogenic agents. Related assays are used to assay apoptosis (a programmed process of cell death) and necrosis.

種々の微生物細胞を異なる試験化合物と接触することにより、抗微生物アッセイを実施し、それによって可能な抗細菌化合物を同定するために本明細書で提供されるデバイスをまた利用し得る。本明細書中で用いられる用語「微生物」は、任意の顕微鏡による、および／または単細胞真菌、および任意の細菌または任意の原生動物をいう。いくつかの抗微生物アッセイは、細胞をセルペン中に保持すること、およびそれを少なくとも１つの可能な抗微生物化合物と接触することを含む。この化合物の影響は、細胞の健康および／または代謝における任意の検出可能な変化として検出され得る。このような変化の例は、制限されずに、成長、細胞増殖、細胞分化、遺伝子発現、細胞分裂などにおける改変を含む。 The devices provided herein can also be utilized to perform antimicrobial assays by contacting various microbial cells with different test compounds, thereby identifying possible antibacterial compounds. The term “microorganism” as used herein refers to any microscopic and / or unicellular fungus, and any bacteria or any protozoan. Some antimicrobial assays involve keeping a cell in a serpen and contacting it with at least one possible antimicrobial compound. The effect of this compound can be detected as any detectable change in cellular health and / or metabolism. Examples of such changes include, but are not limited to, alterations in growth, cell proliferation, cell differentiation, gene expression, cell division, and the like.

本明細書で提供されるミクロ流体デバイスのあるものは、ミニ配列決定反応またはプライマー伸長反応を実施するために利用され得、標的核酸中の多形部位に存在するヌクレオチドを識別する。一般に、これらの方法では、標的核酸のセグメントに相補的なプライマーは、反応がこの多形部位のヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドの存在下で実施される場合に伸長される。しばしば、このような方法は、単一塩基対伸長（ＳＢＰＥ）反応である。このような方法は、代表的には、プライマーを、相補的な標的核酸配列に、プライマーの３’末端が多形部位にすぐ隣接するようにか、または多形部位の２〜３塩基上流にあるようにハイブリダイズすることを含む。伸長反応は、１つ以上の標識された非伸長性ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド）およびポリメラーゼの存在下で実施される。プライマーの３’末端上への非伸長性ヌクレオチドの取り込みは、一旦、非伸長性ヌクレオチドがプライマーの３’末端上に取り込まれると、ポリメラーゼによるプライマーのさらなる伸長を防ぐ。 Some of the microfluidic devices provided herein can be utilized to perform minisequencing reactions or primer extension reactions to identify nucleotides present at polymorphic sites in a target nucleic acid. In general, in these methods, a primer complementary to a segment of the target nucleic acid is extended when the reaction is performed in the presence of a nucleotide that is complementary to the nucleotide at this polymorphic site. Often, such a method is a single base pair extension (SBPE) reaction. Such methods typically involve placing the primer on a complementary target nucleic acid sequence such that the 3 ′ end of the primer is immediately adjacent to the polymorphic site or two to three bases upstream of the polymorphic site. Hybridizing as such. The extension reaction is performed in the presence of one or more labeled non-extendable nucleotides (eg, dideoxynucleotides) and a polymerase. Incorporation of a non-extendable nucleotide on the 3 'end of the primer prevents further extension of the primer by the polymerase once the non-extendable nucleotide is incorporated on the 3' end of the primer.

まさに記載された方法に関連して、本発明のデバイスはまた、当該分野で良好に確立されている増幅技法を用いて複数サンプル中の標的核酸を増幅し、および次に同定するために利用され得る。一般に、このような方法は、標的核酸を潜在的に含むサンプルを、この標的核酸に特異的にハイブリダイズする正プライマーおよび逆プライマーと接触することを含む。反応は、このプライマー配列を伸長するために４つすべてのｄＮＴＰおよびポリメラーゼを含む。 In connection with the method just described, the device of the present invention can also be used to amplify and then identify target nucleic acids in multiple samples using amplification techniques well established in the art. obtain. In general, such methods include contacting a sample potentially containing a target nucleic acid with forward and reverse primers that specifically hybridize to the target nucleic acid. The reaction includes all four dNTPs and a polymerase to extend this primer sequence.

（Ｖ．位相空間の探索）
タンパク質結晶学の問題に緊密に関係するのは、いくつかの化学的変数の関数としてタンパク質の溶解度を決定することである。推測的に、結晶化を誘導する熱力学的状態を決定することは困難であり得るので、スクリーニング方法は、可能な限り多くの位相空間（多くの状態）をサンプリングするべきである。これは、複数のアッセイを実施することにより、そしてまた各アッセイの展開の間に間に合ってサンプリングされる位相空間による達成され得る。 (V. Search of phase space)
Closely related to the problem of protein crystallography is the determination of protein solubility as a function of several chemical variables. A screening method should sample as much phase space (many states) as possible, since speculatively it can be difficult to determine the thermodynamic state that induces crystallization. This can be achieved by performing multiple assays and also by a phase space sampled in time during the development of each assay.

本発明によるミクロ流体デバイスおよび方法の混合および計測機能性は、この課題に適合されており、それによって、タンパク質サンプルは、その化学が系統的に変更される複数の関連溶液と混合され得る。結晶成長を達成する機会を増加する実験を系統的に設計するために沈殿物タンパク質相互作用の一般的な相性質を用いることが可能である。これようにして溶解度「位相空間」が生成され得る。この位相空間の知識は、成功する結晶化状態を予想するか、または同定された状態を洗練するために用いられ得る。 The mixing and metrology functionality of the microfluidic devices and methods according to the present invention is adapted to this challenge, whereby protein samples can be mixed with multiple related solutions whose chemistry is systematically altered. It is possible to use the general phase nature of precipitate protein interactions to systematically design experiments that increase the chances of achieving crystal growth. In this way a solubility “phase space” can be generated. This knowledge of the phase space can be used to predict a successful crystallization state or to refine the identified state.

図５５は、高分子および沈殿剤を含む混合物の位相空間を示す単純化した概略図である。この位相空間は、溶解度曲線５５００によって、高分子溶解度によって決定される溶解（Ｓ）および過飽和（ＳＳ）領域に分割される。 FIG. 55 is a simplified schematic diagram illustrating the phase space of a mixture comprising a polymer and a precipitating agent. This phase space is divided by the solubility curve 5500 into the solubility (S) and supersaturation (SS) regions determined by the polymer solubility.

Ｇｉｂｂｓの自由エネルギー図は、エネルギー的に好まれない状態からエネルギー的に好ましい状態に移動するために必要な障壁エネルギー（Ｅ_ｂ）によって分割される溶解相および沈殿相の相対エネルギーをグラフにより表す。図５６Ａは、図５５の溶解領域（Ｓ）の自由エネルギー図である。図５６Ｂは、溶解度曲線５５００に沿った自由エネルギー図である。図５６Ｃは、図５５の過飽和領域（ＳＳ）の自由エネルギー図である。図５６Ａ〜Ｃの比較は、この溶解度曲線の沿って等しくバランスされる溶解相および沈殿相のエネルギーを示し、溶解領域では溶解形態がエネルギー的に好まれ、そして過飽和領域では固相がエネルギー的に好まれる。 The Gibbs free energy diagram graphically represents the relative energy of the dissolved and precipitated phases divided by the barrier energy (E _b ) required to move from an energetically unfavorable state to an energetically favorable state. FIG. 56A is a free energy diagram of the dissolution region (S) of FIG. FIG. 56B is a free energy diagram along the solubility curve 5500. FIG. 56C is a free energy diagram of the supersaturated region (SS) in FIG. 55. The comparison of FIGS. 56A-C shows the dissolved and precipitated phase energies equally balanced along this solubility curve, where the dissolved form is energetically favored in the dissolved region and the solid phase energetically in the supersaturated region. Liked.

図５５はまた、過飽和領域（ＳＳ）が、長い範囲のオーダーを欠く無定形沈殿物（すなわち、非結晶）が迅速に形成される沈殿領域（Ｐ）、沈殿曲線５５０２の近傍の不安定領域（Ｌ）、および溶解度曲線５５００の近傍の準安定性領域（Ｍ）にさらに分割され得ることを示す。図５６Ｄ、５６Ｅおよび５６Ｆは、それぞれ、沈殿領域、不安定領域、および準安定領域の自由エネルギー図を示す。 FIG. 55 also shows that the supersaturated region (SS) is a precipitate region (P) where an amorphous precipitate (ie, amorphous) that lacks a long range of orders is rapidly formed, an unstable region near the precipitation curve 5502 ( L) and that it can be further divided into metastable regions (M) in the vicinity of the solubility curve 5500. 56D, 56E and 56F show the free energy diagrams of the precipitation region, the unstable region, and the metastable region, respectively.

沈殿領域（Ｐ）では、無定形凝集物が結晶固体よりも好まれ、そして活性化エネルギー（Ｅ_ｂ）は低く、その結果、溶解状態と固形状態との間の遷移が迅速に起こる。不安定領域（Ｌ）では、結晶形態が好まれるが、Ｅ_ｂは低く、迅速な核形成および対応する小結晶の形成が生じる。対照的に、準安定領域（Ｍ）では、比較的高い活性化エネルギーが、核形成を抑制するが、現存する結晶の成長を支持する。 In the precipitation region (P), amorphous aggregates are preferred over crystalline solids and the activation energy (E _b ) is lower, so that the transition between the dissolved and solid states occurs rapidly. In the unstable region (L), crystal morphology is preferred, but _Eb is low, resulting in rapid nucleation and corresponding small crystal formation. In contrast, in the metastable region (M), a relatively high activation energy suppresses nucleation but supports the growth of existing crystals.

臨界的核凝集に必要な三次元核形成は、一般に、引き続く結晶面成長に必要な一次元または二次元核形成の活性化エネルギーより大きな活性化エネルギーを有するので、最適結晶化スキームは、結晶成長のこれらの２つの相に対して独立の制御を提供すべきである。ＢＩＭ計測スキームは、沈殿物とタンパク質溶液との間の「フリー界面拡散」を履行することによりこれの性質を正確に提供する。 Since the three-dimensional nucleation required for critical nucleation generally has an activation energy greater than the activation energy for one-dimensional or two-dimensional nucleation required for subsequent crystal plane growth, the optimal crystallization scheme is Independent control should be provided for these two phases. The BIM measurement scheme accurately provides this property by implementing “free interfacial diffusion” between the precipitate and the protein solution.

図５７は、従来のハンギングドロップおよびミクロバッチ実験の、高分子濃度および沈殿剤濃度を変数として有する二次元位相空間による展開と、本発明の実施形態によるμＦＩＤ実験とを比較する単純化した概略図である。平衡の間のチップによってとられた相−空間軌道は、含まれる種の拡散定数に依存する。チップ界面バルブが開放された後、短時間で、タンパク質側のタンパク質濃度はほとんど変化せず、その一方、代表的には、かなりより大きい拡散定数を有する対向溶媒のそれは、リソグラフィーにより規定された混合比によって決定される３つの最終値の１つまで増加する。次に、約８〜２４時間の時間に亘りタンパク質濃度が平衡化し、溶媒側で増加し、そしてタンパク質側で減少する。最終のタンパク質濃度がもう一度混合比により決定される。従って、チップは、位相空間を通る曲がった経路をとり、これは、原則的に、タンパク質溶液が不安定領域中で効率的な結晶核形成を有し、次いで、準安定領域で高品質成長が続くことを可能にする。 FIG. 57 is a simplified schematic diagram comparing the development of a conventional hanging drop and microbatch experiment with a two-dimensional phase space with the polymer concentration and precipitant concentration as variables and the μFID experiment according to an embodiment of the present invention. It is. The phase-space orbit taken by the tip during equilibrium depends on the diffusion constant of the species involved. In a short period of time after the chip interface valve is opened, the protein concentration on the protein side hardly changes, while that of the counter solvent, typically with a much larger diffusion constant, is mixed by lithography. Increase to one of the three final values determined by the ratio. The protein concentration then equilibrates over a period of about 8-24 hours, increasing on the solvent side and decreasing on the protein side. The final protein concentration is once again determined by the mixing ratio. Thus, the chip takes a curved path through the phase space, which in principle means that the protein solution has efficient crystal nucleation in the unstable region, followed by high quality growth in the metastable region. Allows you to continue.

従って、図５７は、３つの異なる混合比を有するμＦＩＤ反応部位の展開を示す。曲線は、各化合物のサンプル側および沈殿剤側の両方の平均状態を良好に示す。最終的状態（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）は、混合比によって決定され、そしてこれらの曲線が、核形成の高い確率をもつ領域から高品質結晶成長を支持する領域まで通過するより大きな機会を有することを観察し得る。これら曲線の区切りは、混合比によって決定される。 Thus, FIG. 57 shows the development of a μFID reaction site with three different mixing ratios. The curve shows a good average state on both the sample side and the precipitant side of each compound. The final state (I, II, III) is determined by the mixing ratio, and these curves have a greater chance of passing from a region with a high probability of nucleation to a region supporting high quality crystal growth. Can be observed. The division of these curves is determined by the mixing ratio.

対照的に、従来のマイクロバッチおよびハンギングドロップアプローチは、標的分子が沈殿剤と１：１で組み合わされる点ＩＶで開始する。マイクロバッチ実験は、混合不能オイル下でインキュベートされ、引き続く試薬の濃縮を避け、そしてそれ故、位相空間における単一の点のみをサンプリングする。ハンギングドロップ実験では、混合物は、沈殿剤の大きなリザバでの蒸気拡散を通じて平衡化され、試薬を濃縮し、そしてサンプルを過飽和領域中に駆動する。これは望ましくない。なぜなら、得られる位相空間軌道は沈殿領域中に移動するからである。 In contrast, conventional microbatch and hanging drop approaches start at point IV where the target molecule is combined 1: 1 with the precipitant. Microbatch experiments are incubated under immiscible oil, avoiding subsequent concentration of reagents, and therefore sample only a single point in phase space. In hanging drop experiments, the mixture is equilibrated through vapor diffusion through a large reservoir of precipitant, concentrating the reagents and driving the sample into the supersaturated region. This is undesirable. This is because the resulting phase space trajectory moves into the precipitation region.

フリー界面拡散技法の使用は、位相空間をサンプリングする有望な方法を提供するが、任意の所定の高分子のための可能な結晶化剤の真の数および濃度は、より系統的でかつ迅速な位相空間マッピング技法を所望されるようにする。 Although the use of free interfacial diffusion techniques provides a promising way to sample the phase space, the true number and concentration of possible crystallization agents for any given polymer is more systematic and faster A phase space mapping technique is made desirable.

例えば、結晶成長を調査するための実験または実験のセットを設計する前に、まず、高分子および結晶化剤の特定の組み合わせの曲線の位置を同定することがより効率的であると証明され得る。一旦、このような溶解度曲線が位相空間でマップされると、調査者は、次いで、軌道がこの溶解度曲線に隣接する位相空間領域を約束する領域を横断すると予期され得るスクリーニング実験のセットを効率的に設計することに進行し得る。 For example, before designing an experiment or set of experiments to investigate crystal growth, it may prove to be more efficient to first identify the location of the curve for a particular combination of polymer and crystallization agent. . Once such a solubility curve is mapped in phase space, the investigator then efficiently sets up a set of screening experiments that can be expected to traverse a region whose trajectory promises a phase space region adjacent to this solubility curve. You can proceed to designing.

高分子の過飽和のレベルは、一般に、以下の式（８）によって規定される：
（８）ＳＳ＝（ＰＣ−ＭＣ）／ＭＣ・１００、ここで：
ＳＳ＝高分子の過飽和のレベル；
ＰＣ＝高分子濃度；および
ＭＣ＝平衡にある最大可溶性高分子濃度である。 The level of supersaturation of the polymer is generally defined by the following equation (8):
(8) SS = (PC−MC) / MC · 100, where:
SS = level of supersaturation of the polymer;
PC = polymer concentration; and MC = maximum soluble polymer concentration in equilibrium.

本発明の目的には、これまで中間の過飽和（ＩＳＳ）と称される、高分子の過飽和の代替の測定は、ＭＣがタンパク質の中間最大高分子濃度（ＩＭＣ）によって置換される場合に得られる。本発明の目的には、このＩＭＣは、１分以内に、固相（結晶または無定形のいずれか）を生成することができない高分子の最大濃度として規定される。中間の過飽和（ＩＳＳ）は、以下の式（９）によって規定される：
（９）ＩＳＳ＝（ＰＣ−ＩＭＣ）、ここで：
ＩＳＳ＝中間過飽和；
ＰＣ＝高分子濃度；および
ＩＭＣ＝中間最大高分子濃度である。 For the purposes of the present invention, an alternative measure of polymer supersaturation, previously referred to as intermediate supersaturation (ISS), is obtained when the MC is replaced by the intermediate maximum polymer concentration (IMC) of the protein. . For the purposes of the present invention, this IMC is defined as the maximum concentration of polymer that cannot produce a solid phase (either crystalline or amorphous) within 1 minute. Intermediate supersaturation (ISS) is defined by the following equation (9):
(9) ISS = (PC-IMC), where:
ISS = intermediate supersaturation;
PC = polymer concentration; and IMC = medium maximum polymer concentration.

高分子の結晶化は、一般に、代表的には、５０％〜５００％の範囲にある高過飽和値を必要とする。さらに、結晶化実験において正のＩＳＳ値で開始することは所望されない。なぜなら、これは、固相の即座の形成をもたらすからである。 Polymer crystallization generally requires high supersaturation values, typically in the range of 50% to 500%. Furthermore, it is not desirable to start with a positive ISS value in a crystallization experiment. This is because it results in the immediate formation of a solid phase.

所定の位相空間で、ＩＭＣ曲線によって上に境界され、およびＭＣ曲線によって下に境界される領域は、タンパク質結晶成長が支持され得る領域を規定する。従って、このＩＭＣ曲線が、例えば、組み合わせ混合を利用する高スループットスクリーニングの間の迅速固体形成の観察によって既知である場合、結晶化実験は、ＩＭＣの近くで、かつ負のＩＳＳ値で発展するようセットされるべきである。本出願の目的には、約±５０％の間のＩＳＳ値を有する状態は、ＩＭＣ曲線の近傍であると考えられる。 In a given phase space, the region bounded up by the IMC curve and bounded down by the MC curve defines the region where protein crystal growth can be supported. Thus, if this IMC curve is known, for example by observing rapid solid formation during high throughput screening utilizing combinatorial mixing, the crystallization experiment will develop near the IMC and with negative ISS values. Should be set. For purposes of this application, a state having an ISS value between about ± 50% is considered to be near the IMC curve.

図１７Ａ〜Ｂと組み合わせて先に論議された組み合わせ混合デバイス、およびその改変体は、結晶化剤および高分子の溶解度曲線をマップするための迅速かつ効率的な方法を提供する。詳細には、この結晶化剤サンプルは、緩衝液および試薬を、特異的かつ正確な濃度を達成するために回転ミキサーフローチャネル中に注入することにより調製され得る。次いで、サンプル注入ポートライン、およびポンプが、高分子サンプルを回転ミキサー中に導入するために用いられ得、この回転ミキサーにおける沈殿物の形成の検出が続く。 The combinatorial mixing devices discussed above in combination with FIGS. 17A-B, and variants thereof, provide a quick and efficient way to map the solubility curves of crystallization agents and macromolecules. Specifically, the crystallization agent sample can be prepared by injecting buffers and reagents into a rotating mixer flow channel to achieve a specific and accurate concentration. The sample injection port line and pump can then be used to introduce the polymer sample into the rotating mixer, followed by detection of precipitate formation in the rotating mixer.

沈殿物／結晶凝集物の検出は、いくつかの方法でなされ得る。凝集物検出の１つの方法は、カメラ上に混合リングをイメージすることである。単純なイメージ処理が、次いで、沈殿物を有するチャネルから清澄なチャネルを区別するためになされ得る。さらに、いくつかの結晶は、ある程度の複屈折を示すので、偏光レンズを用いて結晶を無定形固体から区別し得る。より小さな長さスケールでタンパク質凝集物を検出するために光散乱のような方法を用いることもまた可能である。 Detection of precipitate / crystal aggregates can be done in several ways. One method of aggregate detection is to image a mixing ring on the camera. Simple image processing can then be done to distinguish the clear channel from the channel with sediment. In addition, some crystals exhibit some degree of birefringence, so polarizing lenses can be used to distinguish the crystals from amorphous solids. It is also possible to use methods such as light scattering to detect protein aggregates on a smaller length scale.

図２４は、塩溶液（３．６ＭＮａＣｌ、およびｐＨ４．６にある１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ））に対し滴定されているタンパク質サンプル（リゾチーム８４ｍｇ／ｍｌ）に対する溶解度「位相空間」を示す。図２４は、１２０ｍＬの合計容量を消費する１００のアッセイの結果を示す。図２４は、溶解度相−空間を含むこのようなグラフの数千のうちの１つだけを表す。 FIG. 24 shows the solubility “phase space” for a protein sample (lysozyme 84 mg / ml) being titrated against a salt solution (3.6 M NaCl, and 100 mM sodium acetate (NaAc) at pH 4.6). FIG. 24 shows the results of 100 assays consuming 120 mL total volume. FIG. 24 represents only one of thousands of such graphs including solubility phase-space.

図２４に示されるグラフは、可溶性状態と沈殿状態との間の区別のみを示す。しかし、両方の方向にこの溶解度曲線を通過するために、高分子と結晶化剤との相対濃度における変化の方向をシフトすることによってより多くの情報を得ることが可能であり得る。例えば、タンパク質サンプルに十分な塩が添加される場合、無定形（沈殿物）または結晶（微結晶）のいずれかであり得る固体が形成される。この溶液がゆっくりと希釈される場合、この固体は、最終的に溶液中に溶解して戻る。しかし、その溶解が生じる濃度は、代表的には、凝固が当初生じる同じ濃度ではなく、そして、一般に、この固体が結晶であるか、または無定形であるかに依存する。 The graph shown in FIG. 24 shows only the distinction between the soluble state and the precipitated state. However, in order to pass this solubility curve in both directions, it may be possible to obtain more information by shifting the direction of change in the relative concentration of the polymer and the crystallization agent. For example, if enough salt is added to a protein sample, a solid is formed that can be either amorphous (precipitate) or crystalline (microcrystalline). If the solution is diluted slowly, the solid will eventually dissolve back into the solution. However, the concentration at which dissolution occurs is typically not the same concentration at which solidification initially occurs, and generally depends on whether the solid is crystalline or amorphous.

詳細には、沈殿は、ほぼ即座に生じるが、結晶は形成するのにより長くかかり、結晶化プロセスのためのより高い活性化エネルギーを示唆している。結晶核形成／形成のためのより高い活性化エネルギーは、実験室時間スケールでの核形成の観察は、実質的な過飽和を必要とすることを意味する。対照的に、結晶形態は、一旦それが出現すると、ゼロより大きいすべての過飽和値について可溶性形態よりも好まれる。従って、固相が溶解度相に戻って再変換される状態と対比して、溶解度相が固体に変換される状態下のヒステリシスの大きさは、沈殿物に対する結晶の存在を、そしてそれ故、結晶化に好適な状態を示し得る。 Specifically, precipitation occurs almost immediately, but crystals take longer to form, suggesting higher activation energy for the crystallization process. The higher activation energy for crystal nucleation / formation means that the observation of nucleation on the laboratory time scale requires substantial supersaturation. In contrast, the crystalline form is preferred over the soluble form for all supersaturation values greater than zero once it appears. Thus, the magnitude of hysteresis under the condition where the solubility phase is converted to a solid, as opposed to the condition where the solid phase is converted back into the solubility phase, indicates the presence of crystals to the precipitate and hence the crystals. It is possible to show a state suitable for conversion.

図２５は、結晶化剤（３．６ＭＮａＣｌ、およびｐＨ４．６にある０．１１Ｍクエン酸ナトリウム）との混合により沈殿されたリゾチーム（８４ｍｇ／ｍｌ）のサンプルの沈殿を示す。矩形（黒四角）と丸（黒丸）シンボルとの間の一致の欠如は、ヒステリシスおよび結晶成長を同定するための位相空間の探索をさらに約束する点を示す。 FIG. 25 shows the precipitation of a sample of lysozyme (84 mg / ml) precipitated by mixing with a crystallizing agent (3.6 M NaCl, and 0.11 M sodium citrate at pH 4.6). The lack of coincidence between the rectangle (black square) and the circle (black circle) symbol indicates a point that further promises a search of the phase space to identify hysteresis and crystal growth.

まさに記載されたような沈殿形成におけるヒステリシスの検出はまた、特定の高分子／結晶化剤の組み合わせが結晶形成の有望性を全く保持するか否かを識別するために非常に価値があることを証明するために供し得る。例えば、図５５の検査は、結晶形成に好適な不安定領域および準安定過飽和領域が溶解度曲線に沿って均一に生じないことを示す。その代わり、このような不安定／準安定領域が、局在化され、そして固体物質の形成が無定形であり、かつ整列された結晶物質の形成が可能ではない隣接する沈殿領域によって取り囲まれ得る。本発明の実施形態によるヒステリシスの検出は、特定タイプの結晶の形成を示し得、そしてそれ故、位相空間の可能な好適な領域をマップするために必要な時間および努力を最小にする予備的スクリーニング機構を提供する。 The detection of hysteresis in precipitate formation as just described is also very valuable for identifying whether a particular polymer / crystallization agent combination retains any promise of crystal formation. Can be served to prove. For example, the inspection of FIG. 55 shows that unstable and metastable supersaturated regions suitable for crystal formation do not occur uniformly along the solubility curve. Instead, such unstable / metastable regions may be surrounded and surrounded by adjacent precipitation regions where the formation of solid material is amorphous and the formation of aligned crystalline material is not possible . Detection of hysteresis according to embodiments of the present invention may indicate the formation of a particular type of crystal and therefore preliminarily screen to minimize the time and effort required to map possible preferred regions of phase space Provide mechanism.

結晶化サンプル中の凝集した固体のサイズを直接測定するために光散乱技法を利用することがさらに可能であり得る。詳細には、入射電磁放射の形態に対するチップのＰＤＭＳの事実上の透明度は、回転またはその他のタイプの混合デバイスのフローチャネルの光学的尋問を可能にし得る。準−弾性光散乱（ＱＥＬＳ）または動的光散乱（ＤＬＳ）のような技法を利用するサンプルから散乱された放射の検出は、サンプル中に存在する固体のサイズの決定を可能にし得、それによって、結晶核形成が好まれるとき、固体形成の開始のサンプル状態の決定を可能にする。 It may further be possible to utilize light scattering techniques to directly measure the size of the aggregated solid in the crystallized sample. In particular, the virtual transparency of the chip's PDMS with respect to the form of incident electromagnetic radiation may allow optical interrogation of the flow channel of a rotating or other type of mixing device. Detection of radiation scattered from a sample utilizing techniques such as quasi-elastic light scattering (QELS) or dynamic light scattering (DLS) may allow determination of the size of solids present in the sample, thereby When crystal nucleation is preferred, it allows determination of the sample state at the beginning of solid formation.

さらに、「希釈溶液性質からタンパク質結晶化を予測すること」、ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．５０：３６１〜３６５（１９９４）において、ＧｅｏｒｇｅおよびＷｉｌｓｏｎは、タンパク質結晶化挙動と、距離に亘る分子内電位の積分を表す基礎的パラメータであるタンパク質浸透圧第２ビリアル係数（Ｂ_２２）との間の関係を示した。このＧｅｏｒｇｅおよびＷｉｌｓｏｎの論文は、すべての目的のためにその全体が本明細書中に援用される。 Furthermore, “Predicting protein crystallization from dilute solution properties”, Acta Crystallogr. D. 50: 361-365 (1994), George and Wilson found between protein crystallization behavior and the protein osmotic second virial coefficient (B ₂₂ ), a fundamental parameter that represents the integral of the intramolecular potential over distance. Showed the relationship. This George and Wilson paper is incorporated herein in its entirety for all purposes.

高分子溶液の第２ビリアル係数は、高分子溶液の散乱挙動から検出され得る。さらに、結晶化を起こすタンパク質溶液の第２ビリアル係数の値は、一般に、狭い範囲にあることが見出されている。従って、小容量サンプルとの迅速組み合わせ混合を実施する能力とカップルされた光散乱技法による第２ビリアル係数のオンチップ評価は、可能な結晶可能性について異なる混合物の迅速スクリーニングを可能にし得る。 The second virial coefficient of the polymer solution can be detected from the scattering behavior of the polymer solution. Furthermore, it has been found that the value of the second virial coefficient of a protein solution that causes crystallization is generally in a narrow range. Thus, on-chip evaluation of the second virial coefficient by a light scattering technique coupled with the ability to perform rapid combinatorial mixing with small volume samples may allow for rapid screening of different mixtures for possible crystallisation potential.

本発明を、その特定の実施形態を参照して本明細書中に記載してきたが、許容範囲の改変、種々の変更および置換が先行する開示で意図され、そしていくつかの事例では、本発明のいくつかの特徴は、提示されたような本発明の範囲から逸脱することなくその他の特徴の対応する使用なくして採用され得ることが認識される。従って、多くの改変が、本発明の本質的な範囲および思想から逸脱することなく、本発明の教示に対して特定の状況または材料を適合するためになされ得る。本発明は、本発明を実施するために企図されたベストモードとして開示された特定の実施形態に制限されないことが意図され、本発明は、請求項の範囲内に入るすべての実施形態および等価物を含むことが意図される。 Although the present invention has been described herein with reference to specific embodiments thereof, it is contemplated by the preceding disclosure that modifications, various changes and substitutions are permissible, and in some instances, the present invention It will be appreciated that some of the features may be employed without the corresponding use of other features without departing from the scope of the invention as presented. Accordingly, many modifications may be made to adapt a particular situation or material to the teachings of the invention without departing from the essential scope and spirit of the invention. The present invention is not intended to be limited to the particular embodiments disclosed as the best mode contemplated for practicing the invention, and the invention includes all embodiments and equivalents falling within the scope of the claims. It is intended to include.

Claims

Invention described in the specification.